AT505574A1 - Pharmazeutische zusammensetzung - Google Patents

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Description

Die Erfindung betrifft die Prävention und Behandlung von Atherosklerose, Atherosklerose-Risiko-Erkrankungen und Atherosklerose-Spätfolgen.
Atherosklerose-Spätfolgen, wie die periphere arterielle Verschlusskrankheit, koronare Herzkrankheit sowie apoplektischer zerebraler Insult, gehören noch immer zu den Haupttodesursachen in den Vereinigten Staaten, Europa und in großen Teilen Asiens. Die Entstehung der Atherosklerose wird als chronisch-progressive Entzündung der arteriellen Gefäßwand angesehen, die durch eine komplexe Wechselwirkung von Wachstumsfaktoren, Cytokinen und Zellinteraktionen gekennzeichnet ist. Gemäß der „Reaktion-auf-Verletzung"-Hypothese stellt die „Verletzung" des Endothels das anfängliche Ereignis der Erkrankung dar, das zu einer endothelialen Dysfunktion führt, die eine Kaskade von Zellinteraktionen auslöst, welche in der Bildung der atherosklerotischen Läsionen kulminieren. Als Risikofaktoren, die eine solche „Verletzung" fördern, werden exogene und endogene Einflüsse erwähnt, die statistisch signifikant mit der Atherosklerose korrelieren. Erhöhtes und modifiziertes LDL, Lp(a), arterielle Hypertonie, Diabetes mellitus und Hyperhomocysteinämie zählen beispielsweise zu den wichtigsten dieser das Endothel schädigenden Faktoren. Da das Endothel keine starre, sondern eher eine extrem dynamische Barriere bildet, treten im Laufe der endothelialen Dysfunktion zusätzlich zu einer erhöhten Permeabilität für Lipoproteine eine Vielzahl von molekularen Veränderungen auf, welche die Wechselwirkung von Monozyten, T-Lymphozyten und Endothel-Zellen entscheidend beeinflussen. Durch die Expression von endothelialen Adhäsions-Molekülen von der Art der E-, L- und P-Selektine, Inte-grine, ICMA-1, VCAM-1 und „Platelet-Endothelial-Cell Adhesion Molecule-1", kommt es zu einer Adhäsion von Monozyten und T-Lymphozyten an der Lumen-Seite. Die nachfolgende Migration der Leukozyten über das Endothel wird durch MCP-1, Interleukin-8, PDGF, M-CSF und Osteopontin vermittelt. Über den sogenannten „Scaven-ger"-Rezeptor können Makrophagen und Monozyten, die in der Intima vorhanden sind, die eingedrungenen LDL-Partikel aufnehmen, um sie als Vakuolen von Cholesterinestern im Zytoplasma abzulagern. Die auf diese Weise gebildeten Schaumzellen sammeln sich hauptsächlich in Gruppen im Bereich der Gefäß-Intima an und bilden die bereits in der Kindheit auftretenden „Fettstreifen"-Läsionen („fatty streak lesions"). LDL sind Lipoproteine mit geringer
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Dichte und werden durch katabolische Auswirkungen lipolytischer Enzyme aus Triglycerid-reichen VLDL-Partikeln gebildet. Neben ihrer schädigenden Eigenschaften auf Endothel-Zellen und Zellen der glatten Muskulatur der Media hat LDL außerdem eine chemotaktische Wirkung auf Monozyten und kann die Expression von MCFS und MCP-1 der Endothel-Zellen über Gen-Amplifikation steigern. Im Gegensatz zu LDL kann HDL Cholesterinester aus beladenen Makrophagen, übermittelt durch Apolipoprotein E unter Bildung sogenannter HDLc-Komplexe aufnehmen. Durch die Interaktion der SR-Bl-Rezeptoren können diese mit Cholesterinester beladenen Partikel an Hepatozyten oder an Zellen der adrenalen Cortex binden und Cholesterin für die Erzeugung von Gallensäuren bzw. Steroiden liefern. Dieser Mechanismus wird reverser Cholesterintransport genannt und erklärt die Schutzfunktion von HDL. Aktivierte Makrophagen können Antigene über HLA-DR präsentieren und dadurch CD4-und CD8-Lymphozyten aktivieren welche folglich stimuliert werden, um Cytokine, wie IFN-gamma und TNF-alpha, zu sezernieren und außerdem zur Verstärkung der entzündlichen Reaktion beitragen. Im weiteren Verlauf der Krankheit beginnen die glatten Muskelzellen der Media in den Bereich der Intima zu wachsen, welcher durch die Entzündung verändert wurde. Dadurch bildet sich die intermediäre Läsion in diesem Stadium. Ausgehend von der intermediären Läsion entwickelt sich im Lauf der Zeit die progressive und komplizierte Läsion, welche morphologisch durch einen nekrotischen Kern, Zellabfall und eine Kollagen-reiche fibrinöse Kappe auf der Seite des Lumens gekennzeichnet ist. Wenn die Zellzahl und der Anteil der Lipoide kontinuierlich ansteigen, kommt es zu Rissen im Endothel, und Oberflächen mit thrombotischen Eigenschaften werden freigelegt. Infolge des Anhaftens und der Aktivierung von Thrombozyten an diesen Rissen werden Granula freigesetzt, die Cytokine, Wachstumsfaktoren und Thrombin enthalten. Proteolytische Enzyme der Makrophagen sind für das Ausdünnen der fibrinösen Kappe verantwortlich, was letztlich zu einem Aufbrechen der Plaques mit nachfolgender Thrombose und Stenose der Gefäße und einer akuten Ischämie der terminalen Gefäße führt.
