PT1390543E

PT1390543E - Novos polinucleótidos e polipéptidos do gene ifna-17

Info

Publication number: PT1390543E
Application number: PT02742996T
Authority: PT
Inventors: Jean-Louis Escary
Original assignee: Genodyssee
Priority date: 2001-04-24
Filing date: 2002-04-23
Publication date: 2006-12-29
Also published as: EP1390543A2; ES2268054T3; CY1107335T1; DE60213402T2; AU2002338442B2; WO2002086156A3; NO20034692L; US20040110715A1; BR0209097A; US20090004156A1; EP1390543B1; ZA200308114B; DE60213402D1; KR20030093328A; FR2823764B1; MXPA03009731A; CA2444235A1; DK1390543T3; AU2002338442B8; US7371819B2

Description

DESCRIÇÃO NOVOS POLINUCLEÓTIDOS E POLIPÉPTIDOS DO GENE IFNa-17

PEDIDOS RELACIONADOS A presente invenção reivindica prioridade ao Pedido de Patente Francês 0105516 depositado no dia 24 de Abril de 2001, intitulado «Nouveaux polynucléotides et polypeptides du gene IFNoí-17>>.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Âmbito da Invenção A presente invenção refere-se a novos polinucleótidos derivados da sequência nucleotidica do gene IFNa-17 compreendendo novos SNPs, e novos polipéptidos derivados da proteina IFNa-17 natural do tipo-selvagem compreendendo mutações causadas por estes SNPs, bem como aos seus usos terapêuticos.

Arte Relacionada O gene 17 do interferão a, daqui em diante designado por IFNa-17, encontra-se descrito nas publicações:

Olopade et al. : "Mapping of the shortest region of overlap of deletions of the short arm of chromosome 9 associated with human neoplasia"; Genomics 14: 437-443/ (1992) . 1

Lawn R. M. et al. ; "DNA sequence of two closely linked human leukocyte interferon genes"; Science 212 (4499), 1159-1162 (1981) . A sequência nucleotidica deste gene está acessível na base de dados de GenBank com o número de acesso V00532.

Os IFNa são conhecidos pelos seus efeitos celulares antiproliferativos e os seus envolvimentos em respostas antivirais e antiparasitárias.

Os IFNa são também conhecidos por inibirem a expressão de diversas citocinas ao nível das células estaminais hematopoiéticas, bem como por inibirem a proliferação celular de certos tumores.

Os IFNa são também conhecidos por reduzirem a expressão dos receptores ao EGF em carcinomas renais, inibirem a expressão de certos genes mitocondriais, inibirem a proliferação de fibroblastos, monócitos e linfócitos B, especialmente in vitro, e bloquearem a síntese de anticorpos através de linfócitos B.

Os IFNa são também conhecidos por induzirem a expressão de antigénios tumorais na superfície de células tumorais e também por induzirem os genes colocados sob o controlo de regiões do promotor do tipo ISRE (Elemento de Resposta Estimulado por Interferão) por actuação nos factores de transcrição específicos destes ISRE.

Sabe-se que os IFNa estão envolvidos em diferentes desordens e/ou doenças humanas, tais como os diferentes cancros como por exemplo, carcinomas, melanomas, linfomas, leucemias e 2 cancros do fígado, pescoço, cabeça e rins, doenças cardiovasculares, doenças metabólicas tais como as que não estão relacionadas com o sistema imune como, por exemplo, obesidade, doenças infecciosas tais como hepatites B e C e SIDA, pneumonias, colites ulcerosas, doenças do sistema nervoso central como, por exemplo, a doença de Alzheimer, esquizofrenia e depressão, a rejeição de transplantes de tecido ou órgão, cicatrização de feridas, anemia em pacientes dialisados, alergias, asma, esclerose múltipla, osteoporose, psoríase, artrite reumática, doença de Crohn, doenças e desordens auto-imunes, desordens gastrointestinais ou mesmo desordens relacionadas com tratamentos de quimioterapia.

Os IFNa são particularmente usados para o tratamento de certas leucemias, carcinomas renais metastizados bem como tumores que aparecem a seguir a uma imunodeficiência, tal como o sarcoma de Kaposi no caso de SIDA. Os IFNa são também eficazes contra outros tipos de tumores e contra certas infecções virais. Os IFNa são também reconhecidos pela FDA (Food and Drug Administration) para o tratamento de verrugas genitais ou doenças venéreas.

Contudo, os IFNa, e em particular o IFNa-17, têm numerosos efeitos colaterais quando são usados em composições farmacêuticas, tais como reacções de hipersensibilidade aguda (urticária, broncoconstrição, choque anafiláctico etc.), arritmias cardíacas, tensão arterial baixa, ataques epilépticos, problemas com funções da tiróide, síndromes do tipo gripe (febres, suores, mialgias), etc.

Além disso, os pacientes tratados com IFNa podem desenvolver anticorpos que neutralizam estas moléculas, diminuindo assim a sua eficácia. 3

Alguns documentos, tais como US 4780 530, Ullrich et al. "nucleotide sequence of a portion of human chromosome 9 containing a leukocyte interferon gene cluster": Journal of molecular biology (1982) 156:467-486, WO 01/25438, Hussain e tal; "identification of interferon alpha-7, alpha-14 and alpha-21 variants in the genome of a large human population"; Journal of Interferon and Cytokine Research (1996) 16: 853-859 e Sylvánen et al.; "Identification of individuais by analysis of biallelic DNA markers, using PCR and solid phase", Journal of Interferon and Cytokine Research (1996) 16:46-59, descrevem sequências nucleotidicas ou polipeptidicas de diferentes variants do inteferão alfa ou moléculas relacionadas, que podem servir como agentes terapêuticos quando expressas em condições apropriadas.

Contudo, estes documentos não divulgam SNPs naturais específicos, que são correlacionados com uma diferença na actividade biológica da molécula do interferão alfa-17.

Os inventores descobriram novos polipéptidos e novos polinucleótidos análogos ao gene IFNcx-17 capazes de possuírem uma funcionalidade diferente da proteína IFNcx-17 natural do tipo-seivagem.

Estes novos polipéptidos e polinucleótidos podem ser notavelmente usados para tratar ou prevenir as desordens ou doenças previamente mencionadas e evitar todas ou parte das desvantagens a eles inerentes.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO A invenção tem como seu primeiro objecto novos polinucleótidos que diferem da sequência nucleotidica do gene 4 IFNa-17 do tipo-selvagem de referência, por compreenderem um ou vários SNPs (Polimorfismo de um Único Nucleótido). A sequência nucleotidica SEQ ID NO 1 do gene IFNa-17 humano do tipo-selvagem de referência é composta de 1873 nucleótidos e compreende uma sequência de codificação de 570 nucleótidos, do nucleótido 639 (codão de iniciação) ao nucleótido 1208 (codão de terminação). O requerente identificou 2 SNPs na sequência nucleotidica do gene IFNa-17 do tipo-selvagem de referência.

Estes SNPs são os seguintes: g771c, 808Ins(a).

Pretende-se, no sentido da presente invenção, que o número correspondendo à posição do SNP previamente definido seja relativo ao número da sequência nucleotidica SEQ ID NO 1.

As letras a, t, c e g correspondem respectivamente às bases azotadas adenina, timina, citosina e guanina. A primeira letra corresponde ao nucleótido do tipo-selvagem, ao passo que a última letra corresponde ao nucleótido mutado.

Assim, o SNP g771c corresponde a uma mutação do nucleótido guanina (g) na posição 771 da sequência nucleotidica SEQ ID NO 1 do gene IFNa-17 do tipo-selvagem de referência, numa citosina (c). O SNP 808Ins(a) corresponde à inserção do nucleótido adenina (a) na posição 808 da sequência nucleotidica SEQ ID NO 1 do gene IFNa-17 do tipo-selvagem de referência. 5

Estes SNPs foram identificados pelo requerente usando o processo de determinação descrito no pedido de patente do requerente FR 00 22894, intitulado "Processo para a determinação de um ou vários polimorfismo(s) funcional (is) na sequência nucleotidica de um gene candidato funcional pré-seleccionado e suas aplicações" e depositado em 6 de Dezembro de 2000, aqui citado por referência. O processo descrito neste pedido de patente permite a identificação de um ou (vários) SNP(s) pré-existentes em pelo menos um indivíduo de uma população aleatória de indivíduos.

No âmbito da presente invenção, foi isolado um fragmento da sequência nucleotidica do gene IFNa-17, compreendendo, por exemplo, a sequência de codificação, de diferentes indivíduos numa população de indivíduos aleatoriamente escolhida. A sequenciação destes fragmentos foi então levada a cabo em algumas destas amostras tendo um perfil de heteroduplex (isto é, um perfil diferente do perfil da sequência do gene IFNa-17 do tipo-selvagem de referência) após análise por DHPLC ("Cromatografia Liquida de Alta Resolução-Desnaturante"). O fragmento sequenciado deste modo foi então comparado com a sequência nucleotidica do fragmento do gene IFNa-17 do tipo-selvagem de referência e os SNPs em conformidade com a invenção identificados.

Assim, os SNPs são naturais e cada um deles está presente em certos indivíduos da população mundial. O gene IFNa-17 do tipo-selvagem de referência codifica uma proteína imatura de 189 aminoácidos, correspondendo à 6 sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2, que será convertida numa proteína madura de 166 aminoácidos, por clivagem do péptido sinal que inclui os primeiros 23 aminoácidos.

Os SNPs de codificação da invenção, nomeadamente: g771c e 808Ins(a), causam modificações ao nível da sequência de aminoácidos da proteína codificada pela sequência nucleotídica do gene IFNa-17. Estas modificações são as seguintes: - 0 SNP g771c causa uma mutação do aminoácido glicina (G) na posição 45 na proteína imatura do gene IFNa-17, correspondendo à sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2, em arginina (R) e na posição 22 da proteína madura. Na descrição da presente invenção, designaremos indiferentemente G22R e G45R a mutação codificada por este SNP se nos referirmos respectivamente à proteína madura ou à proteína imatura. - 0 SNP 808Ins(a) causa uma mutação do aminoácido histidina (H) na posição 57 na proteína imatura do gene IFNa-17, correspondendo à sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2, em glutamina (Q) e na posição 34 da proteína madura. Além disso, a inserção de adenina na posição 808 na sequência nucleotídica causa um deslocamento do quadro de leitura na tradução da proteína, que resulta no aparecimento de um codão de terminação na posição 58 da sequência de aminoácidos. Assim, o SNP 808Ins(a) causa uma interrupção na tradução imediatamente após a glutamina 57. Como consequência, a proteína imatura resultante é reduzida e é composta apenas de 57 aminoácidos. Este polimorfismo é também designado por H57Q quadro 57. Na descrição da presente invenção, designaremos indiferentemente H34Q quadro 34 e H57Q quadro 57 a mutação 7 codificada por este SNP se nos referirmos respectivamente à proteína madura ou à proteína imatura. A sequência de aminoácidos SEQ ID NO 3 corresponde à proteína imatura mutada (H57Q quadro 57) codificada pela sequência nucleotídica SEQ ID NO 1 compreendendo o SNP 808Ins(a).

Cada um dos SNPs da invenção causa modificações da conformação espacial dos polipéptidos em conformidade com a invenção comparativamente ao polipéptido codificado pela sequência nucleotídica do gene IFNa-17 do tipo-selvagem de referência.

Estas modificações podem ser observadas por modelação molecular computacional, de acordo com métodos que são bem conhecidos do perito na arte, fazendo uso, por exemplo, das ferramentas de modelação de novo (por exemplo, SEQFOLD/MSI), homologia (por exemplo, MODELER/MSI), minimização do campo de força (por exemplo, DISCOVER, DELPHI/MSI) e/ou dinâmica molecular (por exemplo, CFF/MSI).

Um exemplo de tais modelos é aqui facultado na secção experimental. A modelação molecular computacional mostra que a mutação G22R na proteína madura mutada envolve uma modificação e um deslocamento da ansa AB em torno da posição 22, o que causa o desaparecimento de pontes de hidrogénio.

As Figuras IA e 1B mostram que a ansa AB é desdobrada e saliente. 8

Na IFNa-17 natural do tipo-selvagem, o resíduo G22 encontra-se bastante próximo do resíduo R144. Sabe-se que este resíduo R144 está envolvido na ligação do interferão a-2 (IFNa-2) ao seu receptor. Sendo as estruturas da IFNa-2 e da IFNa-17 bastante similares, é provável que o resíduo R144 em IFNa-17 esteja envolvido na ligação ao seu receptor.

Assim, a proteína mutada com G22R possui uma conformação tridimensional diferente da proteína IFNa-17 natural do tipo-selvagem. A modelação molecular computacional também permite a previsão que a presença do aminoácido arginina na posição 22 envolve uma modificação significativa da estrutura e da função da proteína IFNa-17 natural do tipo-selvagem, notavelmente ao nível da ligação da IFNa-17 ao seu receptor. A genotipagem dos polinucleótidos em conformidade com a invenção pode ser levada a cabo de um modo tal que determine a frequência alélica destes polinucleótidos numa população. A determinação da funcionalidade dos polipéptidos da invenção pode ser igualmente levada a cabo por um teste da sua actividade biológica. A este respeito, é possível medir, por exemplo, transdução de sinal, a maturação de células dendríticas, a libertação de citocina por linfócitos T, a libertação de citocina por monócitos, actividade antiviral in vitro ou in vivo, actividade anti-proliferativa numa linhagem celular Daudi Burkitt, a actividade antiviral na linhagem celular TF-1 de polipéptidos em conformidade com a invenção e comparar com a 9 IFNcx-17 do tipo-selvagem ou a IFNa-2 do tipo-selvagem escolhida como representativa do produto comercial Intron A. A invenção também tem como objecto o uso de polinucleótidos e de polipéptidos em conformidade com a invenção bem como de moléculas terapêuticas obtidas e/ou identificadas a partir destes polinucleótidos e polipéptidos, notavelmente para a prevenção e o tratamento de certas desordens e/ou doenças humanas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

As Figuras IA e 1B representam um modelo da proteína codificada de acordo com a invenção compreendendo o SNP G45R e a proteína IFNa-17 do tipo-selvagem. A Figura 1B representa uma ampliação do modelo da parte inferior de cada uma das proteínas representadas na Figura IA.

