RU2640258C2

RU2640258C2 - Вакцина

Info

Publication number: RU2640258C2
Application number: RU2014114506A
Authority: RU
Inventors: Сильвия БРУННЕР; Гергана ГАЛАБОФА; Беттина ВАНКО; Маркус ВИНДВАРДЕР; Габриэле ВИНЗАУЭР; Клаудиа ЮНО; Гюнтер ШТАФЛЕР
Original assignee: Аффирис Аг
Priority date: 2011-09-13
Filing date: 2012-09-13
Publication date: 2017-12-27
Also published as: EP2755678A2; WO2013037889A3; RS54639B1; BR112014005756A2; SI2755678T1; CA2848487A1; WO2013037889A2; AU2012307348B2; SMT201600082B; IL231043A; ES2618796T3; HRP20160392T1; NZ621439A; ES2565757T3; IL231043A0; CY1118856T1; CN103874504A; SI2570135T1; EP2570135B1; RU2017139094A

Abstract

Группа изобретений относится к области биотехнологии. Представлена вакцина для снижения уровня холестерина, включающая два фрагмента пропротеинконвертазы субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9), соединенных с фармацевтически приемлемым носителем, в которой указанные два фрагмента представляют собой: PEEDGTRFHRQA и SIPWNLERITP; EEDGTRFHRQASK и SIPWNLERITP; EEDGTRFHRQASK и SIPWNLERIT; или EEDGTRFHRQAS и SIPWNLERIT. Представлено применение указанной вакцины при лечении и/или предупреждении нарушений, вызываемых гиперлипидемией, гиперхолестеринемией и/или атеросклерозом, предпочтительно сердечно-сосудистых заболеваний, инсульта или заболеваний периферических сосудов. Группа изобретений позволяет снижать уровень общего холестерина при использовании указанных комбинаций фрагментов более эффективно, чем при использовании каждого такого фрагмента по отдельности. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл., 3 пр.

Description

Изобретение связано с разработкой новой комбинированной иммуногенной пептидной вакцины против PCSK9, получаемой в результате объединения двух различных эпитопов PCSK9, связанных с иммуногенным носителем. Вакцина разработана для предупреждения и/или лечения нарушений здоровья, вызываемых гиперлипидемией, гиперхолестеринемией и атеросклерозом.

Гиперлипидемия, гиперхолестеринемия, гипертония и атеросклероз представляют собой сердечно-сосудистые заболевания, рассматриваемые в качестве ведущих факторов смертоносности во всем мире. Вместе с такими факторами, как ожирение, сахарный диабет, курение и недостаток физической активности, основные факторы развития сердечно-сосудистых изменений - это генетические нарушения, такие как аутосомно-доминантная гиперхолестеринемия (ADH). ADH рассматривают как важный фактор развития сердечно-сосудистых заболеваний, и она проявляется нарушением обмена холестерина и повышенными уровнями холестерина липопротеинов низкой плотности, что впоследствии приводит к раннему возникновению ишемической болезни сердца (CAD).

Известно, что развитие ADH могут вызвать три основных генетических изменения. Классическая форма ADH вызывается мутациями в рецепторах липопротеинов низкой плотности (далее в настоящем документе называемым LDLR). Кроме того, мутации в аполипопротеине В-100 (ароВ-100), а точнее в его лиганд-связывающем домене нарушают связывание АроВ-100 с LDLR, что впоследствии приводит к нарушению обмена холестерина. Наконец, третий и совсем недавно обнаруженный элемент, который в результате генетических изменений может быть вовлечен в развитие ADH, представляет собой пропротеинконвертазу субтилизин/кексин типа 9 (далее в настоящем документе называемую PCSK9).

PCSK9, также известная как нейронная апоптоз-регулирующая конвертаза 1 (NARC-1), представляет собой протеиназа K-подобную субтилазу, идентифицированную в качестве девятого члена семейства секреторных субтилаз. Белок PCSK9 синтезируется в виде ~72 кДа пропротеина, который претерпевает автокаталитическое расщепление между продоменом и каталитическим доменом, что затем приводит к образованию зрелой формы белка. Продомен (~14 кДа) остается связанным со зрелым 63 кДа белком, и в этой форме зрелый белок поступает в секреторный путь.

