CZ283548B6 - Polypeptid a jehi použití - Google Patents

Abstract

V podstatě čistý polypeptid se sekvencí aminokyselin odpovídající SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:, SEQ ID NO:6 nebo SEQ ID NO:8 nebo peptid s v podstatě stejnou frekvencí aminokyselin a v podstatě stejnou účinností při blokování vápníkových kanálků, jako má výše uvedený polypeptid, a jejich farmaceuticky vhodné soli. Tyto polypeptidy a jejich farmaceuticky vhodné soli blokují vápníkové kanálky v buňkách, včetně neuronových a svalových buněk různých organismů včetně bezobratlých a obratlovců a jsou vhodné při léčbě chorob a stavu savců, které jsou zprostředkovány vápníkovými kanálky a při potlačování bezobratlých škůdců.ŕ

Description

Vynález se týká určitých polypeptidů obsažených vjedu pavouka Theraphosidae aphonopelma. Tyto polypeptidy ajejich farmaceuticky vhodné soli blokují vápníkové kanály v buňkách, včetně neuronových a svalových buněk různých organismů, včetně bezobratlých a obratlovců. Může se jich použít při blokování vápníkových kanálů v buňkách, jako jsou buňky nervového a svalového systému organismu, ať již se jedná o blokování jako takové nebo jako součást léčby chorob a stavů, které jsou zprostředkovány vápníkovými kanály u savců.

Dosavadní stav techniky

Sloučeniny, které jsou antagonisty vápníku, mají značný rozsah použití. Antagonisty vápníku nalézají klinickou aplikaci při léčbě takových chorob, jako je mj. angína, hypertense, kardiomyopathie, supraventrikulámí arrhytmie, aesofogeální achalasie, předčasná práce k porodu a Raynaudova choroba (viz W.G. Nayler, Calcium Antagonists, Academie Press, Harcourt Brace Jovanovich Publishers, New York, NY 1988). Výše uvedená publikace je zde uvedena náhradou za přenesení celého jejího obsahu do popisu tohoto vynálezu. Tyto sloučeniny jsou dále užitečné při studii fyziologie takových buněk, jako jsou neurony a svalové buňky.

Polypeptid izolovaný z jedu tarantule, který má stejnou obecnou povahu jako polypeptid mající sekvenci SEQ ID NO:1, je publikován v Biol. Chem. Hoppe-Seyler, sv. 370(5), 484 až 498 (1989). Tento polypeptid vykazuje 79,5 % homologii (31/39 aminokyselin) se SEQ ID NO:1.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou polypeptidy se sekvencí aminokyselin odpovídající SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6 nebo SEQ ID NO:8 ajejich farmaceuticky vhodné soli. Polypeptidy podle vynálezu, které jsou obsaženy vjedu pavouka Theraphosidae aphonopelma a frakce, v nichž jsou přítomny jsou charakterizovány dále.

Peptid Aphonopelma 6-6 má aminokyselinovou sekvenci odpovídající SEQ IDNO:1. Peptid Aphonopelma 6-8 má aminokyselinovou sekvenci odpovídající SEQ ID NO:2.

Peptid Aphonopelma 7-6.1 má aminokyselinovou sekvenci odpovídající SEQ ID NO:3.

Peptid Aphonopelma 7-13.1 má aminokyselinovou sekvenci odpovídající SEQ ID NO:4. Peptid Aphonopelma 7-13.2 má aminokyselinovou sekvenci odpovídající SEQ ID NO:5. Peptid Aphonopelma 7-15.2 má aminokyselinovou sekvenci odpovídající SEQ ID NO:6. Peptid Aphonopelma 7-17.3 má aminokyselinovou sekvenci odpovídající SEQ IDNO:8.

Polypeptidy podle vynálezu blokují vápníkové kanály v buňkách. V důsledku toho jsou tyto polypeptidy užitečné při blokování vápníkových kanálů v buňkách, jako takovém, a také jsou užitečné při potlačování bezobratlých škůdců a při léčbě chorob a stavů savců, které jsou zprostředkovány funkcí vápníkových kanálů v buňkách.

Jed se získává odběrem z pavouka Theraphosidae aphonopelma po jeho elektrické stimulaci ve shodě se standardními postupy, které jsou odborníkům v tomto oboru známy. Přednostně se používá postupů, které zaručují, že nedojde ke kontaminaci celého jedu abdominálním regurgitantem (vratným proudem) nebo hemolymfou. Takové postupy jsou odborníkům v tomto oboru dobře známy. Takto získaný celý jed se uskladňuje ve zmrazeném stavu při teplotě asi

- 1 CZ 283548 B6

-78 °C až do jeho použití při purifikaci popsané dále. Purifikace složek z celého jedu se provádí vysoce účinnou kapalinovou chromatografií (HPLC) s reversními fázemi na různých preparativních nebo semipreparativních sloupcích, jako je sloupec C-4 aC-18 Vydac^(R) (Rainin Instrument Co. Inc., Mack Road, Wobum, Massachusetts 01801, USA). Detekce píku se provádí monochromaticky při 220 až 230 nm. Další analýza frakcí se například může provádět na základě polychromních UV dat získaných pomocí detektoru se soustavou diod (Waters 990) (Millipore Corporation Waters Chromatography Division, 34 Maple Street, Milford, Massachusetts 01757, USA). Frakce ze sloupců se sbírají známými postupy, jako například za použití sběrače frakcí ISCO/FOXY a píkového detektoru ISCO 2159 (ISCO, 4700 Superior, Lincoln, Nebraska, 68504, USA). Frakce se sbírají do nádob vhodné velikosti, například do sterilních polyethylenových laboratorních nádob. Zkoncentrování frakcí se potom provede lyofilizací z eluátu, po níž následuje lyofilizace z vody. Čistota výsledných složkových frakcí se potom může stanovit chromatografickou analýzou za použití analytického sloupce s gradientovým systémem, který je isokratičtější než systém použitý při finální purifikaci těchto frakcí.

