JP3329826B2 - 野性型分子とは異なる範囲の作用をもつヒト毛様体神経栄養因子（ｈＣＮＴＦ）の変種 - Google Patents
野性型分子とは異なる範囲の作用をもつヒト毛様体神経栄養因子（ｈＣＮＴＦ）の変種Info
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の説明 本発明は神経学の分野に関連するものである。本発明
の主題は、野性型の分子とは異なる作用を示すヒト毛様
体神経栄養因子（hCNTF）の変異体である。これらの変
種の特徴は、LIF受容体（LIFR）との相互作用能が顕著
に低下しているという点である。その結果、CNTFに反応
する細胞の大部分に対する生物学的活性が極度に低くな
っている。しかし、ある種のニューロン細胞に対しては
高い生物学的活性を保持する。これはおそらく、ニュー
ロン細胞が大量のLIFRを発現しているということ、かつ
／またはCNTF受容体α（CNTFRα）が膜に結合している
ことに起因するのであろう。この特性を利用して、CNTF
の投与によって起こる末梢の副作用を軽減することがで
きる。
の主題は、野性型の分子とは異なる作用を示すヒト毛様
体神経栄養因子（hCNTF）の変異体である。これらの変
種の特徴は、LIF受容体（LIFR）との相互作用能が顕著
に低下しているという点である。その結果、CNTFに反応
する細胞の大部分に対する生物学的活性が極度に低くな
っている。しかし、ある種のニューロン細胞に対しては
高い生物学的活性を保持する。これはおそらく、ニュー
ロン細胞が大量のLIFRを発現しているということ、かつ
／またはCNTF受容体α（CNTFRα）が膜に結合している
ことに起因するのであろう。この特性を利用して、CNTF
の投与によって起こる末梢の副作用を軽減することがで
きる。
ヒト毛様体神経栄養因子（hCNTF）は23kDaのニューロ
サイトカインである。シュヴァン細胞および星状細胞に
おいて発現され、運動ニューロン、感覚ニューロン、交
感神経ニューロン、海馬および稀突起神経膠細胞のニュ
ーロンを含む各種のニューロン細胞およびグリア細胞の
生存と分化（in vitro、in vivo共に）に対して強力な
促進作用を発揮する（１、２）。CNTFの生理学的役割
は、外傷後のニューロン変性の防止に関与する因子とし
て働くことであると思われる（２）。この防御作用はCN
TFがin vivoで多くの神経細胞に対して示しているもの
で、ヒトの神経変性性疾患の治療への臨床的応用が期待
される（３）。
サイトカインである。シュヴァン細胞および星状細胞に
おいて発現され、運動ニューロン、感覚ニューロン、交
感神経ニューロン、海馬および稀突起神経膠細胞のニュ
ーロンを含む各種のニューロン細胞およびグリア細胞の
生存と分化（in vitro、in vivo共に）に対して強力な
促進作用を発揮する（１、２）。CNTFの生理学的役割
は、外傷後のニューロン変性の防止に関与する因子とし
て働くことであると思われる（２）。この防御作用はCN
TFがin vivoで多くの神経細胞に対して示しているもの
で、ヒトの神経変性性疾患の治療への臨床的応用が期待
される（３）。
しかし、CNTFは神経防御作用だけでなく、in vivoに
おいて体重低下および食欲不振、急性反応や発熱等、種
々の作用も有することが示されている。したがって、こ
のような副作用があるためにCNTFを薬剤として使用する
にあたっては問題が生じる。
おいて体重低下および食欲不振、急性反応や発熱等、種
々の作用も有することが示されている。したがって、こ
のような副作用があるためにCNTFを薬剤として使用する
にあたっては問題が生じる。
他の成長因子、特にサイトカインと同様に、CNTFは多
数のサブユニットをもつ受容体複合体との結合、逐次的
会合、および活性化を通じてその作用を発揮する（４、
５）。CNTFがその一部をなす受容体複合体は、６個のサ
ブユニットから構成される（インターロイキン６の場合
と同様）（６）。複合体は２個のCNTF分子、CNTFとの低
親和性結合を形成する２個のα受容体特異的分子（CNTF
Rα）および２個のシグナル変換サブユニット（LIFRお
よびgp130）から成る（11）。gp130および特異的受容体
との結合に関与するCNTF部位は、インターロイキン６と
の類似性によって識別できる（７、８、10）。CNTFとLI
F受容体（LIFR）の結合部位はまだ特定されていない。
数のサブユニットをもつ受容体複合体との結合、逐次的
会合、および活性化を通じてその作用を発揮する（４、
５）。CNTFがその一部をなす受容体複合体は、６個のサ
ブユニットから構成される（インターロイキン６の場合
と同様）（６）。複合体は２個のCNTF分子、CNTFとの低
親和性結合を形成する２個のα受容体特異的分子（CNTF
Rα）および２個のシグナル変換サブユニット（LIFRお
よびgp130）から成る（11）。gp130および特異的受容体
との結合に関与するCNTF部位は、インターロイキン６と
の類似性によって識別できる（７、８、10）。CNTFとLI
F受容体（LIFR）の結合部位はまだ特定されていない。
ヒト、ウサギ、ラットおよびマウスのCNTF配列と、LI
F受容体に結合するその他のサイトカイン配列（例えばL
IF、オンコスタチンＭおよびCT−１）との間で多くの一
致が見られることから、D1として知られる構造モチーフ
の中に２個の保存的アミノ残基が存在することが示され
る。この２個のアミノ酸とは、第152位のフェニルアラ
ニンと第155位のリシンである。以下の例で詳細に示す
が、この２個のアミノ酸はLIFR結合部位の一部を構成し
ている。この概念に基づき、２個のアミノ酸をアラニン
で置換したCNTF変異体が産生された。野性型の分子（配
列番号１）と本発明の目的である変異体の配列を表１に
示す（簡略化するため、アミノ酸配列全体ではなく第15
2位から167位までを示す）。文献では２種類の変異体の
うちの１種（Lys155Ala/CNTF）がニワトリのニューロン
に対してまったく活性をもたないとされているが（1
0）、両変異体の生物学的活性について評価した結果、
以前の報告（10）とは逆に、ある種のニューロン細胞の
膜受容体上で強力な作動薬として働く一方でLIF受容体
または可溶性のCNTF受容体に結合するとその生物学的活
性が大きく低下することが確認された。この現象の解釈
として、次の説明が可能である：これらの分子の生物学
的作用はCNTFRαとLIF受容体の濃度に依存するため、あ
る種のニューロン細胞群の細胞膜に結合する受容体の場
合と同様、局所的な受容体濃度が非常に高くなると増幅
される。
F受容体に結合するその他のサイトカイン配列（例えばL
IF、オンコスタチンＭおよびCT−１）との間で多くの一
致が見られることから、D1として知られる構造モチーフ
の中に２個の保存的アミノ残基が存在することが示され
る。この２個のアミノ酸とは、第152位のフェニルアラ
ニンと第155位のリシンである。以下の例で詳細に示す
が、この２個のアミノ酸はLIFR結合部位の一部を構成し
ている。この概念に基づき、２個のアミノ酸をアラニン
で置換したCNTF変異体が産生された。野性型の分子（配
列番号１）と本発明の目的である変異体の配列を表１に
示す（簡略化するため、アミノ酸配列全体ではなく第15
2位から167位までを示す）。文献では２種類の変異体の
うちの１種（Lys155Ala/CNTF）がニワトリのニューロン
に対してまったく活性をもたないとされているが（1
0）、両変異体の生物学的活性について評価した結果、
以前の報告（10）とは逆に、ある種のニューロン細胞の
膜受容体上で強力な作動薬として働く一方でLIF受容体
または可溶性のCNTF受容体に結合するとその生物学的活
性が大きく低下することが確認された。この現象の解釈
として、次の説明が可能である：これらの分子の生物学
的作用はCNTFRαとLIF受容体の濃度に依存するため、あ
る種のニューロン細胞群の細胞膜に結合する受容体の場
合と同様、局所的な受容体濃度が非常に高くなると増幅
される。
これらの分子は膜結合型受容体を発現するニューロン
細胞に対して生物学的活性を発揮すること、そしてその
一方で可溶性の受容体と相互作用すると生物学的活性が
著しく弱くなることを発見したため、ここに示す特定の
位置で修飾された分子は可溶性の受容体結合により媒介
される末梢副作用を起こすことなくニューロン細胞との
特異的な反応のために利用できる可能性が示される。
細胞に対して生物学的活性を発揮すること、そしてその
一方で可溶性の受容体と相互作用すると生物学的活性が
著しく弱くなることを発見したため、ここに示す特定の
位置で修飾された分子は可溶性の受容体結合により媒介
される末梢副作用を起こすことなくニューロン細胞との
特異的な反応のために利用できる可能性が示される。
したがって、本発明の主題はヒト毛様体神経栄養因子
（hCNTF）の変種であり、第152位のフェニルアラニンお
