KR101983685B1 - 백신 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 프로단백질 컨버타아제 서브틸리신/켁신 9형 (PCSK9)의 2개 이상의 단편을 포함하는 백신으로서, 상기 2개 이상의 단편이 PCSK9 (SEQ ID NO.9)의 아미노산 잔기 150번 내지 170번 및 205번 내지 225번의 8개 이상의 연속 아미노산 잔기를 포함하는 백신에 관한 것이다.

Description

백신 {VACCINE}
본 발명은 면역원성 담체에 연결된 2개의 상이한 PCSK9 에피토프의 조합물로부터 유래된 PCSK9에 대한 신규한 조합된 면역원성 펩티드 백신의 개발과 관련된다. 이러한 백신은 고지혈증, 고콜레스테롤혈증 및 죽상경화증에 의해 초래된 건강 장애의 예방 및/또는 치료를 위해 확립된다.
고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 고혈압 및 죽상경화증은 전세계적인 치사율에 대한 주된 요인으로서 간주되는 심혈관 장애이다. 비만, 당뇨병, 흡연 및 신체 활동의 부족과 같은 요인과 함께, 심혈관 변형의 발생에 대한 주요 요인은 상염색체 우성 고콜레스테롤혈증 (ADH)과 같은 유전자 장애이다. ADH는 심혈관 장애의 발생에 대한 중요한 요인으로서 간주되며, 손상된 콜레스테롤 대사 및 증가된 수준의 저밀도 지단백질 콜레스테롤에 의해 나타나며, 이는 후속하여 조기 관상동맥 질환 (CAD) 형성을 초래한다.
3개의 주요 유전자 변형이 ADH의 발생을 초래할 수 있는 것으로 공지되어 있다. 전형적인 형태의 ADH는 저밀도 지단백질 수용체 (이하, LDLR로 불림)에서의 돌연변이에 의해 초래된다. 또한, 아포지단백질 B-100 (apoB-100)에서의 돌연변이 및 더욱 특이적으로, 이의 리간드-결합 도메인에서의 돌연변이는 ApoB-100의 LDLR으로의 결합을 파괴하고, 그 후, 이는 손상된 콜레스테롤 대사를 초래한다. 최종적으로, 유전자 변형에 의해 ADH의 발생에 관여할 수 있는, 제 3의 그리고 가장 최근에 밝혀진 요소는 단백질 컨버타아제 서브틸리신/켁신 9형 (이하, PCSK9로 불림)이다.
또한, 신경 아폽토시스-조절된 컨버타아제 1 (NARC-1)으로서 공지된 PCSK9은 분비성 서브틸라아제 패밀리중 9번째 구성원으로서 확인된 프로테이나아제 K-유사 서브틸라아제이다. PCSK9 단백질은 ~72kDa 프로단백질로서 합성되며, 이는 프로도메인과 촉매 도메인 사이에서 자동촉매적으로 절단 처리되어 결국은 성숙한 단백질 형태의 생성을 유도한다. 프로도메인 (~14kDa)은 성숙한 단백질 63kDa에 결합된 채 유지되며, 이러한 형태로 성숙한 단백질이 분비 경로에 이른다.
지질 항상성에서의 PCSK9의 역할은 이미 널리 공지되어 있다. PCSK9의 발현이 지질 항상성에 관여하는 다른 스테롤-조절 요소 결합 단백질 (이하에서는 SREBP (Sterol-Regulatory Element Binding Protein)로 불림)-반응성 유전자와 유사한 방식으로 SREBP에 의해 조절된다는 점뿐만 아니라, PCSK9가 또한, LDLR 내재화 및 분해를 촉진함으로써 저밀도 지단백질 콜레스테롤 (이하에서는 LDLc로 불림) 제거에 관여한다는 점이 공지되어 있다.
시험관내 및 생체내 연구는 혈액으로부터 저밀도 지단백질 콜레스테롤 흡수에서 PCSK9의 필수 역할을 강조하였다. 한편으로, PCSK9 아데노바이러스 과다발현은 순환하는 LDLc의 수준을 현저하게 증가시켰으며, 다른 한편으로, PCSK9-/- 마우스는 야생형 동물과 비교하여 LDLR 수준의 2.8배 증가 및 LDLc의 감소를 나타내었다.
이러한 유전자는 인간 염색체 1p33-p34.3에 위치하며, 간, 신장, 소뇌 및 소장과 같은 조직에서 발현된다. 많은 연구에 의해 "기능획득 돌연변이"가 LDLR 수준의 감소를 초래하고, 결과적으로 고콜레스테롤혈증 및 죽상경화증에 걸리기 쉬운 유전적 소인을 초래함이 확인되었다. "기능손실 돌연변이"는 LDLR 수준을 증가시켜, 결과적으로 저밀도 지단백질 콜레스테롤 (LDLc)의 감소를 초래한다.
전체적으로, PCSK9는 LDLR 수준을 전사후 조절하며, 따라서, 죽상경화증 치료를 위한 매력적인 표적이다.
한편, PCSK9의 기능을 억제하기 위한 수 많은 다양한 전략 및 방법이 확립되었다.
