ES2216001T3 - Polipeptidos de quimioquina humana. - Google Patents

Abstract

SE MUESTRAN QUIMIOQUINAS HUMANAS Y DNA (RNA) QUE CODIFICA DICHOS POLIPEPTIDOS DE QUIMIOQUINA Y PROCESO PARA PRODUCIR DICHOS POLIPEPTIDOS MEDIANTE TECNICAS RECOMBINANTES. TAMBIEN SE MUESTRAN METODOS PARA UTILIZAR DICHOS POLIPEPTIDOS DE QUIMIOQUINA PARA EL TRATAMIENTO DE LA LEUCEMIA, TUMORES, INFECCIONES CRONICAS, ENFERMEDAD AUTOINMUNE, TRASTORNOS FIBROTICOS, CICATRIZACION DE HERIDAS Y PSORIASIS. TAMBIEN SE MUESTRAN ANTAGONISTAS CONTRA DICHOS POLIPEPTIDOS DE QUIMIOQUINA Y SU USO TERAPEUTICO PARA TRATAR LA ARTRITIS REUMATOIDE, ENFERMEDADES INFLAMATORIAS AUTOINMUNES, CRONICAS, E INFECCIOSAS, REACCIONES ALERGICAS, FIEBRE INDEPENDIENTE DE LA PROSTAGLANDINA Y FALLO DE LA MEDULA OSEA.

Description

Polipeptidos de quimioquina humana.

Esta invención se refiere a polinucleótidos recién identificados, a polipéptidos codificados por estos polinucleótidos, al uso de estos polinucleótidos y polipéptidos, así como a la producción de estos polinucleótidos y polipéptidos. Más en concreto, el polipéptido de la presente invención es una quimioquina beta-4 humana, denominada a veces en lo sucesivo en la presente "Ck\beta-4", y denominada colectivamente "el polipéptido de quimioquina". La invención también se refiere a inhibir la acción de este polipéptido.

Las quimioquinas son una superfamilia emergente de pequeñas citoquinas segregadas que están relacionas desde el punto de vista estructural y funcional. Todas la quimioquinas muestran una homología del 25% al 75% al nivel de aminoácidos, y contienen restos cisteína espacialmente conservados, como los polipéptidos de la presente invención. Los miembros de la "rama C-X-C" (según la posición de las primeras dos cisteínas en el motivo conservado), también conocidos como la familia del péptido activador de neutrófilos (NAP, ``neutrophil-activating peptide)/IL-8, ejercen una actividad proinflamatoria principalmente a través de su acción sobre neutrófilos (por ejemplo, IL-8 y NAP-2), mientras que los miembros de la familia de la "rama C-C" parecen atraer a ciertas células mononucleares. Los miembros de la "rama C-C" incluyen PF4, MIP, MCP y el polipéptido de quimioquina de la presente invención.

Se han asignado numerosas actividades biológicas a esta familia de quimioquinas. Las proteínas inflamatorias de macrófagos 1\alpha y 1\beta son quimiotácticas para monocitos y poblaciones de linfocitos diferenciadas (Schall, T.J., Cytokine, 3:165 (1991)), mientras que se ha descrito a MCP-1 como un quimioatrayente específico de monocitos (Matsushima, K. et al., J. Exp. Med., 169:1485 (1989)). La función común de esta familia de quimioquinas es su capacidad para estimular la migración quimiotáctica de grupos diferenciados de células, por ejemplo, células inmunológicas (leucocitos) y fibroblastos. Estas quimioquinas también son capaces de activar ciertas células en esta familia. La técnica anterior también incluye el documento US 5278287, que se refiere a la citoquina JE, y su uso.

Las células inmunológicas que responden a las quimioquinas tienen un vasto número de funciones in vivo y, por tanto, su regulación por estas quimioquinas es un área importante en el tratamiento de una enfermedad.

Por ejemplo, los eosinófilos destruyen parásitos para disminuir una infección parasitaria. Los eosinófilos también son responsables de la inflamación crónica de los conductos respiratorios del sistema respiratorio. Los macrófagos son responsables de suprimir la formación de tumores en vertebrados. Además, los basófilos liberan histamina que puede desempeñar un papel importante en la inflamación alérgica. Por consiguiente, la estimulación y la inhibición de estas células tiene amplias aplicaciones terapéuticas.

Según un aspecto de la presente invención, se proporciona un nuevo polipéptido que es Ck\beta-4, así como sus fragmentos, análogos y derivados. Los polipéptidos de la presente invención son de origen humano.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporcionan polinucleótidos (DNA o RNA) que codifican estos polipéptidos.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un proceso para producir estos polipéptidos mediante técnicas recombinantes.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un proceso para utilizar estos polipéptidos, o polinucleótidos que codifican estos polipéptidos, para fines terapéuticos, por ejemplo, para tratar tumores sólidos, infecciones crónicas, enfermedades autoinmunológicas, psoriasas, asma, alergia, para regular la hematopoyesis, y para estimular la curación de heridas.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporcionan anticuerpos contra estos polipéptidos.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporcionan antagonistas/inhibidores de estos polipéptidos, que pueden utilizarse para inhibir la acción de estos polipéptidos, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades autoinmunológicas, enfermedades infecciosas e inflamatorias crónicas, reacciones alérgicas mediadas por histamina, fiebre independiente de prostaglandinas, insuficiencia de la médula ósea, silicosis, sarcoidosis, síndrome hipereosinófilo e inflamación pulmonar.

Estos y otros aspectos de la presente invención deberían ser evidentes para los expertos en la técnica a partir de las indicaciones de la presente.

Los siguientes dibujos son ilustrativos de las realizaciones de la invención, y no se pretende que limiten el alcance de la invención, según está incluido en las reivindicaciones.

La figura 1 muestra la secuencia de cDNA y la correspondiente secuencia de aminoácidos deducida de Ck\beta-4. Los 24 aminoácidos iniciales representan la secuencia conductora deducida de Ck\beta-4, de forma que el polipéptido maduro putativo comprende 72 aminoácidos. Se utiliza la abreviatura de una letra convencional para aminoácidos.

La figura 2 muestra la homología en la secuencia de aminoácidos entre Ck\beta-4 y el péptido maduro de eotaxina (abajo).

Según un aspecto de la presente invención, se proporcionan ácidos nucleicos aislados (polinucleótidos) que codifican el polipéptido Ck\beta-4 maduro, que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la figura 1, o el polipéptido maduro codificado por el cDNA del clon depositado como ATCC nº de depósito 75848, el 29 de julio, 1994.