よび／または155位のリシンをアラニンで置換した、そ
して特に配列番号３から配列番号７に示した配列から選
択したアミノ酸配列を含有する、という特徴をもつ。
（hCNTF）の変種であり、第152位のフェニルアラニンお
よび／または155位のリシンをアラニンで置換した、そ
して特に配列番号３から配列番号７に示した配列から選
択したアミノ酸配列を含有する、という特徴をもつ。
配列番号３、４及び６によって表される分子は、LIF
受容体に結合する能力および可溶性CNTFRαによってそ
れを活性化する能力が低下している一方で、ある種のニ
ューロン細胞のCNTFRに対しては作動薬として働く。配
列番号７によって表される分子は、CNTFRαの受容体結
合に対する競合的拮抗薬として作用する。
受容体に結合する能力および可溶性CNTFRαによってそ
れを活性化する能力が低下している一方で、ある種のニ
ューロン細胞のCNTFRに対しては作動薬として働く。配
列番号７によって表される分子は、CNTFRαの受容体結
合に対する競合的拮抗薬として作用する。
本発明はまた、これらの分子を利用して神経系の疾患
または病態、あるいは神経系自体に損傷を与える神経系
の疾患または病態を含めてCNTFに反応する細胞が関与す
るその他の病態を治療するための薬剤も包含する。
または病態、あるいは神経系自体に損傷を与える神経系
の疾患または病態を含めてCNTFに反応する細胞が関与す
るその他の病態を治療するための薬剤も包含する。
表２に示すのは、CNTFの各種変異体のCNTFRα受容体
結合能に関するデータである。ビチオニル化CNTFまたは
ビオチニル化MUT−DHの不動化CNTFRαへの結合を50％阻
害するのに必要な蛋白質濃度（IC50）を測定した。相対
結合度とは、（CNTFのIC150）／（被験蛋白質のIC50）
の比である。
結合能に関するデータである。ビチオニル化CNTFまたは
ビオチニル化MUT−DHの不動化CNTFRαへの結合を50％阻
害するのに必要な蛋白質濃度（IC50）を測定した。相対
結合度とは、（CNTFのIC150）／（被験蛋白質のIC50）
の比である。
図１に示すのは、サブユニットgp130およびLIFRを含
む変種CNTFがその一部を形成する各受容体複合体におけ
る結合試験の結果である。各試験は、それぞれ２種類の
量の変種分子を用いて実施した（１または0.1mg、各欄
の上部に記載）。各図における最終欄は陰性対照であ
り、変種分子不在下で実施したものである。（Ａ）原型
MUT−DH、Phe152Ala/MUT−DH、Lys155Ala/MUT−DH、Phe
152Ala/Lys155Ala/MUT−DHの変種および野性型CNTF（そ
れぞれMUT/DH、AK/DH、FA/DH、AA/DHおよびwtとして記
載）を含有する複合体と受容体サブユニットgp130をも
つCNTFRαとの結合試験。（Ｂ）原型MUT−DH、Phe152Al
a/MUT−DH、Lys155Ala/MUT−DH、Phe152Ala/Lys155Ala/
MUT−DHの変種および野性型CNTF（それぞれMUT−DH、AK
/DH、FA/DH、AA/DHおよびwtとして記載）を含有する複
合体とと受容体サブユニットLIFRをもつCNTFRαとの結
合試験。（Ｃ）原型MUT−DH、Phe152Ala/MUT−DH、Lys1
55Ala/MUT−DH、Phe152Ala/Lys155Ala/MUT−DHの変種お
よび野性型CNTF（それぞれMUT−DH、AK/DH、FA/DH、AA/
DHおよびwtとして記載）を含有する複合体と受容体サブ
ユニットgp130をもつ複合体LIFR/CNTFRαとの結合試
験。
む変種CNTFがその一部を形成する各受容体複合体におけ
る結合試験の結果である。各試験は、それぞれ２種類の
量の変種分子を用いて実施した（１または0.1mg、各欄
の上部に記載）。各図における最終欄は陰性対照であ
り、変種分子不在下で実施したものである。（Ａ）原型
MUT−DH、Phe152Ala/MUT−DH、Lys155Ala/MUT−DH、Phe
152Ala/Lys155Ala/MUT−DHの変種および野性型CNTF（そ
れぞれMUT/DH、AK/DH、FA/DH、AA/DHおよびwtとして記
載）を含有する複合体と受容体サブユニットgp130をも
つCNTFRαとの結合試験。（Ｂ）原型MUT−DH、Phe152Al
a/MUT−DH、Lys155Ala/MUT−DH、Phe152Ala/Lys155Ala/
MUT−DHの変種および野性型CNTF（それぞれMUT−DH、AK
/DH、FA/DH、AA/DHおよびwtとして記載）を含有する複
合体とと受容体サブユニットLIFRをもつCNTFRαとの結
合試験。（Ｃ）原型MUT−DH、Phe152Ala/MUT−DH、Lys1
55Ala/MUT−DH、Phe152Ala/Lys155Ala/MUT−DHの変種お
よび野性型CNTF（それぞれMUT−DH、AK/DH、FA/DH、AA/
DHおよびwtとして記載）を含有する複合体と受容体サブ
ユニットgp130をもつ複合体LIFR/CNTFRαとの結合試
験。
図２に示すのは、CNTFおよびCNTF変種によってHepG2
細胞におけるハプトグロビンの産生を刺激した結果であ
る。実験は、800ng/mlの濃度の可溶性CNTFRα受容体の
不在下（Ａ）または存在下（Ｂ）のいずれかにおいて実
施した。実験に使用した蛋白質は次のとおりであった。
CNTF（○）、Lys155Ala/CNTF（FA−CNTF）（□）、Lys1
55Ala/MUT−DH（FADH−CNTF）（■）、Phe152Ala/MUT−
DH（AKDH−CNTF）（▲）およびPhe152Ala/Lys155Ala/MU
T−DH（AADH−CNTF）（▼）。各実験の間の差を規格化
するため、データはCNTFの最大作用の百分率として表
す。
細胞におけるハプトグロビンの産生を刺激した結果であ
る。実験は、800ng/mlの濃度の可溶性CNTFRα受容体の
不在下（Ａ）または存在下（Ｂ）のいずれかにおいて実
施した。実験に使用した蛋白質は次のとおりであった。
CNTF（○）、Lys155Ala/CNTF（FA−CNTF）（□）、Lys1
55Ala/MUT−DH（FADH−CNTF）（■）、Phe152Ala/MUT−
DH（AKDH−CNTF）（▲）およびPhe152Ala/Lys155Ala/MU
T−DH（AADH−CNTF）（▼）。各実験の間の差を規格化
するため、データはCNTFの最大作用の百分率として表
す。
図３に示すのは、IMR−32細胞においてコリンアセチ
ルトランスフェラーゼ（Chat）を刺激した結果である。
実験に使用した蛋白質は次のとおりであった:CNTF
（○）、FA−CNTF（□）、FADH−CNTF（■）、AKDH−CN
TF（▲）およびAADH−CNTF（▼）。各実験の間の差を規
格化するため、データはCNTFの最大作用の百分率として
表す。
ルトランスフェラーゼ（Chat）を刺激した結果である。
実験に使用した蛋白質は次のとおりであった:CNTF
（○）、FA−CNTF（□）、FADH−CNTF（■）、AKDH−CN
TF（▲）およびAADH−CNTF（▼）。各実験の間の差を規
格化するため、データはCNTFの最大作用の百分率として
表す。
図４に示すのは、HepG2細胞における変異体Phe152Ala
/Lys155Ala/MUT−DHの拮抗薬特性である。図4Aは、Phe1
52Ala/Lys155Ala/MUT−DHの不在下（●）および以下の
濃度（mg/ml）での存在下におけるIMR−32細胞中コリン
アセチルトランスフェラーゼ（Chat）活性に対するCNTF
の漸増用量の作用である:0.01（○）、0.1（■）、１
（□）、10（▲）。図4Bは、3ng/mlのCNTFによって誘発
される反応に対するPhe152Ala/Lys155Ala/MUT−DHの漸
増用量の作用である。
/Lys155Ala/MUT−DHの拮抗薬特性である。図4Aは、Phe1
52Ala/Lys155Ala/MUT−DHの不在下（●）および以下の
濃度（mg/ml）での存在下におけるIMR−32細胞中コリン
アセチルトランスフェラーゼ（Chat）活性に対するCNTF
の漸増用量の作用である:0.01（○）、0.1（■）、１
（□）、10（▲）。図4Bは、3ng/mlのCNTFによって誘発
される反応に対するPhe152Ala/Lys155Ala/MUT−DHの漸
増用量の作用である。
ここまでは、本発明に関する一般的な説明を記載し
た。本発明の目的、特徴、利点および操作方法について
さらに十分な理解を得るため、以下に掲げる例により、
個々の態様についてのより詳細な説明を加える。
た。本発明の目的、特徴、利点および操作方法について
さらに十分な理解を得るため、以下に掲げる例により、
個々の態様についてのより詳細な説明を加える。
寄託 それぞれプラスミドpRSET−AKDH−CNTF、pRSET−FADH
