ES2262179T3

ES2262179T3 - Vacuna basada en un plasmido para el tratamiento de la aterosclerosis.

Info

Publication number: ES2262179T3
Application number: ES97924549T
Authority: ES
Inventors: Lawrence J. Thomas
Original assignee: Avant Immunotherapeutics Inc
Current assignee: Celldex Therapeutics Inc
Priority date: 1996-05-01
Filing date: 1997-05-01
Publication date: 2006-11-16
Anticipated expiration: 2017-05-01
Also published as: EP0914427B1; EP0914427A1; DE69735591T2; AU721729B2; JP2001508760A; ATE321559T1; DE69735591D1; AU2994697A; WO1997041227A1; CA2250428A1

Abstract

SE PROPORCIONA UNA VACUNA A BASE DE PLASMIDIO, QUE SE APOYA EN LA COMBINACION DE SEGMENTOS DE ADN QUE CODIFICAN UNO O MAS EPITOPES DE LAS CELULAS B DEL CETP Y UNO O MAS EPITOPES DE LAS CELULAS T POSITIVAS DE AMPLIO ESPECTRO. LA ADMINISTRACION DE LOS PLASMIDIOS COMO VACUNA A UN SUJETO VERTEBRADO PROPORCIONA UNA RESPUESTA INMUNE AL CETP ENDOGENO DEL SUJETO Y UNA MODULACION DE LA ACTIVIDAD DEL CETP, PERMITIENDO LA PREVENCION O DESAPARICION DE VARIAS MANIFESTACIONES DE ENFERMEDAD CARDIACA. LAS VACUNAS PROPORCIONAN UNA ESTRATEGIA VENTAJOSA PARA LA PREVENCION O EL TRATAMIENTO DE LA ATEROSCLEROSIS.

Description

Vacuna basada en un plásmido para el tratamiento de la aterosclerosis.

Campo de la invención

La presente invención se refiere al campo de la inmunobiología y específicamente a una vacuna de ADN plasmídico para controlar la actividad o el efecto de la proteína de transferencia de ésteres de colesterol, o CETP, en el cuerpo.

Antecedentes de la invención

El colesterol circula por el cuerpo predominantemente como componente de partículas de lipoproteína (lipoproteínas), las cuales se componen de una porción proteica que consta de una o varias apolipoproteínas (Apo) y diversos lípidos, incluyendo fosfolípidos, triacilgliceroles (triglicéridos), colesterol y ésteres de colesterol. Hay diez clases principales de apolipoproteínas: Apo A-I, Apo A-II, Apo-IV, Apo B-48, Apo B-100, Apo C-I, Apo C-II, Apo C-III, Apo D y Apo E.

Las lipoproteínas se clasifican por densidad y composición. Las lipoproteínas de alta densidad (HDL), una de cuyas funciones es intervenir en el transporte de colesterol desde los tejidos periféricos al hígado, tiene normalmente una densidad en el intervalo de aproximadamente 1,063-1,21 g/ml. Las HDL contienen diversas cantidades de Apo A-I, Apo A-II, Apo C-I, Apo C-II, Apo C-III, Apo D, Apo E, así como diversas cantidades de lípidos, como colesterol, ésteres de colesterol, fosfolípidos y triglicéridos.

En contraste con las HDL, las lipoproteínas de baja densidad (LDL), que generalmente tienen una densidad de aproximadamente 1,019-1,063 g/ml, contienen Apo B-100 en asociación con diversos lípidos. En particular, las cantidades de lípidos, colesterol y ésteres de colesterol son considerablemente más altas en las LDL que en las HDL, si se miden como porcentaje de la masa seca. Las LDL son especialmente importantes en el suministro de colesterol a los tejidos periféricos.

Las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) tienen una densidad de aproximadamente 0,95-1,006 g/ml y difieren también de las otras clases de lipoproteínas en la composición, tanto en el contenido de proteínas como de lípidos. Generalmente, las VLDL tienen una cantidad de triglicéridos mucho mayor que las HDL o las LDL, y son especialmente importantes en el suministro de los triglicéridos sintetizados endógenamente desde el hígado a los tejidos adiposos y a otros tejidos.

Con una densidad aún menor que las LDL, los quilomicrones (densidad normalmente inferior a 0,95 g/ml) contienen Apo A-I, Apo A-II, Apo B, Apo C-I, Apo C-II y Apo C-III, e intervienen en el transporte de los triglicéridos y ésteres de colesterol de la dieta desde el intestino al tejido adiposo y al hígado.

Las características y funciones de las diversas lipoproteínas se han estudiado exhaustivamente. (Véase por ejemplo, Mathews, C.K. y van Holde, K.E., Biochemistry, pp. 574-576, 626-630 (The Benjamin/Cummings Publishing Co., Redwood City, California, 1990); Havel, R.J. y col., "Introduction: Structure and metabolism of plasma lipoproteins", en The Metabolic Basis of Inherited Disease, 6ª ed., pp. 1129-1138 (Scriver, C.R. y col., eds.) (McGraw-Hill, Inc., Nueva York, 1989); Zannis, V.I. y col., "Genetic mutations affecting human lipoproteins, their receptors, and their enzymes", en Advances in Human Genetics, vol. 21, pp. 145-319 (Plenum Press, Nueva York, 1993)).

Generalmente, se ha correlacionado una reducida susceptibilidad a la enfermedad cardiovascular, como aterosclerosis, con un aumento en los niveles absolutos de las HDL circulantes y también con un aumento de los niveles de HDL respecto a los niveles circulantes de lipoproteínas de menor densidad como las VLDL y LDL (véase por ejemplo, Gordon, D.J. y col., N. Engl. J. Med., 321: 1311-1316 (1989); Castelli, W.P. y col., J. Am. Med. Assoc., 256: 2835-2838 (1986); Miller, N.E. y col., Am. Heart J., 113: 589-597 (1987); Tall, A.R., J. Clin. Invest. 89: 379-384 (1990); Tall, A.R., J. Internal Med., 237: 5-12 (1995)).

La proteína de transferencia de ésteres de colesterol (CETP) interviene en la transferencia de los ésteres de colesterol desde las HDL a lipoproteínas ricas en triglicéridos como las VLDL y las LDL, y también en el intercambio recíproco de triglicéridos desde VLDL a HDL (Tall, A.R., J. Internal Med., 237: 5-12 (1995); Tall, A.R., J. Lipid Res., 34: 1255-1274 (1993); Hesler, C.B. y col., J. Biol. Chem., 262: 2275-2282 (1987); Quig, D.W. y col., Ann. Rev. Nutr., 10: 169-193 (1990)). La CETP puede desempeñar un papel en la modulación de los niveles de ésteres de colesterol y triglicéridos asociados con diversas clases de lipoproteínas. Una alta actividad de transferencia de ésteres de colesterol de la CETP se ha correlacionado con el aumento de los niveles de colesterol asociado a LDL y de colesterol asociado a VLDL, lo que a su vez se correlaciona con un aumento del riesgo de enfermedad cardiovascular (véase por ejemplo, Tato, F. y col., Arterioscler. Thromb. Vascular Biol., 15: 112-120 (1995)).

A partir de ahora, LDL-C se usará para referirse al colesterol total, incluyendo ésteres de colesterol y/o colesterol sin esterificar, asociado con lipoproteína de baja densidad. VLDL-C se usará para referirse al colesterol total, incluyendo ésteres de colesterol y/o colesterol sin esterificar, asociado con lipoproteína de muy baja densidad. HDL-C se usará para referirse al colesterol total, incluyendo ésteres de colesterol y/o colesterol sin esterificar, asociado con lipoproteína de alta densidad.

Todas las lipoproteínas contienen apolipoproteínas que sirven para mantener la integridad estructural de las lipoproteínas e intervenir en el transporte y metabolismo de los lípidos, actuando como ligandos para receptores específicos o cofactores de ciertas enzimas. Además de la CETP, otras proteínas son importantes en el transporte y metabolismo de los lípidos, incluyendo la lipasa hepática, lipasa lipoprotéica, lecitina-colesterol acetiltransferasa (LCAT), receptor de LDL, receptor de HDL (SR-B1) y receptor de quilomicrón remanente. Una disrupción en la función de estos componentes puede conducir a dislipidemia, el metabolismo anormal de los lípidos del plasma, lo que a su vez puede contribuir al desarrollo de aterosclerosis.

Las proteínas, apolipoproteínas y lipoproteínas descritas anteriormente participan en tres rutas de transporte y metabolismo de los lípidos: (1) la ruta del quilomicrón, (2) la ruta de las VLDL-LDL y (3) la ruta inversa del colesterol. Los quilomicrones y quilomicrones remanentes transportan los lípidos de la dieta desde el intestino a los tejidos periféricos, como el tejido adiposo, y al hígado. La ruta de las VLDL-LDL transporta los lípidos desde el intestino a los tejidos periféricos. En la ruta inversa del colesterol, el exceso de colesterol, que no puede ser degradado por la mayoría de los tejidos, se esterifica y se suministra al hígado para su excreción desde los tejidos periféricos, bien directamente en HDL o indirectamente después del intercambio con otras fracciones lipoproteicas. Específicamente, la HDL naciente, producida por el hígado y el intestino, aumenta de tamaño y se transforma en HDL3 y después en HDL2, a medida que adquiere colesterol y éste se esterifica a éster de colesterol. Los ésteres de colesterol (CE) pueden permanecer con HDL2 para su transporte y absorción por el hígado o pueden ser transferidos por la CETP a lipoproteínas de baja densidad, como las VLDL y LDL, en intercambio por triglicéridos. En el hígado se eliminan los triglicéridos de HDL2 mediante la lipasa hepática, que convierte HDL2 de nuevo en HDL3 para su reutilización. Durante este proceso, los CE pueden transferirse también a hepatocitos. Adicionalmente, algunas HDL pueden ser absorbidas directamente por hepatocitos (véase por ejemplo, Havel, R.J. y col., The Metabolic Basis of Inherited Disease, 6ª ed., páginas 1129-1138 (Scriver, C.R. y col., eds.) (McGraw-Hill, Inc, Nueva York, 1989); Fielding, C.J. y col., J. Lipid Res., 36: 211-228 (1995)).

Por tanto, la transferencia de CE sigue una de dos rutas. Primera, las lipoproteínas pueden suministrar los ésteres de colesterol al hígado para su excreción, participando así en la ruta inversa de transporte de colesterol. Segunda, los ésteres de colesterol pueden reciclarse de vuelta a los tejidos periféricos.

Cuando todos los componentes de estas rutas funcionan correctamente, los lípidos de la dieta se absorben, transportan y almacenan o utilizan rápidamente. En el estado de ayuno, los lípidos se transportan eficientemente a los tejidos y el colesterol se recicla o se excreta. Las dislipidemias que se producen de forma natural, quizá como resultado de mutaciones de apolipoproteínas, se deben frecuentemente a la disfunción de uno o varios de los componentes de las rutas descritas anteriormente (véase por ejemplo, Farmer, J.A. y col., Heart Disease, A Textbook of Cardiovascular Medicine, 4ª ed., pp. 1125-1160 (Braunwald, E., ed.) (W.B. Saunders Co., Philadelphia, 1992); Havel, R.J. y col., 1992; Zanis, V.I. y col., 1993). Un exceso crónico de colesterol en la dieta puede sobrecargar los mecanismos normales de eliminación de colesterol desde los tejidos periféricos y puede resultar en aterosclerosis, como prueba el desarrollo de lesiones y el bloqueo del flujo sanguíneo en el tejido cardiovascular.

