ES2263225T3 - Generacion rapida de lineas celulares estables de mamifero que producen niveles elevados de proteinas recombinantes. - Google Patents
Generacion rapida de lineas celulares estables de mamifero que producen niveles elevados de proteinas recombinantes.Info
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Abstract
Secuencia de ADN recombinante que comprende la secuencia de ADN de pHTop según la SEC ID nº 1.
Description
Generación rápida de líneas celulares estables
de mamíferos que producen niveles elevados de proteínas
recombinantes.
La presente invención se refiere a un nuevo
procedimiento para generar líneas celulares estables de mamífero
que producen niveles elevados de proteínas recombinantes, y a las
líneas celulares y vectores adecuados para la utilización en dicho
procedimiento.
Las líneas celulares de mamífero, tales como las
líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO), se utilizan
frecuentemente para la producción de proteínas recombinantes. En
tales procedimientos, es deseable generar líneas celulares estables
y generar dichas líneas celulares estables de elevada productividad
en un período de tiempo relativamente corto. La generación de tales
líneas celulares permite producir cantidades de proteína
recombinante rápidamente a una escala útil para su evaluación
biológica y para la producción comercial.
La presente invención se refiere a nuevos
vectores para la expresión en mamíferos que permiten establecer en
un período de tiempo relativamente corto, preferiblemente tan corto
como aproximadamente 4 semanas, líneas celulares estables de
mamífero que producen niveles elevados de proteínas recombinantes
segregadas y unidas a la membrana. En una forma de realización
preferida de la presente invención, las líneas celulares de mamífero
son de ovario de hámster chino (CHO).
En una forma de realización, la presente
invención comprende secuencias de ADN recombinante y plásmidos de
expresión génica útiles para la generación de líneas celulares
estables. Las formas de realización preferidas comprenden
secuencias de ADN recombinante de los plásmidos de expresión génica
pHTop o pHTop6. En otras formas de realización, la presente
invención comprende un sistema de expresión de ADN recombinante que
comprenden un gen que codifica un factor de transcripción quimérico
[tTA], tTA que puede comprender la fusión de una proteína de E.
coli represor de tetraciclina [tet R] con un dominio
activador de la transcripción del virus del herpes simplex 16
(VP16); y un vector que comprende un promotor mínimo precedido de
múltiples secuencias del operador tet (tet O).
La transfección del vector pHTop en la línea
celular CHO/A2 conduce a una expresión muy eficiente del gen
clonado en él, así como también del DHFR presente en el mismo
mensaje policistrónico. Utilizando un protocolo MTX de selección
restrictivo, en un mes se pueden aislar y expandir clones de elevada
expresión. Para cinco genes ensayados, los niveles de expresión son
superiores a los niveles de expresión transitoria en células COS.
Los niveles de expresión se pueden amplificar creciendo las células
en concentraciones crecientes de MTX. Se ha demostrado que la
estabilidad de la expresión se puede mantener durante por lo menos
tres semanas sin selección.
El nivel de expresión conseguido mediante un
protocolo de selección de una etapa oscila de un gen a otro. Se han
observado niveles de proteína secretada comprendidos entre 1 y 14
\mug/ml. La selección MTX restrictiva generalmente produce clones
que expresan niveles uniformes de proteína, lo que elimina la
necesidad de seleccionar grandes cantidades de clones. Utilizando
el vector pHTop se pueden expresar a un nivel elevado tanto las
proteínas segregadas como las unidas a la membrana.
El protocolo optimizado destinado a establecer
líneas celulares CHO estables descrito en la presente invención se
puede utilizar como una alternativa a las transfecciones de COS a
gran escala. Las células CHO crecen bien en medio libre de suero y
se puede generar fácilmente un medio condicionado para la
purificación de nuevas proteínas, por ejemplo, dicho protocolo
puede acelerar la generación de líneas celulares estables en busca
de una función.
La Figura 1 es un diagrama del sistema de
expresión regulable caracterizado por Gossen y Bujard, Proc. Nat.
