CN106459209B - Pcsk9疫苗 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及能够在体内诱导针对PCSK9的抗体的生成的疫苗。
Description
本发明涉及能够诱导针对前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin型9(ProproteinConvertase Subtilisin/Kexin Type 9,PCSK9)的抗体形成的免疫原性肽。
血管病症，诸如高胆固醇血症、动脉粥样硬化、冠状动脉心脏病和中风是全世界死亡的主要原因之一，并且低密度脂蛋白胆固醇(LDLc)的升高水平在其发病机制中发挥关键的作用。因此，LDLc管理对于血脂异常和动脉粥样硬化的成功治疗是一项非常重要的要素。
PCSK9在2003年的发现及其被鉴定为参与常染色体显性高胆固醇血症(ADH)形成的第三种因素(在LDLR和ApoB-100外)对ADH疾病形成的机制带来新的洞察。另外，人的遗传学研究确认了LDLc水平、PCSK9和冠状动脉心脏病的发作之间的关联。还已经在不同动物模型中观察到PCSK9和升高的LDLc之间的联系。
PCSK9主要在肝、肠和肾中表达，并且还发现在血流中分泌。它与低密度脂蛋白(LDL)受体(LDLR)直接相互作用，并且随后，形成的复合物被内化。通过结合LDLR，PCSK9促进受体降解，并且导致血浆LDLc升高。PCSK9基因中的“功能获得突变”(GOF)增强其与LDLR的相互作用，导致显著更高的LDLc水平，随后的高胆固醇血症和对动脉粥样硬化的倾向。然而，PCSK9“功能丧失突变”(LOF)突变与降低的冠状动脉心脏病(CHD)风险有关。令人感兴趣地，具有功能性PCSK9丧失和非常低的LDLc(约14mg/dL)的健康女性的两个案例突出显示PCSK9为非必需的并且为用于降低血流中的LDLc水平的有希望的靶物。
野生型小鼠中的PCSK9过表达显著降低肝LDLR蛋白，尽管有稳定的mRNA水平，从而导致升高的循环LDLc。作为比较，LDLR-/-小鼠中的PCSK9的过表达不影响LDLc的水平，确认了在LDL分解代谢中发挥作用方面PCSK9对LDLR的依赖性。并且如预期，与野生型动物相比，PCSK9-/-小鼠显示LDLR水平的2.8倍升高和LDLc的降低。最后，在肝组织中的PCSK9失活后循环中的PCSK9分泌被消除，确认了肝为负责PCSK9分泌的主要器官。
因此，PCSK9经由对LDLR的直接作用在LDL分解代谢中发挥至关重要的作用。对PCSK9的抑制变得对LDLc水平有益。因此，抗PCSK9疗法就LDLc水平的有益调控而言是有希望的方法。
PCSK9，又称为神经凋亡调节转化酶1(NARC-1)，是一种分泌性蛋白酶K样枯草杆菌酶(subtilase)和哺乳动物前蛋白转化酶(PC)家族的成员。它作为约72kDa的前蛋白合成，并且为了有功能，前体(pro-PCSK9)被处理以自催化。这导致产物(aa31-152)的形成，所述产物与成熟形式的PCSK9片段(aa153-692)(约60-63kDa)以1:1复合物形成非共价紧密结合。朝向分泌途径加工PCSK9。
在此成熟的PCSK9形式外，已经在许多细胞系和血浆中观察到PCSK9的另一种截短的(弗林蛋白酶切割)形式。人和小鼠血浆含有PCSK9的两种形式，即成熟(aa153-692)和其截短形式(aa218-692)，并且在小鼠血浆中，截短的形式可以占总血浆PCSK9的多达约50％。此弗林蛋白酶切割的截短的PCSK9是成熟PCSK9(aa153-692)在位点aa218-219(因此称为弗林蛋白酶/PC5/6A切割位点)处的切割产物。在此类切割后，形成随后的PCSK9截短的片段(aa219-692)(所谓的弗林蛋白酶切割的PCSK9)。
最近的数据确认了这两种形式的能力：成熟PCSK9(aa153-692)和弗林蛋白酶切割的PCSK9(aa219-aa692)结合低密度脂蛋白受体(LDLR)并且因此调节其水平和因此LDLc水平。
在结合LDLR的过程中，PCSK9催化域经由不同位点与LDLR相互作用。由于此结合，PCSK9将自身与LDLR的EGF(B)域置于结构构象中，该结构构象经由第二位点再次强化并且优化此相互作用，所述第二位点已知作为安置弗林蛋白酶/PC5/6A切割位点(aa218-219)的区域。
因此，靶向弗林蛋白酶/PC5/6A切割PCSK9位点(aa218-219)的治疗剂，在其消除PCSK9向LDLR的正确定位的能力外，将能够阻断弗林蛋白酶对PCSK9的作用。此类治疗剂将平行消除间接的PCSK9/LDLR相互作用(定位)，并且会抑制PCSK9的截短的LDLR结合活性形式(aa219-692)的生成。这将导致LDLR的有益的增加和因此血浆LDLc的有益的降低。
贯穿过去25年的临床试验确认了通过使用3-羟基-3甲基-戊二酰辅酶A还原酶抑制剂(抑制素(Statins))治疗心血管疾病和降低循环LDLc水平的清楚益处。抑制素通过抑制肝胆固醇生物合成起作用，导致固醇调节元件结合蛋白(下文称作SREBP)的随后增加。SREBP是参与脂质稳态的基因，诸如LDLR的调节物。并且，升高的SREBP导致升高的LDLR蛋白水平和从循环的LDLc摄取的随后增加。
抑制素是针对血脂异常的最普遍使用的疗法。但是尽管其具有效力，用抑制素的治疗经常与不利效应，诸如升高的肝酶、肌肉疼痛和肌炎有关。另外，相当多数目的经抑制素治疗的患者就有益的LDLc管理而言不能达到其目的，并且他们中的一些甚至是抑制素不耐的(intolerant)。令人感兴趣地，通过作用于SREBP抑制素，不仅增加LDLR，而且还提高PCSK9表达，导致抵消的药理学效果。
因此，认为抑制素以及抗PCSK9疗法的组合是与个别治疗相比具有协同/添加效应的效能进行LDLc管理的有希望的办法。
并且在相当程度上抗PCSK9疗法成为甚至更有吸引力的潜在的未来LDLc调控物。其不仅适合作为单一疗法，而且还适合作为最为推荐并使用的目前的疗法，诸如抑制素或其它物质诸如贝特类(fibrates)或烟酸的新的辅助疗法。同时，已经建立了抑制PCSK9的合成或功能的几种不同策略。在过去十年期间，已经相当活跃地开发了通过用反义寡核苷酸(ASO)、锁定核酸反义寡核苷酸(LNO-ASO)和siRNA的基因沉默抑制合成的方法。另外，用于抑制载脂蛋白B的ASO技术已经得到成功应用，并且最近得到食品药品管理局(Food andDrug Administration,FDA)批准。实际上，在猴(成束猴(Macaca fascicularis))中应用针对PCSK9的siRNA导致总胆固醇的显著降低。一般地，来自用于PCSK9基因沉默的不同方法的结果是争议的，并且明显依赖于方法的特异性。使用siRNA和LNA寡核苷酸的两个临床I期面对一些挑战，并且出于某些原因而提前结束。然而，另一方面，成功地结束了通过siRNA抑制PCSK9的第三个临床试验I期。
已经设计出通过模拟肽和Adnectins抑制PCSK9-LDLR相互作用的其它有希望的治疗方法。但是尽管有用于抑制的不同可能性，通过调控PCSK9降低LDLc的最先进的方法之一是抗PCSK9单克隆抗体。至今，评估抗PCSK9单克隆抗体的许多临床研究目前在进行中。在使用健康受试者的I期临床试验中，静脉内或皮下引入的单剂抗PCSK9单克隆抗体能够将LDLc水平降低直至67％。此外，在依靠抑制素治疗的受试者中每两周或在4周中皮下应用的相同mAB成功降低LDLc直至81％。另外，在抑制素不耐的患者中用相同单克隆抗体(每两周治疗)的II期临床试验在41-66％的范围中降低LDLc。那些研究确认了抗PCSK9疗法不仅在健康受试者中，而且在经抑制素治疗的和抑制素不耐的群体中也是有效的。此外，基于来自完成的临床试验的正面结果，实施了用于评估mAB抗PCSK9疗法对具有在先心肌梗塞或中风、冠状动脉风险因素和冠状动脉综合征的历史的患者的影响的III期临床试验，并且最近报告为满足共主要(co-primary)端点。然而，PCSK9单克隆抗体疗法的一个主要问题是缺乏长期持续的LDLc管理。
WO 2009/055783 A2、WO 2009/100297 A1、WO 2010/057242 A2、WO 2011/02757A2、WO 2011/117401 A1、WO 2012/59573 A1、WO 2013/037889 A2和WO 2013/148284 A1公开了具有抗原性PCSK9肽的疫苗。Luo等(J.Lipid Res.50(2009):1581-1588)公开了转基因小鼠中肝外表达的循环人PCSK9的功能和分布。
本发明的目的是提供用于降低个体中的LDLc的手段和方法；本发明的具体的目的提供作为疫苗的新的抗原性PCSK9肽，所述疫苗具有改善的抗原性潜力并且有效降低接种疫苗的个体中的胆固醇。