Verschiedene Risikofaktoren werden für die Bildung athero-sklerotischer Läsionen verantwortlich gehalten. Hyperlipoprotein-ämie, arterielle Hypertonie und Nikotinabusus sind von besonderer Bedeutung in dieser Hinsicht. Eine Krankheit, die mit einer übermäßigen Erhöhung des gesamten und des LDL-Cholesterins verbunden
NACHGEREICHT
- 3 - ist, ist die familiäre Hypercholesterinämie. Sie gehört zu den häufigsten monogenetisch vererbten Stoffwechselerkrankungen. Die moderate heterozytoge Form tritt mit einer Häufigkeit von 1:500, die homozygote Form mit 1:1 Million deutlich viel seltener auf. Ursachen für die familiäre Hypercholesterinämie sind Mutationen im LDL-Rezeptor-Gen- am kurzen Arm des Chromosoms 19. Diese Mutationen können Deletionen, Insertionen oder Punkt-Mutationen sein. Der charakteristische Befund der Lipoproteine bei familiärer Hypercholesterinämie ist die Erhöhung des gesamten und des LDL-Cholesterins bei zumeist normalen Triglycerid- und VLDL-Konzen-trationen. Häufig ist das HDL erniedrigt. Phänotypisch gibt es eine Typ IIAa-Hyperlipoproteinämie. Bei der heterozygoten Form ist das Gesamtcholesterin um das Zwei- bis Dreifache erhöht, bei der homozygoten Form ist es im Vergleich zum Normalwert um das Fünf- bis Sechsfache erhöht. Klinisch manifestiert sich die familiäre Hypercholesterinämie durch eine frühe Koronarsklerose. In der Regel treten bei heterozygoten Männern die ersten Symptome einer koronaren Herzkrankheit (KHK) zwischen ihrem 30. und 40. Lebensjahr auf, bei Frauen im Durchschnitt 10 Jahre später. 50% der betroffenen Männer sterben an den Folgen ihrer Koronarsklerose bevor sie 50 Jahre alt sind. Neben den massiv erhöhten LDL-Spiegeln sind auch erniedrigte HDL-Konzentrationen für das rapide Fortschreiten der Atherosklerose verantwortlich. Atheroskleroti-sche Veränderungen können sich auch an extrakardialen Gefäßen, wie der Aorta, den Karotiden und peripheren Arterien, manifestieren. Bei der homozygoten Form der Erkrankung entsteht die Koronarsklerose schon in der frühen Kindheit. Der erste Myokardinfarkt tritt häufig vor dem 10. Lebensjahr auf, und in den meisten Fällen sterben die betroffenen Personen, bevor sie 20 Jahre alt sind. Das Entstehen von Xanthomen ist eine Funktion der Höhe des Serum-Cholesterins und der Dauer der Erkrankung. Etwa 75% der betroffenen heterozygoten Individuen, die über 20 Jahre alt sind, weisen tendinöse Xanthome auf. Die homozygoten Individuen haben in fast 100% Haut- und Sehnen-Xanthome. Lipidablagerungen können auch am Augenlid und in der Hornhaut auftreten (Xanthelasmen; Arcus lipoides). Diese sind jedoch kein spezifisches Anzeichen einer Hypercholesterinämie, da man sie auch bei normalen Cholesterinwerten findet. Weiters treten bei der FH häufig akute Arthritiden und Tendosynovitiden auf. Die einzelnen Lipoproteine unterscheiden sich hinsichtlich Größe und Dichte, da sie ver-
NACHGEREICHT 4 schieden große Anteile von Lipiden und Proteinen, sogenannte Apo-proteine, enthalten. Die Dichte nimmt mit zunehmendem Protein-und abnehmendem Lipid-Anteil zu. Infolge ihrer unterschiedlichen Dichten können sie durch Ultrazentrifugieren in verschiedene Fraktionen aufgetrennt werden. Dies ist die Basis für die Klassifizierung der Lipoproteine in ihre Hauptgruppen: Chylomikrone, Lipoproteine sehr geringer Dichte („very-low-density lipoprote-ins", VLDL), Lipoproteine intermediärer Dichte („intermediate-density lipoproteins", IDL), Lipoproteine geringer Dichte („low-density lipoproteins, LDL), Lipoproteine hoher Dichte (high-den-sity lipoproteins", HDL), Lipoprotein (a) (Lp(a)). Zu den Lipo proteinen mit hohem atherogenem Potential zählen vor allem das LDL, das Lp(a) und das VLDL. LDL hat eine Dichte von etwa d=l,006-1,063 g/ml. Der Kern ist aus veresterten Cholesterinmole-külen gebildet. Dieser stark hydrophobe Kern ist von einer Hülle aus Phospholipiden, nicht-verestertem Cholesterin und einem einzigen apo B100-Molekül umgeben. Außerdem findet man Apoprotein E an der Oberfläche der LDL-Partikel. Die Funktion des LDL besteht im Transportieren von Cholesterin an periphere Gewebe, wo es -über Vermittlung des Apoprotein B-100 - in die Zellen über den LDL-Rezeptor aufgenommen wird. In umfassenden epidemiologischen Untersuchungen konnte eine positive Korrelation zwischen der Höhe des Serum-Cholesterins und dem Auftreten einer koronaren Herzkrankheit nachgewiesen werden. LDL-Cholesterinmengen von mehr als 160 mg/dl stellen ein hohes kardiovaskuläres Risiko dar. Neben der Höhe des LDL-Cholesterins spielt auch die Höhe des Gefäßschützenden HDL-Cholesterins eine wichtige Rolle beim Abschätzen des Risikoprofils für kardiovaskuläre Erkrankungen. Mengen von weniger als 35 mg/dl sind mit einem erhöhten Risiko verbunden. VLDL sind Lipoproteine mit sehr geringer Dichte (d=0,94-1,006 g/ ml) und einem hohen Triglycerid-Anteil. Im Wesentlichen enthält VLDL Apoprotein C und geringe Anteile der Apoproteine B-100 und E. Anders als Chylomikrone bestehen VLDL nicht aus Nahrungsmittel-Lipiden, sondern sie werden in der Leber aus endogen gebildeten Triglyceriden synthetisiert und in den Blutkreislauf sezerniert. Wie die Chylomikrone werden die Triglyceride durch die Apoprotein C-II-aktivierte Lipoprotein-Lipase hydrolysiert, und die freien Fettsäuren werden dem Muskel- und Fettgewebe zugeführt. Die verbleibenden Cholesterin-reichen VLDL-Überreste werden wegen ihrer höheren Dichte Intermediate-density-Lipoproteine I nachgereicht genannt. Lipoprotein(a) (Lp(a)) hat eine Dichte von 1,05 bis 1,12 g/ml und ist dem LDL in seiner Zusammensetzung ähnlich. Neben Apoprotein B-100 besteht sein Protein-Anteil aus dem Apopro-tein(a), welches für Lp(a) charakteristisch ist. Bisher weiß man sehr wenig über die Physiologie und Funktion des Lp(a). Da das Apoprotein(a)-Molekül eine hohe Sequenz-Homologie mit Plasminogen aufweist, nimmt man an, dass Lp(a) sowohl die Bildung von Thromben an atherosklerotischen Plaques fördert als auch eine atherogene Wirkung hat. Lp(a) findet man zusammen mit Apoprotein B in atherosklerotischen Läsionen. Retrospektive Untersuchungen zeigten eine Korrelation zwischen erhöhtem Lp(a) und einer KHK. Ebenso zeigte die Metaanalyse zahlreicher prospektiver Untersuchungen, dass Lp(a) ein unabhängiger Risikofaktor für das Auftreten einer KHK ist. Mengen von zwischen 15 und 35 mg/dl werden als normal angesehen. Bisher kann Lp(a) weder durch die Diät, noch durch Medikamente beeinflusst werden. Daher sind Therapie-Maßnahmen auf die Reduktion weiterer Risikofaktoren beschränkt. Insbesondere scheint eine Verringerung des LDL-Cholesterins das kardiovaskuläre Risiko von Lp(a) zu senken. Bei der Pathogenese der Atherosklerose wird außerdem den Gerinnungsfaktoren eine beträchtliche pathophysiologische Bedeutung beigemessen. Epidemiologische Erkenntnisse weisen auf eine Korrelation zwischen der Fibrinogen-Konzentration im Plasma und dem Entstehen einer koronaren Herzkrankheit und vor allem eines Myokardinfarkts hin. In diesem Zusammenhang erwiesen sich erhöhte Fibrinogenmengen (>300 mg/dl) als unabhängiger Indikator und Risikofaktor für kardiovaskuläre Erkrankungen. Es stehen aber auch hohe Konzentrationen des Gewebe-Plasminogen-Aktivator-Inhibitors tPA-I in einem Zusammenhang mit dem Auftreten der KHK. Das Verhältnis zwischen Hyper-Triglyceridämie und dem koronaren Risiko ist in jedem Fall ein anderes, je nach der Ursache der Erhöhung der Blut-Lipide. Trotz der Diskussion, ob Triglyceride als unabhängiger Risikofaktor anzusehen sind oder nicht, ist unbestritten, dass sie eine wichtige Rolle bei der Pathogenese der koronaren Herzkrankheiten spielen. Das Auftreten der Krankheit ist am höchsten bei Patienten, die hohes LDL-Cholesterin und einen hohen Triglycerid-Spiegel aufweisen.
