ES2265653T3

ES2265653T3 - Variantes del factor neurotrofico ciliar humano (hcntf) con un intervalo de accion diferente del de la molecula de tipo silvestre.

Info

Publication number: ES2265653T3
Application number: ES97932007T
Authority: ES
Inventors: Ralph Laufer; Annalise Di Marco
Original assignee: Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P Angeletti SpA
Current assignee: Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P Angeletti SpA
Priority date: 1996-07-10
Filing date: 1997-07-10
Publication date: 2007-02-16
Anticipated expiration: 2017-07-10
Also published as: DE69736241T2; JP3329826B2; CA2260296A1; WO1998001149A2; ATE331734T1; US6756357B1; IT1284867B1; ITRM960492A1; WO1998001149A3; EP0936919B1; JP2000507271A; IL127959A0; EP0936919A2; DE69736241D1; AU3557697A; AU719086B2; CA2260296C; ITRM960492A0

Abstract

VARIANTES DE FACTOR NEUROTROFICO CILIAR HUMANO QUE SE CARACTERIZAN POR LA SUSTITUCION DE FENILALANINA 152 Y/O DE LISINA 155 POR ALANINA. ESTAS VARIANTES TIENEN PROPIEDADES BIOLOGICAS QUE LAS HACEN IMPORTANTES COMO PRINCIPALES PRINCIPIOS ACTIVOS DE MEDICAMENTOS PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES Y DE PATOLOGIAS QUE AFECTAN AL SISTEMA NERVIOSO U OTRAS PATOLOGIAS QUE IMPLIQUEN LA RESPUESTA DE LAS CELULAS AL CNTF. LA FIGURA 2 ILUSTRA LOS RESULTADOS DE LA ESTIMULACION DE LA SECRECION DE HAPTOGLOBINA DE CELULAS HEPG2 POR EL CNTF Y LAS VARIANTES DESCRITAS EN LA PRESENTE INVENCION.

Description

Variantes del factor neurotrófico ciliar humano (hCNTF) con un intervalo de acción diferente del de la molécula de tipo silvestre.

La presente invención se refiere al campo de la neurología. Son objeto de la invención, mutantes del factor neurotrófico ciliar humano (hCNTF) que muestran un intervalo de acción diferente del de la molécula de tipo silvestre. Estas variantes se caracterizan por el hecho de que tienen una capacidad fuertemente reducida para interaccionar con el receptor LIF (LIFR). Como consecuencia, tienen una actividad biológica extremadamente reducida sobre la mayoría de las células que responden a CNTF. Sin embargo, mantienen una alta actividad biológica sobre ciertas células neuronales, probablemente por causa de la expresión última de grandes cantidades de LIFR y/o receptor \alpha de CNTF (CNTFR\alpha) unidos a la membrana. Esta propiedad puede usarse para reducir los efectos secundarios periféricos resultantes de la administración de CNTF.

El factor neurotrófico ciliar humano (hCNTF) es una neurocitoquina de 23 kDa. Se expresan en las células de Schwann y en los astrocitos, y ejerce potentes efectos estimuladores sobre la supervivencia y diferenciación de diversas células neuronales y gliales (tanto in vitro como in vivo), incluyendo neuronas motoras, neuronas sensoriales, neuronas simpáticas, neuronas del hipocampo y oligodendrocitos (1, 2). El papel fisiológico de CNTF podría parecer que es el de actuar como un factor implicado en la prevención de la degeneración neuronal después de una lesión (2). Esta acción protectora, que el CNTF ha mostrado in vivo en muchas células nerviosas, ha dado esperanzas para su aplicación clínica en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas humanas (3).

Además de su acción neuroprotectora, sin embargo, se ha observado que el CNTF provoca también in vivo una amplia diversidad de efectos, constituidos por la pérdida de peso y anorexia, respuesta de fase aguda y fiebre. Hay por lo tanto, un problema en el uso farmacológico de CNTF por causa de estos efectos secundarios.

Al igual que otros factores del crecimiento, y en particular citoquinas, el CNTF ejerce sus acciones a través de la unión, ensamblaje secuencial, y activación de un complejo receptor de múltiples subunidades (4, 5). El complejo receptor del que CNTF forma parte, se compone de seis subunidades (de forma similar al caso de la interleuquina 6) (6). El complejo se compone de dos moléculas de CNTF, dos moléculas específicas de receptor-\alpha, que forman un enlace de baja afinidad con el CNTF (CNTFR\alpha) y dos subunidades de transducción de la señal (LIFR y gp130) (7). Los sitios del CNTF implicados en la unión con gp130 y con el receptor específico pueden identificarse por analogía con la interleuquina 6 (8, 9). El sitio de enlace para CNTF y el receptor LIF (LIFR) todavía no se ha identificado. La Solicitud de Patente de Publicación Internacional WO 96/01319 (Cancer Research Campaign Technology Limited) describe proteínas que son variantes del factor inhibidor de la leucemia humano (hLIF) con afinidades de unión al receptor LIF y al receptor gp130 alteradas.