−CNTF、pRSET−AADH−CNTFを用いて形質転換したE.col
i TOP10菌で、アミノ酸配列番号３を含む変種AKDH−CNT
F、アミノ酸配列番号４を含む変種FADH−CNTF、および
アミノ酸配列番号６を含む変種AADH−CNTFをそれぞれコ
ードするヌクレオチド配列を含有する菌株を、1996年６
月24日に受託番号NCIMB 40809、NCIMB 40810およびNCIM
B 40811によりNationalCollections of Industrial and
Marine Bacteria Ltd.（NCIMB）、Aberdeen、Scotlan
d、UKに登録した。
−CNTF、pRSET−AADH−CNTFを用いて形質転換したE.col
i TOP10菌で、アミノ酸配列番号３を含む変種AKDH−CNT
F、アミノ酸配列番号４を含む変種FADH−CNTF、および
アミノ酸配列番号６を含む変種AADH−CNTFをそれぞれコ
ードするヌクレオチド配列を含有する菌株を、1996年６
月24日に受託番号NCIMB 40809、NCIMB 40810およびNCIM
B 40811によりNationalCollections of Industrial and
Marine Bacteria Ltd.（NCIMB）、Aberdeen、Scotlan
d、UKに登録した。
例１ CNTF変異体の構築および特徴 変異体の構築 pRSET−CNTFまたはpRSET−MUT−DHベクターをテンプ
レートとして使用し、既知の方法を用いた逆PCRによっ
てヒトCNTFまたは変種分子MUT−DH（Ser166Asp/Gln167H
is/CNTF）中に変異体を導入した。PCR反応のプライマー
として以下のものを使用した： すべての変異体に使用したセンスプライマー 変異体Phe152Alaのためのアンチセンスプライマー
（第152位のアラニンに相当するコドンを太字で示す） 変異体Phe152Ala/Lys155Alaのための逆プライマー
（第152位および155位のアラニンに相当するコドンを太
字で示す） PCR反応は、DNAテンプレート（pRSET−CNTFまたはpRS
ET−MUT−DH;10fmol）とプライマー（各1mM）を使用
し、Taq DNAポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）２
単位および10倍PCR反応用緩衝液10mlを含有する反応溶
液100ml中で行なった。増幅は、94℃で１分間、45秒で
１分間、および72℃で12分間のサイクルを25回行なっ
た。増幅した混合液95ml中に４種のデオキシヌクレオチ
ド（250mM）および20単位のE.coliポリメラーゼＩ「ク
レノーフラグメント」を添加し、反応液を37℃で30分間
インキュベートした。「WizardTM PCR preps」精製シス
テムを使用してDNAを分離し、製造者の指示に従い20単
位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ（Promega）と共にイ
ンキュベートすることによりリン酸化した。次に産物を
アガロースゲル（0.7％）上で泳動させた後、Qiaexキッ
ト（Qiagen）を用いて精製し、12単位のT4リガーゼを用
いたリガーゼ反応を16℃で20時間行なった。反応混合物
を用いて、HB2151菌株の形質転換可能なE.coli細胞を形
質転換した。細菌細胞からDNAを回収し、USB Sequenase
プロトコルを用いてDNAの配列決定を行なうことによ
り、CNTF変異体をコードする領域の本質を確認した。
レートとして使用し、既知の方法を用いた逆PCRによっ
てヒトCNTFまたは変種分子MUT−DH（Ser166Asp/Gln167H
is/CNTF）中に変異体を導入した。PCR反応のプライマー
として以下のものを使用した： すべての変異体に使用したセンスプライマー 変異体Phe152Alaのためのアンチセンスプライマー
（第152位のアラニンに相当するコドンを太字で示す） 変異体Phe152Ala/Lys155Alaのための逆プライマー
（第152位および155位のアラニンに相当するコドンを太
字で示す） PCR反応は、DNAテンプレート（pRSET−CNTFまたはpRS
ET−MUT−DH;10fmol）とプライマー（各1mM）を使用
し、Taq DNAポリメラーゼ（Boehringer Mannheim）２
単位および10倍PCR反応用緩衝液10mlを含有する反応溶
液100ml中で行なった。増幅は、94℃で１分間、45秒で
１分間、および72℃で12分間のサイクルを25回行なっ
た。増幅した混合液95ml中に４種のデオキシヌクレオチ
ド（250mM）および20単位のE.coliポリメラーゼＩ「ク
レノーフラグメント」を添加し、反応液を37℃で30分間
インキュベートした。「WizardTM PCR preps」精製シス
テムを使用してDNAを分離し、製造者の指示に従い20単
位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ（Promega）と共にイ
ンキュベートすることによりリン酸化した。次に産物を
アガロースゲル（0.7％）上で泳動させた後、Qiaexキッ
ト（Qiagen）を用いて精製し、12単位のT4リガーゼを用
いたリガーゼ反応を16℃で20時間行なった。反応混合物
を用いて、HB2151菌株の形質転換可能なE.coli細胞を形
質転換した。細菌細胞からDNAを回収し、USB Sequenase
プロトコルを用いてDNAの配列決定を行なうことによ
り、CNTF変異体をコードする領域の本質を確認した。
Phe152Ala/Lys155Ala/MUT−DH（AADH−PCR1）をコー
ドする配列は、他に２個の変異体（Ala70Thr/Val146Gl
y）を含有することが明らかになった。これらの変異を
修正し本体の配列に戻すために、以下の方法を用いた：
変異Val146Glyを消失させるため、第１位から第163位に
CNTFをコードする配列を含むNco I/Pst Iフラグメント
を増幅した。テンプレートしてAADH−PCR1のDNAを使用
し、以下のプライマーと共に行なった： PCR反応は、2.5単位のクローンpfuポリメラーゼ（Str
atagene）を用いて30サイクル続行した（94℃で130秒;5
0℃で130秒;72℃で190秒）。反応産物をNco IおよびPst
Iの酵素で切断し、0.7％アガロースゲル上で電気泳動
を行なった後、「WizardTM PCR preps DNA」精製システ
ム（Promega）を使用して精製した。次に、Nco I/Pst I
により切断したpRSET−MUT−DHベクター中にフラグメン
トをサブクローニングし、構築AADH−PCR2を得た。変異
Ala70Thrを消失させるため、AADH−PCR2のDNAをHind II
Iによって切断し、得られたフラグメント（CNTFの第79
位の残基から第200位の残基までの断片であるため、第7
0位の変異が除去されている）をHind IIIにより切断し
たpRSET−CNTFベクター中にサブクローニングした。こ
のDNA配列を直接配列決定することによって、配列が実
際にPhe152Ala/Lys155Ala/MUT−DHをコードしているこ
とを確認した。
ドする配列は、他に２個の変異体（Ala70Thr/Val146Gl
y）を含有することが明らかになった。これらの変異を
修正し本体の配列に戻すために、以下の方法を用いた：
変異Val146Glyを消失させるため、第１位から第163位に
CNTFをコードする配列を含むNco I/Pst Iフラグメント
を増幅した。テンプレートしてAADH−PCR1のDNAを使用
し、以下のプライマーと共に行なった： PCR反応は、2.5単位のクローンpfuポリメラーゼ（Str
atagene）を用いて30サイクル続行した（94℃で130秒;5
0℃で130秒;72℃で190秒）。反応産物をNco IおよびPst
Iの酵素で切断し、0.7％アガロースゲル上で電気泳動
を行なった後、「WizardTM PCR preps DNA」精製システ
ム（Promega）を使用して精製した。次に、Nco I/Pst I
により切断したpRSET−MUT−DHベクター中にフラグメン
トをサブクローニングし、構築AADH−PCR2を得た。変異
Ala70Thrを消失させるため、AADH−PCR2のDNAをHind II
Iによって切断し、得られたフラグメント（CNTFの第79
位の残基から第200位の残基までの断片であるため、第7
0位の変異が除去されている）をHind IIIにより切断し
たpRSET−CNTFベクター中にサブクローニングした。こ
のDNA配列を直接配列決定することによって、配列が実
際にPhe152Ala/Lys155Ala/MUT−DHをコードしているこ
とを確認した。