원숭이 (필리핀 원숭이 (Macaca fascicularis))에서 PCSK9에 대한 siRNA의 적용은 전체 콜레스테롤의 현저한 저하를 유도하였다. 마우스 및 인간외 영장류에서의 PCSK9에 대한 모노클로날 및 폴리클로날 항체로의 다른 연구는 전체 콜레스테롤 및 LDLc의 수준에서의 감소를 수반하며 LDLR을 상향조절하는데 성공적이었다.
소분자 억제제에 대한 PCSK9의 불활성화 또는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 요법 및 넉 아웃 기법 (knock out technology)에 의한 PCSK9 수준의 감소는 다양한 동물 모델에서 어떠한 부작용도 나타내지 않았다. 따라서, 대체로 PCSK9은 죽상경화증 치료에 매우 매력적인 표적이다.
WO 2011/027257는 PCSK9-매개된 장애의 치료, 예방 및 완화를 위한 백신에 사용될 수 있는, PCSK9으로부터 유래된 면역원성 단편에 관한 것이다.
WO 2009/100297에는, 인간 PCSK9의 길항제가 기재되어 있다.
WO 2010/057242는 인간 PCSK9의 단편으로부터 유래된 펩티드를 포함하는 백신에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 PCSK9을 억제하고, PCSK9과 LDLR의 상호작용을 해제/감소시킬 수 있는, PCSK9에 대한 펩티드 기반 백신을 제공하는 것이다. 이는 간세포에서 LDLR의 증가된 수준을 유도하고, 전체 콜레스테롤 및 LDLc의 후속 감소를 유도한다.
이러한 목적은 프로단백질 컨버타아제 서브틸리신/켁신 9형 (PCSK9)의 다중 (하나 초과, 2개 이상)의 단편을 포함하는 백신에 의해 달성되며, 여기서 상기 2개 이상의 단편중 제 1 단편은 PCSK9 (SEQ ID NO. 9)의 아미노산 잔기 150번 내지 170번의 8개 이상의 연속 아미노산 잔기를 포함하며, 상기 2개 이상의 단편중 제 2 단편은 PCSK9의 아미노산 잔기 205번 내지 225번의 8개 이상의 연속 아미노산 잔기를 포함한다.
놀랍게도, 상기 규정된 바와 같은 PCSK9의 2개 이상의 상이한 펩티드 단편을 포함하는 백신이, PCSK9의 단지 하나의 단편을 포함하는 백신과 비교하여 훨씬 더욱 효과적으로 LDL 수용체의 양을 증가시킬 수 있음이 밝혀졌다. 본 발명의 백신의 투여는 예를 들어, 생체내 간세포에서 저밀도 지단백질 수용체의 수준의 증가를 유도한다. 그 결과로서, 백신 투여시 혈장내 LDLc 및 전체 콜레스테롤의 평균값은 현저하게 감소한다. 따라서, 본 발명에 따른 백신의 투여는 단일 펩티드의 투여와 비교하여, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증 및/또는 죽상경화증에 의해 초래된 질환을 훨씬 더욱 효과적이고 정확하게 치료하거나 예방한다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 백신의 모든 PCSK9 단편은 SEQ ID NO. 9의 아미노산 잔기 150번 내지 170번 및 205번 내지 225번으로 구성된 PCSK9 단편으로부터 유래된다.
본 발명의 백신에 사용된 펩티드 단편은 PCSK9 (SEQ ID No. 9)의 아미노산 잔기 150번 내지 170번, 바람직하게는, 아미노산 잔기 153번 내지 165번, 및 205번 내지 225번, 바람직하게는, 아미노산 잔기 209번 내지 222번의 8개 이상, 바람직하게는, 9개 이상, 더욱 바람직하게는, 10개 이상의 연속 아미노산 잔기를 포함한다.
SEQ ID NO. 9 (PCSK9 아미노산 서열):
Figure 112014034945420-pct00001

PCSK9으로부터 유래된 단편은 바람직하게는, 8개 내지 20개, 더욱 바람직하게는, 10개 내지 15개 아미노산 잔기를 포함하거나 이들로 구성된다. 본 발명의 특히 바람직한 구체예에 있어서, PCSK9의 아미노산 잔기 150번 내지 170번으로부터 유래된 펩티드는 8개 내지 15개, 바람직하게는, 10개 내지 13개 아미노산 잔기를 포함한다. PCSK9의 아미노산 잔기 205번 내지 225번으로부터 유래된 펩티드는 8개 내지 16개, 바람직하게는, 10개 내지 14개 아미노산 잔기를 포함한다.
본 발명의 백신은 PCSK9 (SEQ ID No. 9)의 아미노산 잔기 150번 내지 170번 및 205번 내지 225번으로부터 유래된 2개 이상, 바람직하게는, 3개 이상, 더욱 바람직하게는, 4개 이상, 심지어 더욱 바람직하게는, 5개 이상의 펩티드의 조합물이다. 이러한 조합물은 다양한 에피토프 기원을 갖는 2개 이상의 서열을 포함한다.