El polinucleótido que codifica el Ck\beta-4 se descubrió en un banco de cDNA derivado de una vejiga urinaria humana. El Ck\beta-4 está relacionado, desde el punto de vista estructural, con la familia de quimioquinas. Contiene un marco de lectura abierto que codifica una proteína de 116 restos aminoácidos, de los cuales aproximadamente los primeros 24 restos aminoácidos son la secuencia conductora putativa, de forma que la proteína madura comprende 92 aminoácidos. La proteína muestra el mayor grado de homología con la eotaxina, con un 20% de coincidencia y 37% de similitud a lo largo de la secuencia codificadora completa. También es importante que los cuatro restos cisteína conservados espacialmente en las quimioquinas se encuentran en los polipéptidos de la presente invención.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden estar en forma de RNA o en forma de DNA, incluyendo dicho DNA cDNA, DNA genómico y DNA sintético. El DNA puede bicatenario o monocatenario, y si es monocatenario puede ser la hebra codificadora o la hebra no codificadora (antisentido). La secuencia codificadora que codifica los polipéptidos maduros puede ser idéntica a la secuencia codificadora que aparece en las figuras 1 y 2, o a la de los clones depositados, o puede ser una secuencia codificadora diferente, cuya secuencia codificadora, como resultado de la redundancia o degeneración del código genético, codifica los mismos polipéptidos maduros que el DNA de las figuras 1 y 2 o los cDNA depositados.

Los polinucleótidos que codifican los polipéptidos maduros de la figura 1, o los polipéptidos maduros codificados por el cDNA depositado, pueden incluir: sólo la secuencia codificadora del polipéptido maduro; la secuencia codificadora del polipéptido maduro y otra secuencia codificadora, como una secuencia conductora o secretora, o una secuencia de proproteína; la secuencia codificadora del polipéptido maduro (y opcionalmente otra secuencia codificadora) y una secuencia no codificadora, como intrones o una secuencia 5' y/o 3' no codificadora de la secuencia codificadora de los polipéptidos maduros.

Por tanto, la expresión "polinucleótido que codifica un polipéptido" incluye un polinucleótido que incluye sólo la secuencia codificadora del polipéptido, así como un polinucleótido que incluye otra secuencia codificadora y/o no codificadora.

La presente invención se refiere además a variantes de los polinucleótidos descritos en la presente anteriormente que codifican fragmentos, análogos y derivados del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida de la figura 1, o el polipéptido codificado por el cDNA del clon depositado. El variante de los polinucleótidos puede ser un variante alélico de los polinucleótidos que aparece en la naturaleza o un variante de los polinucleótidos que no aparece en la naturaleza.

Por tanto, la presente invención incluye polinucleótidos que codifican los mismos polipéptidos maduros que aparecen en el figura 1, o los mismos polipéptidos maduros codificados por el cDNA de los clones depositados, así como los variantes de estos polinucleótidos, en los que dichos variantes codifican un fragmento, derivado o análogo del polipéptido de la figura 1, o los polipéptidos codificados por el cDNA del clon depositado. Estos variantes de nucleótidos incluyen variantes de delección, variantes de sustitución y variantes de adición o inserción.

Como se indicó en la presente anteriormente, los polinucleótidos pueden tener una secuencia codificadora que es un variante alélico que aparece en la naturaleza de la secuencia codificadora que aparece en la figura 1, o de la secuencia codificadora del clon depositado. Como se conoce en la técnica, un variante alélico es una forma alternativa de una secuencia de polinucleótido que puede tener una sustitución, deleción o adición de uno o más nucleótidos, que no altera sustancialmente la función del polipéptido codificado.

La presente invención también incluye polinucleótidos, en los que la secuencia codificadora de los polipéptidos maduros puede estar condensada, en el mismo marco de lectura, con una secuencia de polinucleótido que ayuda en la expresión y secreción de un polipéptido a partir de una célula hospedante, por ejemplo, una secuencia conductora que actúa como secuencia secretora para controlar el transporte de un polipéptido desde la célula. El polipéptido que tiene una secuencia conductora es una preproteína y la célula hospedante puede escindir la secuencia conductora, para formar la forma madura de la polipéptido. Los polinucleótidos también pueden codificar una proproteína que es la proteína madura más otros restos aminoácidos 5'. Una proteína madura que tiene una prosecuencia es una proproteína, y es una forma inactiva de la proteína. Cuando la prosecuencia se escinde, lo que queda es una proteína madura activa.

Así, por ejemplo, el polinucleótido de la presente invención puede codificar una proteína madura, o una proteína que tiene una prosecuencia, o una proteína que tiene una prosecuencia y una presecuencia (secuencia conductora).

Los polinucleótidos de la presente invención también pueden tener la secuencia codificadora condensada dentro del marco con una secuencia marcadora que permite la purificación de los polipéptidos de la presente invención. La secuencia marcadora puede ser un marcador de hexa-histidina suministrado por un vector pQE-9 para proporcionar la purificación de los polipéptidos maduros condensados con el marcador en el caso de un hospedante bacteriano o, por ejemplo, la secuencia marcadora puede ser un marcador de hemaglutinina (HA) cuando se utiliza un hospedante mamífero, por ejemplo células COS-7. El marcador de HA se corresponde con un epitopo derivado de la proteína de hemaglutinina de la gripe (Wilson, I. et al., Cell, 37:767 (1984)).

La presente invención se refiere, además, a polinucleótidos que se hibridan con las secuencias descritas en la presente anteriormente, si existe al menos 50% y preferiblemente 70% de coincidencia entre las secuencias. La presente invención se refiere, en particular, a polinucleótidos que se hibridan bajo condiciones estrictas con los polinucleótidos descritos en la presente anteriormente. Tal como se utiliza en la presente, la expresión "condiciones estrictas" significa que la hibridación se producirá sólo si existe al menos 95%, y preferiblemente al menos 97% de coincidencia entre las secuencias. Los polinucleótidos que se hibridan con los polinucleótidos descritos en la presente anteriormente en una realización preferida codifican polipéptidos que mantienen sustancialmente la misma función o actividad biológica que el polipéptido maduro codificado por el cDNA de la figura 1, o el cDNA depositado.

