ES2439703T3 - Tratamiento de la aterosclerosis - Google Patents

Abstract

Compuesto que comprende la secuencia aminoácida FGFPAHVFIDWLQSLS o FGFPAHVYIDWLQSLS oFGFPAHVFIDWLQSLN para su utilización en la prevención y/o el tratamiento de la aterosclerosis, enfermedadoclusiva arterial periférica, enfermedad cardiaca coronaria o lesión cerebral apopléjica.

Description

Tratamiento de la aterosclerosis.

5 La invencion se refiere a la prevencion y al tratamiento de la aterosclerosis, de las enfermedades con un riesgo aterosclerotico y a las secuelas ateroscleroticas. Las secuelas ateroscleroticas, como la enfermedad de oclusion arterial periferica, la coronaria cardiaca, asi como la lesion cerebral apoplejica, se encuentran todavia entre las causas principales de muerte en Europa, Estados Unidos y en gran parte de Asia. El desarrollo de la aterosclerosis se considera como una inflamacion progresiva cronica de la pared de los vasos arteriales, que se caracteriza por una interaccion compleja de factores de crecimiento, citocinas e interacciones celulares. Segun la hipotesis "respuesta a la lesion", la lesion del endotelio constituye el evento inicial de la enfermedad, que conduce a una disfuncion endotelial, que propicia una cascada de interacciones

15 celulares que culmina en la formacion de las lesiones ateroscleroticas. Como factores de riesgo que promueven dicho dano, se mencionan influencias exogenas y endogenas que se correlacionan de modo estadisticamente significativo con la aterosclerosis. El aumento y la modificacion del LDL Lp(a), la hipertension arterial, la diabetes mellitus y la hiperhomocisteinemia, por ejemplo, se cuentan entre los factores mas importantes que danan el endotelio ya que el endotelio no constituye una barrera rigida, sino una extremadamente dinamica, teniendo lugar durante el curso de la disfuncion endotelial diversos cambios moleculares ademas de un aumento en la permeabilidad para las lipoproteinas, presentando dichos cambios moleculares una influencia decisiva sobre la interaccion de monocitos, linfocitos T y celulas endoteliales. La adhesion de monocitos y linfocitos T tiene lugar en la luz del vaso, por la expresion de moleculas de adhesion endotelial del tipo de las selectinas E, L y P, integrinas, ICMA-1, VCAM-1 y la molecula 1 de adhesion celular endotelial-plaquetaria. La migracion subsiguiente de los

25 leucocitos sobre el endotelio, esta mediada por MCP-1, interleucina-8, PDGF, M-CSF y osteopontina. Mediante el receptor denominado "de barrido", los macrofagos y monocitos que residen en la intima pueden tomar las particulas LDL que han penetrado y depositarlas como vacuolas de esteres de colesterol en el citoplasma. Las celulas espumosas formadas de esta forma se agrupan principalmente en grupos en la region de la intima del vaso y forman las lesiones veteadas que se presentan ya en la infancia. Las LDL son lipoproteinas de baja densidad y estan formadas por los efectos catabolicos de enzimas lipoliticos a partir de las particulas VLDL ricas en trigliceridos. Ademas de sus propiedades daninas sobre las celulas endoteliales y las celulas lisas musculares de la lamina media, LDL posee un efecto quimiotactico sobre los monocitos y puede aumentar la expresion de MCSF y MCP-1 de las celulas endoteliales mediante la amplificacion genica. Contrariamente a LDL, HDL puede tomar esteres de colesterol de los macrofagos cargados, mediante la apolipoproteina E, bajo la formacion de los complejos

35 denominados dic. Mediante la interaccion de los receptores SR-B1, estas particulas cargadas de esteres de colesterol pueden unirse a hepatocitos o a celulas del cortex adrenal y entregar colesterol para la produccion de acidos biliares y esteroides, respectivamente. Este mecanismo se denomina transporte inverso del colesterol y dilucida la funcion protectora del HDL. Los macrofagos activados pueden presentar antigenos via HLA-DR y por tanto, activar los linfocitos CD4 y CD8 que, consecuentemente, son estimulados a secretar citocinas, tales como IFN-gamma y TNF-alfa, y ademas, contribuir a aumentar la reaccion inflamatoria. En el curso posterior de la enfermedad, las celulas lisas musculares de la lamina media empiezan a crecer en la region de la intima que ha sido alterada por la inflamacion. Por esto, se forma en este estadio la lesion intermediaria. Iniciandose en la lesion intermediaria, se desarrollara en el tiempo la lesion progresiva y complicada, que se caracterizara morfologicamente por un nucleo necrotico, detritus celulares y un casquete fibrinoso rico en colageno en el lado de la luz del vaso. Si el

45 numero de celulas y la parte de los lipidos aumenta continuamente, se producen roturas en el endotelio, quedando expuestas las superficies con propiedades tromboticas. Debido a la adhesion y activacion de trombocitos en estas roturas, se liberaran granulos que contienen citoquinas, factores de crecimiento y trombina. Los enzimas proteoliticos de los macrofagos son responsables del adelgazamiento del casquete fibrinoso que, por lo menos, llevara a una ruptura de las placas, con posterior trombosis y estrechamiento de los vasos y una isquemia aguda de los vasos terminales. Varios factores de riesgo son responsables en la formacion de las lesiones ateroescleroticas. La hiperlipoproteinemia, la hipertension arterial y el abuso de la nicotina tienen un significado particular a este respecto. Una patologia que implica un aumento excesivo en el colesterol LDL y total, es la hipercolesterolemia familiar (FH).

55 Pertenece a las enfermedades metabolicas mas frecuentes que se heredan monogeneticamente. La forma heterocigotica moderada se presenta con una frecuencia de 1:500, y la homocigotica, del 1:1 millones, mas raramente, de forma clara. Las causas de la hipercolesterolemia familiar son mutaciones en el gen receptor LDL en el brazo corto del cromosoma 19. Estas mutaciones pueden ser deleciones, inserciones o mutaciones puntuales. El hallazgo caracteristico de las lipoproteinas en la hipercolesterolemia familiar es un aumento en el colesterol LDL y total en las concentraciones la mayor parte normales de VLDL y trigliceridos. A menudo el HDL disminuye. Fenotipicamente, existe una hiperlipoproteinemia de tipo IIAa. En la forma heterocigotica, el colesterol total aumenta de 2 a 3 veces, y en la homocigotica, de 5 a 6 veces, comparado con el nivel normal. Clinicamente, la hipercolesterolemia familiar se manifiesta por una temprana esclerosis coronaria. Habitualmente, en los hombres heterocigoticos, los primeros sintomas de una patologia cardiaca coronaria (CHD) se presentan entre los 30 y 40

65 anos de edad. En las mujeres, como promedio, 10 anos despues. El 50% de los hombres afectados mueren debido a las consecuencias de su esclerosis coronaria antes de los 50 anos de edad. Ademas de los niveles masivamente

aumentados de LDL, tambien una disminucion de las concentraciones de HDL son responsables de un rapido progreso de la aterosclerosis. Los cambios ateroscleroticos pueden hacerse manifiestos tambien en los vasos extracardiacos, tales como la aorta, las arterias carotidas y las perifericas. Con la forma homocigotica de la enfermedad, la esclerosis coronaria se desarrolla ya a edad temprana. El primer infarto miocardico tiene lugar a menudo antes de los 10 anos de edad, y en la mayoria de los casos, las personas afectadas mueren antes de que alcancen los 20 anos. El desarrollo de xantomas esta en funcion del nivel serico del colesterol y de la duracion de la enfermedad. Aproximadamente, el 5% de los individuos heterocigoticos que sufren la enfermedad que tienen mas de veinte anos, muestran xantomas tendinosos. Los individuos homocigoticos tienen xantomas dermicos y tendinosos en casi el 100%. Pueden tambien presentarse depositos lipidicos en los parpados y en la cornea (xantelasmas, Arcus lipoides). Estos, sin embargo, no constituyen un sintoma especifico de una hipercolesterolemia, ya que se encuentran tambien con niveles normales de colesterol. Ademas, con FH, se presentan frecuentemente artritis aguda y tendosinovites. Las lipoproteinas individuales difieren con respecto a tamano y densidad, ya que contienen partes voluminosas de forma diferente de lipidos y proteinas, denominadas apoproteinas. La densidad aumenta con porciones proteicas que se incrementan y de lipidos que disminuyen. Debido a sus densidades distintas, pueden separarse en diferentes fracciones mediante ultracentrifugacion. Esto constituye la base para la clasificacion de las lipoproteinas en sus grupos principales: quilomicrones, lipoproteinas de muy baja densidad (VLDL), lipoproteinas de densidad intermedia, (IDL), lipoproteinas de baja densidad (LDL), lipoproteinas de alta densidad (HDL), lipoproteinas (a) (Lp(a)). Entre las lipoproteinas con un alto potencial aterogenico se encuentran en primer lugar LDL, Lp(a) y VLDL. LDL posee una densidad de aproximadamente d=1.006-1.063 g/ml. El nucleo esta formado por moleculas de colesterol esterificado. Este nucleo altamente hidrofobo esta rodeado por una envoltura de fosfolipidos, colesterol no esterificado y una unica molecula Apo B-100. Ademas, la Apoproteina E se encuentra en la superficie de las particulas LDL. La funcion de LDL consiste en transportar colesterol a los tejidos perifericos donde mediante la intervencion de la apoproteina B100 es tomado por las celulas via el receptor de LDL. En estados epidemiologicos globales, pudo demostrarse una correlacion positiva entre el nivel del colesterol serico y la presentacion de una patologia cardiaca coronaria. Los niveles de colesterol LDL superiores a 160 mg/dl constituyen un alto riesgo cardiovascular. Ademas del nivel del colesterol LDL, tambien ejerce un papel importante el nivel del colesterol HDL protector del vaso, cuando se evalua el perfil de riesgo para las enfermedades cardiovasculares. Los niveles inferiores a 35 mg/dl se asocian con un aumento del riesgo. VLDL son lipoproteinas con baja densidad (d=0,94-1.006 g/ml) y una parte alta en trigliceridos. Sustancialmente, VLDL contienen apoproteina C, y pequenas porciones de apoproteinas B-100 y E. De forma distinta a los quilomicrones, VLDL no consisten en lipidos alimentarios, si no que se sintetizan en el higado a partir de trigliceridos formados endogenamente y secretados a la circulacion. Como con los quilomicrones, los trigliceridos son hidrolizados por la apoproteina C-II, y los acidos grasos libres son suministrados al musculo y al tejido graso. Los restos de VLDL ricos en colesterol que permanecen, se denominan lipoproteinas de densidad intermedia, a causa de su densidad mas alta. La lipoproteina (a) (Lp(a)) posee una densidad de 1,05 a 1,12 g/ml y se parece a LDL en su composicion. Ademas, la apoproteina B-100, su porcion proteica, consiste en la apoproteina (a), que es caracteristica de Lp(a). Hasta la fecha, se conoce muy poco acerca de la fisiologia y funcion de Lp(a), ya que la molecula de apoproteina (a) posee una alta homologia secuencial con el plasminogeno, se asume que Lp(a), promueve tanto la formacion de trombos sobre las placas ateroscleroticas, como posee un efecto aterogenico. Lp(a) se encuentra junto con apoproteina B en las lesiones ateroscleroticas. Los estudios retrospectivos han mostrado una correlacion entre el aumento de Lp(a) y CHD. Igualmente, el metaanalisis de numerosos estudios de prospeccion ha mostrado que Lp(a) constituye un factor de riesgo independiente para que se produzca un CHD. Los niveles de entre 15 y 35 mg/dl se consideran normales, no pudiendo Lp(a) ser influenciado ni por la dieta ni por medicamentos. Por tanto, las medidas terapeuticas estan restringidas a reducir ulteriormente los factores de riesgo. En particular, una bajada del colesterol LDL parece disminuir el riesgo cardiovascular de Lp(a). En la patogenesis de la aterosclerosis, se atribuye ademas, una importancia patofisiologica considerable, a los factores de coagulacion. Los hallazgos epidemiologicos sugieren una correlacion entre la concentracion de fibrinogeno en el plasma y el desarrollo de una enfermedad cardiaca coronaria, y, de forma primaria, un infarto miocardico. En este contexto, niveles aumentados (> 300 mg/dl) mostraron ser un indicador independiente y un factor de riesgo para las enfermedades cardiovasculares. Tambien, todavia, altas concentraciones del inhibidor tPA-I del activador del plasminogeno tisular, estan asociadas con la presencia de CHD. La relacion entre la hipertrigliceridemia y el riesgo coronario es diferente en cada caso, dependiendo de la causa de la elevacion de los lipidos sanguineos. A pesar de la discusion de si los trigliceridos tienen que considerarse o no como un factor independiente de riesgo, es indiscutible que juegan un papel importante en la patogenesis de las enfermedades cardiacas coronarias. La incidencia de la enfermedad es la mas alta en pacientes que muestran altos niveles de colesterol LDL y de trigliceridos.