Nas Figuras IA e 1B, a banda preta representa a estrutura da proteína IFNa-17 do tipo-selvagem e a banda branca representa a estrutura da proteína IFNa-17 mutada com G22R. A Figura 2 representa os resultados do teste para medir o efeito anti-proliferativo da IFNa-17 mutada com G45R, na linhagem celular TF-1. Nesta figura, as abcissas correspondem a concentração de IFNa (ng/ml) e as ordenadas correspondem à inibição de proliferação celular (%) . 0 efeito anti- proliferativo da IFNa-17 mutada com G45R (diamantes pretos) é comparado ao da IFNa-2 do tipo-selvagem (quadrados brancos). A Figura 3 representa os resultados do teste para medir o efeito anti-proliferativo da IFNa-17 mutada com G45R, na linhagem celular Daudi Burkitt. Nesta figura, as abcissas 10 correspondem à concentração de IFNa (ng/ml) e as ordenadas correspondem à inibição de proliferação celular (%). 0 efeito anti-proliferativo da IFNa-17 mutada com G45R (diamantes pretos) é comparado ao da IFNa-2 do tipo-selvagem (quadrados brancos). A Figura 4 representa a taxa de sobrevivência de ratinhos previamente infectados por virus VSV e tratados com proteína IFNa-17 mutada com G45R, em comparação com os tratados com IFNa-2 do tipo-selvagem, ou como os que não foram tratados.

Nesta Figura, as abcissas correspondem ao tempo de sobrevivência (dias) e as ordenadas correspondem à taxa de sobrevivência relativa de ratinhos infectados por VSV. Os diamantes pretos representam os dados para ratinhos infectados por VSV tratados com IFNa-17 mutada com G45R, os quadrados pretos representam os dados para ratinhos infectados por VSV tratados com IFNa-2 do tipo-selvagem, e os triângulos abertos representam os dados para ratinhos infectados por VSV que não foram tratados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições. "Sequência nucleotídica do gene do tipo-selvagem de referência" significa a sequência nucleotídica SEQ ID NO 1 do gene IFNa-17 humano.

Esta sequência está acessível em GenBank com o número de Acesso V00532 descrita em: 11 "Mapping of the shortest region of

Olopade et al., overlap of deletions of the short arm of chromosome 9 associated with human neoplasia"; Genomics; 14: 437-443/ 1992 .

Lawn R. M. et al. ; "DNA sequence of two closely linked human leukocyte interferon genes"; Science 212 (4499), 1159- 1162 (1981) . "Proteína IFNa-17 natural do tipo-selvagem" ou "proteína IFNa-17 do tipo-selvagem" significam a proteína madura codificada pela sequência nucleotídica do gene IFNa-17 do tipo-selvagem de referência. A proteína IFNa-17 natural imatura do tipo-selvagem corresponde à sequência peptídica mostrada em SEQ ID NO 2. "Polinucleótido" significa um poli-ribonucleótido ou um poli-desoxirribonucleótido que podem ser um ADN ou um ARN modificado ou não-modifiçado. 0 termo polinucleótido inclui, por exemplo, um ADN de cadeia simples ou dupla, um ADN composto de uma mistura de uma ou várias região(ões) de cadeia simples e de uma ou vários região(ões) de cadeia dupla, um ARN de cadeia simples ou dupla e um ARN composto de uma mistura de uma ou várias região(ões) de cadeia simples e de uma ou vários região(ões) de cadeia dupla. 0 termo polinucleótido também pode incluir um ARN e/ou um ADN incluindo uma ou várias regiões de cadeia tripla. Polinucleótido significa igualmente os ADNs e ARNs contendo uma ou várias bases modificadas de modo a terem um esqueleto modificado por motivos de estabilidade ou por outras razões. Base modificada significa, por exemplo, as bases incomuns tal como inosina. 12 "Polipéptido" significa um péptido, um oligopéptido, um oligómero ou uma proteína compreendendo pelo menos dois aminoácidos ligados por uma ligação peptídica normal ou modificada, tal como nos casos dos péptidos isotéricos, por exemplo.

Um polipéptido pode ser composto de aminoácidos que não os 20 aminoácidos definidos pelo código genético. Um polipéptido pode ser igualmente composto de aminoácidos modificados por processos naturais, tais como processos de maturação pós-tradução ou por processos químicos, que são bem conhecidos de um perito na arte. Tais modificações encontram-se completamente detalhadas na literatura. Estas modificações podem aparecer em qualquer local no polipéptido: no esqueleto do péptido, na cadeia de aminoácidos, ou mesmo nas extremidades terminais-carboxilo ou -amino.

Um polipéptido pode se ramificado seguindo uma ubiquitinação ou pode ser cíclico com ou sem ramificação. Este tipo de modificação pode ser o resultado de processos pós-tradução naturais ou sintéticos que são bem conhecidos do perito na arte. gama-carboxilação, 13 glicosilação

Por exemplo, modificações polipeptídicas incluem acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, fixação covalente de flavina, fixação covalente de heme, fixação covalente de um nucleótido ou de um derivado nucleotídico, fixação covalente de um lípido ou de um derivado lipídico, fixação covalente de um fosfatidilinositol, reticulação covalente ou não-covalente, ciclização, formação de ponte de dissulfureto, demetilação, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação incluindo PEGilação, formação de fixação GPI, hidroxilação, iodização, metilação, miristoilação, oxidação, processos proteolíticos, fosforilação, prenilação, racemização, seneloilação, sulfatação, adição de aminoácido tal como arginilação ou ubiquitinação. Tais modificações encontram-se completamente detalhadas na literatura: PROTEIN-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2a Ed., T. E. Creighton, Nova Iorque, 1993, POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nova Iorque, 1983, Seifter et al., "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990) 182: 626-646, e Rattan et al., "Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging", Ann. NY Acad Sei (1992) 663: 48-62. "Polinucleótido isolado" ou "polipéptido isolado" significa, respectivamente, um polinucleótido ou um polipéptido como previamente definido que é isolado do corpo humano ou então produzido por um processo técnico. "Identidade" significa a medida da identidade da sequência nucleotidica ou polipeptidica.

Identidade é um termo bem conhecido do perito na arte e encontra-se bem descrito na literatura. Ver COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A.M., Ed., Oxford University Press, Nova Iorque, 1998, BIOCOMPUTING INFORMATICS AND GENOME PROJECT, Smith, D.W., Ed., Academic Press, Nova Iorque, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A.M. e Griffin H.G., Ed, Humana Press, Nova Jersey, 1994; e SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, 1987. 14

Os métodos geralmente empregues para determinar a identidade e a semelhança entre duas sequências encontram-se igualmente bem descritos na literatura. Ver GUIDE TO HUGE COMPUTER, Martin J. Bishop, Ed, Academic Press, San Diego, 1994, e Carillo H. e Lipton D., Siam. J Applied Math (1988) 48: 1073.

Um polinucleótido tendo, por exemplo, uma identidade de pelo menos 95% com a sequência nucleotidica SEQ ID NO 1 é um polinucleótido que contém no máximo 5 pontos de mutação ao longo de 100 nucleótidos, comparado à dita sequência.

Estes pontos de mutação podem ser uma (ou várias) substituição(ões), adição(ões) e/ou deleção(ões) de um (ou vários) nucleótido(s).

Do mesmo modo, um polipéptido tendo, por exemplo, uma identidade de pelo menos 95% com a sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2 é um polipéptido que contém no máximo 5 pontos de mutação ao longo de 100 aminoácidos, comparado à dita sequência.

Estes pontos de mutação podem ser uma (ou várias) substituição (ões), adição(ões) e/ou deleção(ões) de um (ou vários) aminoácido(s).

Os polinucleótidos e os polipéptidos de acordo com a invenção que não são totalmente idênticos, com respectivamente: a sequência nucleotidica SEQ ID NO 1 compreendendo pelo menos um dos seguintes SNPs: g771c e 808Ins(a)

a sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2 compreendendo o SNP G45R 15

a sequência de aminoácidos SEQ ID NO 3 compreendendo possivelmente o SNP G45R são considerados como variantes destas sequências.

Normalmente um polinucleótido de acordo com a invenção possui a mesma ou praticamente a mesma actividade biológica que a sequência nucleotidica SEQ ID NO 1 compreendendo pelo menos um dos SNPs: g771c e 808Ins(a).

De um modo semelhante, geralmente um polipéptido de acordo com a invenção possui a mesma ou praticamente a mesma actividade biológica que: a sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2 compreendendo o SNP G45R, e/ou a sequência de aminoácidos SEQ ID NO 3 compreendendo possivelmente o SNP G45R.

Uma variante, de acordo com a invenção, pode ser obtida, por exemplo, por mutagénese dirigida ou por síntese directa. "SNP" significa qualquer variação natural de uma base numa sequência nucleotidica. Um SNP, numa sequência nucleotidica, pode ser de codificação, silencioso ou não-codificante.

Um SNP de codificação é um polimorfismo incluído na sequência de codificação de uma sequência nucleotidica que envolve uma modificação de um aminoácido na sequência de aminoácidos codificada por esta sequência nucleotidica. Neste caso, o 16 termo SNP aplica-se igualmente, por extensão, a uma mutação numa sequência de aminoácidos.

Um SNP silencioso é um polimorfismo incluído na sequência de codificação de uma sequência nucleotídica que não envolve uma modificação de um aminoácido na sequência de aminoácidos codificada por esta sequência nucleotídica.

Um SNP não-codificante é um polimorfismo incluído na sequência não-codificante de uma sequência nucleotídica. Este polimorfismo pode ser notavelmente encontrado num intrão, numa zona de união, num promotor de transcrição ou numa sequência facilitadora. "SNP funcional" significa um SNP, como previamente definido, que está incluído numa sequência nucleotídica ou numa sequência de aminoácidos, tendo uma funcionalidade. "Funcionalidade" significa a actividade biológica de um polipéptido ou de um polinucleótido. A funcionalidade de um polipéptido ou de um polinucleótido de acordo com a invenção pode consistir numa conservação, um aumento, uma redução ou uma supressão da actividade biológica do polipéptido codificado pela sequência nucleotídica do gene de referência do tipo-selvagem ou desta última sequência nucleotídica. A funcionalidade de um polipéptido ou de um polinucleótido de acordo com a invenção pode igualmente consistir numa alteração na natureza da actividade biológica do polipéptido codificado pela sequência nucleotídica do gene de referência do tipo-selvagem ou desta última sequência nucleotídica. 17 A actividade biológica pode, notavelmente, ser ligada à afinidade ou à ausência de afinidade de um polipéptido de acordo com a invenção com um receptor.

Polinucleótido A presente invenção tem como seu primeiro objecto um polinucleótido isolado compreendendo: a) uma sequência nucleotidica tendo pelo menos 95% de identidade, mais preferivelmente pelo menos 99% de identidade com a sequência SEQ ID NO 1 ou com a sua sequência de codificação (do nucleótido 639 ao nucleótido 1208), subentendendo-se que esta sequência nucleotidica compreende pelo menos um dos seguinte SNPs de codificação g771c e 808Ins (a), ou b) uma sequência nucleotidica complementar a uma sequência nucleotidica segundo a) .

Em conformidade com a presente invenção, a sequência nucleotidica segundo a) pode compreender o SNP g771c, ou o SNP 808Ins(a), ou ambos os SNPs g771c e 808Ins(a).

Subentende-se, no sentido da presente invenção, que a numeração corresponde à posição dos SNPs na sequência nucleotidica SEQ ID NO 1. A presente invenção refere-se igualmente a um polinucleótido isolado compreendendo: 18 a) uma sequência nucleotídica SEQ ID N0.1 ou a sua sequência de codificação, subentendendo-se que cada uma destas sequências compreende pelo menos um dos seguintes SNPs de codificação: g771c e 808Ins(a), ou b) uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência nucleotídica segundo a) .

De preferência, o polinucleótido da invenção consiste na sequência SEQ ID NO 1 ou na sua sequência de codificação, subentendendo-se que cada uma destas sequências compreende pelo menos um dos seguintes SNPs de codificação: g771c e 808Ins (a) .

De acordo com a invenção, o polinucleótido previamente definido compreende um único SNP de codificação seleccionado do grupo que consiste em: g771c e 808Ins(a). A presente invenção refere-se também a um polinucleótido isolado consistindo de uma parte de: a) uma sequência nucleotídica SEQ ID NO 1 ou a sua sequência de codificação, subentendendo-se que cada uma destas sequências compreende pelo menos um dos seguintes SNPs: g771c e 808Ins(a), ou b) uma sequência nucleotídica complementar a uma sequência nucleotídica segundo a) . sendo o dito polinucleótido isolado composto de pelo menos 10 nucleótidos.

De preferência, o polinucleótido isolado como acima definido é composto de 10 a 40 nucleótidos. 19 A presente invenção também tem por seu objecto um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido compreendendo: a) a sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2, ou b) a sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos incluídos entre as posições 24 e 189 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2, subentendendo-se que cada uma das sequências de aminoácidos segundo a) e b) compreende o seguinte SNP de codificação: G45R.

No sentido da presente invenção a numeração correspondendo à posição do G45R significa que é relativa à numeração da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2. A presente invenção também tem por seu objecto um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido compreendendo: a) a sequência de aminoácidos SEQ ID NO 3, ou b) a sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos incluídos entre as posições 24 e 57 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 3.