本发明关注由SEQ ID No.1的氨基酸残基209至222组成的PCSK9片段的特定免疫加强变体(氨基酸交换和任选的截短)。
本发明的肽是所谓的即肽PEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.1)的初始天然序列的氨基酸变异。具有不同于衍生它们的初始蛋白质/肽序列的氨基酸序列。根据本发明的被免疫系统认为是外来的，并且不需要打破自身耐受性。
本发明涉及疫苗、疫苗组合物或组合物，其包含至少一种由肽组成的肽或其肽片段，源自由氨基酸残基209至222(SEQ ID No.1)组成的PCSK9片段。
因此，本发明提供了疫苗，该疫苗包含至少一种由9至25个氨基酸残基组成的肽，所述肽是与PEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.1)相比在哺乳动物，尤其是人中具有增加的免疫原性的肽PEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.1)变体，并且其中所述变体的特征在于与PEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.1)相比至少一个且最多四个氨基酸交换。
优选地，根据本发明的疫苗包含至少一种由9至25个氨基酸残基组成的肽，所述肽具有或包含氨基酸序列
X1X2EDGX6RFX9X10X11X12X13X14,(SEQ ID No.46),
其中
X1是选自下组的氨基酸残基：赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸和脯氨酸，优选丙氨酸或脯氨酸，
X2是谷氨酰胺或天冬氨酸，优选天冬氨酸，
X6是苏氨酸或丝氨酸，
X9是选自下组的氨基酸残基：组氨酸、丙氨酸和丝氨酸，
X10是选自下组的氨基酸残基：精氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和丝氨酸，优选精氨酸、丝氨酸或丙氨酸，
X11是选自下组的氨基酸残基：谷氨酰胺、丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸、和精氨酸，优选谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、和苏氨酸，
X12是选自下组的氨基酸残基：丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸，优选丙氨酸或丝氨酸，
X13是选自下组的氨基酸残基：丝氨酸、丙氨酸、和天冬酰胺，优选丝氨酸，
X14是选自下组的氨基酸残基：赖氨酸、丙氨酸、精氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸，优选赖氨酸或丝氨酸，
或具有至少9个连续氨基酸残基的SEQ.ID.No.46的片段，并且
其中SEQ ID No.46不是PEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.1)或其N或C端截短的片段。
根据本发明的一个优选的实施方案，疫苗包含由选自下组的氨基酸序列组成的肽或包含选自下组的氨基酸序列的肽：AEEDGTRFHRQASK，PEEDGTRFARQASK，PEEDGTRFHAQASK，PEEDGTRFHRAASK，PEEDGTRFHRQAAK，PEEDGTRFHRQASA，TEEDGTRFHRQASK，PQEDGTRFHRQASK，PEEDGSRFHRQASK，PEEDGTRFHQQASK，PEEDGTRFHKQASK，PEEDGTRFHMQASK，PEEDGTRFHREASK，PEEDGTRFHRRASK，PEEDGTRFHRKASK，PEEDGTRFHRQSSK，PEEDGTRFHRQANK，PEEDGTRFHRQASR，PEEDGTRFHRQASL，KEEDGTRFHRQASK，PEEDGTRFSRQASK，PEEDGTRFHPQASK，PEEDGTRFHSQASK，PEEDGTRFHRTASK，PEEDGTRFHRQTSK，PEEDGTRFHRQASS，PEEDGTRFHRQAST，PEEDGTRFHRQASV，PEEDGSRFHKQASK，PEEDGSRFHMQASK，PEEDGSRFHRRASK，和PEEDGSRFHRQATK；优选AEEDGTRFHRQASK，PEEDGTRFARQASK，PEEDGTRFHAQASK，PEEDGTRFHRAASK，PEEDGTRFHRQASA，TEEDGTRFHRQASK，PQEDGTRFHRQASK，PEEDGTRFHRRASK，PEEDGTRFHRKASK，PEEDGTRFHRQSSK，PEEDGTRFSRQASK，PEEDGTRFHPQASK，PEEDGTRFHSQASK，PEEDGTRFHRTASK，PEEDGTRFHRQTSK，PEEDGTRFHRQASS，PEEDGTRFHRQASV，PEEDGSRFHKQASK，PEEDGSRFHRRASK，和PEEDGSRFHRQATK；尤其是AEEDGTRFHRQASK，PEEDGTRFHAQASK，PQEDGTRFHRQASK，PEEDGTRFHRRASKPEEDGTRFHRKASK，PEEDGTRFHRQSSK，PEEDGTRFSRQASK，PEEDGTRFHSQASK，PEEDGTRFHRTASK，PEEDGTRFHRQTSK，PEEDGTRFHRQASS，PEEDGSRFHKQASK和PEEDGSRFHRRASK。
本发明提供的肽是天然PCSK9氨基酸序列PEEDGTRFHRQASK(SEQ ID No.1)的免疫增强变体。已经努力地设计了根据本发明的肽，并且进行选择以在注意考虑通常与依赖于天然PCSK9序列的疫苗关联的自身耐受性问题下提供改善的针对PCSK9的免疫应答。
根据本发明的肽与天然序列PEEDGTRFHRQASK(SEQ ID No.1)相比具有氨基酸变异。根据优选的实施方案，变异(交换的氨基酸残基)的数目不超过3个氨基酸残基。优选地，根据本发明的肽仅具有一个或两个氨基酸交换。令人惊讶的是凭借此类少数氨基酸交换，可以提供免疫加强的肽变异，尤其就它们的其它有益特性而言，也就是说这些新的肽不必打破自身耐受性。
根据本发明的优选的肽与肽PEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.1)相比具有至少50％，优选地至少100％，尤其是至少200％的增加的免疫原性，如在血清ELISA中证明，例如如通过以下实施例证明。
根据优选的实施方案，本发明的疫苗中的肽与肽PEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.1)相比具有至少3％，优选地至少5％，尤其是至少10％的增加的降低总胆固醇水平的能力，如在血清胆固醇测试中证明(在绝对数字中，未处理的比较是100％)，例如如通过以下实施例证明。对于根据本发明的至少一些肽，已经在科学上公认的胆固醇模型中实验确认了与天然序列相比此类增强的总胆固醇降低水平。因而，根据本发明的变体优选地选自下组：AEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.2)、TEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.9)、PQEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.10)、PEEDGTRFHRRASK(SEQ.ID.No.17)、PEEDGTRFHRKASK(SEQ.ID.No.18)、PEEDGTRFHRQASR(SEQ.ID.No.23)、和PEEDGTRFHRTASK(SEQ.ID.No.36)。虽然已经令人惊讶的是与天然序列肽PEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.1)相比，天然序列的变体肽具有增加的免疫原性，甚至更令人惊讶的是此类肽也可以在科学上公认的胆固醇模型中比相应的天然序列更有效降低总胆固醇。
优选地，根据本发明的疫苗中含有的肽与药学可接受的载体，优选载体蛋白，尤其是包含至少一个T细胞表位的蛋白质偶联或融合。
根据本发明的疫苗的施用允许治疗或预防与PCSK9相关的生理学状况及其在疾病，诸如血脂异常、高脂血症、高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化中的作用。