Una serie de estudios in vivo utilizando modelos animales o humanos han indicado que la actividad de la CETP puede afectar al nivel de HDL con colesterol circulante. El aumento de la actividad de transferencia de ésteres de colesterol mediada por CETP puede producir una disminución en los niveles de HDL-C respecto a los niveles de LDL-C y/o VLDL, lo que a su vez se correlaciona con un aumento de la susceptibilidad a aterosclerosis. Por ejemplo, se demostró que la inyección de CETP humana parcialmente purificada en ratas (que normalmente carecen de actividad de CETP) resultaba en un desplazamiento de los ésteres de colesterol de las HDL a las VLDL, coherente con la transferencia de CE de las HDL a las VLDL potenciada por la CETP (véase Ha, Y.C. y col., Biochem. Biophys. Acta, 833: 203-211 (1985); Ha, Y.C. y col., Comp. Biochem. Physiol., 83B: 463-466 (1986); Gavish, D. y col., J. Lipid Res., 28: 257-267 (1987)). Además, se informó de que ratones transgénicos que expresaban la CETP mostraban una disminución significativa en el nivel de colesterol asociado con HDL (véase por ejemplo, Hayek, T. y col., J. Clin. Invest., 90: 505-510 (1992); Breslow, J.L. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8314-8318 (1993)). Además, mientras que los ratones de tipo salvaje presentan normalmente una alta resistencia a aterosclerosis (Breslow, J.L. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8314-8318 (1993)), se informó de que los ratones transgénicos que expresaban la CETP de simio presentaban una distribución alterada del colesterol asociado con lipoproteínas, es decir, elevados niveles de LDL-C y VLDL-C y reducidos niveles de HDL-C (Marotti, K.R. y col., Nature, 364: 73-75 (1993)). Estos ratones transgénicos que expresaban la CETP de simio fueron también más susceptibles a una grave aterosclerosis inducida por la dieta en comparación con ratones de control sin expresión, y desarrollaron lesiones en las aortas de un área significativamente mayor que las encontradas en los animales de control y más típicamente que las que se encuentran en aterosclerosis (Marotti y col., 1993). La infusión por vía intravenosa de anticuerpos monoclonales (Mab) anti-CETP humana en hámsteres y conejos inhibió la actividad de la CETP in vivo y resultó en un aumento de los niveles de HDL-C, disminución de los niveles de HDL-triglicéridos y aumento del tamaño de las HDL, significativos, lo que implica de nuevo un papel crítico de la CETP en la distribución del colesterol en las lipoproteínas circulantes (véase Gaynor, B.J. y col., Aterosclerosis, 110: 101-109 (1994) (hámsteres); Whitlock, M.E. y col., J. Clin. Invest. 84: 129-137 (1989) (conejos)).

También se ha estudiado el papel de la actividad de la CETP en humanos. Por ejemplo, en ciertos estudios de familias en Japón, los individuos homocigotos para alelos no funcionales del gen de la CETP no presentaron una actividad detectable de la CETP. Estos individuos prácticamente no mostraron placas ateroscleróticas, y también mostraron una tendencia a la longevidad en sus familias (véase por ejemplo, Brown, M.L. y col., Nature, 342: 448-451 (1989); Inazu, A. y col., New Engl. J. Med., 323: 1234-1238 (1990); Bisgaier, C.L. y col., J. Lipid Res., 32: 21-23 (1991)). Estos individuos homocigotos deficientes en CETP también demostraron tener un perfil lipoproteico antiaterogénico, como prueban los elevados niveles de HDL circulantes ricas en ésteres de colesterol, así como niveles generales elevados de HDL y unas HDL de tamaño excepcionalmente grande, es decir hasta cuatro a seis veces el tamaño de las HDL normales (Brow, M.L. y col., 1989, cita anterior, p.451).

Los estudios anteriores indican que la CETP desempeña un papel principal en la transferencia de ésteres de colesterol desde las HDL a las VLDL y las LDL, alterando con ello el perfil relativo de lipoproteínas circulantes hacia un perfil asociado con un aumento del riesgo de enfermedad cardiovascular (es decir, disminución de los niveles de HDL-C y aumento de los niveles de VLDL-C y LDL-C). Marotti y col. (Nature, 364: 73-75 (1993)) interpretaron sus datos como una indicación de que una alteración de la distribución del colesterol inducida por la CETP era la razón principal de que las lesiones arteriales se desarrollaran más rápidamente en los ratones transgénicos que expresaban la CETP que en los ratones de control no transgénicos, cuando ambos grupos se alimentaron con una dieta aterogénica.

La CETP aislada de plasma humano es una glicoproteína hidrófoba con 476 aminoácidos y un peso molecular relativo de aproximadamente 66000 a 74000 daltons en geles de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS) (Albers, J.J. y col., Arteriosclerosis, 4: 49-58 (1984); Hesler, C.B. y col., J. Biol. Chem., 262: 2275-2282 (1987); Jarnagin, S.S. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 1854-1857 (1987)). Se ha clonado y secuenciado un ADNc que codifica la CETP humana (Drayna, D. y col., Nature, 327: 632-634 (1987)). Se ha demostrado que la CETP se une a ésteres de colesterol (CE), triglicéridos (TG), fosfolípidos (Barter, P.J. y col., J. Lipid Res., 21: 238-249 (1980)) y lipoproteínas (véase por ejemplo, Swenson, T.L. y col., J. Biol. Chem., 264: 14318-14326 (1989)). Más recientemente, se ha demostrado que la región de la CETP definida por los 26 aminoácidos carboxiterminales y, en particular, los aminoácidos 470 a 475, es especialmente importante para la unión de los lípidos neutros implicada en la transferencia de lípidos neutros (Hesler, C.B. y col., J. Biol. Chem., 263: 5020-5023 (1988)), pero no para la unión de fosfolípidos (véase Wang, S. y col., J. Biol. Chem., 267: 17487-17490 (1992); Wang, S. y col., J. Biol. Chem., 270: 612-618 (1995)).

A partir de las investigaciones actuales se deduce que el aumento de los niveles de actividad de la CETP puede predecir un aumento del riesgo de enfermedad cardiovascular. Por tanto, la actividad de la CETP endógena es una atractiva diana terapéutica para modular los niveles relativos de lipoproteínas para evitar o inhibir el desarrollo, o potenciar la regresión de enfermedades cardiovasculares como aterosclerosis.

Por consiguiente sería de utilidad el desarrollo de los medios y procedimientos para controlar la actividad de la CETP endógena para evitar o tratar la enfermedad cardiovascular. Preferentemente, la modulación de la actividad de la CETP endógena en un humano o animal se llevará a cabo mediante la administración al sujeto de una composición farmacéutica que es específica para la CETP, no requiere grandes cantidades, no requiere una dosificación continua o repetida frecuentemente y tampoco produce efectos secundarios perjudiciales.

Resumen de la invención

Se describe una vacuna de ADN basada en un plásmido que comprende una molécula de ADN plasmídico, la cual contiene una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de fusión inmunogénico que, al ser administrado a un sujeto humano o animal, inducirá la producción de autoanticuerpos específicamente reactivos contra la CETP endógena del sujeto. Estos anticuerpos inhiben la actividad de la CETP endógena o retiran la CETP de la circulación (eliminación), potencian la formación y el mantenimiento del perfil antiaterogénico de lipoproteínas del suero (por ejemplo, niveles de HDL aumentados y niveles de LDL reducidos) y/o inhiben el desarrollo de lesiones ateroscleróticas.

El polipéptido de fusión inmunogénico codificado en un plásmido como se describe en este documento comprende una porción epitópica para células T y una porción epitópica para células B. La porción epitópica para células T codificada en el plásmido de esta invención comprende una proteína CETP no endógena, o un fragmento de la misma, que contiene un epítopo de amplio espectro o "universal" para células T auxiliares, que se une al sitio de presentación antigénica de múltiples (es decir, 2, 3, 4, 5, 6 o más) moléculas principales de histocompatibilidad (MHC) de clase II y puede formar un complejo terciario con un receptor antigénico de células T, es decir MHC:antígeno:receptor antigénico de células T. "Proteína CETP no endógena" significa una proteína que no es la CETP endógena del individuo al que va a administrarse el plásmido de esta invención. Estas proteínas CETP no endógenas, o fragmentos de las mismas, útiles como las porciones epitópicas para células T del polipéptido de fusión inmunogénico codificado por los plásmidos de esta invención, incluyen el toxoide tetánico (particularmente los péptidos del toxoide tetánico que tienen las secuencias aminoacídicas de los aminoácidos 2-15 de ID SEC Nº:7 y la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº:10); la toxina diftérica (particularmente los péptidos que tienen las secuencias aminoacídicas de los aminoácidos 271-290, 321-340, 331-350, 351-370, 411-430 y 431-450 de ID SEC Nº:9).; la cadena invariante asociada a la clase II del MHC; el epítopo para células T de la hemaglutinina de influenza; la hemocianina de lapa californiana (KLH); una proteína de vacunas conocidas incluyendo la vacuna contra la tos ferina, la vacuna contra la tuberculosis de bacilos de Calmette-Guerin (BCG), la vacuna contra la polio, la vacuna contra el sarampión, la vacuna contra las paperas, la vacuna contra la rubeola y un derivado proteico purificado (PPD) de la tuberculina; y también péptidos sintéticos que se unen al sitio de presentación antigénica de múltiples moléculas de histocompatibilidad de clase II, como aquellas que contienen aminoácidos naturales descritas por Alexander y col., (Immunity, 1: 751-761 (1994)). Al asociarse a una porción epitópica para células B de la CETP, la porción epitópica para células T permite al polipéptido de fusión inmunogénico romper la tolerancia para crear los anticuerpos que reaccionen con la CETP endógena. "Romper la tolerancia" significa forzar a un organismo a crear una respuesta inmunitaria frente a una proteína, como la CETP endógena'', que normalmente el organismo no considera inmunogénica.

La porción epitópica para células B de un polipéptido de fusión inmunogénico codificado en el plásmido de esta invención comprende la secuencia de aminoácidos de la CETP endógena, o un fragmento de la misma, de la misma especie que el individuo al que se administrará el plásmido; la CETP o un fragmento de la misma de una especie diferente de la del individuo al que se administrará el plásmido; o una secuencia de aminoácidos sintética que provoca anticuerpos que se unen a la CETP endógena. Esta porción epitópica para células B, de utilidad en la vacuna contra la CETP basada en un plásmido de esta invención, está codificada por una secuencia de ADN de al menos 15 nucleótidos de longitud.

En una realización de esta invención, un plásmido de ADN contiene una secuencia codificante estructural de un polipéptido de fusión inmunogénico, en que la secuencia codificante estructural comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido del toxoide tetánico (como los nucleótidos 13-54 de ID SEC Nº:5) como la porción epitópica para células T, ligado en el mismo marco de lectura con secuencias de ADN (como los nucleótidos 55-159 de ID SEC Nº:5) que codifican los aminoácidos 350-368 y 481-496 de la secuencia de aminoácidos de la CETP madura de conejos (ID SEC Nº:2), como la porción epitópica para células B. En una realización preferida, un plásmido de ADN de esta invención codifica una secuencia codificante estructural de un péptido de fusión inmunogénico, en que la secuencia codificante estructural comprende una secuencia de ADN que codifica un polipéptido del toxoide tetánico (como los nucleótidos 13-54 de ID SEC Nº:5) como la porción del polipéptido de fusión inmunogénico con epítopos para células T, ligado en el mismo marco de lectura con secuencias de ADN, como los nucleótidos 1045-1101 y 1381-1428 de ID SEC Nº:3 que codifican, respectivamente, los aminoácidos 349-367 y 461-476 de la secuencia de aminoácidos de la CETP madura humana (ID SEC Nº:4), como la porción epítópica para células B del polipéptido de fusión inmunogénico.

Los polipéptidos de fusión inmunogénicos de la invención se expresan a partir de los plásmidos de la invención a niveles suficientes y durante períodos de tiempo suficientes para provocar la producción de autoanticuerpos que reaccionan específicamente con la CETP endógena y que sirven para reducir o inhibir la aterogénesis mediada por la CETP, como prueba un perfil antiaterogénico de lipoproteínas del suero y/o una inhibición en el desarrollo de lesiones ateroscleróticas.

La expresión de la proteína de fusión inmunogénica está dirigida por una secuencia promotora o promotora/poten-
ciadora que puede dirigir una transcripción eficiente en células de mamíferos, particularmente en células de los músculos esqueléticos. Estas secuencias promotoras/potenciadoras incluyen, pero no se limitan a, la secuencia promotora/potenciadora de citomegalovirus humano (CMV), la secuencia promotora/potenciadora de adenovirus y la secuencia promotora/potenciadora de \beta-actina.

Además, un plásmido de esta invención puede codificar o no una secuencia señal secretora, ligada al polipéptido de fusión inmunogénico. Preferentemente, un plásmido de esta invención codifica un polipéptido de fusión inmunogénico que no contiene una secuencia señal secretora aminoterminal.

En otra realización preferida, un plásmido de esta invención incluye también una secuencia señal de poli-A situada del lado 3' de la secuencia codificante estructural del polipéptido de fusión inmunogénico.

Por tanto, un plásmido preferido de esta invención consta esencialmente de una secuencia promotora/potenciadora ligada operativamente a una secuencia de ADN codificante de un polipéptido de fusión inmunogénico que comprende una porción epitópica para células T y una porción epitópica para células B, el cual induce en un individuo que recibe el plásmido la producción de una respuesta inmunitaria que resulta en la inhibición de la actividad de la CETP
endógena.

El ADN de los plásmidos de esta invención puede administrarse por cualquier medio usado normalmente para administrar vacunas basadas en plásmidos a humanos o animales, siempre que el modo de administración resulte en la expresión del péptido de fusión inmunogénico y la producción de anticuerpos que reaccionen específicamente con (es decir, se unan a) la CETP endógena. Preferentemente, los plásmidos de ADN se administran por vía intramuscular o intradérmica.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 es un diagrama que muestra la construcción del plásmido pCMV-LUC que contiene un gen de luciferasa, cuya transcripción se encuentra bajo el control de un promotor y potenciador de CMV.