Cada uma das sequências de aminoácidos segundo a) e b) do polipéptido previamente definido também pode compreender o SNP G45R. 20

De acordo com um objecto preferido da invenção, o polipéptido previamente definido compreende um único SNP de codificação como acima definido.

Mais preferivelmente, um polipéptido isolado de acordo com a invenção codifica um polipéptido compreendendo a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2 e tendo o SNP de codificação SNP G45R.

Mais preferivelmente, um polipéptido isolado de acordo com a invenção codifica um polipéptido compreendendo a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 3, tendo também possivelmente o SNP de codificação SNP G45R.

De preferência um polinucleótido de acordo com a invenção é composto de uma molécula de ADN ou ARN.

Um polinucleótido de acordo com a invenção pode ser obtido por métodos sintéticos de ADN ou ARN padrão.

Um polinucleótido de acordo com a invenção compreendendo o SNP g771c pode ser igualmente obtido por mutagénese dirigida a partir da sequência nucleotídica do gene IFNoí-17 por modificação do nucleótido guanina (g) do tipo-selvagem pelo nucleótido mutado citosina (c) na posição 771 da sequência nucleotídica SEQ ID NO 1.

Um polinucleótido de acordo com a invenção compreendendo o SNP 808Ins(a) pode ser igualmente obtido por mutagénese dirigida a partir da sequência nucleotídica do gene IFNa-17 por adição de um nucleótido adenina (a) na posição 808 da sequência nucleotídica SEQ ID NO 1. 21 ser

Os processos de mutagénese dirigida que podem implementados deste modo são bem conhecidos do perito na arte. Pode ser mencionada a publicação de TA Kunkel de 1985 em "Proc. Natl. Acad. Sei. USA" 82:488.

Um polinucleótido isolado pode igualmente incluir, por exemplo, sequências nucleotidicas que codificam sequências de aminoácidos de pre-, pro-, ou pre-pro-proteinas ou sequências de aminoácidos marcadoras, tal como péptido hexa-histidina.

Um polinucleótido da invenção pode igualmente ser associado com sequências nucleotidicas que codificam outras proteínas ou fragmentos de proteina com vista a obter proteínas de fusão ou outros produtos de purificação.

Um polinucleótido de acordo com a invenção pode igualmente incluir sequências nucleotidicas tais como as sequências não-codificantes 5' e/ou 3' , tais como, por exemplo, sequências transcritas ou não-transcritas, sequências traduzidas ou não-traduzidas, sequências sinal de união, sequências poliadeniladas, sequências de ligação ao ribossoma ou mesmo sequências que estabilizam ARNm.

Uma sequência nucleotidica complementar à sequência nucleotidica ou polinucleotídica é definida como uma que pode hibridizar com esta sequência nucleotidica, sob condições rigorosas. "Condições de hibridação rigorosas" significa de uma maneira geral, mas não são necessariamente, as condições químicas que permitem uma hibridação quando as sequências nucleotidicas têm uma identidade de pelo menos 80%, de preferência superior 22 ou igual a 90%, ainda mais preferencialmente superior ou igual a 95% e mais preferivelmente superior ou igual a 97%.

As condições rigorosas podem ser obtidas de acordo com métodos bem conhecidos do perito na arte e, por exemplo, por uma incubação dos polinucleótidos, a 42°C, numa solução compreendendo formamida a 50%, 5xSSC (NaCl 150 mM, citrato trissódico 15 mM), fosfato de sódio 50 mM (pH=7,6), 5x Solução de Denhardt, sulfato de dextrano a 10% e 20 pg de ADN de esperma de salmão desnaturado, seguido de lavagem dos filtros a 0,lxSSC, a 65°C.

Dentro do âmbito da invenção, quando as condições de hibridação rigorosas permitem a hibridação das sequências nucleotidicas que têm uma identidade igual a 100%, é considerado que a sequência nucleotidica é estritamente complementar à sequência nucleotidica tal como descrito em a) .

No âmbito do significado da presente invenção subentende-se que a sequência nucleotidica complementar a uma sequência nucleotidica compreende pelo menos um SNP anti-sentido de acordo com a invenção.

Assim, por exemplo, se a sequência nucleotidica compreender o SNP g771c, a sua sequência nucleotidica complementar compreende o nucleótido g no equivalente da posição 771.

Identificação,_hibridação e/ou amplificação de um polinucleótido compreendendo um SNP. A presente invenção também tem por seu objecto o uso de: 23 a) um polinucleótido tendo 95% de identidade e particularmente 100% de identidade com a sequência nucleotidica SEQ ID NO 1, ou uma sequência do dito polinucleótido composta de 10 a 40 nucleótidos, e/ou, b) um polinucleótido de acordo com a invenção

compreendendo pelo menos um SNP com vista a identificar, hibridar e/ou amplificar um polinucleótido tendo pelo menos 90% de identidade, mais preferivelmente 95% de identidade e particularmente 100% de identidade com a sequência nucleotidica SEQ ID NO 1 ou se necessário a sua sequência de codificação (do nucleótido 639 ao nucleótido 1208), subentendendo-se que cada uma destas sequências compreende pelo menos um dos seguinte SNPs: g771c, 808Ins(a).

Genotipagem e determinação da frequência de um SNP A presente invenção tem igualmente por seu objecto o uso de: a) um polinucleótido tendo 95% de identidade e particularmente 100% de identidade com a sequência nucleotidica SEQ ID NO 1, ou uma sequência do dito polinucleótido composta de 10 a 40 nucleótidos, e/ou,

b) um polinucleótido de acordo com a invenção compreendendo pelo menos um SNP para a genotipagem de um polinucleótido tendo pelo menos 90% de identidade, mais preferivelmente 95% de identidade e particularmente 100% de identidade com a sequência nucleotidica SEQ ID NO 1 ou se necessário a sua sequência de 24 codificação (do nucleótido 639 ao nucleótido 1208), subentendendo-se que cada uma destas sequências compreende pelo menos um dos SNPs seguintes: g771c, 808Ins(a).

De acordo com a invenção, a genotipagem pode ser levada a cabo num individuo ou numa população de individuos.

No âmbito do significado da invenção, a genotipagem é definida como um processo para a determinação do genótipo de um individuo ou de uma população de individuos. O genótipo consiste nos alelos presentes num ou mais pontos especificos. "População de individuos" significa um grupo de individuos seleccionado de modo aleatório ou não-aleatório. Estes individuos podem ser humanos, animais, microorganismos ou plantas.

Normalmente, o grupo de individuos compreende pelo menos 10 individuos, de preferência de 100 a 300 individuos.

Os individuos podem ser seleccionados de acordo com a sua etnicidade ou de acordo com o seu fenótipo, notavelmente os que são afectados pelas seguintes desordens e/ou doenças: carcinomas, melanomas, linfomas, leucemias e cancros do fígado, pescoço, cabeça e rins, doenças cardiovasculares, doenças metabólicas tais como as que não estão relacionadas com o sistema imune, por exemplo, obesidade, doenças infecciosas em particular infecções virais tais como hepatites B e C e SIDA, pneumonias, colites ulcerosas, doenças do sistema nervoso central como, por exemplo, a doença de Alzheimer, esquizofrenia e depressão, a rejeição de transplantes de tecido ou órgão, cicatrização de feridas, anemia em pacientes dialisados, alergias, asma, esclerose 25 múltipla, osteoporose, psoríase, artrite reumática, doença de Crohn, doenças e desordens auto-imunes, desordens gastrointestinais ou mesmo desordens relacionadas com tratamentos de quimioterapia.

Um SNP funcional de acordo com a invenção é de preferência genotipado numa população de indivíduos.

Existem múltiplas tecnologias que podem ser implementadas com vista a genotipar SNPs (ver Kwok Pharmacogenomics, 2000, vol 1, pp 95-100. "High-throughput genotyping assay approaches"). Estas tecnologias são baseadas num dos quatro princípios seguintes: hibridação de oligonucleótido especifica de alelo, alongamento de oligonucleótido por didesoxinucleótidos facultativamente na presença de desoxinucleótidos, ligação de oligonucleótidos específicos de alelos ou clivagem de oligonucleótidos específicos de alelos. Cada uma destas tecnologias pode ser acoplada a um sistema de detecção tal como medição de fluorescência directa ou polarizada, ou espectrometria de massa. A genotipagem pode ser notavelmente levada a cabo por minisequenciação com ddNTPs quentes (2 ddNTPs diferentes marcados por diferentes fluoróforos) e ddNTPs frios (2 ddNTPs diferentes não marcados), em ligação a um detector de fluorescência polarizada. O protocolo de minisequenciação com leitura da fluorescência polarizada (Tecnologia FP-TDI ou "Fluorescence Polarization Template-direct Dye-Terminator Incorporation") é bem conhecido do perito na arte.

Pode ser levada a cabo num produto obtido após amplificação através de reacção de polimerização em cadeia (PCR) do ADN de cada indivíduo. Este produto de PCR é seleccionado para 26 cobrir a região polinucleotidica génica contendo o SNP estudado. Após o último passo no termociclador de PCR, a placa é colocada num detector de fluorescência polarizada para uma leitura das bases marcadas usando filtros de excitação e emissão específicos de fluoróforo. Os valores da intensidade das bases marcadas são transcritos num gráfico.

Para a amplificação por PCR, no caso de um SNP da invenção, os iniciadores sentido e anti-sentido, respectivamente, podem ser facilmente seleccionados por um perito na arte de acordo com a posição dos SNPs da invenção.

Por exemplo, as sequências nucleotídicas sentido e anti-sentido para os iniciadores da amplificação por PCR podem ser, respectivamente:

SEQ ID NO.4: Iniciador sentido:TTCAAGGTTACCCATCTCAA

SEQ ID NO.5: Iniciador anti-sentido:TTAGTCAATCAGGATCATTGC

As sequências nucleotídicas permitem a amplificação de um fragmento tendo um comprimento de 655 nucleótidos, do nucleótido 591 ao nucleótido 1245 na sequência nucleotídica SEQ ID NO 1. É então alcançada uma análise estatística da frequência de cada alelo (frequência alélica) codificada pelo gene compreendendo o SNP na população de indivíduos, o que permite a determinação da importância do seu impacto e sua distribuição nos diferentes sub-grupos e notavelmente, se necessário, os diversos grupos étnicos que constituem esta população de indivíduos. 27

Os dados da genotipagem são analisados com vista a estimar a frequência de distribuição dos diferentes alelos observados nas populações estudadas. Os cálculos das frequências alélicas podem ser levados a cabo com auxílio de software tal como SAS-suite® (SAS) ou SPLUS® (MathSoft). A comparação das distribuições alélicas de um SNP da invenção em grupos étnicos diferentes da população de indivíduos pode ser levada a cabo por meio do software ARLEQUIN® e SAS-suite®. SNPs da invenção como marcadores genéticos.

Ao passo que os SNPs que modificam sequências funcionais de genes (e.g. promotor, sítios de união, região de codificação) estão provavelmente directamente relacionados com susceptibilidade ou resistência a doença, todos os SNPs (funcionais ou não) podem proporcionar valiosos marcadores para a identificação de um ou vários genes envolvidos nestes estados de doença e, consequentemente, podem estar indirectamente relacionados com estes estados de doença (Ver Cargill et al. (1999). Nature Genetics 22:231-238/ Riley et al. (2000). Pharmacogenomics 1:39-47; Roberts L. (2000).

Science 287: 1898-1899).

Assim, a presente invenção diz também respeito a uma base de dados que compreende pelo menos um dos seguintes SNPs: g771c, 808Ins (a) , num polinucleótido do gene IFNoí-17.

Subentende-se facilmente que os ditos SNPs são numerados em conformidade com a sequência nucleotidica SEQ ID NO 1.

Esta base de dados pode ser analisada para determinar associações estatisticamente relevantes entre: 28 (i) pelo menos um dos SNPs seguintes: g771c, 808Ins(a), num polinucleótido do gene IFNa-17, e (ii) uma doença ou uma resistência a uma doença.

Mais preferivelmente, a presente invenção diz respeito a um método para determinar associações estatisticamente relevantes entre pelo menos um SNP seleccionado do grupo que consiste em g771c, 808Ins (a), no gene IFNa-17, e uma doença ou uma resistência a uma doença compreendendo: a) Proceder à genotipagem de um grupo de indivíduos; b) Determinar a distribuição da dita doença ou resistência a doença dentro do dito grupo de indivíduos; c) Comparar os dados de genótipos com a distribuição da dita doença ou resistência a doença; e d) Analisar a dita comparação para associações estatisticamente relevantes. A presente invenção diz também respeito ao uso in vitro de pelo menos um dos seguintes SNPs: g771c, 808Ins(a), num polinucleótido do gene IFNa-17, para desenvolver estojos de diagnóstico/prognóstico para uma doença ou resistência a uma doença.

Um SNP da invenção tal como acima definido pode estar directa ou indirectamente associado a uma doença ou uma resistência a uma doença.

De preferência, estas doenças podem ser as que são definidas como acima mencionado. 29

Vector de expressão e células hospedeiras. A presente invenção também tem por seu objecto um vector recombinante compreendendo pelo menos um polinucleótido de acordo com a invenção.

Podem ser utilizados diversos sistemas de expressão, incluindo sem limitação cromossomas, epissomas, e virus derivados. Mais particularmente, os vectores recombinantes utilizados podem ser derivados de plasmídeos bacterianos, transposões, epissomas de levedura, elementos de inserção, elementos de cromossoma de levedura, vírus tais como baculovírus, vírus do papiloma tal como SV40, vírus de vaccinia, adenovirus, virus da varíola de raposa, vírus da pseudoraiva, retrovírus.