本发明的肽是具有氨基酸序列PEEDGTRFHRQASK(SEQ ID No.1)的PCSK9片段的变体(氨基酸交换和任选的截短)，并且由9至25个氨基酸残基，优选地9至20个氨基酸残基，尤其是9至15个氨基酸残基组成。根据本发明的特别优选的肽由10、11、12、13、14或15个氨基酸残基，优选地13或14个氨基酸残基，尤其是14个氨基酸残基组成。虽然优选地，根据本发明的PCSK9肽优选以如下形式使用，其中所述肽由给定的序列(例如SEQ IDNo.2-46；任选地具有与其N或C端附着的接头，尤其在其C端；所述接头是或含有优选地半胱氨酸残基，尤其是C端的半胱氨酸残基)组成；然而，还可能使用缩短或较长的序列(参见例如WO 2013/037889 A1)。例如，可能从N或C端缺失单个氨基酸，并且就免疫原性或TC降低而言达到实质上相当的肽疫苗。优选地，可以在C端进行此类缺失。在一些情况中，较长的缺失(即两个或更多个氨基酸)也可以是有可能的(具体参见：WO 2013/037889 A1，对IPRP提供了额外的实验(图5/6))。另一方面，也有可能在N或C端(优选C端)添加氨基酸残基，而就本发明而言不显著改变这些肽的特性(参见例如Amar等，AHA presentation 18960(2014))。优选地，在N或C端添加氨基酸残基是在此(添加)位点处天然存在的其它氨基酸残基的添加，即在此类中添加天然的序列延伸。
本发明的疫苗包含至少1种、至少2种、或至少3种本文中限定的肽，并且允许哺乳动物，特别是人个体的主动免疫，其中通过用衍生的片段接种疫苗诱导针对PCSK9的中和性抗体，尤其是在与肽或多肽或载体蛋白(如包含T细胞表位的分子)偶联或融合时。
肽/载体组合通常是重要的，因为本发明的肽在不偶联的情况下注射时通常没有诱导相关量的抗体的能力。
因此，疫苗可以包含如本文中公开的两种或更多种肽的组合。然而，也可能的是，除了一种或多种与SEQ ID No.1相关并且如本文中限定的肽外，本发明的疫苗还包含其它肽，诸如模拟表位(mimotopes)(即PCSK9片段的突变体；EP12182241)或PCSK9片段(参见例如WO 2013/037889)。
本发明的肽可以通过本领域公知的方法化学合成。当然，也可以利用重组的方法生产本发明的肽。所述肽可以在微生物，如细菌，酵母或真菌，在真核细胞，如哺乳动物或昆虫细胞，或重组病毒载体如腺病毒,痘病毒,疱疹病毒,Simliki森林病毒,杆状病毒,噬菌体,辛德毕斯病毒或仙台病毒中生产。适合用于生产所述肽的细菌包括大肠杆菌(E.coli)，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)，或能够表达此类肽的任何其他细菌。适合于表达本发明的肽的酵母细胞包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe),假丝酵母(Candida),巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)或能表达肽的任何其他酵母。相应的手段和方法是本领域公知的。用于分离和纯化重组生产的肽的方法也是本领域公知的，并包括凝胶过滤，亲和层析，离子交换层析等。
根据本发明的肽能够诱导特异性结合人并抑制PCSK9介导的LDLR的降解。
为了便于分离本发明的肽，可以制备融合肽，其中所述的肽翻译地融合(共价连接)于异源多肽，使得能够通过亲和层析分离。典型的异源多肽是His-标签(例如His6；6组氨酸残基),GST-标签(谷胱甘肽-S-转移酶)等。所述的融合多肽不仅有利于所述肽的纯化，还可以防止所述肽在纯化步骤中降解。如果需要在纯化后去除异源多肽，所述融合多肽可以在所述肽和异源多肽的连接处包含切割位点。所述切割位点可由对该位点的氨基酸序列特异的酶(例如蛋白酶)切割的氨基酸序列组成。
可以对任何种类的哺乳动物，包括人施用本发明的疫苗和肽。然而，优选对人施用本发明的疫苗和肽。
根据本发明的优选的实施方案，本发明的疫苗中包含的至少一种肽选自下组：
Seq 2:AEEDGTRFHRQASK,Seq 4:PEEDGTRFARQASK,Seq 5:PEEDGTRFHAQASK,Seq 6:PEEDGTRFHRAASK,Seq 7:PEEDGTRFHRQAAK,Seq 8:PEEDGTRFHRQASA,Seq 9:TEEDGTRFHRQASK,Seq 10:PQEDGTRFHRQASK,Seq 12:PEEDGSRFHRQASK,Seq 13:PEEDGTRFHQQASK,Seq 14:PEEDGTRFHKQASK,Seq 15:PEEDGTRFHMQASK,Seq 16:PEEDGTRFHREASK,Seq 17:PEEDGTRFHRRASK,Seq 18:PEEDGTRFHRKASK,Seq 19:PEEDGTRFHRQSSK,,Seq 21:PEEDGTRFHRQANK,,Seq 23:PEEDGTRFHRQASR,Seq 24:PEEDGTRFHRQASL,Seq 25:KEEDGTRFHRQASK,Seq 29:PEEDGTRFSRQASK,Seq 34:PEEDGTRFHPQASK,Seq 35:PEEDGTRFHSQASK,Seq 36:PEEDGTRFHRTASK,Seq 37:PEEDGTRFHRQTSK,Seq 38:PEEDGTRFHRQASS,Seq 39:PEEDGTRFHRQAST,Seq 40:PEEDGTRFHRQASV,Seq 41:PEEDGSRFHKQASK,Seq 42:PEEDGSRFHMQASK,Seq 43:PEEDGSRFHRRASK,Seq 44:PEEDGSRFHRQATK；
和其具有至少9个氨基酸的长度的片段。
没有引发靶向PCSK9的体液免疫应答的能力的以下肽突出显示了必须准确选择氨基酸交换以导致诱导有效阻断PCSK9功能的抗体的免疫原性肽：
Seq 26:PEWDGTRFHRQASK,Seq 28:PEEDGTGFHRQASK,Seq 32:PEEDGTRFGRQASK。
根据本发明的特别优选的实施方案，本发明的疫苗中包含的至少一种肽选自下组：
Seq 2:AEEDGTRFHRQASK,Seq 4:PEEDGTRFARQASK,Seq 5:PEEDGTRFHAQASK,Seq 6:PEEDGTRFHRAASK,Seq 7:PEEDGTRFHRQAAK,Seq 8:PEEDGTRFHRQASA,Seq 9:TEEDGTRFHRQASK,Seq 10:PQEDGTRFHRQASK,Seq 12:PEEDGSRFHRQASK,Seq 13:PEEDGTRFHQQASK,Seq 14:PEEDGTRFHKQASK,Seq 15:PEEDGTRFHMQASK,Seq 16:PEEDGTRFHREASK,Seq 17:PEEDGTRFHRRASK,Seq 18:PEEDGTRFHRKASK,Seq 19:PEEDGTRFHRQSSK,Seq 21:PEEDGTRFHRQANK,Seq 23:PEEDGTRFHRQASR,Seq 24:PEEDGTRFHRQASL,Seq 25:KEEDGTRFHRQASK,Seq 29:PEEDGTRFSRQASK,Seq 34:PEEDGTRFHPQASK,Seq 35:PEEDGTRFHSQASK,Seq 36:PEEDGTRFHRTASK,Seq 37:PEEDGTRFHRQTSK,Seq 38:PEEDGTRFHRQASS,Seq 39:PEEDGTRFHRQAST,Seq 40:PEEDGTRFHRQASV,Seq 41:PEEDGSRFHKQASK,Seq 42:PEEDGSRFHMQASK,Seq 43:PEEDGSRFHRRASK,Seq 44:PEEDGSRFHRQATK。
表A:氨基酸残基
| 氨基酸 | 三字母代码 | 单字母代码 |
| 丙氨酸 | ala | A |
| 精氨酸 | arg | R |
| 天冬酰胺 | asn | N |
| 天冬氨酸 | asp | D |
| 半胱氨酸 | cys | C |
| 谷氨酸 | glu | E |
| 谷胺酰胺 | gln | Q |
| 甘氨酸 | gly | G |
| 组氨酸 | his | H |
| 异亮氨酸 | ile | I |
| 亮氨酸 | leu | L |
| 赖氨酸 | lys | K |
| 甲硫氨酸 | met | M |
| 苯丙氨酸 | phe | F |
| 脯氨酸 | pro | P |
| 丝氨酸 | ser | S |
| 苏氨酸 | thr | T |
| 色氨酸 | trp | W |
| 酪氨酸 | tyr | Y |
| 缬氨酸 | val | V |
根据尤其优选的具体实施方案，本发明的疫苗中包含的至少一种肽，在其N-和/或C-末端包含与其直接或通过间隔序列连接的至少1个半胱氨酸残基。
这一半胱氨酸残基可以作为反应基团，用于使所述肽结合于另一分子或载体。例如，这一基团可以用于将所述的肽结合于载体蛋白。该半胱氨酸残基可以直接或通过间隔序列与本发明的肽结合。优选地间隔序列包含至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，更加优选至少四个，可选择地最多十个，优选最少五个非极性的氨基酸残基，如甘氨酸。