Polypeptidy podle vynálezu je možno známými metodami sekvenovat. Obecná strategie pro stanovení základní struktury zahrnuje například tyto stupně

1) Redukci a S-pyridylaci disulfidem přemostěných cysteinových zbytků za účelem zvýšení susceptibility substrátu k enzymatickému napadení,

2) Regulované jednostupňové nebo vícestupňové štěpení peptidu enzymem.

3) Isolaci a purifikaci fragmentů peptidu vysoce účinnou kapalinovu chromatografií (HPLC) s reversními fázemi.

4) Charakterizaci fragmentů peptidu pomocí N-terminálního sekvenování a hmotnostní spektrometrie ion-spray.

S-pyridylethylace cysteinových zbytků studovaných polypeptidů se například může provádět v roztoku a po této operaci následuje sekvenování polypeptidů. Jeden ze způsobů S-pyridylethylace, kterého je možno použít, je popsán dále.

Asi 1 až 10 pg polypeptidů se rozpustí v 50 μΐ pufru připraveného smícháním 1 dílu 1M TrisHCl o pH 8,5 s obsahem EDTA (4mM) a 3 dílů 8M hydrochloridu guanidinu, nebo se tímto pufrem na objem 50 μΐ zředí. Přidá se 2,5 μΐ 10% vodného 2-merkaptoethanolu a směs se inkubuje při teplotě místnosti v temnu pod argonovou atmosférou po dobu 2 hodin. Po inkubaci se přidají 2 μΐ 4—vinylpyridinu (čerstvé reakční činidlo skladované pod argonovou atmosférou při -20 °C) a výsledná směs se další 2 hodiny inkubuje při teplotě místnosti v temnu pod argonovou atmosférou. Potom se směs odsolí, přednostně chromatograficky na krátkém sloupci s reversními fázemi. Získaný alkylovaný polypeptid se potom známými metodami sekvenuje.

Díky vynálezu, který je charakterizován v tomto popisu, se peptidy přítomné ve 6-6, 6-8, 7-6.1, 7-13.1, 7-13.2, 7-15.2 a 7-17.3 frakcích jedu z Theraphosidae aphonopelma mohou získat také jinými metodami než izolací a purifikaci z celého jedu. Polypeptidy podle vynálezu je tedy také možno vyrobit za použití rekombinantních DNA technik pomocí klonování kódující sekvence pro tyto polypeptidy nebo jejich části. Tak například je možno, s využitím informace o známé sekvenci aminokyselin těchto polypeptidů, použít hybridizačních prób pro klonování kódující sekvence pro celý polypeptid, což se provádí způsoby dobře známými odborníkům v tomto oboru. Při výrobě polypeptidů podle vynálezu se také může použít kombinace rekombinantních DNA technik s in vitro syntézou proteinu. Jako neomezující příklad metody in vitro syntézy proteinu je možno uvést metodu prováděnou v syntetizátoru peptidů v pevné fázi ABI 430A (Applied Biosystems Inc., 850 Lincoln Center Drive, Foster City, Califomia 94404, USA), při

-2 CZ 283548 B6 níž se používá standardní Merrifieldovy chemie nebo jiných chemií pro postup v pevné fázi, které jsou dobře známé odborníkům v tomto oboru.

V tomto oboru je dobře známo, že v polypeptidech je možno provádět určité substituce aminokyselin, které neovlivňují nebo v podstatě neovlivňují funkci těchto polypeptidů. Specifické substituce, které jsou možné, se mění od polypeptidů k polypeptidů. Stanovení přípustných substitucí se provádí postupy, které jsou v tomto oboru dobře známy. Tak lze získat polypeptidy, které mají v podstatě shodnou sekvenci aminokyselin a v podstatě shodnou účinnost při blokování vápníkových kanálů.

Polypeptidy podle vynálezu blokují vápníkové kanály obsažené v různých buňkách, jako jsou například buňky nervového systému a svalového systému bezobratlých a obratlovců.

Schopnost polypeptidů podle vynálezu blokovat vápníkové kanály je možno demonstrovat následujícím postupem. Z cerebella osmidenních krys se získají cerebelámí granulámí buňky (Wilkin et al., Brain Res., 115, 181 až 199, 1976). Čtverečky (1 cm²) z Aclaru (Proplastics lne., 5033 Industrial Ave., Wall, NJ, 07719, USA) se potáhnou poly-L-lysinem a umístí do 12jamkových misek obsahujících 1 ml Eaglova bazálního média. Buňky se disociují a do každé jamky obsahující čtvereček Aclaru se přidá alikvotní část obsahující 6,25 x 10⁶ buněk. Po 24 hodinách se přidá cytosin-beta-D-arabinofuranosid (koncová koncentrace 10μΜ). Buněk se používá pro fura2 analýzu u 6-, 7- a 8-denní kultury. Buňky (připojené k Aclarovým čtverečkům) se převedou do 12-jamkové misky obsahující 1 ml 2μΜ fura2/AM (Molecular Probes lne.. Eugene, OR 97402, USA) v pufru HEPES (s obsahem hovězího sérového albuminu 0,01 % a dextrosy 0,01 %; pH 7,4, bez hořčíku). Buňky se inkubují po dobu 40 minut při 37 °C a potom se pufr obsahující fura2/AM odstraní a nahradí 1 ml stejného pufru bez fura2/AM. Do kyvety z křemenného skla se předloží 2,0 ml předehřátého (37 °C) pufru. Do kyvety se přidají buňky na Aclaru, kyveta se vloží do termostatovaného (37 °C) držáku vybaveného magnetickým míchadlem a pomocí fluorescenčního spektrofotometru (Biomedical Instrument Group, University of Pennsylvania, USA) se měří fluorescence. Fluorescenční signál se nechá stabilizovat po dobu asi 2 minut. Potom se do kyvety přidá 5 až 20 μΐ zásobního roztoku studované sloučeniny v roztoku chloridu sodného pufrovaném fosforečnanem (PBS, pH 7,4) o vhodné koncentraci. Kalibrace fluorescentních signálů a oprava úniku fura2/AM se provede zavedenými postupy (Nemeth et al.,