Estes vectores recombinantes podem ser igualmente derivados de cosmídeo ou de fasmídeo. A sequência nucleotídica pode ser inserida no vector de expressão recombinante por métodos bem conhecidos do perito na arte tais como, por exemplo, os que se encontram descritos em MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Sambrook et al., 4a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001. O vector recombinante pode incluir sequências nucleotídicas que controlam a regulação da expressão do polinucleótido bem como sequências nucleotídicas que permitem a expressão e a transcrição de um polinucleótido da invenção e a tradução de um polipéptido da invenção, sendo estas sequências seleccionadas de acordo com as células hospedeiras que são usadas. 30

Assim, por exemplo, um sinal de secreção adequado pode ser integrado no vector recombinante de forma a que o polipéptido, codificado pelo polinucleótido da invenção, seja dirigido para o lúmen do reticulo endoplasmático, para o espaço periplásmico, na membrana ou para o ambiente extracelular. A presente invenção também tem por seu objecto uma célula hospedeira compreendendo um vector recombinante de acordo com a invenção. A introdução do vector recombinante numa célula hospedeira pode ser levada a cabo de acordo com métodos que são bem conhecidos do perito na arte, tais como os descritos em BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Davis et al., 2a ed., McGraw-Hill Professional Publishing, 1995, e MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, supra, tais como transfecção por fosfato de cálcio, transfecção por dextrano-DEAE, transfecção, microinjecção, transfecção por lipidos catiónicos, electroporação, transdução ou infecção.

As células hospedeiras podem ser, por exemplo, células bacterianas tais como células de estreptococos, estafilococos, E. coli ou Bacillus subtilis, células de fungos tais como células de levedura e células de

Aspergillus, Streptomyces, células de insecto tais como células de Drosophila S2 e de Spodoptera Sf9, células animais, tais como células CHO, COS, HeLa, C127, BHK, HEK 293 e células de humano do individuo a tratar ou mesmo células de planta.

As células hospedeiras podem ser usadas, por exemplo, para expressar um polipéptido da invenção ou como produto activo 31 em composições farmacêuticas, como será aqui visto mais adiante.

Polipéptido. A presente invenção também tem por seu objecto um polipéptido isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade, mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade e ainda mais preferencialmente pelo menos 99% de identidade com: a) a sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2 ou b) a sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos incluídos entre as posições 24 e 189 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2, subentendendo-se que cada uma das sequências de aminoácidos segundo a) e b) contém o seguinte SNP de codificação: G45R. O polipéptido da invenção pode igualmente compreender: a) a sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2, ou b) a sequência de aminoácidos contendo os aminoácidos incluídos entre as posições 24 e 189 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2, subentendendo-se que cada uma das sequências de aminoácidos segundo a) e b) contém o seguinte SNP de codificação: G45R. O polipéptido da invenção pode mais particularmente consistir de: 32 a) a sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2, ou b) a sequência de aminoácidos contendo os aminoácidos incluídos entre as posições 24 e 189 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2, subentendendo-se que cada uma das sequências de aminoácidos segundo a) e b) contém o seguinte SNP de codificação: G45R. A presente invenção também tem por seu objecto um polipéptido isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade, mais preferivelmente pelo menos 95% de identidade e ainda mais preferencialmente pelo menos 99% de identidade com: a) a sequência de aminoácidos SEQ ID NO 3 ou b) a sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos incluídos entre as posições 24 e 57 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 3, subentendendo-se que cada uma das sequências de aminoácidos segundo a) e b) contém o seguinte SNP de codificação: H57Q quadro 57. O polipéptido da invenção pode igualmente compreender: a) a sequência de aminoácidos SEQ ID NO 3, ou b) a sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos incluídos entre as posições 24 e 57 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 3, 33 0 polipéptido da invenção pode mais particularmente consistir de: a) a sequência de aminoácidos SEQ ID NO 3, ou b) a sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos incluídos entre as posições 24 e 57 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 3,

Cada uma das sequências de aminoácidos segundo a) e b) do dito polipéptido pode também compreender o SNP G45R.

De preferência, um polipéptido de acordo com a invenção contém um único SNP de codificação seleccionado do grupo que consiste em: G45R, H57Q quadro 57.

Mais preferivelmente, o polipéptido de acordo com a invenção compreende os aminoácidos 24 a 189 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2, e tem o SNP de codificação G45R.

Mais preferivelmente, o polipéptido de acordo com a invenção compreende os aminoácidos 24 a 57 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 3. A presente invenção tem igualmente por seu objecto um processo para a preparação do polipéptido acima descrito, no qual uma célula hospedeira previamente definida é cultivada num meio de cultura e o dito polipéptido é isolado do meio de cultura. 0 polipéptido pode ser purificado a partir do meio de cultura das células hospedeiras, de acordo com métodos bem conhecidos 34 do perito na arte tais como precipitação com o auxilio de agentes caotrópicos tais como sais, em particular sulfato de amónio, etanol, acetona ou ácido tricloroacético, extracção ácida; cromatografia de troca iónica; cromatografia em fosfocelulose; cromatografia de interacção hidrofóbica; cromatografia de afinidade; cromatografia em hidroxiapatite ou cromatografias de exclusão. "Meio de cultura" significa o meio no qual o polipéptido da invenção é isolado ou purificado. Este meio pode ser composto do meio extracelular e/ou do lisado celular. Técnicas bem conhecidas do perito na arte permitem igualmente que este último possa conferir novamente uma conformação activa ao polipéptido, se a conformação do dito polipéptido foi alterada durante o isolamento ou purificação.

Anticorpos. A presente invenção também tem por seu objecto um processo para obter um anticorpo imuno-especifico. "Anticorpo" significa anticorpos monoclonais, policlonais, quiméricos, de cadeia simples, humanizados bem como os fragmentos Fab, incluindo produtos de bibliotecas de expressão Fab ou imunoglobulina.

Um anticorpo imuno-especifico pode ser obtido por imunização de um animal com um polipéptido de acordo com a invenção. A invenção refere-se também a um anticorpo imuno-especifico para um polipéptido de acordo com a invenção, tal como previamente definido. 35

Um polipéptido de acordo com a invenção, um dos seus fragmentos, um análogo, uma das suas variantes ou uma célula gue expressa este polipéptido também pode ser usado para produzir anticorpos imuno-especificos. 0 termo "imuno-especifico" significa que o anticorpo possui uma melhor afinidade para o polipéptido da invenção do que para outros polipéptidos conhecido na arte prévia.

Os anticorpos imuno-especificos podem ser obtidos por administração de um polipéptido da invenção, de um dos seus fragmentos, de um análogo ou de um fragmento epitópico ou de uma célula que expressa este polinucleótido num mamífero, de preferência não humano, de acordo com métodos bem conhecidos do perito na arte.

Para a preparação de anticorpos monoclonais, podem ser usados métodos típicos para produção de anticorpos, a partir de linhagens celulares, tal como a técnica do hibridoma (Kohler et al., Nature (1975) 256: 495-497), a técnica do trioma, a técnica do hibridoma da célula B humana (Kozbor et al., Immunology Today (1983) 4: 72) e a técnica do hibridoma EBV (Cole et al., "The EBV-hybridoma technique and its application to human lung câncer", em Monoclonal Antibodies e Câncer Therapy (Vol. 27, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, Novas Séries) (eds. R.A. Reisfeld e S.Sell), pp. 77-96, Alan R. Liss, Inc. N.Y., 1985, pp. 77-96) .

As técnicas de produção de anticorpo de cadeia única tais como descritas, por exemplo, em Patente US. n° 4 946 778 podem ser igualmente utilizadas. 36

Podem ser igualmente usados animais transgénicos tais como ratinhos, por exemplo, para produzir anticorpos humanizados.

Agentes gue interactuam com o polipéptido da invenção. A presente invenção tem igualmente por seu objecto um processo para a identificação de um agente que activa ou inibe um polipéptido de acordo com a invenção, compreendendo: a) a preparação de um vector recombinante compreendendo um polinucleótido de acordo com a invenção contendo pelo menos um SNP de codificação, b) a preparação de células hospedeiras compreendendo um vector recombinante de acordo com a), c) o contacto de células hospedeiras de acordo com b) com um agente a ser testado, e d) a determinação do efeito activador ou inibidor gerado pelo agente a testar.

Também pode ser empregue um polipéptido de acordo com a invenção para um processo para rastrear compostos que interactuam com ele.

Estes compostos podem ser agentes activadores (agonistas) ou inibidores (antagonistas) de actividade intrínseca de um polipéptido de acordo com a invenção. Estes compostos podem ser igualmente ligandos ou substratos de um polipéptido da invenção. Ver Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1 (2), Capitulo 5 (1991). 37

De um modo geral, para implementar tal processo, é desejável em primeiro lugar gerar células hospedeiras adequadas que expressam um polipéptido de acordo com a invenção. Tais células podem ser, por exemplo, células de mamíferos, leveduras, insectos tal como Drosophila ou bactérias tal como E. coli.

Estas células ou extractos membranares destas células são então colocados na presença de compostos a serem testados. A capacidade de ligação dos compostos a serem testados com o polipéptido da invenção pode ser então observada, bem como a inibição ou activação da resposta funcional. 0 passo d) do processo anterior pode ser implementado por utilização de um agente a ser testado que é directa ou indirectamente marcado. Também pode incluir um teste de competição, usando um agente marcado ou não- -marcado e um agente competidor marcado.

Pode ser igualmente determinado se um agente a ser testado gera um sinal de activação ou de inibição em células que expressam o polipéptido da invenção usando meios de detecção adequadamente escolhidos de acordo com o sinal a ser detectado.

Tais agentes de activação ou inibição podem ser polinucleótidos, e em alguns casos oligonucleótidos ou polipéptidos, tais como proteínas ou anticorpos, por exemplo. A presente invenção também tem por seu objecto um processo para a identificação de um agente activado ou inibido por um polipéptido de acordo com a invenção, compreendendo: 38 a) a preparação de um vector recombinante compreendendo um polinucleótido de acordo com a invenção contendo pelo menos um SNP de codificação, b) a preparação de células hospedeiras compreendendo um vector recombinante de acordo com a), c) colocar células hospedeiras de acordo com b) na presença de um agente a ser testado, e d) a determinação do efeito activador ou inibidor gerado pelo polipéptido no agente a ser testado.

Um agente activado ou inibido pelo polipéptido da invenção é um agente que responde, respectivamente, por uma activação ou inibição na presença deste polipéptido.

Os agentes, activados ou inibidos directa ou indirectamente pelo polipéptido da invenção, podem consistir em polipéptidos tais como, por exemplo, receptores membranares ou nucleares, cinases e mais preferivelmente tirosina cinases, factores de transcrição ou polinucleótidos.

Detecção de doenças. A presente invenção também tem por objecto um processo para analisar as caracteristicas biológicas de um polinucleótido de acordo com a invenção e/ou de um polipéptido de acordo com a invenção num indivíduo, compreendendo pelo menos um do seguintes: 39 a) Determinar a presença ou ausência de um polinucleótido de acordo com a invenção no genoma de um indivíduo; b) Determinar o nivel de expressão de um polinucleótido de acordo com a invenção num indivíduo; c) Determinar a presença ou ausência de um polipéptido de acordo com a invenção num indivíduo; d) Determinar a concentração de um polipéptido de acordo com a invenção num indivíduo; e/ou e) Determinar a funcionalidade de um polipéptido de acordo com a invenção num indivíduo.

Estas características biológicas podem ser analisadas num indivíduo ou numa amostra de um indivíduo.

Estas características biológicas podem permitir levar a cabo diagnósticos genéticos e determinar se um indivíduo é afectado ou corre o risco de ser afectado ou, ao contrário, apresenta uma resistência parcial para o desenvolvimento de uma doença, uma indisposição ou uma desordem associada à presença de um polinucleótido de acordo com a invenção e/ou de um polipéptido de acordo com a invenção.

Estas doenças podem ser desordens e/ou doenças humanas, tais como cancros e tumores, doenças infecciosas, doenças venéreas, doenças imunológicas relacionadas e/ou doenças e desordens auto-imunes, doenças cardiovasculares, doenças metabólicas, doenças do sistema nervoso central, e desordens relacionadas com tratamentos de quimioterapia. 40

Os ditos cancros e tumores incluem carcinomas compreendendo carcinomas renais metastizados, melanomas, linfomas compreendendo linfomas foliculares e linfoma de célula T cutâneo, leucemias compreendendo leucemia de tricoleucitos, leucemia linfocitária crónica e leucemia mielóide crónica, cancros do figado, pescoço, cabeça e rins, mielomas múltiplos, tumores carcinóides e tumores que aparecem a seguir a uma deficiência imune compreendendo o sarcoma de Kaposi no caso de SIDA.

As ditas doenças infecciosas incluem infecções virais compreendendo hepatites B e C crónicas e VIH/SIDA, pneumonias infecciosas, e doenças venéreas, tal como verrugas genitais.

As ditas doenças imunológicas e auto-imunológicas relacionadas podem incluir a rejeição de transplantes de tecido ou órgãos, alergias, asma, psoríase, artrite reumática, esclerose múltipla, doença de Crohn e colite ulceractiva.

As ditas doenças metabólicas podem incluir tais doenças não relacionadas com o sistema imune tal como obesidade.

As ditas doenças do sistema nervoso central podem incluir a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esquizofrenia e depressão.

As ditas doenças e desordens podem também incluir cicatrização de feridas, anemia em pacientes dialisados, e osteoporose.

Este processo também permite o diagnóstico genético de uma doença ou de uma resistência a uma doença associada à 41 presença, num indivíduo, do alelo mutante codificado por um SNP de acordo com a invenção.