La proteina de transferencia del ester de colesterol (CETP) es una glicoproteina plasmatica estable que es responsable de la transferencia de lipidos neutros y fosfolipidos entre las lipoproteinas, y que regula por disminucion la concentracion plasmatica de HDL. La inhibicion de la actividad de transferencia del lipido CETP ya ha sido sugerida como una aproximacion terapeutica para aumentar el nivel plasmatico de HDL. Existen razones numerosas que sugieren que la reduccion de la actividad de CETP en el plasma conducira a un aumento en los niveles de HDL. De este modo, CETP disminuye la concentracion de HDL mediante la transferencia de esteres de colesterol desde HDL a LDL y VLDL. En experimentos animales con conejos y hamsteres, la inhibicion transitoria de CETP con anticuerpos monoclonales CETP, oligonucleotidos no codificantes o inhibidores de CETP condujeron al aumento en los niveles de HDL. La inhibicion duradera de CETP con oligonucleotidos no codificantes, aumento los niveles de HDL y, por tanto, condujo a una reduccion de las lesiones ateroscleroticas en el modelo animal del conejo para la

aterosclerosis.

En la literatura, se describen varios inhibidores de CETP, algunos de los cuales se encuentran en ensayos clinicos (por ejemplo, Anacetrapib (Krishna R., Lancet 3�0 (9603) (200�): 190�-14) y Torcetrapib (Sikorski, J.A., J. Med. Chem. 49 (1) (2006): 1-22)).

En la patente US n° 5.512.548 y el documento WO 93/011�82, se describen polipeptidos y sus analogos que pueden inhibir CETP que cataliza la transferencia de esteres de colesterol desde HDL a VLDL y LDL, y, por tanto, tienen actividad anti-aterosclerotica si se administran a un paciente. Segun estos documentos, tal inhibidor polipeptido inhibidor de CETP se deriva de la apolipoproteina C-I de diversas fuentes, donde fragmentos especialmente Nterminales hasta 36 aminoacidos se han identificado como inhibidores de CETP.

Tambien, en el documento US 5.880.095A, se da a conocer un peptido de union CETP que es capaz de inhibir la actividad de CETP en un individuo. La proteina inhibitoria de CETP comprende un fragmento N-terminal de apolipoproteina C-III porcina.

En los documentos US 2006/02�6400 y WO 96/034888 se dan a conocer peptidos que se derivan de CETP y comprenden epitopos de celulas T y/o B. Estos peotidos pueden inducir in vivo la formacion de anticuerpos CETP especificos.

En los documentos US 2004/008�481 y US 6.410.022 B1, se dan a conocer peptidos que, a causa de la induccion de una respuesta inmune CETP especifica, pueden utilizarse para el tratamiento y la prevencion de patologias cardiovasculares, tales como, por ejemplo, aterosclerosis. Estos peptidos comprenden un epitopo de celulas T auxiliadoras que no se deriva de CETP, y por lo menos, un epitopo de celulas B que procede de CETP y puede derivarse directamente del ultimo. El epitopo de celulas T auxiliadoras se deriva ventajosamente del toxoide tetanico y de una covalentemente a, por lo menos, un epitopo de celulas B de CETP. Utilizando un epitopo de celulas T auxiliadoras que es extrano al organismo, es posible inducir anticuerpos en el organismo de un individuo los cuales se dirigen contra aquella parte del peptido que esta formada, por lo menos, de un epitopo celula B-CETP.

En Mao D et al (vacuna 24(2006): 4942-4950), se describe la utilizacion de un plasmido que comprende una molecula acido que codifica un epitopo celula B de CETP como vacuna.

En el documento WO 2006/029982 CETP, se describen mimotopos para utilizarse en la preparacion de un medicamento para el tratamiento o prevencion de la aterosclerosis.

Muy recientemente, se ha sugerido ya un enfoque vacunal con respecto a CETP. De este modo, por ejemplo, se trataron conejos con una vacuna que contenia aquel peptido de CETP responsable de la transferencia del ester de colesterol como un antigeno. Los conejos inmunizados mostraban una actividad CETP reducida, y niveles alterados de lipoproteinas con un aumento de HDL y una reduccion en los valores LDL. Ademas los animales de ensayo tratados del modelo aterosclerotico mostraron tambien lesiones ateroscleroticas reducidas en comparacion con los animales de control.

Los resultados de un estudio de una fase clinica II se publicaron, cuyo estudio se habia llevado a cabo por la compania americana Avant de biotecnologia con la vacuna CETi-1 (BioCentury Extra For Wednesday, Octubre 22, 2003). En este estudio de la fase II, justamente como en el estudio de la fase precedente I, se probo un perfil de seguridad muy bueno, sin ningun efecto secundario capaz de cuestionarse que permitio concluir que no se esperarian, basicamente, efectos secundarios del enfoque de vacunacion anti-CETP. Respecto a la eficacia, sin embargo, la vacuna Avant resulto decepcionante, ya que no condujo a obtener un aumento en los niveles de HDL significativamente mejores que los alcanzados mediante un tratamiento placebo.

El problema con la vacuna CETi-1 es que utiliza antigenos endogenos. El sistema inmunitario humano es tolerante respecto a estructuras endogenas, ya que con la mayoria de las moleculas endogenas -distintas que con CETP- es vital que no se formen autoanticuerpos. Asi, el objetivo de la vacuna CETi-1 fue romper la tolerancia endogena, el cual, aparentemente, no se ha conseguido en un grado suficiente.

Asi, constituye el objetivo de la presente invencion proporcionar antigenos para una vacuna anti-CETP que se seleccionan de forma que se consideren como extranos por el sistema inmune, y por tanto, no requieran romper una autotolerancia. Estos antigenos pueden utilizarse para prevenir y/o tratar la aterosclerosis y sus secuelas.

Por tanto, la presente invencion se refiere a un compuesto que comprende la secuencia aminoacida FGFPAHVFIDWLQSLS o FGFPAHVYIDWLQSLS o FGFPAHVFIDWLQSLN para utilizarla en la prevencion y/o tratamiento de la aterosclerosis, enfermedad oclusiva arterial periferica, enfermedad cardiaca coronaria o dano cerebral apopletico.

La presente invencion proporciona mimotopos CETP con este proposito. Estos mimotopos pueden inducir anticuerpos que pueden inhibir la actividad CETP enzimatica. Los mimotopos CETP segun la presente invencion son

preferentemente polipeptidos antigenicos que en su secuencia aminoacida varian desde la secuencia aminoacida de CETP o de fragmentos de CETP. Los antigenos de la invencion que inducen anticuerpos anti-CETP pueden ensamblarse con aminoacidos D- o L- o de combinaciones de aminoacidos DL- y, opcionalmente, pueden haberse cambiado mediante modificaciones ulteriores, cierres de anillos, o derivatizaciones. Segun la invencion, sin embargo, puede asimismo utilizarse muy bien peptidos mas largos como antigenos que induzcan anticuerpos anti-CETP. Ademas, los mimotopos de la presente invencion pueden tambien formar parte de un polipeptido y, consecuentemente, incluir en su extremo N- y/o C, por lo menos, otro residuo aminoacido mas.

Los mimotopos de la presente invencion pueden unirse a anticuerpos que pueden obtenerse mediante la administracion de C-FGFPEHLLVDFLQSLS (16 aminoacidos C-terminales de la proteina CETP), acoplado as KLH u otros transportadores para mamiferos. Una vez administrado a un mamifero, los mimotopos pueden inducir una respuesta inmunitario correspondiente, de forma que los anticuerpos dirigidos contra CETP se produzcan en dicho mamifero.

Los mimotopos de CETP (es decir, antigenos que inducen anticuerpos anti-CETP) de la presente invencion, pueden identificarse y prepararse mediante varios procedimientos, que incluyen bibliotecas fagicas o peptidicas. Pueden producirse e identificarse, por ejemplo, mediante metodos de quimica combinatoria o de tecnicas de escaneo de alto rendimiento para las estructuras de gran variabilidad (Display: A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas (Editor), et al.; Willats WG Phage display: practicalitiesand prospects. Plant Mol. Biol. 2002; 50(6):83� -54).