Das Cholesterin-Ester-Transfer-Protein (CETP) ist ein stabiles Plasma-Glykoprotein, das für den Transfer neutraler Lipide und Phospholipide zwischen Lipoproteinen verantwortlich ist und
NACHGEREICHT
- 6 - das die Plasma-Konzentration von HDL niederreguliert. Die Hemmung der CETP-Lipidtransfer-Aktivität wurde bereits als therapeutischer Ansatz zur Steigerung des HDL-Plasma-Spiegels vorgeschlagen. Es gibt zahlreiche Gründe, die nahelegen, dass die Verringerung der CETP-Aktivität im Plasma zu einer Steigerung der HDL-Spiegel führen sollte. So senkt CETP die HDL-Konzentration durch den Transfer von Cholesterinestern von HDL zu LDL und VLDL. In Tierversuchen mit Kaninchen und Hamstern führte die vorübergehende Inhibierung von CETP mit monoklonalen anti-CETP-Antikör-pern, Antisense-Oligonukleotiden oder CETP-Inhibitoren zu einer Erhöhung der HDL-Spiegel. Eine dauerhafte CETP-Inhibierung mit Antisense-Oligonukleotiden steigerte die HDL-Mengen und führte so zu einer Verringerung der atherosklerotischen Läsionen im Kaninchen-Tiermodell für Atherosklerose.
In der Literatur sind mehrere CETP-Inhibitoren beschrieben, von welchen einige sich in klinischen Versuchen befinden (z.B. Torcetrapib) (Sikorski, J.A., J. Med. Chem. 49 (1) (2006): 1-22) .
In der US 5,512,548 und in der WO 93/011782 sind Polypeptide und ihre Analoga beschrieben, die CETP, das den Transfer von Cholesterin-Estern von HDL zu VLDL und LDL katalysiert, inhibieren können, und daher bei Verabreichung an einen Patienten eine anti-atherosklerotische Aktivität aufweisen. Gemäß diesen Dokumenten stammt ein solcher CETP-Polypeptid-Inhibitor von Apolipo-protein C-I verschiedener Quellen, wobei insbesondere N-terminale Fragmente von bis zur Aminosäure 36 als CETP-Inhibitoren identifiziert wurden.
Auch in der US 5,880,095 A ist ein CETP-bindendes Peptid geoffenbart, das die Aktivität von CETP bei einem Individuum inhibieren kann. Das CETP-inhibitorische Protein weist ein N-ter-minales Fragment von Schweine-Apolipoprotein C-III auf.
In US 2004/0087481 und US 6,410,022 Bl sind Peptide geoffenbart, die wegen der Induktion einer CETP-spezifischen Immunantwort zur Behandlung und Prävention kardiovaskulärer Erkrankungen, wie z.B. Atherosklerose, verwendet werden können. Diese Peptide weisen ein T-Helfer-Zell-Epitop auf, das nicht von CETP stammt, und mindestens ein B-Zell-Epitop, das von CETP kommt und direkt von letzterem abgeleitet werden kann. Das T-Helfer-Zell-Epitop ist vorteilhaft vom Tetanus-Toxoid abgeleitet und ist an mindestens ein B-Zell-Epitop von CETP kovalent gebunden. Durch Verwen-
NACHGEREICHT ·· ► « ♦ · 7 düng eines T-Helfer-Zell-Epitops, das für den Organismus fremd ist, wird es möglich, Antikörper im Körper eines Individuums zu induzieren, welche Antikörper gegen jenen Peptid-Teil gerichtet sind, der aus mindestens einem CETP-B-Zell-Epitop besteht.
In der WO 2006/029982 sind CETP-Mimotope zur Verwendung für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prävention von Atherosklerose beschrieben.
In jüngster Zeit gab es bereits Vorschläge für einen Vakzin-Ansatz hinsichtlich CETP. So wurden beispielsweise Kaninchen mit einem Vakzin behandelt, das jenes Peptid von CETP, das für den Cholesterin-Ester-Transfer verantwortlich ist, als Antigen enthielt. Die immunisierten Kaninchen hatten eine verringerte CETP-Aktivität und veränderte Lipoprotein-Spiegel mit gesteigerten HDL- und verringerten LDL-Werten. Außerdem wiesen die behandelten Versuchstiere des Atherosklerose-Modells im Vergleich zu Kontroll-Tieren verringerte atherosklerotische Läsionen auf.
Die Ergebnisse einer klinischen Studie der Phase II wurden veröffentlicht, welche Studie von der amerikanischen Biotechnologie-Firma Avant mit dem Vakzin CETi-1 durchgeführt worden waren (BioCentury Extra For Wednesday, 22. Oktober 2003). In dieser Studie der Phase II wurde wie in der vorhergehenden Studie der Phase I ein sehr gutes Sicherheitsprofil ohne jegliche bedenkliche Nebenwirkungen nachgewiesen, was den Schluss zulässt, dass im Grunde keine Nebenwirkungen von einem anti-CETP-Impfungs-An-satz zu erwarten sind. Hinsichtlich der Wirksamkeit war jedoch das Avant-Vakzin enttäuschend, da es nicht zu erhöhten HDL-Spie-geln führte, die signifikant besser als jene waren, die mit einer Placebo-Behandlung erreicht wurden.
Das Problem mit dem CETi-l-Vakzin ist, dass es endogenes An-tigen verwendet. Das humane Immunsystem ist gegenüber endogenen Strukturen tolerant, da bei den meisten der endogenen Moleküle -anders als bei CETP - es lebensnotwendig ist, dass keine Autoantikörper gebildet werden. Somit war es das Ziel des CETi-l-Vak-zins, die endogene Toleranz zu brechen, was ihm offensichtlich nicht in ausreichendem Maß gelang.
