KR20000023692A - 야생형 분자와 활성 범위가 상이한 사람 섬모 신경영양 인자 (ｈＣＮＴＦ) 변이체 - Google Patents

Abstract

본 발명에 따른 사람 섬모 신경영양 인자 (hCNTF)의 변이체는 페닐알라닌 152 및(또는) 라이신 155가 알라닌으로 치환된 것을 특징으로 한다. 이들 변이체는 신경계 관련 질병 및 병리 상태나 CNTF에 반응하는 세포와 관계된 다른 병리 상태의 치료용 약의 활성 성분으로 중요한 생물학적 성질을 갖고 있다. 도 2는 CNTF및 본 발명에 기재된 그 변이체에 의한, HepG2 세포의 합토글로빈 분비의 자극 결과를 보여준다.

Description

야생형 분자와 활성 범위가 상이한 사람 섬모 신경영양 인자 (ｈＣＮＴＦ) 변이체 {Variants of Human Ciliary Neurotrophic Factor (hCNTF) with a Range of Action Different from That of the Wild-Type Molecule}

본 발명은 신경학 분야에 관련되어 있다. 본 발명은 야생형 분자의 활성과 활성 범위가 상이한 사람 섬모 신경영양 인자 (hCNTF)의 변이체에 관한 것이다. 이들 변이체는 LIF 수용체 (LIFR)와의 상호작용 능력이 상당히 감소되었다는 것을 특징으로 한다. 즉, CNTF에 반응하는 대다수의 세포에 대한 이들의 생물학적 활성은 지극히 감소한다. 그러나, 이들은 특정한 신경 세포에 대해서는 높은 생물학적 활성을 보유하고 있는데, 이는 아마도 이 신경 세포가 막에 결합된 LIFR 및(또는) CNTF 수용체 α (CNTFRα)를 다량 발현하기 때문일 것이다. 이런 성질을 사용하면 CNTF의 투여로 인해 발생되는 말초 부작용을 감소시킬 수 있다.

사람 섬모 신경영양 인자 (hCNTF)는 23 kDa의 신경 사이토킨 (neurocytokine)이다. 이 인자는 시반세포 (Schwann cell) 및 성상세포에서 발현되며, 운동 뉴런, 감각 뉴런, 교감 뉴런, 해마의 뉴런 및 희돌기교세포를 비롯한 각종 신경 세포 및 신경교 세포의 (시험관내 및 생체내 모두에서) 생존 및 분화에 대한 강력한 자극 효과를 발휘한다 (1,2). CNTF의 생리적 역할은, 부상 후 신경 퇴화의 예방에 관련된 인자로 작용하는 것으로 보인다 (2). 이런 보호 작용은 CNTF에 의해 생체내의 많은 신경 세포에서 나타나며, 사람 신경퇴화 (neurodegenerative) 질병의 치료에 임상적으로 응용할 수 있는 가능성을 제공해 준다 (3).

CNTF는 신경보호 작용 뿐만 아니라 체중 손실 및 식욕결핍, 급성 반응 및 발열 등에 대해 생체내에서 다양한 효과를 불러일으킨다는 것이 밝혀져 있다. 따라서, 이러한 부수적인 효과로 인해 CNTF를 약물학적으로 사용하는데 문제가 있다.

다른 성장 인자, 특히 사이토킨과 마찬가지로 CNTF는 여러 개의 서브유닛으로 구성된 수용체 복합체의 결합, 순차적인 조립 및 활성화를 거쳐 작용한다 (4, 5). CNTF가 그 일부를 형성하는 수용체 복합체는 6 개의 서브유닛으로 이루어진다 (인터루킨 6의 경우와 유사). 이 복합체는 두 개의 CNTF 분자, CNTF와 낮은 친화도로 결합하는 두 개의 α-수용체 특이적 분자 (CNTFRα) 및 두 개의 신호 전달 서브유닛 (LIFR 및 gp130)으로 이루어진다 (7). gp130과의 결합 및 특이적 수용체와의 결합에 관여하는 CNTF 부위는 인터루킨 6에서 유추하여 밝혀낼 수 있다 (8, 9). CNTF 및 LIF 수용체 (LIFR)의 결합 위치는 아직 밝혀지지 않았다.

사람, 토끼, 쥐 및 마우스 CNTF 서열을 LIF 수용체에 결합하는 다른 사이토킨 서열 (예를 들면, LIF, 온코스타틴 M 및 CT-1 등)과 함께 병렬로 배열해 보면, D1으로 알려진 구조 모티프 내에 두 개의 보존된 아미노산 잔기가 존재한다는 것이 드러난다. 이 두 개의 아미노산은 152번 위치의 페닐알라닌과 155번 위치의 라이신이다. 하기한 실시예에 더 상세하게 기재된 바와 같이, 이 두 아미노산은 LIFR 결합 위치의 일부를 형성한다. 이런 이해를 바탕으로, 알라린에 의해 그 두 개의 아미노산이 치환된 CNTF 변이체를 제조하였으며, 야생형 분자 (서열 1) 및 본 발명의 변이체의 서열을 표 1에 나타냈다 (간략하게 나타내기 위해, 전체 아미노산 서열을 제시하지 않고, 152에서 167번 위치까지의 아미노산만을 나타냄). 두 변이체 중 하나 (Lys155Ala/CNTF)가 암탉 뉴런에서 완전히 불활성화됨을 보여주는 문헌 (10)이 있기는 하지만, 두 변이체 모두의 생물학적 활성을 평가했으며, 그 결과 종래의 보고서 (10)와는 대조적으로, 이들은 LIF 수용체 또는 가용성 CNTF 수용체에 결합할 때는 생물학적 활성이 크게 감소한 반면 특정한 신경 세포의 막 수용체에 대해서는 강력한 아고니스트로 작용한다는 것이 입증되었다. 이런 현상은 이들 분자의 생물학적 효과가 CNTFRα 및 LIF 수용체의 농도에 따라 달라기 때문으로 이해할 수 있는데, 즉 특정한 신경 세포군의 세포막에 결합된 수용체들의 경우처럼 국부적인 수용체 농도가 매우 높다면 그 효과는 증폭될 것이다.