Ademas, segun la invencion, tambien pueden utilizarse los antigenos que inducen anticuerpos anti-CETP, basados en acidos nucleicos ("aptameros"), y estos, tambien pueden encontrarse con las bibliotecas mas variadas (oligonucleotidos) (por ejemplo, con 2-180 residuos de aminoacidos) (por ejemplo, Burgstaller et al., Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5 (5) (2002), 690-�00; Famulok et al., Acc. Chem. Res. 33 (2000), 591-599; Mayer et al., PNAS 98 (2001), 4961-4965, etc.). En antigenos que inducen anticuerpos anti-CETP que se basan en acidos nucleicos, la estructura del acido nucleico puede proporcionarse, por ejemplo, por los compuestos naturales fosforo-di-ester, o tambien por los fosforotivatos o combinaciones o variaciones quimicas (por ejemplo, como PNA), donde como bases, segun la invencion, pueden utilizarse primariamente U, T, A, C, G, H y mC. Los residuos 2' de los nucleotidos que pueden utilizarse segun la presente invencion, son preferentemente H, OH, F, Cl, NH2, O-metil, O-etil, O-propil o O-butil, donde los acidos nucleicos pueden tambien modificarse de forma distinta, es decir, por ejemplo, con grupos protectores, pues ellos se utilizan habitualmente en la sintesis de oligonucleotidos. De este modo, los antigenos que inducen anticuerpos anti-CETP que se basan en aptameros constituyen asimismo antigenos que inducen anticuerpos anti-CETP preferidos, dentro del alcance de la presente invencion.

Segun la presente invencion, el termino "mimotopo" se refiere a una molecula que presenta una conformacion que tiene una topologia equivalente al epitopo del cual es una imitacion. El mimotopo se une a la misma region de union antigenica de un anticuerpo que se une inmuno-especificamente a un antigeno deseado. El mimotopo provocara una respuesta inmunologica en un huesped que es reactivo para el antigeno del cual es un imitador. El mimotopo puede actuar tambien como un competidor para el epitopo del cual es un imitador en ensayos de inhibicion in vitro (por ejemplo, ensayos ELISA de inhibicion), que implica al epitopo y a un anticuerpo que se une a dicho epitopo. Sin embargo, un mimotopo de la presente invencion puede no necesariamente provenir o competir con la union del epitopo del cual es un imitador, en un ensayo in vitro de inhibicion, aunque puede inducir una respuesta inmune especifica cuando se administra a un mamifero.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el termino "epitopo" se refiere a una region inmunogenica de un antigeno que es reconocida por una molecula del anticuerpo en particular. En general, un antigeno poseera uno o mas epitopos capaz cada uno de unirse a un anticuerpo que reconoce al epitopo particular.

Las abreviaturas para los residuos aminoacidos que se dan a conocer en la presente invencion siguen las recomendaciones de la IUPAC:

Aminoacido

Codigo de 3 letras Codigo de 1 letra

Alanina

Ala A

Arginina

Arg R

Asparagina

Asn N

Acido aspartico

Asp D

Cisteina

Cys C

Acido glutanico

Glu E

Glutamina

Gln Q

Glicina

Gly G

Histidina

His H

Isolecina

Ile I

Leucina

Leu L

Lisina

Lys K

Metionina

Met M

Fenilamina

Phe F

Prolina

Pro P

Serina

Ser S

Treonina

The T

Triptofano

Trp W

Tirosina

Tyr Y

Valina

Val V

Los mimotopos de la presente invencion pueden obtenerse sinteticamente mediante procedimientos de sintesis quimica que son bien conocidos en la tecnica, bien como un peptido aislado o como parte de otro peptido o polipeptido. Alternativamente el mimotopo peptido puede producirse en un microorganismo que produce el mimotopo peptido que es entonces aislado, y si se desea, ulteriormente purificado. El mimotopo peptido puede producirse en microorganismos tales como bacterias, levaduras o hongos, en celulas eucariotas tales como en celulas de un mamifero o un insecto, o en un vector virico recombinante como el adenovirus, poxvirus, herpesvirus, Simliki forest virus, baculovirus, bacteriophage, sindbis virus or sendai virus. Las bacterias apropiadas para producir el mimotopo peptido incluyen E. coli, B. Subtilis cualquier otra bacteria que pueda expresar peptidos tales como el peptido mimotopo. Los tipos apropiados de levaduras para expresar el mimotopo peptido incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida, Pichia pastoris o cualquier otra levadura capaz de expresar peptidos. En la tecnica, se conocen metodos correspondientes. Tambien son bien conocidos en la tecnica procedimientos para aislar y purificar peptidos obtenidos de forma recombinante, e incluyen, por ejemplo, filtracion en gel, cromatografia de afinidad, cromatografia de intercambio ionico, etc.

Para facilitar al aislamiento del mimotopo peptido, puede llevarse a cabo un polipeptido de fusion, en el que el mimotopo peptido se fusiona translacionalmente (se une covalentemente) a un polipeptido heterologo que permite el aislamiento mediante cromatografia de afinidad. Tipicos polipeptidos heterologos son His-Tag (por ejemplo, His6; 6 residuos de histidina), GST-Tag (Glutarion-S-transferasa) etc. El polipeptido de fusion no solo facilita la purificacion de los mimotopos, sino que puede prevenir tambien que el polipeptido mimotopo puede degradarse durante la purificacion. Si se desea eliminar el polipeptido heterologo despues de la purificacion, el polipeptido de fusion puede incluir un sitio de fragmentacion en la union entre el mimotopo peptido y el polipeptido heterologo. El sitio de fragmentacion esta formado por una secuencia aminoacida que es fragmentada con un enzima especifico para la secuencia aminoacida en el sitio (por ejemplo, proteasas).

Los mimotopos de la presente invencion pueden tambien modificarse en o cerca de su extremo N-y/o C-, de forma que en dichas posiciones, se una alli un residuo de cisteina. En una forma de realizacion preferida, los residuos de cisteina posicionadas terminalmente (localizados en el extremo N-y C- del peptido), se utilizan para ciclizar los peptidos mediante un enlace disulfuro.

Los mimotopos de la presente invencion pueden utilizarse tambien en diversos ensayos y equipos, en particular en ensayos inmunologicos y equipos. Por tanto, se prefiere particularmente que el mimotopo sea parte de otro peptido o polipeptido, particularmente un enzima que se utilice como un informador en ensayos inmunologicos. Dichos enzimas informativos incluyen, por ejemplo, alcalina-fosfatasa o peroxidasa de rabano.

Las patologias que pueden prevenirse o tratarse incluyen, entre otras, la enfermedad oclusiva arterial periferica, la enfermedad cardiaca coronaria, y el ictus cerebral apropletico (vease por ejemplo, Steinberg D. J. Lipid Res. (2005)

46: 1� 9-190; Steinberg D et al., J. Lipid Res (2006) 4 �: 1339-1351).

Segun una forma de realizacion preferida de la presente invencion, el compuesto se une a un transportador farmaceuticamente aceptable, preferentemente, KLH (hemocianina de lapa, toxoide tetanico, proteina de union a la albumina, albumina serica bovina, un dendrimero, (MAP; Biol. Chem. 358:581), engarces peptidicos (o regiones flanqueantes), asi como las sustancias adyuvantes que se describen en Singh et al., Nat. Biotech. 1� (1999), 10�51081 (en particular aquellas en la tabla 1 de aquel documento y O'Hagan et al., Nature Revie�s, Drug Discovery 2

(9) (2003), �2�-�35, (en particular los compuestos endogenos inmunopotenciadores y los sistemas de suministro descritos ahi), o sus mezclas. La quimica de conjugacion (por ejemplo, mediante compuestos heterobifuncionales tales como GMBS y por supuesto, tambien otros tal como se describe en "Bioconjugate Techniques", Greg T. Hermanson), pueden seleccionarse, en este contexto, a partir de reacciones conocidas por el experto materia. Ademas, la composicion vacunal puede formularse con un adyuvante, preferentemente una composicion baja en aluminio soluble, en particular, hidroxido de aluminio. Por supuesto, pueden utilizarse tambien adyuvantes como fosfato aluminico MF59, fosfato calcico, citocinas (por ejemplo, IL-2, IL-12, GM-CSF), saponinas (por ejemplo, QS21), derivados MDP, oligos CpG, LPS, MPL, polifosfacenos, emulsiones (por ejemplo, Freund's, SAF), liposomas, virosomas, iscoms, cocleatos, microparticulas PLG, particulas de poloxamero, particulas de tipo virico, enterotoxina termolabil (LT), toxina colerica (CT), toxinas mutantes (por ejemplo, LTK63 y LTR �2), microparticulas y/o liposomas polimerizados.

El compuesto de la presente invencion se une preferentemente al transportador o adyuvante mediante un engarce, que se selecciona a partir del grupo formado por NHS-poly (oxido de etileno) (PEO) (por ejemplo, NHS-PEO4

maleimida).

Una vacuna que incluye este compuesto (minotopo) y el transportador farmaceuticamente aceptable, puede administrarse mediante cualquier medio apropiado de aplicacion por ejemplo, intradermico, intravenoso, intraperitoneal, intramuscular, intranasal, oral, subcutaneo, etc., y en cualquier dispositivo apropiado de suministro (O'Hagan et al., Nature Revie�s, Drug Discovery 2 (9), (2003), �2�-�35). El compuesto de la presente invencion se formula preferentemente para administracion intravenosa, subcutanea, intradermica o intramuscular (vease, por ejemplo, "Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations". Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc, 2004).

Tipicamente, la vacuna contiene el compuesto segun la invencion en una cantidad de entre 0,1 ng a 10 mg, preferentemente 10 ng a 1 mg, en particular 100 ng a 100 �g, o, alternativamente por ejemplo, 100 fmol a 10 �mol, preferentemente 10 �mol a 1 �mol, en particular 100 pmol a 100 nmol. Tipicamente, la vacuna puede contener tambien sustancias auxiliares, por ejemplo, tampones, estabilizadores, etc.

Otro aspecto de la presente invencion se refiere a un peptido formado, por lo menos, de una secuencia aminoacida seleccionada a partir del grupo formado por FGFPAHVFIDWLQSLS, FGFPAHVYIDWLQSLS y FGFPAHVFIDWLQSLN. Los peptidos de la presente invencion volvieron a ser miotopos para CETP, y por tanto, estos pudieron unirse a anticuerpos que se unian al fragmento CETP C-FGFPEHLLVDFLQSLS (16 aminoacidos Cterminales de la proteina CETP).

Otro aspecto, todavia, de la presente invencion, se refiere a una formulacion farmaceutica que comprende, por lo menos, un peptido segun la presente invencion.

Los peptidos de la presente invencion pueden formularse en una formulacion farmaceutica que puede administrarse a un individuo. Estas formulaciones pueden utilizarse, por ejemplo para prevenir y/o tratar la aterosclerosis, enfermedad oclusiva arterial periferica, enfermedad cardiaca coronaria o lesion cerebral apoplejica.

Los peptidos en la formulacion pueden combinarse a partir del conjunto de peptidos que se dan a conocer en la presente memoria. Ademas, tambien se pueden proporcionar formulaciones farmaceuticas, que comprenden uno o varios de los peptidos de la presente invencion, y que pueden administrarse separada o conjuntamente a un individuo que lo necesite.

Los peptidos de la presente invencion pueden mezclarse en una unica formulacion farmaceutica, o en una combinacion de dos o tres. La formulacion resultante puede administrarse al mismo tiempo o en distintos momentos. Segun una forma de realizacion preferida de la presente invencion, el peptido que se encuentra en la formulacion, se une a un vehiculo farmaceuticamente aceptable preferentemente KLH (hemocianina de lapa).