J. Biol. Chem. 262, 5188 (1987)) na závěr každé zkoušky. Maximální hodnota fluorescence (Fmax) se stanoví přídavkem ionomycinu (35μΜ) a minimální hodnota (Fmin) se stanoví následujícím přídavkem EGTA (12μΜ) za účelem chelatace vápníku. Za použití výše popsaného postupu se zjistí, že dochází k blokování vápníkových kanálků studovaným polypeptidem, což se projeví poklesem fluorescence po přidání tohoto polypeptidů. Při této zkoušce vykazují polypeptidy podle tohoto vynálezu nízké hodnoty IC50, pod 200 nm, při blokování vápníkových kanálů.

Pro srovnání je možno uvést, že dva známé obchodně dostupné antagonisty vápníkových kanálů. Nifedipine a Verapamil, vykazují hodnotu IC50 33 nm a 4 800 nm.

Polypeptidy podle tohoto vynálezu jsou užitečné při blokování vápníkových kanálů v buňkách, jako takovém. Díky tomu jsou polypeptidy také užitečné při potlačování bezobratlých škůdců a při léčbě chorob a stavů zprostředkovaných funkcí vápníkových kanálů v buňkách savců, jako je mj. angína, hvpertense, kardiomyopathie, supraventrikulámí arrhytmie, aesophogeální achalasie, předčasná práce k porodu a Raynaudova choroba. Dále jsou tyto polypeptidy užitečné při studii fyziologie buněk, přičemž jako neomezující příklady buněk přicházejících v úvahu, je možno uvést buňky nervového, muskulámího a kardiovaskulárního systému.

Do rozsahu tohoto vynálezu spadají také farmaceuticky vhodné soli polypeptidů podle vynálezu. Tyto soli se vyrábějí způsoby, které jsou v tomto oboru osobě známé. Tak například soli polypeptidů s kyselinami je možno vyrobit konvenčními metodami.

Při podávání polypeptidů podle vynálezu savcům je možno tyto látky podávat buď samotné, nebo v kombinaci s farmaceuticky vhodnými nosiči nebo ředidly, v podobě farmaceutických prostředků, jak je to obvy klé ve standardní farmaceutické praxi. Polypeptidy je možno podávat orálně nebo parenterálně. přičemž parenterálnímu způsobu podávání se dává přednost. Patenterální podávání zahrnuje intravenosní, intramuskulámí, intraperitoneální, subkutánní atopické podávání.

Pokud se polypeptidy podle vynálezu podávají orálně, může se k tomuto účelu používat prostředků ve formě tablet nebo kapslí nebo vodných roztoků nebo suspenzí. Jako vhodné nosiče, kterých se obvykle používá v tabletách pro orální podávání, je možno uvést laktosu a kukuřičný škrob. Dále se k takovým tabletám přidávají obvykle lubrikační činidla, jako je stearan hořečnatý. Jako vhodná ředidla pro přípravky v podobě kapslí pro orální podávání je možno uvést laktosu a sušený kukuřičný škrob. Pokud se mají vyrobit vodné suspenze pro orální podávání, míchá se účinná přísada s emulgačními a suspenzními činidly. Je-li to žádoucí, mohou se též přidávat určitá sladidla a/nebo aromatizační látky.

Pro intramuskulámí, intraperitoneální, subkutánní a intravenosní podávání se mohou vyrábět sterilní roztoky účinné přísady. Hodnota pH těchto roztoků se účelně nastavuje nebo pufruje. U roztoků určených pro intravenosní podávání je třeba dbát na nastavení celkové koncentrace rozpuštěných látek, aby byl přípravek isotonický.

Pokud se polypeptid nebo jeho sůl podle vynálezu bude podávat humánnímu pacientovi, stanoví denní dávku obvykle ošetřující lékař. Dávkování bude závislé na věku, hmotnosti a odpovědi konkrétního pacienta a na závažnosti symptomů choroby a účinnosti podávané sloučeniny.

Pokud se polypeptidů nebo jeho soli podle vynálezu bude používat při potlačování bezobratlých škůdců, bude se těmto bezobratlým podávat polypeptid přímo nebo se bude aplikovat na prostředí, v němž se bezobratlí vyskytují. Tak například se může sloučenina podle vynálezu aplikovat na bezobratlé ve formě postřiku roztokem této sloučeniny. Množství sloučeniny potřebné pro potlačení bezobratlých se bude měnit v závislosti na druhu bezobratlých a podmínkách prostředí. Toto množství stanoví osoba provádějící aplikaci.