서열 번호

아미노산

152

153

154

155

156

157

158

159

160

161

162

163

164

165

166

167

1

Phe

Glu

Lys

Lys

Leu

Trp

Gly

Leu

Lys

Val

Leu

Gln

Glu

Leu

Ser

Gln

hCNTF

2

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Asp

His

MUT-DH

3

Ala

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Asp

His

Phe152Ala /MUT-DH

4

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Ala

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Asp

His

Lys155Ala /MUT-DH

5

Ala

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Ala

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Phe152Ala /Lys155Ala /hCNTF

6

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Ala

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Lys155Ala/CNTF

7

Ala

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Ala

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Asp

His

Phe152Ala /Lys155Ala /MUT-DH

이들 분자가 막 결합 수용체를 발현하는 신경 세포에 대해 생물학적 활성을 갖는다는 것과 이들이 가용성 수용체와 상호작용할 때는 대조적으로 지극히 약한 생물학적 활성을 보인다는 발견은, 지정된 위치를 변형시킨 분자를 사용하면 가용성 수용체 결합에 의해 매개되는 말초 부작용을 일으키지 않으면서 신경 세포와 특이적으로 반응하도록 할 수 있다는 것을 의미한다.

따라서, 본 발명은 페닐알라닌 152 및(또는) 라이신 155가 알라닌으로 치환된 것과, 특히 서열 3 내지 서열 7에 나타낸 서열 중에서 선택한 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 사람 섬모 신경영양 인자 (hCNTF)를 제공한다.

서열 3 내지 서열 6에 나타낸 분자는 LIF 수용체에 대해 결합하는 능력과 가용성 CNTFRα을 통해서 LIF 수용체를 활성화시키는 능력이 감소된 반면, 특정 신경 세포의 CNTFR에 대해서는 아고니스트로 작용한다. 서열 7에 나타낸 분자는 CNTFRα 수용체 결합에 대한 경쟁적 길항제로 작용한다.

본 발명은 또한, 신경계 자체의 손상을 유발하는 신경계의 질병 또는 병리 상태를 비롯해서 신경계의 질병 또는 병리 상태나 CNTF에 반응하는 세포와 관련된 기타 병리 상태의 치료를 위한, 이들 분자를 사용하는 제약 제제로까지 확장된다.

표 2는 CNTF의 각종 변이체의 CNTFRα 수용체 결합 활성에 관한 데이타를 보여준다. 고정된 CNTFRα에 바이오티닐화 DNTF 또는 바이오티닐화 MUT-DH가 결합하는 것을 50 %로 억제하는데 필요한 단백질 농도 (IC₅₀)를 결정했다. 상대 결합율은 시험된 단백질의 IC₅₀값으로 CNTF의 IC₅₀값을 나눈 비이다.

단백질	상대 결합율
서열 1	1.0
서열 2	41 ± 4
서열 3	32 ± 11
서열 4	42 ± 2
서열 5	0.9 ± 0.1
서열 6	1.0 ± 0.1
서열 7	51 ± 19

도 1은 여러 수용체 복합체들에 대한 결합 시험에 관한 결과를 보여주는데, 서브유닛 gp130 및 LIFR을 포함하는 변이체 CNTF 분자가 이 수용체 복합체의 일부를 구성한다. 각 시험은 상이한 두 가지 양의 변이체 분자에 대해 수행되었다 (각 컬럼의 상단에 기재한 바와 같이 1 또는 0.1 mg). 각 그래프에서 마지막 컬럼은 음성 대조구로서, 변이체 분자가 없는 상태로 수행한 시험에 관한 것이다. 도 1의 (A)는 최초의 변이체 MUT-DH, Phe152Ala/MUT-DH, Lys155Ala/MUT-DH, Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH 변이체 또는 야생형 CNTF (이들은 각각 MUT-DH, AK/DH, FA/DH, AA/DH 및 wt로 나타냄)와 CNTFRα를 수용체 서브유닛 gp130와 함께 포함하는 복합체에 대한 시험이다. 도 1의 (B)는 변이체 MUT-DH, Phe152Ala/MUT-DH, Lys155Ala/MUT-DH, Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH 변이체 또는 야생형 CNTF (이들은 각각 MUT-DH, AK/DH, FA/DH, AA/DH 및 wt로 나타냄)와 CNTFRα를 수용체 서브유닛 LIFR과 함께 포함하는 복합체에 대한 시험이다. 도 1의 (C)는 최초의 변이체 MUT-DH, Phe152Ala/MUT-DH, Lys155Ala/MUT-DH, Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH 변이체 또는 야생형 CNTF (이들은 각각 MUT-DH, AK/DH, FA/DH, AA/DH 및 wt로 나타냄)와 복합체 LIFR/CNTFRα을 수용체 서브유닛 gp130와 함께 포함하는 복합체에 대한 시험이다.