La alineación múltiple de secuencias de CNTF se ser humano, de conejo, de rata y de ratón, con otras secuencias de citoquina que se unen al receptor LIF (tales como LIF, oncostatina M y CT-1) revela la presencia de dos restos amino conservados dentro del diseño estructural conocido como D1. Los dos aminoácidos son fenilalanina en la posición 152 y lisina en la posición 155. Como se mostrará con más detalle en los siguientes ejemplos, los dos aminoácidos forman parte del sitio de enlace del LIFR. En base a esta idea, se generaron mutantes de CNTF en los que los aminoácidos se sustituyeron por alanina, y las secuencias de, tanto la molécula de tipo silvestre (SEC ID Nº: 1) como los mutantes objeto de la presente invención, se dan en la Tabla 1 (por razones de simplicidad no se da la secuencia completa de aminoácidos, sólo las posiciones de aminoácidos de 152 a 167). Aunque la bibliografía indica que uno de los dos mutantes (Lys155Ala/CNTF) es completamente inactivo sobre neuronas de gallina (10), se evaluó la actividad biológica de los dos mutantes, y se demostró que, contrariamente a los informes previos (10), actúan como potentes agonistas sobre el receptor de membrana de ciertas células neuronales, mientras que su actividad biológica se reduce fuertemente cuando están unidas al receptor LIF o al receptor soluble de CNTF. Una posible interpretación de este fenómeno puede ser la siguiente: puesto que los efectos biológicos de estas moléculas dependen de las concentraciones de CNTFR\alpha y receptor LIF, se amplifican cuando la concentración local de receptor es muy alta, como es el caso en receptores que están unidos a la membrana celular de ciertas poblaciones de células neuronales.

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El descubrimiento de que estas moléculas ejercen una actividad biológica sobre las células neuronales que expresan receptores unidos a membrana y que, por el contrario muestran una actividad biológica extremadamente débil cuando interaccionan con el receptor soluble, indica que las moléculas que están modificadas en las posiciones indicadas, pueden usarse para reacción específica con células neuronales sin causar efectos secundarios periféricos mediados por el enlace al receptor soluble.

Son por lo tanto, objeto de la presente invención variantes del factor neurotrófico ciliar humano (hCNTF), caracterizadas por la sustitución de la fenilalanina 152 y/o de la lisina 155 por alanina y por el hecho de que comprenden en particular una secuencia de aminoácidos elegida entre las secuencias indicadas en SEC ID Nº: 3 a SEC ID Nº: 5 y SEC ID Nº: 7. La Solicitud de Patente Europea EP 0749980 A1 (Sumitomo Pharmaceuticals Co. Ltd.) describe una modificación de un hCNTF, en la que el resto de aminoácido de la secuencia de aminoácidos que corresponde al menos al resto de aminoácido 153 de la secuencia de aminoácidos de un hCNTF natural, se ha sustituido por otro resto de aminoácido.

Las moléculas representadas por SEC ID Nº: 3 a SEC ID Nº: 5 tienen una capacidad reducida para enlazarse al receptor LIF y para activarlo por medio del CNTFR\alpha soluble, y por el contrario actúan como agonistas del CNTFR de ciertas células neuronales. La molécula representada por SEC ID Nº: 7 actúa como un antagonista competitivo para el enlace del receptor CNTFR\alpha.

La presente invención alcanza también preparaciones farmacéuticas que hacen uso de estas moléculas para el tratamiento de enfermedades o patologías del sistema nervioso, o de otras patologías que implican células que responden a CNTF, incluyendo enfermedades o patologías del sistema nervioso que causan daño al propio sistema nervioso.

La Tabla 2 muestra los datos relativos a las actividades de unión al receptor CNTFR\alpha de los diversos mutantes de CNTF. Se determinó la concentración de proteína necesaria para inhibir al 50% (IC50) la unión de DNTF biotinilado o MUT-DH biotinilado al CNTFR\alpha inmovilizado. La unión relativa es la proporción (IC50 de CNTF)/(IC50 de proteína ensayada).

TABLA 2

Proteína	Unión Relativa
SEC ID Nº: 1*	1,0
SEC ID Nº: 2*	41\pm4
SEC ID Nº: 3	32\pm11
SEC ID Nº: 4	42\pm2
SEC ID Nº: 5	0,9\pm0,1
SEC ID Nº: 6*	1,0\pm0,1
SEC ID Nº: 7	51\pm19
* Estas secuencias se citan solamente para comparación.