Роль PCSK9 в гомеостазе липидов уже хорошо изучена. Не только экспрессия PCSK9 регулируется с помощью белка, связывающего стерол-регулирующие элементы (далее в настоящем документе называемого SREBP), таким же образом, как и регулируются другие чувствительные к SREBP гены, вовлеченные в гомеостаз липидов. Но PCSK9 также вовлечен в клиренс холестерина липопротеинов низкой плотности (далее в настоящем документе называемым LDLc), так как содействует интернализации и деградации LDLR.

Исследования in vitro и in vivo выявили важную роль PCSK9 в поглощении холестерина липопротеинов низкой плотности из крови. С одной стороны, опосредуемая аденовирусом сверхэкспрессия PCSK9 значительно увеличивает уровни циркулирующих в крови LDLc, с другой стороны, PCSK9-/-мыши продемонстрировали 2,8-кратное увеличение уровней LDLR и снижение LDLc по сравнению с животными дикого типа.

Ген локализован на хромосоме 1р33-р34.3 человека и экспрессируется в таких тканях, как печень, почка, мозжечок и тонкий кишечник. Во многих исследованиях было подтверждено, что «мутации с усилением функции» вызывают снижение уровней LDLR и, как следствие, гиперхолестеринемию и предрасположение к атеросклерозу. «Мутация с потерей функции» увеличивает уровни LDLR с последующим снижением в холестерине липопротеинов низкой плотности (LDLc).

В целом, PCSK9 регулирует уровни LDLR посттранскрипционно и поэтому представляет собой привлекательную мишень для лечения атеросклероза.

Между тем, были разработаны многочисленные различные стратегии и подходы для ингибирования функции PCSK9.

Применение siRNA против PCSK9 в опытах на обезьянах (Macaca fascicularis) привели к значительному снижению общего холестерина. В других исследованиях с моноклональными и поликлональными антителами против PCSK9, проведенных на мышах и приматах, за исключением человека, удалось активировать LDLR с сопутствующим снижением в уровнях общего холестерина и LDLc.

Снижение уровней PCSK9 терапией с применением моноклональных или поликлональных антител или путем инактивации PCSK9 под действием низкомолекулярных ингибиторов и технологии генного нокаута не показали каких-либо побочных эффектов в различных моделях на животных. Следовательно, в конечном счете, PCSK9 представляет собой очень привлекательную мишень для лечения атеросклероза.

WO 2011/027257 относится к иммуногенным фрагментам, полученным из PCSK9, которые могут быть применены в вакцине для лечения, предупреждения и облегчения опосредуемых PCSK9 нарушений.

В WO 2009/100297 раскрыты антагонисты PCSK9 человека.

WO 2010/057242 относится к вакцинам, которые включают пептиды, полученные из фрагмента PCSK9 человека.

Цель настоящего изобретения заключается в обеспечении пептидной вакцины против PCSK9, которая способна ингибировать PCSK9 и предотвратить/уменьшить взаимодействие PCSK9 и LDLR. Это приведет к увеличению уровня LDRL в гепатоцитах печени и к последующему снижению общего холестерина и LDLc.

Данную цель достигают с помощью вакцины, включающей множество (более чем один, по меньшей мере два) фрагментов пропротеинконвертазы субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9), в которой первый фрагмент из указанных, по меньшей мере двух фрагментов включает по меньшей мере 8 последовательных аминокислотных остатков из аминокислотных остатков со 150 по 170, и второй фрагмент из указанных по меньшей мере двух фрагментов включает по меньшей мере 8 последовательных аминокислотных остатков из аминокислотных остатков с 205 по 225 в PCSK9 (SEQ ID No. 9).

Удивительно, но выяснилось, что вакцина, включающая, по меньшей мере, два различных пептидных фрагмента PCSK9, как определены выше, способна увеличивать количество рецепторов LDRL гораздо более эффективно по сравнению с вакциной, включающей только один фрагмент PCSK9. Введение вакцины настоящего изобретения приводит, например, к увеличению в уровнях рецептора липопротеинов низкой плотности в гепатоцитах печени in vivo. Как следствие этого, средние величины LDLc и общего холестерина в плазме крови при введении вакцин значительно снижаются. Следовательно, введение вакцины в соответствии с настоящим изобретением позволяет лечить или предупреждать заболевания, вызываемые гиперлипидемией, гиперхолестеринемией и/или атеросклерозом с гораздо более высокой эффективностью и точностью по сравнению с введением одиночных пептидов. В предпочтительном воплощении настоящего изобретения все PCSK9-фрагменты вакцины настоящего изобретения получают из PCSK9 фрагментов, состоящих из аминокислотных остатков со 150 по 170 и с 205 по 225 в последовательности SEQ ID No. 9.

Пептидные фрагменты, примененные в вакцине настоящего изобретения, включают по меньшей мере 8, предпочтительно по меньшей мере 9, более предпочтительно по меньшей мере 10 последовательных аминокислотных остатков из аминокислотных остатков со 150 по 170, предпочтительно аминокислотных остатков с 153 по 165, и с 205 по 225, предпочтительно аминокислотных остатков с 209 по 222, из PCSK9 (SEQ ID No. 9).

SEQ ID No. 9 (аминокислотная последовательность PCSK9):

Фрагменты, полученные из PCSK9, включают или состоят из предпочтительно от 8 до 20, более предпочтительно от 10 до 15 аминокислотных остатков. В соответствии с особенно предпочтительным воплощением настоящего изобретения пептиды, полученные из аминокислотных остатков со 150 по 170 в PCSK9, включают от 8 до 15, предпочтительно от 10 до 13 аминокислотных остатков. Пептиды, полученные из аминокислотных остатков с 205 по 225 в PCSK9 включают от 8 до 16, предпочтительно от 10 до 14, аминокислотных остатков.

Вакцина настоящего изобретения представляет собой комбинацию по меньшей мере 2, предпочтительно по меньшей мере 3, более предпочтительно по меньшей мере 4, еще более предпочтительно по меньшей мере 5, пептидов, полученных из аминокислотных остатков с 150 по 170 и с 205 по 225 в PCSK9 (SEQ ID No. 9). Данная комбинация включает по меньшей мере две последовательности, полученные из различных эпитопов.

Пептиды настоящего изобретения могут быть химически синтезированы с помощью способов, хорошо известных в данной области техники. Конечно, также существует возможность получить пептиды настоящего изобретения, применяя способы получения рекомбинантных белков. Пептиды могут быть получены в таких микроорганизмах, как бактерии, дрожжи или грибы, в эукариотических клетках, таких как клетки млекопитающих или насекомых, или в рекомбинантном вирусном векторе, таком как аденовирус, поксвирус, вирус герпеса, вирус леса Семлики, бакуловирус, бактериофаг, вируса Синдбис или вирус Сендай. Бактерии, подходящие для получения пептидов, включают Е.coli, В.subtilis или любую другую бактерию, способную экспрессировать такие пептиды. Дрожжевые клетки, подходящие для экпрессирования пептидов настоящего изобретения, включают Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida, Pichia pastoris или любые другие дрожжи, способные экспрессировать пептиды. Соответствующие средства и способы хорошо известны в данной области техники. Кроме того, способы выделения и очистки пептидов, полученных рекомбинантными способами, хорошо известны в данной области техники и включают, например, гель-фильтрацию, аффинную хроматографию, ионно-обменную хроматографию и т.п.

Для облегчения выделения пептидов настоящего изобретения могут быть созданы слитые полипептиды, в которых пептиды в ходе трансляции объединяют (ковалентно присоединяют) в гетерологичный полипептид, которые можно изолировать с помощью аффинной хроматографии. Типичные гетерологичные полипептиды представляют собой His-Tag (например, His₆; 6 остатков гистидина), GST-Tag (глутатион-S-трансфераза) и т.п. Слияние полипептидов способствует не только очистке пептидов, но также может предотвратить деградацию пептидов на разных стадиях в процессе очистки. Если желательно после очистки удалить гетерологичный полипептид, то слитый полипептид может включать сайт расщепления в месте соединения пептида и гетерологичного полипептида. Сайт расщепления может состоять из аминокислотной последовательности, которая расщепляется под действием фермента, специфического для аминокислотной последовательности в этом сайте (например, под действием протеаз).

В соответствии с настоящим изобретением, по меньшей мере, один фрагмент получают из аминокислотных остатков от 150 до 170 и по меньшей мере один фрагмент получают из аминокислотных остатков от 205 по 225 в PCSK9 (SEQ ID No. 9).

Вакцина настоящего изобретения включает фрагменты PCSK9 из различных частей белка PCSK9. Следовательно, в особенности предпочтительно, чтобы по меньшей мере один фрагмент получали из одного специфического фрагмента PCSK9, тогда как по меньшей мере один фрагмент получали из другого специфического фрагмента PCSK9.

В соответствии с другим предпочтительным воплощением настоящего изобретения, по меньшей мере, два фрагмента из PCSK9 выбирают из группы, состоящей из пептидов, имеющих аминокислотную последовательность SIPWNLERITPPR (SEQ ID No. 2), PEEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 3), PEEDGTRFHRQA (SEQ ID No. 4), EEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 5), EEDGTRFHRQAS (SEQ ID No. 6), SIPWNLERITP (SEQ ID No. 7) и SIPWNLERIT (SEQ ID No. 8).

По меньшей мере два фрагмента из PCSK9 также могут состоять из аминокислотной последовательности или включать аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, состоящей из FAQSIPWNLERITPPRYRAD (SEQ ID No. 10), FAQSIPWNLERITPPRYRA (SEQ ID No. 11), FAQSIPWNLERITPPRYR (SEQ ID No. 12), FAQSIPWNLERITPPRY (SEQ ID No. 13), FAQSIPWNLERITPPR (SEQ ID No. 14), FAQSIPWNLERITPP (SEQ ID No. 15), AQSIPWNLERITPPRYRAD (SEQ ID No. 16), QSIPWNLERITPPRYRAD (SEQ ID No. 17), SIPWNLERITPPRYRAD (SEQ ID No. 18), AQSIPWNLERITPPRYRA (SEQ ID No. 19), QSIPWNLERITPPRYRA (SEQ ID No. 20), SIPWNLERITPPRYRA (SEQ ID No. 21), AQSIPWNLERITPPRYR (SEQ ID No. 22), QSIPWNLERITPPRYR (SEQ ID No. 23), SIPWNLERITPPRYR (SEQ ID No. 24), QSIPWNLERITPPRY (SEQ ID No. 25), SIPWNLERITPPRY (SEQ ID No. 26), AQSIPWNLERITPPR (SEQ ID No. 27), QSIPWNLERITPPR (SEQ ID No. 28), SIPWNLERITPP (SEQ ID No. 29), ENVPEEDGTRFHRQASKCDS (SEQ ID No. 30), ENVPEEDGTRFHRQASKCD (SEQ ID No. 31), ENVPEEDGTRFHRQASKC (SEQ ID No. 32), ENVPEEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 33), NVPEEDGTRFHRQASKCDS (SEQ ID No. 34), VPEEDGTRFHRQASKCDS (SEQ ID No. 35), PEEDGTRFHRQASKCDS (SEQ ID No. 36), NVPEEDGTRFHRQASKCD (SEQ ID No. 37), VPEEDGTRFHRQASKCD (SEQ ID No. 38), PEEDGTRFHRQASKCD (SEQ ID No. 39), NVPEEDGTRFHRQASKC (SEQ ID No. 40), VPEEDGTRFHRQASKC (SEQ ID No. 41), PEEDGTRFHRQASKC (SEQ ID No. 42), NVPEEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 43), VPEEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 44), PEEDGTRFHRQAS (SEQ ID No. 45).

По меньшей мере один фрагмент из PCSK9 предпочтительно имеет аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, состоящей из SIPWNLERITPPR (SEQ ID No. 2), SIPWNLERITP (SEQ ID No. 7) и SIPWNLERIT (SEQ ID No. 8) и по меньшей мере один фрагмент из PCSK9 имеет аминокислотную последовательность, которую выбирают из группы, состоящей из PEEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 3), PEEDGTRFHRQA (SEQ ID No. 4), EEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 5) и EEDGTRFHRQAS (SEQ ID No. 6).

В соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения вакцина настоящего изобретения включает SIPWNLERITPPR (SEQ ID No. 2) и PEEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 3), SIPWNLERITPPR (SEQ ID No. 2) и PEEDGTRFHRQA (SEQ ID No. 4), SIPWNLERITPPR (SEQ ID No. 2) и EEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 5), SIPWNLERITPPR (SEQ ID No. 2) и EEDGTRFHRQAS (SEQ ID No. 6), PEEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 3) и SIPWNLERITP (SEQ ID No. 7), PEEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 3) и SIPWNLERIT (SEQ ID No. 8), PEEDGTRFHRQA (SEQ ID No. 4) и SIPWNLERITP (SEQ ID No. 7), PEEDGTRFHRQA (SEQ ID No. 4) и SIPWNLERIT (SEQ ID No. 8), EEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 5) и SIPWNLERITP (SEQ ID No. 7), EEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 5) и SIPWNLERIT (SEQ ID No. 8), EEDGTRFHRQAS (SEQ ID No. 6) и SIPWNLERITP (SEQ ID No. 7) или EEDGTRFHRQAS (SEQ ID No. 6) и SIPWNLERIT (SEQ ID No. 8), при этом вакцина, включающая PEEDGTRFHRQA (SEQ ID No. 4) и SIPWNLERITP (SEQ ID No. 7), EEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 5) и SIPWNLERITP (SEQ ID No. 7), EEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 5) и SIPWNLERIT (SEQ ID No. 8) или EEDGTRFHRQAS (SEQ ID No. 6) и SIPWNLERIT (SEQ ID No. 8) особенно предпочтительна.

По меньшей мере два фрагмента из PCSK9 предпочтительно включают остаток цистеина на (присоединенный к) С- и/или N-конце.

Обеспечение остатка цистеина на С- и/или N-конце пептида может, например, способствовать его конъюгации с носителем и/или может усиливать иммуногенность пептида.

В соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения по меньшей мере два фрагмента из PCSK9 (т.е. по меньшей мере два пептида, полученные из PCSK9) соединены, индивидуально или в комбинации, с фармацевтически приемлемым носителем, предпочтительно с KLH (гемоцианин фиссуреллы (Keyhole Limpet Hemocyanin)).

В соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения по меньшей мере два фрагмента из PCSK9 были присоединены к фармацевтически приемлемому носителю, предпочтительно к KLH (гемоцианину фиссуреллы), столбнячному антитоксину, альбумин-связывающему белку, внутреннему антигену вируса гепатита В, бычьему сывороточному альбумину, дендримеру (MAP), пептидным линкерам (или фланкирующим областям), а также к веществам-адъювантам, описанным в работе Singh et al., Nat. Biotech. 17 (1999), 1075-1081 (в особенности к тем, которые представлены в таблице 1 этого документа) и в работе O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003), 727-735 (в особенности к описанным в ней эндогенным иммуностимулирующим соединениям и системам доставки) или к их смесям. Химические приемы для осуществления конъюгации (например, посредством гетеробифункциональных соединений, таких как GMBS и, конечно, также других, таких как описанные в руководстве «Bioconjugate Techniques», Greg T. Hermanson) в данном контексте могут быть выбрана из химических реакций, известных специалисту в этой области техники. Кроме того, композиция вакцины может быть составлена с адъювантом, предпочтительно с малорастворимой композицией алюминия, в особенности с гидроксидом алюминия. Конечно, также могут быть применены такие адъюванты как MF59 фосфат алюминия, фосфат кальция, цитокины (например, IL-2, IL-12, GM-CSF), сапонины (например, QS21), производные MDP, CpG олигонуклеотиды, LPS, MPL, полифосфазены, эмульсии (например, Фрейнда, SAF), липосомы, липопептиды, виросомы, иском-частиц, кохлеаты (cochleates), микрочастицы PLG, частицы полоксамера, вирусоподобные частицы, термолабильный энтеротоксин (LT), холерный токсин (СТ), мутантные токсины (например, LTK63 и LTR72), микрочастицы и/или полимеризованные липосомы.

Пептиды настоящего изобретения предпочтительно связаны с носителем или с адъювантом через линкер, который выбирают из группы, состоящей из NHS-поли (этиленоксид) (PEO) (например, NHS-PEO₄-малеимид).

Вакцина, которая включает пептид настоящего изобретения и фармацевтически приемлемым носитель, может быть введена с помощью любого подходящего способа применения, например внутрикожно (i.d.), внутрибрюшинно (i.р.), внутримышечно (i.т.), интраназально, перорально, подкожно (s.с.) и т.п., и в любом подходящем устройстве доставки (O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9), (2003), 727-735). Соединение настоящего изобретения предпочтительно входит в состав для внутрикожного, подкожного или внутримышечного введения. Средства и способы получения соответствующих композиций известны специалисту в этой области техники (смотри, например, «Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations», Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc, 2004).

Таким образом, вакцина в соответствии с настоящим изобретением включает по меньшей мере два пептида, предпочтительно в составе композиции для внутрикожного, подкожного или внутримышечного введения.

По меньшей мере два пептида/фрагмента в вакцине настоящего изобретения предпочтительно входят в состав композиции с адъювантом, предпочтительно, с гидроксидом алюминия.

В соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения вакцину применяют при лечении и/или предупреждении нарушений, вызываемых гиперлипидемией, гиперхолестеринемией и/или атеросклерозом, предпочтительно сердечно-сосудистых заболеваний, инсульта или заболеваний периферических сосудов.

Как отмечалось, вышеуказанные пептиды и их комбинации способны индуцировать образование антител, способных специфически связываться с PCSK9. Взаимодействие антител с PCSK9 приводит к увеличению рецепторов липопротеинов низкой плотности в гепатоцитах печени in vivo и к последующему снижению уровней общего холестерина в плазме.

Заболевание, связанное с атеросклерозом, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из окклюзионного заболевания периферических артерий, ишемической болезни сердца, апоплексического церебрального инсульта и инсульта.

Термины «заболевания, связанные с гиперлипидемией, гиперхолестеринемией и/или атеросклерозом» и «нарушения, вызываемые гиперлипидемией, гиперхолестеринемией и/или атеросклерозом» относятся к заболеваниям, которые представляют собой следствие гиперлипидемии, гиперхолестеринемии и атеросклероза. Данные заболевания включают, среди прочего, окклюзионное заболевание периферических артерий, ишемическую болезнь сердца и апоплексический церебральный инсульт (смотри, например, Steinberg, D. J Lipid Res 46(2005): 179-190 и Steinberg, D. J Lipid Res 47(2006): 1339-1351).

В соответствии с предпочтительным воплощением настоящего изобретения по меньшей мере два фрагмента из PCSK9 вводят индивидууму в количестве, равном от 0,1 нг до 10 мг, предпочтительно от 0,5 до 500 мкг, более предпочтительно от 1 до 100 мкг, на вакцинацию. В предпочтительном воплощении данные количества относятся ко всем фрагментам из PCSK9, присутствующим в вакцине. В другом предпочтительном воплощении данные количества относятся к каждому отдельному фрагменту, присутствующему в вакцине. Конечно, можно обеспечить вакцину, в которой специфические фрагменты из PCSK9 присутствуют в разных или равных количествах. Однако пептид настоящего изобретения альтернативно может быть введен индивидууму в количестве, равном от 0,1 нг до 10 мг, предпочтительно от 10 нг до 1 мг, в особенности, от 100 нг до 300 мкг/кг массы тела.

Количество пептидов, которые могут быть скомбинированы с материалами носителя для получения стандартной лекарственной формы, может изменяться в зависимости от подвергаемого лечению субъекта и конкретного способа введения. Доза вакцины может изменяться в соответствии с такими факторами, как стадия заболевания, возраст, пол и масса индивидуума и способность антитела вызвать желаемый ответ у индивидуума. Режим дозирования может быть подобран так, чтобы обеспечить оптимальный терапевтический ответ. Например, несколько разделенных доз можно вводить ежедневно или доза может быть пропорционально снижена в соответствии с остротой терапевтической ситуации. Доза вакцины также может изменяться для обеспечения оптимального профилактического ответа на дозу в зависимости от обстоятельств. Например, пептиды и вакцина настоящего изобретения могут быть введены индивидууму с интервалами в несколько дней, в одну или две недели или даже в один или два месяца или года во всех случаях в зависимости от уровня антител, направленных на PCSK9.

В предпочтительном воплощении настоящего изобретения пептид/вакцину вводят от 2 до 10, предпочтительно от 2 до 7, еще более предпочтительно вплоть до 5 и наиболее предпочтительно вплоть до 4 раз. Данное число вакцинаций может привести к базовой вакцинации. В особенно предпочтительном воплощении временной интервал между последовательными вакцинациями выбирают так, чтобы он был равен от 2-х недель до 5-ти лет, предпочтительно от 1-го месяца и вплоть до 3-х лет, более предпочтительно от 2-х месяцев до 1,5 лет. В качестве примера схема вакцинации может включать от 3-х до 4-х начальных вакцинаций в течение периода от 6-ти до 8-ми недель и вплоть до 6-ти месяцев. После этого вакцинацию можно повторять от каждых двух до десяти лет. Повторное введение пептида/вакцины настоящего изобретения может максимизировать конечный эффект терапевтической вакцинации.

Вакцина настоящего изобретения также может включать антигены, полученные от других белков, которые также вовлечены в регуляцию уровней LDL и/или HDL в организме человека. Например, фрагменты PCSK9 настоящего изобретения могут быть скомбинированы с эпитопами, полученными от белка СЕТР человека.

Обычно вакцина содержит пептиды настоящего изобретения в количестве, равном от 0,5 до 500 мкг, предпочтительно от 1 до 100 мкг и альтернативно от 0,1 нг до 10 мг, предпочтительно от 10 нг до 1 мг, в особенности от 100 нг до 100 мкг, или, альтернативно, например, от 100 пмоль до 10 мкмоль, предпочтительно от 10 пмоль до 1 мкмоль, в особенности 100 пмоль до 100 нмоль. Обычно вакцина также может содержать вспомогательные вещества, например буферы, стабилизаторы и т.п.

В соответствии с предпочтительным воплощением настоящее изобретение относится к применению двух или более пептидов. В соответствии с настоящим изобретением для производства вакцины для предупреждения и/или лечения атеросклероза и заболевания, связанного с атеросклероза, в котором заболевание, связанное с атеросклерозом предпочтительно выбирают из группы, состоящей из окклюзионного заболевания периферических артерий, ишемической болезни сердца, апоплексического церебрального инсульта и инсульта.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу лечения индивидуума, страдающего от атеросклероза или с риском развития атеросклероза или заболевания, связанного с атеросклерозом, в курсе лечения, при котором пептид или вакцину в соответствии с настоящим изобретением вводят указанному индивидууму.

После введения вакцины настоящего изобретения подлежащий лечению индивидуум также может получать другие активные ингредиенты, о которых известно, что они влияют на уровни LDL и/или HDL у людей и млекопитающих, такие как статины, фибраты, никотиновая кислота, ингибитор поглощения холестерина (например, эзетимиб), ApoAl Milano, очищенная от липидов HDL, растительные стеролы. Особенно предпочтительно вводить индивидууму вакцину настоящего изобретения вместе (т.е. одновременно, последовательно и т.п.) со статинами.

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими четрежами и примерами, не ограничиваясь только ими.

Фиг. 1 показывает количество рецепторов липопротеинов низкой плотности в лизатах печени для пептидов с последовательностью ID No. 1 (нерелевантный контрольный пептид), 4, 5, 6, 7 и 8 и для комбинации А (SEQ ID No. 4 и 7), В (SEQ ID No. 5 и 7), С (SEQ ID No. 5 и 8) и Э (SEQ ID No. 6 и 8) по сравнению с контрольными животными.

Фиг. 2 показывает снижение уровней общего холестерин в плазме в процентах (n = 5 мышей на группу) для пептидов с последовательностью ID No. 1 (нерелевантный контрольный пептид), 4, 5, 6, 7 и 8 и для комбинации А (SEQ ID No. 4 и 7), В (SEQ ID No. 5 и 7), С (SEQ ID No. 5 и 8) и О (SEQ ID No. 6 и 8).

ПРИМЕРЫ

Материалы и способы

Вакцина

Пептиды конъюгировали через гетеробифункциональный линкер GMBS (сложный эфир 4-малеимидомасляной кислоты и N-гидроксисукцинимида) с KLH (гемоцианином фиссуреллы).

15 мкг пептидов суспендировали с гидроксидом алюминия (конечная концентрация гидроксида алюминия была равна 0,2%). В качестве буфера применяли фосфат.

Эксперименты на животных

5 мышей Balb/с иммунизировали подкожно. Мыши имели доступ к пище и воде ad libitum и их содержали в условиях 12-часового цикла чередования света/темноты. Возраст мышей в начале экспериментов обычно был равен от 8 до 10 недель.

Мышей инъецировали четыре раза с 2-недельными интервалами 15 мкг суммарного пептида, соединенного с KLH, и адсорбировали на Alum в качестве адъюванта в общем объеме 1 мл через s.с.-путь.

Кровь отбирали приблизительно через 2 недели после последней инъекции.

Белковый ELISA:

Для определения иммуногенности вакцин, 96-луночные планшеты «Nunc-Maxisorb» покрывали рекомбинантным белком PCSK9 человека. Неспецифическое связывание блокировали инкубацией с блокирующим буфером (1% BSA в PBS). Соответствующие разведения сыворотки добавляли к лункам с серийным разведением 1:2 и инкубировали в течение приблизительно одного часа при 37°С. На каждом планшете ELISA в качестве внутреннего контроля включали стандартную сыворотку. Связанные антитела детектировали инкубацией с биотинилированными козьими антителами к IgO мыши, а затем с пероксидазой хрена, соединенной со стрептавидином. В качестве субстрата добавляли ABTS и оптическую плотность (OD) при 405 нм измеряли с помощью спектрофотометра для прочтения планшетов с микролунками. В качестве негативного контроля анализировали сыворотку из контрольной группы, которой вводили нерелевантный пептид. Титры определяли как разведение сыворотки, при котором достигали 50% от ODмакс в опыте.

Анализ общего холестерина

Общий холестерин измеряли с помощью набора WAKO LabAssay™ Cholesterol Kit (компании «Wako»).

Анализ LDLR способом сэндвич-ELISA

Для определения уровней рецептора липопротеинов низкой плотности (LDRL) в печени мышей, мышей умерщвляли на вторую неделю после последней вакцинации. Ткань печени изолировали и проводили экстракцию белка в соответствии со стандартными протоколами.

96-луночные планшеты «Nunc-Maxisorb» покрывали мышиными LDRL, аффинно очищенными козьими поликлональными антителами к LDRL (R&D Systems). Неспецифическое связывание блокировали инкубацией с 1% BSA/PBS. Затем, лизаты печени инкубировали в течение трех часов при комнатной температуре для захвата мышиных LDRL. Детекцию захваченных LDRL проводили с помощью куриных поликлональных антител к LDRL (Abcam) с последующей инкубацией со вторичными биотинилированными козьими антителами к IgG курицы (Southern Biotech) и с помощью конъюгата стрептавидин-HRP. Наконец, TMB был применен в качестве хромогенного субстрата пероксидазы.

Количественное определение рецепторов липопротеинов низкой плотности проводили путем сравнения со стандартной калибровочной кривой и нормализовали на общую концентрацию белка лизатов.

Контрольная группа (вакцинация нерелевантным контрольным пептидом) была принята за 100%, и уровни групп, обработанных анти-PCSK9 вакцинами, даны по сравнению с данной контрольной группой.

Пример 1. Средние белковые титры против PCSK9 человека (n=5 мышей на группу)=

Пример 2. Средние величины в мг/дл и процент снижения общего холестерина (n=5 мышей на группу)

Пример 3. Количество рецепторов липопротеинов низкой плотности в печени мыши in vivo (n=5 мышей на группу), по сравнению с контрольной группой

Claims

1. Вакцина для снижения уровня холестерина, включающая два фрагмента пропротеинконвертазы субтилизин/кексин типа 9 (PCSK9), соединенных с фармацевтически приемлемым носителем, в которой два фрагмента представляют собой PEEDGTRFHRQA (SEQ ID No. 4) и SIPWNLERITP (SEQ ID No. 7); EEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 5) и SIPWNLERITP (SEQ ID No. 7); EEDGTRFHRQASK (SEQ ID No. 5) и SIPWNLERIT (SEQ ID No. 8); или EEDGTRFHRQAS (SEQ ID No. 6) и SIPWNLERIT (SEQ ID No. 8).

2. Вакцина по п.1, в которой два фрагмента из PCSK9 включают остаток цистеина на С- и/или N-конце.

3. Вакцина по п.1, в которой фармацевтически приемлемый носитель представляет собой KLH (гемоцианин фиссуреллы).

4. Вакцина по п.2, в которой фармацевтически приемлемый носитель представляет собой KLH (гемоцианин фиссуреллы).

5. Вакцина по любому из пп.1-4, изготовленная в форме для внутрикожного, подкожного или внутримышечного введения.

6. Вакцина по п.5, которая включает по меньшей мере один адъювант, предпочтительно гидроксид алюминия.

7. Применение вакцины по любому из пп.1-6 при лечении и/или предупреждении нарушений, вызываемых гиперлипидемией, гиперхолестеринемией и/или атеросклерозом, предпочтительно сердечно-сосудистых заболеваний, инсульта или заболеваний периферических сосудов.

8. Применение по п.7, в котором два фрагмента из PCSK9 вводят индивидууму в количестве, равном от 0,1 нг до 10 мг, предпочтительно от 1 мкг до 500 мкг на дозу.