La presente invencion se ilustra a continuacion mediante las figuras y los ejemplos siguientes no limitativos.

La figura 1 muestra el resultado de una competicion representativa ELISA, despues de escanear una biblioteca Ph.D. � fagica de exposicion con el anticuerpo monoclonal "Paula".

Las figuras 2a y 2b muestran los resultados de 2 competiciones tipicas de ELISA, despues de escanear una biblioteca Ph.D. 12 fagica de exposicion con el anticuerpo monoclonal "Paula".

La figura 3a y 3b muestran los resultados de 2 tipos ELISAs representativos competitivos, despues de escanear una biblioteca Ph.D. � fagica expuesta con el anticuerpo monoclonal Frida.

La figura 4a muestra los resultados de ELISA representativos, despues de escanear una biblioteca Ph.D 12 fagica de exposicion con el anticuerpo monoclonal Frida.

La figura 4b muestra la union del anticuerpo monoclonal "Frida" a las placas ELISA revestidas con mimotopo-BSA.

Las figuras 5a y 5b muestran los resultados de una competicion ELISA representativa despues del escaneo de una biblioteca de exposicion fagica Ph.D 12 con anticuerpos monoclonales Frida.

La figura 6 muestra los resultados de una competicion ELISA de dos mimotopos, despues de escanear una biblioteca Ph.D 12 de exposicion fagica con el anticuerpo monoclonal "Frida"

Las figuras �a a �d muestran el titulo de anticuerpos (IgG anti-raton) de experimentos in vivo, por los que los siguientes conjugados mimotopo-BSA se inyectaron en ratones.

Fr12/3/26/65 ext4 C-FGFPYHVQVDVLQSLS

p4286

Fr12/3/55 ext2 C-FGFPSHLIIDRAQSLS

p4294

Fr12/3/55 ext2 W en vez de R C-FGFPSHLIIDWAQSLS

p4324

Fr12/3/55 en vez de RA C-FGFPSHLIIDWLQSLS

p4325

Fr12/3/84 ext 2 C-FGFPAHVSIDWLQSLS

p4298

Fr12/3/40 ext4 C-FGFPQHLTTDRAQSLS

p4302

Fr12/2/6 ext6 C-FGFPTHYYADFSQSLS

p42�8

Fr12/2/11 ext� C-FGFPGHLIWDSLHSLS

p4282

Fr12/3/1/19/88 ext 4 C-FGFPYHHLVDQLHSLS

p4284

Fr12/3/68 ext5 C-FGFPSHHLQDSLQSLS

p4289

Fr12/3/83 ext5 C-FGFPLHFRSDRIQSLS

p4292

Fr12/3/63 ext4 C-FGFPKHLYADMSQSLS

p4296

Fr12/3/4� ext4 C-FGFPAHLSRDLRQSL

p4300

Fr12/3/35 ext4 C-FGFPFHFAQDSWQSLS

p4304

Las figuras 8a y 8b muestran los resultados de dos ELISA de competicion, representativos, despues de escanear la biblioteca Ph.D �C de exposicion fagica con el anticuerpo monoclonal Frida.

5 La figura 9 muestra un ensayo ELISA in vitro para detectar la union entre "Frida" y los mimotopos ciclicos. Las figuras 10a y 10b muestran los resultados de un ensayo ELISA de inhibicion con FGFPSHLIIDWLQSLS, FGFPAHVFIDWLQSLS y FGFPAHVYIDWLQSLS.

10 La figura 10a (peptido de revestimiento de 1 �M. Deteccion �IgG1.

Frida

2,5 ng mAb Frida

pept n°

2 � peptido 20 �g peptido

p40�3 p1358

Solo tampon Epitopo original Peptido sin importancia C-FGFPEHLLVDFLQSLS Peptido sin importancia 1,05 0,96 0,44 0,1 1,08 0,91

p4361 p4362

FGFPAHVFIDWLQSLS FGFPAHVYIDWLQSLS Fr12/3/84 ext2 VSI�VFI Fr12/3/84 ext2 VSI�VYI 0,82 0,16 0,�5 0,15

Figura 10b (1 �M de revestimiento peptido. Deteccion �IgG1)

Frida

2,5 ng mAb Frida

pept n°

2 � peptido 20 �g peptido

p40�3 p1358

Solo tampon Epitopo original Peptido sin importancia C-FGFPEHLLVDFLQSLS Peptido sin Importancia 0,84 0,�5 0,64 0,15 0.88 0,��

p4325

FGFPSHLIIDWLQSLS Fr12/3/55 ext2 RA�WL 0,42 0,1

15 La figura 11 muestra la induccion in vivo de anticuerpos dirigidos a CETP por mimotopos de la invencion que se administran a los ratones. Los ratones Balb/c/30 �g Peptidos, 2 inyecciones a intervalos de 2 semanas S3= 2 semanas despues de la tercera inyeccion. Alumbre como adyuvante. Los titulos contra el epitopo original (p40�3) inducidos por inyeccion de mimotopos. Revestimiento de pocillos: 50 �l de 1 �M p40� 3-BSA o 1 �g/ml de KLH

20 activado. Deteccion: �IgG:

Grupo 1

KLH KLH

Grupo 2

Epitopo original p40�3-KLH

Grupo 3

C-FGFPQHLTTDWLQSLS p4369-KLH

Grupo 4

C-FGFPSHLIIDWAQSLS p4324-KLH

Grupo 5

C-FGFPSHLIIDWLQSLS p4325-KLH

Grupo 6

C-FGFPSHLIIDWSQSLS p4366-KLH

Grupo �

C-FATPSHLIIDWLQSLS p4345-KLH

Grupo 8

C-FAFPAHVSIDWLQALA p4328-KLH

Grupo 9

C-PGFPAHVSIDWLQSLS p4340-KLH

Grupo 10

C-WGFPAHVSIDWLQSLS p4341-KLH

Grupo 11

C-FSFPAHVSIDWLQSLS p4342-KLH

Grupo 12

C-FYFPAHVSIDWLQSLS p4343-KLH

Grupo 13

C-FDFPAHVSIDWLQSLS p4344-KLH

Grupo 14

C-FGFPAHVSIDWLQLLS p434�-KLH

Grupo 15

C-FGFPAHVSIDWLQYLS p4351-KLH

Peptido-BSA Epitopo peptido-Inyectado BSA BSA original irrelevante

2.040 400

8.600 10

14.000 12.900 10

12.5� 0 �.600 10

2.930 1.820 10

4.�00 3.600 10

8.380 1.2�0 10

10.100 2.�40 400

18.100 15.640 10

10.350 5.500 10

4.620

1.610 10

5.580

2.900 10

12.200 3.580 10

12.000 9.160 10

2.950 2.400 10

Grupo 16

C-FGFPAHVSIDWLQSIS p4352-KLH

Grupo 1�

C-FGFPAHVSIDWLQSLT p4353-KLH

Grupo 18

C-FGFPAHISIDWLQSLS p4358-KLH

Grupo 19

C-FGFPAHIIIDWLQSLS p4359-KLH

Grupo 20

C-FGFPAHVFIDWLQSLS p4361-KLH

19.680 12.0� 0 10

11.200 8.650 10

16.500 12.940 10

8.540 5.340 10

1�.940 9.530 10

Las figuras 12a y 12b muestran la induccion in vivo de anticuerpos especificos para CETP, administrando mimotopos de la invencion. Titulos para p40� 3 y su correlacion con titulos para CETP de grupos seleccionados (que muestran titulos altos contra p40�3): gr. 4, gr. 9, gr. 10, gr. 14, gr. 16-20/gr. 1 (KLH), gr. 2 (epitopo original) como controles. Revestimiento: GST-CETP recombinante o CETP purificado de raton, respectivamente:

figura 12a

GST-CETP Recombinante

CETP de conejo

Grupo 1

KLH KLH/Alum 0,35 1,49 0,45 0,58 0,49 0,39 0,35 0,48 0,5� 0,68 0,�9 1,64 0,19 1,25 0,21 0,28 0,21 0,18 0,2 0,28 0,39 0,58 0,54 1,51

Grupo 2

Epitopo original p40�3-KLH/Alum

Grupo 3

C-FGFPQHLTTDWLQSLS p4369-KLH/Alum

Grupo 4

C-FGFPSHLIIDWAQSLS p4324-KLH/Alum

Grupo 9

C-PGFPAHVSIDWLQSLS p4340-KLH/Alum

Grupo 10

C-WGFPAHVSIDWLQSLS p4341-KLH/Alum

Grupo 14

C-FGFPAHVSIDWLQLLS p434�-KLH/Alum

Grupo 16

C-FGFPAHVSIDWLQSIS p4352-KLH/Alum

Grupo 1�

C-FGFPAHVSIDWLQSLT p4353-KLH/Alum

Grupo 18

C-FGFPAHISIDWLQSLS p4358-KLH/Alum

Grupo 19

C-FGFPAHIIIDWQSLS p4359-KLH/Alum

Grupo 20

C-FGFPAHVFIDWLQSLS p4361-KLH/Alum

10 figura 12b

GST-CETP Recombinante

CETP de conejo

Grupo 1

KLH KLH/Alum 0,18 1,26 0,59 0,4 0,39 0,45 0,38 0,61 0,35 0,54 0,4� 1,42 0,85 0,65 0,46 0,43 0,41 1,05 0,43 0,59

Grupo 2

Epitopo original p40�3-KLH/Alum

Grupo 5

C-FGFPSHLIIDWLQSLS p4325-KLH/Alum

Grupo 6

C-FGFPSHLIIDWSQSLS p4366-KLH/Alum

Grupo �

C-FATPSHLIIDWLQSLS p4345-KLH/Alum

Grupo 8

C-FAFPAHVSIDWLQALA p4328-KLH/Alum

Grupo 11

C-FSFPAHVSIDWLQSLS p4342-KLH/Alum

Grupo 12

C-FYFPAHVSIDWLQSLS p4343-KLH/Alum

Grupo 13

C-FDFPAHVSIDWLQSLS p4344-KLH/Alum

Grupo 15

C-FGFPAHVSIDWLQYLS p4351-KLH/Alum

La figura 13 muestra la induccion in vivo de anticuerpos dirigidos a CETP por mimotopos de la invencion que se administran a ratones.

Los sueros de cada grupo (5 ratones Balb/c cada uno) se combinaron, se diluyeron 1:100 y se ensayaron sobre placas ELISA revestidas con GST-CETP recombinante o CETP de conejo, respectivamente. La deteccion de anticuerpos unidos fue con algG.