La figura 2 es una gráfica de barras que muestra la actividad de la luciferasa medida en diferentes momentos, en homogenizados de cuadríceps de ratones inyectados por vía intramuscular con las construcciones plasmídicas que tienen el gen de la luciferasa bajo el control transcripcional de tres promotores diferentes: CMV, \beta-actina y adenovirus. Los homogenizados se prepararon a partir de cuádriceps de ratones en los días 2, 32 o 132 después de ser inyectados con una de las construcciones plasmídicas. El "control de PBS" se refiere a homogenizados preparados a partir de ratones de control en los días 2, 32 o 132 después de ser inyectados con tampón fosfato salino (PBS) estéril.

La figura 3 es una gráfica de barras que muestra la producción de anticuerpos antiluciferasa en ratones inyectados por vía intramuscular con el plásmido pCMV-LUC, en muestras de sangre obtenidas de los ratones a los 31 y 45 días después de la inmunización.

La figura 4 es un diagrama que muestra la construcción de la vacuna basada en un plásmido, pCMV-CETP/TT.

La figura 5 muestra la secuencia nucleotídica de un inserto de ADN que codifica un fragmento del toxoide tetánico y dos epítopos para células B de la CETP como polipéptido de fusión, insertado bajo el control del promotor/potenciador de CMV en el plásmido pCMV-CETP/TT. También se representa la correspondiente secuencia de aminoácidos, en abreviaturas de una letra, del polipéptido de fusión inmunogénico codificado y la localización de los sitios de corte de la endonucleasa de restricción NotI en el inserto de ADN.

La figura 6 muestra un esbozo del protocolo diario usado para ensayar la vacuna basada en un plásmido, pCMV-CETP/TT en los conejos nº 1 - nº 8 y nº 10 - nº 14 (indicados como números en la parte superior de las columnas de la tabla) en diferentes condiciones de dieta. En cada casilla se indica el día en que se llevó a cabo una etapa concreta (fila) del protocolo en un conejo concreto (columna). Los conejos nº 1 - nº 8 se inyectaron en los días indicados (véanse las filas marcadas "Vacuna CETP") con 50 \mug de pCMV-CETP/TT como vacuna contra la CETP basada en un plásmido, y 50 \mug de pCMV-LUC como control interno e indicador. La primera inyección de los plásmidos en los conejos nº 1 - nº 8 tuvo lugar en el día 0. Los conejos nº 10 - nº 14 fueron conejos de control que no recibieron ninguno de los plásmidos (animales de control negativo). Las casillas en las filas marcadas "PRE 1", "PRE 2" "PRE 3" indican los días (designados como números negativos en negrita y entre paréntesis) en los que se obtuvieron muestras de sangre ("presangrías") de los conejos antes de la primera administración de los plásmidos. "PRE 3" indica también que se tomaron muestras de sangre en el mismo día y antes de la primera inyección del ADN de los plásmidos pCMV-CETP/TT y pCMV-LUC en los conejos nº 1 - nº 8. Las casillas en las filas marcadas "SANGRÍA 1"-"SANGRÍA 12" indican aquellos días (en negrita) en que se obtuvieron muestras de sangre de los conejos después de la primera inyección de ADN plasmídico en los conejos nº 1 - nº 8 en el día 0. Las casillas en las filas marcadas "Tétanos" indican el día en el que el conejo recibió una inyección intramuscular de una preparación de la vacuna del toxoide tetánico adsorbida en alumbre. Las casillas en las filas marcadas "Colesterol 0,25%" y "Colesterol 0,5%" indican el día en el que un conejo concreto se sometió a una dieta de pienso para conejos suplementada con el 0,25% de colesterol (p/p) o el 0,5% de colesterol (p/p), respectivamente. Las casillas que contienen una "X" indican que un conejo concreto no se encontraba en la etapa concreta del protocolo designada por la fila o que el animal había sido sacrificado. Las casillas en las filas marcadas "Terminación" indican el día en que cada conejo fue sacrificado.

La figura 7 es un histograma que muestra la expresión de la luciferasa en homogenizados de tejido tomado de las áreas aproximadas de cada uno de los tres puntos del cuádriceps de un conejo inyectados con los dos plásmidos, pCMV-LUC y pCMV-CETP/TT. La actividad de la luciferasa se expresa en cuentas por segundo. "Conejo normal" se refiere a la actividad de la luciferasa en un homogenizado de tejido tomado de un conejo de control normal que no recibió ninguno de los plásmidos. "Conejo 8" se refiere a los homogenizados de tejido preparados de los puntos aproximados de inyección de los plásmidos pCMV-LUC y pCMV-CETP/TT en el cuádriceps del conejo nº 8, que fue sacrificado 48 horas después de ser inyectado con los plásmidos en el día 0. "Conejo 7" se refiere a los homogenizados de tejido preparados de los puntos aproximados de inyección de los plásmidos pCMV-LUC y pCMV-CETP/TT en el cuádriceps del conejo nº 7 que fue sacrificado 48 horas después de recibir una segunda inyección (refuerzo) de los plásmidos pCMV-LUC y pCMV-CETP/TT en el día 28.

La figura 8 es una gráfica que muestra la detección mediante un ensayo ELISA de anticuerpos anti-CETP_{477-496} de conejo en plasma tomado en el día 57 de seis conejos (conejos nº 1 - nº 6) vacunados con el plásmido pCMV-CETP/TT. Se ensayó el plasma de los conejos nº 1 (cuadrado relleno), conejo nº 2 (círculo relleno), conejo nº 3 (triángulo relleno), conejo nº 4 (triángulo abierto), conejo nº 5 (círculo abierto) y conejo nº 6 (cruz). "PCN" se refiere al plasma tomado de un conejo de control que no fue inyectado con el plásmido pCMV-LUC ni con el plásmido pCMV-CETP/TT (cuadrado abierto).

La figura 9 es una gráfica que muestra la detección de anticuerpos anti-CETP_{477-496} de conejo en plasma tomado en el día 220 de cuatro conejos vacunados con el plásmido pCMV-CETP/TT. Se ensayó el plasma de los conejos nº 2 (círculo relleno), conejo nº 3 (triángulo relleno), conejo nº 5 (círculo abierto) y conejo nº 6 (cruz). "PCN" se refiere al plasma tomado de un conejo de control que no fue inyectado con los plásmidos pCMV-LUC ni pCMV-CEPT/TT (cuadrado abierto).

La figura 10 es una gráfica que muestra la concentración (\mug/ml) de los anticuerpos anti-CETP_{477-496} en muestras de plasma de conejo tomadas como se describe en la figura 6. Se ensayó el plasma de los conejos nº 1 (cuadrado relleno), conejo nº 2 (círculo relleno), conejo nº 3 (triángulo relleno), conejo nº 4 (triángulo abierto), conejo nº 5 (círculo abierto) y conejo nº 6 (cruz).

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona una estrategia para la inhibición o prevención de la enfermedad cardiovascular, como aterosclerosis, mediante modulación de la actividad de la CETP, bien por inhibición de la actividad de la CETP mediante unión a anticuerpos o por eliminación de la actividad de la CETP del sistema circulatorio (o ambos). La modulación de la actividad de la CETP endógena se lleva a cabo usando una vacuna basada en un plásmido. Los plásmidos de ADN descritos en este documento codifican polipéptidos de fusión inmunogénicos que, al expresarse in vivo, provocan la producción de autoanticuerpos para inhibir y/o eliminar la actividad de la CETP endógena circulante. La presente invención proporciona también un procedimiento para inmunizar a un vertebrado, como un humano, para provocar una respuesta de anticuerpos contra su CETP endógena y con ello modular la actividad de la CETP.

Las diversas designaciones para lípidos, lipoproteínas y apolipoproteínas a que se hace referencia a continuación son las mismas que se han descrito anteriormente en los antecedentes. Como se ha observado anteriormente, la CETP desempeña un papel significativo en el transporte y distribución de CE y TG entre las lipoproteínas HDL y LDL. Una disminución en la actividad de la CETP produce un perfil lipoproteico no aterogénico o disminuye el desarrollo de aterosclerosis (véase por ejemplo, Mabuchi y col., Acad. Sci., 748: 333-341 (1995); Inazu y col., New Engl. J. Med., 323: 1234-1238 (1990); Gaynor y col., Atherosclerosis, 110: 101-109 (1994); Whitlock y col., J. Clin. Invest., 84: 129-137 (1989)). A la inversa, un aumento de la actividad de la CETP produce un perfil lipoproteico aterogénico e induce aterosclerosis. La sobreexpresión de la CETP en animales transgénicos reduce los niveles de HDL y acelera la aterosclerosis (Agellon y col., J. Biol. Chem., 266: 10796-10801 (1991); Marotti y col., Nature, 364: 73-75 (1993)), y la administración de la CETP a animales experimentales puede conducir a elevados niveles de VLDL-C y LDL-C y a una disminución relativa del nivel de HDL-C (Groener y col., Biochim. Biophys. Acta, 1002: 93-100 (1989); Ha y col., Biochim. Biophys. Acta, 833: 203-210 (1985)). Por tanto, la inhibición de la actividad de la CETP es un resultado clínico deseable que ayudará a prevenir la aterosclerosis y la inhibición de la actividad de la CETP es una estrategia apropiada para potenciar un estado fisiológico asociado con la prevención y el tratamiento de la enfermedad cardiovascular.

En la invención descrita en este documento se proporcionan vacunas basadas en plásmidos para la producción de autoanticuerpos dirigidos contra la CETP endógena. Específicamente, se describen plásmidos de ADN que se administran a un individuo (por ejemplo, por inyección intramuscular o por administración balística por vía intradérmica). Los plásmidos de ADN administrados codifican y dirigen la producción de polipéptidos de fusión inmunogénicos que presentan uno o varios epítopos de amplio espectro o "universales" para células T auxiliares y también uno o varios epítopos para células B de la CETP. Estos polipéptidos inmunogénicos provocan la producción de autoanticuerpos que reaccionan específicamente contra (es decir, se unen a) la CETP en el individuo (CETP endógena). La producción de anticuerpos anti-CETP potencia un estado fisiológico asociado con la disminución del riesgo de la enfermedad cardiovascular. La modulación beneficiosa de la actividad de la CETP producida por las vacunas de ADN queda demostrada por una reducción significativa o una eliminación de la actividad de la CETP; por un perfil lipoproteico antiaterogénico (por ejemplo, un aumento en el nivel de HDL o HDL-C en comparación con LDL, LDL-C, VLDL o VLDL-C); o por una inhibición (incluyendo la prevención) o disminución del desarrollo de lesiones ateroscleróticas en tejido cardiovascular, como la aorta.

Diseño de una vacuna de ADN plasmídico para modulación de la CETP endógena

Muchos péptidos pequeños sólo adquieren antigenicidad cuando se acoplan a proteínas transportadoras inmunogénicas de mayor tamaño (véase Etlinger, Immunol. Today, 13: 52-55 (1992)). Se entiende que la proteína transportadora proporciona epítopos reconocidos por las células T auxiliares. Por tanto, aunque los autoantígenos, como los epítopos para células B de las proteínas endógenas, generalmente no son inmunogénicos, pruebas recientes han indicado que los autoantígenos pueden hacerse más inmunogénicos ligándolos a uno o varios epítopos reconocidos por las células T auxiliares del sistema inmunitario del huésped. Estos polipéptidos inmunogénicos, que contienen uno o varios epítopos para células T auxiliares y epítopos para células B de una proteína endógena concreta, pueden provocar la producción de autoanticuerpos que reaccionan específicamente con la proteína endógena concreta. Por ejemplo, se ha conjugado un fragmento de la gonadotropina coriónica humana (hCG) con proteínas transportadoras para producir una vacuna peptídica para provocar autoanticuerpos reactivos contra hCG (véase Ada, G.L., en Fundamental Immunology, 3ª ed. W.E. Paul, ed. (Raven Press, Ltd, Nueva York, 1993) pp. 1309-1352; Aitken y col., Brit. Med. Bull., 49: 88-99 (1993)). Esta vacuna peptídica constaba de un dímero heteroespecífico de la subunidad alfa de la hormona luteinizante ovina y de la subunidad beta de la hCG, conjugadas a una de las dos proteínas transportadoras inmunogénicas, toxoide tetánico (TT) o toxoide diftérico (DT) (Talwar y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 8532-8536 (1994)). Además, se demostró que una vacuna peptídica que incluía la porción C-terminal de la CETP humana y un epítopo para células T del toxoide tetánico provocaba una respuesta de anticuerpos anti-CETP y alteraba la actividad de la CETP en conejos, como se describe en la solicitud U.S., en asignación común y pendiente con la presente, con el nº de serie 08/432483, presentada el 1 de mayo de 1995.