Acad. Sci, 89(12):5547-5551 (1992). Este
sistema de expresión se basa en dos elementos: un factor de
transcripción quimérico (tTA), que consiste en la fusión entre el
represor de tetraciclina de E. coli (tetR) y el dominio de
transcripción del virus del herpes simplex 16 (VP16); y un vector en
el que un promotor mínimo que proporciona una secuencia TATA se
encuentra precedido por múltiples secuencias del operador tet
(tetO). Cuando se expresa el transactivador quimérico, su dominio
tetR se une a la secuencia tetO. Ello a su vez, acerca el fuerte
dominio activador VP16 al complejo basal de transcripción y lo
activa. Tal interacción se puede invertir mediante la acción de la
tetraciclina que puede, por consiguiente, ser utilizada como
interruptor para "apagar" la transcripción. En ausencia de
tetraciclina la expresión está "activada".
La Figura 2a es un diagrama que muestra el
complejo de iniciación basal con el promotor mínimo en el sistema
de expresión. La Figura 2b muestra el compuesto de iniciación
activado.
La Figura 3 es un diagrama del plásmido pED6.
PED6 es un plásmido de 5354 pares de bases, que contiene una unión
entre las secuencias guía de EMC y las de DHFR.
La Figura 4 es un diagrama de plásmido que
muestra la construcción de un plásmido de expresión de AdMLP mínimo
[pED6min]. El origen y el amplificador del SV40, así como también el
promotor principal tardío del Adenovirus, hasta 8 pares de bases de
la secuencia TATA han sido extraídos del pED6, una deleción de 575
pares de bases. Se insertó un lugar único XhoI con el fin de
permitir la inserción de tetO.
La Figura 5 es un diagrama que muestra la
construcción de pHTop6 a partir de pED6. Siguiendo la construcción
de pED6min, se ligan 6 secuencias tetO en el lugar XhoI con el fin
de formar pTOP6. A continuación se insertan las secuencias poli A
de HBV corriente arriba de las secuencias tetO.
La Figura 6 es un diagrama del plásmido pHTop.
pHTop es un plásmido de 5639 bp en el que la guía de EMC/unión DHFR
en pHTop6 se modifica para inutilizar la translación de DHFR sin
afectar el nivel de expresión del gen corriente arriba. Ello
permite el mantenimiento de la selección restrictiva sin tener que
utilizar niveles elevados de metotrexato [MTX].
La Figura 7 es un diagrama del plásmido pZtTA.
pZtTA es un plásmido de 6.420 bp que se utiliza para construir una
línea celular CHO transactivadora. Con el fin de construir dicha
línea celular, pZtTA se "electropora" (se introduce por
electroporación) en las células CHO. Después de la electroporación,
se seleccionan 24 clones en presencia de 1 \mug/ml de G418. Los
24 clones se transfectan transitoriamente con pTOP6 que contiene el
gen CAT (pTOP6CAT) para la selección. Los clones transfectados se
ensayan para determinar la actividad CAT. El nivel de actividad se
compara al obtenido mediante la transfección con pTOP6CAT y pEDtTA
en células CHO.
La Figura 8 es un diagrama que muestra la
generación de una línea celular CHO que expresa tTA, CHO/A2, tal
como se describe en la descripción de la Figura 7 anterior.
La Figura 9 es una gráfica que muestra la
expresión transitoria del gen reportero de fosfatasa alcalina
secretada (SEAP) en dos líneas celulares, pEDSEAP y pHTopSEAP. La
expresión de SEAP se monitoriza utilizando un ensayo
quimioluminiscente muy sensible. Se lipofectaron 0,05, 0,1 y 0,2
\mug de pEDSEAP y de pHTopSEAP en la línea celular CHO/A2. La
actividad SEAP se determinó en cuentas por segundo [CPS], que son
proporcionales a la actividad de SEAP dentro del rango mostrado en
la gráfica. En los experimentos de transfección transitoria
mostrados en la Figura 9, se demuestra que el promotor regulable
por tet es aproximadamente 5 veces más fuerte que el promotor
tardío principal de adenovirus.
La Figura 10 es una gráfica que muestra la
expresión transitoria de SEAP en células transfectadas mediante el
adenovirus con pED6SEAP y pHTop6SEAP y pHTop6SEAP en presencia de
Doxiciclina, un análogo de la tetraciclina. De nuevo, se demuestra
que la expresión de SEAP es aproximadamente 5 veces más fuerte bajo
la regulación por pHTop6 que bajo la regulación por pED6. Además
DOX inhibe completamente la expresión de ADN por el promotor
tet.