Pokud se polypeptidů nebo jeho soli podle vynálezu bude používat při studii fyziologie buněk, bude se tento polypeptid podávat buňkám metodami, které jsou známé odborníkům v tomto oboru. Polypeptid je například možno buňkám podávat ve vhodném fyziologickém pufru. Vhodná koncentrace polypeptidů podle vynálezu při použití v takových studiích je 200 μΜ. Koncentrace polypeptidů při těchto studiích však může být i vyšší nebo podstatně nižší než 200 μΜ. Množství podávaného polypeptidů stanoví odborník v tomto oboru známými metodami.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Stupeň I, frakcionace surového jedu z Aphonopelma

Surový jed z Theraphosidae aphonopelma (asi 40 μΐ) se nanese na sloupec HPLC s reversními fázemi [VYDAC^lR> C-18, 300 (30 nm), 22 x 250 mm], který se provozuje za použití programu

-4CZ 283548 B6 s dvoufázovým lineárním gradientem od složení 95 % složky A a 5 % složky B do složení 80 % složky A a 20 % složky B (30 minut) a dále od složení 80 % složky A a 20 % složky B do složení složení 30% složky A a 70% složky B (25 minut), kde složkou A je 0,1% kyselina trifluoroctová a složkou B je acetonitril, přičemž detekce se provádí při 220 nm a průtoková rychlost je 15 ml/min. Požadované frakce se sbírají v dobách uvedených v tabulce 1.

Tabulka 1

Frakce 6 35,9 až 37,3 minuty

Frakce 7 37,3 až 39,5 minuty

Frakce 8 39,5 až 40,1 minuty

Frakce 9 40,1 až 40,9 minuty

Frakce 10 40,9 až 41,8 minuty

Stejné frakce z různých pokusů se spojí a zkoncentrují lyofilizací. Další frakcionace se provádí následujícím způsobem:

Stupeň II, subfrakcionace frakcí ze stupně I

A) Subfrakcionace frakce 6

Látka z frakce 6 ze stupně I získaná z asi 60 μΐ surového jedu se nanese na sloupec HPLC s reversními fázemi (Baker WPC-18, 4,6 x 250 mm), který se provozuje za použití programu s lineárním gradientem při složení v rozmezí od 85 % složky A a 15 % složky B do složení 65 % složky A a 35 % složky B (45 minut), kde složkou A je 0,1% kyselina trifluoroctová a složkou B je acetonitril, přičemž detekce se provádí při 220 nm a průtoková rychlost je 1,0 ml/min. Frakce se sbírají podle časového režimu uvedeného v tabulce 2.

Tabulka 2

Frakce 6-6

Frakce 6-7

Frakce 6-8

Frakce 6-9

Frakce 6-13

Frakce 6-14

24,0 až 24,8 minuty

25,0 až 25,4 minuty

25,6 až 26,5 minuty

27,0 až 28,7 minuty

33,5 až 34,3 minuty

34,4 až 35,4 minuty

Stejné frakce z různých pokusů se spojí a zkoncentrují lyofilizací.

B) Subfrakcionace frakce 7

Látka z frakce 7 ze stupně I získaná z asi 60 μΐ surového jedu se nanese na sloupec silného katexu [sulfoethylaspartamid (The Nést Group, 45 Valley Rd. Southborough. MA 01772), 5 pm,

4,6 x 200 mm], který se provozuje za použití programu s lineárním gradientem při složení v rozmezí od 100 % složky A a 0 % složky B do složení 100 % složky B a 0 % složky A (45 minut), kde složkou A je 5mM H₃PO₄/20% acetonitril a složkou B je 5mM H3PO4, l,0M NaCl/20% acetonitril, přičemž detekce se provádí při 230 nm a průtoková rychlost je 1,0 ml/min. Frakce se sbírají podle časového režimu uvedeného v tabulce 3.

- 5 CZ 283548 B6

Tabulka 3

Frakce 7-6

Frakce 7-9

Frakce 7-11

Frakce 7-12

Frakce 7-13

Frakce 7-14

Frakce 7-15

Frakce 7-16

Frakce 7-17

21,9 až 22,3 minuty 24,8 až 25,5 minuty

26.1 až 26,7 minuty

27.1 až 27,6 minuty

27.6 až 28,9 minuty

29.7 až 30,8 minuty 31,0 až 32,3 minuty

32,5 až 33,1 minuty

34.2 až 36,0 minuty

Stejné frakce z různých pokusů se spojí a zkoncentrují lyofilizací.

C) Subfrakcionace frakce 8

Látka z frakce 8 ze stupně I získaná z asi 100 μΐ surového jedu se nanese na sloupec HPLC s reversními fázemi (Vydac^lR), C-18, 300 (30 nm), 10 x 250 mm), který se provozuje za použití programu s lineárním gradientem při složení v rozmezí od 80 % složky A a 20 % složky B do složení 71 % složky A a 29 % složky B (35 minut) a potom při složení 71 % složky A a 29 % složky B (10 minut), kde složkou A je 0,1% kyselina trifluoroctová a složkou B je acetonitril, přičemž detekce se provádí při 220 nm a průtoková rychlost je 6,0 ml/min. Frakce se sbírají podle časového režimu uvedeného v tabulce 4.

Tabulka 4

Frakce 8-5

Frakce 8-6

Frakce 8-7

Frakce 8-8

19.2 až 21,2 minuty

21.3 až 22,5 minuty

25,9 až 26,5 minuty

27.4 až 28,3 minuty

Stejné frakce z různých pokusů se spojí a zkoncentrují lyofilizací.