La Figura 1 muestra los resultados que se refieren a los ensayos de unión de varios complejos receptores, de los que forman parte las moléculas variantes de CNTF que contienen las subunidades gp130 y LIFR. Cada ensayo se realizó para dos cantidades diferentes de moléculas variantes (1 ó 0,1 mg, como se indica en el encabezamiento de cada columna). En cada figura, la última columna representa el control negativo en el que el ensayo se realizó en ausencia de moléculas variantes. (A) el ensayo de unión para los complejos que contenían las variantes originales MUT-DH, Phe152Ala/MUT-DH, Lys155Ala/MUT-DH, Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH y el CNTF de tipo silvestre (indicados como MUT-DH, AK/DH, FA/DH, AA/DH y wt, respectivamente) y el CNTFR\alpha con la subunidad del receptor gp130. (B) Ensayo de unión para los complejos que contenían las variantes MUT-DH, Phe152Ala/MUT-DH, Lys155Ala/MUT-DH, Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH y el CNTF de tipo silvestre (indicados como MUT-DH, AK/DH, FA/DH, AA/DH y wt, respectivamente) y el CNTFR\alpha con la subunidad del receptor LIFR. (C). Ensayo de unión para los complejos que contenían las variantes MUT-DH, Phe152Ala/MUT-DH, Lys155Ala/MUT-DH, Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH y el CNTF de tipo silvestre (indicados como MUT-DH, AK/DH, FA/DH, AA/DH y wt, respectivamente) y el complejo LIAR/CNTFR\alpha con la subunidad del receptor gp130.

La Figura 2 muestra los resultados de la estimulación de la producción de haptoglobina en las células HepG2 por CNTF y variantes de CNTF. Los experimentos se realizaron en ausencia (A) o en presencia de receptor CNTFR\alpha soluble a una concentración de 800 ng/ml (B). Las proteínas ensayadas fueron: CNTF (\medcirc), Lys155Ala/CNTF (FA-CNTF) (\Box), Lys155Ala/MUT-DH (FADH-CNTF) (\blacksquare), Phe152Ala/MUT-DH (AKDH-CNTF) (\ding{115}) y Phe152Ala/Lys155Ala/
MUT-DH (AADH-CNTF) (\ding{116}). Los datos se expresan como un porcentaje del efecto máximo de CNTF para normalizar las diferencias entre los diferentes experimentos.

La Figura 3 muestra los resultados de la estimulación de la actividad de colina acetil transferasa (Cat) en las células IMR-32. Las proteínas ensayadas fueron: CNTF (\medcirc), FA-CNTF) (\Box), FADH-CNTF) (\blacksquare), AKDH-CNTF) (\ding{115}), y AADH-CNTF) (\ding{116}). Los datos se expresan como un porcentaje del efecto máximo de CNTF para normalizar las diferencias entre los diferentes experimentos.

La Figura 4 muestra las propiedades antagonistas del mutante Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH en las células HepG2. La Figura 4A muestra el efecto de aumentar las dosis de CNTF sobre la actividad de la colina acetil transferasa (Cat) en las células IMR-32 en ausencia (\bullet) y en presencia de las siguientes concentraciones de Phe152Ala/Lys155Ala/
MUT-DH (en mg/ml): 0,01 (\medcirc), 0,1 (\blacksquare), 1 (\Box), 10 (\ding{115}). La Figura 4B muestra el efecto de aumentar las concentraciones de Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH sobre la respuesta inducida por 3 ng/ml de CNTF.

Hasta ahora se ha dado una descripción general de la presente invención. Con la ayuda de los siguientes ejemplos, se dará ahora una descripción más detallada de realizaciones específicas, para dar una mejor comprensión de los objetos, características, ventajas y procedimientos operativos de la presente invención.

Depósitos

Bacterias TOP10 de E. coli, transformadas usando los plásmidos pRSET-AKDH-CNTF, pRSET-FADH-CNTF, pRSET-AADH-CNTF, respectivamente, que contenían las secuencias de nucleótidos que codifican, respectivamente, la variante AKDH-CNTF, que contiene la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 3, la variante FADH-CNTF, que contiene la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 4, y la variante AADH-CNTF, que contiene la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 6, se presentaron el 24 de junio de 1996, con la National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB), Aberdeen, Scotland, UK, con los números de acceso 40809, NCIMB 40810 y NCIMB 40811.

Ejemplo 1 Construcción y caracterización de mutantes de CNTF Construcción de mutantes

Se introdujeron mutaciones en el CNTF humano o en la molécula variante MUT-DH (Ser166Asp/Gln167His/
CNTF) mediante PCR inversa, usando un procedimiento conocido en la técnica (11), usando como plantillas los vectores pRSET-CNTF o pRSET-MUT-DH. Para las reacciones de PCR se usaron los siguientes cebadores:

cebador sentido usado para todos los mutantes

: 5'-CTGTGGGGCCTAAAGGTGCTG-3'

cebador antisentido para mutantes Phe152Ala (el codón correspondiente a Ala152 se indica en negrita)

: 5'-CGCCTTCTCAAAGAGACCACCATCTCCAAC-3'

cebador inverso para los mutantes Phe152Ala /Lys155Ala (los codones correspondientes a Ala152 y Ala155 se indican en negrita)

: 5'-CGCCTTCTCAGCGAGACCACCATCTCCAAC-3'