Epítopos de amplio espectro para células T

Los plásmidos de ADN descritos en este documento comprenden una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de fusión inmunogénico que comprende una porción epitópica para células T y una porción epitópica para células B. La porción epitópica para células T auxiliares (o simplemente "porción epitópica para células T") codificada en un plásmido de esta invención comprende una proteína CEPT no endógena, o un fragmento de la misma, que contiene un epítopo "universal" o "de amplio espectro" para células T, el cual se une a los sitios de presentación antigénica de múltiples (dos o más) moléculas principales de histocompatibilidad (MHC) de clase II y puede formar un complejo terciario con un receptor antigénico de células T, es decir MHC:antígeno:receptor antigénico de células T, que es la unidad funcional de reconocimiento del epítopo para células T. Por tanto, los epítopos "universales" o de amplio espectro para células T de utilidad en esta invención se unen al sitio de presentación antigénica de múltiples moléculas de clase II del MHC y sirven para activar las células T auxiliares que, a su vez, estimulan el crecimiento y diferenciación de las células B, lo que conduce a la secreción de anticuerpos específicos. Preferentemente, un epítopo universal o de amplio espectro para células T codificado por un plásmido de esta invención se une al sitio de presentación antigénica de tres o más moléculas diferentes de clase II del MHC, como las tres moléculas alélicamente diferentes de clase II del MHC encontradas en la población humana. Con mayor preferencia, un epítopo universal o de amplio espectro para células T codificado por un plásmido de esta invención se une al sitio de presentación antigénica de cuatro o más moléculas diferentes de clase II del MHC. Con la mayor preferencia, un epítopo universal o de amplio espectro para células T codificado por un plásmido de esta invención se une al sitio de presentación antigénica de seis o más moléculas diferentes de clase II del MHC.

Los epítopos antigénicos de amplio espectro para células T son conocidos en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, epítopos del toxoide tetánico (TT) y del toxoide diftérico (DT) (véase por ejemplo, Panina-Bordignon, P. y col., Eur. J. Immunol., 19: 2237-2242 (1989) (caracterización de péptidos con epítopos universales del toxoide tetánico para células T auxiliares); Etlinger, H., Immunol. Today, 13: 52-55 (1992); Valmori, D. y col., J. Immunol., 149: 717-721 (1992) (uso de epítopos universales del TT en un candidato de vacuna antimalaria); Raju y col., Eur. J. Immunol., 25: 3207-3214 (1995) (epítopos de amplio espectro del DT para células T); Talwar, G.P. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 8532-8536 (1994) (uso de TT y DT como epítopos universales en una vacuna antigonadotropina coriónica humana).

Además de TT y TD, otras secuencias de epítopos de amplio espectro o universales para células T de utilidad en esta invención incluyen los epítopos universales para células T que se unen a la clase II del MHC: HA o hemaglutinina de influenza, HBVnc, CS y MT, como se describen en Alexander y col. (Immunity, 1: 751-761 (1994)). Otros epítopos adicionales para células T que pueden ser codificados por los plásmidos de esta invención incluyen aquellos polipéptidos derivados de proteínas antigénicas derivadas de la vacuna contra la tos ferina, bacilos de Calmette-Guerin (BCG), la vacuna contra la polio, la vacuna contra el sarampión, la vacuna contra las paperas, la vacuna contra la rubeola y un derivado proteico purificado (PPD) de la tuberculina (véase, por ejemplo Etlinger, H., Immunol. Today, 13: 52-55 (1992)). También pueden usarse secuencias sintéticas, es decir, que no derivan de un organismo que existe de forma natural. En Alexander y col., Immunity, 1: 751-761 (1994) se discuten ejemplos de epítopos sintéticos de amplio espectro para células T.

Los plásmidos de esta invención pueden codificar una diversidad de proteínas CETP no endógenas o fragmentos de las mismas, como el toxoide tetánico, particularmente los péptidos del toxoide tetánico con las secuencias aminoacídicas de los aminoácidos 2-15 de ID SEC Nº:7 (la correspondiente secuencia nucleotídica codificante es la de los nucleótidos 13-54 de ID SEC Nº:5) y la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº:10. Otra fuente de epítopos universales o de amplio espectro para células T de utilidad en los plásmidos de esta invención es la toxina diftérica, particularmente los péptidos que tienen las secuencias aminoacídicas de los aminoácidos 271-290, 321-340, 331-350, 351-370, 411-430 y 431-450 de ID SEC Nº:9. Un ejemplo de las correspondientes secuencias nucleotídicas que codifican estos epítopos de amplio espectro para células T de la toxina diftérica son los nucleótidos 811-870, 961-1020, 991-1050, 1051-1110, 1231-1290 y 1291-1350 de ID SEC Nº:8, respectivamente. Otras fuentes de epítopos universales o de amplio espectro para células T que pueden ser codificados en plásmidos de esta invención incluyen, pero no se limitan a, la cadena invariante asociada a la clase II del MHC; hemaglutinina; hemocianina de lapa californiana (KLH); una proteína de vacunas conocidas incluyendo la vacuna contra la tos ferina, la vacuna contra la tuberculosis de bacilos de Calmette-Guerin (BCG), la vacuna contra la polio, la vacuna contra el sarampión, la vacuna contra las paperas, la vacuna contra la rubeola y un derivado proteico purificado (PPD) de la tuberculina; y también péptidos sintéticos como los descritos por Alexander y col. (1994).

Además, dos o más copias de ADN que codifican el mismo o diversos epítopos universales diferentes para células T auxiliares pueden ligarse entre sí para formar porciones epitópicas para células T auxiliares múltiples o multivalentes de los péptidos de la vacuna de esta invención. Por ejemplo, un plásmido de esta invención puede contener segmentos de ADN que codifican una porción epitópica para células T auxiliares múltiple o multivalente, con una secuencia de aminoácidos de un epítopo para células T auxiliares del TT y con un epítopo para células T auxiliares del DT. La porción de la vacuna con epítopos para células T puede ser continua o puede tener segmentos interpuestos, en el mismo marco de lectura, que codifican la porción epitópica para células B o segmentos (preferentemente no antigénicos) que ligan los epítopos para células T y/o los epítopos para células B.

Un gran número de posibles epítopos para células T podría usarse como la porción epitópica para células T de un polipéptido de fusión inmunogénico codificado en un plásmido de esta invención. Puede usarse una metodología de rutina para identificar estos epítopos adicionales de amplio espectro para células T que se unen a los sitios de presentación antigénica de múltiples moléculas de clase II del MHC (por ejemplo, Raju y col., Eur. J. Immunol., 25: 3207-3214 (1995)). En esta metodología, los epítopos de amplio espectro para células T se identifican obteniendo en primer lugar sangre periférica de individuos que han sido recientemente inmunizados con una proteína de interés, es decir, la proteína de la que se deriva el epítopo para células T. Alternativamente, puede usarse la sangre periférica de individuos que no han sido inmunizados recientemente. Sin embargo, las células T de estos individuos necesitan ser estimuladas con la proteína de interés in vitro para aumentar el número de células T específicas para la proteína de interés. No es necesario conocer la identidad de una proteína de interés tal para obtener un epítopo para células T de utilidad en esta invención. Es suficiente si una proteína puede aislarse y purificarse, como por ejemplo, por extracción de una banda de la proteína de un gel de poliacrilamida después de una electroforesis. Los péptidos de una proteína de interés se preparan, por ejemplo, por proteolisis limitada o, si se conoce la secuencia de aminoácidos de la proteína, sintetizando, por procedimientos estándar, polipéptidos solapantes de al menos cinco, y preferentemente aproximadamente veinte, aminoácidos de longitud. Un grupo preferido de individuos usados como fuente de sangre periférica para esta metodología es un grupo de individuos que han sido recientemente inmunizados con una vacuna profiláctica conocida, como las vacunas contra tétanos, difteria o influenza, que contienen una o varias proteínas que pueden seleccionarse como la proteína de interés para derivar un epítopo para células T de utilidad. Cada péptido de la proteína de interés se cocultiva individualmente con linfocitos de sangre periférica, purificados de la sangre periférica de cada individuo del grupo. Las células que presentan los antígenos en cada cultivo se unirán a ciertos péptidos a través de sus moléculas de clase II del MHC y expondrán éstas en su superficie celular. Las células T CD4+ en el cultivo se unirán a un subgrupo de estos péptidos unidos a la clase II del MHC y formarán consiguientemente el complejo terciario MHC:epítopo para células T:receptor antigénico de células T, necesario para activar las células T e inducir la proliferación. La proliferación se detecta por inorporación estándar de ^{3}H-timidina en el ADN. Los cultivos que muestran proliferación en este ensayo indican que el péptido cocultivado con las células contenía un epítopo para células T auxiliares. Un péptido que estimula la proliferación de los linfocitos de la sangre periférica de múltiples individuos es un candidato de epítopo de amplio espectro para células T de utilidad en esta invención. La secuencia de aminoácidos de un péptido tal puede determinarse por análisis estándar de secuencia de aminoácidos. Se prepara una molécula de ADN codificante del péptido, la cual codifica el péptido. Si todavía no se dispone de una molécula de ADN codificante del péptido, la secuencia de ADN puede deducirse usando el código genético y dicha molécula de ADN con una secuencia nuceotídica codificante del péptido puede sintetizarse por procedimientos estándar de síntesis de ADN u obtenerse de un proveedor comercial. Después, la molécula de ADN se inserta en un plásmido de esta invención, en el mismo marco de lectura que la secuencia que codifica la porción epitópica para células B de la proteína de fusión inmunogénica (véase a continuación).

Epítopos para células B de la CETP

La porción epitópica para células B del polipéptido de fusión inmunogénico codificada por los plásmidos de ADN de esta invención comprende al menos un epítopo para células B de la CETP, preferentemente la CETP endógena del sujeto vertebrado que se va a inmunizar. Es deseable y preferible el uso de al menos dos epítopos para células B, porque esto aumenta la probabilidad de que los diversos autoanticuerpos producidos en respuesta a la expresión de la vacuna de ADN in vivo sean capaces de unirse al menos a dos epítopos distintos en cada molécula de CETP y de potenciar así la formación de complejos inmunitarios, lo que conduce a una eficiente eliminación de las moléculas de la proteína CETP de la circulación.

Los epítopos para células B de utilidad en esta invención pueden ser tan pequeños como 5 a 8 restos de aminoácidos consecutivos de la secuencia completa de aminoácidos de la CETP. Los plásmidos de ADN descritos en este documento contienen una secuencia de ADN que codifica una porción epitópica para células B de la CETP de al menos 15, y preferentemente, 30-48 nucleótidos de longitud. Los epítopos para células B de la CETP preferidos para el uso en vacunas humanas estarán codificados, individualmente, por al menos una secuencia de 15 nucleótidos de la secuencia codificante de la CETP (véase por ejemplo, ID SEC Nº:1, que codifica CETP madura (conejo); ID SEC Nº:3, que codifica CETP madura (humana)), o secuencias degeneradas de las mismas que codifican el mismo epítopo. Debe considerarse que se han descubierto alelos del gen de la CETP de conejo y que, consiguientemente, podrían anticiparse para el gen humano (véase Nagashima y col., J. Lipid Res., 29: 1643-1649 (1988); Kotake y col., J. Lipid Res., 37: 599-605 (1996)). Los epítopos para células B pueden estar presentes en orden o separados por segmentos interpuestos en el mismo marco de lectura que codifican el(los) epítopo(s) para células T o péptidos ligadores (preferentemente no antigénicos) de uno o varios aminoácidos. Por supuesto, la longitud real de la secuencia de ADN que codifica la porción epitópica para células B depende de la longitud de los epítopos para células B concretos seleccionados de la CETP.

Aunque la secuencia de ADN que codifica la porción epitópica para células B del polipéptido de fusión inmunogénico puede codificar dos o más epítopos para células B de la CETP, existen varias razones por las que la secuencia de ADN no deberá codificar la secuencia completa de aminoácidos de la CETP madura circulante. Por ejemplo, el uso de sólo parte de la secuencia codificante estructural completa de la CETP limita la probabilidad de producir anticuerpos que pudieran presentar reacciones cruzadas con otras proteínas propias. Además, el uso de sólo parte de la secuencia codificante estructural completa de la CETP es un modo de evitar la producción de una proteína o fragmento de la CETP potencialmente funcional, es decir, que pudiera presentar actividad de transferencia de CE y/o TG y, por tanto, aumentar la actividad general de la CETP en el individuo vacunado. El uso de sólo parte de la secuencia codificante completa de la CETP reduce también el riesgo de provocar respuestas autoinmunitarias mediadas por células. Si una región de la CETP o incluso un epítopo para células B de la CETP concreto incluye también un epítopo para células T puede determinarse fácilmente mediante el análisis del epítopo para células B o de la región de la CETP en un ensayo de células T citotóxicas o de proliferación (véase por ejemplo, Current Protocols in Immunology, (Coligan y col., eds.) (John Wiley & Sons, Nueva York, 1994) pp. 3.11.4-3.11.7 y 3.12.9-3.12.14).