Stupeň III, subfrakcionace frakcí ze stupně II

A) Subfrakcionace frakce 7-6

Látka z frakce 7-6 ze stupně II-B získaná z asi 70 μΐ surového jedu se nanese na sloupec HPLC s reversními fázemi (Vydac^<R), C-18, 300 (30 nm), 10 x 250 mm), který se provozuje za použití programu s lineárním gradientem při složení 90 % složky A a 10 % složky B (10 minut), potom při složení v rozmezí od 90 % složky A a 10 % složky B do 60 % složky A a 40 % složky B (40 minut), kde složkou A je 0,1% kyselina trifluoroctová a složkou B je acetonitril, přičemž detekce se provádí při 220 nm a průtoková rychlost je 3,5 ml/min. Frakce se sbírají podle časového režimu uvedeného v tabulce 5.

Tabulka 5

Frakce 7-6,1

Frakce 7-6,2

32,2 až 34,3 minuty

35,5 až 36,2 minuty

Stejné frakce z různých pokusů se spojí a zkoncentrují lyofilizací.

B) Subfrakcionace frakce 7-9

-6CZ 283548 B6

Látka z frakce 7-9 ze stupně II-B získaná z asi 300 μΐ surového jedu se nanese na sloupec HPLC s reversními fázemi (Vydac^(R), C-18, 300 (30 nm), 10 x 250 mm), který se provozuje za použití programu s lineárním gradientem při složení 90 % složky A a 10 % složky B (10 minut), potom při složení v rozmezí od 90 % složky A a 10 % složky B do 65 % složky A a 35 % složky B (40 minut), kde složkou A je 0,1% kyselina trifluoroctová a složkou B je acetonitril, přičemž detekce se provádí při 220 nm a průtoková rychlost je 3,5 ml/min. Frakce 7-9.1 z různých pokusů se sebere a spojí (eluční doba v rozmezí od 33 do 35 minut).

C) Subfrakcionace frakce 7-11

Látka z frakce 7-11 ze stupně II-B získaná z asi 600 μΐ surového jedu se nanese na sloupec HPLC s reversními fázemi (Vydac^<R), C-18, 300 (30 nm), 10 x 250 mm), který se provozuje za použití programu s lineárním gradientem při složení 90 % složky A a 10 % složky B (10 minut), potom při složení v rozmezí od 90 % složky A a 10 % složky B do 65 % složky A a 35 % složky B (60 minut), kde složkou A je 0,1% kyselina trifluoroctová a složkou B je acetonitril, přičemž detekce se provádí při 220 nm a průtoková rychlost je 3,5 ml/min. Frakce 7-11.1 z různých pokusů se sebere a spojí (eluční doba v rozmezí od 34,2 do 35,5 minut).

D) Subfrakcionace frakce 7-12

Látka z frakce 7-12 ze stupně II-B získaná z asi 600 μΐ surového jedu se nanese na sloupec HPLC s reversními fázemi (Vydac^(R), C-18, 300 (30 nm), 10 x 250 mm), který se provozuje za použití programu s lineárním gradientem při složení 90 % složky A a 10 % složky B (10 minut), potom při složení v rozmezí od 90 % složky A a 10 % složky B do 65 % složky A a 35 % složky B (60 minut), kde složkou A je 0,1% kyselina trifluoroctová a složkou B je acetonitril, přičemž detekce se provádí při 220 nm a průtoková rychlost je 3,5 ml/min. Frakce se sbírají podle časového režimu uvedeného v tabulce 6.

Tabulka 6

Frakce 7-12.1

Frakce 7-12.2

28,0 až 29,1 minuty

38,4 až 39,6 minuty

E) Subfrakcionace frakce 7-13

Látka z frakce 7-13 ze stupně II-B získaná z asi 200 μΐ surového jedu se nanese na sloupec HPLC s reversními fázemi (Vydac^(R), C-18, 300 (30 nm), 10 x 250 mm), který se provozuje za použití programu s lineárním gradientem při složení 90 % složky A a 10 % složky B (10 minut), potom při složení v rozmezí od 90 % složky A a 10 % složky B do 60 % složky A a 40 % složky B (40 minut), kde složkou A je 0,1% kyselina trifluoroctová a složkou B je acetonitril, přičemž detekce se provádí při 220 nm a průtoková rychlost je 3,5 ml/min. Frakce se sbírají podle časového režimu uvedeného v tabulce 7.

Tabulka 7

Frakce 7-13.1

Frakce 7-13.2

33,0 až 34,5 minuty

35,1 až 36,5 minuty

Stejné frakce z různých pokusů se spojí a zkoncentrují lyofilizací.

-7CZ 283548 B6

F) Subfrakcionace frakce 7-15

Látka z frakce 7-15 ze stupně II-B získaná z asi 200 μΐ surového jedu se nanese na sloupec HPLC s reversními fázemi (Vydac^(R>, C-18, 300 (30 nm), 10 x 250 mm), který se provozuje za použití programu s lineárním gradientem při složení 90 % složky A a 10 % složky B (10 minut), potom při složení v rozmezí od 90 % složky A a 10 % složky B do 60 % složky A a 40 % složky B (40 minut), kde složkou A je 0,1% kyselina trifluoroctová a složkou B je acetonitril, přičemž detekce se provádí při 220 nm a průtoková rychlost je 3,5 ml/min. Frakce se sbírají podle časového režimu uvedeného v tabulce 8.

Tabulka 8

Frakce 7-15.1

Frakce 7-15.2

Frakce 7-15.3

33,1 až 33,6 minuty

34,5 až 36,2 minuty

37,7 až 39,1 minuty

Stejné frakce z různých pokusů se spojí a zkoncentrují lyofilizací.