Las reacciones de PCR se realizaron usando la plantilla de ADN (pRSET-CNTF o pRSET-MUT-DH; 10 fmol) y los cebadores (cada uno 1 mM) en 100 ml de volumen de reacción que contenían 2 unidades de Taq ADN polimerasa (Boehringer Mannheim) y 10 ml de tampón para una reacción de PCR 10x. La amplificación se realizó durante 25 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 45ºC y 12 minutos a 72ºC. Los cuatro desoxinucleótidos (250 mM) y 20 unidades de polimerasa I de E. coli "fragmento de Klenow" se añadieron a 95 ml de la mezcla amplificada, y la mezcla de reacción se incubó a 37ºC durante 30 minutos. El ADN se aisló usando el sistema de purificación "Wizard™ PCR preps" y se fosforiló mediante incubación con 20 unidades de polinucleótido quinasa de T4 (Promega) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El producto se corrió después sobre gel de agarosa (0,7%) y se purificó después usando un kit Qiaex (Qiagen), después se le hizo experimentar una reacción de ligasa usando 12 unidades de ligasa de T4 a 16ºC durante 20 horas. La mezcla de reacción se usó para transformar células competentes de E. coli de la cepa HB2151. Se recuperó el ADN de las células bacterianas y la identidad de las regiones que codificaban los mutantes de CNTF se estableció secuenciando el ADN usando el protocolo Sequenase de USB.

Se descubrió que la secuencia que codifica Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH (AADH-PCR1), contenía dos mutaciones adicionales (Ala70Thr/Val146Gly). Para corregir estas mutaciones y volver a la secuencia original se usó la siguiente estrategia: para eliminar la mutación Val146Gly se amplificó un fragmento NcoI/PstI que comprendía la secuencia codificante de CNTF desde la posición 1 a la posición 163 usando el ADN de AADH-PCR1 como plantilla, junto con los siguientes cebadores:

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 sentido: \+
5'-GTCACCATGGCTTTCACAGAGCATTCACCG-3'\cr
 antisentido: \+
5'-AGCTCCTGCAGCACCTTTAGGCCCCACAGCGCCTTCTCAGCGAGACCACCATCTCC AAC \cr
 \+  \hskip0.3cm  ATTAAT  -  3' (el codón para
Val146 se indica en
negrita).\cr}

La reacción de PCR se continuó durante 30 ciclos (94ºC durante 130 segundos; 50ºC durante 130 segundos; 72ºC durante 190 segundos) usando 2,5 unidades de polimerasa pfu clonada (Stratagene). El producto de reacción se digirió con las enzimas NcoI y PstI, sometidas a electroforesis sobre gel de agarosa al 0,7% y purificadas usando el sistema de purificación "Wizard™ PCR preps DNA" (Progema). El fragmento se subclonó después en el vector pRSET-MUT-DH digerido con NcoI/PstI, obteniendo de este modo la construcción AADH-PCR2. Para eliminar la mutación Ala70Thr, se digirió ADN de AADH-PCR2 con HindIII y el fragmento resultante (que va desde el resto en posición 79 al resto en posición 200 del CNTF, y por lo tanto excluye la mutación en la posición 70) se subclonó en un vector pRSET-CNTF digerido con HindIII. El hecho de que la secuencia verdaderamente codifica Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH se confirmó mediante secuenciación directa de la secuencia de ADN.

La expresión de la proteína y el aislamiento de los cuerpos de inclusión bacterianos, se consiguieron usando el siguiente procedimiento: los vectores pREST-CNTF y variante de pREST, se usaron para transformar células de E. coli de la cepa BL21 (DE3) LysE (genotipo sin SupE). Los transformantes se agitaron a 37ºC en un litro de caldo Luria que contenía 0,1 mg/ml de ampicilina a un A_{600} de 0,8. Posteriormente, se añadió isopropiltiogalactósido (0,4 mM) y se continuó la incubación durante 3 horas más a 37ºC. Las bacterias se recogieron después mediante centrifugación y se resuspendieron en 2 ml por gramo de perlas en tampón A (Tris-HCl 100 mM, pH 7,5, EDTA 50 mM, PMSF 1mM, leupeptina 10 mg/ml). A esto se añadieron 0,5 mg/ml de lisozima y sacarosa al 30% p/v. La suspensión se incubó durante 1 hora a 30ºC. Después de la adición de un volumen de tampón A, las bacterias se lisaron pasandolas dos veces sucesivamente a través de la "French Press" a una presión de 800 bar. Los cuerpos de inclusión se aislaron mediante centrifugación a 12000 x g durante 30 minutos. Las perlas se resuspendieron en una solución de cloruro de guanidina 2 M y se lavaron tres veces usando la misma solución, Las perlas finales se resuspendieron en 5 ml de solución de cloruro de guanidina 8 M y se diluyeron inmediatamente 4 veces en tampón A. Después de centrifugación a 12000 x g durante 30 minutos, el sobrenadante se dializó a 4ºC contra Tris-HCl 10 mM, EDTA 5 mM, DTT 0,1 mM pH 8, tres veces a concentraciones en disminución de cloruro de guanidina (1 M, 0,5 M, 0 M, cada vez durante una noche entera) y una vez contra Tris 20 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM, NaCl 25 mM, pH 8. El producto final dializado se limpió mediante centrifugación a 12000 x g durante 30 minutos y se pasó a través de un filtro de 0,22 mm. La purificación posterior se realizó mediante HPLC, usando una columna C4 (Vydac 214 TP, 2,2 x 25 cm, 10 mm) eluida a un caudal de 30 ml/min. con un gradiente lineal de acetonitrilo al 40%-60%/ácido trifluoroacético al 0,1% en agua/ácido trifluoroacético al 0,1%. Antes de retirar el disolvente mediante liofilización, se añadió n-octilglucopiranósido al 0,1% (p/v) a los eluatos. La proteína se resuspendió en agua y se almacenó a 4ºC.