La Figura 11 es una gráfica que compara los
niveles de expresión estable de SEAP en líneas celulares CHO/A2
transfectadas con pED6SEAP y pHTop6SEAP. Se cosecharon clones a la
concentración más elevada posible de MTX para cada vector
[0,1 \muM MTX para CHO/ED6SEAP; 0,5 \muM MTX para
CHOA2/HTOP6SEAP]. El nivel de expresión observado a la
concentración de MTX fue aproximadamente 30 veces superior a la
observada en los clones cosechados en alfa [sin MTX]. El nivel de
expresión en pHTopSEAP es aproximadamente 3 veces superior que en
pED6SEAP. El nivel de expresión en tales clones es muy elevado para
líneas celulares CHO, tan elevado como el obtenido con
transfecciones transitorias de COS-1.
La Figura 12 es un diagrama de un protocolo
optimizado para la selección en una etapa de líneas celulares CHO
utilizando el vector pHTop y la línea transactivadora CHO/A2.
La Figura 13 es un análisis por transferencia
Western de células CHO que expresan de modo estable
hGDF-9, que se establecieron mediante transfección
utilizando el vector pHTop. A las 48 después de la transfección,
las células se sembraron en placas con objeto de formar colonias en
0,02 y 0,1 \muM de MTX. Una vez transcurridas dos semanas, los
clones se recogieron de cada concentración de MTX. Las células
crecieron hasta confluencia y se cosechó el medio condicionado de
24 horas libre de suero para el análisis por transferencia Western
utilizando un anticuerpo policlonal a GDF-9 seguido
de detección por quimioluminiscencia.
Los clones seleccionados en 0,1 \muM MTX
(carriles 11 a 16) expresaron niveles de GDF-9 más
elevados en comparación con los clones seleccionados en 0,02 \muM
MTX (carriles 1 a 10). Los clones seleccionados a las
concentraciones de MTX inferiores mostraron un rango de expresión
amplio. Sin embargo los niveles de expresión de
GDF-9 fueron muy uniformes para los clones
seleccionados con 0,1 \muM MTX. Por consiguiente, la selección
restrictiva mediante el incremento de la concentración de
metotrexato genera clones que expresan uniformemente niveles
elevados de proteína.
La Figura 14 es una gráfica que demuestra que el
nivel de expresión obtenido mediante una etapa de selección oscila
entre genes diferentes. Las células CHO que expresan de modo estable
formas secretadas de mCD28, mB7,2 o mCTLA4 (todas como proteínas de
fusión con mIG2a) se establecieron utilizando el vector pHTop. Los
clones se seleccionaron en 0,05 \muM MTX, crecieron hasta
confluencia y a las 24 horas se cosechó el medio condicionado libre
de suero para realizar análisis por ELISA de mIgG2a. Para los tres
genes expresados, los clones mCTLA4 produjeron los niveles más
elevados de proteína [13 \mug/ml] seguidos de mCD28 [8 \mug/ml]
y mB7.2 [3 \mug/ml].
La Figura 15 es un análisis por transferencia
Western que muestra una comparación de sistemas de expresión
mamíferos. Los carriles 1 a 9 muestran el efecto de la amplificación
por etapas de células CHO transformadas de modo estable con
pEDBMP-2. Los carriles 10 a 16 muestran el efecto de
una etapa de selección de las células CHO trasfectadas de modo
estable con pHTopBMP-2. Los carriles 17 y 18
muestran la transfección transitoria de células COS con
pEDBMP-2 y una transfección simulada.
La Figura 16 muestra los vectores de dos
vectores de transfección eficientes. pED utiliza el promotor
principal tardío del adenovirus [AdMLP] para la iniciación de la
transcripción. Contiene el origen de replicación del virus SV40
para la expresión transitoria en células COS. Un intrón híbrido está
seguido de lugares de clonaje únicos para la inserción de ADNc. Un
lugar de iniciación ribosómico interno (la guía EMCV) que precede al
marcador seleccionable, DHFR, permite que el marcador se pueda
traducir independientemente a partir de un mensaje policistrónico
único. Para generar el vector pHTop, se modificó el vector pED de
modo que se eliminaron todos los elementos promotores
amplificadores de SV40 y AdMLP dejando solamente la secuencia TATA y
35 pares de bases corriente arriba del lugar de inicio de la
transcripción [pEDmin]. En su lugar se insertaron 6 repeticiones de
la secuencia del operador tet. Dicho vector [pTOP] está ahora
controlado únicamente mediante el transactivador [tTA] a través de
la interacción entre el represor tet y el operador tet y se puede
utilizar tetraciclina para encender y apagar la transcripción.