Somit ist es das Ziel der vorliegenden Erfindung, Antigene für ein anti-CETP-Vakzin vorzusehen, welche so ausgewählt sind, dass sie vom Immunsystem als fremd angesehen werden und daher keine Selbst-Toleranz brechen müssen. Diese Antigene können zur Prävention und/oder Behandlung von Atherosklerose, Atherosklero-
NACHGEREICHT se-Risiko-Krankheiten und Atherosklerose-Spätfolgen verwendet werden.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Verbindung, welche die Aminosäuresequenz (ZiJnXÄXÄiZz), umfasst, worin
Zi ein anderer Aminosäurerest als C ist,
Xx ein Aminosäurerest ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus D, A, R, E, S, N, T und G ist, X2 ein Aminosäurerest ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F, A, W, R, S, L, Q, V und M ist, X3 ein Aminosäurerest ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L, A, S, W, E, R, I und H ist, X4 ein Aminosäurerest ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Q, A, H, D, K, R, S und E ist, Z2 ein anderer Aminosäurerest als C ist, n eine ganze Zahl zwischen 0 und 9 ist, m eine ganze Zahl zwischen 0 und 3 ist, kein 4- bis 16-meres Polypeptidfragment des Cholesterin-Ester-Transport-Proteins (CETP) oder ein CETP-Epitop ist oder umfasst, wobei die Verbindung eine Bindungskapazität an einen Antikörper hat, der für das natürliche CETP-Glykoprotein spezifisch ist, oder
eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SYHATFL, TMAFPLN, HYHGAFL, EHHDIFL, TGLSVFL, WMPSLFY, SMPWWFF, TMPLLFW, DTWPGLE, SMPPIFY, MPLWWWD, SMPNLFY, RMPPIFY, NPFEVFL, TLPNWFW, SMPLTFY, SPHPHFL, NFMSIGL, SQFLASL, WSWPGLN, IAWPGLD, SKFMDTL, SMPMVFY, YEWVGLM, KGFLDHL, HQSDDKMP-WWFF, YVWQDPSFTTFF, YVWQDPSFTTFF, LPQTHPLHLLED, GPVSIYADTDFL, DSNDTLTLAAFL, NGSPALSHMLFL, TDYDPMWVFFGY, IFPLDSQWQTFW, NESMP-DLFYQPS, DWGDKYFSSFWN, VSAYNNV und WPLHLWQ zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von Atherosklerose, Atherosklerose-Risiko-Krankheiten und Atherosklerose-Spätfolgen.
Die vorliegende Erfindung sieht CETP-Mimotope für diese Zwecke vor. Die CETP-Mimotope gemäß der vorliegenden Erfindung sind
NACHGEREICHT
-» m»»o <ϊο ϋβ 4<ι > r» ;» 'ϊ τ ^ τ -» Γ» » r* -1 » '1 * 1 Ί 1 > 1 » ) 1 <»·> Τ'» Ι'* »» ♦ »η ο '»r> >η τι» »r> - 9 - vorzugsweise antigene Polypeptide, die sich in ihrer Aminosäuresequenz von der Aminosäuresequenz des CETP oder von Fragmenten von CETP unterscheiden. In dieser Hinsicht können die erfindungsgemäßen Mimotope eine oder mehrere nicht-natürliche Aminosäuren (d.h. nicht von den 20 „klassischen" Aminosäuren) umfassen, oder sie können vollständig aus solchen nicht-natürlichen Aminosäuren zusammengesetzt sein. Außerdem können die erfindungsgemäßen Antigene, die anti-CETP-Antikörper induzieren, aus D- oder L-Amino-säuren oder aus Kombinationen von DL-Aminosäuren zusammengesetzt sein, und sie können gegebenenfalls durch weitere Modifikationen, Ringschlüsse oder Derivatisierungen verändert worden sein. Geeignete anti-CETP-Antikörper-induzierende Antigene können aus im Handel erhältlichen Peptid-Bibliotheken bereitgestellt werden. Vorzugsweise sind diese Peptide mindestens 4 Aminosäurereste lang, insbesondere mindestens 7 Aminosäuren, und bevorzugte Längen können bis zu 16, vorzugsweise bis zu 14 oder 20 Aminosäuren (z.B. 5 bis 16 Aminosäurereste) sein. Gemäß der Erfindung können jedoch auch sehr wohl längere Peptide als anti-CETP-Antikörper-induzierende Antigene verwendet werden. Weiters können die Mimotope der vorliegenden erfindung auch Teil eines Polypeptids sein und folglich an ihrem N- und/oder C-Terminus mindestens einen weiteren Aminosäurerest aufweisen.
Die Mimotope der vorliegenden Erfindung können an Antikörper binden, die durch Verabreichen von C-FGFPEHLLVDFLQSLS (16 C-ter-minale Aminosäuren des CETP-Proteins), gekoppelt an KLH, an Säuger erhalten werden. Sobald sie an einen Säuger verabreicht worden sind, können die Mimotope eine entsprechende Immunantwort induzieren, so dass gegen CETP gerichtete Antikörper in diesem Säuger erzeugt werden.
Zur Herstellung von CETP-Mimotopen (d.h. anti-CETP-Antikör-per-induzierenden Antigenen) sind natürlich auch Phagen-Biblio-theken, Peptid-Bibliotheken geeignet, die z.B. mittels kombinatorischer Chemie erzeugt oder mittels Screening-Techniken mit hohem Durchsatz für die unterschiedlichsten Strukturen erhalten wurden (Display: A Laboratory Manual von Carlos F. Barbas (Hrsg.) et al.; Willats WG Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol. Biol. 2002 Dec.; 50(6):837-54).
Weiters können gemäß der Erfindung auch anti-CETP-Antikör-per-induzierende Antigene auf Basis von Nukleinsäuren („Aptame-re") verwendet werden, und auch diese sind in den unterschied-
NACHGEREICHT ·· ♦ ·«·· ·· «t ·· «·· · · · · · ·
- 10 - lichsten (Oligonukleotid)-Bibliotheken zu finden (z.B. mit 2-180 Nukleinsäureresten) (z.B. Burgstaller et al., Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5(5)(2002), 690-700; Famulok et al., Acc. Chem. Res. 33 (2000), 591-599; Mayer et al., PNAS 98 (2001), 4961-4965, usw.). Bei anti-CETP-Antikörper-induzierenden Antigenen auf Basis von Nukleinsäuren kann das Nukleinsäure-Gerüst beispielsweise durch die natürlichen Phosphor-Diester-Verbindungen oder auch durch Phosphortioate oder Kombinationen oder chemische Variationen (z.B. als PNA) vorgesehen werden, wobei erfindungsgemäß als Basen vor allem U, T, A, C, G, H und mC verwendet werden können. Die 2’-Reste der Nukleotide, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind vorzugsweise H, OH, F, CI, NH2, 0-Methyl, O-Ethyl, O-Propyl oder O-Butyl, wobei die Nukleinsäuren auch verschieden modifiziert sein können, d.h. z.B. mit Schutzgruppen, wie sie üblicherweise in der Oligonukleotid-Synthese verwendet werden. So sind auch anti-CETP-Antikörper-induzierende Antigene auf Aptamer-Basis bevorzugte anti-CETP-Antikörper-indu-zierende Antigene im Rahmen der vorliegenden Erfindung.