Ensayo de unión al receptor CNTFR\alpha

La capacidad de las variantes de CNTF para competir con el CNTF biotinilado (8 nM) para unirse al dominio extracelular del receptor CNTFR\alpha se determinó en un ensayo de unión a fase sólida, en presencia de gp130 soluble, como se ha descrito en las publicaciones precedentes (19). Se revistieron placas de cultivo de poliestireno de 96 pocillos "Microtiter" con 100 ml de carbonato sódico 50 mM pH 9,5, que contenían 0,2 mg del anticuerpo monoclonal 9E10, que se dirige contra un epítope c-myc, y las placas se conservan después a 4ºC durante una noche. Los pocillos se lavaron después cinco veces con TBS (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM) que contenía Tween al 0,05% y se mantienen durante 90 minutos a temperatura ambiente en TBSMT (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, leche desnatada liofilizada al 5% (p/v)). Todas las incubaciones posteriores se realizaron a temperatura ambiente en un mezclador a una velocidad de 700 rpm, después de cada periodo de incubación, los pocillos se lavaron con TBS que contenía Tween al 0,05% (cinco veces cada periodo). Se realizaron los siguientes periodos de incubación: (1) 2 horas con 50 ml de TBSMT que contenía 10 mg de CNTFR\alpha-myc; (2) 1 hora con 50 ml de TBSMT que contenía 200 ng de gp130-flag, CNTF biotinilado 5 nM, y los diversos competidores y (3) 45 minutos con 50 ml de TBS, albúmina de suero bovino al 5% (p/v), Tween 20 al 0,05% (v/v) que contenía 0,8 mg/ml de avidina conjugada con fosfatasa
alcalina.

La actividad de la fosfatasa alcalina se determinó a 37ºC usando p-nitrofenil fosfato 1 mg/ml en dietanolamina-HCl 1 M, pH 9,8, y la absorbancia a 405 nm se midió después de 40-60 minutos usando un lector adecuado. En algunos experimentos, la molécula variante de MUT-DH biotinilado (0,5 nM) se usó como ligando.

El ensayo de competición mostró que la sustitución de los restos Phe152 y Lys155 por alanina, no modifica la interacción con el receptor CNTFR\alpha. Los dos mutantes Lys155Ala/CNTF y Phe152Ala/Lys155Ala/CNTF fueron equipotentes con la molécula de tipo silvestre en la unión al receptor. Como se ha informado anteriormente (18), la molécula MUT-DH es aproximadamente 40 veces más potente que CNTF en la unión al receptor. En este caso, también los mutantes Phe152Ala/ /MUT-DH, Lys155Ala/MUT-DH y Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH fueron equipotentes con la molécula original (MUT-DH) en la unión al receptor. Estos resultados, que se resumen para mayor claridad en la tabla 2, demuestran que los restos Phe152 y Lys155 no participan en la unión al receptor CNTFR\alpha.

Ensamblaje del complejo receptor in vitro

Se sabe a partir de la bibliografía, que las moléculas gp130 y LIFR son capaces de unirse independientemente al complejo CNTF/CNTFR\alpha (11). Para evaluar la importancia funcional de los restos del diseño D1, se ensayó la capacidad de las variantes de CNTF para ensamblarse a los complejos receptores con las diferentes subunidades. El enlace del complejo citoquina/CNTFR\alpha con gp130 o LIFR marcados con ^{35}S se determinó usado ensayos de inmunoprecipitación como se ha descrito en la bibliografía (11). El receptor CNTFR\alpha soluble se inmovilizó sobre proteína A-Sefarosa usando el anticuerpo monoclonal 9E10 anti-myc y se incubó con gp130 o LIFR soluble marcado con azufre ^{35}S, en ausencia o en presencia de diferentes cantidades de variantes de CNTF (1 ó 0,1 mg). Después de lavar, el material unido se eluyó y se sometió a SDS-PAGE.

Como se muestra en la figura 1A, la unión de gp130 al complejo MUT-DH/CNTFR\alpha no está influenciada por las sustituciones de Phe152A (columna AK/DH), Lys155A (columna FA/DH) y Phe152A/Lys155A (columna AA/DH). En contraste, como se ha visto en la figura 1B, las variantes que llevaban estas sustituciones solas o conjuntamente fueron incapaces de unirse al receptor LIFR. Para ensayar la capacidad de las variantes para formar el complejo tripartito CNTFR\alpha/gp130/LIFR, el receptor LIFR se inmovilizó sobre la proteína A-Sefarosa y se incubó con CNTFR\alpha soluble, gp130 soluble marcado con ^{35}S y con las variantes de CNTF (en este caso el experimento se realizó también dos veces sobre dos cantidades diferentes de las moléculas variantes, 1 ó 0,1 mg).