El(los) depósito(s) mencionado(s) en la presente se mantiene(n) bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para fines de Procedimientos de Patente. Estos depósitos se proporcionan simplemente por conveniencia para los expertos en la técnica y no son un reconocimiento de que se requiera un depósito bajo 35 U.S.C. \NAK112. La secuencia de los polinucleótidos contenida en los materiales depositados, así como la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados por ellos, se incorporan en la presente como referencia y son los que regulan en el caso de producirse cualquier conflicto con cualquier descripción de las secuencias en la presente. Puede requerirse una licencia para fabricar, usar o vender los materiales depositados, y esta licencia no se concede por la presente.

La presente invención se refiere además a polipéptidos de quimioquina que tienen la secuencia de aminoácidos deducida de la figura 1, o que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por el cDNA depositado, así como los fragmentos, análogos y derivados de estos polipéptidos.

Los términos "fragmento," "derivado" y "análogo", cuando se refieren a los polipéptidos de la figura 1, o a los codificados por el cDNA depositado, significan polipéptidos que mantienen esencialmente la misma función o actividad biológica que dichos polipéptidos. Por tanto, un análogo incluye una proproteína que puede activarse mediante la escisión de la porción de proproteína para producir un polipéptido maduro activo.

Los polipéptidos de quimioquina de la presente invención pueden ser polipéptidos recombinantes, polipéptidos naturales o polipéptidos sintéticos, preferiblemente polipéptidos recombinantes.

El fragmento, derivado o análogo de los polipéptidos de la figura 1, o el codificado por el cDNA depositado puede ser (i) uno en el que uno o más de los restos aminoácidos están sustituidos por un resto aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un resto aminoácido conservado), y este resto aminoácido sustituido pueder ser o no ser codificado por el código genético, (ii) uno en el que uno o más de los restos aminoácidos incluyen un grupo sustituyente, (iii) uno en el que el polipéptido maduro está condensado con otro compuesto, como un compuesto para aumentar la semivida del polipéptido (por ejemplo, polietilenglicol), o (iv) uno en el que los aminoácidos adicionales están condensados con el polipéptido maduro, como una secuencia conductora o secretora, o una secuencia que se emplea para la purificación del polipéptido maduro o una secuencia de proproteína. Se considera que estos fragmentos, derivados y análogos están dentro del alcance de los expertos en el técnica a partir de las indicaciones de la presentes.

Los polipéptidos y polinucleótidos de la presente invención se proporcionan, preferiblemente, en una forma aislada, y preferiblemente se purifican hasta alcanzar la homogeneidad.

El término "aislado" significa que el material se retira de su medio original (por ejemplo, el medio natural si aparece en la naturaleza). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido que aparece en la naturaleza presente en un animal vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de alguno o todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Estos polinucleótidos pueden ser parte de un vector y/o estos polinucleótidos o polipéptidos pueden ser parte de una composición, y todavía estar aislados, puesto que este vector o composición no es parte de su medio natural.

La presente invención también se refiere a vectores que incluyen polinucleótidos de la presente invención, células hospedantes que están modificadas genéticamente con vectores de la invención, y la producción de polipéptidos de la invención mediante técnicas recombinantes.

Las células hospedantes se modifican genéticamente (se transducen, se trasforman o se transfectan) con los vectors de esta invención que pueden ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, una partícula vírica, un fago, etc. Las células hospedantes modificadas pueden cultivarse en medios nutrientes convencionales modificados como resulte apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar el gen de Ck\beta-4. Las condiciones de cultivo, como temperatura, pH y similares, son las previamente utilizadas con la célula hospedante seleccionada para la expresión, y serán evidentes para los expertos en la técnica.

Los polinucleótidos de la presente invención pueden emplearse para producir polipéptidos mediante técnicas recombinantes. Así, por ejemplo, el polinucleótido puede estar incluido en uno cualquiera de una diversidad de vectores de expresión para expresar un polipéptido. Estos vectores incluyen secuencias de DNA cromosómico, no cromosómico y sintético, por ejemplo, derivados de SV40; plásmidos bacterianos; DNA de fago; baculovirus; plásmidos de levadura; vectores derivados de combinaciones de plásmidos y DNA de fago, DNA vírico como vaccinia, adenovirus, virus de viruela aviar y pseudorabia. Sin embargo puede utilizarse cualquier otro vector siempre que sea replicable y viable en el hospedante.

La secuencia de DNA apropiada puede insertarse en el vector mediante una diversidad de procedimientos. En general, la secuencia de DNA se inserta en un(os) sitio(s) de endonucleasa de restricción apropiado(s) mediante procedimientos conocidos en la técnica. Se considera que estos procedimientos y otros están dentro del alcance de los expertos en la técnica.

La secuencia de DNA en el vector de expresión está unida operativamente con una(s) secuencia(s) de control de la expresión apropiada(s) (promotor) para dirigir la síntesis de mRNA. Como ejemplos representativos de estos promotores, pueden mencionarse: el promotor SV40 o LTR, el lac o trp de E. coli, el promotor P_{L} del fago lambda y otros promotores conocidos por controlar la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o sus virus. El vector de expresión también contiene un sitio de unión a ribosomas para el inicio de la traducción y un terminador de la transcripción. El vector también puede incluir secuencias apropiadas para amplificar la expresión.

Además, los vectores de expresión contienen preferiblemente uno o más genes marcadores seleccionables para proporcionar un rasgo fenotípico para la selección de células hospedantes transformadas, como la resistencia a la neomicina o dihidrofolato-reductasa para un cultivo de células eucariotas, o como la resistencia a tetraciclina o ampicilina en E. coli.

El vector que contiene la secuencia de DNA apropiada como se ha descrito en la presente anteriormente, así como una secuencia de control o promotora apropiada, puede emplearse para transformar un hospedante apropiado para permitir que el hospedante exprese la proteína.

Como ejemplos representativos de los hospedantes apropiados pueden mencionarse: células bacterianas, como E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; células fúngicas, como levaduras; células de insecto, como Drosophila y Sf9; células animales como CHO, COS o melanoma de Bowes; células vegetales, etc. Se considera que la selección de un hospedante apropiado está dentro del alcance de los expertos en la técnica a partir de las indicaciones en la presente.

Más concretamente, la presente invención también incluye constructos recombinantes que comprenden una o más de las secuencias como se describe extensamente anteriormente. Los constructos comprenden un vector, como un vector plásmido o vírico, en el cual se ha insertado una secuencia de la invención, en una orientación directa o inversa. En un aspecto preferido de esta realización, el constructo comprende además secuencias reguladoras, incluyendo, por ejemplo, un promotor unido operablemente a la secuencia. Los expertos en la técnica conocen un gran número de vectores y promotores adecuados, y están disponibles en el mercado. Se proporcionan los siguientes vectores como ejemplo. Bacterianos: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBS, pD10, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8a, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia). Eucariotas: pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene), pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia). Sin embargo, puede utilizarse cualquier otro plásmido o vector siempre que sean replicables y viables en el hospedante.