GST-CETP Recombinante

CETP de conejo

Grupo 1

KLH KLH/Alum 0,23 1,08 0,26 0,33 0,4 0,86 0,29 0,24 0,1� 0,46 0,14 0,16 0,23 0,94 0,23 0,14

Grupo 2

Epitopo original p40�3-KLH/Alum

Grupo 3

C-FGFAAHVSIDWLQSLS p4335-KLH/Alum

Grupo 4

C-FGFPAHVSIDWLQWLS p4348-KLH/Alum

Grupo 5

C-FGFPAHLTTDWLQSLS p4360-KLH/Alum

Grupo 6

C-FGFPAHVYIDWLQSLS p4362-KLH/Alum

Grupo �

C-FGFPAHVSIDWLQSLY p4359-KLH/Alum

Grupo 8

C-FGFPAHVSIRWLQSLS p433�-KLH/Alum

La figura 14 muestra un ensayo de actividad de CETP, donde 0,6 �l de suero humano (con actividad CETP endogena), se mezcla con suero de ratones de tipo salvaje (que no presentan actividad CETP), vacunados con KLH/Alum (grupo de control negativo), p4�03-KLH/Alum) (epitopo CETP original), o p4361 (o p4362 o p4325) mimotopo, respectivamente. Pudo demostrarse que la adicion de 1,2 �l y 0,6 �l de suero de ratones vacunados con p4361-KLH/Alum, inhibe completamente la actividad CETP, y la adicion de 0,2 �l de suero reduce significativamente dicha actividad, al contrario que la adicion de suero de ratones vacunados con el control KLH/Alum, solo o con el epitopo original (p40� 3-KLH/Alum).

5 La figura 15 muestra que la adicion de p4325-KLH/Alum al suero humano inhibe significativamente la actividad CETP.

La figura 16 muestra que la adicion de p4361-KLH/Alum al suero humano inhibe significativamente la actividad 10 CETP.

La figura 1� muestra que la adicion de p4362-KLH/Alum al suero humano inhibe significativamente la actividad CETP.

15 La figura 18a muestra un ELISA de inhibicion con mimotopos (Revestimiento con 1 �M del peptido 40� 3, deteccion � IgG1).

Frida

2,5 ng mAb Frida

Pept N°

Bajo Alto

Solo tampon

Solo tampon

Solo tampon

1,084 1,0�9

4% DMSO

4% DMSO

4%DMSO 1,180 1,201

p40�3

C-FGFPEHLLVDFLQSLS, peptido de control positivo p40�3 0,53� 0,094

p1208

Peptido de control positivo C-FGFPEHLLVDFLQSLS p1208 0,�12 0,093

p1358

Peptido de control negativo p1358 1,158 1,050

p44�4

C-PAHVYIDWLQSLS Fr12/3/84 ext2 VSI�VFI SLS�SLN 1,452 0,1�9

p44�5

C-FGFPAHFSIDWLQSLS Fr12/3/84 ext2 VSI�FSI 2,211 1,429

p44�6

C-FGFPAHVSFDWLQSLS Fr12/3/84 ext2 VSI�VSF 2,000 1,41�

p44��

C-FGFPEHVFIDWLQSLS Fr12/3/84 ext2 VSI�VFI PAH�PEH 0,808 0,116

p44�8

C-FKPAHVFIDWLQSLS Fr12/3/84 ext1 VSI�VFI 2,231 1,206

p44�9

C-GFKPAHVFIDWLQSLS Fr12/3/84 ext1 VSI�VFI mas G Sobre el extremo N 2,165 1,591

p4480

C-DFGFPAHVFIDWLQSLS Fr12/3/84 ext2 VSI�VFI mas D Sobre el extremo N = 4361 D 0,521 0,103

p4481

C-FGFPQHLFTDWLQSLS Fr12/3/40 ext4 RA�WL LTT�LFT = p4369 con intercambio T�F 0,551 0,156

La figura 18b muestra un ELISA de inhibicion con mimotopos (Revestimiento de 1 �M del peptido 40� 3, deteccion � 20 IgG1).

p1208

Peptido de control positivo p1208 0,264 0,0�9

p1358

Peptido de control Negativo p1358 1,902 1,661

p4629

C-PAHVYIDWLQSLS Extremo C- de p4362; p4362 menos 3 aa sobre el extremo N 0,313 0,118

p4630

C-FGFPAHVYIDWLQ Extremo N de p4362 (menos 3 aa sobre extremo C) 2,131 2,115

p4631

C-FGFPAHVFIDWLQ Extremo N de p4362 (menos 3 aa sobre Extremo C) 2,111 2,14�

p4642

C-DFGFPSHLIIDWLQSLS Fr12/3/55 ext2 RA�WL mas D; p4325 mas D sobre el Extremo N 0,1�1 0,082

P4818

C-DFGFPAHVFIDWLQSLN Fr12/3/84 ext2 VSI�VFI SLS � SLN mas D; = 4361 N hacia atras mas D hacia delante 0,332 0,091

p4819

C-PSHLIIDWLQ = 4325 menos 3AA en los extremos N y C 2,226 2,158

p4820

C-PAHVFIDWLQ = 4361 menos 3AA en los extremos N y C 2,310 2,3�4

p4989

C-DFGFPAHVTIDWLQSLN Fr12/3/84 ext2 VSI�VTI; = p4361 F reemplazado por T, mas D en el extremo N y N en vez de S en el extremo C 0,932 0,2�4

p4990

C-DFGFPAHVLIDWLQSLN Fr12/3/84 ext2 VSI�VLI; =p4361 F reemplazado por T, mas D en el extremo N y N en vez de S en el extremo C 0,263 0,0�3

p506�

FGFPAHVYIDWLQSLS-C p4362 C en el extremo C 0,563 0,21�

p5068

FGFPAHVFIDWLQSLN-C p44�4 C en el extremo C 0,�5� 0,2�1

La figura 18c muestra un ELISA de inhibicion con un cribado de mimotopos PhD12 Frida de intercambio-Ala para la caracterizacion del mimotopo /mAb Frida (Revestimiento 1 �M 40�3. Deteccion �IgG1).

Frida

2,5 ng mAb Frida

Pept N°

Bajo Alto

Solo tampon

Solo tampon

0,964 0,964

4% DMSO

4%DMSO 0,9�3 0,923

Peptido de control Positivo

p40�3 0,554 0,088

p1208

p1208

0,942 0,101

Peptido de control negativo

p1358 0,986 0,93

p4432

C-FGFPSHIIIDWLQSLS Fr12/3/55 ext2exch2 L->I 0,635 0,096

p4433

C-FGFPSHLIIEWLQSLS Fr12/3/55 ext2exch2 D->E 1,114 0,6�2

p4434

C-AAFPAHLLADAAQALA Intercambio Ala para caracterizacion del mimotopo 1,�4 1,461

p4435

C-AAFPAHAAADFLQALA Intercambio Ala para caracterizacion del mimotopo 1,281 1,969

p4436

C-AAFAAHLLADFLQAAA Intercambio Ala para caracterizacion del mimotopo 1,632 1,691

p443�

C-AAAPAHLLVDAAQAAA Intercambio Ala para caracterizacion del mimotopo 1,84 1,6�4

5 La figura 19a muestra un peptido ELISA, inmunizacion con C-DFGFPAHVYIDWLQSLS (p4628-KLH/Alum), titulo para el epitopo original.

La figura 19b muestra un peptido ELISA, la inmunizacion con C-FGFPAHVFIDWLQSLN (p44�4-KLH/Alum), titulo 10 para el epitopo original.

La figura 19c muestra un peptido ELISA, la inmunizacion con C-FGFPAHVFIDWLQSLN (p44 �4-KLH/Alum), titulo para el mimotopo inyectado.

15 La figura 19d muestra una antiproteina ELISA. A los ratones se les inyecto 3 veces con 30 �g de los miotopos indicados acoplados a KLH con alumbre como adyuvante. Los sueros de cada grupo (integrado por 5 ratones), se juntaron, se diluyeron 1:100 y se ensayaron sobre placas ELISA revestidas con CETP purificado de conejo.

La figura 19e muestra una antiproteina ELISA donde a los ratones se les inyecto 3 veces con 30 �g de los

20 mimotopos indicados conjugados a KLH, con alumbre como adyuvante. Los sueros murinos (de un raton unico), se diluyeron 1:100 y se ensayaron sobre las placas ELISA revestidas con CETP purificado de conejo.

Ejemplos

25 Existe una intensa relacion inversa entre la concentracion plasmatica de colesterol en las lipoproteinas de alta densidad (HDLs) y el desarrollo de la enfermedad cardiaca coronaria (CHD). Asi, el riesgo de (CHD) es mas alto cuando HDLs disminuye. Aunque el 33% de los pacientes con CHD tienen niveles plasmaticos bajos de HDLs, no existe habitualmente una terapia efectiva para aumentar la concentracion plasmatica de HDLs. La dieta y el ejercicio moderado son inofensivos, las estatinas consiguen solo un bajo 5 a �% de aumento en HDL y la maxima posee

30 efectos secundarios y perfiles de conformidad que limitan su utilizacion.

La inhibicion de la actividad de CETP se ha sugerido como una aproximacion terapeutica para aumentar los niveles plasmaticos de HDL. CETP es una glicoproteina plasmatica que facilita la transferencia de lipidos neutros y fosfolipidos entre lipoproteinas, regulando la concentracion del HDL plasmatico. La inhibicion de la actividad CETP 35 se espera que aumente las concentraciones plasmaticas de HDL por varias razones, CETP disminuye las concentraciones de HDL trasladando los esteres de colesterol desde HDL a VLDLs y LDLs. La inhibicion transitoria de CETP en conejos y hamsteres mediante los anticuerpos monoclonales, pequenas moleculas (Sikorski, J.A., J. Med. Chem. 49 (1) (2006): 1-22), u oligonucleotidos no codificantes, provoca el aumento de HDL. La inhibicion sostenida de CETP con nucleotidos no codificantes, aumenta el HDL plasmatico y redujo las lesiones 40 ateroscleroticas en un modelo aterosclerotico en el conejo. Los ratones y ratas CETP trasgenicos muestran una disminucion del HDL plasmatico. Los individuos con actividad reducida de CETP muestran un HDL plasmatico

elevado.

Recientemente, se ha sometido a consideracion una vacuna. Los conejos se inmunizaron con un peptido derivado del CETP humano que contenia una region del CETP critica para la funcion de transferencia de lipidos neutros. Los conejos vacunados presentaban una actividad CETP reducida y un perfil lipoproteico alterado con una concentracion mas baja de LDL y mas alta de HDL. Ademas, los ratones vacunados con CETP mostraron tener lesiones ateroscleroticas mas pequenas que los animales de control.