以下に示す手順を用いて蛋白質の発現および細菌封入
体の分離を行なった:pREST−CNTFおよびpREST−変種ベ
クターを用いて、菌株BL21（DE3）LysE（SupEマイナス
遺伝子型）のE.coli細胞を形質転換した。形質転換した
細胞を、A600を0.8として0.1mg/mlのアンピシリンを含
有するルリアブロス1l中で37℃において撹拌した。その
後、イソプロピルチオールガラクトシド（0.4mM）を添
加し、37℃においてさらに３時間インキュベートを続け
た。次に遠心によって細菌を回収し、緩衝液Ａ（100mM
Tris−HCl、pH7.5、50mM EDTA、1mM PMSF、10mg/mlロイ
ペプチン）中2ml/gのビーズに再懸濁した。これに0.5mg
/mlのリゾチームと30％w/vのショ糖を添加した。この懸
濁液を30℃で１時間インキュベートした。等量の緩衝液
Ａを添加した後、800バールの圧力で「フレンチプレ
ス」を２回通過させることにより、細菌を溶菌させた。
12000×ｇで30分間遠心することによって、封入体を分
離した。ビーズを2Mの塩化グアニジン溶液中に再懸濁
し、同溶液を用いて３回洗出した。最終ビーズを5mlの8
M塩化グアニジン溶液中に再懸濁し、直ちに緩衝液Ａで
４倍に希釈した。12000×ｇで30分間遠心した後、上清
を４℃において透析した。透析外液は、最初の３回が10
mM Tris−HCL、5mM EDTA、0.1mM DTT pH8、および漸減
濃度の塩化グアニジン（1M、0.5M、0M、各一晩ずつ）で
もう１回が20mM Tris、0.1mM EDTA、1mM DTT、25mM NaC
l、pH8であった。最終透析産物を12000×ｇで30分間遠
心することにより純化し、0.22mmのフィルターで濾過し
た。その後の精製はHPLCによって行ない、C4カラム（Vy
dac 214 TP、2.2×25cm、10mm）を使用して40％〜60％
アセトニトリル／水中0.1％トリフルオロ酢酸/0.1％ト
リフルオロ酢酸の直線濃度勾配により30ml/minの流速で
溶出した。0.1％（w/v）のｎ−オクチルグルコピラノシ
ドを溶出液に加えた後、凍結乾燥によって溶媒を除去し
た。得られた蛋白質を水中に再溶解し、４℃において保
存した。
体の分離を行なった:pREST−CNTFおよびpREST−変種ベ
クターを用いて、菌株BL21（DE3）LysE（SupEマイナス
遺伝子型）のE.coli細胞を形質転換した。形質転換した
細胞を、A600を0.8として0.1mg/mlのアンピシリンを含
有するルリアブロス1l中で37℃において撹拌した。その
後、イソプロピルチオールガラクトシド（0.4mM）を添
加し、37℃においてさらに３時間インキュベートを続け
た。次に遠心によって細菌を回収し、緩衝液Ａ（100mM
Tris−HCl、pH7.5、50mM EDTA、1mM PMSF、10mg/mlロイ
ペプチン）中2ml/gのビーズに再懸濁した。これに0.5mg
/mlのリゾチームと30％w/vのショ糖を添加した。この懸
濁液を30℃で１時間インキュベートした。等量の緩衝液
Ａを添加した後、800バールの圧力で「フレンチプレ
ス」を２回通過させることにより、細菌を溶菌させた。
12000×ｇで30分間遠心することによって、封入体を分
離した。ビーズを2Mの塩化グアニジン溶液中に再懸濁
し、同溶液を用いて３回洗出した。最終ビーズを5mlの8
M塩化グアニジン溶液中に再懸濁し、直ちに緩衝液Ａで
４倍に希釈した。12000×ｇで30分間遠心した後、上清
を４℃において透析した。透析外液は、最初の３回が10
mM Tris−HCL、5mM EDTA、0.1mM DTT pH8、および漸減
濃度の塩化グアニジン（1M、0.5M、0M、各一晩ずつ）で
もう１回が20mM Tris、0.1mM EDTA、1mM DTT、25mM NaC
l、pH8であった。最終透析産物を12000×ｇで30分間遠
心することにより純化し、0.22mmのフィルターで濾過し
た。その後の精製はHPLCによって行ない、C4カラム（Vy
dac 214 TP、2.2×25cm、10mm）を使用して40％〜60％
アセトニトリル／水中0.1％トリフルオロ酢酸/0.1％ト
リフルオロ酢酸の直線濃度勾配により30ml/minの流速で
溶出した。0.1％（w/v）のｎ−オクチルグルコピラノシ
ドを溶出液に加えた後、凍結乾燥によって溶媒を除去し
た。得られた蛋白質を水中に再溶解し、４℃において保
存した。
CNTFRα受容体結合試験。
CNTF変種が細胞外のCNTFRα受容体領域への結合に関
してビオチニル化CNTF（8nM）と競合し得るかどうかに
ついて、以前の報告で記載したように（19）、可溶性gp
130の存在下での固相結合試験において検討した。「マ
イクロタイター」96穴ポリスチレン製培養プレートを、
ｃ−mycエピトープに対するモノクローナル抗体9E10
（0.2mg）を含有する50mM炭酸ナトリウムpH9.5 100ml中
に浸し、プレートを４℃で一晩放置した。その後、0.05
％のTweenを含有するTBS（50mM Tris−HCl、pH7.5、150
mM NaCl）で穴を５回洗浄し、TBSMT（50mM Tris−HCl、
150mM NaCl、５％（w/v）凍結乾燥脱脂乳）中で室温に
おいて90分間放置した。以後すべてのインキュベーショ
ンは700rpmの速さのミキサー上で室温において行ない、
各インキュベーションの後0.05％のTweenを含有するTBS
によって穴を洗浄した（それぞれ５回ずつ）。次のイン
キュベーションを行なった：（１）10mgのCNTFRα−myc
を含有するTBSMT 50mlと共に２時間；（２）200ngのgp1
30−flag、5nMのビオチニル化CNTF、および各種競合物
質を含有するTBSMT 50mlと共に１時間；および（３）50
mlのTBS、５％（w/v）のウシ血清アルブミン、アルカリ
性ホスファターゼと結合させた0.8mg/mlのアビジンを含
有する0.05％（v/v）のTween 20と共に45分間。
してビオチニル化CNTF（8nM）と競合し得るかどうかに
ついて、以前の報告で記載したように（19）、可溶性gp
130の存在下での固相結合試験において検討した。「マ
イクロタイター」96穴ポリスチレン製培養プレートを、
ｃ−mycエピトープに対するモノクローナル抗体9E10
（0.2mg）を含有する50mM炭酸ナトリウムpH9.5 100ml中
に浸し、プレートを４℃で一晩放置した。その後、0.05
％のTweenを含有するTBS（50mM Tris−HCl、pH7.5、150
mM NaCl）で穴を５回洗浄し、TBSMT（50mM Tris−HCl、
150mM NaCl、５％（w/v）凍結乾燥脱脂乳）中で室温に
おいて90分間放置した。以後すべてのインキュベーショ
ンは700rpmの速さのミキサー上で室温において行ない、
各インキュベーションの後0.05％のTweenを含有するTBS
によって穴を洗浄した（それぞれ５回ずつ）。次のイン
キュベーションを行なった：（１）10mgのCNTFRα−myc
を含有するTBSMT 50mlと共に２時間；（２）200ngのgp1
30−flag、5nMのビオチニル化CNTF、および各種競合物
質を含有するTBSMT 50mlと共に１時間；および（３）50
mlのTBS、５％（w/v）のウシ血清アルブミン、アルカリ
性ホスファターゼと結合させた0.8mg/mlのアビジンを含
有する0.05％（v/v）のTween 20と共に45分間。
37℃で1Mジエタノールアミン−HCl、pH9.8中1mg/ml p
−ニトロフェニルホスフェートを用いてアルカリ性ホス
ファターゼの活性を測定し、40〜60分後に適当な測定機
器を用いて405nmにおける吸光度を測定した。実験によ
っては、リガンドとしてビオチニル化MUT−DH変種分子
（0.5nM）を使用した。
−ニトロフェニルホスフェートを用いてアルカリ性ホス
ファターゼの活性を測定し、40〜60分後に適当な測定機
器を用いて405nmにおける吸光度を測定した。実験によ
っては、リガンドとしてビオチニル化MUT−DH変種分子
（0.5nM）を使用した。
競合試験から、Phe152およびLys155の残基をアラニン
で置換してもCNTFRα受容体との相互作用に変化はない
ことが示された。２種類の変異体Lys155Ala/CNTFおよび
Phe152Ala/Lys155Ala/CNTFは、受容体との結合において
野性型分子と同程度の力価を有していた。以前に報告し
たように（18）、MUT−DH分子は受容体との結合におい
てCNTFより約40倍も強力である。この場合、変異体Phe1
52Ala/MUT−DH、Lys155Ala/MUT−DHおよびPhe152Ala/Ly
s155Ala/MUT−DHも受容体との結合において原型分子（M
UT−DH）と同等の力価を示した。これらの結果は表２に
明示してあり、Phe152およびLys155の両残基はCNTFRα