G) Subfrakcionace frakce 7-16

Látka z frakce 7-16 ze stupně II-B získaná z asi 600 μΐ surového jedu se nanese na sloupec HPLC s reversními fázemi (Vydac^(R), C-18, 300 (30 nm), 10 x 250 mm), který se provozuje za použití programu s lineárním gradientem při složení 90 % složky A a 10 % složky B (10 minut), potom při složení v rozmezí od 90 % složky A a 10 % složky B do 65 % složky A a 35 % složky B (60 minut), kde složkou A je 0,1% kyselina trifluoroctová a složkou B je acetonitril, přičemž detekce se provádí při 220 nm a průtoková rychlost je 3,5 ml/min. Frakce 7-16.1 z různých pokusů se sebere a spojí (eluční doba v rozmezí od 31,8 do 33,8 minut).

H) Subfrakcionace frakce 7-17

Látka z frakce 7-17 ze stupně II-B získaná z asi 25 μΐ surového jedu se nanese na sloupec HPLC s reversními fázemi (Vydac^<R), C-18, 300 (30 nm), 10 x 250 mm), který se provozuje za použití programu s lineárním gradientem při složení 90 % složky A a 10 % složky B (10 minut), potom při složení v rozmezí od 90 % složky A a 10 % složky B do 60 % složky A a 40 % složky B (40 minut), kde složkou A je 0,1% kyselina trifluoroctová a složkou B je acetonitril, přičemž detekce se provádí při 220 nm a průtoková rychlost je 3,5 ml/min. Frakce se sbírají podle časového režimu uvedeného v tabulce 9.

Tabulka 9

Frakce 7-17.1

Frakce 7-17.2

Frakce 7-17.3

Frakce 7-17.4

Frakce 7-17.5

Frakce 7-17.6

15,6 až 18,4 minuty

18.5 až 19,4 minuty

27.1 až 28,6 minuty

28.6 až 30,1 minuty

30.1 až 31,9 minuty

31,9 až 33,5 minuty

Stejné frakce z různých pokusů se spojí a zkoncentrují lyofilizací.

-8CZ 283548 B6

Příklad 1

Peptid Aphonopelma 6-6

Struktura peptidu 6-6 vyrobeného ve stupni II-A se stanoví a ověří následujícími metodami. Provede se analýza aminokyselin PTC za použití 1 až 10 nmol (3 x) pomocí systému Waters Pico-Tag. N-terminální sekvenování se provede v pulsním kapalinovém sekvenátoru (ABI) jak na nativním, tak na redukovaném/pyridylethylovaném peptidu. Data hmotnostní spektrální analýzy se získají z pomocí hmotnostního spektrometru SC1-EX API III Ion Spray Mass Spectrometer.

Zjištěná data společně potvrzují strukturu peptidu 6-6, která je charakterizována dále.

SEQ ID NO:1, 39 zbytků, 6 cysteinů, 5 disulfidových vazeb

Vypočtená molekulová hmotnost - 4382,3

Nalezená molekulová hmotnost = 4382,16 ± 0,54 (hmotnostní spektrum ion spray)

Příklad 2

Peptid Aphonopelma 6-8

Struktura peptidu 6-8 vyrobeného ve stupni II-A se stanoví a ověří následujícími metodami. Provede se analýza aminokyselin PTC za použití 1 až 10 nmol (3 x) pomocí systému Waters Pico-Tag. N-terminální sekvenování se provede v pulsním kapalinovém sekvenátoru (ABI) jak na nativním, tak na redukovaném/pyridylethylovaném peptidu. Data hmotnostní spektrální analýzy se získají z pomocí hmotnostního spektrometru SC1-EX API III Ion Spray Mass Spectrometer.

Zjištěná data společně potvrzují strukturu peptidu 6-8, která je charakterizována dále.

SEQ ID NO: 2, 39 zbytků, 6 cysteinů, 3 disulfidové vazby

Vypočtená molekulová hmotnost = 4369,2

Nalezená molekulová hmotnost = 4368, 26 ± 0, 27 (hmotnostní spektrum ion spray)

Příklad 3

Peptid Aphonopelma 7-6.1

Struktura peptidu 7-6.1 vyrobeného ve stupni ΠΙ-Α se stanoví a ověří následujícími metodami. Provede se analýza aminokyselin PTC za použití 1 až 10 nmol (3 x) pomocí systému Waters Pico-Tag. N-terminální sekvenování se provede v pulsním kapalinovém sekvenátoru (ABI) jak na nativním, tak na redukovaném/pyridylethylovaném peptidu. Data hmotnostní spektrální analýzy se získají s pomocí hmotnostního spektrometru SC1-EX API III Ion Spray Mass Spectrometer.

Zjištěná data společně potvrzují strukturu peptidu 7-6.1, která je charakterizována dále.

SEQ ID NO: 3, 33 zbytků, 6 cysteinů, 3 disulfidové vazby

Vypočtená molekulová hmotnost = 3786,2

Nalezená molekulová hmotnost = 3784,54 (hmotnostní spektrum ion spray)

-9CZ 283548 B6

Příklad 4

Peptid Aphonopelma 7-13.1

Struktura peptidů 7-13.1 vyrobeného ve stupni III E se stanoví a ověří následujícími metodami. Provede se analýza aminokyselin PTC za použití 1 až 10 nmol (3 x) pomocí systému Waters Pico-Tag. N-terminální sekvenování se provede v pulsním kapalinovém sekvenátoru (ABI) jak na nativním, tak na redukovaném/pyridylethylovaném peptidů. Data hmotnostní spektrální analýzy se získají z pomocí hmotnostního spektrometru SC1-EX API III Ion Spray Mass Spectrometer.

Zjištěná data společně potvrzují strukturu peptidů 7-13.1, která je charakterizována dále.