然而，清楚的是，此类半胱氨酸残基或其它氨基酸接头(诸如例如CG-、CGG-、-GC、-GGC等)不视为天然PCSK9肽表位PEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.1)或其片段的(N或C端)交换或变异，而是对引发接种疫苗的个体中的特异性抗体应答的表位序列的添加。
根据本发明的优选实施方案，根据本发明的疫苗包含蛋白质载体，优选选自下组的蛋白质载体：匙孔血蓝蛋白(KLH)、CRM(优选CRM197)、破伤风类毒素(TT)、白喉毒素(DT)、蛋白质D或包含辅助T-细胞表位的任何其它蛋白质或肽。
优选地，根据本发明的肽偶联于或融合于药学上可接受的载体，优选KLH(KeyholeLimpet Hemocyanin)、CRM、破伤风类毒素、白蛋白-结合蛋白、牛血清白蛋白、树状聚体(dendrimer)、肽接头(或侧翼区)，以及Singh等，(Singh等，Nat.Biotech.17,(1999):1075-1081(具体而言所述文献表1中的那些))，和O'Hagan等，(O'Hagan和Valiante，NatureReviews，Drug Discovery 2(9)；(2003):727-735(具体而言，其中描述的内源性免疫-强化化合物和递送系统))中所述的佐剂物质，或其混合物。本申请中的缀合化学(conjugationchemistry)(例如通过异双功能化合物，如GMBS，当然还有如“Bioconjugate Techniques”,Greg T.Hermanson所述的其他选择)可选自本领域技术人员已知的反应。
作为替代地，也可以通过本领域已知的方法，将本发明的至少一种肽与蛋白质载体融合。此类蛋白质包含本申请所描述的肽以及不相关的免疫原性蛋白质。优选地，所述的免疫原性蛋白质能诱发回忆应答(recall response)。此类蛋白质的示例包括破伤风，肺结核，肝炎蛋白质和蛋白质D，革兰氏-阴性细菌流感嗜血杆菌B表面蛋白(WO 91/18926)。优选地，使用蛋白质D衍生物，其包含所述蛋白质的大约前三分之一(例如,N-末端前100-110个氨基酸)，其可能是脂质化的(lipidated)。另一种可用于提供融合蛋白质的载体可以是称作LYTA的蛋白质，或其部分(优选C-末端部分)。LYTA衍生自肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)，其合成N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶，称作酰胺酶LYTA(由LytA基因编码；Gene43；(1986):265-292)。LYTA是一种自溶素，其特异性地降解肽聚糖骨架中的某些键。在优选的实施方案中，LYTA的重复部分可参入到融合蛋白中。重复部分存在于在C-末端区域起始于第178位残基。特别优选的重复部分包含残基188-305。
根据本发明优选的实施方案，所述的肽与佐剂一起配制，更优选吸附于氢氧化铝(铝胶，Al(OH)3)。
根据本发明的疫苗可与佐剂，优选低可溶铝组合物，尤其是氢氧化铝，一起配制。当然，也可以使用MF59，磷酸铝，磷酸钙，细胞因子(例如IL-2，IL-12，GM-CSF)，皂苷(例如QS21)，MDP衍生物，CpG寡核苷酸，LPS，MPL，聚磷腈(polyphosphazenes)，乳剂(例如Freund's,SAF)，脂质体，病毒体，免疫刺激复合物(iscoms)，螺旋体(cochleates)，PLG微颗粒，泊洛沙姆颗粒(poloxamer particles)，病毒样颗粒，热敏感性肠毒素(heat-labileenterotoxin，LT)，霍乱毒素(CT)，突变体毒素(例如LTK63和LTR72),微颗粒和/或多聚脂质体，之类的佐剂。
合适的佐剂可通过商业途径获得，例如，AS01B,AS02A,AS15,AS-2及其衍生物(GlaxoSmithKline,Philadelphia,PA)；CWS,TDM,Leif,铝盐，如氢氧化铝凝胶(alum)或磷酸铝；钙、铁或锌盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化的糖；阳离子化或阴离子衍生化的多糖；聚磷腈；可生物降解的微球；单磷酰基脂质A和quil A。细胞因子,如GM-CSF或白介素-2,-7或-12也可以用作佐剂。
用于诱发优势(predominantly)Th1-型应答的优选的佐剂包括，例如单磷酰基脂质A，优选3-O-脱酰基单磷酰基脂质A(3D-MPL),任选地与铝盐的组合(参见例如，Ribi等，Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins,Plenum Publ.Corp.,NY,(1986):407-419；GB 2122204B；GB2220211；和US 4,912,094)。3D-MP的优选形式是乳剂，其具有直径小于0.2mm大小的小颗粒，WO 94/21292中公开了其制备方法。WO98/43670中描述了包含单磷酰基脂质A和表面活性剂的含水配制剂。示例性的优选佐剂包括AS01B(脂质体配制剂中的MPL和QS21),脂质体配制剂中的3D-MPL和QS21，AS02A(MPL和QS21和水-包-油乳剂),3D-MPL和QS21以及水-包-油乳剂和AS15。MPL佐剂在例如US 4,436,727；US 4,877,611；US 4,866,034和US4,912,094中公开。
含CpG的寡核苷酸(其中的CpG二核苷酸是未甲基化的)也诱导优势Th1应答。CpG是存在于DNA中的胞嘧啶-鸟嘌呤核苷二核苷酸基序的缩写。这种寡核苷酸是公知的，并在例如WO 96/02555,WO 99/33488,US 6,008,200和US 5,856,462中描述。例如Sato等，Science273；(1996):352中也描述了免疫刺激DNA序列。在将CpG配制到疫苗中时，通常与游离抗原一起在游离溶液中施用(WO 96/02555；McCluskie和Davis,见上文)，或共价地共轭连接于抗原(WO 98/16247)，或与诸如氢氧化铝((肝炎表面抗原)之类的载体一起配制，Davis等，见上文；Brazolot-Millan等，PNAS USA,95(26),(1998):15553-8)。本领域已知CpG作为佐剂可以通过全身以及粘膜途径施用(WO 96/02555,EP0 468 520,Davis等，J.lmmunol,160(2),(1998):870-876；McCluskie and Davis,J.Immunol.,161(9),(1998):4463-6)。
另一种优选的佐剂是皂苷或皂苷模拟物或衍生物，优选QS21(AquilaBiopharmaceuticals Inc.)，其可单独使用或与其他佐剂结合使用。例如，增强的系统包括单磷酰基脂质A和皂苷衍生物的组合，如WO 94/00153中所描述的QS21和3D-MP的组合，或如WO 96/33739中所描述的反应原性较低的组合物(less reactogenic composition)其中的QS21使用胆固醇淬灭(quenched)。其他的优选配制剂包含水-包-油乳剂和生育酚。WO 95/17210中描述了在水-包-油乳剂中包含QS21,3D-MPL和生育酚的尤其强力的(potent)佐剂配制剂。本发明所使用的另外的皂苷佐剂包括QS7(描述于WO 96/33739和WO 96/11711中)和QS17(描述于US 5,057,540和EP 0 362 279B1中)。
其他优选的佐剂包括Montanide ISA720(Seppic,France),SAF(Chiron,California,United States),ISCOMS(CSL),MF-59(Chiron),SBAS系列的佐剂(例如,SBAS-2,AS2',AS2,SBAS-4,或SBAS6可由GlaxoSmithKline获得),Detox(Corixa),RC-529(Corixa,Hamilton,MT)以及其他氨基-烷基氨基葡糖苷磷酸盐(amino-alkylglucosaminide 4-phosphates，AGPs)。另外的佐剂示例包括合成的MPL和基于志贺菌毒素B亚基的佐剂(参见WO2005/112991)。尤其优选使用氢氧化铝作为佐剂。
本发明的疫苗可以通过任何已知适合于疫苗的途径，优选皮下，肌内，皮内，或静脉内施用。根据施用途径，药物可包含相应的载体，佐剂和/或赋形剂。
包含本发明的肽和药学上可接受的载体的疫苗可通过任意合适的方式施用，例如皮内(i.d.),腹膜内(i.p.),肌内(i.m.)，鼻内，口服，皮下(s.c.)方式等等，以及任意的递送设备(O'Hagan等，Nature Reviews,Drug Discovery 2(9),(2003),727-735)。优选地，将本发明的肽配制成用于皮内、皮下或肌内施用。获得各制剂的手段和方法是本领域普通技术人员已知的。