受容体への結合に関与しないことが実証される。
で置換してもCNTFRα受容体との相互作用に変化はない
ことが示された。２種類の変異体Lys155Ala/CNTFおよび
Phe152Ala/Lys155Ala/CNTFは、受容体との結合において
野性型分子と同程度の力価を有していた。以前に報告し
たように（18）、MUT−DH分子は受容体との結合におい
てCNTFより約40倍も強力である。この場合、変異体Phe1
52Ala/MUT−DH、Lys155Ala/MUT−DHおよびPhe152Ala/Ly
s155Ala/MUT−DHも受容体との結合において原型分子（M
UT−DH）と同等の力価を示した。これらの結果は表２に
明示してあり、Phe152およびLys155の両残基はCNTFRα
受容体への結合に関与しないことが実証される。
in vitroにおける受容体複合体の会合 文献から、gp130およびLIFRの分子は独立してCNTF/CN
TFRα複合体に結合し得ることが知られている（11）。D
1モチーフ残基の機能的重要性について評価するため、C
NTF変種が異なるサブユニットと受容体複合体を会合さ
せる能力の測定を行なった。文献中の記載に従い（1
1）、免疫沈降試験を利用して35Sで標識したgp130ある
いはLIFRへのサイトカイン/CNTFRα複合体の結合度を測
定した。モノクローナル抗体9E10 抗mycを用いて可溶性
のCNTFRα受容体をＡ−セファロース蛋白質上に不動化
し、CNTF変種の不在下または各量のCNTF変種（１または
0.1mg）の存在下で、35Sにより標識した可溶性のgp130
もしくはLIFRと共にインキュベートした。洗浄した後、
結合した物質を溶出し、SDS−PAGEを行なった。
TFRα複合体に結合し得ることが知られている（11）。D
1モチーフ残基の機能的重要性について評価するため、C
NTF変種が異なるサブユニットと受容体複合体を会合さ
せる能力の測定を行なった。文献中の記載に従い（1
1）、免疫沈降試験を利用して35Sで標識したgp130ある
いはLIFRへのサイトカイン/CNTFRα複合体の結合度を測
定した。モノクローナル抗体9E10 抗mycを用いて可溶性
のCNTFRα受容体をＡ−セファロース蛋白質上に不動化
し、CNTF変種の不在下または各量のCNTF変種（１または
0.1mg）の存在下で、35Sにより標識した可溶性のgp130
もしくはLIFRと共にインキュベートした。洗浄した後、
結合した物質を溶出し、SDS−PAGEを行なった。
図1Aに示すように、複合体MUT−DH/CNTFRαへのgp130
の結合はPhe152A（カラムAK/DH）、Lys155A（カラムFA
−DH）およびPhe152A/Lys155A（カラムAA/DH）の置換に
よる影響を受けない。これに対して、図1Bから明らかな
ように、これらの置換を単独で、あるいは併せもつ変種
はLIFR受容体に結合することができなかった。変種が３
部から成る複合体CNTFRα/gp130/LIFRを形成できるかど
うか検討するために、LIFR受容体を蛋白質Ａ−セファロ
ース上に不動化し、可溶性のCNTFRα、35Sで標識した可
溶性のgp130、およびCNTF変種（この場合、２種類の量
の変種分子（１または0.1mg）に関して実験を２回実施
した）と共にインキュベートした。
の結合はPhe152A（カラムAK/DH）、Lys155A（カラムFA
−DH）およびPhe152A/Lys155A（カラムAA/DH）の置換に
よる影響を受けない。これに対して、図1Bから明らかな
ように、これらの置換を単独で、あるいは併せもつ変種
はLIFR受容体に結合することができなかった。変種が３
部から成る複合体CNTFRα/gp130/LIFRを形成できるかど
うか検討するために、LIFR受容体を蛋白質Ａ−セファロ
ース上に不動化し、可溶性のCNTFRα、35Sで標識した可
溶性のgp130、およびCNTF変種（この場合、２種類の量
の変種分子（１または0.1mg）に関して実験を２回実施
した）と共にインキュベートした。
最初の２つの試験の結果と一致して、変種分子はCNTF
Rα/gp130/LIFR複合体と結合できなかった。これは細胞
表面上での生理学的活性をもつ型のCNTF受容体に相当す
る（図1Cを参照）。
Rα/gp130/LIFR複合体と結合できなかった。これは細胞
表面上での生理学的活性をもつ型のCNTF受容体に相当す
る（図1Cを参照）。
これらの結果から、Phe152とLys155はLIFR受容体結合
部位の一部を形成していることが示される。
部位の一部を形成していることが示される。
例２ CNTF変異体の生物学的活性 ヒトヘパトーマ細胞によるハプトグロビン分泌に関する
試験 CNTF（または変異体）が可溶性のCNTFRαと細胞由来
のLIF受容体との間で機能的な受容体複合体を会合させ
得るかどうか測定することのできる細胞試験により、生
物学的活性を測定した。ヒトのヘパトーマ細胞株HepG2
はCNTFRαを発現していないが、LIF受容体を発現してお
り、高濃度のサイトカインに対してのみ反応する。これ
はおそらく、CNTFと細胞由来のLIF受容体との間の相互
作用の親和性が低いためであると思われる。（18、1
3）。試験は次のようにして実施した。最初に、HepG2細
胞を集満的細胞単層を形成するまで96穴プレートで生育
させ、1mMのデキサメタゾン（14）を含有する最少培養
培地中に移した後、精製したCNTFまたは被験変種分子で
24時間処理した。培養培地中に分泌されたハプトグロビ
ンの量を、ELISA試験を用いて測定した。
試験 CNTF（または変異体）が可溶性のCNTFRαと細胞由来
のLIF受容体との間で機能的な受容体複合体を会合させ
得るかどうか測定することのできる細胞試験により、生
物学的活性を測定した。ヒトのヘパトーマ細胞株HepG2
はCNTFRαを発現していないが、LIF受容体を発現してお
り、高濃度のサイトカインに対してのみ反応する。これ
はおそらく、CNTFと細胞由来のLIF受容体との間の相互
作用の親和性が低いためであると思われる。（18、1
3）。試験は次のようにして実施した。最初に、HepG2細
胞を集満的細胞単層を形成するまで96穴プレートで生育
させ、1mMのデキサメタゾン（14）を含有する最少培養
培地中に移した後、精製したCNTFまたは被験変種分子で
24時間処理した。培養培地中に分泌されたハプトグロビ
ンの量を、ELISA試験を用いて測定した。
ハプトグロビンの分泌は細胞由来のLIFR受容体によっ
て媒介されるため、この受容体への結合に障害を及ぼす
アミノ酸置換を行あうとこの型の生物学的活性が野性型
分子と比較して大きく低下するものと推測される。実
際、アラニンによるPhe152またはLys155の置換によって
高濃度における生物学的活性が弱くなる（最大値に関し
て約20％）と、両残基をアラニンで同時に置換した場合
に高濃度においてさえも生物学的活性が完全に消失する
（図2A）。可溶性のCNTFRαの存在下では、完全な受容
体複合体が形成されるため、LIFRおよびgp130受容体を
もつ細胞が低濃度のCNTFに対して感受性を示すようにな
る。図2Bから明らかなように、外因性CNTFRαの濃度が
上昇すると低濃度のCNTFおよびその変種に対しても細胞
が反応するようになる。
て媒介されるため、この受容体への結合に障害を及ぼす
アミノ酸置換を行あうとこの型の生物学的活性が野性型
分子と比較して大きく低下するものと推測される。実
際、アラニンによるPhe152またはLys155の置換によって
高濃度における生物学的活性が弱くなる（最大値に関し
て約20％）と、両残基をアラニンで同時に置換した場合
に高濃度においてさえも生物学的活性が完全に消失する
（図2A）。可溶性のCNTFRαの存在下では、完全な受容
体複合体が形成されるため、LIFRおよびgp130受容体を
もつ細胞が低濃度のCNTFに対して感受性を示すようにな
る。図2Bから明らかなように、外因性CNTFRαの濃度が
上昇すると低濃度のCNTFおよびその変種に対しても細胞
が反応するようになる。
単一の変種の挙動の分析に関しては、変異体Lys155Al
a/CNTF（FA−CNTF）およびLys155Ala/MUT−DH（FADH−C
NTF）の生物学的活性は著しく低下するが、完全に消失
することはない。一方、Phe152残基をアラニンで置換し
た場合（AKDH−CNTF）には、Lys155残基を置換した場合
よりも生物学的活性の低下の程度が低く、両方の残基を
同時に置換すると（AADH−CNTF）両受容体およびサイト
カインの濃度が高くてもこの活性は完全に消失する。
a/CNTF（FA−CNTF）およびLys155Ala/MUT−DH（FADH−C
NTF）の生物学的活性は著しく低下するが、完全に消失
することはない。一方、Phe152残基をアラニンで置換し
た場合（AKDH−CNTF）には、Lys155残基を置換した場合