Los 26 aminoácidos carboxiterminales de la CETP humana están implicados en la actividad de transferencia de lípidos neutros (Swenson y col., J. Biol. Chem., 264: 14318-14326 (1989)). En particular, una secuencia de 13 aminoácidos (Phe-463 hasta Leu-475 en la CETP humana, ID SEC Nº:4; aminoácidos Phe-483 hasta Leu-495 en la CETP de conejo, ID SEC Nº:2) y posiblemente también Asp-460 (humana) (Asp-480, conejo) son especialmente importantes para la unión y para la actividad de transferencia de los lípidos neutros (Wang y col., J. Biol. Chem., 268: 1955-1959 (1993); Wang y col., J. Biol. Chem., 267: 17487-17490 (1992)). Ya se ha demostrado que esta región es inmunogénica como epítopo para células B de la CETP y que un anticuerpo monoclonal (TP2) dirigido contra esta región inhibe la transferencia de los lípidos neutros. Por consiguiente, en una realización preferida, un plásmido usado como vacuna de ADN de utilidad en humanos comprende una secuencia de ADN que codifica el epítopo para células B de la CETP definido por la secuencia de aminoácidos de Phe-461 a Ser-476 o Phe-463 a Leu-475 de la CETP madura humana (véase ID SEC Nº:4).

Una secuencia de ADN que codifica un segundo epítopo para células B de la CETP está definida por la secuencia de aminoácidos de Leu-349 y Ile-367 de la CETP humana (ID SEC Nº:4) (correspondiente secuencia de aminoácidos de conejo Arg-350 a Ile-368 de ID SEC Nº:2). En realizaciones preferidas, este ADN que codifica este epítopo se incluye en la secuencia codificante estructural del polipéptido inmunogénico para producir in vivo una segunda especie de anticuerpos, específica para un segundo epítopo de la CETP. Los anticuerpos contra un segundo epítopo permitirán la formación de complejos inmunitarios que incluyan a la CETP y que por consiguiente potencien la retirada (eliminación) de la CETP complejada. Este péptido se seleccionó por su antigenicidad potencial y alta probabilidad de expresión superficial en la CETP nativa.

Otros epítopos para células B de la CETP apropiados podrían seleccionarse, por ejemplo, basados en sitios de unión de anticuerpos definidos previamente (véase por ejemplo, Roy y col., Lipid Res., 37: 22-34 (1996)) o por análisis de la secuencia de aminoácidos en cuanto a motivos estructurales asociados con una propensión al reconocimiento por anticuerpos.

Secuencias de control de la transcripción y la replicación

Los plásmidos de ADN de esta invención deben contener las secuencias de ADN necesarias para permitir un nivel de expresión in vivo de los polipéptidos de fusión inmunogénicos suficiente para provocar la producción de autoanticuerpos reactivos contra la CETP endógena. Por tanto, el plásmido de ADN según la presente invención comprende: la secuencia codificante estructural de un polipéptido de fusión inmunogénico que comprende una secuencia de ADN que codifica al menos un epítopo para células T y una secuencia de ADN que codifica al menos un epítopo para células B de la CETP, como se ha descrito anteriormente, y una secuencia promotora o promotora/potenciadora para dirigir la transcripción de la secuencia codificante estructural del polipéptido de fusión inmunogénico. En algunos casos puede ser deseable, como se ha descrito anteriormente, incluir secuencias codificantes de uno o varios aminoácidos adicionales, por ejemplo, para espaciar las porciones epitópicas, para destruir neoepítopos creados sin intención, formados por la yuxtaposición de los epítopos para células T y/o epítopos para células B seleccionados, para insertar sitios de corte proteolítico, etc. También puede ser deseable incluir un origen de replicación bacteriano y un marcador(es) seleccionable(s), por ejemplo, para facilitar la producción de grandes cantidades de la vacuna plasmídica en un cultivo bacteriano.

La transcripción de la secuencia codificante estructural de la proteína de fusión inmunogénica está bajo el control de una secuencia promotora y de una secuencia potenciadora. Se conoce una diversidad de secuencias promotoras y potenciadoras que pueden evaluarse para esta finalidad de acuerdo con el ejemplo 1, a continuación. Las secuencias promotoras/potenciadoras que pueden usarse en los plásmidos de esta invención incluyen, pero no se limitan a, la secuencia promotora/potenciadora de CMV, la secuencia promotora/potenciadora de adenovirus y la secuencia promotora/potenciadora de \beta-actina. En una realización preferida, la secuencia promotora y potenciadora es la secuencia del promotor/potenciador inmediato temprano de CMV. Si un promotor/potenciador concreto es más o menos útil que otra secuencia promotora/potenciadora en los plásmidos de esta invención, puede determinarse por comparación de la capacidad del promotor/potenciador evaluado, analizando si el promotor/potenciador permite la expresión de un gen indicador estándar, como luciferasa o \beta-galactosidasa, y la producción de un anticuerpo reactivo contra el indicador expresado en un modelo animal para expresión génica, como conejos o ratones. Generalmente, cuanto mayor sea el nivel de expresión del producto del gen indicador y/o mayor sea el nivel de producción de anticuerpos reactivos contra el producto expresado por el gen indicador, tanto mayor será la utilidad de este promotor/potenciador concreto para dirigir la transcripción de la secuencia codificante estructural de la proteína de fusión inmunogénica en los plásmidos usados como vacunas de ADN.

Procedimientos de administración de una vacuna de ADN

Las vacunas basadas en plásmidos según la invención pueden administrarse de cualquier forma convencional. Los procedimientos apropiados incluyen, por ejemplo, la administración directa del ADN plasmídico mediante inyección intramuscular, inyección intradérmica o microproyectiles recubiertos con ADN. La cantidad de vacuna administrada dependerá ampliamente según el procedimiento de administración, el tejido (por ejemplo, músculo esquelético, piel) en el que se administra la vacuna, el título de anticuerpos anti-CETP deseado, las necesidades terapéuticas particulares del sujeto que va a ser inmunizado, etc. Unas cantidades muy elevadas de la vacuna de ADN, del orden de 10 mg/kg de peso corporal, pueden administrarse por inyección en el tejido muscular, mientras que con microproyectiles recubiertos es posible usar mucha menos vacuna. La dosis de la vacuna y el protocolo de inmunización deberán calibrarse para obtener una respuesta beneficiosa, lo que puede medirse de diversos modos, dependiendo del planteamiento clínico, por ejemplo, midiendo el cambio en el perfil lipoproteico (por ejemplo, aumento de la relación HDL/LDL), el título de anticuerpos anti-CETP, la concentración de CETP en el suero, el cambio en la actividad de la CETP, etc.

Los ejemplos siguientes se ofrecen para ilustrar la invención descrita en este documento. Estos ejemplos no pretenden limitar de ningún modo el alcance de la invención.

Ejemplo I Selección del promotor/potenciador y del derivado del plásmido pCMV-LUC óptimos

Este experimento se diseñó para evaluar la efectividad de varios promotores/potenciadores para expresar un gen indicador (luciferasa) y provocar respuestas inmunitarias, con el fin de seleccionar el mejor para su uso en experimentos de vacunación futuros.

Se construyeron tres plásmidos diferentes, con el gen de la luciferasa expresado bajo el control del promotor/potenciador de \beta-actina, de adenovirus o del promotor/potenciador inmediato temprano de citomegalovirus humano (CMV). Dado que la construcción de CMV (pCMV-LUC) se usó en los experimentos posteriores, los detalles de su construcción se exponen a continuación.

El promotor/potenciador de CMV, con el armazón del vector plasmídico pUC19 que contiene el gen de resistencia a ampicilina (amp^{r}), se escindió del plásmido pCMV\beta (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) por digestión con BamHI. El gen de la luciferasa (LUC), con sitios donante/aceptor de corte y empalme y una señal de poliadenilación derivada de SV40 adyacentes, se generó a partir del vector pGL2-Promoter (Promega Corp., Madison, WI) en un fragmento BamHI como sigue: pGL2 se digirió con HindIII y los extremos se rellenaron con la polimerasa Klenow. Se unieron ligadores BamHI y se digirieron con BamHI. Este fragmento LUC se purificó en gel y se ligó con el fragmento CMV+vector de pCMV\beta. La estructura del plásmido resultante, pCMV-LUC, se confirmó por cartografía de restricción. Véase la figura 1.

La expresión de la luciferasa se confirmó ensayando la actividad de la luciferasa en lisados de células COS transfectadas con las tres construcciones.

Se establecieron cuatro grupos de nueve ratones. Tres de los grupos se inyectaron por vía intramuscular, en ambos cuádriceps, con 50 \mug/cuádriceps de una de las tres construcciones (anterior) en 25 \mul de tampón fosfato salino (PBS). El cuarto grupo de ratones sirvió como control y sólo recibieron dos inyecciones de 25 \mul de PBS. Los animales recibieron un refuerzo igual del mismo plásmido (o de PBS de control) después de 4 semanas y se sangraron a intervalos de aproximadamente 2 semanas. Un ratón de cada grupo se sacrificó en el día 2 y en el día 32 (48 horas después de las inyecciones) para analizar el tejido en cuanto a la producción de luciferasa. Al final del experimento se practicó la eutanasia a los animales con CO_{2} y el tejido del músculo inyectado se ensayó en cuanto a la producción de luciferasa.

Las muestras de tejido de cuádriceps se prepararon por homogenización mecánica del músculo con 400 \mul de tampón de lisis indicador (Promega Corp., Madison, WI). El homogenizado se agitó con vórtex y se centrifugó a alta velocidad y se retiró el sobrenadante. Se añadieron 100 \mul de luciferina de luciérnaga (Promega Corp.) a 20 \mul de sobrenadante. La luz emitida debido a la interacción enzima-sustrato se midió durante 5 segundos en un contador de centelleo Packard Top Count. Se detectó enzima luciferasa activa en las muestras de tejido de los animales inyectados con cualquiera de los tres plásmidos. Sin embargo, los animales inyectados con pCMV-LUC presentaron el más alto nivel de producción de enzima activa (véase la figura 2), y este promotor/potenciador se seleccionó para su uso en los experimentos posteriores. Los valores para los días 2 y 32 se refieren a un sólo animal. En el día 132, cuando los animales restantes fueron sacrificados y se ensayaron los músculos cuádriceps, se detectó una actividad luciferasa significativa en el grupo de CMV, a niveles tan altos o superiores a los detectados en los días 2 y 32. Llama particularmente la atención que se encontrara luciferasa activa en el tejido muscular 132 días después de la inyección de pCMV-LUC. La longevidad de la expresión de la proteína con la construcción pCMV-LUC fue importante para la lógica de usar el promotor/potenciador de CMV para los plásmidos de la vacuna contra CETP descritos a
continuación.

Los anticuerpos contra la luciferasa se detectaron en sangrías tomadas en los días 31 y 45. El ensayo ELISA se realizó como sigue: se adhirió luciferasa biotinilada a una placa recubierta con estreptavidina durante 1 hora y después se lavó con PBS que contenía Tween 20 al 0,05%. El plasma de ratón se diluyó en PBS con BSA al 1% en PBS, se incubó en la placa durante aproximadamente 2 horas y después se lavó. Se añadió el conjugado antirratón de cabra - HRP (anticuerpo de cabra antirratón conjugado con peroxidasa de rábano) y se incubó durante 45 minutos. Después de incubar durante 2 horas a 20ºC en un agitador rotativo y lavar, la reacción se desarrolló con 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD), se detuvo con H_{2}SO_{4} 2N y se leyó a 450 nm. Los anticuerpos contra la luciferasa se detectaron en las sangrías tomadas en los días 31 y 45. Los resultados se presentan gráficamente en la figura 3.

Después de la segunda inyección de plásmido se observó un aumento significativo de la producción de anticuerpos. Este experimento indica que la luciferasa producida por una vacuna basada en un plásmido puede provocar anticuerpos específicos de antígeno. Estos experimentos indicaron que el promotor/potenciador de CMV es efectivo para dirigir la expresión de una proteína inmunogénica in vivo.