De preferência, vai ser detectado, no passo a), a presença ou ausência de um polinucleótido, contendo pelo menos um SNP de codificação tal como previamente definido. A detecção do polinucleótido pode ser levada a cabo a partir de amostras biológicas do indivíduo a ser estudado, tais como células, sangue, urina, saliva, ou a partir de uma biópsia ou uma autópsia do indivíduo a ser estudado. 0 ADN genómico pode ser usado para a detecção directamente ou após uma amplificação por PCR, por exemplo. Podem ser igualmente usados ARN ou ADNc de um modo semelhante. É então possível comparar a sequência nucleotídica de um polinucleótido de acordo com a invenção com a sequência nucleotídica detectada no genoma do indivíduo. A comparação das sequências nucleotídicas pode ser levada a cabo por sequenciação, por métodos de hibridação de ADN, por diferença de mobilidade dos fragmentos de ADN num gel de electroforese com ou sem agentes desnaturantes ou por diferença de temperatura de fusão (ver Myers et al., Science (1985) 230: 1242). Tais modificações na estrutura da sequência nucleotídica num ponto preciso podem ser igualmente reveladas através de testes de protecção de nucleases, tais como RNase e a nuclease Sl, por digestão enzimática ou também por agentes químicos de clivagem. Ver Cotton et al., Proc. Nat. Acad. Sei. USA (1985) 85: 4397-4401. Podem ser igualmente usadas sondas oligonucleotídicas compreendendo um fragmento de polinucleótido da invenção para conduzir o rastreio. 42

Podem ser usados diversos métodos bem conhecidos do perito na arte para determinar a expressão de um polinucleótido da invenção e identificar a variabilidade genética deste polinucleótido (Ver Chee et al., Science (1996), Vol 274, pp 610-613) .

No passo b), o nivel de expressão do polinucleótido pode ser medido por quantificação do nivel de ARN codificado por este polinucleótido (e de codificação para um polipéptido) de acordo com métodos bem conhecidos do perito na arte como, por exemplo, por PCR, RT-PCR, protecção de RNase, Northern blot, e outros métodos de hibridação.

Nos passos c) e d) a presença ou ausência bem como a concentração de um polipéptido de acordo com a invenção num indivíduo ou numa amostra de um indivíduo pode ser levada a cabo através de métodos bem conhecidos tais como, por exemplo, por radioimunoensaio, testes de ligação competitivos, Western blot e testes ELISA.

Consecutivamente ao passo d) , a concentração determinada do polipéptido de acordo com a invenção pode ser comparada com a concentração de proteína natural do tipo-selvagem normalmente encontrada num indivíduo.

Um perito na arte pode identificar o limiar acima ou abaixo do qual aparece a sensibilidade ou, ao contrário, a resistência à doença, a indisposição ou a desordem acima evocada, com o auxílio de publicações da arte prévia ou por testes ou ensaios convencionais, tais como os previamente mencionados. 43

No passo e) , a determinação da funcionalidade de um polipéptido de acordo com a invenção pode ser levada a cabo por métodos bem conhecidos do perito na arte como, por exemplo, por testes in vitro tais como os supracitados ou por uso de células hospedeiras que expressam o dito polipéptido.

Compostos terapêuticos e tratamentos de doenças. A presente invenção também tem por seu objecto um composto terapêutico contendo, na qualidade de agente activo, um polipéptido de acordo com a invenção. A invenção refere-se também ao uso de um polipéptido de acordo com a invenção, para o fabrico de um composto terapêutico pretendido para a prevenção ou tratamento de diferentes desordens humanas e/ou doenças. Estas doenças podem desordens e/ou doenças humanas, tais como cancros e tumores, doenças infecciosas, doenças venéreas, doenças imunológicas relacionadas e/ou doenças e desordens auto-imunes, doenças cardiovasculares, doenças metabólicas, doenças do sistema nervoso central, e desordens relacionadas com tratamentos de quimioterapia.

Os ditos cancros e tumores incluem carcinomas compreendendo carcinomas renais metastizados, melanomas, linfomas compreendendo linfomas foliculares e linfoma de célula T cutâneo, leucemias compreendendo leucemia de tricoleucitos, leucemia linfocitária crónica e leucemia mielóide crónica, cancros do figado, pescoço, cabeça e rins, mielomas múltiplos, tumores carcinóides e tumores que aparecem a seguir a uma deficiência imune compreendendo o sarcoma de Kaposi no caso de SIDA. 44

As ditas doenças metabólicas podem incluir doenças não relacionadas com o sistema imune tal como obesidade.

De preferência, um polipéptido de acordo com a invenção também pode ser usado para o fabrico de um composto terapêutico pretendido para a prevenção ou o tratamento de diferentes desordens humanas e/ou doenças, tais como certas infecções virais tal como hepatites B e C crónicas, leucemias tais como leucemia de tricoleucitos e leucemia mielóide crónica, mielomas múltiplos, linfomas foliculares, tumores carcinóides, melanomas malignos, carcinomas renais metastizados, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, bem como tumores que aparecem a seguir a uma deficiência imune, tal como o sarcoma de Kaposi no caso de SIDA, e verrugas genitais ou doenças venéreas. 45

Alguns dos compostos que permitem obter o polipéptido de acordo com a invenção bem como os compostos obtidos ou identificados por ou a partir deste polipéptido podem ser igualmente usados para o tratamento terapêutico do corpo humano, i.e. como um composto terapêutico.

Tal é o motivo porque a presente invenção também tem por objecto um medicamento contendo, na qualidade de agente activo, um polinucleótido de acordo com a invenção contendo pelo menos um SNP de codificação previamente definido, um vector recombinante previamente definido, uma célula hospedeira previamente definida, e/ou um anticorpo previamente definido. A invenção refere-se também ao uso de um polinucleótido de acordo com a invenção contendo pelo menos um SNP de codificação previamente definido, um vector recombinante previamente definido, uma célula hospedeira previamente definida, e/ou um anticorpo previamente definido para o fabrico de um medicamento pretendido para a prevenção ou tratamento de diferentes desordens humanas e/ou doenças. Estas doenças podem ser desordens e/ou doenças humanas, tais cancros e tumores, doenças infecciosas, doenças venéreas, doenças imunológicas relacionadas e/ou doenças e desordens auto-imunes, doenças cardiovasculares, doenças metabólicas, doenças do sistema nervoso central, e desordens relacionadas com tratamentos de quimioterapia.

Os ditos cancros e tumores incluem carcinomas compreendendo carcinomas renais metastizados, melanomas, linfomas compreendendo linfomas foliculares e linfoma de célula T cutâneo, leucemias compreendendo leucemia de tricoleucitos, 46 leucemia linfocitária crónica e leucemia mielóide crónica cancros do figado, pescoço, múltiplos, tumores carcinóides seguir a uma deficiência imune Kaposi no caso de SIDA. cabeça e rins, mielomas e tumores gue aparecem a compreendendo o sarcoma de

As ditas doenças imunológicas e auto-imunológicas relacionadas podem incluir a rejeição de transplantes de tecido ou órgãos, alergias, asma, psoriase, artrite reumática, esclerose múltipla, doença de Crohn e colite ulceractiva.

De preferência, a invenção diz respeito ao uso de um polinucleótido de acordo com a invenção contendo pelo menos um SNP previamente definido, um vector recombinante previamente definido, uma célula hospedeira previamente definida, e/ou um anticorpo previamente definido, para o fabrico de um medicamento pretendido para a prevenção ou 47 tratamento de diferentes desordens humanas e/ou doenças, tais como certas infecções virais tal como hepatites B e C crónicas, leucemias tais como leucemia de tricoleucitos e leucemia mielóide crónica, mielomas múltiplos, linfomas foliculares, tumores carcinóides, melanomas malignos, carcinomas renais metastizados, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, bem como tumores que aparecem a seguir a uma deficiência imune, tal como o sarcoma de Kaposi no caso de SIDA, e verrugas genitais ou doenças venéreas. A dosagem de um polipéptido e dos outros compostos da invenção, úteis como agente activo, depende da escolha do composto, da indicação terapêutica, do modo de administração, da natureza da formulação, da natureza do indivíduo e do julgamento do doutor.

Quando for usado como agente activo, um polipéptido de acordo com a invenção é geralmente administrado a doses que variam entre 1 e 15 M IU (Unidade Internacional). A dose recomendada pode ser administrada por via subcutânea ou intramuscular, entre 1 a 5 vezes por semana, durante 1 a 12 meses. A invenção também tem como objecto uma composição farmacêutica que contém, como agente activo, pelo menos um composto supracitado tal como um polipéptido de acordo com a invenção, um polinucleótido de acordo com a invenção contendo pelo menos um SNP previamente definido, um vector recombinante previamente definido, uma célula hospedeira previamente definida, e/ou um anticorpo previamente definido, bem como um excipiente farmaceuticamente aceitável.

Nestas composições farmacêuticas, o agente activo está vantajosamente presente a doses fisiologicamente eficazes. 48

Estas composições farmacêuticas podem ser, por exemplo, sólidos ou líquidos e estarem presente em formas farmacêuticas geralmente usadas em medicina humana tais como, por exemplo, comprimidos simples ou revestidos, cápsulas, grânulos, caramelos, supositórios e de preferência preparações injectáveis e pós para injectáveis. Estas formas farmacêuticas podem ser preparadas de acordo com métodos habituais. O(s) agente(s) activo(s) pode ser incorporado em excipientes geralmente empregues em composições farmacêuticas tais como talco, goma arábica, lactose, amido, dextrose, glicerol, etanol, estearato de magnésio, manteiga de cacau, veículos aquosos ou não-aquosos, substâncias gordas de origem animal ou vegetal, derivado parafínicos, glicóis, vários agentes humidificantes, dispersantes ou emulsificantes, conservantes. 0(s) agente (s) activo(s) de acordo com a invenção pode ser empregue sozinho ou em combinação com outros compostos tais como compostos terapêuticas tal como outras citocinas tais como interleucinas ou interferões, por exemplo.

As diferentes formulações das composições farmacêuticas são adaptadas de acordo com o modo de administração.

As composições farmacêuticas podem ser administradas por diferentes vias de administração conhecidas do perito na arte. A invenção tem igualmente por objecto uma composição de diagnóstico que contém, como agente activo, pelo menos um composto supracitada tal como um polipéptido de acordo com a 49 um invenção, um polinucleótido de acordo com a invenção, vector recombinante previamente definido, uma célula hospedeira previamente definida, e/ou um anticorpo previamente definido, bem como um excipiente farmaceuticamente aceitável adequado.

Esta composição de diagnóstico pode conter, por exemplo, um excipiente adequado tal como os geralmente usados na composição de diagnóstico tais como tampões e conservantes. A presente invenção tem igualmente como objecto o uso: a) de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipéptido de acordo com a invenção, e/ou b) de um polinucleótido de acordo com a invenção, e/ou c) de uma célula hospedeira do indivíduo a ser tratado, previamente definida, para preparar um composto terapêutico pretendido para aumentar a expressão ou a actividade, num indivíduo, de um polipéptido de acordo com a invenção.

Assim, para tratar um indivíduo que necessita de um aumento na expressão ou na actividade de um polipéptido da invenção, são possíveis vários métodos. É possível administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipéptido da invenção, com um excipiente farmaceuticamente aceitável. 50 É igualmente possível aumentar a produção endógena de um polipéptido da invenção por administração ao indivíduo de um polinucleótido de acordo com a invenção. Por exemplo, este polinucleótido pode ser inserido num vector de expressão retrovírico. Tal vector pode ser isolado a partir de células que foram infectadas por um vector plasmídico retrovírico contendo ARN que codifica o polipéptido da invenção, de tal modo que as células transduzidas produzem partículas virais infecciosas contendo o gene de interesse. Ver Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, Capítulo 20, em Human Molecular Genetics, Strachan e Read, BIOS Scientifics Publishers Ltd (1996).

Em conformidade com a invenção, será preferencialmente usado um polinucleótido contendo pelo menos um SNP de codificação tal como previamente definido. É igualmente possível administrar ao indivíduo células hospedeiras que lhe pertencem, tendo estas células hospedeiras sido preliminarmente retiradas e modificadas de modo a expressar o polipéptido da invenção, como previamente descrito. A presente invenção refere-se igualmente ao uso: a) de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo imuno-específico previamente definido, e/ou, b) de um polinucleótido que permite a inibição da expressão de um polinucleótido de acordo com a invenção, 51 com vista a preparar um composto terapêutico pretendido para reduzir a expressão ou a actividade, num indivíduo, de um polipéptido de acordo com a invenção.

Assim, é possivel administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente inibidor e/ou de um anticorpo como previamente definido, possivelmente em combinação, com um excipiente farmaceuticamente aceitável. É igualmente possivel reduzir a produção endógena de um polipéptido da invenção por administração ao indivíduo de um polinucleótido complementar de acordo com a invenção permitindo a inibição da expressão de um polinucleótido da invenção.

De preferência, pode ser usado um polinucleótido complementar contendo pelo menos um SNP de codificação tal como previamente definido. A presente invenção diz também respeito ao uso de uma proteína IFNa-17 para a preparação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de um paciente tendo uma desordem ou uma doença causada por uma variante de IFNa-17 associada à presença no genoma do dito paciente de uma sequência nucleotidica tendo pelo menos 95% de identidade (de preferência, 97% de identidade, mais preferivelmente 99% de identidade e particularmente 100% de identidade) com a sequência nucleotidica SEQ ID NO 1, desde que a dita sequência nucleotidica compreenda um dos SNPs seguintes: g771c, 808Ins(a).

De preferência, o dito medicamento é usado para a prevenção ou tratamento de uma das doenças seleccionadas do grupo que 52 consiste em cancros e tumores, doenças infecciosas, doenças venéreas, doenças imunológicas relacionadas e/ou doenças e desordens auto-imunes, doenças cardiovasculares, doenças metabólicas, doenças do sistema nervoso central, e desordens relacionadas com tratamentos de quimioterapia.