よりも生物学的活性の低下の程度が低く、両方の残基を
同時に置換すると（AADH−CNTF）両受容体およびサイト
カインの濃度が高くてもこの活性は完全に消失する。
IMR−32細胞におけるコリンアセチルトランスフェラー
ゼ（Chat）活性の促進 膜に結合したCNTFニューロン受容体に対する変種の作
用について検討するため、文献による方法（15、22）を
用い、変種分子がヒト神経芽細胞腫（IMR−32）におい
てChat活性を刺激し得るかどうか試験を行なった。これ
らの細胞は、構造上CNTFRα受容体を発現している。IMR
−32の膜結合受容体は、第152位および155位における単
一変異の作用に対する感受性が可溶性受容体よりも低い
ことが確認された。変異体Phe152Ala/MUT−DHは野性型
サイトカインと同程度の活性を示し、変種Lys155Ala/CN
TFおよびLys155Ala/MUT−DHは実際に強力な作動薬であ
ることが明らかになった。しかし、この場合、２種類の
残基を同時に置換することによって、生物学的活性が完
全に消失する。
ゼ（Chat）活性の促進 膜に結合したCNTFニューロン受容体に対する変種の作
用について検討するため、文献による方法（15、22）を
用い、変種分子がヒト神経芽細胞腫（IMR−32）におい
てChat活性を刺激し得るかどうか試験を行なった。これ
らの細胞は、構造上CNTFRα受容体を発現している。IMR
−32の膜結合受容体は、第152位および155位における単
一変異の作用に対する感受性が可溶性受容体よりも低い
ことが確認された。変異体Phe152Ala/MUT−DHは野性型
サイトカインと同程度の活性を示し、変種Lys155Ala/CN
TFおよびLys155Ala/MUT−DHは実際に強力な作動薬であ
ることが明らかになった。しかし、この場合、２種類の
残基を同時に置換することによって、生物学的活性が完
全に消失する。
変異体Phe152AlaおよびLys155AlaがIMR−32細胞にお
いて高い生物学的活性を示すのは、おそらく細胞表面上
の受容体サブユニットの局所濃度が高いことに起因する
と思われる。実際、LIFR受容体結合能が低下したCNTF変
異体は、運動機能に関与するものと同様、膜受容体複合
体を多量に発現する他のニューロン群に対する強い刺激
活性を維持し続けると予想される。例えば急性反応等、
CNTFの投与によって起こる副作用は、循環する可溶性CN
TFRα受容体がLIFR受容体を発現する細胞（例えば肝細
胞）に対して発揮する作用によって媒介されると考えら
れている。したがって、可溶性の受容体と相互作用する
時には活性が弱いが細胞の膜に結合した受容体複合体と
の相互作用では高い生物学的活性を示すようなCNTF変異
体は、ニューロンへの作用がより特異的であり末梢の副
作用が少ないことが期待される。
いて高い生物学的活性を示すのは、おそらく細胞表面上
の受容体サブユニットの局所濃度が高いことに起因する
と思われる。実際、LIFR受容体結合能が低下したCNTF変
異体は、運動機能に関与するものと同様、膜受容体複合
体を多量に発現する他のニューロン群に対する強い刺激
活性を維持し続けると予想される。例えば急性反応等、
CNTFの投与によって起こる副作用は、循環する可溶性CN
TFRα受容体がLIFR受容体を発現する細胞（例えば肝細
胞）に対して発揮する作用によって媒介されると考えら
れている。したがって、可溶性の受容体と相互作用する
時には活性が弱いが細胞の膜に結合した受容体複合体と
の相互作用では高い生物学的活性を示すようなCNTF変異
体は、ニューロンへの作用がより特異的であり末梢の副
作用が少ないことが期待される。
例３ 特定のCNTF変種の拮抗薬特性 LIF受容体への結合能が消失しているがCNTFRαとgp13
0を会合させる能力を残しているCNTF変異体は、競合的
拮抗薬として作用することが期待される。例２に記載し
た方法を用い、これら変異体によるCNTFの生物学的活性
の阻害をIMR−32細胞において試験した。変種タンパク
質Phe152Ala/Lys155Ala/MUT−DHは、CNTFの反応曲線を
作動薬分子の濃度が高い方に移行させるので、膜に結合
したCNTFRα受容体上で競合的拮抗薬として働くことが
実証される。準飽和濃度のCNTFによるChat活性の50％阻
害は、70倍過剰のPhe152Ala/Lys155Ala/MUT−DHによっ
て得られた（図4B）。
0を会合させる能力を残しているCNTF変異体は、競合的
拮抗薬として作用することが期待される。例２に記載し
た方法を用い、これら変異体によるCNTFの生物学的活性
の阻害をIMR−32細胞において試験した。変種タンパク
質Phe152Ala/Lys155Ala/MUT−DHは、CNTFの反応曲線を
作動薬分子の濃度が高い方に移行させるので、膜に結合
したCNTFRα受容体上で競合的拮抗薬として働くことが
実証される。準飽和濃度のCNTFによるChat活性の50％阻
害は、70倍過剰のPhe152Ala/Lys155Ala/MUT−DHによっ
て得られた（図4B）。
例４ CNTF変種の構造 pRSET−CNTFまたはpRSET−MUT−DHベクター（イタリ
ア特許申請番号RM9500380）をテンプレートとして使用
し、逆PCR（Hemsleyら、1989年）によってヒトCNTFある
いはS166D/Q167H/CNTF（DH−CNTF）内に変異を導入し
た。二重構造上で「背中合わせ」になるように合成オリ
ゴヌクレオチドプライマーを構築し、5'末端は並列さ
せ、3'末端はプラスミド環の周囲で反対の方向に伸張す
るよう方向付けた。使用したプライマーは次のとおりで
あった： これらの変異体プライマーを野性型のセンスプライマ
ーと共にPCRにおいて用いた： テンプレートDNA（10fmol）とプライマーセット（各1
mM）を、100mM Tris−HCl pH8.3、500mM KCl、15mM MgC
l2、0.2mM各dNTPおよび２単位のTaqポリメラーゼ（Boeh
ringer）を含有する反応溶液100ml中でインキュベート
した。
ア特許申請番号RM9500380）をテンプレートとして使用
し、逆PCR（Hemsleyら、1989年）によってヒトCNTFある
いはS166D/Q167H/CNTF（DH−CNTF）内に変異を導入し
た。二重構造上で「背中合わせ」になるように合成オリ
ゴヌクレオチドプライマーを構築し、5'末端は並列さ
せ、3'末端はプラスミド環の周囲で反対の方向に伸張す
るよう方向付けた。使用したプライマーは次のとおりで
あった： これらの変異体プライマーを野性型のセンスプライマ
ーと共にPCRにおいて用いた： テンプレートDNA（10fmol）とプライマーセット（各1
mM）を、100mM Tris−HCl pH8.3、500mM KCl、15mM MgC
l2、0.2mM各dNTPおよび２単位のTaqポリメラーゼ（Boeh
ringer）を含有する反応溶液100ml中でインキュベート
した。
増幅は、94℃における変性（１分間）、45℃における
結合（１分間）および72℃におけるプライマー伸張（12
分間）を１サイクルとして計25サイクル行なうことによ
り進行させた。PCRにより得られた試料のうち５μｌを
アガロースゲル（0.7％）上で分析し、増幅効率を測定
した。残り（95ml）をE.coliポリメラーゼＩ（20単位）
のクレノーフラグメントおよび最終濃度が各250mMであ
る４種類のdNTPで処理した。反応混合物を37℃において
30分間インキュベートした。Wizard PCR preps DNA精製
システム（Promega）を用いてPCR反応混合液から二重鎖
DNAを分離し、20単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ（P
romega）および1mMのATPと共にインキュベートすること
により5'末端をリン酸化した。
結合（１分間）および72℃におけるプライマー伸張（12
分間）を１サイクルとして計25サイクル行なうことによ
り進行させた。PCRにより得られた試料のうち５μｌを
アガロースゲル（0.7％）上で分析し、増幅効率を測定
した。残り（95ml）をE.coliポリメラーゼＩ（20単位）
のクレノーフラグメントおよび最終濃度が各250mMであ
る４種類のdNTPで処理した。反応混合物を37℃において
30分間インキュベートした。Wizard PCR preps DNA精製
システム（Promega）を用いてPCR反応混合液から二重鎖
DNAを分離し、20単位のT4ポリヌクレオチドキナーゼ（P
romega）および1mMのATPと共にインキュベートすること
により5'末端をリン酸化した。
次に、リン酸化したDNA試料をアガロースゲル（0.7
％）上で電気泳動し、該当するバンドを切り出し、Qiag
en DNA精製キットを用いて精製した。10μｌのDNA（計2