Las regiones promotoras pueden seleccionarse a partir de cualquier gen deseado utilizando vectores de CAT (cloranfenicol-transferasa) u otros vectores con marcadores seleccionables. Dos vectores apropiados con pKK232-8 y pCM7. Los promotores bacterianos nombrados de forma particular incluyen lacI, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P_{R}, P_{L} y trp. Los promotores eucariotas incluyen el inmediato temprano de CMV, la timidina-quinasa de HSV, el temprano y tardío de SV40, LTR de retrovirus, y metalotioneína-I de ratón. La selección del vector y promotor apropiado está dentro del nivel de un experto en la técnica.

En otra realización, la presente invención se refiere a células hospedantes que contienen los constructos descritos anteriormente. La célula hospedante puede ser una célula de eucariota superior, como una célula de mamífero, o una célula de eucariota inferior, como una célula de levadura, o la célula hospedante puede ser una célula procariota, como una célula bacteriana. La introducción del constructo en la célula hospedante puede realizarse mediante transfección con fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, o electroporación (Davis, L., Dibner, M., Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology (1986)).

Los constructos en células hospedantes pueden utilizarse de una manera convencional para producir el producto del gen codificado por la secuencia recombinante. Como alternativa, los polipéptidos de la invención pueden producirse de modo sintético mediante sintetizadores de péptidos convencionales.

Las proteínas maduras pueden expresarse en células de mamífero, levadura, bacterias u otras células bajo el control de los promotores apropiados. Los sistemas de traducción exentos de células también pueden emplearse para producir estas proteínas utilizando RNA derivados de los constructos de DNA de la presente invención. Los vectores de clonación y expresión apropiados para utilizar con hospedantes procariotas y eucariotas se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor, Nueva York (1989), cuya descripción se incorpora en la presente como referencia.

La transcripción del DNA que codifica los polipéptidos de la presente invención por eucariotas superiores aumenta mediante la inserción de una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son elementos de acción cis de DNA, normalmente desde aproximadamente 10 a 300 pb, que actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Los ejemplos incluyen el potenciador de SV40 en el lado tardío del origende la replicación pb 100 a 270, un potenciador promotor temprano de citomegalovirus, el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de replicación, y potenciadores de adenovirus.

En general, los vectores de expresión recombinante incluyen orígenes de replicación y marcadores seleccionables que permiten la transformación de la célula hospedante, por ejemplo, el gen de resistencia a la ampicilina de E. coli y el gen TRP1 de S. cerevisiae, y un promotor derivado de un gen de alta expresión para dirigir la transcripción de una secuencia estructural cadena abajo. Estos promotores pueden derivarse de operones que codifican enzimas glicolíticas, como 3-fosfoglicerato-quinasa (PGK), factor \alpha, fosfatasa ácida o proteínas de choque térmico, entre otras. La secuencia estructural heteróloga se ensambla en la fase apropiada con secuencias de iniciación y terminación de la transcripción y, preferiblemente, una secuencia conductora capaz de dirigir la secreción de la proteína traducida hacia el espacio periplásmico o el medio extracelular. Opcionalmente, la secuencia heteróloga puede codificar una proteína de fusión que incluye un péptido de identificación N-terminal que imparta las características deseadas, por ejemplo, la estabilización o la purificación simplificada del producto recombinante expresado.

Los vectores de expresión útiles para un uso bacteriano se construyen insertando una secuencia de DNA estructural que codifica una proteína deseada, junto con señales de iniciación y terminación de la traducción adecuadas en fase de lectura operable con un promotor funcional. El vector comprenderá uno o más marcadores seleccionables fenotípicos y un origen de la replicación para asegurar el mantenimiento del vector y, si resulta deseable, para proporcionar la amplificación dentro del hospedante. Los hospedantes procariotas adecuados para la transformación incluyen E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium y diversas especies del género Pseudomonas, Streptomyces y Staphylococcus, aunque pueden emplearse otras según la elección.

Como ejemplo representativo, pero no limitante, los vectores de expresión útiles para uso bacteriano pueden comprender un marcador seleccionable y un origen de la replicación bacteriano derivados de plásmidos que están disponibles en el mercado que comprendan elementos genéticos del vector de clonación pBR322, muy conocido (ATCC 37017). Estos vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI, EEUU). Estas secciones del "esqueleto" de pBR322 se combinan con un promotor apropiado y la secuencia estructural que se va a expresar.

Después de la transformación de una cepa hospedante adecuada y el cultivo de la cepa hospedante hasta alcanzar una densidad celular apropiada, el promotor seleccionado se induce mediante medios apropiados (por ejemplo, cambio de la temperatura o inducción química), y las células se cultivan durante otro periodo más.

Las células se recogen, de forma típica, mediante centrifugación, se rompen mediante medios físicos o químicos, y el extracto bruto resultante se mantiene para su posterior purificación.

Las células microbianas empleadas en la expresión de las proteínas pueden romperse mediante cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, ruptura mecánica, o el uso de agentes lisantes de células, siendo estos métodos muy conocidos por los expertos en la técnica.

También pueden emplearse diversos sistemas de cultivo de células de mamíferos para expresar la proteína recombinante. Los ejemplos de sistemas de expresión de mamífero incluyen las líneas COS-7 de fibroblastos de riñón de mono, descritas por Gluzman, Cell, 23:175 (1981), y otras líneas celulares capaces de expresar un vector compatible, por ejemplo, las líneas celulares C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Los vectores de expresión de mamífero comprenderán un origen de la replicación, un promotor y potenciador adecuado, y también cualquier sitio de unión a ribosomas, sitio de poliadenilación, sitios donantes y aceptores de escisión, secuencias de terminación transcripcional, y secuencias no trascritas flanqueantes 5' necesarios. Las secuencias de DNA derivadas de la escisión de SV40 y los sitios de poliadenilación pueden utilizarse para proporcionar los elementos genéticos no transcritos requeridos.

El polipéptido de quimioquina puede recuperarse y purificarse a partir de los cultivos celulares recombinantes mediante métodos que incluyen precipitacion con sulfato de amonio o etanol, extracción de ácidos, cromatografía de intercambio aniónico o catiónico, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatito y cromatografía de lectina. Pueden utilizarse etapas de replegamiento de la proteína, si es necesario, para completar la configuración de la proteína madura. Por último, puede emplearse una cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para las etapas de purificación finales.