본 발명의 펩티드는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성될 수 있다. 물론, 재조합 방법을 이용하여 본 발명의 펩티드를 생성하는 것이 또한 가능하다. 펩티드는 박테리아, 효모 또는 균류와 같은 미생물, 포유동물 또는 곤충 세포와 같은 진핵 세포, 또는 아데노바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스 바이러스, 심리키 포레스트 바이러스 (Simliki forest virus), 바쿨로바이러스, 박테리오파아지, 신드비스 바이러스 (sindbis virus) 또는 센다이 바이러스 (Sendai virus)와 같은 재조합 바이러스 벡터에서 생성될 수 있다. 펩티드를 생성하는데 적합한 박테리아는 E. 콜라이 (E. coli), B. 서브틸리스 (B. subtilis) 또는 이러한 펩티드를 발현할 수 있는 임의의 다른 박테리아를 포함한다. 본 발명의 펩티드를 발현하는데 적합한 효모 세포는 사카로미세스 세레비시아 (Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 칸디다 (Candida), 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) 또는 펩티드를 발현할 수 있는 임의의 다른 효모를 포함한다. 상응하는 수단 및 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 또한, 재조합으로 생성된 펩티드를 분리하고 정제하는 방법은 당해분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어, 겔 여과, 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 등을 포함한다.
본 발명의 펩티드의 분리를 용이하게 하기 위해, 펩티드가 친화성 크로마토그래피에 의한 분리를 가능케 하는 이종성 폴리펩티드에 번역적으로 융합된 (공유적으로 결합된) 융합 폴리펩티드가 제조될 수 있다. 전형적인 이종성 폴리펩티드는 His-Tag (예를 들어, His6; 6개 히스티딘 잔기), GST-Tag (글루타티온-S-트랜스퍼라아제) 등이다. 융합 폴리펩티드는 펩티드의 정제를 용이하게 할 뿐만 아니라, 정제 단계 동안 펩티드의 분해를 방지할 수 있다. 정제 후 이종성 폴리펩티드를 제거하고자 하는 경우, 융합 폴리펩티드는 펩티드와 이종성 폴리펩티드 사이의 접합부에 절단 부위를 포함할 수 있다. 절단 부위는 그 부위에서의 아미노산 서열에 대해 특이적인 효소 (예를 들어, 프로테아제)로 절단되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.
본 발명에 있어서, 하나 이상의 단편은 PCSK9 (SEQ ID No. 9)의 아미노산 잔기 150번 내지 170번으로부터 유래되며, 하나 이상의 단편은 아미노산 잔기 205번 내지 225번로부터 유래된다.
본 발명의 백신은 PCSK9 단백질의 상이한 부분의 PCSK9 단편을 포함한다. 따라서, 하나 이상의 단편이 하나의 특이적인 PCSK9 단편으로부터 유래되는 반면, 하나 이상의 단편은 또 다른 특이적 PCSK9 단편으로부터 유래되는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에 있어서, PCSK9의 2개 이상의 단편은 아미노산 서열 SIPWNLERITPPR (SEQ ID No. 2), PEEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 3), PEEDGTRFHRQA (SEQ ID No. 4), EEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 5), EEDGTRFHRQAS (SEQ ID No. 6), SIPWNLERITP (SEQ ID No. 7) 및 SIPWNLERIT (SEQ ID No. 8)을 갖는 펩티드로 구성된 군으로부터 선택된다.
PCSK9의 2개 이상의 단편은 또한, FAQSIPWNLERITPPRYRAD (SEQ ID No. 10), FAQSIPWNLERITPPRYRA (SEQ ID No. 11), FAQSIPWNLERITPPRYR (SEQ ID No. 12), FAQSIPWNLERITPPRY (SEQ ID No. 13), FAQSIPWNLERITPPR (SEQ ID No. 14), FAQSIPWNLERITPP (SEQ ID No. 15), AQSIPWNLERITPPRYRAD (SEQ ID No. 16), QSIPWNLERITPPRYRAD (SEQ ID No. 17), SIPWNLERITPPRYRAD (SEQ ID No. 18), AQSIPWNLERITPPRYRA (SEQ ID No. 19), QSIPWNLERITPPRYRA (SEQ ID No. 20), SIPWNLERITPPRYRA (SEQ ID No. 21), AQSIPWNLERITPPRYR (SEQ ID No. 22), QSIPWNLERITPPRYR (SEQ ID No. 23), SIPWNLERITPPRYR (SEQ ID No. 24), QSIPWNLERITPPRY (SEQ ID No. 25), SIPWNLERITPPRY (SEQ ID No. 26), AQSIPWNLERITPPR (SEQ ID No. 27), QSIPWNLERITPPR (SEQ ID No. 28), SIPWNLERITPP (SEQ ID No. 29), ENVPEEDGTRFHRQASKCDS (SEQ ID No. 30), ENVPEEDGTRFHRQASKCD (SEQ ID No. 31), ENVPEEDGTRFHRQASKC (SEQ ID No. 32), ENVPEEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 33), NVPEEDGTRFHRQASKCDS (SEQ ID No. 34), VPEEDGTRFHRQASKCDS (SEQ ID No. 35), PEEDGTRFHRQASKCDS (SEQ ID No. 36), NVPEEDGTRFHRQASKCD (SEQ ID No. 37), VPEEDGTRFHRQASKCD (SEQ ID No. 38), PEEDGTRFHRQASKCD (SEQ ID No. 39), NVPEEDGTRFHRQASKC (SEQ ID No. 40), VPEEDGTRFHRQASKC (SEQ ID No. 41), PEEDGTRFHRQASKC (SEQ ID No. 42), NVPEEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 43), VPEEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 44), PEEDGTRFHRQAS (SEQ ID No. 45)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 구성되거나 이들을 포함할 수 있다.