Gemäß der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck „Mimotop" auf ein Molekül, das eine Konformation hat, welche eine Topologie aufweist, die dem Epitop, welches es imitiert, äquivalent ist. Das Mimotop bindet an dieselbe Antigen-bindende Region eines Antikörpers, die immunspezifisch an ein gewünschtes Antigen bindet. Das Mimotop ruft eine immunologische Antwort bei einem Wirt hervor, der auf das Antigen, das es imitiert, reagiert. Das Mimotop kann auch als Kompetitor für das Epitop, welches es imitiert, in in vitro-Inhibitionstests (z.B. ELISA-Inhibitions-test) wirken, welche das Epitop und einen an das Epitop bindenden Antikörper umfassen. Ein Mimotop der vorliegenden Erfindung muss jedoch nicht unbedingt die Bindung des Epitops, das es imitiert, in einem in vitro-Inhibitionstest verhindern oder mit dieser konkurrieren, obwohl es bei Verabreichung an einen Säuger eine spezifische Immunantwort induzieren kann.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „Epitop" auf eine immunogene Region eines Antigens, die von einem bestimmten Antikörper-Molekül erkannt wird. Im Allgemeinen hat ein Antigen ein oder mehrere Epitope , die jedes einen Antikörper, der das bestimmte Epitop erkennt, binden können.
Die Abkürzungen für die in der vorliegenden Erfindung geof-fenbarten Aminosäurereste folgen den IUPAC-Empfehlungen:
NACHGEREICHT ·« 9 «·«· ·· ·· »· * · ·· φ 9 f · · · * * · · « · ·« • ♦ · ···#·«· • · · · 9 9 9 Φ 9 9 9 - 11 -
Aminosäure 3-Buchstaben-Code 1-Buchstaben-Code Alanin Ala A Arginin Arg R Asparagin Asn N Asparaginsäure Asp D Cystein Cys C Glutaminsäure Glu E Glutamin Gin Q Glycin Gly G Histidin His H Isoleucin Ile I Leucin Leu L Lysin Lys K Methionin Met M Phenylalanin Phe F Prolin Pro P Serin Ser S Threonin Thr T Tryptophan Trp w Tyrosin Tyr Y Valin Val V
Die Mimotope der vorliegenden Erfindung können synthetisch mittels chemischer Synthesemethoden, die auf dem Gebiet wohl bekannt sind, entweder als isoliertes Peptid oder als Teil eines anderen Peptids oder Polypeptids hergestellt werden. Alternativ kann das Peptid-Mimotop in einem Mikroorganismus erzeugt werden, der das Peptid-Mimotop erzeugt, welches danach isoliert und ge-wünschtenfalls weiter gereinigt wird. Das Peptid-Mimotop kann in Mikroorganismen, wie Bakterien, Hefe oder Pilzen, in Eukaryonten-Zellen, wie Säuger- oder Insektenzellen, oder in einem rekombi-nanten Virus-Vektor, wie einem Adenovirus, Poxvirus, Herpes-Virus, Simliki-Forest-Virus, Baculovirus, Bakteriophagen, Sindbis-
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Virus oder Sendai-Virus, erzeugt werden. Zu den geeigneten Bakterien für die Erzeugung des Peptid-Mimotops zählen E.coli, B.sub-tilis oder jedes andere Bakterium, das Peptide, wie die Peptid-Mimotope, exprimieren kann. Zu den geeigneten Hefe-Arten für die Expression des Peptid-Mimotops zählen Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Candida, Pichia pastoris oder jede andere Hefe, die Peptide exprimieren kann. Entsprechende Verfahren sind auf dem Gebiet wohl bekannt. Auch Verfahren zum Isolieren und Reinigen rekombinant erzeugter Peptide sind auf dem Gebiet wohl bekannt und umfassen z.B. Gelfiltration, Affinitäts-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie usw..
Um die Isolierung des Peptid-Mimotops zu erleichtern, kann ein Fusionspolypeptid hergestellt werden, wobei das Peptid-Mimo-top translationell an ein heterologes Polypeptid fusioniert (kovalent gebunden) wird, was die Isolierung mittels Affinitäts-Chromatographie ermöglicht. Typische heterologe Polypeptide sind His-Tag (z.B. His6; 6 Histidin-Reste), GST-Tag (Glutathion-S-transferase) usw.. Das Fusionspolypeptid erleichtert nicht nur die Reinigung der Mimotope, sondern kann auch verhindern, dass das Mimotop-Polypeptid während der Reinigung abgebaut wird. Wenn erwünscht ist, das heterologe Polypeptid nach der Reinigung zu entfernen, kann das Fusionspolypeptid eine Schnittstelle an der Verbindung zwischen dem Peptid-Mimotop und dem heterologen Polypeptid aufweisen. Die Schnittstelle besteht aus einer Aminosäuresequenz, die mit einem Enzym geschnitten wird, das für die Aminosäuresequenz an dieser Stelle spezifisch ist (z.B. Proteasen).
Die Mimotope der vorliegenden Erfindung können auch an oder nahe ihrer N- und/oder C-Termini modifiziert sein, so dass an diesen Positionen ein Cystein-Rest daran gebunden ist. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden terminal positionierte (an den N- und C-Termini des Peptids befindliche) Cystein-Reste verwendet, um die Peptide durch eine Disulfid-Bindung zu zyklisieren.
Die Mimotope der vorliegenden Erfindung können auch in verschiedenen Tests und Kits verwendet werden, insbesondere in immunologischen Tests und Kits. Daher ist es besonders bevorzugt, dass das Mimotop ein Teil eines anderen Peptids oder Polypeptids, insbesondere eines Enzyms, sein kann, das als Reporter in immunologischen Tests verwendet wird. Zu solchen Reporter-Enzymen zählen z.b. alkalische Phosphatase oder Meerrettich-Peroxidase (horseradish peroxidase).
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Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist Xi D und X4 ist Q oder H, vorzugsweise Q. Ein solches Molekül weist vorzugsweise an seinem N-Terminus weitere Aminosäurereste mit der Sequenz Xa Xb Xc Xd Xe Xf auf, worin Xa P, Y, T oder K ist, Xb ein anderer Aminosäurerest als C ist, Xc H ist,
Xd Y, L, Η, V, T, I oder F ist, Xe Y, I, P, L, Q, S, R, T, F oder A ist, und Xf A, W, V, Q, L, S, I, R oder T ist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist n 7, 8 oder 9, Zi ist ein anderer Aminosäurerest als C oder ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F, G, F, A, P, W, Y, S, G, D, L, E, K, T, P, I und M, vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus F, G, F, A, P, Y, T, S, G, K und D, und Z2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus S, L, A, W, L, N, T, I, Y und H.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist Xi ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus D, A, R, E und L, X2 ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F, A, W, Q und R, X3 ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L, A und S, und X4 ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Q, A und H.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist Χχ D, X2 ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F, Q und W, X3 ist L oder S, und X4 ist Q oder H.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Verbindung die Aminosäuresequenz FX8 (F) oPX9HX10XiiX12DX2X3X4X5X6X7, worin X8 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus G, A, F, Y und K, X9 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus E, Y, A, Q, K und S,
Xio ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Η, V, L, F und I,
Xu ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus L, W, S, I, F und Y, X12 V, T, F oder I ist, X5 S oder Y ist, X6 L, A oder I ist, X7 S, N oder T ist, und o 0 oder 1 ist.