El polipéptido de quimioquina de la presente invención puede ser un producto purificado de forma natural o un producto de procedimientos químicos sintéticos, o producido mediante técnicas recombinantes a partir de un hospedante procariota o eucariota (por ejemplo, por células bacterianas, de levadura, de plantas superiores, de insecto y de mamífero en cultivo). Dependiendo del hospedante empleado en un procedimiento de producción recombinante, los polipéptidos de la presente invención pueden estar glicosilados o pueden estar no glicosilados. Los polipéptidos de la invención también pueden incluir un resto aminoácido metionina inicial.

El polipéptido de quimioquina puede utilizarse para inhibir la formación de colonias de células pluripotenciales de la médula ósea como tratamiento protector adjunto durante la quimioterapia del cáncer y para la leucemia.

El polipéptido de quimioquina también puede utilizarse para inhibir la proliferación de queratinocitos epidérmicos para el tratamiento de la psoriasis, que se caracteriza por la hiperproliferación de queratinocitos.

El polipéptido de quimioquina también puede utilizarse para tratar tumores sólidos mediante la estimulación de la invasión y activación de las células de defensa del hospedante, por ejemplo, células T citotóxicas y macrófagos. También puede utilizarse para potenciar las defensas del hospedante contra infecciones crónicas resistentes, por ejemplo, infecciones micobacterianas mediante la atracción y activación de leucocitos microbicidas.

El polipéptido de quimioquina también puede utilizarse para tratar la enfermedad autoinmunológica y leucemias linfocíticas inhibiendo la proliferación de células T a través de la inhibición de la biosíntesis de IL2.

El Ck\beta-4 también puede utilizarse en la curación de heridas, mediante el reclutamiento de células inflamatorias de limpieza de residuos y de estimulación del tejido conectivo, y también a través del control que ejerce sobre la fibrosis mediada por TGF\beta escesivo. De esta manera, el Ck\beta-4 también puede utilizarse para tratar otros trastornos fibróticos, incluyendo cirrosis hepática, osteoartritis y fibrosis pulmonar. Los polipéptidos de quimioquina también aumentan la presencia de eosinófilos que tienen la función diferenciada de matar las larvas de parásitos que invaden tejidos, como en la esquistosomiasis, la triquinosis y la ascariasis. También pueden utilizarse para regular la hematopoyesis, regulando la activación y diferenciación de diversas células progenitoras hematopoyéticas.

Las quimioquinas también pueden emplearse como inhibidores de la angiogénesis y, por tanto, tienen efectos antitumorales.

El polipéptido de quimioquina de la presente invención también es útil para identificar otras moléculas que tienen una actividad biológica similar. Un ejemplo de un ensayo de selección con relación a esto es aislar la región codificadora de los genes utilizando la secuencia de DNA conocida para sintetizar sondas de oligonucleótidos. Se utiizan oligonucleótidos marcados que tienen una secuencia complementaria con la de los genes de la presente invención para seleccionar un banco de cDNA humano, DNA genómico o mRNA, para determinar cuáles son los miembros del banco que se hibridan con la sonda.

La presente invención también se refiere a ensayos de diagnóstico para detectar niveles alterados de los polipéptidos o el mRNA que proporciona el mensaje para dichos polipéptidos, tanto cuantitativa como cualitativamente. Estos ensayos son muy conocidos en la técnica, e incluyen un ensayo ELISA, el radioinmunoensayo y RT-PCR. Los niveles de polipéptidos, o sus mRNA, que se detectan en los ensayos pueden emplearse para determinar la importancia de los polipéptidos en diversas enfermedades, y para el diagnóstico de enfermedades en las que unos niveles alterados de los polipéptidos pueden ser significativos.

Esta invención proporciona un método para la identificación de los receptores para los polipéptidos. El gen que codifica los receptores puede identificarse mediante clonación de expresión. Se prepara un RNA poliadenilado a partir de una célula que responde a los polipéptidos, y un banco de cDNA creado a partir de este RNA se divide en grupos y se utiliza para transfectar células COS u otras células que no responden a los polipéptidos. Las células transfectadas que se cultivan en placas de vidrio se exponen a los polipéptidos marcados. Los polipéptidos pueden marcarse mediante una diversidad de medios, incluyendo la yodación o la inclusión de un sitio de reconocimiento para una proteína-quinasa específica de sitio. Después de la fijación y la incubación, las placas se someten a un análisis autorradiográfico. Se identifican los grupos positivos y se prepraran subgrupos y se retransfectan utilizando un proceso de subagrupación y reselección iterativo, que produce, por último, clones individuales que codifican el receptor putativo. Como enfoque alternativo para la identificación de receptores, los polipéptidos marcados pueden unirse mediante fotoafinidad con la membrana celular o preparaciones de extractos que expresan la molécula del receptor. El material enlazado se resuelve mediante análisis PAGE y se expone a una película de rayos X. El complejo marcado que contiene los receptores de los polipéptidos puede escindirse, separarse en fragmentos peptídicos y someterse a una microsecuenciación de proteínas. La secuencia de aminoácidos obtenida a partir de la microsecuenciación se utiliza para diseñar una serie de sondas de oligonucleótidos generados para seleccionar un banco de cDNA para identificar los genes que codifican los receptores putativos.

Esta invención proporciona un método para seleccionar fármacos para identificar los que potencian (agonistas) o bloquean (antagonistas) la interacción de los polipéptidos con sus receptores identificados. Un agonista es un compuesto que aumenta las funciones biológicas naturales de los polipéptidos, mientras que los antagonistas eliminan estas funciones. Como ejemplo, una preparación de membranas o células de mamífero que exprese los receptores de los polipéptidos se incuba con un polipéptido de quimioquina marcado, por ejemplo, mediante radiactividad, en presencia del fármaco. Entonces se mide la capacidad del fármaco para potenciar o bloquear esta interacción.

Los antagonistas potenciales incluyen anticuerpos o, en algunos casos, oligonucleótidos, que se unen a los polipéptidos. Otro ejemplo de un antagonista potencial es un mutante dominante negativo de los polipéptidos. Los mutantes dominantes negativos son polipéptidos que se unen al receptor del polipéptido de tipo salvaje, pero no pueden mantener la actividad biológica.

Un ensayo para detectar mutantes dominantes negativos de los polipéptidos incluye un ensayo de quimiotaxis in vitro en el que una cámara de quimiotaxis de múltiples pocillos equipada con membranas de policarbonato exento de polivinilpirrolidona se utiliza para medir la capacidad quimioatrayente de los polipéptidos por los leucocitos en presencia y ausencia de moléculas de antagonista/inhibidor o agonista potenciales.