Ejemplo II Diseño y construcción de la vacuna plasmídica pCMV-CETP/TT

Se ha identificado que el fragmento de la CETP de conejo correspondiente a los aminoácidos C-terminales 481-496 (véase ID SEC Nº:2) contiene el sitio funcional de unión a lípidos neutros de la CETP de conejo. Este fragmento incluye el epítopo reconocido por TP2, un anticuerpo monoclonal anti-CETP que inhibe la actividad de la CETP (Swenson, T.L. y col., J. Biol. Chem., 264: 14318-14326 (1989)). Un segundo epítopo de la CETP de conejo (aminoácidos 350-368 de ID SEC Nº:2) se seleccionó para la vacuna basada en un plásmido, con el fin de provocar anticuerpos contra un segundo epítopo que permitan la formación de complejos inmunitarios que incluyan la CETP y por consiguiente estimulen la eliminación de la CETP en el complejo inmunitario. Este epítopo se seleccionó por su antigenicidad potencial y alta probabilidad de expresión superficial en la CETP nativa.

Como porción epitópica para células T se seleccionó una secuencia del toxoide tetánico reconocida como casi universalmente antigénica (Panina-Bordignon, P. y col., Eur. J. Immunol., 19: 2237-2242 (1989)). Este epítopo del TT ha sido usado con éxito en la generación de una respuesta de anticuerpos autoinmunitaria a la hCG (Talwar, G.P. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 8532-8536 (1994)). Se esperaría que fuera también particularmente efectivo en vacunas administradas a sujetos vacunados previamente con el toxoide tetánico.

Se sintetizó una serie de cuatro oligonucleótidos que codificaban los epítopos del TT y de la CETP, así como un resto iniciador de metionina, una secuencia de Kozak del lado 5' (para una traducción eficiente), un codón de parada (STOP), y sitios NotI flanqueantes para clonación. Los oligonucleótidos se alinearon y extendieron con polimerasa de ADN. Véase la figura 4.

El producto bicatenario se digirió con NotI y se purificó en gel para aislar el inserto CETP/TT siguiente:

1

En el inserto anterior, la cadena codificante es ID SEC Nº:5, la cadena antisentido es ID SEC Nº:6, la secuencia de aminoácidos es ID SEC Nº:7. El inserto se representa también en la figura 5.

El plásmido pCMV\beta (Clontech Laboratoires) se digirió con NotI para generar un fragmento que contenía el promotor/potenciador de CMV en un armazón de pUC19, con el gen de resistencia a ampicilina (amp^{r}). Este fragmento incluye también sitios donante/aceptor de corte y empalme y una señal de poliadenilación derivada de SV40 flanqueando el sitio de inserción NotI. El inserto CETP/TT sintetizado se ligó al fragmento CMV+vector de pCMV\beta. Los plásmidos se recuperaron por transformación bacteriana y los insertos se confirmaron por secuenciación de ADN.

Ejemplo III Vacunación de conejos con los plásmidos pCMV-LUC y pCMV-CETP/TT

Se diseñó un experimento que empleaba un modelo de conejo para aterosclerosis (Daley y col., Arterioscl. Thromb., 14: 95-104 (1994)), para analizar si una vacuna de ADN basada en un plásmido según esta invención rompería la tolerancia frente a la CETP endógena, resultando en la producción de anticuerpos reactivos contra la CETP endógena y/o en la inhibición del desarrollo de lesiones ateroscleróticas en la aorta de conejo. Se inmunizaron conejos blancos de Nueva Zelanda (n = 8) con los dos plásmidos pCMV-LUC y pCMV-CETP/TT y se monitorizaron en cuanto a la producción de anticuerpos antiluciferasa y anti-CETP, así como en cuanto a la capacidad de inhibir la progresión de aterosclerosis al someterlos a dietas aterogénicas, es decir, dietas suplementadas con cantidades de colesterol que se sabe generan lesiones ateroscleróticas definidas y extensas en conejos de control (Daley y col., idem). El protocolo diario para este experimento empleando 13 conejos se muestra en la figura 6.

Ocho conejos (conejos nº 1 - nº 8) se vacunaron por vía intramuscular en tres puntos en cada cuádriceps con una preparación de una vacuna que constaba de una mezcla a partes iguales de los plásmidos pCMV-CETP/TT y pCMV-LUC en el día 0. El plásmido pCMV-LUC sirvió como un plásmido indicador para permitir un nivel adicional de cuantificación experimental de la expresión de proteínas dependiente de un plásmido y de la producción de anticuerpos contra la proteína expresada, codificada por el plásmido. Específicamente, se tomaron muestras de sangre de los conejos (por ejemplo, 3-5 ml de una vena auricular) una vez a la semana durante 3 semanas, para establecer diversos valores de prevacunación ("presangrías" designadas PRE 1, PRE 2 y PRE 3 en la figura 6). Las muestras de sangre, tomadas después de un ayuno nocturno (aproximadamente 16 horas), se recogieron en EDTA como anticoagulante. Después de la última presangría (PRE 3), cada animal se vacunó con tres inyecciones en cada cuádriceps. Cada una de estas seis inyecciones constó de 50 \mug del plásmido pCMV-LUC y de 50 \mug del plásmido pCMV-CETP/TT en 100 \mul de PBS que contenía una pequeña cantidad de polvo de carbón (para facilitar la excisión del punto de inyección). Cuarenta y ocho horas después de la vacunación se sacrificó un conejo (conejo nº 8) y se le extrajo la sangre y los cuádriceps para su análisis. Todos los animales se sangraron y reforzaron (como anteriormente, excepto porque se usó un colorante azul en lugar de carbón) cuatro semanas (día 28) después de la vacunación primaria. De nuevo, 48 después de la vacunación se sacrificó un conejo (conejo nº 7) y se le extrajo la sangre y los cuádriceps.

Se tomaron muestras de tejido alrededor de las áreas de las marcas de carbón en los cuádriceps de los conejos nº 8 y nº 7, respectivamente, y se prepararon homogenizados de tejido. Mediante el ensayo de la luciferasa descrito anteriormente, se detectó actividad enzimática de luciferasa en el tejido tomado de los puntos de las inyecciones primarias (día 0), como se muestra en la figura 7. Por ejemplo, el tejido muscular sin vacunar dio una señal de fondo de aproximadamente 5,33 cuentas por segundo (cps) en este ensayo (conejo normal en la figura 7). El tejido muscular de un punto de vacunación del conejo nº 8 (punto 3 para el conejo 8 en la figura 7), extraído 2 días después de la vacunación, dio una señal de luciferasa de 125 cps (23,5 veces el fondo) y el tejido muscular de los puntos de vacunación del conejo nº 7, extraídos 30 días después de la vacunación mostraron una señal de luciferasa de 26,7 cps (punto 1 para el conejo 7 en la figura 7, 5 veces el fondo) y 168 cps (punto 3 para el conejo 7 en la figura 7, 31,5 veces el fondo). El hecho de que no todas las muestras de tejido mostraran actividad de luciferasa se debió probablemente a la dificultad de localizar de forma precisa los puntos de deposición del plásmido, a pesar del uso de carbón para marcar los puntos de vacunación. Sin embargo, los datos de las muestras del punto 3 de los conejos nº 8 y nº 7 mostrados en la figura 7 demuestran claramente que esta construcción plasmídica es efectiva como un vector para vacunas (independientemente del inserto) en conejos.

Se tomaron dos muestras de sangre adicionales (SANGRÍAS 3 y 4 en los días 44 y 57, respectivamente en la figura 6) con intervalos de dos semanas. Los animales se vacunaron después tres veces por vía intramuscular con 0,5 ml de una preparación del toxoide tetánico adsorbido en alumbre (Connaught Laboratories, Inc., Swiftwater, PA) en los días 66, 91 y 128 (véase la figura 6). Esto se hizo para determinar si la vacunación tetánica aumenta la eficacia de la vacuna contra la CETP y para reflejar mejor la situación en humanos.

Inicialmente, todos los conejos en este experimento se alimentaron con pienso estándar para conejos. Para inducir la formación de lesiones de tipo aterosclerótico, los conejos se sometieron a una dieta que contenía el 0,25% de colesterol (p/p) o el 0,5% de colesterol (p/p) en los días 99, 112 y 154, como se indica en la figura 6. Se tomaron muestras de sangre adicionales (SANGRÍAS 8-12), y el experimento completo se terminó en el día 220.

Un ensayo ELISA, diseñado para detectar anticuerpos libres en el suero que reconocieran un péptido de la CETP de conejo con una secuencia aminoacídica correspondiente a los aminoácidos 477-496 de la CETP de conejo (aminoácidos 477-496 de ID SEC Nº:2), se llevó a cabo esencialmente como sigue: los pocillos de una placa de 96 pocillos recubierta con estreptavidina se recubrieron con el péptido 477-496 de la CETP biotinilado por incubación de 100 \mul de una disolución del péptido (1,0 \mug/ml en PBS) durante 30 minutos a 1 hora, después se lavaron con 2x PBS con Tween 20 al 0,1%. El plasma de los conejos inmunizados (o el plasma de conejos normales; PCN) se diluyó en PBS con albúmina de suero bovino (BSA) al 1%, se incubó en la placa durante aproximadamente 2 horas y después se lavó. Se añadió el conjugado anticonejo de cabra - HRP (anticuerpo de cabra anticonejo conjugado con peroxidasa de rábano) y se incubó durante aproximadamente 45 minutos en un agitador rotativo. Después del lavado, la reacción se desarrolló con 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD), se detuvo con H_{2}SO_{4} 2N y se leyó espectrofotométricamente a 450 nm utilizando un lector de placas de
ELISA.

Las muestras de plasma de los seis conejos (conejos nº 1 - nº 6), tomadas 57 días después de la vacunación primaria, se diluyeron y ensayaron en cuanto a la producción de anticuerpos reactivos contra el péptido CETP_{477-496}. También se ensayó el plasma de un conejo no inyectado (PCN). Los resultados se representan en la figura 8, indicando una variedad en los niveles de producción de anticuerpo anti-péptido CETP_{477-496} de conejo en el día 57 en los animales vacunados.

También se tomaron muestras de plasma de los conejos nº 2, nº 3, nº 5 y nº 6 en el día 220 y se ensayaron para determinar si los conejos vacunados con pCMV-CETP/TT continuaban produciendo niveles detectables de anticuerpo contra la CETP, como se determinó mediante un ensayo ELISA usando el péptido CETP_{477-496} de conejo. Los pocillos de una placa de 96 pocillos recubierta con estreptavidina se recubrieron con el péptido CETP_{477-496} biotinilado por incubación de 100 \mul de una disolución del péptido (200 ng/ml en PBS) durante 1 hora. La unión inespecífica se evitó mediante incubación con tampón de bloqueo (PBS con BSA al 1% (p/v), leche en polvo desnatada al 1% (p/v), gelatina al 0,5% (p/v), Tritón x-100 al 0,9% y NP-40 al 0,6% (v/v)) durante la noche a 4ºC en un agitador rotativo a 150 rpm, seguido por tres lavados con tampón de lavado (2x PBS con Tween 20 al 0,05% (v/v)). El plasma de los conejos inmunizados (o el plasma de conejos normales, PCN) se diluyó en tampón de bloqueo, se incubó en la placa durante aproximadamente 2 horas y después se lavó. Se añadió el conjugado anticonejo de cabra - HRP y se incubó durante aproximadamente 1 hora en un agitador rotativo. Después del lavado, la reacción se desarrolló con TMB, se detuvo con 50 \mul de H_{2}SO_{4} 2N y se leyó a 450 nm en un lector de placas de ELISA. Los datos del plasma tomado en el día 220 de los cuatro conejos vacunados y del plasma de conejos normales (PCN) se muestran en la figura 9.

Los datos en la figura 9 indican que el plasma del conejo nº 3 contenía claramente anticuerpo detectable contra el péptido CETP_{477-496} de conejo, según este ensayo ELISA. Usando este ensayo ELISA, el plasma del conejo nº 6 también pareció contener algún anticuerpo anti-CETP detectable. Sin embargo, mientras que la señal del plasma del conejo nº 3 fue sustancial, la señal del plasma del conejo nº 6 quedó cerca de la línea de base (véase, por ejemplo, la figura 9). Se interpreta que esta señal indica la presencia de anticuerpos en el conejo nº 3 y probablemente en el conejo nº 6 que reconocen este epítopo de la CETP.

Las muestras de plasma se ensayaron en otro ensayo ELISA diseñado para cuantificar el anticuerpo contra el péptido CETP_{477-496}. Los pocillos de una placa de 96 pocillos recubierta con estreptavidina se recubrieron con el péptido CETP_{477-496} biotinilado por incubación de 100 \mul de una disolución del péptido (1 \mug/ml en PBS) durante 30 minutos hasta toda la noche, y después se lavaron con PBS con Tween 20 al 0,05% (v/v). La unión inespecífica se evitó mediante incubación con tampón de bloqueo (descrito anteriormente) durante 2 horas a temperatura ambiente en un agitador rotativo a 150 rpm, seguido de 4 lavados con tampón de lavado (descrito anteriormente). El plasma de los conejos inmunizados se diluyó en tampón de bloqueo, se incubó en la placa durante 1,5 horas y después se lavó. Se añadió el conjugado anticonejo de cabra - HRP y se incubó durante aproximadamente 1 hora en un agitador rotativo. Después de un lavado, la reacción se desarrolló con 100 \mul de TMB, se detuvo con 50 \mul de H_{2}SO_{4} 2N y se leyó a 450 nm en un lector de placas de ELISA. La concentración de los anticuerpos específicos se estimó usando una curva estándar preparada con inmunoglobulina bioltinilada de conejo a 15 hasta 250 ng/ml.