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung umfasst vorzugsweise die Aminosäuresequenz XiX2X3X4X5X6X7, worin Xi ausgewählt ist
NACHGEREICHT • # · • ·♦· · • . · « ·· • # 14 aus der Gruppe bestehend aus D, S, N, T und G, X2 F ist, X3 L ist, X4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Q, D, K, R, S und E, X5 S oder T ist, X6 L ist und X7 ein anderer Aminosäurerest als C ist, der vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus S, T, A, M, F und W.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SSLELFL, SFLDTLT, NFLKTLS, DFLRTLT, AFLDTLV, TFLSSLA, GFLDSLM, SPHPHFL, SNFLKTL, TGFLATL, SDFLRAL, SANPRDFLETLF, RM-PESFLDTLW, TIYDSFLDSLAS, KPYLLKDFLEAL, AMGPYDALDLFL, TWNPIES-FLESL, QYQTPLTFLEAL, RHISPATFLEAL, HTDSFLSTFYGD, ADSTFTSFLQTL, GPVSIYADTDFL, DSNDTLTLAAFL, TPTHYYADFSQL, LPGHLIWDSLHY, LPQTH-PLHLLED, IPYHHLVDQLHH, YPYHVQVDVLQN, IPSHHLQDSLQL, EYAHHTSLDLRQ, EPLHFRSDRIQA, ATPSHLIIDRAQ, APKHLYADMSQA, FKPAHVSIDWLQ, MPAHLS-RDLRQS, NPKHYSIDRHQA, SPQHLTTDRAQA, TPFHFAQDSWQW, TPTHYYADFSQLLS, TPTHYYADFSQSLS, GTPTHYYADFSQLL, GTPTHYYADFSQSL, FGTPTHYYADFSQSLS, FGFPTHYYADFSQSLS, LPGHLIWDSLHY, LPGHLIWDSLHYL, LPGHLIWDSLHYLS, LPGHLIWDSLHSL, LPGHLIWDSLHSLS, GLPGHLIWDSLHYL, GLPGHLIWDSLHSL, FGLPGHLIWDSLHSLS, FGFPGHLIWDSLHSLS, LPQTHPLHLLED, IPYHHLVDQLHH, IPYHHLVDQLHLS, IPYHHLVDQLHSLS, FGIPYHHLVDQLHHLS, FGFPYHHLVDQL-HSLS, YPYHVQVDVLQN, YPYHVQVDVLQNLS, YPYHVQVDVLQSLS, FGYPYHVQVD-VLQNLS, FGFPYHVQVDVLQSLS, IPSHHLQDSLQL, IPSHHLQDSLQLLS, IPSHHLQDSLQSLS, GIPSHHLQDSLQLL, FGIPSHHLQDSLQLLS, FGFPSHHLQD-SLQSLS, EYAHHTSLDLRQ, EPLHFRSDRIQA, EPLHFRSDRIQALS, EPLH-FRSDRIQSLS, GEPLHFRSDRIQAL, FGEPLHFRSDRIQALS, FGFPLHFRSDRIQSLS, APKHLYADMSQA, APKHLYADMSQALS, APKHLYADMSQSLS, GAPKHLYADMSQAL, FGFPKHLYADMSQSLS, MPAHLSRDLRQS, MPAHLSRDLRQSL, MPAHLSRDLRQSLS, GMPAHLSRDLRQSL, FGFPAHLSRDLRQSLS, NPKHYSIDRHQA, TPFHFAQDSWQW, TPFHFAQDSWQWLS, TPFHFAQDSWQSLS, GTPFHFAQDSWQWL, FGFPFHFAQDSWQSLS, ACSFAYLYRC, ACFMGDKWVC, ACVLYPKAIC, ACYMGQQFVC, ACLTAYLHWC, ACT-LFPVAYC, ACWLFPYAHC, ACKSINMWLC, ACQTINRWLC, FGFPEHLLVDFLQSLS, FGFPEHLLVDFLQSLS, FPEHLLVDFLQSL, AGFPEHLLVDFLQSLS, FAFPEHLLVDFL-QSLS, FGAPEHLLVDFLQSLS, FGFAEHLLVDFLQSLS, FGFPAHLLVDFLQSLS, FGFPEALLVDFLQSLS, FGFPEHALVDFLQSLS, FGFPEHLAVDFLQSLS, FGFPEHL-LADFLQSLS, FGFPEHLLVAFLQSLS, FGFPEHLLVDALQSLS, FGFPEHLLVDFAQSLS, FGFPEHLLVDFLASLS, FGFPEHLLVDFLQALS, FGFPEHLLVDFLQSAS, FGFPEHLLVD-FLQSLA, FAFPAHLLVDFLQALA, AAFPAHLLADFLQALA, SPQHLTTDRAQA, SPQHLTTDRAQALS, SPQHLTTDRAQSLS, GSPQHLTTDRAQAL, FGFPQHLTTDRAQSLS, FGFPQHLTTDWAQSLS, FGFPQHLTTDRLQSLS, FGFPQHLTTDWLQSLS, ATPSHLIIDRAQ, ATPSHLIIDRAQSLS, FGFPSHLIIDRAQSLS, FGFPSHLIIDWAQSLS,
·· • ««·· ·· ·· 99 • • · • • • • • • ♦ 9 • ·♦· • * 99 • • • • · • * « • • • # • · • · • • - 15 - FGFPSHLIIDWLQSLS, FGFPSHLIIDWSQSLS, FATPSHLIIDWLQSLS, FKPAHVSIDW-LQ, FKPAHVSIDWLQSLS, FGFPAHVSIDWLQSLS, AGFPAHVSIDWLQSLS, FAF— PAHVSIDWLQSLS, FGAPAHVSIDWLQSLS, FGFAAHVSIDWLQSLS, FGFPAHVSADWLQSLS, FGFPAHVSIDWLQALS, FGFPAHVS IDWLQSLA, FAF-PAH V SIDWLQALA, FGFAAHVS IDWLQSLS, FGFFAHVS IDWLQSLS, FGFPAHVSIRWL-QSLS, FGFPAHVSIEWLQSLS, FGFPAHVSIDWLNSLS, FGFPAHVSIDWLHSLS, AGFPAHVSIDWLQSLS, PGFPAHVSIDWLQSLS, WGFPAHVSIDWLQSLS, FAF-PAHVSIDWLQSLS, FSFPAHVSIDWLQSLS, FYFPAHVSIDWLQSLS, FDFPAHVSIDWLQSLS, FGAPAHVSIDWLQSLS, FGFPAHVSIDWLQLLS, FG FPAHVSIDWLQWLS, FGFPAHVSIDWLQNLS, FGFPAHVSIDWLQTLS, FGFPAHVSIDWLQYLS, FGFPAHVSIDWLQSIS, FGFPAHVSIDWLQSLT, FGFPAHVSIDWLQSLY, FAF-PAHVSIDWLQALA, FGFPAHVSIDRAQSLS, FGFPTHVSIDWLQSLS, FGFPFHVSIDWLQSLS, FGFPAHISIDWLQSLS, FGFPAHIIIDWLQSLS, FGFPAHLTTDWLQSLS, FG-FPAHVFIDWLQSLS, FGFPAHVYIDWLQSLS, FGFPAHVSLDWLQSLS, FGFPAHVSADWLQSLS, TPTHYYADFSQSLS, FGFPAHVSIDWSQSLS und FGFPAHVSIDFSQSLS.