Además, se insertó el lugar de poliadenilación de la hepatitis
corriente arriba de la secuencia del operador tet para evitar la
posible interferencia por promotores crípticos presentes en el
esqueleto del plásmido.
Los vectores de la presente invención utilizan
elementos transcripcionales fuertes activados mediante una
construcción transactivadora quimérica que se expresa establemente
en una línea celular de mamífero receptora. En una forma de
realización preferida, los elementos transcripcionales fuertes
comprenden copias múltiples del operador tet localizado corriente
arriba y adyacente a una secuencia "TATA" mínima de mamífero.
Tal quimera constituye un promotor mamífero potente. En otra forma
de realización preferida, dicho promotor potente dirige la síntesis
de un mensaje policistrónico, en el que la expresión de un marcador
de resistencia, tal como el gen de resistencia al deshidrofolato
[DHFR], está ligada a la expresión del gen de interés, permitiendo
la selección de clones de expresión elevada en un proceso de
selección de una etapa. En una forma de realización preferida, se
puede utilizar una fracción de secuencia guía, tal como la secuencia
guía del virus EMC [EMCV], para una operación eficiente de dicho
mensaje policistrónico. La secuencia guía de EMCV se puede obtener,
por ejemplo, de pMT2-ECAT1 [S.K. Jung, et
al., J. Virol. 63:1651-1660 (1989)]. La
utilización combinada de dicho promotor quimérico potente, que
genera un mensaje policistrónico, con un marcador de resistencia, en
una célula huésped que expresa el transactivador quimérico, permite
la selección rápida de líneas celulares que producen niveles
elevados de proteína recombinante en una sola etapa.
Se han obtenido niveles de proteína secretada de
hasta 50 \mug/ml utilizando dicho procedimiento de selección de
una etapa. Los clones seleccionados restrictivamente a un nivel
elevado de metotrexato [MTX] producen niveles uniformes de
proteína, eliminando la necesidad de seleccionar un gran número de
clones. Aunque el nivel de producción obtenido en la etapa de
selección inicial es diferente para cada gen, los niveles se pueden
amplificar mediante el incremento de la concentración de MTX.
Además, los niveles de producción son estables en presencia de
selección o por lo menos durante 3 semanas después de eliminar la
presión de selección.
El sistema actual tiene la ventaja de
desarrollar líneas celulares estables mucho más rápidamente de lo
que antes era posible utilizando el procedimiento habitual de
amplificación por etapas [aproximadamente 1 mes en comparación con
4 meses]. Además, se pueden obtener niveles de producción más
elevados con este sistema en comparación con la expresión
transitoria en células COS. En consecuencia, la presente invención
proporciona procedimientos para el desarrollo de líneas celulares
estables de elevado nivel de expresión con rapidez y facilidad,
supliendo la antigua necesidad de tales sistemas comprendidos entre
los de expresión transitoria en células COS [rápidos pero muy
laboriosos para la producción de grandes cantidades de proteínas] y
los de expresión estable mediante la amplificación por etapas
[lentos y laboriosos].
El sistema de expresión se basa en la
utilización combinada de dos elementos: un factor de transcripción
quimérico [tTA], que resulta de la fusión entre el represor de
tetraciclina [tet R] de E. coli y el dominio de transcripción
del virus del herpes simplex 16 (VP16) y un vector en el que un
promotor mínimo proporciona la secuencia TATA precedida de
múltiples secuencias del operador tet [tet O]. Tales operadores
acercan el fuerte dominio de activación de VP16 al complejo de
transcripción basal, activándolo. Tal interacción se puede invertir
mediante la utilización de tetraciclina, que puede en consecuencia
utilizarse como un interruptor para apagar la transcripción.