Os drtos cancros e tumores incluem carcinomas compreendendo carcinomas renais metastizados, melanomas, linfomas compreendendo linfomas foliculares e linfoma de célula T cutâneo, leucemras compreendendo leucemia linfocitária crónica e cancros do figado, pescoço, múltiplos, tumores carcinóides seguir a uma deficiência imune Kaposi no caso de SIDA. As ditas doenças infecciosas compreendendo hepatites B e C crc infecciosas, e doenças venéreas, leucemra de trrcoleucrtos, leucemia mielóide crónica, cabeça e rins, mielomas e tumores que aparecem a compreendendo o sarcoma de incluem infecções virais micas e VIH/SIDA, pneumonias tal como verrugas genitais.

As ditas doenças do sistema nervoso central podem incluir a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esquizofrenia e depressão. 53

Compostos miméticos de um polipéptido IFNa-17 compreendendo o SNP g771c da Invenção. A presente invenção diz também respeito a um novo composto que tem uma actividade biológica substancialmente semelhante ao do polipéptido da: a) sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2, ou b) sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos incluídos entre as posições 24 e 189 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2/ desde que as ditas sequências de aminoácidos segundo a) e b) compreendam o SNP G45R. A dita actividade biológica pode ser avaliada, por exemplo, por medição da maturação de células dendriticas, libertação de citocina por linfócitos T CD4+ ou T CD8 + , libertação de citocina por monócitos, actividade antiviral in vitro ou in vivo, actividade antiproliferativa celular na linhagem celular TF-1, ou actividade antiproliferativa celular na linhagem celular de Daudi Burkitt como descrito na parte experimental.

Tal como mencionado na secção experimental, em comparação com a IFNa-2 do tipo-selvagem, a IFNa-17 mutada com G45R possui: 54 uma maior capacidade para estimular libertação de IFN-gama por linfócitos T CD4+ uma maior capacidade para estimular libertação de IFN-gama e IL-10 por linfócitos T CD8+ uma menor capacidade para estimular libertação de IL-10 e IL-12 por monócitos uma actividade antiproliferativa em células TF-1 similar uma maior actividade antiproliferativa em células da linhagem celular de Daudi Burkitt

uma maior actividade antiviral in vitro em cultura celular infectada com VS

uma maior actividade antiviral in vivo em modelo de ratinho EMCV

Como mencionado na parte experimental também, a IFNa-17 mutada com G45R possui uma menor actividade antiproliferativa celular na linhagem celular de Daudi Burkitt em comparação com a da IFNa-17 natural do tipo-selvagem.

Um novo composto da invenção, tal como previamente definido, pode possuir uma actividade biológica substancialmente semelhante à da IFNa-17 mutada com G45R. 0 dito composto também pode ter uma actividade biológica tal como libertação de IFN-gama por linfócitos T CD4+ ou T CD8+, libertação de IL-10 por linfócitos T CD8+, actividade 55 antiviral in vitro, ou actividade antiviral in vivo, que é ainda superior à da IFNa-17 mutada com G45R. O dito composto também pode ter uma actividade biológica tal como libertação de IL-10 e IL-12 por monócitos, que é ainda inferior à da IFNa-17 mutada com G45R. 0 dito composto pode ser um composto bioquímico, tal como um polipéptido ou um péptido por exemplo, ou um composto químico orgânico, tal como um péptido-mimético sintético por exemplo. A presente invenção diz também respeito ao uso de um polipéptido da invenção contendo o SNP G45R, para a identificação de um composto tal como acima definido. A presente invenção diz também respeito a um processo para a identificação de um composto da invenção, compreendendo os passos seguintes: a) Determinar a actividade biológica do composto a ser testado, tal como maturação de células dendríticas, libertação de citocina por linfócitos T CD4+ ou T CD8 + , libertação de citocina por monócitos, actividade antiproliferativa celular na linhagem celular TF-1, actividade antiproliferativa celular na linhagem celular de Daudi Burkitt, actividade antiviral in vitro ou in vivo, por exemplo; b) Comparar: i) a actividade determinada no passo a) do composto a ser testado, com 56 ii) a actividade do polipéptido da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2, ou da sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos incluídos entre as posições 24 e 189 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2; desde que as ditas sequências de aminoácidos compreendam o SNP G45R; e c) Determinar com base na comparação levada a cabo no passo b) se o composto a ser testado tem uma actividade substancialmente semelhante, ou inferior ou superior, comparada à do polipéptido da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2, ou da sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos incluídos entre as posições 24 e 189 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2; desde que as ditas sequências de aminoácidos compreendam o SNP G45R.

De preferência, o composto a ser testado pode ser previamente identificado de bibliotecas combinatoriais peptídicas sintéticas, rastreamento de alto-processamento, ou projectado por projecto de drogas com auxílio de computador de modo a ter a mesma estrutura tridimensional do polipéptido da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2, ou da sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos incluídos entre as posições 24 e 189 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2/ desde que as ditas sequências de aminoácidos compreendam o SNP G45R.

Os métodos para identificar e projectar compostos são bem conhecidos de um perito na arte.

Publicações que se referem a estes métodos podem ser, por exemplo: 57

Silverman R.B. (1992). "Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action". Academic Press, Ia edição (15 de Janeiro, 1992).

Anderson S e Chiplin J. (2002) . "Structural genomics; shaping the future of drug design" Drug Discov. Today. 7(2) :105-107 .

Selick Η E, Beresford AP, Tarbit MH. (2002) . "The emerging importance of predictive ADME simulation in drug discovery". Drug Discov. Today.7(2): 109-116.

Burbidge R, Trotter M, Buxton B, Holden S. (2001) . "Drug design by machine learning: support vector machines for pharmaceutical data analysis". Comput. Chem. 26(1): 5-14.

Kauvar L. M. (1996). "Peptide mimetic drugs: a comment on progress and prospects" 14(6): 709.

Os compostos da invenção podem ser usados para a preparação de um medicamento pretendido para a prevenção ou tratamento de uma das doenças seleccionadas do grupo que consiste em cancros e tumores, doenças infecciosas, doenças venéreas, doenças imunológicas relacionadas e/ou doenças e desordens auto-imunes, doenças cardiovasculares, doenças metabólicas, doenças do sistema nervoso central, e desordens relacionadas com tratamentos de quimioterapia.

Os ditos cancros e tumores incluem carcinomas compreendendo carcinomas renais metastizados, melanomas, linfomas compreendendo linfomas foliculares e linfoma de célula T cutâneo, leucemias compreendendo leucemia de tricoleucitos, leucemia linfocitária crónica e leucemia mielóide crónica, 58 mielomas cancros do figado, pescoço, múltiplos, tumores carcinóides seguir a uma deficiência imune Kaposi no caso de SIDA. cabeça e rins, e tumores que aparecem a compreendendo o sarcoma de

De preferência, os compostos da invenção podem ser usados para a preparação de um medicamento pretendido para a prevenção ou tratamento de uma das doenças seleccionados do grupo que consiste em certas infecções virais tais como hepatites B e C crónicas, leucemias tais como leucemia de tricoleucitos e leucemia mielóide crónica, mielomas múltiplos, linfomas foliculares, tumores carcinóides, 59 melanomas malignos, carcinomas renais metastizados, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, bem como tumores que aparecem a seguir a uma deficiência imune, tal como o sarcoma de Kaposi no caso de SIDA, e verrugas genitais ou doenças venéreas.

SECÇÃO EXPERIMENTAL EXEMPLO 1: Modelação de uma proteina codificada por um polinucleótido de sequência nucleotidica contendo o SNP G45R e da proteina codificada pela sequência nucleotidica do gene de referência do tipo-selvagem

Num primeiro passo a estrutura tridimensional de IFNa-17 foi construida a partir da de IFNcx-2 cuja estrutura está disponível na base de dados PDB (código 1ITF) e usando o software Modeler (MSI, San Diego, CA). 0 fragmento polipeptídico maduro foi então modificado de uma tal maneira a reproduzir a mutação G45R.

Foram conduzidos mil passos de minimização molecular neste fragmento mutado usando os programas AMBER e DISCOVER (MSI: Molecular Simulations Inc.)·

Duas corridas de cálculo dinâmico molecular foram então levadas a cabo com o mesmo programa e os mesmos campos de força.

Em cada caso, foram calculados 50000 passos a 300°K, terminados por 300 passos de equilíbrio. 60 0 resultado desta modelação é visualizado nas Figuras IA e 1B. EXEMPLO 2: Expressão de IFNg-17 natural do tipo selvagem e IFNa-17 mutada com G45R em levedura a) Clonagem da IFNg-17 natural do tipo-selvagem e IFNg-17 mutada no vector de expressão eucariótico pPicZa-topo

As sequências nucleotidicas que codificam para a parte matura de IFNa-17 natural do tipo-selvagem e IFNa-17 mutada com G45R são amplificadas por PCR usando como molde ADN genómico de um indivíduo que é heterozigótico para o SNP.

Os iniciadores de PCR que permitem uma tal amplificação são:

SEQ ID NO. 6: Iniciador sentido: TGTGATCTGCCTCAGACCCAC SEQ ID NO. 7:Iniciador anti-sentido:

TCAATCCTTCCTCCTTAATATTTTTTGC

Os produtos de PCR são inseridos no vector de expressão eucariótico pPicZa-TOPO sob controlo do promotor híbrido A0X1 induzível por metanol (TOPO™-cloning; Invitrogen Corp.).

Este vector permite a expressão heteróloga de proteínas eucarióticas na levedura Pichia pastoris.

Após verificar a sequência nucleotídica da região do vector que codifica as proteínas recombinantes, o vector é linearizado pela enzima de restrição Pmel, e a estirpe de levedura P. pastoris (Invitrogen) é transformada com estes vectores de expressão recombinantes. 61

b) Expressão heteróloga em P. pastoris e purificação das proteínas IFNa-17 do tipo-selvagem e IFNa-17 mutadas com G45R

Duas pré-culturas saturadas de 50 mL de meio BMGY (2% Peptona, 1% extracto de levedura, 1,34% YNB, 1% Glicerol, fosfato de potássio 100 mM, biotina 0,4 mg/Litro a pH 6,0) contendo um clone que codifica a proteína IFNa-17 do tipo-selvagem ou que codifica a proteína IFNa-17 mutada com G45R, foram levadas a cabo durante 24-48 horas a 30°C a uma agitação de 200 rotações por minuto (rpm).

Quando a cultura alcança uma densidade celular de saturação (correspondendo a uma densidade óptica de 12 medida a um comprimento de onda de 600 nm) , é usada para inocular, a 5 OD/mL, 250 mL de meio BMMY (2% Peptona, 1% extracto de levedura, 1,34% YNB, 0,5% Metanol, fosfato de potássio 100 mM, biotina 0,4 mg/Litro a pH 6,0). A expressão da proteína é então induzida por metanol a uma concentração final de 1%, durante 24 horas a 30°C, com uma agitação do frasco de cultura a 180 rpm.

Devido à presença da sequência do péptido sinal do "factor alfa", a montante da sequência de codificação, as proteínas são segregadas pelas leveduras no meio de cultura. O factor alfa é naturalmente clivado durante o processamento. A suspensão é centrifugada e a proteína é purificada por HPLC a partir do sobrenadante obtido.

Num passo pré-iniciado, uma ultrafiltração (Labscale, corte 5000Da, Millipore) seguida por uma diálise permite uma 62 concentração de dez vezes do sobrenadante de levedura num tampão de Tris-Cl 50 mM pH 9,0, NaCl 25 mM. O primeiro passo cromatográfico permite a recuperação da proteína por afinidade numa coluna de sefarose azul (Amersham Pharmacia). A presença da proteína é verificada nas fracções recolhidas, por um lado por electroforese de tipo SDS PAGE e por outro por imuno-detecção através de um anticorpo específico dirigido contra a proteína IFNa-17. Neste passo, a pureza da proteína de interesse é superior a 75%.

Num segundo passo de purificação, uma filtração em gel permite troca de tampão das fracções recolhidas que correspondem a proteínas IFNa-17 contra Tris 50 mM pH 9,0, NaCl 25 mM. O último passo da purificação consiste numa separação das proteínas numa coluna cromatográfica de troca iónica.

As fracções que contêm a proteína recombinante são injectadas numa coluna de troca aniónica (ResourceQ 6,0 mL, Pharmacia) previamente equilibrada em tampão Tris 50 mM pH 9, NaCl 25 mM. A eluição das proteínas é levada a cabo pela migração de um gradiente de NaCl entre 0,025 e 1 M no tampão Tris 50 mM pH 9. A pureza da proteína de interesse é estimada em gel SDS/PAGE e as concentrações de proteína foram medidas por densitometria (Quantity one, Biorad) e análise BCA (ácido bicinconínico e sulfato de cobre, Sigma).

As proteínas IFNa-17 do tipo-selvagem e IFNa-17 mutada com G45R purificadas obtidas de acordo com este protocolo, 63 eventualmente com aumento de escala para produzir maiores quantidades de proteínas, são usadas para os testes funcionais descritos abaixo.

EXEMPLO 3. Avaliação de actividade imunomoduladora de IFNa-17 natural do tipo-selvagem e IFNa-17 mutada com G45R

Os IFNs do tipo I (IFN alfa e IFN beta) são capazes de modular certas funções do sistema imune. Demonstrou-se que aumentam a maturação das células dendríticas (DC) : aumento na expressão das moléculas MHC classe I (HLA-ABC) e II (HLA-DR), aumento na expressão das moléculas envolvidas na co-estimulação dos linfócitos T, moléculas CD80, CD86 e CD83 e aumento na função estimulante de linfócitos T. a) Efeito de IFNa-17 mutada com G45R na maturação de célula dendrítica. A actividade imunomoduladora de IFNa-17 mutada com G45R foi inicialmente investigada na maturação de células dendríticas e comparada à de IFNa-2 do tipo-selvagem escolhida como representativa do produto comercial Intron A.