PCSK9의 하나 이상의 단편은 바람직하게는, SIPWNLERITPPR (SEQ ID No. 2), SIPWNLERITP (SEQ ID No. 7) 및 SIPWNLERIT (SEQ ID No. 8)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지며, PCSK9의 하나 이상의 단편은 PEEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 3), PEEDGTRFHRQA (SEQ ID No. 4), EEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 5) 및 EEDGTRFHRQAS (SEQ ID No. 6)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 본 발명의 백신은 SIPWNLERITPPR (SEQ ID No. 2)와 PEEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 3), SIPWNLERITPPR (SEQ ID No. 2)와 PEEDGTRFHRQA (SEQ ID No. 4), SIPWNLERITPPR (SEQ ID No. 2)와 EEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 5), SIPWNLERITPPR (SEQ ID No. 2)와 EEDGTRFHRQAS (SEQ ID No. 6), PEEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 3)와 SIPWNLERITP (SEQ ID No. 7), PEEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 3)와 SIPWNLERIT (SEQ ID No. 8), PEEDGTRFHRQA (SEQ ID No. 4)와 SIPWNLERITP (SEQ ID No. 7), PEEDGTRFHRQA (SEQ ID No. 4)와 SIPWNLERIT (SEQ ID No. 8), EEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 5)와 SIPWNLERITP (SEQ ID No. 7), EEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 5)와 SIPWNLERIT (SEQ ID No. 8), EEDGTRFHRQAS (SEQ ID No. 6)와 SIPWNLERITP (SEQ ID No. 7) 또는 EEDGTRFHRQAS (SEQ ID No. 6)와 SIPWNLERIT (SEQ ID No. 8)를 포함하며, PEEDGTRFHRQA (SEQ ID No. 4)와 SIPWNLERITP (SEQ ID No. 7), EEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 5)와 SIPWNLERITP (SEQ ID No. 7), EEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 5)와 SIPWNLERIT (SEQ ID No. 8) 또는 EEDGTRFHRQAS (SEQ ID No. 6)와 SIPWNLERIT (SEQ ID No. 8)을 포함하는 백신이 특히 바람직하다.
PCSK9의 2개 이상의 단편은 바람직하게는, C- 및/또는 N-말단 단부(에 결합된) 에서 시스테인 잔기를 포함한다.
펩티드의 N- 및/또는 C-말단에서 시스테인 잔기의 공급은 예를 들어, 담체로의 이의 컨쥬게이션을 용이하게 할 수 있으며/있거나, 펩티드의 면역원성을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, PCSK9의 2개 이상의 단편 (즉, PCSK9으로부터 유래된 2개 이상의 펩티드)은 개별적으로 또는 조합되어 약학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는, KLH (키홀 림펫 헤모시아닌 (Keyhole Limpet Hemocyanin))에 결합된다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, PCSK9의 2개 이상의 단편은 약학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는, KLH (키홀 림펫 헤모시아닌), 테타누스 톡소이드, 알부민-결합 단백질, B형 간염 코어 항원, 소 혈청 알부민, 덴드리머 (MAP), 펩티드 링커 (또는 플랭킹 영역), 및 문헌 [Singh et al., Nat. Biotech. 17 (1999), 1075-1081] (특히, 이러한 문헌의 표 1에 기재된 것들), 및 문헌 [O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003), 727-735] (특히, 여기 기재된 내인성 면역-강화 화합물 및 전달 시스템)에 기술된 애주번트 물질, 또는 이들의 혼합물에 결합된다. 이와 관련해서 컨쥬게이션 화학 작용 (예를 들어, GMBS와 같은 이종이작용성 화합물 (heterobifunctional compounds) 및 물론 또한, 문헌 ["Bioconjugate Techniques", Greg T. Hermanson]에 기술된 바와 같은 다른 화합물을 통한)은 당업자에게 공지된 반응으로부터 선택될 수 있다. 게다가, 백신 조성물은 애주번트, 바람직하게는, 저가용성 알루미늄 조성물, 특히 알루미늄 하이드록시드와 제형화될 수 있다. 물론, MF59 알루미늄 포스페이트, 칼슘 포스페이트, 사이토킨 (예를 들어, IL-2, IL-12, GM-CSF), 사포닌 (예를 들어, QS21), MDP 유도체, CpG 올리고뉴클레오티드, LPS, MPL, 폴리포스파젠, 에멀젼 (예를 들어, 프로인드(Freund's), SAF), 리포좀, 리포펩티드, 비로좀, ISCOM, 코크리트 (cochleates), PLG 미립자, 폴록사머 입자, 바이러스-유사 입자, 열불안정성 엔테로톡신 (LT), 콜레라 독소 (CT), 변종 독소 (예를 들어, LTK63 및 LTR72), 미립자 및/또는 중합된 리포좀과 같은 애주번트가 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 펩티드는 바람직하게는, 링커를 통해 담체 또는 애주번트에 결합되며, 링커는 NHS-폴리 (에틸렌 옥사이드) (PEO) (예를 들어, NHS-PEO4-말레이미드)로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 펩티드 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 백신은 임의의 적합한 적용 방식 예를 들어, 피내 (i.d.), 복강내 (i.p.), 근내 (i.m.), 비강내, 경구, 피하 (s.c.), 등에 의해 그리고, 임의의 적합한 전달 기기 (O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9), (2003), 727-735)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 바람직하게는, 피내, 피하 또는 근내 투여를 위해 제형화된다. 각각의 제형을 수득하기 위한 수단 및 방법은 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 ["Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations", Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc, 2004] 참조).