도 2는 HepG2 세포에서 CNTF 및 CNTF 변이체에 의한 합토글로빈 생성의 자극 결과를 보여준다. 실험은 가용성 CNTFRα 수용체의 부재 (A) 또는 농도 800 ng/ml로 존재 (B)하는 상태로 수행했다. 시험된 단백질은 CNTF (m), Lys155Ala/CNTF (FA-CNTF) (o), Lys155Ala/MUT-DH (FADH-CNTF) (n), Phe152Ala/MUT-DH (AKDH-CNTF) (s) 및 Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH (AADH-CNTF) (t)였다. 데이타는 상이한 실험들 사이의 차이를 표준화하기 위해 최대 CNTF 효과의 백분율로 나타낸다.

도 3은 IMR-32 세포에서 콜린 아세틸트랜스퍼라제 (Chat) 활성의 자극 결과를 보여준다. 시험된 단백질은 CNTF (1), MUT-DH (m), Lys155Ala/CNTF (n), Lys155Ala/MUT-DH (o), Phe152Ala/MUT-DH (s), Phe152Ala/Lys155Ala/CNTF (△) 및 Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH (t)였다. 데이타는 상이한 실험들 사이의 차이를 표준화하기 위해 최대 CNTF 효과의 백분율로 나타낸다.

도 4a 및 4b는 HepG2 세포에서 Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH 변이체의 길항성을 보여준다. 도 4a는 Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH가 없는 상태 (1) 및 0.01 (m), 0.1 (n), 1 (o), 10 (s) mg/ml로 존재하는 상태로, IMR-32 세포에서 콜린 아세틸트랜스퍼라제 (Chat) 활성에 대해 CNTF의 용량 증가 효과를 보여준다. 도 4b는 CNTF 3 ng/ml에 의해 유도된 반응에 대해 Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH의 농도 증가 효과를 보여준다.

지금까지는 본 발명에 대한 개괄적 설명이었다. 다음의 실시예를 통해, 본 발명의 목적, 특징, 이점 및 실행 방법을 더 잘 이해할 수 있는, 구체적인 실시태양에 대한 보다 상세한 설명이 제시될 것이다.

<기탁>

변이체 AKDH-CNTF (서열 3의 아미노산 서열 포함)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 변이체 FADH-CNTF (서열 4의 아미노산 서열 포함)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 변이체 AADH-CNTF (서열 6의 아미노산 서열 포함)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 각각 포함하는 플라스미드 pRSET-AKDH-CNTF, pRSET-FADH-CNTF, pRSET-AADH-CNTF를 사용하여 형질전환된 대장균 TOP10이 영국 스코틀랜드 아버딘에 위치한 국립산업해양미생물수탁기관 (The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd.; NCIMB)에 수탁번호 NCIMB 40809, NCIMB 40810 및 NCIMB 40811로 1996년 6월 24일에 기탁되었다.

실시예 1

CNTF 변이체의 구성 및 특성 파악

변이체 구성

pRSET-CNTF 또는 pRSET-MUT-DH 벡터를 주형으로 하고, 당업계에 공지된 방법 (11)을 써서 역 PCR로 사람 CNTF 또는 변이체 분자 MUT-DH (Ser166Asp/Gln167His/CNTF)에 돌연변이를 도입하였다. PCR 반응에는 다음 프라이머를 사용하였다:

모든 변이체에 사용된 센스 프라이머:

5'-CTGTGGGGCCTAAAGGTGCTG-3'

변이체 Phe152Ala용 안티센스 프라이머 (Ala 152에 대응하는 코돈은 굵은 활자로 표시):

5'-CGCCTTCTCAAAGAGACCACCATCTCCAAC-3'

변이체 Phe152Ala/Lys155Ala용 인버스 프라이머 (Ala 152 및 Ala 155에 대응하는 코돈은 굵은 활자로 표시):

5'-CGCCTTCTCAGCGAGACCACCATCTCCAAC-3'

PCR 반응은 2 단위의 Taq DNA 폴리머라제 (Boehringer Mannheim) 및 10 x PCR 반응용 완충액 10 ml을 함유한 100 ml 반응액에서 DNA 주형 (pRSET-CNTF 또는 pRSET-MUT-DH; 10 fmol) 및 프라이머 (각 1 mM)를 사용하여 수행하였다. 증폭은 94℃ 1 분, 45℃ 1 분, 그리고 72℃ 12 분으로 하여 25 사이클 동안 진행하였다. 네 가지 데옥시뉴클레오티드 (250 mM) 및 20 단위의 대장균 (E. coli) 폴리머라제 I "클레노우 단편"을 증폭된 혼합물 95 ml에 가하고, 반응 혼합물을 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. "위저드 (Wizard) (등록상표) PCR 프렙 (preps)" 정제 시스템을 사용하여 DNA를 단리하고, 제조사의 지시에 따라서 20 단위의 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 (Promega)와 인큐베이션하여 포스포릴화하였다. 생성물을 아가로스 겔 (0.7%)에서 전개한 다음 퀴아엑스 (Qiaex) 키트 (Qiagen)를 써서 정제한 후, 12 단위의 T4 리가제를 써서 16℃에서 20 시간 동안 리가제 반응을 진행하였다. 반응 혼합물을 사용하여 HB2151 균주의 감응 대장균 세포를 형질전환시켰다. 세균 세포에서 DNA를 회수하고, USB 시쿼나제 (Sequenase) 프로토콜을 써서 DNA를 서열결정하여 CNTF 변이체를 코딩하는 영역을 동정하였다.

Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH (AADH-PCR1)의 코딩 서열은 두 개의 추가적인 돌연변이를 포함한 것으로 밝혀졌다 (Ala70Thr/Val146Gly). 이들 돌연변이를 수정하고 원래의 서열을 회복하기 위해 다음과 같은 전략을 썼다: Val146Gly 돌연변이를 제거하기 위해서는 다음 프라이머들과 함께 AADH-PCR1의 DNA를 주형으로 써서 CNTF 코딩 서열의 1 내지 163 위치를 포함하는 NcoI/PstI 단편을 증폭시켰다.