Los constructos antisentido preparados utilizando tecnología antisentido también son antagonistas potenciales. La tecnología antisentido puede utilizarse para controlar la expresión génica a través de RNA o DNA antisentido o la formación de triples hélices, basándose ambos métodos en la unión de un polinucleótido al DNA o RNA. Por ejemplo, la porción codificadora 5' de la secuencia del polinucleótido, que codifica los polipéptidos maduros de la presente invención, se utiliza para diseñar un oligonucleótido de RNA antisentido con una longitud desde aproximadamente 10 a 40 pares de bases. Se diseña un oligonucleótido de DNA para que sea complementario con una región del gen implicado en la transcripción (triple hélice, véase Lee et al., Nucl. Acids Res., 6:3073 (1979); Cooney et al., Science, 241:456 (1988); y Dervan et al., Science, 251:1360 (1991)), evitando con ello la transcripción y la producción de los polipéptidos. El oligonucleótido de RNA antisentido se hibrida con el mRNA in vivo y bloquea la traducción de la molécula de mRNA en los polipéptidos (antisentido, Okano, J. Neurochem, 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988)). Los oligonucleótidos descritos anteriormente también pueden administrarse a las células de modo que el DNA o RNA antisentido puede expresarse in vivo para inhibir la producción de los polipéptidos.

Otro antagonista potencial es un derivado peptídico de los polipéptidos que son análogos, modificados de forma natural o sintética, de los polipéptidos, que han perdido la función biológica pero que todavía reconocen y se unen a los receptores de los polipéptidos para, con ello, bloquear de forma eficaz los receptores. Los ejemplos de derivados peptídicos incluyen, pero no se limitan a péptidos pequeños o moléculas de tipo peptídico.

Los antagonistas pueden emplearse para inhibir la quimiotaxis y la activación de macrófagos y sus precursores, y de neutrófilos, basófilos, linfocitos B y algunos subgrupos de células T, por ejemplo, células T citotóxicas activadas y CD8 y células asesinas naturales, en enfermedades infecciosas e inflamatorias crónicas y autoinmunológicas. Los ejemplos de enfermedades autoinmunológicas incluyen artritis reumatoide, esclerosis múltiple, y diabetes dependiente de insulina. Algunas enfermedades infecciosas incluyen silicosis, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática evitando el reclutamiento y la activación de fagocitos mononucleares, síndrome hipereosinófilo idiopático evitando la producción y migración de eosinófilos, choque endotóxico evitando la migración de macrófagos y su producción de los polipéptidos de quimioquina de la presente invención. Los antagonistas también pueden utilizarse para tratar la aterosclerosis, evitando la infiltración de monocitos en la pared arterial.

Los antagonistas también pueden utilizarse para tratar las reacciones alérgicas mediadas por histaminas, inhibiendo la desgranulación de células cebadas y basófilos inducida por quimioquina y la liberación de histamina.

Los antagonistas también pueden utilizarse para tratar la inflamación, evitando la atracción de monocitos hacia el área de la herida. También pueden utilizarse para regular las poblaciones de macrófagos pulmonares normales, puesto que las enfermedades pulmonares inflamatorias agudas y crónicas están asociadas con el secuestro de fagocitos mononucleares en el pulmón.

Los antagonistas también pueden utilizarse para tratar la artritis reumatoide, evitando la atracción de monocitos hacia el fluido sinovial en las articulaciones de los pacientes. El influjo de monocitos y la activación desempeñan un papel importante en la patogénesis de las artropatías degenerativas e inflamatorias.

Los antagonistas pueden utilizarse para interferir con las cascadas perjudiciales atribuidas, principalmente, a IL-1 y TNF, que evita la biosíntesis de otras citoquinas inflamatorias. De esta manera, los antagonistas pueden utilizarse para evitar la inflamación. Los antagonistas también pueden utilizarse para inhibir la fiebre independiente de prostaglandinas inducida por quimioquinas.

Los antagonistas también pueden utilizarse para tratar casos de insuficiencia de la médula ósea, por ejemplo, anemia aplásica y síndrome mielodisplásico.

Los antagonistas también pueden utilizarse para tratar el asma y la alergia, evitando la acumulación de eosinófilos en el pulmón. Los antagonistas pueden emplearse en una composición con un vehículo farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, como se describe en la presente a continuación.

Los polipéptidos de quimioquina y los agonistas o antagonistas de la presente invención pueden emplearse junto con una disolución tampón. Con el fin de aislar fragmentos de DNA para la construcción de plásmidos, se digiere, de forma típica, desde 5 a 50 \mug de DNA con 20 a 250 unidades de enzima en un volumen mayor. El fabricante especifica los tampones y las cantidades de sustrato apropiados para las enzimas de restricción concretas. Normalmente se utilizan unos tiempos de incubación de aproximadamente 1 hora a 37ºC, pero pueden variar según las instrucciones del suministrador. Después de la digestión, la reacción se somete a una electroforesis directamente sobre un gel de poliacrilamida para aislar el fragmento deseado.

La separación por tamaño de los fragmentos escindidos se realiza utilizando un gel de poliacrilamida al 8% descrito por Goeddel, D. et al., Nucleic Äids Res., 8:4057 (1980).

"Oligonucleótidos" se refiere a un polidesoxinucleótido monocatenario o a dos hebras de polidesoxinucleótidos complementarias que pueden sintetizarse de modo químico. Estos oligonucleótidos sintéticos no tienen 5'-fosfato y, por tanto, no se acoplan a otro oligonucleótido sin añadir un fosfato con un ATP en presencia de una quinasa. Un oligonucleótido sintético se acoplará a un fragmento que no se ha desfosforilado.

"Acoplamiento" se refiere al proceso de formar enlaces fosfodiéster entre dos fragmentos de ácidos nucleicos bicatenarios (Maniatis, T., et al., Id., p. 146). A menos que se indique lo contrario, el acoplamiento puede realizarse utilizando tampones y condiciones conocidos con 10 unidades de DNA-ligasa de T4 ("ligasa") por 0,5 \mug de cantidades aproximadamente equimolares de los fragmentos de DNA que se van a acoplar.

A menos que se indique lo contrario, la transformación se realizó como se describe en el método de Graham, F. y Van der Eb, A., Virology, 52:456-457 (1973).