En ausencia de tetraciclina, la expresión está
"encendida". Sin embargo, el procedimiento presente no necesita
que se utilice la regulación. Por consiguiente, en una forma de
realización, la presente invención comprende un plásmido en el que
un promotor mínimo está funcionalmente unido a una secuencia guía
que a su vez está funcionalmente unida a un gen de DHFR. Corriente
arriba de la secuencia guía existe uno o más lugares de restricción
adecuados para la inserción de la secuencia de un gen que codifica
la proteína deseada para su expresión. En una forma de realización
preferida, se utiliza el plásmido pHTop6, que se genera a partir del
plásmido pED tal como se describe más adelante en la presente
memoria. El plásmido pHTop también es de utilidad en la presente
invención. En pHTop, la unión entre la guía EMCV y el gen DHFR se
modificó para impedir la traducción de DHFR sin afectar el nivel de
expresión del gen corriente arriba. Para la producción de proteínas
grandes, para las que se pueden esperar niveles bajos de expresión
de DHFR, el vector pHTop6 puede ser preferible. Los procedimientos
de la presente invención son de utilidad para la producción de
proteínas tanto de membrana como secretadas. Los procedimientos de
la presente invención se pueden utilizar como una alternativa a la
transfección a gran escala de células COS. En una forma de
realización preferida en la que se utilizan células CHO, las
células pueden crecer en medio libre de suero, para la purificación
de las
proteínas.
proteínas.
Una línea celular transactivadora de utilidad
como línea celular de mamífero receptora se puede derivar mediante
la transfección de un factor de transcripción quimérico, tal como el
tTA descrito anteriormente, en la línea celular adecuada, tal como
la línea celular CHO. En una forma de realización preferida, se
utiliza la línea celular CHO, CHO DUKX B11, que es deficiente en
DHFR y por consiguiente no es normalmente capaz de sobrevivir en
presencia de selección por metotrexato. En las Figuras 10 y 11 se
muestra un diagrama de dicho procedimiento.
Se genera el plásmido pHTop-X,
en el que X es la secuencia codificarte para la proteína que se debe
expresar, y luego se transfecta en la línea celular transactivadora
y se selecciona tal como se ilustra en la Figura 15. Por
consiguiente, en una forma de realización, la presente invención
comprende secuencias de ADN recombinante que comprenden la
secuencia de ADN de pHTop o pHTop6. En otras formas de realización,
la presente invención comprende procedimientos para la generación
de una línea celular recombinante estable de mamífero, comprendiendo
dicho procedimiento: (1) transfectar una línea celular receptora de
mamífero con un vector plasmídico para generar una línea celular
receptora transfectada de mamífero, comprendiendo dicho vector
plasmídico: (a) un promotor mínimo precedido de múltiples
operadores tet; (b) una secuencia guía capaz de dirigir la expresión
eficiente de un mensaje policistrónico; y (c) un mensaje
policistrónico que comprende una primera secuencia de ADN que
codifica una proteína de interés y una segunda secuencia de ADN que
codifica un gen marcador seleccionable, y dicha línea celular
receptora de mamífero que comprende (1) un factor de transcripción
quimérico, que comprende la fusión de una o más copias del represor
de tetraciclina de E. coli; (2) un dominio de transcripción
del virus herpes simplex 16; y (3) un vector que comprende un
promotor mínimo precedido de múltiples secuencias del operador tet;
y (B) aislar dicha línea celular receptora transfectada de mamífero.
Opcionalmente, la línea celular transfectada se puede cultivar para
utilización posterior.
Los ejemplos siguientes describen algunas de las
formas de realización preferidas de la presente invención.
- A.
- En la amplificación por etapas se observó lo siguiente. Se transfectaron de modo estable células CHO DUKX con pEDBMP-2. Las células se sembraron para la formación de colonias en medio alfa 48 horas post transfección. Después de 2 semanas, se recogieron los clones, crecieron en 0,02 \muM MTX hasta que se estabilizaron (4 semanas) y a continuación transfirieron a 0,1 \muM MTX y se crecieron durante 4 semanas. Se cosechó el medio condicionado libre de suero (24 h) de las células confluentes para análisis por transferencia Western.
- B.
- En la presente selección de una etapa, se transfectaron de modo estable células CHO DUKX/A2 con pHTopMBP-2. A las 48 h post transfección, las células se sembraron para la formación de colonias en medio con 0,1 \muM MTX y 1 mg/ml G418. Dos semanas más tarde, se recogieron los clones, crecieron hasta confluencia y se cosechó el medio condicionado libre de suero para análisis por transferencia Western.
- C.