Besonders bevorzugte Mimotope zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung sind SANPRDFLETLF, RMFPESFLDTLW, SFLDTLT, NFLKTLS, DFLRTLT, TFLSSLA, GFLDSLM, FGFPYHVQVDVLQSLS, FGFPSHLII-DRAQSLS, FKPAHVSIDWLQSLS, FGFPAHVSIDWLQSLS, FGFPQHLTTDRAQSLS, FGFPTHYYADFSQSLS, FGFPGHLIWDSLHSLS, FGFPYHHLVDQLHSLS, FGFPSHHL-QDSLQSLS, FGFPLHFRSDRIQSLS, FGFPKHLYADMSQSLS, FGFPAHLSRDLRQSLS und FGFPFHFAQDSWQSLS.
Besonders bevorzugte Mimotope der vorliegenden Erfindung sind FGFPSHLIIDWLQSLS, FGFPAHVFIDWLQSLS und FGFPAHVYIDWLQSLS.
Weiters bevorzugte Mimotope sind FGFPAHVWIDWLQSLS, FGFPAHVFI DWLQSLN, FGFPAHFSIDWLQSLS, FGFPAHVSFDWLQSLS, FGFPEHVFIDWLQSLS, DFGFPAHVFIDWLQSLS, FGFPQHLFTDWLQSLS und FGFPKHLLVDFLQSLS.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger gekoppelt, vorzugsweise mit KLH (Keyhole Limpet Hemocya-nin (Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin)), Tetanus-Toxoid, Albumin-bindendem Protein, Rinderserumalbumin, einem Dendrimer (MAP; Biol., Chem. 358: 581), Peptid-Linkern (oder flankierenden Regionen) sowie den Adjuvans-Substanzen, die in Singh et al.,
Nat. Biotech. 17(1999), 1075-1081 (insbesondere jenen in Tabelle 1 dieses Dokuments) und O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9) (2003), 727-735 geoffenbart sind (insbesondere die endogenen immunverstärkenden Verbindungen und Abgabesysteme, die darin beschrieben sind) oder Mischungen davon. Die Konjugations-Chemie (z.B. über heterobifunktionelle Verbindungen, wie GMBS,
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16 und natürlich auch andere, wie sie in „Bioconjugate Techniques", Greg T. Hermanson beschrieben sind) kann in diesem Zusammenhang aus dem Fachmann bekannten Reaktionen ausgewählt werden. Außerdem kann die Vakzin-Zusammensetzung mit einem Adjuvans, vorzugsweise einer wenig löslichen Aluminium-Zusammensetzung, insbesondere Aluminiumhydroxid, formuliert werden. Natürlich können auch Adjuvantien wie MF59 Aluminiumphosphat, Calciumphosphat, Cytokine (z.B. IL-2, IL-12, GM-CSF), Saponine (z.B. QS21), MDP-Derivate, CpG-Oligos, LPS, MPL, Polyphosphazene, Emulsionen (z.B. Freundsches Adjuvans, SAF), Liposome, Virosome, Iscome, Cochleate, PLG-Mikropartikel, Poloxamer-Partikel, Virus-artige Partikel, Hitze-instabiles Enterotoxin (LT), Cholera-Toxin (CT), mutierte Toxine (z.B. LTK63 und LTR72), Mikropartikel und/oder polymerisierte Liposome verwendet werden.
Die Verbindung der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise an den Träger oder das Adjuvans über einen Linker gebunden, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus NHS-poly (Ethylenoxid) (PEO) (z.B. NHS-PE04-Maleimid) .
Ein Vakzin, das die vorliegende Verbindung (Mimotop) und den pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist, kann auf jede geeignete Anwendungsweise, beispielsweise i.d., i.v., i.p., i.m., intranasal, oral, subkutan, usw. und mit jeder geeigneten Abgabevorrichtung verabreicht werden (O'Hagan et al., Nature Reviews, Drug Discovery 2 (9), (2003), 727-735). Die Verbindung der vorliegenden Erfindung ist vorzugsweise zur intravenösen, subkutanen, intradermalen oder intramuskulären Verabreichung formuliert (vgl. z.B. „Handbook of Pharmaceutical Manufacturing Formulations", Sarfaraz Niazi, CRC Press Inc, 2004).
Typischerweise enthält das Vakzin die erfindungsgemäße Verbindung in einer Menge von 0,1 ng bis 10 mg, vorzugsweise 10 ng bis 1 mg, insbesondere 100 ng bis 100 pg, oder alternativ z.B. 100 fmol bis 10 pmol, vorzugsweise 10 pmol bis 1 pmol, insbesondere 100 pmol bis 100 nmol. Typischerweise kann das Vakzin auch Hilfssubstanzen, z.B. Puffer, Stabilisatoren usw., enthalten.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Peptid, bestehend aus mindestens einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SYHATFL, TMAFPLN, HYHGAFL, EHHDIFL, SSLELFL, TGLSVFL, WMPSLFY, SMPWWFF, TMPLLFW, DTWPGLE, SMPPIFY, MPLWWWD, SMPNLFY, RMPPIFY, NPFEVFL, TLPNWFW, SMPLTFY, SFLDTLT, NFLKTLS, DFLRTLT, AFLDTLV, TFLSSLA, GFLDSLM, SPHPHFL,