이와 같이, 본 발명에 따른 백신은 2개 이상의 펩티드를 포함하며, 이러한 펩티드는 바람직하게는, 피내, 피하 또는 근내 투여를 위해 제형화된다.
바람직하게는, 본 발명의 백신중의 2개 이상의 펩티드/단편은 애주번트, 바람직하게는, 알루미늄 하이드록시드와 제형화된다.
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, 백신은 고지혈증, 고콜레스테롤혈증 및/또는 죽상경화증에 의해 초래된 장애 바람직하게는, 심혈관 질환, 뇌졸중 또는 말초 혈관 질환의 치료 및/또는 예방에 사용된다.
기술된 바와 같이, 상기 언급된 펩티드 및 이의 조합물은 PCSK9에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 형성을 유도할 수 있다. 항체와 PCSK9과의 상호작용은 생체내 간세포에서 저밀도 지단백질 수용체를 증가시키고, 이어서 총 혈장 콜레스테롤 수준을 감소시킨다.
죽상경화증과 관련된 질환은 바람직하게는, 말초동맥 폐색증, 관상심장 질환, 졸중성 뇌 발작 (apoplectic cerebral insultus) 및 뇌졸중 (stroke)으로 구성된 군으로부터 선택된다.
용어 "고지혈증, 고콜레스테롤혈증 및/또는 죽상경화증과 관련된 질환" 및 "고지혈증, 고콜레스테롤혈증 및/또는 죽상경화증에 의해 초래된 장애"는 고지혈증, 고콜레스테롤혈증 및 죽상경화증의 결과인 질환을 나타낸다. 이러한 질환으로는 특히, 말초동맥 폐색증, 관상심장 질환 및 졸중성 뇌 발작을 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Steinberg, D. J Lipid Res 46(2005):179-190 and Steinberg, D. J Lipid Res 47(2006):1339-1351] 참조).
본 발명의 바람직한 구체예에 있어서, PCSK9의 2개 이상의 단편이 접종당 0.1 ng 내지 10 mg, 바람직하게는, 0.5 내지 500　㎍, 더욱 바람직하게는, 1 내지 100　㎍의 양으로 개체에 투여된다. 바람직한 구체예에서, 이러한 양은 백신중에 존재하는 PCSK9의 모든 단편을 나타낸다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 이러한 양은 백신중에 존재하는 각각의 단일 단편을 나타낸다. 물론, PCSK9의 특이적 단편이 상이하거나 동일한 양으로 존재하는 백신을 제공하는 것이 가능하다. 그러나, 본 발명의 펩티드는 대안적으로, 0.1　ng 내지 10　mg, 바람직하게는, 10　ng 내지 1　mg, 특히, 100　ng 내지 300　㎍/체중 1kg의 양으로 개체에 투여될 수 있다.
단일 투여 형태를 생성하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 펩티드의 양은 치료되는 숙주 및 특정 투여 방식에 따라 다양할 것이다. 백신의 용량은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 요망되는 반응을 유도하는 항체의 능력과 같은 요인에 따라 다양할 수 있다. 투여 요법은 최적의 치료 반응을 제공하기 위해 조절될 수 있다. 예를 들어, 수개의 나누어진 용량으로 매일 투여될 수 있거나, 용량은 치료적 긴급 상황에 의해 지시된 바에 따라 비례적으로 감소될 수 있다. 백신의 용량은 또한, 환경에 따라 최적의 예방적 용량 반응을 제공하기 위해 변화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 펩티드 및 백신은 항상 PCSK9에 대해 유도된 항체의 수준에 따라 수일, 1주 또는 2주, 또는 심지어 수개월 또는 수년의 간격을 두고 개체에 투여될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 펩티드/백신은 2회 내지 10회, 바람직하게는, 2회 내지 7회, 심지어 더욱 바람직하게는, 5회 이하 및 가장 바람직하게는, 4회 이하로 적용된다. 이러한 횟수의 접종은 기본적 면역화를 유도할 수 있다. 특히 바람직한 구체예에서, 후속 백신 접종들 사이의 시간 간격은 2주 내지 5년, 바람직하게는, 1개월 내지 3년 이하, 더욱 바람직하게는, 2개월 내지 1.5년으로 선택된다. 예시된 백신 접종 스케줄은 6주 내지 8주 및 6개월 이하의 기간에 걸친 3회 내지 4회 초기 백신 접종을 포함할 수 있다. 그 후, 백신 접종은 매 2년 내지 10년 마다 반복될 수 있다. 본 발명의 펩티드/백신의 반복된 투여는 치료적 백신 접종의 최종 효과를 최대화할 수 있다.