센스:

5'-GTCACCATGGCTTTCACAGAGCATTCACCG-3'

안티센스:

5'-AGCTCCTGCAGCACCTTTAGGCCCCACAGCGCCTTCTCAGCGAGACCACCATCTCCAACATTAAT-3' (Val146의 코돈은 굵은 활자로 표시)

2.5 단위의 클로닝된 pfu 폴리머라제 (Stratagene)를 사용하여 PCR 반응을 30 사이클 계속하였다 (94℃ 130초, 50℃ 130초, 72℃ 190초). 반응 생성물을 NcoI 및 PstI 효소로 소화시키고, 0.7% 아가로스 겔 상에서 전기영동시킨 다음 "위저드 (등록상표) PCR 프렙 DNA" 정제 시스템 (Promega)을 써서 정제하였다. 그 다음 이 단편을 NcoI/PstI으로 소화시킨 pRSET-MUT-DH 벡터 내로 서브클로닝하여 AADH-PCR2 구조체를 얻었다. Ala70Thr 돌연변이를 제거하기 위해서는, AADH-PCR2 DNA를 HindIII로 소화시키고 그 결과 얻어진 단편 (CNTF의 79 위치 잔기에서 200 위치의 잔기까지를 포함하므로 70 위치의 돌연변이를 포함하지 않음)을 HindIII로 소화시킨 pRSET-CNTF 벡터 내로 서브클로닝하였다. DNA 서열을 직접 서열결정하여 이 서열이 실제로 Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH를 코딩한다는 사실을 확인하였다.

단백질의 발현 및 세균 봉입체의 단리는 다음 과정을 통해 실행하였다: pRSET-CNTF 및 pRSET-변이체 벡터를 사용하여 BL21 (DE3) LysE (SupE- 유전자형) 균주의 대장균 세포를 형질전환시켰다. 형질전환체를 0.1 mg/ml의 암피실린을 함유한 Luria 액상배지 1 리터 중, 37℃에서 A₆₀₀0.8로 진탕하였다. 이어서, 이소프로필티오갈락토시드 (0.4 mM)를 첨가하고 37℃에서 추가로 3 시간 동안 인큐베이션을 계속하였다. 그 다음 원심분리로 세균을 수득하여 완충액 A (100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 50 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10 mg/ml 류펩틴)에 비드 1 g 당 2 ml로 재현탁시켰다. 여기에 0.5 mg/ml의 리소짐과 30% w/v 수크로오스를 첨가하였다. 이 현탁액을 30℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 등부피의 완충액 A를 첨가한 후, 800 바의 압력으로 세균을 "French Press"에 연속 2 회 통과시켜 용해시켰다. 12000x g에서 30 분 동안 원심분리하여 봉입체를 단리하였다. 이 비드를 2 M 구아니딘 클로라이드 용액에 재현탁시키고, 동일한 용액을 사용하여 3 회 세척하였다. 최종적으로 얻어진 비드를 5 ml의 8 M 구아니딘 클로라이드 용액에 재현탁시키고, 즉시 완충액 A에 4 배 희석시켰다. 12000x g에서 30 분 동안 원심분리한 후, 상등액을 4℃에서 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 0.1 mM DTT, pH 8에 대해 구아니딘 클로라이드의 농도를 점감시키면서 3 회 (1 M, 0.5 M, 0 M, 매번 하룻밤 꼬박), 그리고 20 mM Tris, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 25 mM NaCl, pH 8에 대해 한 번 투석하였다. 최종 투석된 생성물을 12000x g에서 30 분 동안 원심분리하여 청정화하고 0.22 mm 필터를 통과시켰다. 후속 정제는 HPLC로, 즉 C4 컬럼 (Vydac 214 TP, 2.2 x 25 cm, 10 mm)을 써서 40%-60% 아세토니트릴/0.1% 트리플루오로아세트산 수용액/0.1% 트리플루오로아세트산의 선형 구배를 주고 30 ml/분의 유속으로 용출시켜 수행하였다. 동결건조로 용매를 제거하기 전에 용출액에 0.1% (w/v) n-옥틸글루코피라노시드를 가하였다. 얻어진 단백질을 물에 재현탁시켜 4℃에서 보관하였다.

CNTFRα 수용체 결합 분석

CNTFRα 수용체의 세포외 도메인에 결합하기 위해 바이오티닐화된 CNTF (8 nM)와 경쟁하는 CNTF 변이체의 능력을, 선행 문헌 (12)에 기재된 바와 같이 가용성 gp130의 존재 하에 고상 결합 분석법으로 측정하였다. "마이크로타이터" 96-웰 폴리스티렌 배양 플레이트에 c-myc 에피토프에 대항하는 모노클론 항체 9E10 0.2 mg을 함유한 100 ml의 50 mM 탄산나트륨 pH 9.5를 덮은 다음 플레이트를 4℃에서 하룻밤 동안 보존하였다. 그 다음 0.05% Tween을 함유한 TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl)로 웰을 5 회 씻어내고, 실온에서 90 분 동안 TBSMT (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5% (w/v) 동결건조 탈지유) 중에 고정시켰다. 후속 인큐베이션은 모두 실온에서 700 rpm의 믹서 상에서 수행하고, 각 인큐베이션 기간 후에는 0.05% Tween을 함유한 TBS로 웰을 세척하였다 (매번 5 회). 다음과 같은 인큐베이션 기간을 두었다: (1) CNTFRα-myc 10 mg을 함유한 TBSMT 50 ml과 2 시간, (2) gp130-flag 200 ng, 5 nM 바이오티닐화 CNTF, 및 각종 경쟁제를 함유한 TBSMT 50 ml과 1 시간, 및 (3) 알칼리 포스파타제와 결합된 아비딘 0.8 mg/ml을 함유한, TBS, 5% (w/v) 소 혈청 알부민, 0.05% (v/v) Tween 20 50 ml과 45 분.