根据本发明优选的实施方案，所述疫苗用于治疗和/或预防高脂血症，高胆固醇血症，和/或动脉粥样硬化引起的病症，优选心血管疾病，中风或外周血管疾病和与PCSK9关联的其它疾病，例如肿瘤性疾病，如黑素瘤和肝癌转移(Sun等，Neoplasia,14(12)2012,1122-1131)，特别是在哺乳动物中，优选在人中。
如所概括的，本发明的肽可以诱导形成能特异性结合PCSK9抗体。抗体和PCSK9的相互作用导致体内肝脏的肝细胞中的低密度脂蛋白受体增加，升高的血浆胆固醇摄入，和接下来血浆LDL胆固醇以及由此总体胆固醇水平的降低。
具体地，本发明涉及能够结合aa209-222PCSK9区并且负面影响PCSK9/LDLR相互作用，并且因此有益地降低血浆胆固醇的抗体。那些抗体还阻断弗林蛋白酶对成熟PCSK9(aa153-692)蛋白的切割，并且因此抑制结合LDLR的PCSK9的截短形式(aa219-692)的生成。另外，本发明的肽能够诱导抗体的形成，所述抗体能够在区域209-222中结合PCSK9，并且抑制成熟PCSK9的弗林蛋白酶切割的过程。
与动脉粥样硬化相关的疾病优选地选自外周动脉堵塞性疾病、冠心病、脑中风发作(apoplectic cerebral insultus)和中风。
术语“高脂血症，高胆固醇血症，和/或动脉粥样硬化相关的疾病”和“高脂血症，高胆固醇血症，和/或动脉粥样硬化引起的病症”指作为高脂血症，高胆固醇血症，和动脉粥样硬化的结果疾病。这些疾病包括外周动脉堵塞性疾病,冠心病和脑中风发作(参见例如Steinberg,D.J Lipid Res 46(2005):179-190和Steinberg,D.J Lipid Res 47(2006):1339-1351)等。
根据本发明优选的实施方案，本发明的肽以每次免疫0.1ng到10mg，优选0.5到500μg,更优选1到100μg的量施用于哺乳动物或个体。在优选的实施方案中，这些量指疫苗中存在的全部肽(如果一种以上的肽用于疫苗)的量。在另一个优选的实施方案中，这些量指疫苗中存在的每个单一的片段。当然可以提供一种疫苗，其中所述的肽以不同或相同的量存在。但是，可以作为替代地，以0.1ng到10mg，优选10ng到1mg,尤其是100ng到300μg/kg体重的量，将本发明的肽施用于哺乳动物或个体。
可与载体物质结合形成单一剂量形式的肽的量根据被治疗的宿主以及具体地施用模式而变化。疫苗的剂量可以根据下述因素变化，例如哺乳动物或个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及抗体在所述个体中引发所需应答的能力。可以调节剂量方案(Dosageregime)以提供最佳的治疗应答。例如，可以每天施用几个分开的剂量，或根据治疗形式的迫切情况(exigencies)所指示的，按比例减少所述剂量。根据相应的环境所述疫苗的剂量也可以变化，以提供最佳预防剂量反应。举例而言，本发明的肽的疫苗可以根据针对PCSK9的抗体水平，间隔几天、一或两周、或甚至数月或数年施用于个体。
在本发明的优选的实施方案中，所述的肽/疫苗应用2到10次，优选2到7次，最优选多达5次。该免疫次数可引起基础免疫(basic immunisation)。在特别优选的具体实施方案中，后续免疫接种的时间间隔可选在2周到5年之间，优选1个月到多达3年之间，更优选2个月到1.5年之间。示例性的免疫接种时间表可以包含在6到8周和多达6个月的时间段中进行3到4次初次免疫接种，优选接着在此类初次疫苗接种后进一步施用。此后，例如，可每2到10年重复免疫接种。重复施用本发明的肽/疫苗可使得治疗性免疫接种的最终效果最佳化。
本发明的疫苗也可以包含从其他蛋白质所衍生的抗原。例如，涉及人体内的LDL和/或HDL水平调节的蛋白质。举例而言，本发明的PCSK9片段可以与由人CETP蛋白衍生的表位相结合。本发明的疫苗也可以包含PCSK9蛋白的不同表位衍生的抗原。
本发明的疫苗还可以包含从适合于治疗高脂血症、高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化，优选心血管疾病、中风或周围血管疾病的其它蛋白质衍生的抗原。
典型地，所述疫苗以0.5到500μg，优选1到100μg，以及替代性地，0.1ng到10mg，优选10ng到1mg，尤其是100ng到100μg，或者，替代性地例如100fmol到10μmol，优选10pmol到1μmol，尤其是100pmol到100nmol的量包含本发明的肽。典型地，所述疫苗亦可以包含辅助性物质，例如缓冲剂，稳定剂等。
本发明的又一方面涉及治疗罹患动脉粥样硬化或动脉粥样硬化相关疾病、或处于罹患动脉粥样硬化或动脉粥样硬化相关疾病风险之下的个体的方法，在其过程中对所述个体施用本发明的肽或疫苗。
本发明的疫苗之外，待治疗的个体还可以接受已知影响人或哺乳动物中LDL和/或HDL水平的其他活性成分，如抑制素,纤维,烟酸,胆固醇摄取抑制剂(例如怡妥锭(ezetimibe)),ApoA1 Milano,去脂化的(delipidated)HDL,植物甾醇。尤其优选向个体连同(即同时或接连地)施用本发明的疫苗和抑制素。本发明的疫苗也可以与LDL清血法(apheresis)之类的方法结合使用。LDL清血法是从血流中清除含胆固醇颗粒的低密度脂蛋白(LDL)的一种清血法。典型地，LDL清血法引导静脉血流经被抗体包被的柱子，所述抗体是针对脱脂载脂蛋白B(LDL颗粒的主要蛋白质)、硫酸葡聚糖(dextran sulfate)或聚丙烯酸酯的抗体，或者在低pH下利用肝素沉淀LDL。相应的方法是本领域普通技术人员已知的。
本申请中所用的术语预防”，不仅涵盖预防疾病的发生，如减少风险因子的措施，还包括一旦疾病发生阻止病情恶化以及减轻病症的措施。
本申请中所用的术语“治疗”，或其等同词语包括改善和/或逆转疾病症状。在本发明的筛选方法中使用时，使得与疾病相关的任意参数得以改善的化合物可以因此鉴定为治疗性化合物。术语“治疗”指治疗处理和预防处理或预防措施。例如，可以得益于使用本发明的组合物和方法治疗的那些对象包括已经患有疾病和/或病症的、以及有待预防(例如，应用本发明的预防治疗方法)疾病和/或病症的对象。
本发明通过下述的实施例和附图进一步阐述，但是不限于此。
图1：蛋白质ELISA
图1A和1B显示了由所示序列诱导的针对人PCSK9蛋白的均值滴度(n＝5只小鼠/组)的比较。
数据揭示了与天然序列(Seq 1:PEEDGTRFHRQASK)相比选定的诱导更高的针对人PCSK9蛋白的抗体滴度的能力。
图2：与设置为100％的阴性对照组相比的％总胆固醇。
图2A显示了与用无关肽免疫的阴性对照组和与天然初始PCSK9序列(Seq 1:PEEDGTRFHRQASK)相比，用选定的免疫原性(Seq 10:PQEDGTRFHRQASK,Seq17:PEEDGTRFHRRASK,Seq 18:PEEDGTRFHRKASK,Seq 23:PEEDGTRFHRQASR)免疫的小鼠的％均值(n＝3只小鼠/组)总胆固醇水平的比较。注意与天然序列相比，降低总胆固醇水平到类似或甚至更低水平的能力。
图2B显示了与用无关肽免疫的阴性对照组和与天然初始PCSK9序列(Seq 1:PEEDGTRFHRQASK)相比，用选定的免疫原性(Seq 36:PEEDGTRFHRTASK)免疫的小鼠的％均值(n＝5只小鼠/组)总胆固醇水平的比较。注意与天然序列相比，更强降低总胆固醇水平的能力。
图2C显示了与用无关肽免疫的阴性对照组和与天然初始PCSK9序列(Seq 1:PEEDGTRFHRQASK)相比，用具有多个aa交换的选定的(Seq 41:PEEDGSRFHKQASK和Seq 44:PEEDGSRFHRQATK)免疫的小鼠的％均值(n＝5只小鼠/组)总胆固醇水平的比较。注意与天然序列相比，更强降低总胆固醇水平的能力。
图3：抑制弗林蛋白酶切割和截短的弗林蛋白酶切割的PCSK9的生成。
图3揭示了选定的高免疫原性(Seq 10:PQEDGTRFHRQASK,Seq 17:PEEDGTRFHRRASK,Seq 18:PEEDGTRFHRKASK,Seq 23:PEEDGTRFHRQASR)诱导能够抑制成熟PCSK9(aa153-692)的弗林蛋白酶切割的抗体并且因此消除截短的PCSK9(约50kDa产物)(aa219-692)生成的能力。将切割过程与阴性对照(与来自注射无关肽的小鼠的血浆一起温育的PCSK9)和阳性对照(使用或不使用弗林蛋白酶温育的huPCSK9)比较。
图4显示了与设置为100％的阴性对照组相比的％总胆固醇(TC)。
图5显示了与设置为0的用初始序列处理的组相比，经处理的组的TC的％差异。
图6显示了与设置为0的用初始序列处理的组相比，经处理的组的TC的％差异。