- Se lograron las transfecciones estables en COS utilizando células COS-1 transfectadas de forma transitoria con pEDBMP-2. A las 48 a 72 horas post transfección, se cosechó medio condicionado libre de suero para análisis por transferencia Western.
Se analizó medio condicionado 10:1 de los
protocolos A, B, C anteriores en un gel de PAGE-SDS
del 16% en condiciones reductoras y se transfirió a nitrocelulosa
por transferencia Western. Se detectó BMP-2 mediante
un anticuerpo policlonal específico a BMP-2 seguido
de detección por quimioluminiscencia.
Los clones establecidos mediante la
amplificación por etapas utilizando el vector pED mostraron un
amplio rango de expresión de BMP-2. Por el
contrario, los clones recogidos de la selección por una etapa
utilizando el vector pHTop mostraron una expresión más elevada
uniforme de BMP-2. El nivel de BMP-2
expresado transitoriamente en el carril de las células COS fue muy
inferior al observado para los clones pHTop.
Las líneas celulares CHO estables establecidas
utilizando la selección en una etapa mostraron niveles de expresión
consistentemente más elevados en comparación con las CHO
seleccionadas por etapas o las COS transitorias. Además, los
niveles de expresión alcanzados con la selección en una etapa fueron
más uniformes. Se establecieron líneas celulares CHO que expresan
de modo estable una forma secretada de la proteína de fusión
mB7.1-mlgG2a mediante la utilización del vector
pHTop. Los clones seleccionados en 0,1 \muM MTX se pasaron dos
veces a la semana en presencia o ausencia de selección (MTX y G418)
durante 3 semanas. Se cosechó medio condicionado libre de suero (24
h) de las células confluentes a 1, 2 y 3 semanas y se analizó
mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo
anti-mlgG2a HRP seguido de detección de
quimioluminiscencia. Los niveles de expresión permanecieron
constantes durante por lo menos 3 semanas sin selección de las
células seleccionadas a una concentración elevada de
metotrexato.
Las células CHO que expresan de modo estable una
forma secretada de la proteína de fusión hCD28-hlgG4
se establecieron mediante transfección utilizando el vector pHTop.
Los clones se seleccionaron en 0,1 \muM MTX, a continuación
crecieron en 0,5 \muMMTX durante 3 semanas. Se analizó medio
condicionado libre de suero (24h) de las células confluyentes
mediante transferencia Western utilizando un anticuerpo
anti-hlgG-HRP seguido de la
detección de quimioluminiscencia. Cada carril representa medio
condicionado 10:1 o proteína hlgG4 purificada para cuantificación.
Los niveles de expresión para el medio condicionado de los tres
clones más expresados (2, 3, 5) se midieron mediante ELISA de
hlgG4.
Los clones seleccionados en 0,1 \muM MTX
expresan aproximadamente entre 1 y 2 \mug/ml de hCD28/hlgg4
mostraron un incremento significativo (5 a 10 veces) en la
expresión de hCD28 mientras que 2 clones (números 1 y 40) mostraron
un incremento de expresión moderado. Los niveles de expresión de las
células seleccionadas en concentraciones elevadas de metotrexato se
pueden amplificar mediante el incremento de la concentración de
metotrexato.
Se seleccionaron líneas celulares CHO mediante
transfección con pHTopmuFrzb-1 (Frazzled murino) y
seleccionando los clones en 0,05 \muM MTX. También se
establecieron dos grupos de clones que sobrevivieron en 0,1 \muM
MTX. Las células se marcaron durante 6 horas con
^{35}S-metionina/cisteína y el medio condicionado
libre de suero fue cosechado y analizado mediante
SDS-PAGE. Cada carril representa 50 \mul de medio
condicionado de los clones y grupos. La expresión de los clones
individuales seleccionados en 0,05 \muM MTX fue uniforme y la
expresión de los 2 grupos fue tan elevada como la de los clones
individuales.
Debido a la uniformidad de la expresión de los
clones individuales bajo condiciones de selección restrictiva, es
posible agrupar colonias sin comprometer la expresión, por
consiguiente acelerando las últimas etapas de la generación de
líneas celulares estables.
Se establecieron líneas celulares CHO que
expresan CCR5 de modo estable mediante transfección con el vector
pHTop. Los clones seleccionados en 0,02 \muM MTX se analizaron
para determinar la expresión de CCR5 mediante análisis por FACS.