알칼리 포스파타제 활성은 37℃에서 1 M 디에탄올아민-HCl, pH 9.8 중의 1 mg/ml p-니트로페닐 포스페이트를 사용하여 측정하였으며, 적절한 판독기를 써서 40-60 분 후에 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 일부 실험에서는 바이오티닐화된 MUT-DH 변이체 분자 (0.5 nM)를 리간드로 사용하였다.

경쟁 분석에서는 Phe152 및 Lys155 잔기를 알라닌으로 치환한 것이 CNTFRα 수용체와의 상호작용을 변화시키지 않는 것으로 나타났다. 두 가지 변이체 Lys155Ala/CNTF 및 Phe152Ala/Lys155Ala/CNTF는 수용체에 결합하는 데 있어 야생형 분자와 동등한 효력을 지녔다. 이전에 보고된 바와 같이 (12), MUT-DH 분자는 수용체 결합에 있어 CNTF보다 대략 40 배 더 강력하다. 이 경우에도 역시, 변이체 Phe152Ala/MUT-DH, Lys155Ala/MUT-DH 및 Phe152Ala/Lys155Ala/MUt-DH는 수용체에 결합하는 데 있어서 원래의 분자 (MUT-DH)와 동등한 효력을 보였다. 명확성을 위해 표 2에 요약해 놓은 이들 결과는 Phe152 및 Lys155 잔기가 CNTFRα 수용체에 결합하는 데 참여하지 않음을 보여준다.

시험관내에서 수용체 복합체의 조립

gp130 및 LIFR 분자가 CNTF/CNTFRα 복합체에 개별적으로 결합할 수 있다는 것은 문헌을 통해 알려져 있다 (7). D1 모티프 잔기들의 기능적 중요성을 분석하기 위해 여러가지 서브유닛과 수용체 복합체를조립하는 CNTF 변이체들의 능력을 평가하였다.³⁵S로 표지한 gp130 또는 LIFR에 대한 사이토킨/CNTFRα 복합체의 결합을 문헌 (7)에 설명된 바와 같이 면역침전 시험을 이용하여 측정하였다. 모노클론 항체 9E10 안티-myc을 사용하여 가용성 CNTFRα 수용체를 A-세파로오스 단백질 상에 고정시키고, 상이한 양의 CNTF 변이체의 부재 또는 존재 (1 또는 0.1 mg) 하에서,³⁵S로 표지한 가용성 gp130 또는 LIFR과 인큐베이션하였다. 세척 후, 결합된 물질을 용출시키고 SDS-PAGE시켰다.

도 1A에 나타낸 바와 같이, MUT-DH/CNTFRα 복합체에 대한 gp130 결합은 Phe152A (AK/DH 컬럼), Lys155A (FA/DH 컬럼) 및 Phe152A/Lys155A (AA/DH 컬럼) 치환의 영향을 받지 않는다. 이와 대조적으로, 도 1B에 보이는 바와 같이 이들 치환을 단독으로, 또는 함께 지닌 변이체는 LIFR 수용체에는 결합할 수 없었다. 변이체들이 CNTFRα/gp130/LIFR 3원 복합체를 형성하는 능력을 시험하기 위해, LIFR 수용체를 단백질 A-세파로오스 상에 고정시키고³⁵S로 표지한 가용성 CNTFRα, 가용성 gp130과, 그리고 CNTF 변이체와 인큐베이션하였다 (이 경우에도, 두 가지 상이한 양의 변이체 분자, 1 또는 0.1 mg에 대해 두 번 실험을 행하였음).

처음 두 가지 결과와 합치되게, 변이체 분자들은 세포 표면에 있는 CNTF 수용체의 생리적 활성형태에 해당하는 CNTFRα/gp130/LIFR 복합체에 결합할 수 없었다 (도 1C 참조).

상기 결과들은 Phe152 및 Lys155가 LIFR 수용체 결합 부위의 일부를 형성한다는 것을 보여준다.

실시예 2

CNTF 변이체의 생물학적 활성

사람 간암 세포의 합토글로빈 분비에 대한 평가

가용성 CNTFRα와 세포성 LIF 수용체 간의 기능성 수용체 복합체를 조립하는 CNTF (또는 그의 변이체)의 능력을 측정할 수 있는 세포 기준 분석법으로 생물학적 활성을 측정하였다. 사람 간암 세포주 HepG2는 CNTFRα를 발현하지 않는 반면 LIF 수용체는 발현하며, 아마도 CNTF와 세포성 LIF 수용체의 저친화도 상호작용 때문이겠지만 고농도의 사이토킨에만 반응한다 (12, 13). 평가는 다음과 같이 수행하였다. 먼저, 96-웰 플레이트에서 HepG2 세포를 전면생장 단일층을 형성할 때까지 증식시킨 다음 1 mM 덱사메타손을 함유한 최소 배양 배지에 넣고 (14), 24 시간 동안 정제된 CNTF로, 또는 시험하는 변이체 분자로 처리하였다. 배양 배지 중의 세포가 분비한 합토글로빈의 양은 ELISA 시험을 이용하여 측정하였다.