En línea con los dos primeros resultados, las moléculas variantes fueron incapaces de unirse al complejo CNTFR
\alpha/gp130/LIFR, lo que corresponde a la forma fisiológicamente activa del receptor de CNTF en la superficie celular (véase Figura 1C).

Estos resultados muestran que Phe152 y Lys155, forman parte del sitio de unión del receptor LIFR.

Ejemplo 2 Actividad biológica de los mutantes de CNTF Ensayo de la secreción de haptoglobina por células de hepatoma humano

La actividad biológica se determinó en ensayos basados en células, capaces de medir la capacidad de CNTF (o de los mutantes) para ensamblar un complejo receptor funcional entre CNTF soluble y receptores LIF celulares. La línea celular de hepatoma humano HepG2 no expresa CNTFR\alpha, mientras que si expresa el receptor LIF y responde solamente a altas concentraciones de la citoquina, probablemente por causa de una interacción de baja afinidad de CNTF con los receptores LIF celulares (18, 13). El ensayo se realizó de la siguiente manera. En primer lugar, las células HepG2 se cultivaron en placas de 96 pocillos hasta que formaron una única capa confluyente, después se situaron en un medio de cultivo mínimo que contenía dexametasona 1 mM (14) y se trataron durante 24 horas con CNTF purificado o con las moléculas variantes ensayadas. La cantidad de haptoglobina secretada por las células en el medio de cultivo se determinó usando un ensayo ELISA.

Puesto que la secreción de haptoglobina está mediada por el receptor celular LIFR se supone que las sustituciones de aminoácidos que alteran la unión a este receptor conducirán a una fuerte reducción en la actividad biológica de este tipo cuando se compara con la molécula de tipo silvestre. En efecto, si la sustitución de Phe152 o Lys155 por alanina da una actividad biológica débil (aproximadamente el 20% con respecto al valor máximo) a altas concentraciones, la sustitución simultanea de ambos restos por alanina suprime completamente la actividad biológica, incluso a altas concentraciones (figura 2A). En presencia de CNTFR\alpha soluble, las células que llevan receptores LIFR y gp130, se vuelven sensibles a concentraciones bajas de CNTF, debido a la formación del complejo receptor completo. Como puede observarse a partir de la figura 2B, el aumento en la concentración de CNTFR\alpha exógeno, conduce a un cambio en la respuesta celular hacia concentraciones bajas de CNTF y sus variantes.

Pasando a los análisis del comportamiento de variantes sencillas, puede decirse que los mutantes Lys155Ala/CNTF (FA-CNTF) y Lys155Ala/MUT-DH (FADH-CNTF) tienen una actividad biológica que se reduce fuertemente pero no se suprime totalmente. Por otro lado, la sustitución por alanina del resto Phe152 (AKDH-CNTF) reduce la actividad biológica de la molécula a un alcance menor que la sustitución del resto Lys155, y la sustitución simultánea de ambos restos (AADH-CNTF) suprime totalmente esta actividad, incluso a altas concentraciones de tanto el receptor como la citoquina.

Estimulación de la actividad de colina acetiltransferasa (Cat) en células IMR-32

Para determinar los efectos de las variantes sobre el receptor neuronal de CNTF unido a membrana, las moléculas se ensayaron para su capacidad para estimular esta actividad en células de neuroblastoma humano (IMR-32) usando procedimientos conocidos a partir de la bibliografía (15, 22). Estas células expresan de forma constitutiva el receptor CNTFR\alpha. Se descubrió que los receptores unidos a membrana de IMR-32, eran menos sensibles que el receptor soluble al efecto de las mutaciones sencillas en las posiciones 152 y 155. El mutante Phe152Ala/MUT-DH era tan activo como la citoquina de tipo silvestre, y las variantes Lys155Ala/CNTF y Lys155Ala/MUT-DH se mostraron verdaderamente como potentes agonistas. Sin embargo, en este caso también la sustitución simultánea de los dos restos dio como resultado una pérdida total de actividad biológica.

La alta actividad biológica de los mutantes Phe152Ala y Lys155Ala en las células IMR-32 se debe probablemente a la alta concentración local de subunidades de receptor sobre la superficie de la célula. De hecho, se espera que los mutantes de CNTF con una capacidad de unión al receptor LIFR reducida, continúen manteniendo una actividad estimuladora potente sobre otras poblaciones neuronales que expresan altos niveles de complejos receptores de membrana, como por ejemplo los que participan en las funciones motoras. Se cree que los efectos secundarios resultantes de la administración de CNTF, por ejemplo respuesta de fase aguda, están mediados por la acción que el receptor CNTFR\alpha circulante ejerce sobre las células que expresan el receptor LIFR (por ejemplo hepatocitos). Por lo tanto, se espera que los mutantes de CNTF que muestran actividad débil cuando interaccionan con el receptor soluble y por el contrario muestran un alto nivel de actividad biológica cuando la interacción es con los complejos receptores unidos a la membrana de la célula, tengan una acción neuronal más específica, reduciendo los efectos secundarios periféricos.