实施例
材料和方法
疫苗:
经由异双官能性接头GMBS(4-马来酰亚胺丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯)将肽与KLH(匙孔血蓝蛋白)缀合。
动物实验：
皮下免疫5只BALB/c小鼠。小鼠任意接触食物和水，并且保持在12h光照/黑暗循环下。实验开始时的小鼠年龄是8至10周。
在总共1ml体积中，用与KLH偶联并且吸附到作为佐剂的铝胶的15μg净肽以2周间隔注射小鼠四次。
在最后一次注射后约2周采集血液。
蛋白质ELISA：
为了测定疫苗的免疫原性，并且因此为了鉴定免疫动物的血浆中的PCSK9特异性抗体的量，实施ELISA免疫测定法。ELISA免疫测定法产生信号，该信号可以容易地量化，并且代表疫苗诱导的PCSK9特异性抗体的量的定量测量。因此，如通过ELISA测量的滴度与经处理的动物的血浆样品中的靶物特异性抗体的量(μg/ml)直接相关。在最后一次免疫后两周收集所有血浆样品，并且同等处理。为了具有直接比较，对所有样品同时实施通过疫苗诱导的PCSK9特异性抗体的PCSK9蛋白ELISA免疫测定法的定量评估和与其相对对照(初始序列和阴性对照)的比较。出于此目的，用重组表达的人PCSK9蛋白包被ELISA板。通过与封闭缓冲液(PBS中的1％BSA)一起温育阻断非特异性结合。将适当的血清稀释液(起始稀释为1:100)以1:2倍连续稀释(12个稀释步骤)添加到孔，并且温育约1小时。通过与抗小鼠IgG抗体一起温育检测结合的抗体，添加ABTS作为底物，并且测量405nm的OD。作为阴性对照，分析来自用无关肽注射的对照组的对照血清。滴度定义为达到测定法中的ODmax的50％的血清稀释。
总胆固醇测定法：
在最后一次免疫后两周收集所有血浆样品，并且同等处理。对所有样品同时实施总胆固醇(TC)测量，并且与其相关对照(初始序列和阴性对照)并排比较。通过LabAssayTM胆固醇试剂盒(Wako)测量以mg/dL计的血浆TC水平的同时定量测量。详细地，在与含有胆固醇酯酶的色原体试剂温育后，样品中的胆固醇酯被分解成游离的胆固醇和脂肪酸。随后，游离的胆固醇被胆固醇氧化酶氧化，导致过氧化氢的同时释放。生成的过氧化氢使DAOS和4-氨基安体比林(4-Aminoantipyrin)氧化，并且通过过氧化物酶(HRP)定量缩合物(condensate)，其产生蓝色色素。在600nm测量光密度，并且根据标准曲线计算TC的量化。
对弗林蛋白酶切割的抑制
在含有100mM Hepes缓冲液pH 7.5、5％Triton-X和1mM CaCl的PCSK9缓冲液中用2个单位的弗林蛋白酶(约110ng)(New England Biolabs)实施弗林蛋白酶切割反应。详细地，在室温将4μl来自经疫苗接种的小鼠的小鼠血浆与PCSK9缓冲液中的250ng生物素化的huPCSK9(BPS Bioscience)温育1h。随后，将2U弗林蛋白酶(约110ng)(NewEngland Biolabs)添加到反应溶液，并且在RT温育过夜。在还原条件下通过SDS-PAGE分析反应产物。
结果：
1.序列信息和针对huPCSK9的滴度(ODmax/2)：
图1中也描述了这些结果。根据本发明，根据本实施例具有引起更高的针对huPCSK9的滴度的潜力(例如以ODmax/2测量)的那些视为天然序列PEEDGTRFHRQASK的免疫加强变体。根据本发明的优选的具有显著的免疫加强特性(例如以在本实施例中测量为高于20000的ODmax/2或者与天然序列相比将此效果提高到150％，优选倍增此效果)。根据本发明的甚至更优选的具有甚至更显著的免疫加强特性(例如以在本实施例中测量为高于25000的ODmax/2，优选高于30000的ODmax/2；或者与天然序列相比此效果增至三倍)。
2.在用具有单一AA交换(Seq 10、17、18和23；图2A和Seq 36 2B)和多个交换(Seq41、44；图2C)的免疫的小鼠中与设置为100％的对照组相比的以％计的总胆固醇。
图2A
图2B
图2C
图2中也描绘了这些结果。根据本发明，与天然序列PEEDGTRFHRQASK相比，具有引发相当的TC降低的潜力的那些是优选的。当然，根据本发明的甚至更优选的具有比天然序列甚至更高的量降低TC的能力(与天然序列相比，例如以％TC降低测量，如在本实施例中测量为超过5％，尤其是超过10％(绝对值，即与阴性对照相比))。
3.Western印迹分析揭示了用Seq 10、17、18和23免疫后诱导的抗体抑制截短的经弗林蛋白酶切割的PCSK9(a219-692；约50kDa)的形成的能力(参加图3)。
经处理的动物中总胆固醇(TC)的降低
实施额外的实验以提供额外的实验证据，该实验证据显示选定的疫苗候选物的能力具有比含有相应的天然(初始)序列的疫苗在更高的程度上在处理的动物中降低总胆固醇(TC)的能力。
用于以下实验中的免疫的肽：
Seq 1:PEEDGTRFHRQASK(初始天然序列)
Seq 2:AEEDGTRFHRQASK
Seq 9:TEEDGTRFHRQASK
Seq 10:PQEDGTRFHRQASK
Seq 17:PEEDGTRFHRRASK
Seq 18:PEEDGTRFHRKASK
Seq 23:PEEDGTRFHRQASR
Seq 36:PEEDGTRFHRTASK
Seq 24:PEEDGTRFHRQASL
为了评估选定的疫苗候选物降低TC的能力并且为了比较经处理的动物中的TC降低与用含有初始序列的疫苗处理的动物中的TC降低的幅度，用含有1μg净肽的疫苗以2周间隔对每组的5至10只小鼠注射五次。与往常一样，将抗原性肽与KLH偶联，并且在总共1ml体积中吸附到作为佐剂的0.2％铝胶。对于描述的实验，使用GMP样材料。在最后一次注射后约2周采集血液样品。
在第一次实验中，测试含有初始序列和含有以下的疫苗：
Seq 1:PEEDGTRFHRQASK
Seq 9:TEEDGTRFHRQASK
Seq 17:PEEDGTRFHRRASK
Seq 18:PEEDGTRFHRKASK
Seq 23:PEEDGTRFHRQASR
为了包括已知能够在经处理的动物中降低TC水平，但是与含有初始序列的疫苗相比在降低TC水平上较差的疫苗，在此实验中包括以下肽疫苗：
Seq 24:PEEDGTRFHRQASL
如上文已经概述(图1A)，所有疫苗候选物是高度免疫原性的，并且具有诱导有效结合huPCSK9以及小鼠PCSK9抗体应答的能力。为了证明诱导的抗体的效力，实施来源于个体小鼠的血液样品的TC测量。图4描绘了与设置为100％的对照组相比的相对组均值TC值(以％计)。在此实验中，免疫每组5只动物。如可以看出，在所有疫苗处理组中，TC值与对照组相比显著降低。
由于本研究的目的是比较经处理的组与用初始天然序列处理的组，在图5中，呈现了与设置为0％的用初始序列处理的组相比，经疫苗处理的组的TC值的％降低。
如图5中描绘，含有以下序列的疫苗与含有初始序列的疫苗相比，更有力地降低TC水平3至10％。与此形成对比，含有Seq 24:PEEDGTRFHRQASL的疫苗与阴性对照相比拥有降低TC水平的能力(图4)，但是与含有初始肽的疫苗相比，TC水平更高(+9％)。
Seq 9:TEEDGTRFHRQASK
Seq 17:PEEDGTRFHRRASK
Seq 18:PEEDGTRFHRKASK
Seq 23:PEEDGTRFHRQASR
在别的实验中，测试了以下并且再次与Seq 1比较：
Seq 2:AEEDGTRFHRQASK
Seq 10:PQEDGTRFHRQASK
Seq 36:PEEDGTRFHRTASK
在此实验中，用含有1μg净肽的疫苗以2周间隔给每组10只动物注射五次。在最后一次注射后约2周再次采集血液样品。为了将这些动物中的TC降低直接与用初始序列处理的动物中的TC数值比较，图6中呈现了与设置为0％的用初始序列处理的组相比，经疫苗处理的组的TC数值的％降低。
如图6中显示，此实验中测试的所有三种疫苗候选物与含有初始序列的疫苗相比更有力降低TC水平(-7％至-13％)。
基于公开内容，可以明确突出显示以下优选的实施方案：
1.疫苗，其包含至少一种由9至25个氨基酸残基组成的肽，所述肽是与PEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.1)相比在哺乳动物，尤其是人中具有增加的免疫原性的肽PEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.1)的变体，并且其中所述变体的特征在于与PEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.1)相比的至少一个且至多四个氨基酸交换，其中优选地，所述变体选自下组：AEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.2)、TEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.9)、PQEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.10)、PEEDGTRFHRRASK(SEQ.ID.No.17)、PEEDGTRFHRKASK(SEQ.ID.No.18)、PEEDGTRFHRQASR(SEQ.ID.No.23)、和PEEDGTRFHRTASK(SEQ.ID.No.36)。