El problema del enfoque de la vacuna anti-CETP anteriormente mencionado es que su formulacion comprende un autopeptido y por tanto debe destruir la tolerancia natural contra los antiantigenos. La invencion describe un mimotopo CETP que puede utilizarse para la vacunacion: el mimotopo inducira la produccion de anticuerpos contra CETP. El mimotopo CETP no posee una autosecuencia y por tanto, no necesita destruir la tolerancia. Asi, la induccion de una respuesta del anticuerpo anti-CETP, resulta mayormente facilitada. El mimotopo se identifica con un anticuerpo monoclonal (mAb) y bibliotecas peptidicas (comercialmente disponibles). Se utiliza un anticuerpo monoclonal anti-CETP, que neutraliza la actividad CETP. Este mAb detecta una secuencia en el interior del extremo C, 26 aminoacidos de CETP necesarios para la actividad de transferencia de lipidos neutrales.

Ejemplo 1: Generación de anticuerpos monoclonales para utilizarse para el escaneo de bibliotecas que muestren fagos.

A.) 2 anticuerpos derivados de "Fusion F":

Ratones Balb/c se inmunizaron con el epitopo CETP original C-FGFPEHLLVDFLQSLS (16 aminoacidos del extremo C de la proteina CETP), conjugados a KLH y alumbre como adyuvante.

2 clones hibridoma (ambos IgG1) se purificaron y utilizaron para escaneo: F5AF9G4 ("Paula") y F6F11D1 ("Felix").

Estos 2 anticuerpos monoclonales reconocen el epitopo inyectado tan bien como la proteina CETP en ELISA. Tambien puede utilizarse en la transferencia Western para detectar la proteina CETP (proteina recombinante que se expresa en las bacterias tanto como la proteina aislada del suero de conejos). Ambos anticuerpos no inhiben la actividad enzimatica de CETP (ensayada con el equipo Roar de Ensayo de la Actividad de CETP, vease, por ejemplo, US 5.585.235; US 5.618.683; US 5. ��0.355).

B.) 2 anticuerpos derivados de "Fusion I":

Ratones Balb/c se inmunizaron con el epitopo original CETP C-FGFPEHLLVDFLQSLS (16 aminoacidos en el extremo C de la proteina CETP), acoplados a KLH y alumbre como adyuvante.

Se purificaron 2 clones hibridinicos (ambos IgG1), utilizandose para escaneo: I2G6H5 ("Frida") y I2G6H ("James").

Estos 2 anticuerpos monoclonales reconocen el epitopo inyectado tanto como la proteina CETP en ELISA. Tambien pueden utilizarse en la transferencia Western para detectar la proteina CETP (proteina recombinante que se expresa en bacterias, tanto como la proteina aislada del suero del conejo). Contrariamente a los anticuerpos derivados de "Fusion F" (ver A.), ambos anticuerpos "Frida" y "James", inhiben la actividad enzimatica CETP (ensayada con el equipo Roar de Ensayo de la actividad CETP).

Ejemplo 2: Exhibición fágica ELISA de inhibición in vitro y ensayo in vivo de mimotopos

Las Bibliotecas de exhibicion fagica utilizadas en el ejemplo fueron:

Ph.D. �: Ne� England BioLabs E8102L (biblioteca lineal de � unidades metamericas).

Ph.D. C �C: Ne� England BioLabs E8121L (biblioteca de unidades metamericas, peptidos ciclizados).

Ph.D. 12: Ne� England BioLabs E8111L (biblioteca lineal de 12 unidades metamericas).

La exhibicion fagica se llevo a cabo segun el protocolo del fabricante (���.neb.com).

Despues de 2 o 3 episodios subsiguientes de planificacion, se tomaron clones fagicos unicos, sometiendose los sobrenadantes fagicos a ELISA sobre placas revestidas con el anticuerpo que se utilizo para el procedimiento de planificacion. Los clones fagicos que fueron positivos en este ELISA, (senal intensa para la diana, pero sin senal para un control inespecifico), se secuenciaron. A partir de las secuencias del ADN se dedujeron las secuencias peptidicas. Estos peptidos se sintetizaron y caracterizaron en el ELISA de inhibicion.

1. Ensayo de inhibicion in vitro (ELISA)

Distintas cantidades de peptidos (2 y 20 �g, tal como se indica en las figuras respectivas), derivados de la exhibicion fagica, se incubaron con el anticuerpo monoclonal que se utilizo para el procedimiento de escaneo. Los peptidos que disminuian la subsiguiente union del anticuerpo al epitopo original de CETP (16 aminoacidos en el extremo C de la proteina CETP), que revistieron las placas ELISA, se consideraron como inhibidores (Resultados que se aprecian i.

a. Figuras 19a a 19c)

2. Ensayo in vivo de mimotopos

Unos peptidos inhibidores, asi como algunos no inhibidores, se conjugaron a KLH y se inyectaron a ratones (tipo de ratones salvajes o CETP-transgenicos, subcutaneamente en el flanco o intradermicamente en las orejas) o en conejos (subcutaneamente en los flancos) junto con un adyuvante apropiado (hidroxido de aluminio y Gerbu 100 para ratones e indroxido de aluminio o CFA/IFA para conejos).

Los titulos para los peptidos inyectados, asi como para el epitopo CETP original, se determinaron. Ademas, para los sueros seleccionados tambien se midio la respuesta inmune a la proteina CETP (resultados, ver de figura a a d y 19a a 19e).

3. Resultados

3.1. Escaneo con 2 anticuerpos derivados de "Fusion F": "Paula" y "Felix".

3.1.1. Biblioteca de exhibicion fagica Ph.D.

3.1.1.1. Escaneo con el anticuerpo monoclonal "Paula"

Se identificaron 1 secuencias en este escaneo.

P2�8 SYHATFL P2�9 TMAFPLN P2�11 HYHGAFL P2�12 EHHDIFL P2�15 SSLELFL P2�16 TGLSVFL P3�2 WMPSLFY P3�6. 14. 28 SMPWWFF P3�9 TMPLLFW P3�13 DTWPGLE P3�16 SMPPIFY P3�1� MPLWWWD P3�18 SMPNLFY P3�19 RMPPIFY P3�21 NPFEVFL P3�25 TLPNWFW P3�26 SMPLTFY

El resultado de un ELISA de competicion, representativo se muestra en la figura 1.

3.1.1.2. Escaneo con el anticuerpo monoclonal "Felix"

Se identificaron 6 secuencias que inhiben la union del anticuerpo monoclonal "Felix" en experimentos in vitro de competicion:

F2-9 C SFLDTLT F3-6 C NFLKTLS F3-18 C DFLRTLT F3-23 C AFLDTLV F3-34 C TFLSSLA F3-38 C GFLDSLM

Se identificaron 12 secuencias que no inhiben la union del anticuerpo monoclonal "Felix" en experimentos in vitro de competicion:

F2-2�5 SPHPHFL F2-6 NFMSIGL F2-16/F3-30 SQFLASL F2-29 SNFLKTL

F3-1-� TGFLATL F3-11-� WSWPGLN F3-1�-IAWPGLD F3-32-SKFMDTL

5 F3-41-SDFLRAL F3-44-� SMPMVFY F3-49-YEWVGLM F3-64-KGFLDHL

10 Todos los mimotopos que inhiben la union del anticuerpo monoclonal "Felix" in vitro, se acoplaron a KLHy se inyectaron subcutaneamente (en el flanco; s.c.), o intradermicamente (i.d.) en ratones de tipo salvaje (los ratones no tienen la proteina CETP), ratones CETP-tg, o conejos, respectivamente, e indujeron la respuesta inmune al peptido inyectado con todos los adyuvantes que se ensayaron (alumbre y CFA (Adyuvante completo de Freund's); Gerbu).

15 Para todos los mimotopos que inhiben in vitro, mencionados anteriormente, pudieron detectarse en ratones y conejos anticuerpos que reaccionaban al epitopo CETP original.

Para 5 de los 6 mimotopos (ver a continuacion y en la tabla 1), los anticuerpos que reaccionaban con CETP humano purificado, y el CETP humano expresado de modo recombinante, pudieron detectarse en los ELISAs de los sueros

20 de conejos:

F2-9 C SFLDTLT F3-6 C NFLKTLS F3-18 C DFLRTLT

25 F3-34 C TFLSSLA F3-38 C GFLDSLM

Las inyecciones subcutaneas en el costado se llevaron a cabo en las semanas 1, 3 y , con 30 �g de peptido-KLH por raton. Se llevaron a cabo inyecciones intradermicas en las orejas en las semanas 1, 3 y 6 con 10 �g de

30 peptido-KLH por raton. Los sueros se tomaron 2 semanas despues de la tercera inyeccion. La formulacion de la vacuna con alumbre (siempre 1 mg por raton): hasta 250 �l, se inyecto en un costado. La formulacion con 1 ml por raton (500 �l en cada lado), se realizo en 1x PBS como tampon.

La formulacion vacunal con el Adyuvante Gerbu 100 (Gerbu Cat. Nr. �3100; siempre 50 �l adyuvante por raton): 200 35 �l, 100 �l se inyectaron en cada lado incluyendo como tampon 1x HEPES.

Tabla 1: Resultados de la determinacion del titulo:

Adyuvante

KLH Mimotopo inyectado P40�3 (FG-FPEHLLVD-FLQSLS) P irrelevante

Alumbre s.c. (30 �g peptido)

KLH 1:20.000 n.a. 1:400 Sin titulo

p40�3-KLH

C-FGFPE-HLLVDFLQSLS 1:�0.000 n.a. 1:20.000 Sin titulo

p4223-KLH

F2-9; C-SFLDTLT 1:15.000 1:15.000 1:6.400 Sin titulo

p4181-KLH

F3-6-C-NFLKTLS 1:8.000 1:6.400 1:800 Sin titulo

p4184-KLH

F3-18 C-DFLRTLT 1:5.000 1:10.000 1:3.000 1:2.500

p418�

F3-34 C-TFLSSLA 1:3.200 1:9.000 1:4.000 Sin titulo

p4188-KLH

F3-38 C-GFLDSLM 1:10.000 1:9.000 1:5.000 Sin titulo

p422�-KLH

P12-19; C-SANPRDFLETLF 1:12.800 1:10.000 1:5.000 Sin titulo

p4228-KLH

P12-21; C-RM FPESFLDTLW 1:10.000 1:4.000 1:1.000 1:400

KLH/Gerbu Subcutaneos (peptido 30 �g)

KLH 1:�0.000 n.a. 1:6.000 1:800

p40�3-KLH

C-FGFPEHLLV-DFLQSLS 1:25.000 n.a. 1:15.000 1:200

p4223-KLH

F2-9; C-SFLDTLT 1:40.000 1:25.000 1:50.000 1:1.000

p4181-KLH

F3-6; C-NFLKTLS 1:20.000 1:20.000 1:8.000 1:400

p4184-KLH

F3-18; C-DFLRTLT 1:2�.000 1:35.000 1:15.000 1:6.000

p418�-KLH

F3-34; C-TFLSSLA 1:20.000 1:20.000 1:15.000 Sin titulo

p4188-KLH

F3-38; C-GFLDSLM 1:40.000 1:35.000 1:35.000 1:400

p422�-KLH

P12-19; C-SANPRDFLETLF 1:20.000 1:30.000 1:3.000 1:400

p4228-KLH

P12-21; C-RMFPESFLDTLW 1:2�.000 1:8.000 1:5.000 Sin titulo

p40�3-KLH

C-FGFPEHLLV-DFLQSLS 1:10.000 1:10.000 Sin titulo

KLH/Alum Intradermico (peptido 10 �g)