SEQ ID NO:4, 34 zbytků, 6 cysteinů, 3 disulfidové vazby

Vypočtená molekulová hmotnost = 3814,32

Nalezená molekulová hmotnost = 3813,67 ± 0,27 (hmotnostní spektrum ion spray)

Příklad 5

Peptid Aphonopelma 7-13.2

Struktura peptidů 7-13.2 vyrobeného ve stupni III-E se stanoví a ověří následujícími metodami. Provede se analýza aminokyselin PTC za použití 1 až 10 nmol (3 x) pomocí systému Waters Pico-Tag. N-terminální sekvenování se provede v pulsním kapalinovém sekvenátoru (ABI) jak na nativním, tak na redukovaném/pyridylethylovaném peptidů. Data hmotnostní spektrální analýzy se získají z pomocí hmotnostního spektrometru SC1-EX API III Ion Spray Mass Spectrometer.

Zjištěná data společně potvrzují strukturu peptidů 7-13.2, která je charakterizována dále.

SEQ ID NO: 5, 42 zbytků, 6 cysteinů, 3 disulfidové vazby

Vypočtená molekulová hmotnost = 4844,45

Nalezená molekulová hmotnost = 4844,66 (hmotnostní spektrum ion spray)

Příklad 6

Peptid Aphonopelma 7-15.2

Struktura peptidů 7-15.2 vyrobeného ve stupni III-F se stanoví a ověří následujícími metodami. Provede se analýza aminokyselin PTC za použití 1 až 10 nmol (3 x) pomocí systému Waters Pico-Tag. N-terminální sekvenování se provede v pulsním kapalinovém sekvenátoru (ABI) jak na nativním, tak na redukovaném/pyridylethylovaném peptidů. Data hmotnostní spektrální analýzy se získají z pomocí hmotnostního spektrometru SC1-EX API III Ion Spray Mass Spectrometer.

Zjištěná data společně potvrzují strukturu peptidů 7-15.2, která je charakterizována dále.

SEQ ID NO: 6, 49 zbytků, 6 cysteinů, 3 disulfidové vazby

Vypočtená molekulová hmotnost - 4342,19

Nalezená molekulová hmotnost = 4341,84 ± 0,33 (hmotnostní spektrum ion spray)

- 10CZ 283548 B6

Příklad 7

Peptid Aphonopelma 7-17.1

Struktura peptidu 7-17.1 vyrobeného ve stupni III-H se stanoví a ověří následujícími metodami. Provede se analýza aminokyselin PTC za použití 1 až 10 nmol (3 x) pomocí systému Waters Pico-Tag. N-terminální sekvenování se provede v pulsním kapalinovém sekvenátoru (ABI) jak na nativním, tak na redukovaném/pyridylethylovaném peptidu. Data hmotnostní spektrální analýzy se získají z pomocí hmotnostního spektrometru SCI-EX API III Ion Spray Mass Spectrometer.

Zjištěná data společně potvrzují strukturu peptidu 7-17.1, která je charakterizována dále.

SEQ ID NO: 7, 39 zbytků, 6 cysteinů, 3 disulfidové vazby

Vypočtená molekulová hmotnost = 4383,28

Nalezená molekulová hmotnost = 4382,33 ± 0,52 (hmotnostní spektrum ion spray)

Příklad 8

Peptid Aphonopelma 7-17.3

Struktura peptidu 7-17.3 vyrobeného ve stupni III-H se stanoví a ověří následujícími metodami. Provede se analýza aminokyselin PTC za použití 1 až 10 nmol (3 x) pomocí systému Waters Pico-Tag. N-terminální sekvenování se provede v pulsním kapalinovém sekvenátoru (ABI) jak na nativním, tak na redukovaném/pyridylethylovaném peptidu. Data hmotnostní spektrální analýzy se získají z pomocí hmotnostního spektrometru SCI-EX API III Ion Spray Mass Spectrometer.

Zjištěná data společně potvrzují strukturu peptidu 7-17.3, která je charakterizována dále.

SEQ ID NO: 8

Nalezená molekulová hmotnost = 4368,32 ± 0,47 (hmotnostní spektrum ion spray)

Příklad 9

Peptid Aphonopelma 7-17.4

Struktura peptidu 7-17.4 vyrobeného ve stupni III-H se stanoví a ověří následujícími metodami. Provede se analýza aminokyselin PTC za použití 1 až 10 nmol (3 x) pomocí systému Waters Pico-Tag. N-terminální sekvenování se provede v pulsním kapalinovém sekvenátoru (ABI) jak na nativním, tak na redukovaném/pyridylethylovaném peptidu. Data hmotnostní spektrální analýzy se získají z pomocí hmotnostního spektrometru SCI-EX API III Ion Spray Mass Spectrometer.

Zjištěná data společně potvrzují strukturu peptidu 7-17.4, která je charakterizována dále.

SEQ ID NO: 9, 39 zbytků, 6 cysteinů, 3 disulfidové vazby

Vypočtená molekulová hmotnost = 4383,23

Nalezená molekulová hmotnost = 4382,19 ± 0,38 (hmotnostní spektrum ion spray)

- 11 CZ 283548 B6

Záznam o sekvencích (1) Obecné informace (i) PŘIHLAŠOVATEL (A) JMÉNO: Pfizer lne.

(B) ULICE: 235 East 42nd Street (C) MĚSTO: New York (D) STÁT: New York (E) ZEMĚ: USA (F) POŠTOVNÍ SMĚROVACÍ ČÍSLO (ZIP) : 10017 (G) TELEFON: (203) 441-4905 (H) TELEFAX: (203) 441-5221 (A) JMÉNO: NPS Pharmaceuticals, lne.