본 발명의 백신은 또한, 인간 체내 LDL 및/또는 HDL 수준의 조절에 또한 관련되는 다른 단백질로부터 유래된 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 PCSK9 단편은 인간 CETP 단백질로부터 유래된 에피토프와 조합될 수 있다.
전형적으로, 백신은 0.5 내지 500　㎍, 바람직하게는, 1 내지 100　㎍ 및 대안적으로, 0.1　ng 내지 10　mg, 바람직하게는, 10　ng 내지 1　mg, 특히, 100　ng 내지 100　㎍, 또는, 대안적으로, 예를 들어, 100 fmol 내지 10　μmol, 바람직하게는, 10　pmol 내지 1　μmol, 특히, 100　pmol 내지 100　nmol의 양으로 본 발명의 펩티드를 함유한다. 전형적으로, 백신은 또한, 보조 물질 예를 들어, 완충제, 안정화제 등을 함유할 수 있다.
바람직한 구체예에 있어서, 본 발명은 2개 또는 그 초과의 펩티드의 용도에 관한 것이다. 죽상경화증 및 죽상경화증과 관련된 질환을 예방하고/거나 치료하기 위한 백신의 제조를 위한 본 발명에 있어서, 죽상경화증과 관련된 질환은 바람직하게는, 말초동맥 폐색증, 관상심장 질환, 졸중성 뇌 발작 및 뇌졸중으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 양태는 죽상경화증 또는 죽상경화증과 관련된 질환을 앓고 있거나 걸릴 위험성이 있는 개체를, 이러한 개체에 본 발명에 따른 펩티드 또는 백신을 투여하는 과정으로 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 백신 다음에, 치료될 개체는 또한, 인간 및 포유동물중의 LDL 및/또는 HDL 수준에 영향을 끼치는 것으로 공지된 기타 활성 성분 예컨대, 스타틴, 피브레이트, 니코틴산, 콜레스테롤 흡수 억제제 (예를 들어, 에제티미브), ApoA1 Milano, 지질제거된 (delipidated) HDL, 식물성 스테롤을 수용할 수 있다. 본 발명의 백신을 스타틴과 함께 (즉, 동시에, 연속하여 등) 개체에 투여하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명은 하기 도면 및 실시예에 추가로 예시되나, 여기에 제한되지 않는다.
도 1은 대조군 동물과 비교하여, 서열 ID No. 1 (무관한 펩티드 대조군), 4, 5, 6, 7 및 8 및 조합물 A (SEQ ID No. 4와 7), B (SEQ ID No. 5와 7), C (SEQ ID No. 5와 8) 및 D (SEQ ID No. 6과 8)을 갖는 펩티드에 대한 간 용해물에서 저밀도 지단백질 수용체의 양을 나타낸다.
도 2는 서열 ID No. 1 (무관한 펩티드 대조군), 4, 5, 6, 7 및 8 및 조합물 A (SEQ ID No. 4와 7), B (SEQ ID No. 5와 7), C (SEQ ID No. 5와 8) 및 D (SEQ ID No. 6과 8)을 갖는 펩티드에 대한 혈장내 전체 콜레스테롤 (군당 n=5 마리 마우스) 수준의 감소 퍼센트를 나타낸다.
실시예 :
재료 및 방법
백신:
펩티드를 이종이작용성 링커 GMBS (4-말레이미도부티르산 N-하이드록시석신이미드 에스테르)를 통해 KLH (키홀 림펫 헤모시아닌)에 컨쥬게이션하였다.
15 ㎍의 펩티드를 알루미늄 하이드록시드 (알루미늄 하이드록시드의 최종 농도는 0.2%임)로 현탁시켰다. 완충제로서 포스페이트를 사용하였다.
표 1. 백신 생성에 사용된 서열
Figure 112014034945420-pct00002
Figure 112014034945420-pct00003
동물 실험:
5 Balb/c 마우스를 피하 접종하였다. 마우스가 무제한으로 음식과 물에 접근할 수 있게 하였으며, 12h 명/암 사이클 하에 두었다. 실험 시작시 마우스는 보통 8주령 내지 10주령이었다.
마우스에 총 1ml의 부피중의, KLH에 결합되고 애주번트로서의 알룸 (Alum)에 흡착된 15 ㎍의 순수 펩티드를 s.c. 경로를 통해 2주 간격으로 4회 주입하였다.
최종 주입하고 약 2주 후에 혈액을 채취하였다.