Ejemplo 3 Propiedades antagonistas de ciertas variantes de CNTF

Se espera que los mutantes de CNTF que hayan perdido la capacidad de unirse al receptor LIF, pero sean capaces aún de ensamblar CNTFR\alpha y gp130 actuarán como antagonistas competitivos. La inhibición de la actividad biológica de CNTF por estos mutantes se ensayó en células IMR-32 usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 2. La proteína variante Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH provoca un cambio en la curva de respuesta de CNTF hacia concentraciones altas de la molécula agonista, demostrando que actúa como un antagonista competitivo sobre el receptor CNTFR\alpha unido a membrana. Se obtuvo una inhibición del 50% de la actividad de Cat inducida por una dosis subsaturante de CNTF, con un exceso de 70 veces de Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH (Figura 4B).

Ejemplo 4 Construcción de variantes de CNTF

Las mutaciones se introdujeron en las secuencias de CNTF humano o S166D/Q167H/CNTF (DH-CNTF) mediante PCR inversa (Hemsley y col., 1989), usando los vectores pRSET-CNTF o pRSET-MUT-DH (Solicitud de Patente Italiana RM9500380) como plantillas. Los cebadores de oligonucleótidos sintéticos se construyeron para situarlos "back to back" ("espalda contra espalda") sobre el dúplex, con los extremos 5' yuxtapuestos y los extremos 3' orientados para la extensión en orientaciones opuestas alrededor del círculo del plásmido. Los cebadores usados fueron:

cebador antisentido para FA-CNTF y FADH-CNTF:

: 5' CGCCTTCTCAAAGAGCCACCATCTCCAAC3'

cebador antisentido para AKDH-CNTF:

: 5' CTTCTTCTCAGCGAGACCACCATCTCCAAC3'

cebador antisentido para AA-CNTF y AADH-CNTF:

: 5' CGCCTTCTCAGCGAGACCACCATCTCCAAC3'

Estos cebadores mutantes se usaron en PCR junto con el cebador sentido de tipo silvestre:

: 5' CTGTGGGGCCTAAAGGTGCTG3'

El ADN plantilla (10 fmol), y las series de cebadores (cada uno 1 mM) se incubaron en 100 ml de volumen de reacción que contenía Tris-HCl 100 mM, pH 8,3, KCl 500 mM, MgCl_{2} 15 mM, cada dNTP a 0,2 mM y dos unidades de Taq polimerasa (Boehringer).

La amplificación continuó a través de un ciclo de desnaturalización a 94ºC (1 min), templando a 45ºC (1 min) y extensión de los cebadores a 72ºC (12 min) para un total de 25 ciclos. Se analizaron cinco porciones de un microlitro de la muestra generadas por PCR, en un gel de agarosa (0,7%) para determinar la eficacia de la amplificación. El resto (95 ml) se trató con fragmento de Klenow de polimerasa I de E. coli (20 unidades) y los cuatro dNTP a la concentración final de 250 mM cada uno. La mezcla de reacción se incubó a 37ºC durante 30 minutos. Se aisló ADN de doble cadena de las mezclas de reacción de PCR usando el sistema de purificación de ADN Wizard PCR preps (Promega) y se fosforiló en el extremo 5' mediante incubación con 20 unidades de la polinucleótido quinasa de T4 (Promega) y ATP 1 mM.

Las muestras de ADN fosforilado se sometieron después a electroforesis en geles de agarosa (0,7%), y las bandas apropiadas se extirparon y se purificaron usando un kit de purificación de ADN Quiagen. Se usó un volumen de 10 microlitros de ADN (de un total de 25 ml) en una reacción de ligasa que contenía tampón de ligamiento de extremo romo convencional y ADN ligasa de T4 (12 unidades). Las mezclas de ligamiento se incubaron durante una noche a 16ºC, y después se calentaron a 65ºC y se usaron para transformar células competentes top10 de E. coli. Los transformantes se aislaron y la identidad de los clones se confirmó mediante análisis de secuencia de ADN.

Se descubrió que las secuencias que codifican AA-CNTF y AADH-CNTF contenían 2 mutaciones adicionales (probablemente debidas a errores inducidos por PCR) en los nucleótidos 208 y 435. La última mutación se eliminó mediante PCR usando los siguientes cebadores sentido y antisentido:

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sentido:

: 5'GTCACCATGGCTTTCACAGAGCATTCACCG3'

antisentido

: 5'AGCTCCTGCAGCACCTTTAGGCCCCACAGCGCCTTCTCAGCGAGACCACCATCTCCAACATT AAT3'

La PCR se realizó durante 30 ciclos de 140 seg. a 94ºC, 140 seg. a 50ºC, y 190 seg. a 72ºC usando 2,5 unidades de ADN polimerasa pfu (Stratagene), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los productos de PCR se aislaron como se ha descrito anteriormente, se digirieron con NcoI (el sitio situado en el nucleótido 2 de la secuencia que codifica CNTF) y PstI (sitio en el nucleótido 484 de la se secuencia codificante) y se subclonaron en los vectores pRSET-CNTF o pRSET-DH-CNTF digeridos con NcoI/PstI. Este procedimiento dió origen a vectores que contenían la secuencia que codificaba AA-CNTF o AADH-CNTF, con una mutación que permanecía en el nucleótido 208. Esta mutación se eliminó mediante digestión de los vectores con HindIII (sitio situado en el nucleótido 233 y al final de la secuencia codificante), y la sustitución del fragmento de restricción grande (que comprendía los nucleótidos 1 a 233) por el fragmento correspondiente de pRSET-CNTF.