2.根据实施方案1的疫苗，其包含至少一种由9至25个氨基酸残基组成的肽，所述肽具有或包含氨基酸序列
X1X2EDGX6RFX9X10X11X12X13X14,(SEQ ID No.46)，
其中
X1是选自下组的氨基酸残基：赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸和脯氨酸，优选丙氨酸或脯氨酸，
X2是谷氨酰胺或天冬氨酸，优选地天冬氨酸，
X6是苏氨酸或丝氨酸，
X9是选自下组的氨基酸残基：组氨酸、丙氨酸和丝氨酸，
X10是选自下组的氨基酸残基：精氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和丝氨酸，优选精氨酸、丝氨酸或丙氨酸，
X11是选自下组的氨基酸残基：谷氨酰胺、丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸和精氨酸，优选谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸和苏氨酸，
X12是选自下组的氨基酸残基：丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸，优选丙氨酸或丝氨酸，
X13是选自下组的氨基酸残基：丝氨酸、丙氨酸和天冬酰胺，优选丝氨酸，
X14是选自下组的氨基酸残基：赖氨酸、丙氨酸、精氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸和缬氨酸，优选赖氨酸或丝氨酸，
或具有至少9个连续氨基酸残基的SEQ.ID.No.46的片段，和
其中SEQ ID No.46不是PEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.1)或其N或C端截短的片段。
3.根据实施方案1或2的疫苗，其中所述肽由选自下组的氨基酸序列组成或包含选自下组的氨基酸序列：AEEDGTRFHRQASK，PEEDGTRFARQASK，PEEDGTRFHAQASK，PEEDGTRFHRAASK，PEEDGTRFHRQAAK，PEEDGTRFHRQASA，TEEDGTRFHRQASK，PQEDGTRFHRQASK，PEEDGSRFHRQASK，PEEDGTRFHQQASK，PEEDGTRFHKQASK，PEEDGTRFHMQASK，PEEDGTRFHREASK，PEEDGTRFHRRASK，PEEDGTRFHRKASK，PEEDGTRFHRQSSK，PEEDGTRFHRQANK，PEEDGTRFHRQASR，PEEDGTRFHRQASL，KEEDGTRFHRQASK，PEEDGTRFSRQASK，PEEDGTRFMRQASK，PEEDGTRFHPQASK，PEEDGTRFHSQASK，PEEDGTRFHRTASK，PEEDGTRFHRQTSK，PEEDGTRFHRQASS，PEEDGTRFHRQAST，PEEDGTRFHRQASV，PEEDGSRFHKQASK，PEEDGSRFHMQASK，PEEDGSRFHRRASK，和PEEDGSRFHRQATK；优选AEEDGTRFHRQASK，PEEDGTRFARQASK，PEEDGTRFHAQASK，PEEDGTRFHRAASK，PEEDGTRFHRQASA，TEEDGTRFHRQASK，PQEDGTRFHRQASK，PEEDGTRFHRRASK，PEEDGTRFHRKASK，PEEDGTRFHRQSSK，PEEDGTRFSRQASK，PEEDGTRFHPQASK，PEEDGTRFHSQASK，PEEDGTRFHRTASK，PEEDGTRFHRQTSK，PEEDGTRFHRQASS，PEEDGTRFHRQASV，PEEDGSRFHKQASK，PEEDGSRFHRRASK，和PEEDGSRFHRQATK；特别是AEEDGTRFHRQASK，PEEDGTRFHAQASK，PQEDGTRFHRQASK，PEEDGTRFHRRASK PEEDGTRFHRKASK，PEEDGTRFHRQSSK，PEEDGTRFSRQASK，PEEDGTRFHSQASK，PEEDGTRFHRTASK，PEEDGTRFHRQTSK，PEEDGTRFHRQASS，PEEDGSRFHKQASK和PEEDGSRFHRRASK。
4.根据实施方案1至3中任一项的疫苗，其中所述至少一种肽与药学可接受载体偶联或融合。
5.根据实施方案1至4中任一项的疫苗，其中所述至少一种肽在其N和/或C端包含至少一个直接或经由间隔区序列与其结合的半胱氨酸残基。
6.根据实施方案4或5的疫苗，其中所述药学可接受载体是蛋白质载体。
7.根据实施方案6的疫苗，其中所述蛋白质载体选自下组：匙孔血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素(TT)、CRM197、蛋白D或白喉毒素(DT)，优选突变的白喉毒素、CRM197、或KLH，尤其是KLH。
8.根据实施方案1至7中任一项的疫苗，其中用佐剂，优选地用Al(OH)3(铝胶)配制所述疫苗。
9.根据实施方案1至8中任一项的疫苗，其中所述至少一种肽由9至20个氨基酸残基，尤其是9至15个氨基酸残基组成。
10.根据实施方案1至9中任一项的疫苗，其中所述至少一种肽由10、11、12、13、14或15个氨基酸残基，优选13或14个氨基酸残基，尤其是14个氨基酸残基组成。
11.根据实施方案1至10中任一项的疫苗，其包含至少2种、至少3种、或至少4种所述由9至25个氨基酸残基组成的所述肽。
12.根据实施方案1至11中任一项的疫苗，其以0.1ng至10mg，优选0.5至500μg，更优选1至100μg的量包含至少一种肽。
13.根据实施方案1至12中任一项的疫苗，其中所述肽与肽PEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.1)的肽相比具有至少50％，优选至少100％，尤其至少200％的升高的免疫原性，如在血清ELISA中证明。
14.根据实施方案1至13中任一项的疫苗，其中所述肽与肽PEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.1)的肽相比具有至少3％，优选至少5％，尤其至少10％的升高的降低总胆固醇水平的能力，如在血清胆固醇测试中证明。
15.根据实施方案1至14中任一项的疫苗，其用于治疗和/或预防由高脂血症、高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化引起的病症，优选地心血管疾病、中风或周围血管疾病，或肿瘤性疾病，优选地与PCSK9有关的黑素瘤和肝癌转移的方法中。
16.由9至25个氨基酸残基组成的肽，所述肽是与PEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.1)相比在哺乳动物，尤其是人中具有增加的免疫原性的肽PEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.1)的变体，并且其中所述变体的特征在于与PEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.1)相比至少一个且最多四个氨基酸交换。
17.根据实施方案16的肽，其由9至25个氨基酸残基组成，所述肽具有或包含氨基酸序列
X1X2XEDGX6RFX9X10X11X12X13X14,(SEQ ID No.46)，
其中
X1是选自下组的氨基酸残基：赖氨酸、苏氨酸、丙氨酸和脯氨酸，优选丙氨酸或脯氨酸，
X2是谷氨酰胺或天冬氨酸，优选天冬氨酸，
X6是苏氨酸或丝氨酸，
X9是选自下组的氨基酸残基：组氨酸、丙氨酸和丝氨酸，
X10是选自下组的氨基酸残基：精氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸和丝氨酸，优选精氨酸、丝氨酸或丙氨酸，
X11是选自下组的氨基酸残基：谷氨酰胺、丙氨酸、谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸、和精氨酸，优选谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、和苏氨酸，