Las células transfectadas se tiñeron utilizando un anticuerpo
monoclonal antiCCR5 (clon 45531.111 de R&D) o un isotipo de
IgG2a murina para las células control no transfectadas seguido de un
anticuerpo antiIgG murina conjugado a PE. De los 13 clones
seleccionados por expresión de CCR5, 11 clones expresaron CCR5 y
demostraron un incremento de la fluorescencia de 2 log sobre las
células control no transfectadas. Solamente 2 clones no mostraron
expresión de CCR5 por encima del fondo.
El sistema de selección de una etapa también se
puede utilizar para expresar proteínas transmembranales.
Los ejemplos y figuras en las páginas siguientes
ilustran la práctica de la presente invención con el fin de generar
líneas celulares de mamífero que producen niveles elevados de
proteínas recombinantes, utilizando líneas celulares y vectores que
forman parte de la presente invención, que son adecuados para la
utilización en dicho procedimiento. En los ejemplos, se demuestra
que la presente invención es efectiva para la producción eficiente
de proteínas recombinantes. Un gran número de modificaciones y
variaciones resultarán evidentes para los expertos en la materia al
leer la memoria y los ejemplos.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Solicitante: Genetics Institute, INC.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- Título de la invención: GENERACIÓN RÁPIDA DE LÍNEAS CELULARES ESTABLES DE MAMÍFERO QUE PRODUCEN DE NIVELES ELEVADOS DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- Número de secuencias: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- Dirección de correspondencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Destinarario: Genetics Institute, INC.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Calle: 87 Cambridgepark Drive
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Ciudad: Cambridge
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Estado: Massachussets
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- País: U.S.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- Código postal: 02140
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- Forma legible por ordenador:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Tipo de medio: disco flopy
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Ordenador: PC compatible con IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Sistema operativo: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Software: PatentIn Publicación: nº 1.0. Versión nº 1.30
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- Datos de la solicitud actual:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Número de la solicitud: US XXXX
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Fecha de la solicitud:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Clasificación:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- Información del abogado/agente:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Nombre: Lazar, Steven R.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Número de Registro: 32.618
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Numero de Referencia/Certificado: GI5310A-PCT
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- Información de telecomunicaciones:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Teléfono: (617) 498-8260
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Telefax: (617) 876-5851
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SECUENCIA ID NO:
1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- Características de la secuencia:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- Longitud: 5639 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- Tipo: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- Tipo de cadena: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- Topología: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\newpage
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (3)
1. Secuencia de ADN recombinante que
comprende la secuencia de ADN de pHTop según la SEC ID nº 1.
2. Sistema de expresión de ADN recombinante
que comprende:
- (a)
- un factor de transcripción quimérico, factor de transcripción quimérico que comprende una fusión de un represor de tetraciclina de E. coli con el dominio de activación transcripcional del virus herpes simplex 16; y
- (b)
- un vector que comprende un promotor mínimo precedido de una pluralidad de secuencias del operador tet y un mensaje policistrónico que comprende un primer ADN que codifica una proteína de interés y una segunda secuencia de ADN que codifica un gen marcador seleccionable.
3. Procedimiento destinado a la producción de
una línea celular recombinante estable de mamífero, comprendiendo
dicho procedimiento:
- (A)
- transfectar una línea celular receptora de mamífero con un vector de plásmido para formar una línea celular receptora de mamífero transfectada,
- (1)
- comprendiendo dicho vector de plásmido:
- (a)
- un promotor mínimo precedido de múltiples operadores tet;
- (b)
- una secuencia guía capaz de dirigir la expresión eficiente de un mensaje policistrónico; y
- (c)
- un mensaje policistrónico que comprende un primer ADN que codifica una proteína de interés y una segunda secuencia de ADN que codifica un gen marcador seleccionable;
- (2)
- comprendiendo dicha línea celular receptora de mamífero un factor de transcripción quimérico que comprende una fusión de un represor de tetraciclina de E. coli y un dominio de activación transcripcional del virus herpes simplex 16; y
- (B)
- aislar y opcionalmente cultivar dicha línea celular receptora de mamífero transfectada.
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---|---|---|---|
US6344997P | 1997-10-29 | 1997-10-29 | |
US63449P | 1997-10-29 | ||
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US175690 | 1998-10-20 |
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