합토글로빈 분비가 LIFR 세포성 수용체에 의해 매개되므로 이 수용체에 대한 결합을 불가능하게 만드는 아미노산 치환은 이 형태의 생물학적 활성을 야생형 분자에 비해 크게 감소시킬 것으로 예상된다. 실제로, 알라닌에 의한 Phe152 또는 Lys155의 치환이 고농도에서 약한 생물학적 활성을 부여한다면 (최대치에 대해 대략 20%), 두 잔기의 동시적인 알라닌 치환은 고농도에서까지도 생물학적 활성을 완전히 파괴한다 (도 2A). 가용성 CNTFRα의 존재시, LIFR 및 gp130 수용체를 보유한 세포는 완전한 수용체 복합체의 형성으로 인해 저농도의 CNTF에 대해 민감해진다. 도 2B에서 알 수 있는 것처럼, 외인성 CNTFRα의 농도가 증가하면 더 낮은 농도의 CNTF 및 그 변이체 쪽으로 세포 반응이 이동하게 된다.

단일 변이체들의 거동 분석을 보자면, 변이체 Lys155Ala/CNTF (FA-CNTF) 및 Lys155Ala/MUT-DH (FADH-CNTF)는 생물학적 활성이 현저히 감소했지만 완전히 없어지지는 않았다고 할 수 있다. 한편, Phe152 잔기의 알라닌 치환 (AKDH-CNTF)은 분자의 생물학적 활성을 Lys155 잔기의 치환보다는 적게 감소시키며, 두 잔기의 동시 치환 (AADH-CNTF)은 수용체와 사이토킨 모두가 고농도일 때조차 이 활성을 완전히 없앤다.

IMR-32 세포에서 콜린 아세틸트랜스퍼라제 (Chat) 활성의 자극

막결합 CNTF 뉴런 수용체에 대한 변이체의 영향을 산출하기 위해, 문헌 (15, 16)에서 공지된 방법을 이용하여 사람 신경아종 세포 (IMR-32)에서 Chat 활성을 자극하는 분자들의 능력을 시험하였다. 이들 세포는 본래 CNTFRα 수용체를 발현한다. IMR-32 막결합 수용체는 152 위치와 155 위치에 존재하는 단일 돌연변이의 영향에 대해 가용성 수용체보다 덜 민감한 것으로 밝혀졌다. 변이체 Phe152Ala/MUT-DH는 야생형 사이토킨만큼 활성이 있었고, 변이체 Lys155Ala/CNTF 및 Lys155Ala/MUT-DH는 실제로 그들 자체가 강력한 아고니스트임을 보여주었다. 그러나 이 경우에도, 두 잔기의 동시 치환은 생물학적 활성이 완전히 소실되는 결과를 가져온다.

IMR-32 세포 중에서의 변이체 Phe152Ala 및 Lys155Ala의 높은 생물학적 활성은 아마도 세포 표면에 수용체 서브유닛이 국소적으로 고농도로 존재하기 때문일 것이다. 실제로, LIFR 수용체 결합 능력이 감소된 CNTF 변이체는 예컨대 동작 기능에 참여하는 것들과 같이 고농도의 막 수용체 복합체를 발현하는 다른 뉴런 집단에 대해 강한 자극 활성을 계속 유지할 것이라고 예상된다. CNTF 투여에 기인하는 부작용, 예컨대 급성기 반응은 순환하는 가용성 CNTFRα 수용체가 LIFR 수용체를 발현하는 세포 (예, 간세포)에 가하는 작용이 매개한다고 여겨진다. 따라서 가용성 수용체와 상호작용할 때에는 약한 활성을 보이는 반면 세포의 막결합 수용체 복합체와 상호작용할 때에는 높은 수준의 생물학적 활성을 보이는 CNTF 변이체는 더욱 특이적으로 뉴런에 작용하여 말초 부작용을 감소시킬 것으로 예상된다.

실시예 3

특정 CNTF 변이체의 안타고니스트 특성

LIF 수용체에 결합하는 능력을 소실했지만 CNTFRα와 gp130과는 여전히 결합할 수 있는 CNTF 변이체는 경쟁적 안타고니스트로 작용할 것으로 예상된다. 실시예 2에 기재한 방법을 이용하여 이들 변이체에 의한 CNTF 생물학적 활성의 억제를 IMR-32 세포에서 시험하였다. 변이 단백질 Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH는 CNTF 반응 곡선을 아고니스트 분자의 고농도 쪽으로 이동시키는데, 이것은 이 단백질이 막결합 CNTFRα 수용체에 경쟁적 안타고니스트로 작용하는 것을 보여준다. 포화 투여량의 CNTF에 의해 유도된 Chat 활성의 50% 억제가 70배 과량의 Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH에서 이루어졌다 (도 5B).

실시예 4

CNTF 변이체의 제작

사람 CNTF 또는 S166D/Q167H/CNTF (DH-CNTF) 서열에, pRSET-CNTF 또는 pRSET-MUT-DH 벡터 (이탈리아 특허 출원 제RM9500380호)를 주형으로 사용하여 역 PCR (Hemsley et al., 1989)로 변이를 도입하였다. 합성 올리고뉴클레오티드 프라이머를 이중나선에 "백 투 백(back to back)"으로 놓이되, 5' 말단들이 붙어 있고 3' 말단들이 원형 플라스미드를 따라 반대 방향으로 연장되도록 배치되게 제조하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같다:

FA-CNTF 및 FADH-CNTF용 안티센스 프라이머:

5'-CGCCTTCTCAAAGAGCCACCATCTCCAAC3'

AKDH-CNTF용 안티센스 프라이머:

5'-CTTCTTCTCAGCGAGACCACCATCTCCAAC3'

AA-CNTF 및 AADH-CNTF용 안티센스 프라이머:

5'-CGCCTTCTCAGCGAGACCACCATCTCCAAC3'

상기 돌연변이 프라이머를 다음 센스 야생형 프라이머와 함께 PCR에 사용하였다.