Los resultados de este ensayo se muestran en la figura 10. De nuevo, la muestra de plasma del conejo nº 3 contuvo claramente anticuerpo detectable reactivo contra el péptido CETP_{477-496}. Sin embargo, este ensayo no detectó anticuerpo reactivo contra el péptido en las muestras de plasma de los conejos nº 2, nº 5 y nº 6. Los conejos sin inmunizar nº 10, nº 12 y nº 13 mostraron una señal de fondo en este ensayo similar a la del conejo nº 2. La muestra de plasma del conejo nº 4 también pareció contener anticuerpo detectable contra la CETP según este ensayo. Sin embargo, el conejo nº 4 se sacrificó según el protocolo en el día 148 (véase la figura 6), mientras que los conejos nº 2, nº 3, nº 5 y nº 6 estuvieron vivos durante todos los 220 días del experimento.

La observación de que hay variación entre los animales en respuesta a la vacuna es coherente con la bibliografía sobre vacunas basadas en plásmidos. Por consiguiente, puede deducirse que la vacuna basada en un plásmido produjo la proteína deseada en una forma humoralmente inmunogénica. Es importante considerar que este ensayo sólo detecta el anticuerpo libre en las muestras de plasma. Los anticuerpos anti-CETP unidos a la CETP endógena (presumiblemente la mayoría) no se detectarán. Además, estos conejos no se habían vacunado previamente con la vacuna antitetánica. Es probable que se eleven los títulos en un individuo que reciba o haya recibido previamente la vacuna antitetánica, como es el caso de muchos adultos humanos que han recibido vacunaciones contra el tétanos.

Como se indica en el protocolo diario de la figura 6, los conejos nº 2, nº 3, nº 5 y nº 6 en este experimento se pasaron de una dieta de pienso básico de conejos a dietas suplementadas con distintas cantidades de colesterol que se sabe producen lesiones de tipo aterosclerótico en conejos (Daley y col., Arterioscler. Thromb., 14: 95-104 (1994)), en los días 99, 112 y 154. Para determinar si la vacuna basada en un plásmido puede afectar al desarrollo de la aterosclerosis, las aortas de estos conejos se examinaron histológicamente en cuanto al desarrollo de lesiones ateroscleróticas. Después de tomar muestras de sangre en el día 220, los conejos nº 2, nº 3, nº 5 y nº 6 se sacrificaron. Se extirparon las aortas completas de cada uno de los cuatro conejos y se colocaron en disolución de fijación (formaldehído al 3,7% v/v). El tejido laxo, la grasa adherida y la adventicia se separaron de las arterias. Después, cada arteria se cortó longitudinalmente, se inmovilizó en forma plana para exponer la superficie íntima (luminal), se tiñó con Sudán IV y después se fotografió. Sudán IV es un colorante soluble en grasa que tiñe las placas ateroscleróticas de la superfície íntima de las arterias. Las aortas teñidas de los conjejos nº 2 y nº 5 revelaron un predomino de lesiones ateroscleróticas a lo largo de la longitud de las aortas y particularmente, en la porción de las aortas de la región torácica. Las aortas de los conejos nº 2 y nº 5 fueron similares a las de los conejos sin vacunar en una dieta aterogénica, suplementada con colesterol (como los conejos nº 10, nº 12 y nº 13). En contraste, las aortas de los conejos nº 3 y nº 6 presentaron una apariencia mucho más suave y más uniforme en la superficie íntima debido a una menor incidencia de lesiones, incluyendo la porción de la aorta de la región torácica.

Para cuantificar la considerable diferencia entre la presencia de lesiones ateroscleróicas en las aortas de los conejos nº 2 y nº 5 y la falta de las mismas en las aortas de los conejos nº 3 y nº 6, se determinó el área superficial de las aortas inmovilizadas y la de las lesiones de las aortas a partir de fotografías por morfometría plana (Daley y col., 1994) usando una tabla digitalizadora con un software asociado (THE MORPHOMETER^{TM}, Woods Hole Educational Associates, Woods Hole, Massachusetts). Se determinó que el porcentaje del área superficial de las aortas cubierta por lesiones fue del 44,8% para el conejo nº 2, del 50,9% para el conejo nº 5, del 14,2% para el conejo nº 3 y del 14,4% para el conejo nº 6.

En resumen, los conejos nº 2 y nº 5 no produjeron un anticuerpo anti-CETP de conejo detectable, como se determinó por ensayo ELISA usando el péptido CETP_{477-496} de conejo, después de 220 días con el protocolo de vacunación descrito anteriormente y mostrado en la figura 6, y estos conejos desarrollaron lesiones ateroscleróticas significativas en la superficie íntima de sus aortas (44,8% y 50,9%, respectivamente) después de ingerir una dieta suplemetada con colesterol durante aproximadamente 17 semanas. En contraste, los conejos nº 3 y nº 6, que probablemente produjeron un anticuerpo anti-CETP de conejo, presentaron considerablemente menos área superficial en sus aortas cubierta con lesiones ateroscleróticas (14,2% y 14,4%, respectivamente), después de aproximadamente 17 semanas con una dieta de elevado colesterol.

Ejemplo IV

Los resultados del experimento anterior usando un modelo de conejo para aterosclerosis indican que las vacunas basadas en plásmidos de esta invención pueden usarse para prevenir o tratar la aterosclerosis en otros vertebrados. Por analogía con el tratamiento para la inhibición de la aterosclerosis en conejos ilustrado en el ejemplo III, pueden prepararse construciones plasmídicas similares para otros vertebrados, incluyendo humanos. Estos plásmidos codifican un polipéptido de fusión inmunogénico que comprende un epítopo universal o de amplio espectro para células T, como el del toxoide tetánico o el del toxoide diftérico, ligados en el mismo marco de lectura a, al menos uno, con mayor preferencia dos, epítopos para células B de la CETP endógena del individuo. Un ejemplo de una vacuna basada en un plásmido para la CETP endógena humana contiene una secuencia de ADN que codifica una metionina para iniciación de la traducción ligada a un polipéptido del TT, como en los nucleótidos 10-54 de ID SEC Nº:5, ligada en el mismo marco de lectura (con o sin secuencias ligadoras interpuestas) a una secuencia de ADN que codifica las regiones de la CETP humana análogas a aquellas usadas en la vacuna basada en un plásmido para la CETP de conejo, como los nucleótidos 1045-1101 y 1381-1428 de ID SEC Nº:3, que codifican los aminoácidos 349-367 y 461-476 de ID SEC Nº:4, respectivamente. Preferentemente, la secuencia de ADN en el plásmido para usar como vacuna contra la CETP endógena humana incluye también regiones como se muestran en la figura 5, como codones de inicio y parada de la transcripción y los sitios para endonucleasas de restricción flanqueantes que se emplean normalmente para la construcción de plásmidos y expresión de genes.

Ejemplo V

En otro aspecto de esta invención, pueden prepararse vacunas basadas en plásmidos en las que un plásmido codifica una porción epitópica universal o de amplio espectro para células T ligada en el mismo marco de lectura a una porción epitópica para células B que comprende uno o varios epítopos para células B de una CETP no endógena. Estos epítopos de vacunación no endógenos para células B codificados por plásmidos de esta invención pueden derivarse de otra especie, otro alelo o no ser de origen natural (es decir, una secuencia sintética); en tales casos, la secuencia de aminoácidos del(os) epítopo(s) de vacunación no endógeno(s) para células B es ligeramente diferente de la secuencia de la CETP endógena del individuo que se va a vacunar. Por ejemplo, un epítopo de vacunación no endógeno para células B que es ligeramente diferente de un epítopo para células B de la proteína CETP endógena, es un epítopo que tiene una secuencia de aminoácidos que difiere de la del correspondiente epítopo para células B de la CETP endógena en unos pocos restos, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5 o 6.

Otro ejemplo de un epítopo de vacunación no endógeno para células B que es ligeramente diferente de un epítopo para células B de una CETP endógena, es un epítopo que contiene uno o varios cambios conservadores en la secuencia de aminoácidos, en uno o varios restos que se sabe son importantes para una actividad de la CETP y/o para la unión de anticuerpos (véase por ejemplo, Hesler y col., J. Biol. Chem., 263: 5020-5023 (1988); Wang y col., J. Biol. Chem., 267: 17487-17490 (1992); Wang y col., J. Biol. Chem., 268: 1955-1959 (1993)), o en uno o varios restos que se sabe difieren en las posiciones análogas de la secuencia de aminoácidos de la CETP codificada por otros alelos o por genes de otras especies (véase por ejemplo, Nagashima y col., J. Lipid Res., 29: 1643-1649 (1988); Kotake y col., J. Lipid Res., 37: 599-605 (1996); Drayna y col., Nature, 327: 632-634 (1987)).

Un ejemplo de una vacuna para humanos basada en un plásmido, que contiene epítopos de vacunación no endógenos para células B, es el plásmido descrito anteriormente, pCMV-CETP/TT, que usa secuencias de ADN que codifican epítopos para células B de la CETP de conejo. Otro ejemplo para uso en humanos es un plásmido similar, en el que los epítopos para células B codificados no se derivan de una especie concreta, sino que son versiones sintéticas ligeramente diferentes de aquellas codificadas por las correspondientes secuencias de ADN de la CETP humana.

Aunque sin el deseo de atarse a ninguna teoría, el uso de uno o varios epítopos de vacunación no endógenos para células B que contienen una secuencia de aminoácidos ligeramente diferente de la de un epítopo para células B de la proteína endógena (es decir, CETP endógena) puede provocar anticuerpos de forma más efectiva que si se emplean los epítopos endógenos para células B. Estos epítopos de vacunación no endógenos para células B (1) provocan la producción de anticuerpos en el individuo vacunado y (2) estos anticuerpos producidos, o un subgrupo de los mismos, se unen a la CETP endógena. Por ejemplo, para analizar si una vacuna basada en un plásmido de esta invención provoca autoanticuerpos contra la CETP en un humano, se vacunan ratones transgénicos para la CETP humana (por ejemplo, disponibles comercialmente, ratones BIODIGM^{TM}-CETP, Pharmakon, USA, Waverly, PA) con una construcción plasmídica según esta invención y se cuantifica la producción de los anticuerpos que reconocen la CETP humana. La cuantificación de los anticuerpos anti-CETP humana se determina fácilmente por diversos procedimientos, incluyendo una inmunotransferencia con suero de un animal vacunado frente a la CETP humana separada por electroforesis; o un ensayo ELISA, en que el suero del animal vacunado se ensaya en cuanto a la capacidad de unirse a la CTP humana o a un fragmento(s) peptídico(s) de la misma; o el aislamiento de la CETP de la sangre de animales vacunados y su ensayo en cuanto a los anticuerpos unidos a la CETP.

Cultivos de células bacterianas (E. coli) con los plásmidos pCMV-LUC y pCMV-CETP/TT preparados como se ha descrito anteriormente se depositaron bajo los términos del Tratado de Budapest el 26 de abril de 1996 en la colección American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD. Se les asignaron los números de acceso 98037 y 98038, respectivamente.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE: Thomas, Lawrence J.

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: VACUNA BASADA EN UN PLÁSMIDO PARA EL TRATAMIENTO DE LA ATEROSCLEROSIS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 10

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(iv): DIRECCIÓN POSTAL

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: Banner & Witcoff, Ltd.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 75 State Street, Suite 2300

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: Boston

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: Massachusetts

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: EEUU

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 02109-1807

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE SOPORTE: disquete

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: WordPerfect 6.1

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD: (aún no asignado)

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 1 de mayo de 1997 (01.05.97)

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SOLICITUD: 08/640713

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 1 de mayo de 1996 (01.05.96)

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS DE LA SOLICITUD PREVIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): SOLICITUD:08/802967

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 21 de febrero de 1997 (21.02.97)

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Leon R. Yankwich

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 30237

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: TCS 414.1 PCT (05872)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1488 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA:

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO:

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA: Secuencia codificante estructural de la CETP madura de conejo

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(x): INFORMACIÓN BIBLIOGRÁFICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): AUTORES: Nagashima, Mariko, y col.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TÍTULO: Cloning and mRNA tissue distribution of rabbit cholesteryl ester transfer protein

\vskip0.500000\baselineskip

(C): REVISTA: J. Lipid Res.