KLH 1:12.800 n.a. Sin titulo Sin titulo

p40�3-KLH

C-FGFPEHLLV-DFLQSLS 1:10.000 n.a. 1:3.200 Sin titulo

p4223-KLH

F2-9; C-SFLDTLT 1:6.400 1:3.200

p4181-KLH

F3-6; C-NFLKTLS 1:10.000 1:1.500 1:600 Sin titulo

p4184-KLH

F3-18; C-DFLRTLT 1:15.000 1:5.000 1:1.500 Sin titulo

p418�-KLH

F3-34; C-TFLSSLA 1:50.000 1:6.400 1:3.200 1:500

p4188-KLH

F3-38; C-GFLDSLM 1:12.000 1:5.000 1:2.000 Sin titulo

p422�-KLH

P12-19; C-SANPRDFLETLF 1:6.400 1:6.400 Sin titulo Sin titulo

p4228-KLH

P12-21; C-RMFPESFLDTLW 1:20.000 1:2.000 1:1.600 Sin titulo

p4298-KLH

Fr12/3/84 Ext2; c-FG FPAHVSIDWLQS-S 1:25.000 1:3.200 1:1.600 Sin titulo

3.1.2.Biblioteca Ph.D. 12

3.1.2.1. Escaneado con el anticuerpo monoclonal "Paula".

5 Fuera de las 20 secuencias aminoacidas derivadas de este escaneado, 3 inhibian en los experimentos de inhibicion in vitro:

P12-19 SANPRDFLETLF

10 P12-21 RMFPESFLDTLW P12-3� TIYDSFLDSLAS

Los peptidos no inhibidores eran:

15 P12-5/44/46/49 HQSDDKMPWWFF P12-9 KPYLLKDFLEAL P12-24/43-� AMGPYDALDLFL P12-25 TWNPIESFLESL P12-28�42 YVWQDPSFTTFF

20 P12-30 QYQTPLTFLEAL P12-35-RHISPATFLEAL P12-39-HTDSFLSTFYGD P12-42-YVWQDPSFTTFF P12-45-ADSTFTSFLQTL

25 P12-50-GPVSIYADTDFL P12-51-DSNDTLTLAAFL P12-52-NGSPALSHMLFL P12-53-TDYDPMWVFFGY P12-56-IFPLDSQWQTFW

30 P12-58-NESMPDLFYQPS P12-61-DWGDKYFSSFWN

Los resultados de 2 composiciones ELISAs tipicas se muestran en las figuras 2a y 2b.

35 Los 3 mimotopos se acoplaron a KLH y se inyectaron en ratones de tipo salvaje (los ratones no presentaban la proteina CETP), ratones CETP-tg, o conejos, respectivamente, e indujeron respuesta inmunitaria a los peptidos

inyectados con todos los adyuvantes que se ensayaban (alumbre y CFA, Gerbu).

Los mimotopos P12-19; C-SANPRDFLETLF y P12-21; C-RMFPESFLDTLW indujeron una respuesta inmunitaria al epitopo CETP original en ratones blancos y en conejos.

En oposicion, el mimotopo p12-3� C-TIYDSFLDSLAS no indujo una respuesta del anticuerpo al epitopo original.

3.2. Escaneado con 2 anticuerpos a partir de "Fusion I", "Frida" y "James".

3.2.1. Biblioteca Ph.D. � de exhibicion fagica

3.2.1.1. Escaneado con anticuerpos monoclonales "Frida" y "James".

En estos escaneados se identifican dos secuencias peptidicas distintas, teniendo identicas secuencias 11 de los 12 clones que se secuenciaron. Estos peptidos no son inhibidores en experimentos de competicion in vitro.

Fr�-2-2 Fr�-2B-65 Fr�-3Fr�-3-13 Fr�-3-26 Fr�-3-32 Ja�-2-22 Ja�-3-28 Ja�-3-41 Ja�-3-52 Ja�-3-56 VSAYNNV

Ja�-3-89 WPLHLWQ

Los resultados de 2 ELISAs representativos de competicion con mAb "Frida" se muestran en las figuras 3a y 3b. Identico patron se vio en mAb "James".

3.2.2. Biblioteca Ph.D. 12 de exhibicion fagica

3.2.2.1. Escaneo con anticuerpo monoclonal "Frida".

Fr12/2/6 TPTHYYADFSQL Fr12/2/11 LPGHLIWDSLHY Fr12/2/2� LPQTHPLHLLED

Fr12/3/1 Fr12/3/19 Fr12/3/88 IPYHHLVDQLHH

Fr12/3/26 Fr12/3/65 YPYHVQVDVLQN

Fr12/3/68 IPSHHLQDSLQL Fr12/3/12 EYAHHTSLDLRQ Fr12/3/83 EPLHFRSDRIQA Fr12/3/55 ATPSHLIIDRAQ Fr12/3/63 APKHLYADMSQA Fr12/3/84 FKPAHVSIDWLQ Fr12/3/4� MPAHLSRDLRQS Fr12/3/80 NPKHYSIDRHQA Fr12/3/40 SPQHLTTDRAQA Fr12/3/35 TPFHFAQDSWQW

Ninguna de las 15 secuencias aminoacidas identificadas en este escaneo inhibian en experimentos de competicion in vitro. Sin embargo, el analisis de las secuencias revelo una homologia bastante alta con la secuencia proteica original para muchos de los mimotopos. Por otra parte, se pudo mostrar la union de algunos peptidos de anticuerpos monoclonales "Frida" a las placas ELISA revestidas con mimotopo-BSA (ver las figuras 4a y 4b).

Esto muestra que la union del anticuerpo monoclonal a los mimotopos inmovilizados no permite necesariamente predecir la inhibicion en la competicion ELISA in vitro.

Los experimentos de inhibicion in vitro con variaciones de la secuencia original FGFPEHLLVDFLQSLS (16 aminoacidos del extremo c de la proteina CETP) mostraron que la extraccion de mas de 2 aminoacidos del extremo N o de mas de 1 del extremo C, abole la inhibicion (para los anticuerpos monoclonales "Frida" y "James", "Paula" y "Felix" reconocen una parte distinta de la secuencia original).

Ademas, la eliminacion simultanea de 2 aminoacidos del extremo N y de 1 aminoacido del extremo C da lugar tambien a un peptido que ya no inhibe in vitro.

C-FGFPEHLLVDFLQSLS secuencia "original" (peptido derivado de CETP)/que inhibe in vitro

C-GFPEHLLVDFLQSLS secuencia N-1/que inhibe in vitro

C-FPEHLLVDFLQSLS secuencia N-2/que inhibe in vitro

C-PEHLLVDFLQSLS secuencia N-3/que inhibe ligeramente in vitro

C-FGFPEHLLVDFLQSL secuencia C-1/que inhibe in vitro

C-FGFPEHLLVDFLQS secuencia C-2/que no inhibe in vitro

C-FPEHLLVDFLQSL secuencia N-2 y C-1/que no inhibe in vitro!

FGFPEHLLVDFLQSLS "original"

Fr12/2/6 TPTHYYADFSQL Fr12/2/11 LPGHLIWDSLHY Fr12/2/2� LPQTHPLHLLED

Fr12/3/1 IPYHHLVDQLHH Fr12/3/19 IPYHHLVDQLHH Fr12/3/88 IPYHHLVDQLHH

Fr12/3/26 YPYHVQVDVLQN Fr12/3/65 YPYHVQVDVLQN Fr12/3/68 IPSHHLQDSLQL Fr12/3/12 EYAHHTSLDLRQ Fr12/3/83 EPLHFRSDRIQA Fr12/3/55 ATPSHLIIDRAQ Fr12/3/63 APKHLYADMSQA Fr12/3/84 FKPAHVSIDWLQ Fr12/3/4� MPAHLSRDLRQS Fr12/3/80 NPKHYSIDRHQA Fr12/3/40 SPQHLTTDRAQA Fr12/3/35 TPFHFAQDSWQW

Consecuentemente, utilizando la secuencia original CETP como matriz, las secuencias peptidicas obtenidas en este procedimiento de exhibicion Fagica, se alargaron en el extremo N y/o el extremo C, para comprobar si la inhibicion in vitro es posible con peptidos mas largos.

3.2.2.2. Mimotopos Frida Pd.D.12 y sus variaciones

Fr12/2/6 TPTHYYADFSQL Fr12/2/6 ext1 TPTHYYADFSQLLS Fr12/2/6 ext2 TPTHYYADFSQSLS Fr12/2/6 ext3 GTPTHYYADFSQLL Fr12/2/6 ext4 GTPTHYYADFSQSL Fr12/2/6 ext5 FGTPTHYYADFSQSLS Fr12/2/6 ext6 FGFPTHYYADFSQSLS

Fr12/2/11 LPGHLIWDSLHY Fr12/2/11 ext1 LPGHLIWDSLHYL Fr12/2/11 ext2 LPGHLIWDSLHYLS Fr12/2/11 ext3 LPGHLIWDSLHSL Fr12/2/11 ext4 LPGHLIWDSLHSLS Fr12/2/11 ext5 GLPGHLIWDSLHYL

Fr12/2/11 ext5 GLPGHLIWDSLHSL Fr12/2/11 ext6 FGLPGHLIWDSLHSLS Fr12/2/11 ext� FGFPGHLIWDSLHSLS

Fr12/2/2� LPQTHPLHLLED

Fr12/3/1/19/88 ext1 IPYHHLVDQLHLS Fr12/3/1/19/88 ext2 IPYHHLVDQLHSLS Fr12/3/1/19/88 ext3 FGIPYHHLVDQLHHLS Fr12/3/1/19/88 ext4 FGFPYHHLVDQLHSLS

Fr12/3/26/65 ext1 YPYHVQVDVLQNLS Fr12/3/26/65 ext2 YPYHVQVDVLQSLS Fr12/3/26/65 ext3 FGYPYHVQVDVLQNLS Fr12/3/26/65 ext4 FGFPYHVQVDVLQSLS

Fr12/3/68 ext1 IPSHHLQDSLQLLS Fr12/3/68 ext2 IPSHHLQDSLQSLS Fr12/3/68 ext3 GIPSHHLQDSLQLL Fr12/3/68 ext4 FGIPSHHLQDSLQLLS Fr12/3/68 ext5 FGFPSHHLQDSLQSLS

Fr12/3/83 ext1 EPLHFRSDRIQALS Fr12/3/83 ext2 EPLHFRSDRIQSLS Fr12/3/83 ext3 GEPLHFRSDRIQAL Fr12/3/83 ext4 FGEPLHFRSDRIQALS Fr12/3/83 ext5 FGFPLHFRSDRIQSLS