(B) ULICE: 420 Chipeta Way (C) MĚSTO: Salt Lake City (D) STÁT: Utah (E) ZEMĚ: USA (F) POŠTOVNÍ SMĚROVACÍ ČÍSLO (ZIP) .84108 (G) TELEFON: (801) 583-4939 (H) TELEFAX: (801) 583-4961 (ii) NÁZEV VYNÁLEZU: Polypeptidy z Theraphosidae aphonopelma blokující vápníkové kanálky (iii) POČET SEKVENCÍ: 9 (iv) STROJNĚ ČITELNÁ FORMA:

(A) TYP NOSIČE: floppy disk (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, verze# 1.25 (EPO) (ví) DATA O DŘÍVĚJŠÍ PŘIHLÁŠCE:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: US 07/973, 323 (B) DATUM PODÁNÍ: 3. listopadu 1992 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETÉZOVOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne

- 12 CZ 283548 B6 (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Theraphosidae aphonopelma (F)TYP TKÁNĚ: jed (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ IDNO:l:

Leu Phe Glu Cys Val Leu Ser Cys Asp Ile Lys Lys Asn Gly Lys Pro

5 10

Cys Lys Pro Lys Gly Glu Lys Lys Cys Ser Gly Gly Trp Arg Cys Lys

25 30

Ile Asn Phe Cys Leu Lys Val (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETÉZOVOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Theraphosidae aphonopelma (F) TYP TKÁNĚ: jed (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 2:

Leu Phe Glu Cys Ala Leu Ser Cys Asp Ile Lys Lys Asn Gly Lys Pro

10 15

Cys Lys Pro Lys Gly Glu Lys Lys Cys Ser Gly Gly Trp Arg Cys Lys

25 30

Ile Asn Phe Cys Leu Lys Ile (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 3 :

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 33 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETÉZOVOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid

- 13 CZ 283548 B6 (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Theraphosidae aphonopelma (F) TYP TKÁNĚ: jed (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 3 :

Cys Ala Glu Phe Gin Ser Lys Cys Lys Lys Asp Ser Glu Cys Cys Gly 15 10 15

Thr Leu Glu Cys Ser Pro Thr Trp Lys Trp Cys Val Tyr Pro Ser Pro 20 25 30

Phe (2) INFORMACE O SEQ ID NO:4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 34 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZOVOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Theraphosidae aphonopelma (F) TYP TKÁNĚ: jed (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:4:

Ser Cys Gly His Val Gly Thr Pro Cys Glu Lys Asn Trp Asp Cys Cys 15 10 15

Lys Gly Lys Val Cys Ser Pro Arg Trp Lys Leu Cys Ala Tyr Glu Ser 20 25 30

Pro Phe (2) INFORMACE O SEQ ID NO: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 42 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETĚZOVOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne

- 14 CZ 283548 B6 (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Theraphosidae aphonopelma (F) TYP TKÁNĚ: jed (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:5:

Cys Leu Gly Glu Asn Val Pro Cys Asp Lys Asp Arg Pro Asn Cys Cys 15 1015

Ser Lys Tyr Glu Cys Leu Glu Pro Thr Gly Tyr Gly Arg Cys Tyr Ala

2530

Ser Tyr Tyr Ser Tyr Lys Lys Lys Thr Leu

3540 (2) INFORMACE O SEQ ID NO:6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETÉZOVOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Theraphosidae aphonopelma (F)TYP TKÁNĚ: jed (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:6 :

Leu Ile Glu Cys Ala Phe Ser Cys Asp Ile Thr Lys Asn Gly Lys Pro 15 10 15

Cys Lys Pro Lys Gly Glu Lys Lys Cys Ser Gly Gly Trp Arg Cys Lys 20 25 30

Ile Asn Phe Cys Leu Lys Ile (2) INFORMACE O SEQ ID NO:7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 39 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETÉZOVOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární

- 15 CZ 283548 B6 (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Theraphosidae aphonopelma (F) TYP TKÁNĚ: jed (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO: 7 :

Leu Phe Glu Cys Val Leu Ser Cys Asp Ile Lys Lys Asn Gly Lys Pro 15 10 15

Cys Lys Pro Lys Gly Glu Lys Lys Cys Ser Gly Gly Trp Arg Cys Lys

25 30

Ile Asn Phe Cys Leu Lys Val (2) INFORMACE O SEQ ID NO:8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 35 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETÉZOVOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Theraphosidae aphonopelma (F) TYP TKÁNĚ: jed (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:8:

Leu Phe Glu Cys Ala Leu Ser Cys Asp Ile Lys Lys Asn Gly Lys Pro 15 10 15

Cys Lys Pro Xaa Gly Glu Lys Lys Cys Ser Gly Gly Xaa Arg Xaa Xaa

25 30

Ile Asn Phe (2) INFORMACE O SEQ ID NO:9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

- 16 CZ 283548 B6 (A) DÉLKA: 39 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) ŘETÉZOVOST: jednoduchá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) KÓDUJÍCÍ: ne (vi) PŮVODNÍ ZDROJ:

(A) ORGANISMUS: Theraphosidae aphonopelma (F)TYP TKÁNĚ: jed (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID NO:9:

Leu Phe Glu Cys Val Leu Ser Cys Asp Ile Lys Lys Asn Gly Lys Pro

10 15

Cys Lys Pro Lys Gly Glu Lys Lys Cys Ser Gly Gly Trp Arg Cys Lys

25 30

Ile Asn Phe Cys Leu Lys Val

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   Polypeptidy se sekvencí aminokyselin odpovídající SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:
2. 2, SEQ ID NO:
3. 3, SEQ ID NO:
4. 4, SEQ ID NO:
5. 5, SEQ ID NO: 6 nebo SEQ ID NO:8 ajejich farmaceuticky vhodné soli.