Ejemplo 1 Expresión bacteriana y purificación de Ck\beta-4

La secuencia de DNA que codifica Ck\beta-4, ATCC nº 75848, se amplifica inicialmente utilizando cebadores de oligonucleótidos de PCR que se corresponden con las secuencias 5' y 3' de la proteína Ck\beta-4 procesada (menos la secuencia del péptido señal putativo). Se añadieron otros nucleótidos que se corresponden con Ck\beta-4 a las secuencias 5' y 3', respectivamente. El cebador de oligonucleótido 5' tiene la secuencia 5' CCCGCATGC AAGCAGCAAGCAACTTT 3', y contiene un sitio de enzima de restricción SphI (negrita) seguido de 17 nucleótidos de la secuencia codificadora de Ck\beta-4 (subrayado) comenzando a partir del segundo nucleótido de la secuencia codificadora para la proteína madura. El codón ATG se incluye en el sitio SphI. En el siguiente codón después de ATG, la primera base es del sitio SphI y las otras dos bases se corresponden con la segunda y tercera base del primer codón de la proteína madura putativa. Como consecuencia, la primera base en este codón cambia de G a C, comparado con las secuencias originales, produciendo una sustitución de E a Q en la proteína recombinante. La secuencia 3', 5' AAAGGATCCCATGTTCTTGACTTTTTTACT 3', contiene secuencias complementarias al sitio BamHI (negrita) y están seguidas de 21 nucleótidos de secuencias específicas del gen que preceden al codón de terminación. Los sitios de enzimas de restricción se corresponden a los sitios de enzimas de restricción sobre el vector de expresión bacteriana pQE-70 (Qiagen, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311). El pQE-70 codifica la resistencia a antibióticos (Amp'), un origen de la replicación bacteriano (ori), un promotor operador regulable por IPTG (P/O), un sitio de unión a ribosomas (RBS), un marcador de 6-His, y sitios de enzimas de restricción. El pQE-70 entonces se digiere con SphI y BamHI. Las secuencias amplificadas se acoplaron en pQE-70 y se insertaron dentro del marco con la secuencia que codifica el marcador de histidina y el RBS. La figura 8 muestra una representación esquemática de esta disposición. La mezcla de acoplamiento entonces se utilizó para transformar la cepa de E. coli disponible en Qiagen, con la marca comercial M15/rep 4, mediante el procedimiento descrito en Sambrook, J., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press (1989). El M15/rep4 contiene múltiples copias del plásmido pREP4, que expresa el represor lacI y también confiere resistencia a la kanamicina (Kan'). Los transformantes se identifican por su capacidad para crecer en placas LB, y se seleccionaron las colonias resistentes a ampicilina/kanamicina. El DNA del plásmido se aisló y se confirmó mediante análisis de restricción. Los clones que contenían los constructos deseados se cultivaron durante la noche (D/N) en cultivo líquido en medio LB suplementado con Amp (100 ug/ml) y Kan (25 ug/ml). El cultivo O/N se utilizó para inocular un cultivo mayor con una proporción de 1:100 a 1:250. Las células se cultivaron hasta una densidad óptica de 600 (DO^{600}) de entre 0,4 y 0,6. Entonces se añadió IPTG ("isopropil-B-D-tiogalactopiranósido") hasta una concentración final de 1 mM. El IPTG produce la inducción mediante la inactivación del represor lacI, dejando libre el P/O, lo cual conduce a una mayor expresión del gen. Las células se cultivaron durante 3 a 4 horas más. Las células entonces se recogieron mediante centrifugación. El sedimento celular se solubilizó en el agente caotrópico HCl de guanidina 6 molar. Después de la aclaración, el Ck\beta-4 solubilizado se purificó a partir de esta disolución mediante cromatografía sobre una columna de quelado de níquel bajo condiciones que permiten una unión fuerte por proteínas que contienen el marcador de 6-His (Hochuli, E., et al., J. Chromatography, 411:177-184 (1984)). El Ck\beta-4 (>98% puro) se eluyó de la columna en HCl de guanidina 6 molar, pH 5,0. La renaturalización de las proteínas fuera del HCl de Gn puede lograrse mediante diversos protocolos (Jaenicke, R. y Rudolph, R., Protein Structure - A Practical Approach, IRL Press, Nueva York (1990)). Inicialmente, la etapa de diálisis se utiliza para eliminar el HCl de Gn. Como alternativa, la proteína purificada aislada a partir de la columna de quelado de Ni puede unirse a una segunda columna, a través de la cual se hace pasar un gradiente de HCl de Gn lineal decreciente. Se deja que la proteína se renaturalice mientras está unida a la columna, y posteriormente se eluye con un tampón que contiene imidazol 250 mM, NaCl 150 mM, Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, y glicerol al 10%. Por último, la proteína soluble se dializa contra un tampón de conservación que contiene bicarbonato de amonio 5 mM.

Ejemplo 2 Expresión de Ck\beta-4 recombinante en células COS

La expresión del plásmido, el Ck\beta-4 HA, se deriva del vector pcDNAI/Amp (Invitrogen) que contiene: 1) un origen de la replicación de Sv40, 2) un gen de resistencia a la ampicilina, 3) un origen de la replicación de E. coli, 4) un promotor de CMV, seguido de una región de policonector, un intrón de SV40 y un sitio de poliadenilación. Un fragmento de DNA que codifica el precursor Ck\beta-4 completo y un marcador de HA condensado dentro del marco con su extremo 3' se clonó dentro de la región del policonector del vector y, por tanto, la expresión de la proteína recombinante está dirigida por el promotor de CMV. El marcador de HA se corresponde con un epitopo derivado de la proteína de hemaglutinina de la gripe, como se ha descrito previamente (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly y R. Lerner, 1984, Cell, 37, 767). La infusión del marcador de HA hacia la proteína diana permite la fácil detección de la proteína recombinante con un anticuerpo que reconoce el epitopo de HA.