5'-CTGTGGGGCCTAAAGGTGCTG3'

주형 DNA (10 fmol) 및 프라이머 세트(각 1 mM)를 100 mM Tris-HCl pH 8.3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl₂, 각 dNTP 0.2 mM 및 Taq 폴리머라제 (Boehringer) 2 단위를 함유한 반응액 100 ml에서 인큐베이션하였다.

증폭은 94℃에서 변성 (1 분), 45℃에서 어닐링 (1 분) 및 72℃에서 프라이머 연장 (12 분)하는 사이클을 통해 총 25 사이클 동안 진행하였다. PCR로 생성된 시료 중 5 ㎕ 분획을 아가로스 겔 (0.7%) 상에서 분석하여 증폭 효율을 측정하였다. 그 나머지 (95 ml)를 대장균 폴리머라제 I의 클레노우 단편 (20 단위) 및 최종 농도 각 250 mM의 네 가지 dNTP로 처리하였다. 반응 혼합물을 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 위저드 PCR 프렙 DNA 정제 시스템 (Promega)을 사용하여 PCR 반응 혼합물에서 이중 가닥 DNA를 단리하고, 20 유닛의 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 (Promega) 및 1 mM ATP와 인큐베이션하여 5' 말단을 포스포릴화하였다.

다음으로, 포스포릴화한 DNA 시료를 아가로스 겔 (0.7%) 상에서 전기영동시키고, 적합한 밴드를 잘라내어 Qiagen DNA 정제 키트를 사용하여 정제하였다. 10㎕ 부피의 DNA (총 25 ml 중)를 써서 표준 평활 말단 라이게이션 완충액과 T4 DNA 리가제 (12 단위)로 리가제 반응시켰다. 라이게이션 혼합물을 16℃에서 밤새 인큐베이션한 다음 65℃로 가열하고, 이것을 써서 감응 대장균 Top 10 세포를 형질전환시켰다. 형질전환체를 단리하고, DNA 서열분석으로 클론을 동정하였다.

AA-CNTF와 AADH-CNTF의 코딩 서열은 뉴클레오티드 208과 435에 2 개의 돌연변이 (아마도 PCR에 유래한 오류 때문)를 더 포함한 것으로 밝혀졌다. 뉴클레오티드 435의 돌연변이는 다음 센스 및 안티센스 프라이머를 사용하여 PCR로 제거하였다:

센스: 5'-GTCACCATGGCTTTCACAGAGCATTCACCG3'

안티센스:

5'-AGCTCCTGCAGCACCTTTAGGCCCCACAGCGCCTTCTCAGCGAGACCACCATCTCCAACATTAAT3'

PCR은 2.5 U의 pfu DNA 폴리머라제 (Stratagen)를 제조사의 지시대로 사용하여 94℃ 140 초, 50℃ 140 초, 72℃ 190초로 30 사이클 시행하였다. PCR 생성물을 상기와 마찬가지로 단리하고, NcoI (인식부위가 CNTF 코딩 서열의 뉴클레오티드 -2에 위치) 및 PstI (인식부위가 코딩 서열의 뉴클레오티드 484에 위치)으로 소화시키고, NcoI/PstI으로 소화시킨 pRSET-CNTF 또는 pRSET-DH-CNTF 벡터내로 서브클로닝하였다. 이 과정을 통해 AA-CNTF 또는 AADH-CNTF를 코딩하는 서열을 뉴클레오티드 208에 돌연변이가 남아있는 상태로 포함한 벡터를 얻었다. 이 돌연변이는 벡터를 HindIII (인식부위가 코딩 서열의 뉴클레오티드 233 및 말단에 위치)로 소화시키고 큰 제한 단편 (뉴클레오티드 1 내지 233으로 이루어짐)을 pRSET-CNTF에 있는 대응하는 단편으로 대체함으로써 제거하였다.

<참고문헌>

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7.Savino R., Lahm A., Salvati A.L., Ciapponi L., Sporeno E., Altamura S., Paonessa G., Toniatti C. & Ciliberto G. (1994) EMBO J. 13:1357-1367.

8.Brakenhoff J.P.L., de Hon F.D., Fontaine V., Boekel E.T., Schooltingk H., Rose-John S., Heinrich P.C., Content J. & Aarden L.A. (1994) J.Biol.Chem. 269:86-93.

9.Hudson K.R., Vernallis A.B. & Heath J.K. (1996) J. Biol. Chem. in press.

10.Paonessa G., Graziani R., De Serio A., Savino R., Ciapponi L., Lahm A., Salvati A.L., Toniatti C. & Ciliberto G. (1995) EMBO J. 14:1942-1951.

11.De Serio a., Graziani R., Laufer R., Ciliberto G. & Paonessa G. (1995) J.Mol.Biol. 254:795-800

12.Savino R., Lahm a., Giorgio M., Cabibbo ., Tramontano A. & Ciliberto G. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:4067-4071.

13.Savino R., Ciapponi L., Lahm A., Demartis A., Cabibbo A., Toniatti C., Delmastro P., Altamura S. & Ciliberto G. (1994) EMBO J. 13: 5863-5870.

14.Robinson R.C., Grey L.M., Staunton D., Vankelekom H., Vernallis A.B., Moreau J.F., Stuart D.I., Heath J.K. & Jones E.Y. (1994) Cell 77:1101-1116.