Fr12/3/55 ext1 ATPSHLIIDRAQSLS Fr12/3/55 ext2 FGFPSHLIIDRAQSLS Fr12/3/55 ext 2 R->W FGFPSHLIIDWAQSLS Fr12/3/55 ext2RA->WL FGFPSHLIIDWLQSLS

Fr12/3/63 ext1 APKHLYADMSQALS Fr12/3/63 ext2 APKHLYADMSQSLS Fr12/3/63 ext3 GAPKHLYADMSQAL Fr12/3/63 ext4 FGFPKHLYADMSQSLS

Fr12/3/84 ext1 FKPAHVSIDWLQSLS

Fr12/3/84 ext2 FGFPAHVSIDWLQSLS

Fr12/3/4� ext1 MPAHLSRDLRQSL Fr12/3/4� ext2 MPAHLSIDLRQSLS Fr12/3/4� ext3 GMPAHLSRDLRQSL Fr12/3/4� ext4 FGFPAHLSRDLRQSLS

Fr12/3/40 ext1 SPQHLTTDRAQALS Fr12/3/40 ext2 SPQHLTTDRAQSLS Fr12/3/40 ext3 GSPQHLTTDRAQAL Fr12/3/40 ext4 FGFPQHLTTDRAQSLS Fr12/3/35 ext1 TPFHFAQDSWQWLS Fr12/3/35 ext2 TPFHFAQDSWQSLS Fr12/3/35 ext3 GTPFHFAQDSWQWL Fr12/3/35 ext4 FGFPFHFAQDSWQSLS

Los ejemplos representativos de ELISA inhibicion se muestran en la figura 5a y 5b. Los peptidos alargados Fr12/3/84 ext2 y Fr12/3/55 ext3 mostraron una inhibicion significativa:

C-FGFPSHLIIDRAQSLS Fr12/3/55 ext3

C-FGFPAHVSIDWLQSLS Fr12/3/84 ext2

Tres peptidos adicionales tambien eran inhibidores en este ensayo:

C-FGFPYHVQVDVLQSLS Fr12/3/26/65 ext4

C-FKPAHVSIDWLQSLS Fr12/3/84 ext1 C-FGFPQHLTTDRAQSLS Fr12/3/40 ext4

5 Despues del analisis de la secuencia que comparaba el equipo original y todos los mimotopos derivados de los escaneados de la Muestra Fagica, se crearon otros dos peptidos. Para el mimotopo Fr12/3/55 ext3 C-FGFPSHLIIDRAQSLS (que inhibe en ELISA, ver anteriormente), se ensayaron

los intercambios aminoacidos en la ELISA de inhibicion: 10 Inhibiendo intensamente: C-FGFPAHVSIDWLQSLS Fr12/3/84 ext2 15 Inhibiendo ligeramente: C-FGFPSHLIIDEAQSLS Fr12/3/55 ext3 Peptidos con secuencias alteradas (inhibiendo, ver figura 6): 20 C-FGFPSHLIIDWAQSLS Fr12/3/55 ext2, en vez de R C-FGFPSHLIIDWLQSLS Fr12/3/55 ext2 WL en vez de RA 25 Otros mimotopos preferidos se caracterizaron por el siguiente ejemplo expuesto.

Exp. Nr. CETP-42

C42-1 KLH/Alum

C42-2

p40�3-KLH/Alum C-FGFPEHLLVDFLQSLS

C42-3

p40�3 LLV -> LFV p4468-KLH/Alum C-FGFPEHLFVDFLQSLS

C42-4

Fr12/3/84 ext2 VSI -> VFI p4361-KLH/Alum C-FGFPAHVFEDWLQSLS

C42-5

Fr12/3/84 ext2 VSI ->VHI p4469-KLH/Alum C-FGFPAHVHIDWLQSLS

C42-6

Fr12/3/84 ext2 VSI -> VPI p44�0-KLH/Alum C-FGFPAHVPIDWLQSLS

C42

Fr12/3/84 ext2 VSI -> VWI p44�1-KLH/Alum C-FGFPAHVWIDWLQSLS

C42-8

Fr12/3/55 ext2 R->W LII-> LFI p44�2 KLH/Alum C-FGFPSHLFIDWAQSLS

C42-9

Fr12/3/84 ext2 VSI�->VFI FGF->PGF SLS ->LIT p44�3-KLH/Alum C-PGFPAHVFIDWLQLIT

C42-10

Fr12/3/84 ext2 VSI->VYI p4362 KLH/Alum C-FGFPAHVYIDWLQSLS

Exp. Nr. CETP-45

C45-1 KLH/Alum

C45-2

p1358-KLH/Alum Peptido de control negativo

C45-3

p40�3-KLH/Alum C-FGFPEHLLVDFLQSLS

C45-4

Fr12/3/84 ext2 VSI->VFI SLS->SLN p44�4-KLH/Alum C-FGFPAHVFIDWLQSLN

C45-5

Fr12/3/84 ext2 VSI->FSI p44�5-KLH/Alum C-FGFPAHFSIDWLQSLS

C45-6

Fr12/3/84 ext2 VSI ->VSF p44�6-KLH/Alum C-FGFPAHVSFDWLQSLS

C45

Fr12/3/84 ext2 VSI->VFI PAH->PEH p44��-KLH/Alum C-FGFPEHVFIDWLQSLS

C-45-8

Fr12/3/19/88 ext4 p4284-KLH/Alum C-FGFPYHHLVDQLHSLS

C45-9

Fr12/3/84 ext1 VSI-VFI mas G sobre p44�9-KLH/Alum C

el extremo N

GFKPAHVFIDWLQSLS

C45-10

Fr12/3/84 ext2 VSI->VFI mas D sobre el extremo N; =4361 plus D p4480-KLH/Alum C-DFGFPAHVFIDWLQSLS

C45-11

Fr12/3/40 ext4 RA->WL LTT->LFT = p4369 con intercambio T�F p4481-KLH/Alum C-FGFPQHLFTDWLQSLS

C45-12

Fr12/3/55 ext2 RA->WL (vease C-31 y C-33; actividad inhibitoria serica) p4325-KLH/Alum C-FGFPSHLIIDWLQSLS

C45-13

Fr12/3/84 ext2 FGF->FYF(vease C33: reconocimiento proteina/actividad no inhibitoria) p4343-klh/Alum C-FYFPAHVSIDWLQSLS

C45-14

Secuencia de conejo p4125-KLH/Alum C-FGFPKHLLVDFLQSLS

3.2.2.3. Ensayo in vivo de mimotopos

5 Unos ratones hembras Balb/c, 4 animales por grupo, se inmunizaron subcutaneamente con 30 �g de peptido acoplado a KLH. A los grupos de control se le administro KLH o C-FGFPEHLLVDFLQSLS. Se utilizo alumbre como adyuvante. Los peptidos administrados fueron todos capaces de unirse a "Frida" e inducir una respuesta inmunitaria para CETP, aunque alguno de estos peptidos no inhibieron la union de CETP a "Frida" in vitro (en un ensayo de inhibicion in vitro). El ensayo ELISA in vitro para determinar el titulo de anticuerpos se llevo a cabo con sueros que

10 se habian unido despues de dos vacunaciones en un intervalo de 2 semanas (S2; vease figura �a a �d). Las paredes de la placa ELISA se revistieron con KLH (control positivo), mimotopo-BSA conjugado, C-FGFPEHLLVDFLQSLS y un conjugado peptido-BSA irrelevante (control negativo). La deteccion se realizo con IgG anti-raton.

15 3.2.3. Biblioteca Ph.D.�C de muestra del fajo

3.2.3.1. Escaneo con anticuerpos monoclonales "Frida" y "James"

Fr2-1 ACSFAYLYRC

20 Fr2-5 Fr2-6 Fr2-18 Fr2-19 Fr2-28

25 Ja2-5 Ja2-20 Ja2-23 Ja2-24 Ja2-30 ACFMGDKWVC

30 Fr2Fr2-9 ACVLYPKAIC

Fr2-11 35 Ja2-19 ACYMGQQFVC

Fr2-16 ACLTAYLHWC

Fr2-20 ACTLFPVAYC 40 Fr-25 ACWLFPYAHC

Fr2-26 ACKSINMWLC

45 Fr2-2� ACQTINRWLC

Debido a la naturaleza ciclica de estos peptidos-mimotopos, su sintesis es mas complicada que la sintesis de peptidos lineales, siete de 9 secuencias ciclicas se seleccionaron para el analisis in vitro en la ELISA inhibicion (ver las figuras 8a y 8b). Ninguna de estas secuencias inhibio la union del anticuerpo monoclonal que se utilizo para el 50 escaneo de la exhibicion fagica al epitopo CETP original. Ademas, cuando estos peptidos se acoplaron a BSA y se revistieron sobre la palca ELISA, no fueron detectados por el anticuerpo monoclonal (ver la figura 9). Esto fue al reves que los datos con mimotopos derivados de las bibliotecas Ph.D. o Ph.D. 12, en las que los anticuerpos monoclonales se unieron a la mayor parte de los mimotopos identificados cuando estos peptidos se unieron a BSA y

revistieron las placas ELISA.

Ejemplo 3. Ensayo de actividad CETP

El ensayo de actividad CETP se realizo con ensayos comercialmente disponibles (por ejemplo Ensayo de actividad ROAR CETP) y que se describieron, por ejemplo en las patentes US n° 5.585.235, US n° 5.618.683 y US n°

5.��0.355. El ensayo se lleva a cabo segun las recomendaciones del fabricante.

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1. Compuesto que comprende la secuencia aminoacida FGFPAHVFIDWLQSLS o FGFPAHVYIDWLQSLS o

   FGFPAHVFIDWLQSLN para su utilizacion en la prevencion y/o el tratamiento de la aterosclerosis, enfermedad 5 oclusiva arterial periferica, enfermedad cardiaca coronaria o lesion cerebral apoplejica.
2. 2. Compuesto para la utilizacion segun la reivindicacion 1, caracterizado porque el compuesto se acopla a un vehiculo farmaceuticamente aceptable, preferentemente KLH (hemocianina de lapa californiana).

   10 3. Compuesto para la utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el compuesto se formula para la administracion intradermica, subcutanea o intramuscular.
3. 4. Compuesto para la utilizacion segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el compuesto

   se formula con un adyuvante, preferentemente hidroxido aluminico. 15
4. 5. Peptido que consiste en por lo menos una secuencia aminoacida seleccionada de entre el grupo constituido por FGFPAHVFIDWLQSLS, FGFPAHVYIDWLQSLS y FGFPAHVFIDWLQSLN.
5. 6. Formulacion farmaceutica que comprende por lo menos un peptido segun la reivindicacion 5. 20

   �. Formulacion segun la reivindicacion 6, caracterizada porque el peptido se acopla a un vehiculo farmaceuticamente aceptable, preferentemente KLH (hemocianina de lapa californiana).