5mlのうち）を、標準平滑末端ライゲーション緩衝液お
よびT4 DNAリガーゼ（12単位）を含有するリガーゼ反応
液に添加した。ライゲーション混合液を16℃で一晩イン
キュベートした後、65℃まで加熱し、形質転換能のある
E.coli Top10細胞を形質転換するのに使用した。形質転
換した細胞を分離し、DNA配列分析によってクローンの
本質を確認した。
％）上で電気泳動し、該当するバンドを切り出し、Qiag
en DNA精製キットを用いて精製した。10μｌのDNA（計2
5mlのうち）を、標準平滑末端ライゲーション緩衝液お
よびT4 DNAリガーゼ（12単位）を含有するリガーゼ反応
液に添加した。ライゲーション混合液を16℃で一晩イン
キュベートした後、65℃まで加熱し、形質転換能のある
E.coli Top10細胞を形質転換するのに使用した。形質転
換した細胞を分離し、DNA配列分析によってクローンの
本質を確認した。
AA−CNTFおよびAADH−CNTFをコードする配列には、第
208番および435番のヌクレオチドにさらに２箇所の変異
（おそらくPCRによって発生したエラー）があることが
明らかになった。後者の変異は、以下のセンスプライマ
ーおよびアンチセンスプライマーを用いたPCRによって
消失した： 製造者の指示に従って2.5Uのpfu DNAポリメラーゼ（S
tratagene）を使用し、94℃において140秒間、50℃にお
いて140秒間、および72℃において190秒間を１サイクル
とするPCRを30サイクル行なった。上述の方法によりPCR
産物を分離し、Nco I（CNTFコード配列の第−２番ヌク
レオチドの位置）およびPst I（コード配列の第484番ヌ
クレオチドの位置）で切断した後、Nco I/Pst Iで切断
したpRSET−CNTFまたはpRSET−DH−CNTFベクター内にサ
ブクローニングした。この手順によって、AA−CNTFまた
はAADH−CNTFをコードする配列を含むベクターが得ら
れ、第208番ヌクレオチドの位置の変異が残る。この変
異は、ベクターをHind III（コード配列の第233番ヌク
レオチドおよび末端の位置）で切断し、大きい制限フラ
グメント（第１番ヌクレオチドから第233番ヌクレオチ
ドで構成される）をpRSET−CNTFからの該当フラグメン
トで置換することによって消失した。
208番および435番のヌクレオチドにさらに２箇所の変異
（おそらくPCRによって発生したエラー）があることが
明らかになった。後者の変異は、以下のセンスプライマ
ーおよびアンチセンスプライマーを用いたPCRによって
消失した： 製造者の指示に従って2.5Uのpfu DNAポリメラーゼ（S
tratagene）を使用し、94℃において140秒間、50℃にお
いて140秒間、および72℃において190秒間を１サイクル
とするPCRを30サイクル行なった。上述の方法によりPCR
産物を分離し、Nco I（CNTFコード配列の第−２番ヌク
レオチドの位置）およびPst I（コード配列の第484番ヌ
クレオチドの位置）で切断した後、Nco I/Pst Iで切断
したpRSET−CNTFまたはpRSET−DH−CNTFベクター内にサ
ブクローニングした。この手順によって、AA−CNTFまた
はAADH−CNTFをコードする配列を含むベクターが得ら
れ、第208番ヌクレオチドの位置の変異が残る。この変
異は、ベクターをHind III（コード配列の第233番ヌク
レオチドおよび末端の位置）で切断し、大きい制限フラ
グメント（第１番ヌクレオチドから第233番ヌクレオチ
ドで構成される）をpRSET−CNTFからの該当フラグメン
トで置換することによって消失した。
配列表 一般情報 （ｉ）出願人： INSTITUTO DI RICERCHE DI BIOLOGIA MOLECOLARE P.ANG
ELETTI S.p.A. （ii）発明の名称：「野性型分子とは異なる範囲の作用
をもつヒト毛様体神経栄養因子（hCNTF）の変種」 （iii）配列番号:7 （iv）郵便宛名： （Ａ）名宛人:Societa'Italiana Brevetti （Ｂ）地番:Piazza di Pietra、39 （Ｃ）市：ローマ （Ｄ）国：イタリア （Ｅ）郵便番号:I−00186 （ｖ）コンピュータ読取り形式： （Ａ）サポートするタイプ:3.5インチフロッピーディ
スク、1.44メガバイト （Ｂ）コンピュータ:IBM PC互換機 （Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS R
ev.5.0 （Ｄ）ソフトウエア:Microsoft Word 6.0 （viii）担当部署 （Ａ）氏名:DI CERBO Mario（博士） （Ｂ）整理番号:RM/X88808/PC−DC （ix）テレコミュニケイション情報 （Ａ）電話:06/6785941 （Ｂ）テレファックス:06/6794692 （Ｃ）テレックス:612287 ROPAT （１）配列番号１に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：アミノ酸16個 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）分子の型：タンパク （ix）他の特徴 （Ａ）名称:hCNTF （Ｂ）追加情報：第152位から第167位までのヒト
CNTF配列。
ELETTI S.p.A. （ii）発明の名称：「野性型分子とは異なる範囲の作用
をもつヒト毛様体神経栄養因子（hCNTF）の変種」 （iii）配列番号:7 （iv）郵便宛名： （Ａ）名宛人:Societa'Italiana Brevetti （Ｂ）地番:Piazza di Pietra、39 （Ｃ）市：ローマ （Ｄ）国：イタリア （Ｅ）郵便番号:I−00186 （ｖ）コンピュータ読取り形式： （Ａ）サポートするタイプ:3.5インチフロッピーディ
スク、1.44メガバイト （Ｂ）コンピュータ:IBM PC互換機 （Ｃ）オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS R
ev.5.0 （Ｄ）ソフトウエア:Microsoft Word 6.0 （viii）担当部署 （Ａ）氏名:DI CERBO Mario（博士） （Ｂ）整理番号:RM/X88808/PC−DC （ix）テレコミュニケイション情報 （Ａ）電話:06/6785941 （Ｂ）テレファックス:06/6794692 （Ｃ）テレックス:612287 ROPAT （１）配列番号１に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：アミノ酸16個 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）分子の型：タンパク （ix）他の特徴 （Ａ）名称:hCNTF （Ｂ）追加情報：第152位から第167位までのヒト
CNTF配列。
（xi）配列番号１の配列： （２）配列番号２に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：アミノ酸16個 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ii）分子の型：タンパク （ix）他の特徴 （Ａ）名称：（Ser166Asp/Gln167His）hCNTF （Ｂ）追加情報：第152位から第167位までのヒト
CNTF配列 （xi）配列番号２の配列： （３）配列番号３に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：アミノ酸16個 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ix）他の特徴 （Ａ）名称：（Phe152Ala/Ser166Asp/Gln167Hi
s）hCNTF （Ｂ）追加情報：第152位から第167位までのヒト
CNTF配列 （xi）配列番号３の配列： （４）配列番号４に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：アミノ酸16個 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ix）他の特徴 （Ａ）名称：（Lys155Ala/Ser166Asp/Gln167Hi
s）hCNTF （Ｂ）追加情報：第152位から第167位までのヒト
CNTF配列 （xi）配列番号４の配列： （５）配列番号５に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：アミノ酸16個 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ix）他の特徴 （Ａ）名称：（Phe152Ala/Lys155Ala）hCNTF （Ｂ）追加情報：第152位から第167位までのヒト