15.Bazan E. (1991) Neuron 7:197-208.

16.Hemsley A., Arnheim N., Toney M.D., Cortopassi G. & Galas D.J. (1989) Nucl. Acids Res. 17:6545-6551.

17.Masiakowsky P., Liu H., Radziejewsky C., Lottspeich F., Oberthuer W., Wong V., Lindsay R.M., Furth M.E. & Panayotatos N. (1991) J. Neurochem. 57:1003-1012.

18.Saggio I., Gloaguen I., Poiana G. & Laufer R. (1995) EMBO J. 14: 3045-3054.

19.Saggio I., Paonessa G., Graziani R., Di Serio A & Laufer R. (1994) Anal. Biochem. 221:387-391.

20.Baumann H., Ziegler S.F., Mosley B., Morella K.K., Pajovic S. & Gearing D.P. (1993) J. Biol.Chem. 268:8414-8417.

21.Baumann H., Ziegler S.F., Mosley B., Morella K.K., Pajovic S. & Gearing D.P. (1993) J.Biol.Chem. 268:8414-8417

22.Saggio I., Gloaguen I. & Laufer R. (1995) Gene 152:35-39.

23.Rabinovsky E.D., Browder D.P., & McManaman J.L. (1994) J. Newrosoi. Res. 38. 127-133.

〈서열표〉

(1) 일반적 정보 : 이스티투토 디 리세르쉐 디 비올로지아 몰레콜라레 피. 안젤레티 에스. 피. 에이.

(i) 출원인:

(ii) 발명의 명칭: 야생형 분자와 활성 범위가 상이한 사람 섬모 신경영양 인자 (hCNTF) 변이체

(iii) 서열수: 7

(iv) 통신 주소:

(A) 수신인: 소시에타 이탈리아나 브레비티

(B) 거리: 피아자 디 피에트라 39

(C) 도시: 로마

(D) 국가: 이탈리아

(E) 우편번호: 아이-00186

(v) 컴퓨터 판독 형태

(A) 매체 유형: 플로피 디스켓 3.5인치 1.44 메가바이트

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형

(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS 5.0판

(D) 소프트웨어: 마이크로소프트 워드 6.0

(viii) 대리인 정보:

(A) 이름: 디 세르보 마리오 (박사)

(B) 관리번호: RM/X88808/PC-DC

(ix) 전자통신 정보:

(A) 전화: 06/6785941

(B) 팩스: 06/6794692

(C) 텔렉스: 612287 ROPAT

(1) 서열 1에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 16 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 양상: 밝혀지지 않음

(ii) 분자 형태: 단백질

(ix) 추가 특징:

(A) 이름: hCNTF

(B) 추가 정보: 사람 CNTF에서 위치 152 내지 위치 167의 서열

(xi) 서열 설명: 서열 1

(2) 서열 2에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 16 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 밝혀지지 않음

(ii) 분자 형태: 단백질

(ix) 추가 특징:

(A) 이름: (Ser166Asp/Gln167His) hCNTF

(B) 추가 정보: 사람 CNTF에서 위치 152 내지 위치 167의 서열

(xi) 서열 설명: 서열 2

(3) 서열 3에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 16 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 밝혀지지 않음

(ix) 추가 특징:

(A) 이름: (Phe152Ala/Ser166Asp/Gln167His)hCNTF

(B) 추가 정보: 사람 CNTF에서 위치 152 내지 위치 167의 서열

(xi) 서열 설명: 서열 3

(4) 서열 4에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 16 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 밝혀지지 않음

(ix) 추가 특징:

(A) 이름: (Lys155Ala/Ser166Asp/Glu167His) hCNTF

(B) 추가 정보: 사람 CNTF에서 위치 152 내지 위치 167의 서열

(xi) 서열 설명: 서열 4

(5) 서열 5에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 16 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 밝혀지지 않음

(ix) 추가 특징:

(A) 이름: (Phe152Ala/Lys155Ala)hCNTF

(B) 추가 정보: 사람 CNTF에서 위치 152 내지 위치 167의 서열

(xi) 서열 설명: 서열 5

(6) 서열 6에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 16 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 밝혀지지 않음

(ix) 추가 특징:

(A) 이름: (Phe152Ala/Lys155Ala/Ser166Asp/Gln167His)hCNTF

(B) 추가 정보: 사람 CNTF에서 위치 152 내지 위치 167의 서열

(xi) 서열 설명: 서열 6

(7) 서열 7에 대한 정보:

(i) 서열 특징:

(A) 길이: 16 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 단일

(D) 토폴로지: 밝혀지지 않음

(ix) 추가 특징:

(A) 이름: (Lys155Ala)hCNTF

(B) 추가 정보: 사람 CNTF에서 위치 152 내지 위치 167의 서열

(xi) 서열 설명: 서열 7

Claims (4)

1. 페닐알라닌 152 및(또는) 라이신 155가 알라닌으로 치환된 것과 특히 서열 3 내지 서열 7에 기재된 서열 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함한다는 것을 특징으로 하는 사람 섬모 신경영양 인자 hCNTF의 변이체.
2. 제1항에 따른 hCNTF의 변이체 중 1 종 이상을 활성 성분으로 함유하는 제약 조성물.
3. 신경계 관련 질병 또는 병리 상태, 또는 CNTF에 반응하는 세포와 관련된 다른 병리 상태의 치료용 약을 제조하기 위한, 제1항에 따른 hCNTF 변이체의 용도.
4. 제3항에 있어서, 신경계의 질병 또는 병리 상태가 신경계 자체의 손상을 포함하는 것인 용도.