La estrategia de construcción del plásmido se describe como sigue:

La secuencia de DNA que codifica el Ck\beta-4, ATCC nº 75848, se construyó mediante PCR en el
EST original clonado utilizando dos cebadores: el ce-
bador 5',5' GGAAAGCTTATGTGCTGTACCAAGA
GTTT 3', contiene un sitio HindIII, seguido de 20 nucleótidos de la secuencia codificadora de Ck\beta-4, comenzando a partir del codón de iniciación; la secuencia 3', 5' CGCTCTAGATTAAGCGTAGTCTG
GGACGTCGTATGGGTAACATGGTTCCTTGACT
TTTT 3', contiene secuencias complementarias con el sitio XbaI, el codón de terminación de la traducción, el marcador de HA y al menos 20 nucleótidos de la secuencia codificadora de Ck\beta-4 (que no incluye el codón de terminación). Por tanto, el producto de PCR contiene un sitio HindIII, la secuencia codificadora de Ck\beta-4 seguida de un marcador de HA condensado dentro del marco, un codón de terminación de la traducción junto al marcador de HA, y un sitio XbaI. El fragmento de DNA amplificado con PCR y el vector, pcDNAI/Amp, se digirieron con las enzimas de restricción HindIII y XbaI, y se acoplaron. La mezcla de acoplamiento se transformó en la cepa de E. coli SURE (disponible en Stratagene Cloning Systems, 11099 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037), el cultivo transformado se colocó en placas con medio de ampicilina y se seleccionaron las colonias resistentes. El DNA del plásmido se aisló a partir de los transformantes y se estudió mediante análisis de restricción para detectar la presencia del fragmento correcto. Para la expresión de Ck\beta-4 recombinante se transfectaron células COS con el vector de expresión mediante el método de DEAE-DEXTRAN (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press (1989)). La expresión de la proteína Ck\beta-4 HA se detectó mediante marcaje radiactivo y el método de inmunoprecipitación (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988)). Las células se marcaron durante 8 horas con ^{35}S-cisteína dos días después de la transfección. Los medios de cultivo entonces se recogieron y las células se lisaron con detergente (tampón RIPA (NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, NP-40 al 1%, DOC al 0,5%, Tris 50 mM, pH 7,5; Wilson, I. et al., Id., 37:767 (1984)). Tanto el lisado de células como los medios de cultivo se precipitaron con un anticuerpo monoclonal específico de HA. Las proteínas precipitadas se analizaron mediante SDS-PAGE.

Son posibles numerosas modificaciones y variaciones de la presente invención a la luz de las anteriores indicaciones y, por tanto, dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, la invención puede ponerse en práctica de una manera diferente a la descrita de modo concreto.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i)

SOLICITANTE: Li, et al.

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(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Polipéptidos de quimioquina humanos

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 2

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(iv)

DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:

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(A)

DESTINATARIO: Carella, Byrne, Bain, Gilfillan, Cecchi, Stewart y Olstein

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(B)

CALLE: 6 Becker Farm Road

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(C)

CIUDAD: Roseland

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(D)

ESTADO: Nueva Jersey

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(E)

PAÍS: EEUU

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(F)

CÓDIGO POSTAL: 07068

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(v)

FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO MEDIO: disquete de 3,5 pulgadas

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(B)

ORDENADOR: IBM PS/2

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: MS-DOS

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(D)

PROGRAMA: Wordperfect 5.1

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(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: presentado con la presente

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(C)

CLASIFICACIÓN:

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(vii) DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

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(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

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(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

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(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

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(A)

NOMBRE: Ferraro, Gregory D.

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(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 36.134

\vskip0.333000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: 325800-183

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(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

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(A)

TELÉFONO: 201-994-1700

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(B)

TELEFAX: 201-994-1744

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 291 pares de bases

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(B)

TIPO: ácido nucleico

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(C)

CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: cDNA

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

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1

\vskip1.000000\baselineskip

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO:2:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 96 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácidos

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(C)

CADENA:

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

2

Claims (16)

1. Un polinucleótido aislado seleccionado del grupo que consiste en

(a) polinucleótidos que codifican al menos la forma madura del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos deducida que aparece en la figura 1;

(b) polinucleótidos que tienen la secuencia codificadora que aparece en la figura 1 que codifican al menos la forma madura del polipéptido;

(c) polinucleótidos que codifican el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de al menos la forma madura del polipéptido codificado por el cDNA contenido en ATCC 75848;

(d) polinucleótidos que tienen la secuencia codificadora del cDNA contenido en ATCC 75848 que codifican al menos la forma madura del polipéptido;

(e) polinucleótidos que codifican un fragmento de un polipéptido codificado por un polinucleótido de una cualquiera de (a) a (d), en el que dicho fragmento tiene actividad Ck\beta-4; y

(f) polinucleótidos que tienen al menos 95% de coincidencia de secuencia con un polinucleótido según se define en una cualquiera de (a) a (e), y que codifica un polipéptido que tiene actividad Ck\beta-4;

o la hebra complementaria de dicho polinucleótido.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, que es DNA.

3. El DNA de la reivindicación 2, que es DNA genómico.

4. El polinucleótido de la reivindicación 1, que es RNA.

5. Un vector que contiene el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. El vector de la reivindicación 5, en el que el polinucleótido está unido operativamente a secuencias de control de la expresión que permiten la expresión en células hospedantes procariotas o eucariotas.

7. Una célula hospedante modificada genéticamente con el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o con el vector de la reivindicación 5 ó 6.

8. Un proceso para producir un polipéptido que tiene actividad Ck\beta-4 que comprende cultivar la célula hospedante de la reivindicación 7 y recuperar a partir del cultivo el polipéptido codificado por dicho polinucleótido.

9. Un proceso para producir células capaces de expresar un polipéptido que tiene actividad Ck\beta-4, que comprende modificar genéticamente células con el vector de la reivindicación 5 ó 6.

10. Un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, o que puede obtenerse mediante el proceso de la

\hbox{reivindicación 8.}

11. Un anticuerpo que es específico del polipéptido de la reivindicación 10.

12. Un antagonista/inhibidor contra el polipéptido de la reivindicación 10, en el que dicho antagonista/inhibidor es un anticuerpo de la reivindicación 11, o un constructo antisentido que se hibrida de forma específica con transcriptos de un polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

13. Una composición farmacéutica que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el polipéptido de la reivindicación 10, o el antagonista/inhibidor de la reivindicación 12, y opcionalmente un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Una composición de diagnóstico que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

15. El uso del polipéptido de la reivindicación 10, o del polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento protector durante la quimioterapia del cáncer, y para la leucemia, para el tratamiento de la psoriasis, tumores sólidos, enfermedades autoinmunológicas, leucemia linfocítica, trastornos fibróticos, para la curación de heridas, para la defensa contra infecciones crónicas resistentes, para matar las larvas de parásitos, para la regulación de la hematopoyesis, para la inhibición de la angiogénesis, y para el tratamiento del asma o la alergia.

16. El uso del antagonista/inhibidor de la reivindicación 12 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades autoinmunológicas, y enfermedades infecciosas e inflamatorias crónicas.