\vskip0.500000\baselineskip

(D): VOLUMEN: 29

\vskip0.500000\baselineskip

(E): NÚMERO:

\vskip0.500000\baselineskip

(F): PÁGINAS: 1643-1649

\vskip0.500000\baselineskip

(G): FECHA: 1988

\vskip0.500000\baselineskip

(K): RESTOS RELEVANTES EN ID SEC Nº:1: DE 1 A 1488

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:1:

\vskip1.000000\baselineskip

2

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 496 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA:

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO:

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Secuencia de aminoácidos de la proteína CETP madura de conejo

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(x): INFORMACIÓN BIBLIOGRÁFICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): AUTORES: Nagashima, Mariko, y col.

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(C): REVISTA: J. Lipid Res.

\vskip0.500000\baselineskip

(D): VOLUMEN: 29

\vskip0.500000\baselineskip

(E): NÚMERO:

\vskip0.500000\baselineskip

(F): PÁGINAS: 1643-1649

\vskip0.500000\baselineskip

(G): FECHA: 1988

\vskip0.500000\baselineskip

(K): RESTOS RELEVANTES EN ID SEC Nº:2: DE 1 A 496

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:2:

\vskip1.000000\baselineskip

4

5

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1428 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA:

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO:

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Secuencia codificante estructural de la CETP madura humana

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(x): INFORMACIÓN BIBLIOGRÁFICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): AUTORES: Drayna, Dennis, y col.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TÍTULO: Cloning and sequencing of human cholesteryl ester transfer cDNA

\vskip0.500000\baselineskip

(C): REVISTA: Nature

\vskip0.500000\baselineskip

(D): VOLUMEN: 327

\vskip0.500000\baselineskip

(E): NÚMERO:

\vskip0.500000\baselineskip

(F): PÁGINAS: 632-634

\vskip0.500000\baselineskip

(G): FECHA: 18-JUNIO-1987

\vskip0.500000\baselineskip

(K): RESTOS RELEVANTES EN ID SEC Nº:3: DE 1 A 1428

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:3:

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7

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 476 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA:

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO:

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Secuencia de aminoácidos de la CETP madura humana

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(x): INFORMACIÓN BIBLIOGRÁFICA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): AUTORES: Drayna, Dennis, y col.

\vskip0.500000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

(C): REVISTA: Nature

\vskip0.500000\baselineskip

(D): VOLUMEN: 327

\vskip0.500000\baselineskip

(E): NÚMERO:

\vskip0.500000\baselineskip

(F): PÁGINAS: 632-634

\vskip0.500000\baselineskip

(G): FECHA: 18-JUNIO-1987

\vskip0.500000\baselineskip

(K): RESTOS RELEVANTES EN ID SEC Nº:4: DE 1 A 476

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:4:

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9

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 169 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA:

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA:

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO:

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:5:

\vskip1.000000\baselineskip

12

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 169 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA:

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO:

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Cadena complementaria de ID SEC Nº:5

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1 a 169

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:6:

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 50 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA:

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO:

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA: Secuencia de aminoácidos del péptido codificado por las bases 10 a 159 de ID SEC Nº:5

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:7:

\vskip1.000000\baselineskip

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1608 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: monocatenaria

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA:

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA:

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO:

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: codón de parada de la traducción

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1606-1608

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:8:

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15

16

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 535 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA:

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO:

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:9:

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18

19

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE ID SEC Nº:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 21 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA:

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO:

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: ID SEC Nº:10:

21

Claims

1. Una vacuna basada en un plásmido de ADN que comprende una secuencia nucleotídica codificante de un polipéptido inmunogénico, la cual, al ser administrada a un sujeto humano o animal, inducirá la producción de autoanticuerpos específicamente reactivos contra la proteína de transferencia de ésteres de colesterol (CETP) endógena del sujeto, en que dicha secuencia nucleotídica comprende: al menos un segmento que codifica un epítopo para células B de la CETP, ligado en el mismo marco de lectura con al menos un segmento que codifica un epítopo universal para células T auxiliares, cuya secuencia nucleotídica está ligada operativamente a una secuencia promotora apropiada para dirigir la transcripción de la secuencia nucleotídica en una célula humana o animal.

2. La vacuna de ADN basada en un plásmido según la reivindicación 1, en la que dicho epítopo para células B comprende una porción de la CETP humana que consta de 5-8 aminoácidos consecutivos de ID SEC Nº:4.

3. La vacuna de ADN basada en un plásmido según la reivindicación 1, en la que dicho epítopo para células B comprende una región carboxiterminal de la CETP, implicada en la unión a lípidos neutros o en la actividad de transferencia de lípidos neutros.

4. La vacuna de ADN basada en un plásmido según la reivindicación 1, en la que el epítopo para células T auxiliares comprende un epítopo para células T auxiliares derivado de un péptido antigénico seleccionado del grupo que consta del toxoide tetánico, la toxina diftérica, la vacuna contra la tos ferina, los bacilos de Calmette-Guerin (BCG), la vacuna contra la polio, la vacuna contra el sarampión, la vacuna contra las paperas, la vacuna contra la rubeola, el derivado proteico purificado de la tuberculina, la hemocianina de lapa californiana y combinaciones de los mismos.

5. La vacuna de ADN basada en un plásmido según la reivindicación 1, en la que el polipéptido inmunogénico incluye dos epítopos para células B de la CETP.

6. La vacuna de ADN basada en un plásmido según la reivindicación 1, en la que dicho, al menos un segmento que codifica el epítopo para células B de la CETP se selecciona entre uno o varios del grupo que consta de:

(a) un segmento de ADN que codifica los aminoácidos 463 a 475 de ID SEC Nº:4,

(b) un segmento de ADN que codifica los aminoácidos 461 a 476 de ID SEC Nº:4, y

(c) un segmento de ADN que codifica los aminoácidos 349 a 367 de ID SEC Nº:4.

7. La vacuna de ADN basada en un plásmido según la reivindicación 5, que incluye un segmento de ADN que codifica los aminoácidos 461 a 476 de ID SEC Nº:4 y un segmento de ADN que codifica los aminoácidos 349 a 367 de ID SEC Nº:4.

8. La vacuna de ADN basada en un plásmido según la reivindicación 1, que incluye un segmento de ADN que codifica los aminoácidos 2 a 15 de ID SEC Nº:7.

9. La vacuna de ADN basada en un plásmido según la reivindicación 1, que comprende la secuencia de aminoácidos de ID SEC Nº:7.

10. Una vacuna de ADN basada en un plásmido según la reivindicación 1, en la que el promotor es el promotor/potenciador inmediato temprano de citomegalovirus.

11. Una vacuna de ADN basada en un plásmido según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia nucleotídica comprende:

(a) la región del promotor/potenciador inmediato temprano de citomegalovirus (CMV), ligada operativamente a

(b) un segmento de ADN estructural que codifica un polipéptido inmunogénico y comprende:

(i): un segmento de ADN que codifica los aminoácidos 2 a 15 de ID SEC Nº:7,

(ii): un segmento de ADN que codifica los aminoácidos 463 a 475 de ID SEC Nº:4 y

(iii): un segmento de ADN que codifica los aminoácidos 349 a 367 de ID SEC Nº:4,

cuyos segmentos de ADN (i), (ii) y (iii) están ligados en el mismo marco de lectura.

12. Una vacuna de ADN basada en un plásmido según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia nucleotídica comprende:

(ii): un segmento de ADN que codifica los aminoácidos 461 a 476 de ID SEC Nº:4 y

13. Una vacuna de ADN basada en un plásmido según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia nucleotídica comprende, ligadas en el mismo marco de lectura, una secuencia nucleotídica que codifica un epítopo universal para células T auxiliares, la secuencia de los nucleótidos 55 a 111 de ID SEC Nº:5 y la secuencia de los nucleótidos 112 a 159 de ID SEC Nº:5.

14. La vacuna de ADN basada en un plásmido según la reivindicación 13, en la que la secuencia nucleotídica comprende la secuencia nucleotídica de ID SEC Nº:5.

15. Una vacuna de ADN basada en un plásmido según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia nucleotídica comprende una secuencia nucleotídica que codifica un epítopo universal para células T auxiliares, la secuencia de los nucleótidos 1045 a 1101 de ID SEC Nº:3 y los nucleótidos 1387 a 1425 de ID SEC Nº:3.

16. Una vacuna de ADN basada en un plásmido según la reivindicación 1, en la que dicha secuencia nucleotídica comprende una secuencia nucleotídica que codifica un epítopo universal para células T auxiliares, la secuencia de los nucleótidos 1045 a 1101 de ID SEC Nº:3 y los nucleótidos 1381 a 1428 de ID SEC Nº:3.

17. Una vacuna de ADN basada en un plásmido como se reivindica en la reivindicación 1, en la que el polipéptido inmunogénico comprende un epítopo para células B del los 26 aminoácidos C-terminales de la CETP humana y un epítopo para células T auxiliares del toxoide tetánico.

18. Una vacuna de ADN basada en un plásmido como se reivindica en la reivindicación 1 para uso como medicamento.

19. Una vacuna de ADN basada en un plásmido como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 2-17 para uso como medicamento.

20. Una vacuna de ADN basada en un plásmido como se reivindica en la reivindicación 18 o la reivindicación 19 para uso como medicamento para elevar la relación de las HDL circulantes a las LDL, VLDL circulantes o colesterol total en un humano u otro animal.

21. Una vacuna de ADN basada en un plásmido como se reivindica en la reivindicación 18 o la reivindicación 19 para uso como medicamento para reducir el nivel de actividad de la CETP endógena en un humano u otro animal.

22. Una vacuna de ADN basada en un plásmido como se reivindica en la reivindicación 18 o la reivindicación 19 para uso como medicamento para provocar la producción de anticuerpos anti-CETP en un humano o animal.

23. Una vacuna de ADN basada en un plásmido como se reivindica en la reivindicación 18 o la reivindicación 19 para uso como medicamento para aumentar el nivel de las HDL circulantes en un humano o animal.

24. Una vacuna de ADN basada en un plásmido como se reivindica en la reivindicación 18 o la reivindicación 19 para uso como medicamento para el tratamiento terapéutico o profiláctico de la enfermedad cardiovascular en un humano u otro animal.

25. Una vacuna de ADN basada en un plásmido para uso como medicamento como se reivindica en la reivindicación 24, en la que la secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido inmunogénico comprende la secuencia de ADN de los nucleótidos 55 a 111 de ID SEC Nº:5 y los nucleótidos 112 a 159 de ID SEC Nº:5.

26. Una vacuna de ADN basada en un plásmido para uso como medicamento como se reivindica en la reivindicación 24, en la que el segmento de ADN comprende la secuencia nucleotídica de ID SEC Nº:5.

27. Una vacuna de ADN basada en un plásmido para uso como medicamento como se reivindica en la reivindicación 24, en la que la secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido inmunogénico comprende la secuencia de ADN de los nucleótidos 1045 a 1101 de ID SEC Nº:3 y los nucleótidos 1387 a 1425 de ID SEC Nº:3.

28. Una vacuna de ADN basada en un plásmido para uso como medicamento como se reivindica en la reivindicación 24, en la que la secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido inmunogénico comprende la secuencia de ADN de los nucleótidos 1045 a 1101 de ID SEC Nº:3 y los nucleótidos 1381 a 1428 de ID SEC Nº:3.

29. Uso de una vacuna de ADN basada en un plásmido como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 en la fabricación de un medicamento para inducir la producción en un humano o animal de autoanticuerpos específicamente reactivos contra la CETP endógena de dicho humano o animal, y elevar la relación de las HDL circulantes a las LDL, VLDL circulantes o colesterol total en dicho humano o animal.

30. Uso de una vacuna de ADN basada en un plásmido como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 en la fabricación de un medicamento para inducir la producción en un humano o animal de autoanticuerpos específicamente reactivos contra la CETP endógena de dicho humano o animal, y reducir el nivel de actividad de la CETP endógena en dicho humano o animal.

31. Uso de una vacuna de ADN basada en un plásmido como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 en la fabricación de un medicamento para inducir la producción en un humano o animal de anticuerpos específicamente reactivos contra la CETP endógena de dicho humano o animal.

32. Uso de una vacuna de ADN basada en un plásmido como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 en la fabricación de un medicamento para inducir la producción en un humano o animal de autoanticuerpos específicamente reactivos contra la CETP endógena de dicho humano o animal, y aumentar el nivel de las HDL circulantes en dicho humano o animal.

33. Uso de una vacuna de ADN basada en un plásmido como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 en la fabricación de un medicamento para inducir la producción en un humano o animal de autoanticuerpos específicamente reactivos contra la CETP endógena de dicho humano o animal, y el tratamiento terapéutico o profiláctico de la enfermedad cardiovascular en dicho humano o animal.