단백질 ELISA :
백신의 면역원성을 측정하기 위해, 96-웰 Nunc-Maxisorb 플레이트를 재조합체 인간 PCSK9 단백질로 코팅하였다. 차단 완충제 (PBS중의 1% BSA)와 인큐베이션함으로써 비특이적 결합을 차단하였다. 적합한 혈청 희석물을 1:2배 연속 희석된 웰에 첨가하고, 약 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 모든 ELISA 플레이트상에서, 표준 혈청이 내부 대조군으로부터 포함되었다. 결합된 항체를 바이오티닐화된 염소 항-마우스 IgG 및 이어서 스트렙타비딘에 결합된 홀스래디쉬 퍼옥시다아제와 인큐베이션함으로써 검출하였다. 기질로서 ABTS를 첨가하고, 405nm에서의 광밀도 (OD)를 마이크로웰 플레이트-리더 (Microwell plate-reader)에서 측정하였다. 음성 대조군으로서, 무관한 펩티드가 주입된 대조군으로부터의 혈청을 분석하였다. 역가를, 검정시 ODmax의 50%에 도달하는 경우의 혈청 희석물로서 규정하였다.
총 콜레스테롤 검정
총 콜레스테롤을 WAKO LabAssayTM 콜레스테롤 키트 (Wako)로 측정하였다.
LDLR 샌드위치 ELISA
뮤린 (murine) 간에서 저밀도 지단백질 수용체 (LDLR)의 수준을 측정하기 위해, 마우스를 마지막 백신 접종하고 2주 후에 희생시켰다. 간 조직을 분리하고, 표준 프로토콜에 따라 단백질 추출을 수행하였다.
96 웰 Nunc-Maxisorb 플레이트를 LDLR 친화성 정제된 염소 폴리클로날 항-LDLR 항체 (R&D Systems)로 코팅하였다. 비특이적 결합을 1% BSA/PBS와의 인큐베이션에 의해 차단하였다. 후속하여, 간 용해물을 3시간 동안 실온에서 인큐베이션하여 뮤린 LDLR을 포획하였다. 포획된 LDLR의 검출은 닭 폴리클로날 항-LDLR 항체 (Abcam), 이어서 이차 바이오티닐화된 염소 항-닭 IgG (Southern Biotech)와의 인큐베이션 및 이어서 스트렙타비딘-HRP 컨쥬게이트에 의해 수행하였다. 마지막으로, TMB를 퍼옥시다아제 크로모겐 기질로서 사용하였다.
저밀도 지단백질 수용체의 정량화를 표준 검량 곡선과 비교하여 수행하고, 용해물의 총 단백질 농도로 표준화시켰다.
대조군 농도 (무관한 펩티드 대조군 백신 접종)를 100%로 지정하고, 항-PCSK9 백신으로 처리된 군의 수준을 이러한 대조군 군과 비교하였다.
실시예 1. 인간 PCSK9에 대한 단백질 중앙 역가 (군당 n=5 마우스)
Figure 112014034945420-pct00004

실시예 2. 평균값 (mg/dL) 및 총 콜레스테롤의 감소율 (군당 n=5 마우스)
Figure 112014034945420-pct00005

실시예 3. 대조군과 비교한, 생체내에서 마우스 간에서 저밀도 지단백질 수용체의 양 (군당 n=5 마우스)
Figure 112014034945420-pct00006
SEQUENCE LISTING <110> Affiris AG <120> Vaccine <130> R 62642 <150> EP 11181090.9 <151> 13.09.2011 <160> 45 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PCSK9 fragment <400> 1 Arg Pro Glu Thr Trp Ile Pro Asn Arg Ser Pro Ile Leu 1 5 10 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PCSK9 fragment <400> 2 Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg Ile Thr Pro Pro Arg 1 5 10 <210> 3 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PCSK9 fragment <400> 3 Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PCSK9 fragment <400> 4 Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PCSK9 fragment <400> 5 Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PCSK9 fragment <400> 6 Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PCSK9 fragment <400> 7 Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg Ile Thr Pro 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PCSK9 fragment <400> 8 Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg Ile Thr 1 5 10 <210> 9 <211> 692 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Gly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gln Glu 20 25 30 Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu 35 40 45 Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe 50 55 60 His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val 65 70 75 80 Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gln Ser Glu Arg Thr Ala Arg 85 90 95 Arg Leu Gln Ala Gln Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys Ile Leu 100 105 110 His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly 115 120 125 Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro His Val Asp Tyr Ile Glu 130 135 140 Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gln Ser Ile Pro Trp Asn Leu Glu Arg 145 150 155 160 Ile Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gln Pro Pro Asp Gly 165 170 175 Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser Ile Gln Ser Asp 180 185 190 His Arg Glu Ile Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val 195 200 205 Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gln Ala Ser Lys Cys Asp 210 215 220 Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly 225 230 235 240 Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gln 245 250 255 Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu Ile Gly Leu Glu Phe Ile Arg 260 265 270 Lys Ser Gln Leu Val Gln Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro 275 280 285 Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gln Arg Leu 290 295 300 Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp 305 310 315 320 Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val Ile Thr Val 325 330 335 Gly Ala Thr Asn Ala Gln Asp Gln Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly 340 345 350 Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp Ile 355 360 365 Ile Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gln Ser Gly 370 375 380 Thr Ser Gln Ala Ala Ala His Val Ala Gly Ile Ala Ala Met Met Leu 385 390 395 400 Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ile 405 410 415 His Phe Ser Ala Lys Asp Val Ile Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp 420 425 430 Gln Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr 435 440 445 His Gly Ala Gly Trp Gln Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His 450 455 460 Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp 465 470 475 480 Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg 485 490 495 Gly Glu Arg Met Glu Ala Gln Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His 500 505 510 Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala Ile Ala Arg Cys Cys Leu 515 520 525 Leu Pro Gln Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala 530 535 540 Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gln Gln Gly His Val Leu Thr 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Claims (13)

  1. 프로단백질 컨버타아제 서브틸리신/켁신 9형 (PCSK9)의 2개 이상의 단편을 포함하는 백신으로서, 상기 2개 이상의 단편 중 제 1 단편은 SEQ ID No. 9의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9의 아미노산 잔기 153번 내지 165번의 9개 이상의 연속 아미노산 잔기를 포함하며, 상기 2개 이상의 단편 중 제 2 단편은 SEQ ID N0. 9의 아미노산 서열로 이루어진 PCSK9의 아미노산 잔기 209번 내지 222번의 9개 이상의 연속 아미노산 잔기를 포함하는 백신.