X12是选自下组的氨基酸残基：丙氨酸、丝氨酸和苏氨酸，优选丙氨酸或丝氨酸，
X13是选自下组的氨基酸残基：丝氨酸、丙氨酸、和天冬酰胺，优选丝氨酸，
X14是选自下组的氨基酸残基：赖氨酸、丙氨酸、精氨酸、亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、和缬氨酸，优选赖氨酸或丝氨酸，
或具有至少9个连续氨基酸残基的SEQ.ID.No.46的片段，并且
其中SEQ ID No.46不是PEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.1)或其N或C端截短的片段。
18.根据实施方案16或17的肽，其中所述肽由选自下组的氨基酸序列组成或包含选自下组的氨基酸序列：AEEDGTRFHRQASK，PEEDGTRFARQASK，PEEDGTRFHAQASK，PEEDGTRFHRAASK，PEEDGTRFHRQAAK，PEEDGTRFHRQASA，TEEDGTRFHRQASK，PQEDGTRFHRQASK，PEEDGSRFHRQASK，PEEDGTRFHQQASK，PEEDGTRFHKQASK，PEEDGTRFHMQASK，PEEDGTRFHREASK，PEEDGTRFHRRASK，PEEDGTRFHRKASK，PEEDGTRFHRQSSK，PEEDGTRFHRQANK，PEEDGTRFHRQASR，PEEDGTRFHRQASL，KEEDGTRFHRQASK，PEEDGTRFSRQASK，PEEDGTRFMRQASK，PEEDGTRFHPQASK，PEEDGTRFHSQASK，PEEDGTRFHRTASK，PEEDGTRFHRQTSK，PEEDGTRFHRQASS，PEEDGTRFHRQAST，PEEDGTRFHRQASV，PEEDGSRFHKQASK，PEEDGSRFHMQASK，PEEDGSRFHRRASK，和PEEDGSRFHRQATK；优选AEEDGTRFHRQASK，PEEDGTRFARQASK，PEEDGTRFHAQASK，PEEDGTRFHRAASK，PEEDGTRFHRQASA，TEEDGTRFHRQASK，PQEDGTRFHRQASK，PEEDGTRFHRRASK，PEEDGTRFHRKASK，PEEDGTRFHRQSSK，PEEDGTRFSRQASK，PEEDGTRFHPQASK，PEEDGTRFHSQASK，PEEDGTRFHRTASK，PEEDGTRFHRQTSK，PEEDGTRFHRQASS，PEEDGTRFHRQASV，PEEDGSRFHKQASK，PEEDGSRFHRRASK，和PEEDGSRFHRQATK；尤其是AEEDGTRFHRQASK，PEEDGTRFHAQASK，PQEDGTRFHRQASK，PEEDGTRFHRRASK PEEDGTRFHRKASK，PEEDGTRFHRQSSK，PEEDGTRFSRQASK，PEEDGTRFHSQASK，PEEDGTRFHRTASK，PEEDGTRFHRQTSK，PEEDGTRFHRQASS，PEEDGSRFHKQASK和PEEDGSRFHRRASK。
19.根据实施方案16至18中任一项的肽，其中所述肽由9至20个氨基酸残基，尤其是9至15个氨基酸残基组成。
20.根据实施方案16至19中任一项的肽，其中所述肽由10、11、12、13、14或15个氨基酸残基，优选13或14个氨基酸残基，尤其是14个氨基酸残基组成。
21.根据实施方案16至20中任一项的肽，其中所述肽与肽PEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.1)相比具有至少50％，优选至少100％，尤其至少200％的升高的免疫原性，如在血清ELISA中证明。
22.根据实施方案16至21中任一项的肽，其中所述肽与肽PEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.1)相比至少3％，优选至少5％，尤其至少10％的增加的降低总胆固醇水平的能力，如在血清胆固醇测试中证明。
23.用于治疗具有由高脂血症、高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化引起的病症或具有形成由高脂血症、高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化引起的病症的风险的患者的方法，其包括对患者施用有效量的根据实施方案1至15中任一项的疫苗。
24.根据实施方案23的方法，其中所述病症选自下组：心血管疾病、中风或周围血管疾病。
25.根据实施方案23或24的方法，其中优选皮下、肌肉内、皮内或静脉内。
26.根据实施方案23至25中任一项的方法，其中施用的疫苗以0.1ng至10mg，优选0.5至500μg，尤其是1至100μg的量含有至少一种肽。
27.根据实施方案23至26中任一项的方法，其中对患者应用疫苗2-10，优选2-7，且最优选多达5次。
28.根据实施方案23至27中任一项的方法，其中所述疫苗至少施用两次，并且其中施用的间隔是2周-5年，优选1个月-长达3年，更优选2个月-1.5年。
29.根据实施方案23至28中任一项的方法，其中在6至8周和长达6个月的时段里施用疫苗以进行3至4次初始疫苗接种，优选接着在此类初始疫苗接种后进一步施用。
Claims (17)
1.疫苗，所述疫苗包含至少一种肽，所述肽是肽PEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.1)的变体，并且其中所述变体选自下组：PEEDGTRFHRRASK(SEQ.ID.No.17)、PEEDGTRFHRKASK(SEQ.ID.No.18)、PEEDGTRFHRTASK(SEQ.ID.No.36)、PEEDGSRFHKQASK(SEQ.ID.No.41)、和PEEDGSRFHRQATK(SEQ.ID.No.44)。
2.根据权利要求1的疫苗，其用于降低血浆LDL胆固醇水平。
3.根据权利要求1或2的疫苗，其中所述至少一种肽与药学可接受载体偶联或融合。
4.根据权利要求1至3中任一项的疫苗，其中所述至少一种肽在其N和/或C端包含至少一个直接或经由间隔区序列与其结合的半胱氨酸残基。
5.根据权利要求3或4的疫苗，其中所述药学可接受载体是蛋白质载体。
6.根据权利要求5的疫苗，其中所述蛋白质载体选自下组：匙孔血蓝蛋白(KLH)、破伤风类毒素(TT)、CRM197、蛋白D或白喉毒素(DT)。
7.如权利要求5所述的疫苗，其中所述蛋白质载体选自下组：突变的白喉毒素、CRM197、或KLH。
8.根据权利要求1至7中任一项的疫苗，其中用佐剂配制所述疫苗。
9.根据权利要求8的疫苗，其中所述佐剂是铝胶。
10.根据权利要求1至9中任一项的疫苗，其用于治疗和/或预防由高脂血症、高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化引起的病症或肿瘤性疾病的方法中。
11.根据权利要求10的疫苗，其中所述由高脂血症、高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化引起的病症选自心血管疾病、中风或周围血管疾病。
12.根据权利要求10的疫苗，其中所述肿瘤性疾病选自与PCSK9有关的黑素瘤和肝癌转移。
13.肽，所述肽是肽PEEDGTRFHRQASK(SEQ.ID.No.1)的变体，并且其中所述变体选自下组：PEEDGTRFHRRASK(SEQ.ID.No.17)、PEEDGTRFHRKASK(SEQ.ID.No.18)、PEEDGTRFHRTASK(SEQ.ID.No.36)、PEEDGSRFHKQASK(SEQ.ID.No.41)和PEEDGSRFHRQATK(SEQ.ID.No.44)。
14.根据权利要求13的肽，其中所述肽能够用于降低血浆LDL胆固醇水平。
15.根据权利要求13或14的肽，其中所述肽能够用于治疗具有由高脂血症、高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化引起的病症或具有形成由高脂血症、高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化引起的病症的风险的患者。
16.权利要求13的肽在制备用于降低血浆LDL胆固醇水平的疫苗中的用途。
17.权利要求13的肽在制备用于治疗具有由高脂血症、高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化引起的病症或具有形成由高脂血症、高胆固醇血症和/或动脉粥样硬化引起的病症的风险的患者的疫苗中的用途。
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