CNTF配列 （xi）配列番号５の配列： （６）配列番号６に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：アミノ酸16個 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ix）他の特徴 （Ａ）名称：（Lys155Ala）hCNTF） （Ｂ）追加情報：第152位から第167位までのヒト
CNTF配列 （xi）配列番号６の配列： （７）配列番号７に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：アミノ酸16個 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ix）他の特徴 （Ａ）名称：（Phe152Ala/Lys155Ala/Ser166Asp/
Gln167His）hCNTF （Ｂ）追加情報：第152位から第167位までのヒト
CNTF配列 （xi）配列番号７の配列：
CNTF配列 （xi）配列番号２の配列： （３）配列番号３に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：アミノ酸16個 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ix）他の特徴 （Ａ）名称：（Phe152Ala/Ser166Asp/Gln167Hi
s）hCNTF （Ｂ）追加情報：第152位から第167位までのヒト
CNTF配列 （xi）配列番号３の配列： （４）配列番号４に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：アミノ酸16個 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ix）他の特徴 （Ａ）名称：（Lys155Ala/Ser166Asp/Gln167Hi
s）hCNTF （Ｂ）追加情報：第152位から第167位までのヒト
CNTF配列 （xi）配列番号４の配列： （５）配列番号５に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：アミノ酸16個 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ix）他の特徴 （Ａ）名称：（Phe152Ala/Lys155Ala）hCNTF （Ｂ）追加情報：第152位から第167位までのヒト
CNTF配列 （xi）配列番号５の配列： （６）配列番号６に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：アミノ酸16個 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ix）他の特徴 （Ａ）名称：（Lys155Ala）hCNTF） （Ｂ）追加情報：第152位から第167位までのヒト
CNTF配列 （xi）配列番号６の配列： （７）配列番号７に関する情報 （ｉ）配列の特徴 （Ａ）配列の長さ：アミノ酸16個 （Ｂ）配列の型：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：不明 （ix）他の特徴 （Ａ）名称：（Phe152Ala/Lys155Ala/Ser166Asp/
Gln167His）hCNTF （Ｂ）追加情報：第152位から第167位までのヒト
CNTF配列 （xi）配列番号７の配列：
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 国際公開96／1319（ＷＯ，Ａ１) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，1995年，92，ｐ．8579− 8583 Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ, 1995年，14（13），ｐ．3045−3054 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/00 - 14/825 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (13)
- 【請求項１】ヒト毛様体神経栄養因子hCNTFの変種であ
って、第152位のフェニルアラニン残基をアミノ酸であ
るアラニンで置換していることを特徴とするか、又は第
152位のフェニルアラニン若しくは第155位のリシン残基
をアミノ酸であるアラニンで置換しており、かつ第166
位のセリン及び第167位のグルタミン残基をそれぞれア
スパラギン酸及びヒスチジンにより置換していることを
特徴とし、野生型のhCNTFに比べ、LIFRに対してより弱
い結合親和力を有し、α−hCNTFRに対しては変わらない
結合親和力を有する上記変種。 - 【請求項２】配列番号３及び配列番号４で表される配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む請求項１
に記載の変種。 - 【請求項３】野生型のhCNTFの受容体作動薬として使用
するための、請求項１又は２に記載の変種。 - 【請求項４】医薬として使用するための、請求項１〜３
のいずれか一項に記載の変種。 - 【請求項５】hCNTFに応答する細胞を含む障害の治療用
医薬組成物であって、第152位のフェニルアラニン又は
第155位のリシン残基のいずれかをアミノ酸であるアラ
ニンで置換しており、野生型のhCNTFに比べ、LIFRに対
してより弱い結合親和力を有し、α−hCNTFRに対しては
変わらない結合親和力を有するヒト毛様体神経栄養因子
hCNTFの変種を少なくとも一種含有する、上記医薬組成
物。 - 【請求項６】変種がさらに第166位のセリン及び第167位
のグルタミンにおいて、それぞれアスパラギン酸及びヒ
スチジンにより置換されている、請求項５に記載の医薬
組成物。 - 【請求項７】請求項１〜４のいずれか一項に記載の変種
を少なくとも一種含有する、hCNTFに応答する細胞を含
む障害の治療用医薬組成物。 - 【請求項８】変種が配列番号３、配列番号４又は配列番
号６で表されるアミノ酸配列を含む、請求項５又は６に
記載の医薬組成物。 - 【請求項９】細胞が神経細胞である、請求項５〜８のい
ずれか一項に記載の医薬組成物。 - 【請求項１０】障害が神経系に影響を与える、請求項５
〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。 - 【請求項１１】障害が神経系への損傷を含む、請求項10
に記載の医薬組成物。 - 【請求項１２】障害が病理である、請求項５〜11のいず
れか一項に記載の医薬組成物。 - 【請求項１３】病理が、ヒト運動ニューロン病、ヒト神
経変性病からなる群から選択される、請求項12に記載の
医薬組成物。
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|---|---|---|---|
| IT96RM000492A IT1284867B1 (it) | 1996-07-10 | 1996-07-10 | Varianti del fattore neurotrofico ciliare umano (hcntf) con uno spettro di azione differente dalla molecola di tipo selvatico |
| IT96A000492 | 1996-07-10 | ||
| PCT/IT1997/000163 WO1998001149A2 (en) | 1996-07-10 | 1997-07-10 | VARIANTS OF HUMAN CILIARY NEUROTROPHIC FACTOR (hCNTF) WITH A RANGE OF ACTION DIFFERENT FROM THAT OF THE WILD-TYPE MOLECULE |
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| CN118141922A (zh) * | 2016-12-06 | 2024-06-07 | 小利兰·斯坦福大学理事会 | 睫状神经营养因子受体配体结合剂及其使用方法 |
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|---|
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９５年，９２，ｐ．８５７９−８５８３ |
| Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９５年，１４（１３），ｐ．３０４５−３０５４ |
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