  2. 제 1항에 있어서, 2개 이상의 단편이 아미노산 서열 SIPWNLERITPPR (SEQ ID No. 2), PEEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 3), PEEDGTRFHRQA (SEQ ID No. 4), EEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 5), EEDGTRFHRQAS (SEQ ID No. 6), SIPWNLERITP (SEQ ID No. 7) 및 SIPWNLERIT (SEQ ID No. 8)을 갖는 펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 백신.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, PCSK9의 하나 이상의 단편이 SIPWNLERITPPR (SEQ ID No. 2), SIPWNLERITP (SEQ ID No. 7) 및 SIPWNLERIT (SEQ ID No. 8)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 가지며, PCSK9의 하나 이상의 단편이 PEEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 3), PEEDGTRFHRQA (SEQ ID No. 4), EEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 5) 및 EEDGTRFHRQAS (SEQ ID No. 6)로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 백신.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 백신이 SIPWNLERITPPR (SEQ ID No. 2)와 PEEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 3), SIPWNLERITPPR (SEQ ID No. 2)와 PEEDGTRFHRQA (SEQ ID No. 4), SIPWNLERITPPR (SEQ ID No. 2)와 EEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 5), SIPWNLERITPPR (SEQ ID No. 2)와 EEDGTRFHRQAS (SEQ ID No. 6), PEEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 3)와 SIPWNLERITP (SEQ ID No. 7), PEEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 3)와 SIPWNLERIT (SEQ ID No. 8), PEEDGTRFHRQA (SEQ ID No. 4)와 SIPWNLERITP (SEQ ID No. 7), PEEDGTRFHRQA (SEQ ID No. 4)와 SIPWNLERIT (SEQ ID No. 8), EEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 5)와 SIPWNLERITP (SEQ ID No. 7), EEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 5)와 SIPWNLERIT (SEQ ID No. 8), EEDGTRFHRQAS (SEQ ID No. 6)와 SIPWNLERITP (SEQ ID No. 7) 또는 EEDGTRFHRQAS (SEQ ID No. 6)와 SIPWNLERIT (SEQ ID No. 8)를 포함하는 백신.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, PCSK9의 2개 이상의 단편이 C-, N-, 또는 C- 및 N-말단 단부에서 시스테인 잔기를 포함함을 특징으로 하는 백신.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, PCSK9의 2개 이상의 단편이 약학적으로 허용되는 담체에 결합됨을 특징으로 하는 백신.
  7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, PCSK9의 2개 이상의 단편이 피내, 피하 또는 근내 투여를 위해 제형화됨을 특징으로 하는 백신.
  8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 백신이 하나 이상의 애주번트를 포함함을 특징으로 하는 백신.
  9. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 고지혈증 (hyperlipidemia), 고콜레스테롤혈증 (hypercholesterolemia), 죽상경화증 (atherosclerosis), 심혈관 질환 (cardiovascular diseases), 뇌졸중 (stroke) 및 말초 혈관 질환 (peripheral vascular diseases)으로 이루어진 군에서 선택되는 장애의 치료, 예방, 또는 치료 및 예방에 사용하기 위한 백신.
  10. 제 9항에 있어서, PCSK9의 2개 이상의 단편이 용량당 0.1 ng 내지 10 mg의 양으로 개체에 투여됨을 특징으로 하는 백신.
  11. 제 6항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체가 KLH (키홀 림펫 헤모시아닌)인 백신.
  12. 제 8항에 있어서, 애주번트가 알루미늄 하이드록시드인 백신.
  13. 제 10항에 있어서, PCSK9의 2개 이상의 단편이 용량당 1 ㎍ 내지 500 ㎍의 양으로 개체에 투여됨을 특징으로 하는 백신.
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