Para tal, as células dendríticas foram primeiro geradas de monócitos de sangue periférico de adulto cultivados na presença de GM-CSF e citocinas IL-4. Após purificação usando um estojo de purificação de células CD14+, estas células dendríticas foram colocadas na presença de 100 ng/mL de IFNa-2 do tipo-selvagem ou IFNa-17 mutada com G45R, e o seu fenótipo foi determinado por análise FACS que visavam a procura da expressão de moléculas MHC de classe I e II e dos marcadores CD40, CD80, CD86, CD83 e CDla. O estado de maturação destas células dendríticas foi também comparado ao 64 obtido sem tratamento com IFNoí, para proporcionar um controlo com células dendriticas não-estimuladas. 0 valor mediano das medidas de intensidade de fluorescência para cada marcador e para as três condições experimentais, expresso como unidade arbitrária, é apresentado na tabela seguinte: HLA ABC HLA DR CD40 CD80 CD86 CD83 CDla Nenhum IFNa 142 155 246 40 24 21 65 IFNal7 mutada com G45R 165 189 316 50 32 19 49 IFNa2 do tipo-selvagem 179 276 491 87 57 26 51

Os resultados deste teste demonstram que a proteína IFNoí-17 mutada com G45R é capaz de estimular a maturação de célula dendrítica.

b) Efeito de IFNa-17 mutada com G45R na libertação de citocina por linfócitos T A actividade imunomoduladora de IFNa-17 mutada com G45R foi também investigada medindo a libertação de citocina por linfócitos T colocados na presença de proteína IFNa-17 mutada e com ou sem um antigénio forte (SEB) de forma a mimetizar uma resposta imune contra uma agressão. Este teste também foi executado na presença de IFNa-2 do tipo-selvagem usado como controlo e escolhido como representativo do produto comercial Intron A. 65

Para tal, foram isoladas células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de dadores saudáveis e estimuladas durante 16 horas num meio apropriado contendo anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 ou SEB. Em cada cultura foi adicionado 4 yg/mL de IFNa-2 do tipo-selvagem ou IFNa-17 mutada com G45R. Após estimulação, os linfócitos T foram marcados extracelularmente com anticorpos anti-CD3, anti-CD4 e anti-CD69 ou anticorpos anti-CD3, anti-CD8 e anti-CD69, e marcados intracelularmente com anticorpos específicos dirigidos contra citocinas do tipo Thl (IFN-gama) ou citocinas do tipo Th2 (IL-10). As células fluorescentes foram analisadas usando software FACScalibur e CellQuest.

Os resultados obtidos indicam que a IFNa-17 mutada com G45R e IFNa-2 do tipo-selvagem não estimulam a libertação de IL-10 e de IFN-gama e, assim, não activam linfócitos T na ausência de SEB.

Em contraste, a IFNa-17 mutada com G45R e a IFNa-2 do tipo-selvagem estimulam a libertação de citocinas (IL-10 e IFN-gama) por linfócitos T activados com SEB como mostrado na tabela abaixo. Esta tabela representa a libertação de citocina por linfócitos T na presença de SEB, expressa como percentagem das células CD4+ CD69+ ou células CD8+ CD69+ para os linfócitos T CD4+ e linfócitos T CD8+, respectivamente, e a percentagem de células CD69+ nas células totais.

Linfócito IFN IL-10 Células T gama CD69+/Total CD4+CD69+ Controlo negativo 11, 9 7,5 1,26 IFNa-17 G45R 37,27 20,06 2, 94 66 IFNa2 do tipo-selvagem 19, 6 24, 68 2,7 CD8+CD69+ Controlo negativo 8,73 0,65 4, 69 IFNa-17 G45R 36, 7 7,02 9, 54 IFNa2 do tipo-selvagem 16, 37 4,26 10,02

Estes resultados demonstram claramente que a IFNa-17 mutada com G45R estimula fortemente a libertação de citocina (IFN gama e IL-10) por linfócitos T CD4+ e linfócitos T CD8+ previamente activados por antigénio SEB. Neste teste, a produção de interferão gama por linfócitos T CD4+ é superior na presença de IFNa-17 mutada com G45R do que em presença de IFNa-2 do tipo-selvagem e a produção de interferão gama e IL-10 por linfócitos T CD8+ é superior na presença de IFNa-17 mutada com G45R do que em presença de IFNa-2 do tipo-selvagem. c) Efeito de IFNa-17 mutada com G45R na libertação de citocina por monócitos

Finalmente, a actividade imunomoduladora de IFNa-17 mutada com G45R foi investigada por medição da libertação de citocina por monócitos na ausência ou na presença de um agente tóxico bacteriano (LPS). Este teste foi também executado na presença de IFNa-2 do tipo-selvagem usada como controlo e escolhida como representativa do produto comercial Intron A.

Para tal, foram isoladas células mononucleares do sangue periférico (PBMC) humano de dadores saudáveis e o seu fenótipo foi analisado para determinar a quantidade relativa 67 de células CD64+ CD4dim (CD64 e CD4dim são marcadores para monócitos sanguíneos). Após cultura durante a noite, estes PBMC foram incubados no meio de cultura sozinhos (células não estimuladas) ou na presença de LPS (células estimuladas) . Em cada cultura, foi adicionado 4 pg/mL de IFNa-2 do tipo-selvagem ou IFNa-17 mutada com G45R. Após cultura, as células foram extracelularmente marcadas com anti-CD64 e anti-CD4dim, e intracelularmente marcadas com anticorpos específicos dirigidos contra citocinas de tipo Thl (TNF-alfa), IL-12 e IL-10 .

As células fluorescentes foram analisadas usando software FACScalibur e CellQuest.

Os resultados obtidos indicam que a IFNa-17 mutada com G45R e a IFNa-2 do tipo-selvagem não estimulam libertação de citocinas (IL-10, IL-12 e TNF-alfa) na ausência de LPS.

Em contraste, na presença de LPS, os monócitos libertam citocinas. A libertação de IL-10 e IL-12 por monócitos na presença de LPS é adicionalmente aumentada na presença de IFNa-2 do tipo-selvagem mas não na presença de IFNa-17 mutada com G45R como mostrado na tabela abaixo. Esta tabela representa a libertação de citocina por monócitos na presença de LPS, expressa como percentagem de células CD64+ CD4dim, e a percentagem de células CD4dim CD64+ nas células totais. IL-10 11-12 TNF-a Células CD4d±m CD64+/total Nenhum IFNa 16,21 8,52 13, 88 3,1 IFNal7 G45R 17,47 8,3 40, 92 2,86 68 IFNa2 do tipo- 49, 34 34,48 50,87 2,71 selvagem

Assim, a ausência de efeito sinergético observado na presença de IFNa-17 mutada com G45R e LPS sugere gue a IFNa-17 mutada com G45R pode ter uma acção imunossupressora. EXEMPLO 4. Avaliação de actividade antiproliferativa in vitro de IFNa-17 mutada com G45R na linhagem celular de eritroleucemia TF-1 0 efeito da IFNa-17 mutada com G45R foi também avaliada na linhagem celular de eritroleucemia TF-1. Este teste também foi executado na presença de IFNa-2 do tipo-selvagem usada como controlo e escolhida como representativa do produto comercial Intron A.

Para tal, as células TF-1 foram colocadas em contacto com concentrações crescentes de IFNa-17 mutada ou IFNa-2 do tipo-selvagem (0,001 a 1000 ng/mL) e foi medida a proliferação celular.

Os resultados, apresentados na Figura 2, indicam que a IFNa-17 mutada com G45R tem um efeito antiproliferativo fraco nas células TF-1, e este efeito é similar ao da IFNa-2 do tipo-selvagem, sugerindo que a toxicidade hematológica da IFNa-17 mutada com G45R não é superior do que a da IFNa-2 do tipo-selvagem. EXEMPLO 5. Avaliação da capacidade de IFNa-17 mutada com G45R em induzir a anti-proliferação da linhagem celular de linfoma de Daudi Burkitt humano 69

Estes testes são levados a cabo em duas proteínas IFNa-17 diferentes, designadamente IFNa-17 mutada com G45R e IFNa-17 natural do tipo-selvagem. As células (a linhagem celular de linfoma de Daudi Burkitt humano, em seguida chamadas "células Daudi") previamente cultivadas num meio RPMI 1640 (suplementado com 10% de soro de feto de bezerro e L-glutamina 2 mM) são inoculadas em placas de 96 poços à densidade celular de 4xl04 células/poço.

Em cada poço, as células Daudi são colocadas em contacto com concentrações crescentes de: proteínas ou IFNa-17 natural do tipo-selvagem ou IFNa-17 mutada com G45R.

As concentrações de IFNa-17 estudadas (proteína natural do tipo-selvegem ou mutada) estão incluídas entre 0,003 pM e 600 nM (concentrações finais nos poços).

As células Daudi são então incubadas durante 66 h a 37°C sob 5% C02 após o que o reagente Uptiblue (Uptima) é adicionado às culturas. A taxa de proliferação celular é quantificada por medição da fluorescência emitida a 590 nm (excitação 560 nm) após um período de incubação adicional de 4 horas. A actividade antiproliferativa de IFNa-17 do tipo-selvagem ou de IFNa-17 mutada com G45R é baseada nas medições do IC50, correspondendo à concentração de proteína IFNa-17, em picomolar (pM), que inibe 50% do crescimento celular.

Foram levadas a cabo quatro experiências similares, cada uma repetida quatro vezes. Para cada experiência, os valores IC50 são mencionados na tabela seguinte: 70

Experiência IC50 (pM) Razão IFNa-17 do tipo-se1vagem IFNa-17 G45R 1 0,32 1,51 5 2 0, 60 7,20 12 3 0,22 1,53 7 4 0,81 10, 99 14 0 valor médio de IC50 medido para a IFNa-17 do tipo-selvagem é de 0,49 pM, enquanto que o valor médio de IC50 medido para a IFNa-17 mutada com G45R é de 5,31Pm. Assim, a razão média que corresponde ao valor de IC50 para a IFNa-17 mutada sobre o valor para a IFNa-17 natural do tipo-selvagem alcança 10,80 (com um desvio padrão de 3,46).

Este teste demonstra que a actividade antiproliferativa celular é fortemente inibida (aproximadamente numa gama compreendida entre 5 e 15 vezes menos) no caso da IFNa-17 mutada com G45R por comparação com a IFNa-17 do tipo-selvagem.

Também foram executadas experiências independentes similares com IFNa-2 do tipo-selvagem de forma a comparar o efeito antiproliferativo da IFNa-17 mutada com G45R na proliferação de células Daudi com o efeito da IFNa-2 do tipo-selvagem. Para tal, as células Daudi foram cultivadas na presença de concentrações de IFNa-17 mutada com G45R ou IFNa-2 do tipo-selvagem na gama de 0,001 a 10 ng/mL. 71

Foram levadas a cabo três experiências similares. Os resultados de uma experiência representativa são apresentados na Figura 3.

Estes resultados demonstram que a actividade antiproliferativa celular da IFNa-17 mutada com G45R na linhagem celular de Daudi Burkitt é superior à da IFNcx-2 do tipo-seivagem.

Exemplo 6. Avaliação da actividade antiviral de IFNa-17 mutada com G45R

Os IFNs desempenham um papel importante na defesa antiviral. A actividade antiviral de IFN é em parte devida a sistemas enzimáticos induzidos por IFNs, tais como: A oligoadenilato sintetase 2' 5', uma enzima que catalisa a síntese de oligómero adenosina. Estes oligómeros activam a RNase L, uma endoribonuclease que destrói o ARN virai uma vez activada.

As proteínas Mx (GTPases) que inibem a síntese e/ou a maturação de transcritos virais. Esta actividade é principalmente exercida no vírus influenza. A proteína PKR (ou cinase p68) que é activada pelo ARN de dupla cadeia. A PKR activada inibe a síntese proteica. A actividade antiviral de IFNs também é induzida por outros mecanismos tais como, no caso de retrovírus, a inibição da entrada de partículas virais nas células, a replicação, a 72 ligação, a saída das partículas e o poder infeccioso de partículas virais.

Finalmente, os IFNs exercem uma actividade antiviral indirecta por modulação de certas funções do sistema imune, em particular por favorecimento da resposta a mediação celular (incluindo um aumento das moléculas MHC de classe I e II, aumento de produção de IL-12 e IFN-gama, aumento das actividades de CTL, entre outros). A actividade antiviral de IFNa-17 mutada com G45R foi avaliada tanto in vitro em cultura celular com in vivo em modelo de ratinho. Ambos os testes foram executados em paralelo com IFNa-2 do tipo-selvagem usada como controlo e escolhida como representativa do produto comercial Intron A. a) Actividade antiviral in vitro em cultura celular

Este ensaio permite a avaliação da actividade antiviral de IFNa-17 mutada com G45R e IFNa-2 do tipo-selvagem em cultura celular usando o vírus de estomatite vesicular (VSV).

Para tal, são cultivadas células epiteliais humanas WISH durante 24 horas na presença de concentrações decrescentes de IFNa-17 mutada com G45R ou IFNa-2 do tipo-selvagem. Em seguida, as células são infectadas pelo vírus de estomatite vesicular (VSV) durante 24 a 48 horas adicionais e é medida a lise celular. 0 efeito antiviral dos diferentes IFNa testados é determinado por comparação do valor de IC50 correspondendo à concentração de IFN que inibe 50% da lise celular induzida pelo VSV. 73

Foi executada uma experiência semelhante duas vezes, e os valores de IC50 medidos numa experiência representativa são apresentados na tabela seguinte: IFNcx-2 do Tipo selvagem IFNa-17 mutado com G45R IC50 (ng/mL) 4 2

Assim, em cultura celular infectada com VSV, a IFNa-17 mutada com G45R exibe uma actividade antiviral, sendo esta actividade antiviral superior do que a da IFNcx-2 do tipo-selvagem. b) Actividade antiviral in vivo em modelo de ratinho

Este teste in vivo é executado em modelo de ratinho EMCV (virus da Encefalomiocardite).