Bibliografía

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INFORMACIÓN GENERAL

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(i): SOLICITANTE: INSTITUTO DI RECERCHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE P.ANGELETTI S.p.A.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: "VARIANTES DEL FACTOR NEUROTRÓFICO CILIAR HUMANO (hCNTF) CON UN INTERVALO DE ACCIÓN DIFERENTE DEL DE LA MOLÉCULA DE TIPO SILVESTRE".

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 7

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(iv): DIRECCIÓN POSTAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DIRECCIÓN: Societa' Italiana Brevetti

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: Piazza di Pietra, 39

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Roma

\vskip0.500000\baselineskip

(D): PAÍS: Italia

\vskip0.500000\baselineskip

(E): CÓDIGO POSTAL: I-00168

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE SOPORTE: Floppy disk 3,5'' 1,44 MBYTES

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: PC compatible con IBM

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS Rev. 5.0

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: Microsoft Word 6.0

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL AGENTE

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: DI CERBO Mario (Dr.)

\vskip0.500000\baselineskip

(B): REFERENCIA: RM/X88808/PC-DC

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: 06/6785941

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: 06/6794692

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TELEX: 612287 ROPAT

\vskip1.000000\baselineskip

(1) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEC ID Nº: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ASPECTO: desconocido

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS ADICIONALES

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: hCNTF

\vskip0.500000\baselineskip

(B): INFORMACIÓN ADICIONAL: secuencia para CNTF humano de la posición 152 a la posición 167.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID Nº: 1

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Ser Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEC ID Nº: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS ADICIONALES

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: (Ser166Asp/Gln167His)hCNTF

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID Nº: 2

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Asp His}

\vskip1.000000\baselineskip

(3) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEC ID Nº: 3

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS ADICIONALES

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE:(Phe152Ala/Ser166Asp/Gln167His)hCNTF

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\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID Nº: 3

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Asp His}

\vskip1.000000\baselineskip

(4) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEC ID Nº: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS ADICIONALES

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE:(Lys155Ala/Ser166Asp/Gln167His)hCNTF

\vskip0.500000\baselineskip

(B): INFORMACIÓN ADICIONAL: secuencia de CNTF humano de la posición 152 a la posición 167.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID Nº: 4

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\sa{Phe Glu Lys Ala Leu Trp Gly Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Asp His}

\vskip1.000000\baselineskip

(5) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEC ID Nº: 5

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

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(ix): CARACTERÍSTICAS ADICIONALES

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: (Phe152Ala/Lys155Ala)hCNTF

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID Nº: 5

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Glu Lys Ala Leu Trp Gly Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Ser Gln}

\vskip1.000000\baselineskip

(7) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEC ID Nº: 7

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

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(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: desconocida

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS ADICIONALES

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE:(Phe152Ala/Lys155Ala/Ser166Asp/Gln167His)hCNTF

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID Nº: 7

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\sa{Ala Glu Lys Ala Leu Trp Gly Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Asp His}

\vskip1.000000\baselineskip

(6) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEC ID Nº: 6

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

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(C): TIPO DE CADENA: sencilla

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(D): TOPOLOGÍA: desconocida

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(ix): CARACTERÍSTICAS ADICIONALES

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(A): NOMBRE: (Lys155Ala)hCNTF

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEC ID Nº: 6

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Glu Lys Ala Leu Trp Gly Leu Lys Val Leu Gln Glu Leu Ser Gln}

Claims

1. Una variante del factor neurotrófico ciliar humano (hCNTF), donde dicha variante se caracteriza por la sustitución de fenilalanina 152 y/o lisina 155 por alanina y que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre la secuencia indicada en SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 5 o SEC ID Nº: 7.

2. La variante de hCNTF de la reivindicación 1, donde dicha variante comprende SEC ID Nº: 3.

3. La variante de hCNTF de la reivindicación 1, donde dicha variante comprende SEC ID Nº: 4.

4. La variante de hCNTF de la reivindicación 1, donde dicha variante comprende SEC ID Nº: 5.

5. La variante de hCNTF de la reivindicación 1, donde dicha variante comprende SEC ID Nº: 7.

6. Una composición farmacéutica que comprende como principio activo al menos uno de una variante del factor neurotrófico ciliar humano (hCNTF) de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

7. La variante de hCNTF de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para uso en terapia.

8. Uso de la variante de hCNTF de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 o de la composición de la reivindicación 6, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas.