ES2618796T3 - Vacuna de PCSK9 - Google Patents

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ES2618796T3 ES12759427.3T ES12759427T ES2618796T3 ES 2618796 T3 ES2618796 T3 ES 2618796T3 ES 12759427 T ES12759427 T ES 12759427T ES 2618796 T3 ES2618796 T3 ES 2618796T3
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Gergana Galabova
Bettina Wanko
Markus Windwarder
Gabriele Winsauer
Claudia Juno
Günther STAFFLER
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Abstract

Vacuna que comprende por lo menos dos fragmentos de proproteína convertasa subtilisina/kexina de tipo 9 (PCSK9), en la que un primer fragmento de dichos por lo menos dos fragmentos comprende por lo menos 9 residuos aminoácidos consecutivos de los residuos aminoácidos 153 a 165 de PCSK9 según la SEC ID nº 9 y un segundo fragmento de dichos por lo menos dos fragmentos comprende por lo menos 9 residuos aminoácidos consecutivos de los residuos aminoácidos 209 a 222 de PCSK9 según la SEC ID nº 9.

Description

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DESCRIPCION
Vacuna de PCSK9.
La presente invencion se refiere al desarrollo de una nueva vacuna combinada de peptidos inmunogenos contra PCSK9 derivada de una combinacion de dos epttopos PCSK9 diferentes unidos a un portador inmunogeno. La vacuna se genera para la prevencion y/o el tratamiento de trastornos de salud causados por hiperlipidemia, hipercolesterolemia y ateroesclerosis.
La hiperlipidemia, la hipercolesterolemia, la hipertension y la ateroesclerosis son trastornos cardiovasculares considerados factores principales en la letalidad mundial. Conjuntamente con factores tales como la obesidad, la diabetes, el tabaquismo y la falta de actividad ffsica, factores principales en el desarrollo de las alteraciones cardiovasculares, se encuentran trastornos geneticos tales como la hipercolesterolemia dominante autosomica (HDA). La HDA se considera un factor importante en el desarrollo de algunos trastornos cardiovasculares y se manifiesta por un metabolismo del colesterol alterado y niveles incrementados de lipoprotema de baja densidad- colesterol, que posteriormente conduce a la formacion de enfermedad arterial coronaria (EAC) prematura.
Es conocido que tres alteraciones geneticas principales podnan causar el desarrollo de HDA. La forma clasica de la HDA esta causada por mutaciones en el receptor de la lipoprotema de baja densidad (en adelante denominada RLBD). Ademas, las mutaciones en la apolipoprotema B-100 (apoB-100) y mas concretamente en su dominio de union a ligandos alteran la union de ApoB-100 a RLBD, que a continuacion conduce a un metabolismo del colesterol alterado. Finalmente, el tercer y mas recientemente descubierto elemento que, por alteraciones geneticas, podna estar implicado en el desarrollo de la HDA es la proprotema convertasa subtilisina/kexina de tipo 9 (en adelante denominada PCSK9).
La PCSK9, tambien conocida como convertasa 1 neural regulada por la apoptosis (NARC-1), es una subtilasa similar a la proteinasa K identificada como el noveno elemento de la familia de la subtilasa secretoria. La protema PCSK9 es sintetizada en forma de un proprotema de ~72 kDa, que experimenta corte autocatalttico entre el pro- dominio y el dominio catalftico, conduciendo en consecuencia a la generacion de la forma proteica madura. El pro- dominio (~14 kDa) permanece unido a la protema madura de 63 kDa y en esta forma la protema madura sigue hacia la ruta secretoria.
La funcion de PCSK9 en la homeostasis de los lfpidos ya es bien conocida. No solo eso, la expresion de PCSK9 esta regulada por la protema de union al elemento regulador del esterol (en adelante denominado PUERE) de una manera similar a otros genes sensibles a PUERE que participan en la homeostasis de los lfpidos. Sin embargo, PCSK9 tambien participa en la eliminacion de la lipoprotema de baja densidad-colesterol (en adelante denominada LDLc) al fomentar la internalizacion y degradacion del RLDL.
Los estudios in vitro e in vivo subrayan el papel esencial de PCSK9 en la incorporacion de la lipoprotema de baja densidad-colesterol a partir de la sangre. Por un lado la sobreexpresion adenovmca de PCSK9 incrementa significativamente los niveles de LDLc circulante y, por otro lado, los ratones PCSK9-/- muestran un incremento de 2,8 veces de los niveles de RLDL y la reduccion de los niveles de LDLc en comparacion con los animales de tipo salvaje.
El gen se localiza en el cromosoma humano 1p33-p34.3 y se expresa en tejidos tales como el tHgado, el rinon, el cerebelo y el intestino delgado. Muchos estudios confirman que las "mutaciones de ganancia de funcion" provocan una reduccion del nivel de RLDL y la consecuente hipercolesterolemia y predisposicion a la ateroesclerosis. Las "mutaciones de perdida de funcion" incrementan los niveles de RLDL, con la consecuente reduccion del nivel de lipoprotema de baja densidad-colesterol (LDLc).
Conjuntamente, PCSK9 regula los niveles de RLDL postranscripcionalmente y, por lo tanto, es una diana atractiva para el tratamiento de la aterosclerosis.
Simultaneamente se han consolidado numerosas estrategias y enfoques diferentes para inhibir la funcion de PCSK9.
La aplicacion de ARNip contra PCSK9 en monos (Macaca fascicularis) ha conducido a una reduccion significativa del colesterol total. Otras investigaciones con anticuerpos monoclonales y policlonales contra PCSK9 en ratones y primates no humanos han conseguido regular positivamente el RLDL con una reduccion concomitante de los niveles de colesterol total y de LDLc.
La reduccion de los niveles de PCSK9 por la terapia de anticuerpos monoclonales o policlonales o la inactivacion de PCSK9 con inhibidores de molecula pequena y tecnologfa de inactivacion genica ("knock out") no ha demostrado presentar ningun efecto secundario en diferentes modelos animales. Por lo tanto, globalmente PCKS9 es una diana muy atractiva para el tratamiento de la ateroesclerosis.
El documento WO 2011/027257 se refiere a unos fragmentos inmunogenos derivados de PCSK9 que pueden ser
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utilizados en una vacuna para el tratamiento, la prevencion y el alivio de los trastornos mediados por PCSK9.
En el documento WO 2009/100297 son divulgados unos antagonistas de PCSK9 humana.
El documento WO 2010/057242 se refiere a vacunas que comprenden peptidos derivados de un fragmento de PCSK9 humana.
Un objetivo de la presente invencion es proporcionar una vacuna basada en peptidos contra PCSK9 que es capaz de inhibir PCSK9 y anular/reducir la interaccion entre PCSK9 y RLDL. Esto conduce a niveles incrementados de RLDL en los hepatocitos del hfgado y la posterior reduccion de los niveles de colesterol total y LDLc.
Dicho objetivo se consigue con una vacuna que comprende por lo menos dos fragmentos de proprotefna convertasa subtilisina/kexina de tipo 9 (PCSK9), en la que un primer fragmento de dichos por lo menos dos fragmentos comprende por lo menos 9 residuos aminoacidos consecutivos de los residuos aminoacidos 153 a 165 y un segundo fragmento de dichos por lo menos dos fragmentos comprende por lo menos 9 residuos aminoacidos consecutivos de los residuos aminoacidos 209 a 222 de PCSK9 (SEC iD n° 9).
Inesperadamente ha resultado que una vacuna que comprende por lo menos dos fragmentos peptfdicos diferentes de PCSK9 tal como se ha definido anteriormente puede incrementar la cantidad de receptores de LDL de manera mucho mas eficaz que una vacuna que comprende unicamente un fragmento de PCSK9. La administracion de la vacuna de la presente invencion conduce, por ejemplo, a un incremento de los niveles de receptor de lipoprotefna de baja densidad en los hepatocitos del hfgado in vivo. Como consecuencia de lo anterior, los valores medios de LDLc y colesterol total en el plasma sangufneo con la administracion de la vacuna se reducen significativamente. Por lo tanto, la administracion de una vacuna segun la presente invencion permite tratar o prevenir enfermedades causadas por hiper lipidemia, hipercolesterolemia y/o ateroesclerosis con una eficiencia y exactitud mucho mas altas que con la administracion de peptidos individuales.
Los fragmentos peptfdicos utilizados en la vacuna de la presente invencion comprenden por lo menos 9, mas preferentemente por lo menos 10, residuos aminoacidos consecutivos de los residuos aminoacidos 153 a 165, y de los residuos aminoacidos 209 a 222, de PCSK9 (SEC ID n° 9).
SEC ID n° 9 (secuencia de aminoacidos de PCSK9):
MGTVSSRRSW
PWRLPGTYW
DYIEEDSSVF
EDGTRFHRQA
GPLWLLPLA
LGTNFGRCVD
KDVINEAWFP
RSGKRRGERM
GCSSHWEVED
TLTGCSALPG
WPLPLLLLLL
VLKEETHLSQ
AQSIPWNLER
SKCDSHGTHL
GGYSRVLNAA
LFAPGEDIIG
EDQRVLTPNL
EAQGGKLVCR
LGTHKPPVLR
TSHVLGAYAV
LLLGPAGARA
SERTARRLQA
ITPPRYRADE
AGWSGRDAG
CQRLARAGW
ASSDCSTCFV
VAALPPSTHG
AHNAFGGEGV
PRGQPNQCVG
DNTCWRSRD
QEDEDGDYEE
QAARRGYLTK
YQPPDGGSLV
VAKGASMRSL
LVTAAGNFRD
SQSGTSQAAA
AGWQLFCRTV
YAIARCCLLP
HREASIHASC
VSTTGSTSEG
LVLALRSEED ILHVFHGLLP EVYLLDTSIQ RVLNCQGKGT DACLYSPASA HVAGIAAMML WSAHSGPTRM QANCSVHTAP CHAPGLECKV AVTAVAICCR
GLAEAPEHGT
GFLVKMSGDL
SDHREIEGRV
VSGTLIGLEF
PEVITVGATN
SAEPELTLAE
ATAVARCAPD
PAEASMGTRV
KEHGIPAPQE
SRHLAQASQE
TATFHRCAKD
LELALKLPHV
MVTDFENVPE
IRKSQLVQPV
AQDQPVTLGT
LRQRLIHFSA
EELLSCSSFS
HCHQQGHVLT
QVTVACEEGW
LQ
Los fragmentos derivados de PCSK9 comprenden o consisten de entre preferentemente 8 y 20, mas preferentemente de entre 10 y 15, residuos aminoacidos.
La vacuna de la presente invencion es una combinacion de por lo menos 2, preferentemente de por lo menos 3, mas preferentemente de por lo menos 4, todavfa mas preferentemente de por lo menos 5, peptidos derivados de los residuos aminoacidos 150 a 170 y 205 a 225 de PCSK9 (SEC ID n° 9). Dicha combinacion comprende por lo menos dos secuencias con diferente origen epitopico.
Los peptidos de la presente invencion pueden sintetizarse qufmicamente mediante metodos bien conocidos en la tecnica. Evidentemente tambien resulta posible producir los peptidos de la presente invencion utilizando metodos recombinantes. Los peptidos pueden producirse en microorganismos tales como bacterias, levaduras u hongos, en celulas eucarioticas tales como celulas de mamffero o de insecto, o en un vector vfrico recombinante, tal como adenovirus, poxvirus, virus herpes, virus del bosque de Simliki, baculovirus, bacteriofagos, virus Sindbis o virus Sendai. Entre las bacterias adecuadas para producir los peptidos se incluyen E. coli, B. subtilis o cualquier otra
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bacteria que sea capaz de expresar dichos peptidos. Entre las celulas de levadura adecuadas para expresar los peptidos de la presente invencion se incluyen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida, Pichia pastoris o cualquier otra levadura capaz de expresar peptidos. Los metodos y metodos correspondientes son bien conocidos en la tecnica. Tambien son conocidos en la tecnica metodos para aislar y purificar peptidos producidos recombinantemente y entre ellos se incluyen, por ejemplo, la filtracion en gel, la cromatografia de afinidad, la cromatografia de intercambio ionico, etc.
Con el fin de facilitar el aislamiento de los peptidos de la presente invencion, pueden generarse polipeptidos de fusion en los que los peptidos se encuentran traduccionalmente fusionados (unidos covalentemente) con un polipeptido heterologo que permite el aislamiento mediante cromatografia de afinidad. Los polipeptidos heterologos tfpicos son las etiquetas de His (por ejemplo His6, 6 residuos de histidina), la etiqueta de GST (glutation-S- transferasa), etc. El polipeptido de fusion facilita no solo la purificacion de los peptidos sino que tambien evita la degradacion de los peptidos durante las etapas de purificacion. Si se desea eliminar el polipeptido heterologo despues de la purificacion, el polipeptido de fusion puede comprender un sitio de corte en la union entre el peptido y el polipeptido heterologo. El sitio de corte puede consistir de una secuencia de aminoacidos que se corta con un enzima especffico para la secuencia de aminoacidos en el sitio (por ejemplo proteasas).
Segun la presente invencion, se obtiene por lo menos un fragmento a partir de los residuos aminoacidos 150 a 170 y se obtiene por lo menos un fragmento a partir de los residuos aminoacidos 205 a 225 de PCSK9 (SEC ID n° 9).
Segun otra forma de realizacion preferida de la presente invencion dichos por lo menos dos fragmentos de PCSK9 se seleccionan de entre el grupo que consiste en peptidos que presentan la secuencia de aminoacidos SIPWNLERITPPR (SEC ID n° 2), PEEDGTRFHRQASK (SEC ID n° 3), PEEDGTRFHRQA (SEC ID n° 4), EEDGTRFHRQASK (SEC ID n° 5), EEDGTRFHRQAS (SEC ID n° 6), SIPWNLERITP (SEC ID n° 7) y SIPWNLERIT (SEC ID n° 8).
Dichos por lo menos dos fragmentos de PCSK9 ademas pueden consistir o comprender una secuencia de aminoacidos seleccionada de entre el grupo que consiste de:
FAQSIPWNLERITPPRYRAD (SEC ID n° 10), FAQSIPWNLERITPPRYRA (SEC ID n° 11), FAWSIPWNLERITPPRYR (SEC ID n° 12), FAQSIPWNLERITPPRY (SEC ID n° 13), FAQSIPWNLERITPPR (SEC ID n° 14), FAQSIPWNLERITPP (SEC ID n° 15), AQSIPWNLERITPPRYRAD (SEC ID n° 16), QSIPWNLERITPPRYRAD (SEC ID n° 17), SIPWNLERITPPRYRAD (SEC ID n° 18), AQSIPWNLERITPPRYRA (SEC ID n° 19), QSIPWNLERITPPRYRA (SEC ID n° 20), SIPWNLERITPPRYRA (SEC ID n° 21), AQSIPWNLERITPPRYR (SEC ID n° 22), QSIPWNLERITPPRYR (SEC ID n° 23), SIPWNLERITPPRYR (SEC ID n° 24), QSIPWNLERITPPRY (SEC ID n° 25), SIPWNLERITPPRY (SEC ID n° 26), AQSIPWNLERITPPR (SEC ID n° 27), QSIPWNLERITPPR (SEC ID
n° 28), SIPWNLERITPP
(SEC ID n° 29), ENVPEEDGTRFHRQASKCDS (SEC ID n° 30),
ENVPEEDGTRFHRQASKCD
(SEC ID n° 31), ENVPEEDGTRFHRQASKC (SEC ID n° 32)
ENVPEEDGTRFHRQASK
(SEC ID n° 33), NVPEEDGTRFHRQASKCDS (SEC ID n° 34),
VPEEDGTRFHRQASKCDS (SEC ID n° 35), PEEDGTRFHRQASKCDS (SEC ID n° 36), NVPEEDGTRFHRQASKCD (SEC ID n° 37), VPEEDGTRFHRQASKCD (SEC ID n° 38), PEEDGTRFHRQASKCD (SEC ID n° 39), NVPEEDGTRFHRQASKC (SEC ID n° 40), VPEEDGTRFHRQASKC (SEC ID n° 41), PEEDGTRFHRQASKC (SEC ID n° 42), NVPEEDGTRFHRQASK (SEC ID n° 43), VPEEDGTRFHRQASK (SEC ID n° 44), PEEDGTRFHRQAS (SEC ID n° 45).
Dicho por lo menos un fragmento de PCSK9 preferentemente presenta una secuencia de aminoacidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SIPWNLERITPPR (SEC ID n° 2), SIPWNLERITP (SEC ID n° 7) y SIPWNLERIT (SEC ID n° 8) y por lo menos un fragmento de PCSK9 presenta una secuencia de aminoacidos seleccionada de entre el grupo que consiste en PEEDGTRFHRQASK (SEC ID n° 3), PEEDGTRFHRQA (SEC ID n° 4), EEDGTRFHRQASK (SEC ID n° 5) y EEDGTRFHRQAS (SEC ID n° 6).
Segun una forma de realizacion preferida de la presente invencion, la vacuna de la presente invencion comprende: SIPWNLERITPPR (SEC ID n° 2) y PEEDGTRFHRQASK (SEC ID n° 3), SIPWNLERITPPR (SEC ID n° 2) y PEEDGTRFHRQA (SEC ID n° 4), SIPWNLERITPPR (SEC ID n° 2) y EEDGTRFHRQASK (SEC ID n° 5),
SIPWNLERITPPR (SEC ID n° 2) y EEDGTRFHRQAS (SEC ID n° 6), PEEDGTRFHRQASK (SEC ID n° 3) y
SIPWNLERITP (SEC ID n° 7), PEEDGTRFHRQASK (SEC ID n° 3) y SIPWNLERIT (SEC ID n° 8), PEEDGTRFHRQA (SEC ID n° 4) y SIPWNLERITP (SEC ID n° 7), PEEDGTRFHRQA (SEC ID n° 4) y SIPWNLERIT (SEC ID n° 8), EEDGTRFHRQASK (SEC ID n° 5) y SIPWNLERITP (SEC ID n° 7), EEDGTRFHRQASK (SEC ID n° 5) y SIPWNLERIT (SEC ID n° 8), EEDGTRFHRQAS (SEC ID n° 6) y SIPWNLERITP (SEC ID n° 7) o EEDGTRFHRQAS (SEC ID n° 6) y SIPWNLERIT (sEc ID n° 8), en el que una vacuna que comprende
PEEDGTRFHRQA (SEC ID n° 4) y SIPWNLERITP (SEC ID n° 7), EEDGTRFHRQASK (SEC ID n° 5) y
SIPWNLERITP (SEC ID n° 7), EEDGTRFHRQASK (SEC ID n° 5) y SIPWNLERIT (SEC ID n° 8) o EEDGTRFHRQAS (SEC ID n° 6) y SIPWNLERIT (SEC ID n° 8) resulta particularmente preferente.
Dichos por lo menos dos fragmentos de PCSK9 preferentemente comprende un residuo de cistefna en (unido a) el extremo C-terminal y/o N-terminal.
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La provision de un residuo de cistefna en el extremo N-terminal y/o C-terminal de un peptido puede facilitar su conjugacion con un portador, por ejemplo, y/o puede incrementar la inmunogenicidad del peptido.
Segun una forma de realizacion preferida de la presente invencion, dichos por lo menos dos fragmentos de PCSK9 (es decir, los dos o mas peptidos derivados de PCSK9) se acoplan, individualmente o en combinacion, con un portador farmaceuticamente aceptable, preferentemente HLA (hemocianina de lapa americana).
Segun una forma de realizacion preferida de la presente invencion, dichos por lo menos dos fragmentos de PCSK9 se acoplan con un portador farmaceuticamente aceptable, preferentemente HLA (hemocianina de lapa americana), toxoide tetanico, protefna de union a albumina, antfgeno nuclear de la hepatitis B, alumina de suero bovino, un dendrfmero (MAP), conectores peptfdicos (o regiones flanqueantes), asf como las sustancias adyuvantes descritos en Singh et al., Nat. Biotech. 17:1075-1081, 1999, 1075-1081 (en particular los de la tabla 1 de dicho documento), y O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2(9) (2003), 727-735 (en particular los compuestos inmunopotenciadores endogenos y sistemas de administracion descritos en la misma) o mezclas de los mismos. La reaccion de conjugacion (por ejemplo mediante compuestos heterobifuncionales tales como GMBS y evidentemente tambien otros, tal como se indica en "Bioconjugate Techniques", Greg T. Hermanson) en el presente contexto puede seleccionarse de entre reacciones conocidas por el experto en la materia. Ademas, la composicion de vacuna puede formularse con un adyuvante, preferentemente una composicion de aluminio de baja solubilidad, en particular hidroxido de aluminio. Evidentemente, tambien pueden utilizarse adyuvantes tales como fosfato de aluminio MF59, fosfato de calcio, citoquinas (por ejemplo IL-2, IL-12, GM-CSF), saponinas (por ejemplo QS21), derivados de MDP, oligonucleotidos CpG, LPS, MPL, polifosfacenos, emulsiones (por ejemplo de Freund, SAF), liposomas, lipopeptidos, virosomas, iscomas, cocleatos, micropartfculas de PLG, partfculas de poloxamero, partfculas de tipo vfrico, enterotoxina termolabil (ET), toxina del colera (TC), toxinas mutantes (por ejemplo LTK63 y LTR72), micropartfculas y/o liposomas polimerizados.
Los peptidos de la presente invencion preferentemente se encuentran unidos al portador o adyuvante mediante un conector, que se selecciona de entre el grupo que consiste en NHS-poli(oxido de etileno) (PEO) (por ejemplo NHS-PEO4-maleimida).
Una vacuna que comprende un peptido de la presente invencion y el portador farmaceuticamente aceptable puede administrarse mediante cualquier modo de aplicacion adecuado, por ejemplo por via intradermica (i.d.), intraperitoneal (i.p.), intramuscular (i.m.), intranasal, oral, subcutanea (s.c.), etc., y en cualquier dispositivo de administracion adecuado (O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2(9):727-735, 2003). El compuesto de la presente invencion preferentemente se formula para la administracion intradermica, subcutanea o intramuscular. Los metodos y metodos para obtener las formulaciones respectivas son conocidos por el experto en la materia (ver, por ejemplo, "Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations", Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc., 2004).
De esta manera, la vacuna segun la presente invencion comprende por lo menos dos peptidos que preferentemente se formulan para la administracion intradermica, subcutanea o intramuscular.
Dichos por lo menos dos peptidos/fragmentos en la vacuna de la presente invencion preferentemente se formulan con un adyuvante, preferentemente hidroxido de aluminio.
Segun una forma de realizacion preferida de la presente invencion, la vacuna se utiliza en el tratamiento y/o prevencion de trastornos causados por hiperlipidemia, hipercolesterolemia y/o ateroesclerosis, preferentemente enfermedades cardiovasculares, accidente cerebrovascular o enfermedades vasculares perifericas.
Tal como se ha indicado de manera general, los peptidos anteriormente indicados y las combinaciones de los mismos pueden inducir la formacion de anticuerpos que son capaces de unirse especfficamente a PCSK9. La interaccion de los anticuerpos con PCSK9 conduce al incremento del receptor de la lipoprotefna de baja densidad en los hepatocitos del hfgado in vivo y la posterior reduccion de los niveles plasmaticos de colesterol total.
La enfermedad asociada a la ateroesclerosis preferentemente se selecciona de entre el grupo que consiste en enfermedad oclusiva arterial periferica, enfermedad cardiaca coronaria, ataque cerebral apoplejico y accidente cerebrovascular.
Las expresiones "enfermedades asociadas a hiper lipidemia, hipercolesterolemia y/o ateroesclerosis" y "trastornos causados por hiper lipidemia, hipercolesterolemia y/o ateroesclerosis" se refieren a enfermedades que son una consecuencia de la hiper lipidemia, la hipercolesterolemia y la ateroesclerosis. Entre estas enfermedades se incluyen entre otras la enfermedad oclusiva arterial periferica, la enfermedad cardiaca coronaria y el insulto cerebral apoplectico (ver, por ejemplo, Steinberg D., J. Lipid Res. 46:179-190, 2005, y Steinberg D., J. Lipid Res. 47:1339-1351, 2006).
Segun una forma de realizacion preferida de la presente invencion los dos o mas fragmentos de PCSK9 se administran en el individuo en una cantidad de entre 0,1 ng y 10 mg, preferentemente de entre 0,5 y 500 pg, mas preferentemente de entre 1 y 100 pg, en cada inmunizacion. En una forma de realizacion preferente, dichas
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cantidades se refieren a la totalidad de los fragmentos de PCSK9 presentes en la vacuna. En otra forma de realizacion preferente, dichas cantidades se refieren a cada fragmento individual presente en la vacuna. Evidentemente resulta posible proporcionar una vacuna en la que los fragmentos especfficos de PCSK9 se encuentren presentes en cantidades diferentes o iguales. Sin embargo, el peptido de la presente invencion puede administrate alternativamente en un individuo en una cantidad de entre 0,1 ng y 10 mg, preferentemente de entre 10 ng y 1 mg, en particular de entre 100 ng y 300 pg/kg de peso corporal.
La cantidad de peptidos que puede combinarse con los materiales portadores para producir una forma de administracion individual variara segun el huesped tratado y el modo de administracion particular. La dosis de la vacuna puede variar segun factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo de inducir una respuesta deseada en el individuo. El regimen de administracion puede ajustarse para proporcionar la respuesta terapeutica optima. Por ejemplo, pueden administrarse varias dosis divididas diariamente o la dosis puede reducirse proporcionalmente segun indiquen las exigencias de la situacion terapeutica. La dosis de la vacuna tambien puede modificarse para proporcionar una respuesta de dosis preventiva optima segun las circunstancias. Por ejemplo, los peptidos y la vacuna de la presente invencion pueden administrarse en el individuo a intervalos de varios dfas, una o dos semanas o incluso meses o anos en todo caso dependiendo del nivel de anticuerpos dirigidos a PCSK9.
En una forma de realizacion preferida de la presente invencion, el peptido/vacuna se aplica entre 2 y 10, preferentemente entre 2 y 7, todavfa mas preferentemente hasta 5 y todavfa mas preferentemente hasta 4 veces. Este numero de inmunizaciones puede conducir a una inmunizacion basica. En una forma de realizacion particularmente preferida, el intervalo de tiempo entre las vacunaciones sucesivas se selecciona para que sea de entre 2 semanas y 5 anos, preferentemente de entre 1 mes y hasta 3 anos, mas preferentemente de entre 2 meses y 1,5 anos. Un programa de vacunacion ejemplificado puede comprender entre 3 y 4 vacunaciones iniciales durante un periodo de entre 6 y 8 semanas y de hasta 6 meses. Despues, la vacunacion puede repetirse cada dos a diez anos. La administracion repetida del peptido/vacuna de la presente invencion puede maximizar el efecto final de una vacunacion terapeutica.
La vacuna de la presente invencion puede comprender ademas antfgenos derivados de otras protefnas que tambien participan en la regulacion de los niveles de LDL y/o HDL dentro del cuerpo humano. Por ejemplo, los fragmentos de PCSK9 de la presente invencion pueden combinarse con epftopos derivados de la protefna PTEC humana.
Tfpicamente, la vacuna contiene los peptidos de la presente invencion en una cantidad de entre 0,5 y 500 pg, preferentemente de entre 1 y 100 pg y alternativamente de entre 0,1 ng y 10 mg, preferentemente de entre 10 ng y 1 mg, en particular de entre 100 ng y 100 pg, o, alternativamente, por ejemplo, de entre 100 fmoles y 10 pmoles, preferentemente de entre 10 pmoles y 1 pmol, en particular de entre 100 pmoles y 100 nmoles. Tfpicamente, la vacuna puede contener ademas sustancias auxiliares, por ejemplo tampones, estabilizadores, etc.
Segun una forma de realizacion preferida de la presente invencion, se refiere a la utilizacion de dos o mas peptidos. Segun la presente invencion para la preparacion de una vacuna para la prevencion y/o el tratamiento de la ateroesclerosis y enfermedades asociadas a la ateroesclerosis, en la que la enfermedad asociada a la ateroesclerosis se selecciona preferentemente de entre el grupo que consiste en enfermedad oclusiva arterial periferica, enfermedad cardiaca coronaria, ataque cerebral apoplejico y accidente cerebrovascular.
Todavfa otro aspecto de la presente invencion se refiere a un procedimiento para el tratamiento de un individuo que padece o se encuentra en riesgo de padecer ateroesclerosis o una enfermedad asociada con la ateroesclerosis en cuyo curso es administrado/a a dicho individuo un peptido o una vacuna segun la presente invencion.
Ademas de la vacuna de la presente invencion, el individuo que debe ser tratado puede recibir tambien otros ingredientes activos que es conocido que influyen sobre los niveles de LDL y/o HDL en el ser humano y en los mamfferos, tales como estatinas, fibras, acido nicotfnico, inhibidor de la incorporacion del colesterol (por ejemplo ezetimibe), ApoA1 Milano, HDL deslipidado o esteroles vegetales. Resulta particularmente preferido administrar en el individuo la vacuna de la presente invencion conjuntamente (es decir, simultaneamente, consecutivamente, etc.) con estatinas.
La presente invencion se ilustra adicionalmente en las figuras y ejemplos, a continuacion, sin encontrarse limitada a los mismos.
La figura 1 muestra la cantidad de receptor de lipoprotefna de baja densidad en lisados hepaticos para peptidos con la SEC ID n° 1 (control de peptido irrelevante), n° 4, n° 5, n° 6, n° 7 y n° 8 y la combinacion A (SEC ID n° 4 y n° 7), B (SEC ID n° 5 y n° 7), C (SEC ID n° 5 y n° 8) y D (SEC ID n° 6 y n° 8) en comparacion con los animales de control.
La figura 2 muestra el porcentaje de reduccion de los niveles plasmaticos de colesterol total (n=5 ratones por grupo) para los peptidos con la secuencia ID n° 1 (control de peptido irrelevante), n° 4, n° 5, n° 6, n° 7 y n° 8, y la combinacion A (SEC ID n° 4 y n° 7), B (SEC ID n° 5 y n° 7), C (SEC ID n° 5 y n° 8) y D (SEC ID n° 6 y n° 8).
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Ejemplos:
Materiales y metodos Vacuna:
Los peptidos se conjugaron mediante el conector heterobifuncional GMBS (N-hidroxisuccinimida ester de acido 4-maleimidobutfrico) a HLA (hemocianina de lapa americana).
Se suspendieron 15 pg de los peptidos en hidroxido de aluminio (concentracion final de hidroxido de aluminio: 0,2%). Como tampon se utilizo fosfato.
Tabla 1. Secuencias utilizadas para la produccion de vacuna
Secuencia de aminoacidos Informacion de secuencia
SEC ID n° 1
RPETWIPNRSPIL Irrelevante (grupo de control)
SEC ID n° 2
SIPWNLERITPPR aa 153-165 de SEC ID n° 9
SEC ID n° 3
PEEDGTRFHRQASK aa 209-222 de SEC ID n° 9
SEC ID n° 4
PEEDGTRFHRQA aa 209-220 de SEC ID n° 9
SEC ID n° 5
EEDGTRFHRQASK aa 210-222 de SEC ID n° 9
SEC ID n° 6
EEDGTRFHRQAS aa 210-221 de SEC ID n° 9
SEC ID n° 7
SIPWNLERITP aa 153-163 de SEC ID n° 9
SEC ID n° 8
SIPWNLERIT aa 153-162 de SEC ID n° 9
Combinacion A (SEC ID n° 4 y n° 7)
PEEDGTRFHRQA + SIPWNLERITP aa 209-220 + aa 153-163 de SEC ID n° 9
Combinacion B (SEC ID n° 5 y n° 7)
EEDGTRFHRQASK + SIPWNLERITP aa 210-222 + aa 153-163 de SEC ID n° 9
Combinacion C (SEC ID n° 5 y n° 8)
EEDGTRFHRQASK + SIPWNLERIT aa 210-222 + aa 153-162 de SEC ID n° 9
Combinacion D (SEC ID n° 6 y n° 8)
EEDGTRFHRQAS + SIPWNLERIT aa 210-221 + aa 153-162 de SEC ID n° 9
Experimentos animales:
Se inmunizaron por via subcutanea 5 ratones Balb/c. Los ratones disponfan de acceso a alimentos y agua ad libitum y se mantuvieron bajo un ciclo de 12 h de luz/oscuridad. La edad de los ratones al inicio de los experimentos habitualmente era de 8 a 10 semanas.
Los ratones recibieron cuatro inyecciones a intervalos de 2 semanas con 15 pg de peptido neto acoplado con HLA y adsorbido en alumina como adyuvante en un volumen de 1 ml en total mediante la via s.c.
Se extrajo sangre aproximadamente 2 semanas despues de la inyeccion final.
ELISA de proteinas:
Para determinar la inmunogenicidad de las vacunas, se recubrieron placas de 96 pocillos Nunc-Maxisorb con protefna PCSK9 humana recombinante. Se bloqueo la union no especifica mediante incubacion con tampon de bloqueo (BSA al 1% en PBS). Se anadieron diluciones apropiadas de suero a los pocillos diluidas en serie 1:2 veces y se incubaron durante aproximadamente 1 hora a 37°C. En cada placa de ELlSA se incluyo un suero estandar a modo de control interno. Los anticuerpos unidos se detectaron mediante incubacion con IgG de cabra antiraton biotinilado, seguido de peroxidasa de rabano picante acoplada a estreptavidina. Como sustrato se anadio ABTS y se midio la densidad optica (DO) a 405 nm en un lector de placas de micropocillos. A modo de control negativo se analizaron sueros del grupo de control a los que se habia inyectado un peptido irrelevante. Se definieron los valores como la dilucion del suero en la que se alcanzaba el 50% de la DOmax en el ensayo.
Ensayo de colesterol total
Se midio el colesterol total con el kit de colesterol WAKO LabAssay™ (Wako).
ELISA de tipo sandwich de RLDL
Para determinar los niveles de receptor de lipoproteina de baja densidad (RLDL) en hfgado murino, se sacrificaron los ratones 2 semanas despues de la ultima vacunacion. Se aislo el tejido hepatico y se llevo a cabo la extraccion de las proteinas siguiendo protocolos estandares.
Se recubrieron placas Nunc-Maxisorb de 96 pocillos con anticuerpo policlonal de cabra anti-RLDL purificado por afinidad para rLdL de raton (R&D Systems). Se bloqueo la union no especffica mediante incubacion con BSA/PBS al 1%. A continuacion, los lisados hepaticos se incubaron durante 3 h a temperatura ambiente para capturar el RLDL 5 murino. La deteccion del RLDL capturado se llevo a cabo con anticuerpo policlonal de pollo anti-RLDL (Abcam), seguido de la incubacion con un anticuerpo secundario de cabra biotinilado anti-IgG de pollo (Southern Biotech) y con un conjugado de estreptavidina-HRP. Finalmente, se utilizo TMB como sustrato cromogeno de peroxidasa.
La cuantificacion del receptor de lipoprotefna de baja densidad se llevo a cabo mediante comparacion con una curva 10 de calibracion de estandares y se normalizo frente a la concentracion de protefnas totales de los lisados.
El grupo de control (vacunacion de control con peptido irrelevante) se fijo en 100% y se compararon los niveles de los grupos tratados con vacunas anti-PCSK9 a dicho grupo de control.
15 Ejemplo 1. Medianas de valores de protefna contra PCSK9 humano (n=5 ratones en cada grupo).
ID de secuencia
| Mediana de valor de protefna (DOmax/2)
sec 1 control
0
sec 4
45.000
sec 7
47.000
sec 5
14.000
sec 7
47.000
sec 5
14.000
sec 8
31.000
sec 6
13.000
sec 8
31.000
Ejemplo 2. Valores medios en mg/dl y porcentaje de reduccion del colesterol total (n=5 ratones en cada grupo).
ID de secuencia Valores medios (mg/dl) Stdv % de reduccion de CT en comparacion con el grupo de control
sec 1 control 98 9
sec 4 88 12 10
sec 7 78 4 20
Combinacion A
sec 4 + 7 71 5 28
sec 1 control 86 9
sec 5 61 7 29
sec 7 64 5 26
Combinacion B
sec 5 + 7 51 1 41
sec 1 control 83 7
sec 5 60 8 28
sec 8 55 3 34
Combinacion C
sec 5 + 8 47 7 43
sec 1 control 83 7
sec 6 65 4 22
sec 8 55 3 34
Combinacion D
sec 6 + 8 48 4 42
20
Ejemplo 3. Cantidad de receptor de lipoprotefna de baja densidad en hfgado de raton in vivo (n=5 ratones en cada grupo), en comparacion con el grupo de control.
ID de secuencia % de RLDL Stdv
sec 1 control 100 8
sec 4 130 8
sec 7 148 12
Combinacion A
sec 4 + 7 212 24
ID de secuencia % de RLDL Stdv
sec 1 control 100 19
sec 5 140 6
sec 7 140 14
Combinacion B
sec 5 + 7 202 18
sec 1 control 100 13
sec 5 135 12
sec 8 143 17
Combinacion C
sec 5 + 8 212 21
sec 1 control 100 22
sec 6 116 27
sec 8 125 14
Combinacion D
sec 6 + 8 187 30

Claims (10)

  1. 5
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    REIVINDICACIONES
    1. Vacuna que comprende por lo menos dos fragmentos de proprotefna convertasa subtilisina/kexina de tipo 9 (PCSK9), en la que un primer fragmento de dichos por lo menos dos fragmentos comprende por lo menos 9 residuos aminoacidos consecutivos de los residuos aminoacidos 153 a 165 de PCSK9 segun la SEC ID n° 9 y un segundo fragmento de dichos por lo menos dos fragmentos comprende por lo menos 9 residuos aminoacidos consecutivos de los residuos aminoacidos 209 a 222 de PCSK9 segun la SEC ID n° 9.
  2. 2. Vacuna segun la reivindicacion 1, en la que dichos por lo menos dos fragmentos se seleccionan de entre el grupo que consiste en peptidos que presentan la secuencia de aminoacidos SIPWNLERITPPR (SEC ID n° 2), PEEDGTRFHRQASK (SEC ID n° 3), PEEDGTRFHRQA (SEC ID n° 4), EEDGTRFHRQASK (SEC ID n° 5), EEDGTRFHRQAS (SEC ID n° 6), SIPWNLERITP (SEC ID n° 7) y SIPWNLERIT (SEC ID n° 8).
  3. 3. Vacuna segun la reivindicacion 1 o 2, en la que por lo menos un fragmento de PCSK9 presenta una secuencia de aminoacidos seleccionada de entre el grupo que consiste en SIPWNLERITPPR (SEC ID n° 2), SIPWNLERITP (SEC ID n° 7) y SIPWNLERIT (SEC ID n° 8) y por lo menos un fragmento de PCsK9 presenta una secuencia de aminoacidos seleccionada de entre el grupo que consiste en PEEDGTRFHRQASK (SEC ID n° 3), PEEDGTRFHRQA (SEC ID n° 4), EEDGTRFHRQASK (SEC ID n° 5) y EEDGTRFHRQAS (SEC ID n° 6).
  4. 4. Vacuna segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la vacuna comprende SIPWNLERITPPR (SEC ID n° 2) y PEEDGTRFHRQASK (SEC ID n° 3), SIPWNLERITPPR (SEC ID n° 2) y PEEDGTRFHRQA (SEC ID n° 4), SIPWNLERITPPR (SEC ID n° 2) y EEDGTRFHRQASK (SEC ID n° 5), SIPWNLERITPPR (SEC ID n° 2) y EEDGTRFHRQAS (SEC ID n° 6), PEEDGTRFHRQASK (SEC ID n° 3) y SIPWNLERITP (SEC ID n° 7), PEEDGTRFHRQASK (SEC ID n° 3) y SIPWNLERITP (SEC ID n° 8), PEEDGTRFHRQA (SEC ID n° 4) y SIPWNLERIT (SEC ID n° 7), PEEDGTRFHRQA (SEC ID n° 4) y SIPWNLERIT (SEC ID n° 8), EEDGTRFHRQASK (SEC ID n° 5) y SIPWNLERITP (SEC ID n° 7), EEDGTRFHRQASK (SEC ID n° 5) y SIPWNLERIT (SEC ID n° 8), EEDGTRFHRQAS (SEC ID n° 6) y SIPWNLERITP (SEC ID n° 7) o EEDGTRFHRQAS (SEC ID n° 6) y SIPWNLERIT (SEC ID n° 8).
  5. 5. Vacuna segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que dichos por lo menos dos fragmentos de PCSK9 comprenden un residuo de cistefna en el extremo C-terminal y/o N-terminal.
  6. 6. Vacuna segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que dichos por lo menos dos fragmentos de PCSK9 estan acoplados a un portador farmaceuticamente aceptable, preferentemente HLA (hemocianina de lapa americana).
  7. 7. Vacuna segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada por que dichos por lo menos dos fragmentos de PCSK9 se formulan para la administracion intradermica, subcutanea o intramuscular.
  8. 8. Vacuna segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada por que la vacuna comprende por lo menos un adyuvante, preferentemente hidroxido de aluminio.
  9. 9. Vacuna segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la utilizacion en el tratamiento y/o la prevencion de enfermedades cardiovasculares, accidente cerebrovascular, enfermedad oclusiva arterial periferica, enfermedad cardiaca coronaria, ataque cerebral apoplejico o enfermedades vasculares perifericas.
  10. 10. Vacuna para la utilizacion segun la reivindicacion 9, caracterizada por que dichos por lo menos dos fragmentos de PCSK9 se administran en una cantidad de 0,1 ng a 10 mg, preferentemente 1 pg a 500 pg por dosis a un individuo.
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