Os IFNs humanos exibem actividade antiviral dependente da dose no ratinho que é em geral 100 a 1000 vezes inferior que a exibida pela mesma quantidade de IFN de ratinho (Meister et al. (1986). J. Gen. Virol. 67, 1633-1644). A injecção intraperitoneal de ratinhos com virus de Encefalomiocardite (EMCV) dá origem a uma doença fatal rapidamente progressiva caracterizada por envolvimento do sistema nervoso central e encefalite (Finter NB (1973). Front Biol. 2: 295-360). Mostrou-se que ambos os interferões-α de ratinho e humano são eficazes na protecção de ratinhos contra infecção por EMCV letal (Tovey e Maury (1999). J. IFN Cytokine Res. 19: 145-155). 74

Grupos de 20 ratinhos Swiss, com seis-semanas de idade foram infectados via intraperitoneal (ip) com 100 x LD50 EMCV e tratados uma hora depois, e em seguida uma vez diariamente durante 3 dias com preparações de 2 yg de IFNa-17 mutada com G45R ou IFNa-2 do tipo-selvagem. Foi executado um grupo de controlo com animais tratados apenas com excipiente. Os animais foram seguidos diariamente para sobrevivência durante 21 dias.

Os resultados são apresentados na Figura 4 e indicam que a taxa de sobrevivência relativa dos ratinhos que foram tratados com IFNa-17 mutada com G45R é muito superior à taxa de sobrevivência dos ratinhos não-tratados, e ainda superior à observada para os ratinhos que foram tratados com IFNa-2 do tipo-selvagem. Estes dados demonstram a forte actividade antiviral da IFNa-17 mutada com G45R in vivo em modelo de ratinho.

Todos estes resultados demonstram que a IFNa-17 mutada com G45R possui propriedades biológicas únicas. 75

LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110>Genodyssee <120> Novos polinucleótidos e polipéptidos Do Gene <130> IFN*-17 <140> <141> <160>5 <170>PatentIn versão 2.1

<210>1 <211>1873 <212 >ADN <213>Homo Sapiens <400>1 agcttcatac actaagagaa aaattttaaa aaattattga ttcttatttt caggagtttt 60 gaatgatcag gtatgtaatt atattcatat tattaatgtg tatttatata gatttttatt 120 ttgcacaggt actttgatac aaaatttaca tgaacaaatt acactaaaag ttatttcaca 180 aatatactta tcaagttaag ttaaatgcaa tagctttaaa cttagatttt aatttaactt 240 tttctatcat cattctttac attaaataaa aaaagcaaac tttatagttt ttatctataa 300 agtagaggta tacatagtat acataaatac atatgccaaa tctgtgttat taaaacttca 360 tgaagatttc gattacaaaa aaataccgta aaagactttg agtgcagaag aaaaatgggc 420 aatgatgaaa aacaatgaaa aacattctta aacacatgta gagagtgcaa aaagaaagca 480 aaaacagaca tagaaagtaa aactagggca tttagaaaat ggaaattagt atgttcacta 540 tttaaggcct atgcacagag caaagtcttc agaaaaccta gaggccaaag ttcaaggtta 600 76 gtagcctagc gctggtgctc cctgggtaat ctgcctgaag ccagaagact cagcacagag actttaccag gactcccctg tctttatcta catgagatct actggttcaa tcctccattt ttttcagcag accatgctga ttaaattatt tatgttcttc aaatttcttg cttaaaaata acatttttct cagtccctgt atgctgaatt ttc aacatttgca agctacaaat aggagggcct gacagacatg caagccatct gactcatctg caactgaata atgaatgagg acagagaaga ctctcttttt catggcaatg caaagactca tgtaaagaag tgtctctgtt tttttatgta atatttagcc tgtttgttta tatgatttaa gttactggtt tctcttgtat aatatcagtg acatcccaat ccatctgttc tgatactcct actttggact ctgtcctcca ctgcttggga acctggaagc actccatcct aatacagccc caacaaactt atcctgattg cttctataac cgtcgtgtat catctattta atatcatgtg aatatattaa ttctttaaga ttaagttatc atatgttgcc ctttgatttt atgctaactg ggccctgtcc tctaggctgt ggcacaaatg tccccaggag tgagatgatc acagagcctc atgtgtgata ggctgtgagg ttgtgcctgg gcaaaaaata actaatacat caccacgagt acctgtgcag tttaaatatt tacctttaca tttccttttt taaaatgtcg tatcataatt ttcaagatat tgtcaggaaa ctataatgtg ttttctttac gatctgcctc ggaagaatct gagtttgatg cagcagacct ctagaaaaat caggaggttg aaatacttcc gaggttgtca ttaaggagga tatctcacac tgaatcaaaa gcactagtac tatttaatta ttgtggtgaa cattaaattt aggctgactt ttattcaagt aaacgtgaac gaaatctaaa aggaagtaaa 77 <210>2 <211>189

<212>PRT <213>Homo Sapiens <400>2

Met Ala Leu Ser Fen Ser Leu Leu Met Ala Vai Leu Vai Leu Ser Tir 1 5 10 15 Lis Ser Ile Cis Ser Leu Gli Cis Asp Leu Pro Gin Tre His Ser Leu 20 25 30 Gli Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gin Met Gli Arg Ile Ser 35 40 45 Pro Fen Ser Cis Leu Lis Asp Arg His Asp Fen Gli Leu Pro Gin Glu 50 55 60 Glu Fen Asp Gli Asn Gin Fen Gin Lis Tre Gin Ala Ile Ser Vai Leu 65 70 75 80 His Glu Met Ile Gin Gin Tre Fen Asn Leu Fen Ser Tre Glu Asp Ser 85 90 95 Ser Ala Ala Trp Glu Gin Ser Leu Leu Glu Lis Fen Ser Tre Glu Leu 100 105 110 Tir Gin Gin Leu Asn Asn Leu Glu Ala Cis Vai Ile Gin Glu Vai Gli 115 120 125 Met Glu Glu Tre Pro Leu Met Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg 130 135 140 Lis Tir Fen Gin Arg Ile Tre Leu Tir Leu Tre Glu Lis Lis Tir Ser 145 150 155 160 Pro Cis Ala Trp Glu Vai Vai Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Leu Ser 165 170 175 Fen Ser Tre Asn Leu Gin Lis Ile Leu Arg Arg Lis Asp 180 185 <210>3 <211>57

<212>PRT <213>Homo Sapiens <400>3

Met Ala Leu Ser Fen Ser Leu Leu Met Ala Vai Leu Vai Leu Ser Tir 15 10 15 78

Lis Ser Ile Cis Ser Leu Gli Cis Asp Leu Pro Gin Tre His Ser Leu 20 25 30

Gli Asn Arg Arg Ala Leu Ile Leu Leu Ala Gin Met Gli Arg Ile Ser 35 40 45

Pro Fen Ser Cis Leu Lis Asp Arg Gin 50 55

<210>4 <211>20 <212 >ADN <213>Homo Sapiens <400>4 ttcaaggtta cccatctcaa 20

<210>5 <211>21 <212 >ADN <213>Homo Sapiens <400> 5 ttagtcaatc aggatcattg c 21 25-10-2006 79

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Polinucleótido isolado compreendendo: a) uma sequência nucleotídica tendo pelo menos 95% de identidade com a sequência nucleotídica SEQ ID NO 1, ou a sua região de codificação, e compreendendo pelo menos um SNP que consiste em g771c e 808Ins(a); ou b) uma sequência nucleotídica complementar à sequência nucleotídica segundo a).
2. Polinucleótido isolado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a sequência nucleotídica segundo a) ter pelo menos 99% de identidade com a sequência nucleotídica SEQ ID NO 1.
3. Polinucleótido isolado de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por compreender o SNP g771c.
4. Polinucleótido isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por codificar um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2, tendo o SNP de codificação G45R.
5. Polinucleótido isolado, caracterizado por codificar um polipéptido compreendendo a sequência de aminoácidos SEQ ID NO 3.
6. Polinucleótido isolado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a dita sequência de aminoácidos conter o SNP de codificação G45R.
7. Uso de um polinucleótido isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou uma sequência do dito polinucleótido isolado composto de 10 a 40 nucleótidos, para identificar, hibridizar e/ou amplificar um polinucleótido tendo 90 a 100% de identidade com a 1 sequência nucleotídica SEQ ID NO 1, ou a sua sequência de codificação, desde que cada uma destas sequências compreenda pelo menos um dos seguintes SNPs: g771c, 808Ins(a).
8. Uso de polinucleótido isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, ou uma sequência do dito polinucleótido isolado composto de 10 a 40 nucleótidos, para a genotipagem de um polinucleótido tendo 90 a 100% de identidade com a sequência nucleotídica SEQ ID NO 1, ou a sua sequência de codificação, desde que cada uma destas sequências compreenda pelo menos um dos seguintes SNPs: g771c, 808Ins(a).
9. Vector recombinante, caracterizado por compreender um polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
10. Célula hospedeira, caracterizado por compreender um vector recombinante de acordo com a reivindicação 9.
11. Método para separar um polipéptido, compreendendo cultivar uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 10 num meio de cultura e separar o dito polipéptido do meio de cultura.
12. Polipéptido isolado caracterizado por ser codificado pelo polinucleótido isolado de qualquer uma das reivindicações 1 a 6.
13. Polipéptido isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade com: a) a sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2; ou b) a sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos incluídos entre as posições 24 a 189 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2; 2 desde que a sequência de aminoãcidos segundo a) ou b) contenha o SNP G45R.
14. Polipéptido isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade com: a) a sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2; ou b) a sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos incluídos entre as posições 24 a 189 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2; desde que a sequência de aminoácidos segundo a) ou b) contenha o SNP G45R.
15. Polipéptido isolado compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 99% de identidade com: a) a sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2; ou b) a sequência de aminoácidos compreendendo os aminoácidos incluídos entre as posições 24 a 189 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2; desde que a sequência de aminoácidos segundo a) ou b) contenha o SNP G45R.
16. Polipéptido isolado compreendendo os aminoácidos 24 a 189 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2, e tendo o SNP G45R.
17. Polipéptido isolado compreendendo os aminoácidos 24 a 57 da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 3.
18. Polipéptido de acordo com a reivindicação 17 tendo o SNP de codificação G45R.
19. Anticorpo imuno-específico para um polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18. 3
20. Método para identificar um agente entre um ou mais compostos a serem testados que activam ou inibem a actividade de um polipéptido isolado compreendendo a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 2 e tendo o SNP G45R, compreendendo o dito método: a) facultar células hospedeiras compreendendo o vector recombinante de acordo com a reivindicação 9; b) colocar em contacto as ditas células hospedeiras com os ditos compostos a serem testados, c) determinar o efeito activador ou inibidor na actividade do dito polipéptido pelo que o dito agente activador ou inibidor é identificado.
21. Método para identificar um agente entre um ou mais compostos a serem testados que activam ou inibem a actividade de um polipéptido isolado compreendendo a totalidade ou parte da sequência de aminoácidos SEQ ID NO 3, possivelmente também tendo o SNP de codificação G45R, compreendendo o dito método: a) facultar células hospedeiras compreendendo o vector recombinante de acordo com a reivindicação 9; b) colocar em contacto as ditas células hospedeiras com os ditos compostos a serem testados, c) determinar o efeito activador ou inibidor na actividade do dito polipéptido pelo que o dito agente activador ou inibidor é identificado.
22. Método para analisar as características biológicas de um indivíduo, compreendendo executar pelo menos um dos passos seguintes: a) Determinar a presença ou ausência do polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 no genoma de um indivíduo,· 4 b) Determinar o nível de expressão do polinucleótido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 num indivíduo; c) Determinar a presença ou ausência do polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 num indivíduo; d) Determinar a concentração do polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 num indivíduo; ou e) Determinar a funcionalidade do polipéptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18 num indivíduo.
23. Agente terapêutico compreendendo um ou mais compostos seleccionados do grupo que consiste em: polinucleótido isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6; vector recombinante de acordo com a reivindicação 9; célula hospedeira de acordo com a reivindicação 10, compreendendo o dito vector recombinante; polipéptido isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18; anticorpo de acordo com a reivindicação 19.
24. Uso de um ou mais compostos seleccionados do grupo que consiste em: polinucleótido isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6; vector recombinante de acordo com a reivindicação 9; célula hospedeira de acordo com a reivindicação 10, compreendendo o dito vector recombinante; polipéptido isolado de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 18; anticorpo de acordo com a reivindicação 19 para a preparação de um medicamento para prevenir ou tratar uma doença seleccionada do grupo que consiste em cancros e tumores, doenças infecciosas, doenças imunológicas e § auto-imunológicas relacionadas, doenças cardiovasculares, doenças metabólicas, doenças do sistema nervoso central, desordens relacionadas com tratamentos de quimioterapia, cicatrização de feridas, anemia em pacientes dialisados, e/ou osteoporoses.
25. Uso da reivindicação 24, em que as ditas doenças infecciosas compreendem infecções virais incluindo hepatites B e C crónicas e VIH/SIDA, pneumonias infecciosas, e doenças venéreas, tais como verrugas genitais.
26. Método para determinar associações estatisticamente relevantes entre pelo menos um SNP seleccionado do grupo que consiste em g771c e 808Ins(a), no gene IFN»-17, e uma doença ou resistência a doença compreendendo: a) Proceder à genotipagem de um grupo de indivíduos; b) Determinar a distribuição da dita doença ou resistência a doença dentro do dito grupo de indivíduos; c) Comparar os dados de genótipos com a distribuição da dita doença ou resistência a doença; e d) Analisar a dita comparação para associações estatisticamente relevantes.
27. Método para diagnosticar ou determinar um prognóstico de uma doença ou uma resistência a doença compreendendo detectar in-vitro pelo menos um SNP seleccionado do grupo que consiste em g771c e 808Ins(a), no gene IFN·-17 . 25-10-2006