NACHGEREICHT ·· « ··«« ·· ·· ·· ·«·# · · « · · · » · · · ··· · · t· • · · *··♦·#* • # · · ·· ·· · « · ·· #♦· ·· ·· «t ·· - 17 - NFMSIGL, SQFLASL, SNFLKTL, TGFLATL, WSWPGLN, IAWPGLD, SKFMDTL, SDFLRAL, SMPMVFY, YEWVGLM, KGFLDHL, SANPRDFLETLF, RMFPESFLDTLW, TIYDSFLDSLAS, HQSDDKMPWWFF, KPYLLKDFLEAL, AMGPYDALDLFL, TWNPIES-FLESL, YVWQDPSFTTFF, QYQTPLTFLEAL, RHISPATFLEAL, HTDSFLSTFYGD, YVWQDPSFTTFF, ADSTFTSFLQTL, GPVSIYADTDFL, DSNDTLTLAAFL, NG-SPALSHMLFL, TDYDPMWVFFGY, IFPLDSQWQTFW, NESMPDLFYQPS, DWGDKYFSS-FWN, VSAYNNV, WPLHLWQ, TPTHYYADFSQL, LPGHLIWDSLHY, LPQTHPLHLLED, IP YHHLVDQLHH, YPYHVQVDVLQN, IPSHHLQDSLQL, EYAHHTSLDLRQ, EPLH-FRSDRIQA, ATPSHLIIDRAQ, APKHLYADMSQA, FKPAHVSIDWLQ, MPAHLSRDLRQS, NPKHYSIDRHQA, SPQHLTTDRAQA, TPFHFAQDSWQW, TPTHYYADFSQLLS, TPTHYYADFSQSLS, GTPTHYYADFSQLL, GTPTHYYADFSQSL, FGTPTHYYADFSQSLS, FGFPTHYYADFSQSLS, LPGHLIWDSLHY, LPGHLIWDSLHYL, LPGHLIWDSLHYLS, LPGHLIWDSLHSL, LPGHLIWDSLHSLS, GLPGHLIWDSLHYL, GLPGHLIWDSLHSL, FGLPGHLIWDSLHSLS, FGFPGHLIWDSLHSLS, LPQTHPLHLLED, IP YHHLVDQLHH, IPYHHLVDQLHLS, IPYHHLVDQLHSLS, FGIPYHHLVDQLHHLS, FGFPYHHLVDQL-HSLS, YPYHVQVDVLQN, YPYHVQVDVLQNLS, YPYHVQVDVLQSLS, FGYPYHVQVD-VLQNLS, FGFPYHVQVDVLQSLS, IPSHHLQDSLQL, IPSHHLQDSLQLLS, IPSHHLQDSLQSLS, GIPSHHLQDSLQLL, FGIPSHHLQDSLQLLS, FGFPSHHLQD-SLQSLS, EYAHHTSLDLRQ, EPLHFRSDRIQA, EPLHFRSDRIQALS, EPLH-FRSDRIQSLS, GEPLHFRSDRIQAL, FGEPLHFRSDRIQALS, FGFPLHFRSDRIQSLS, APKHLYADMSQA, APKHLYADMSQALS, APKHLYADMSQSLS, GAPKHLYADMSQAL, FGFPKHLYADMSQSLS, MPAHLSRDLRQS, MPAHLSRDLRQSL, MPAHLSRDLRQSLS, GMPAHLSRDLRQSL, FGFPAHLSRDLRQSLS, NPKHYSIDRHQA, TPFHFAQDSWQW, TPFHFAQDSWQWLS, TPFHFAQDSWQSLS, GTPFHFAQDSWQWL, FGFPFHFAQDS-WQSLS, ACSFAYLYRC, ACFMGDKWVC, ACVLYPKAIC, ACYMGQQFVC, ACLTAYL-HWC, ACTLFPVAYC, ACWLFPYAHC, ACKSINMWLC, ACQTINRWLC, FGFPEHLLVDFLQSLS, FGFPEHLLVDFLQSLS, FPEHLLVDFLQSL, AGFPEHLLVDFL-QSLS, FAFPEHLLVDFLQSLS, FGAPEHLLVDFLQSLS, FGFAEHLLVDFLQSLS, FGFPAHLLVDFLQSLS, FGFPEALLVDFLQSLS, FGFPEHALVDFLQSLS, FGFPEHL-AVDFLQSLS, FGFPEHLLADFLQSLS, FGFPEHLLVAFLQSLS, FGFPEHLLVDALQSLS, FGFPEHLLVDFAQSLS, FGFPEHLLVDFLASLS, FGFPEHLLVDFLQALS, FGFPEHLL-VDFLQSAS, FG FPEHLLVDFLQSLA, FAFPAHLLVD FLQALA, AAFPAHLLADFLQALA, SPQHLTTDRAQA, SPQHLTTDRAQALS, SPQHLTTDRAQSLS, GSPQHLTTDRAQAL, FGFPQHLTTDRAQSLS, FGFPQHLTTDWAQSLS, FGFPQHLTTDRLQSLS, FGFP-QHLTTDWLQSLS, ATPSHLIIDRAQ, ATPSHLIIDRAQSLS, FGFPSHLIIDRAQSLS, FGFPSHLIIDWAQSLS, FGFPSHLIIDWLQSLS, FGFPSHLIIDWSQSLS, FATPSHLI-IDWLQSLS, FKPAHVS I DWLQ, FKPAHVS IDWLQSLS, FGFPAHVS IDWLQSLS, AGFP-AHVSIDWLQSLS, FAFPAHVSIDWLQSLS, FGAPAHVSIDWLQSLS, FGFAAHVS IDWLQSLS, FGFPAHVSADWLQSLS, FGFPAHVS IDWLQALS, FGFP-AHV SI DWLQ SLA, FAF PAHV SIDWLQALA, FGFAAHVS IDWLQSLS, FGFFAHVSIDWL-
NACHGEREICHT
··♦♦ ·· ♦· ·« • ♦ · · · # • ··· · ♦ ·» • · · · « 4 18 QSLS, FGFPAHVSIRWLQSLS, fgfpahvsiewlqsls, fgfpahvsidwlnsls, FGFPAHVSIDWLHSLS, AGFPAHVSIDWLQSLS, PGFPAHVSIDWLQSLS, WGFPAHVSIDWLQSLS, FAFPAHVSIDWLQSLS, FSFPAHVSIDWLQSLS, FYF-PAHVSIDWLQSLS, FDFPAHVSIDWLQSLS, FGAPAHVSIDWLQSLS, FGFPAHVSIDWL-QLLS, FGFPAHVSIDWLQWLS, FGFPAHVSIDWLQNLS, FGFPAHVSIDWLQTLS, FGFPAHVSIDWLQYLS, FGFPAHVSIDWLQSIS, FGFPAHVSIDWLQSLT, FGFPAHVS IDWLQSLY, FAFPAHVSIDWLQALA, FGFPAHVSIDRAQSLS, FGFPTHVSIDWLQSLS, FGFPFHVSIDWLQSLS, FGFPAHISIDWLQSLS, FGFPAHIIIDWLQSLS, FGFPAHLTTDWLQSLS, FGFPAHVFIDWLQSLS, FGFPAHVYIDWLQSLS, FGFP-AHVSLDWLQSLS, FGFPAHVSADWLQSLS, TPTHYYADFSQSLS, FGFPAHVWID-WLQSLS, FGFPAHVFIDWLQSLN, FGFPAHFSIDWLQSLS, FGFPAHVSFDWLQSLS, FGFPEHVFIDWLQSLS, DFGFPAHVFIDWLQSLS, FGFPQHLFTDWLQSLS, FGFP-KHLLVDFLQSLS, FGFPAHVSIDWSQSLS und FGFPAHVSIDFSQSLS.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung erwiesen sich als Mi-motope für CETP, und folglich konnten die Mimotope an Antikörper binden, die an das CETP-Fragment C-FGFPEHLLVDFLQSLS (16 C-termi-nale Aminosäuren des CETP-Proteins) binden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Peptid an einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, vorzugsweise KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) gekoppelt.
Noch ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Formulierung, die mindestens ein Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung aufweist.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können in einer pharmazeutischen Formulierung formuliert sein, die an ein Individumm verabreicht werden kann. Diese Formulierungen können beispielsweise zur Prävention und/oder Behandlung von Atherosklerose, Atherosklerose-Risiko-Erkrankungen und Atherosklerose-Spätfolgen verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung ist durch die folgenden Figuren und Beispiele näher veranschaulicht, ohne jedoch auf diese eingeschränkt zu sein.
Fig. 1 zeigt das Ergebnis eines repräsentativen Kompetiti-ons-ELISA nach Screenen der Phagen-Display-Bibliothek Ph.D.7 mit dem monoklonalen Antikörper „Paula".
Fig. 2a und 2b zeigen die Ergebnisse von 2 typischen Kompe-titions-ELISAs nach dem Screenen der Phagen-Display-Bibliothek Ph.D.12 mit dem monoklonalen Antikörper „Paula".
Fig. 3a und 3b zeigen die Ergebnisse von 2 repräsentativen Kompetitions-ELISAs nach dem Screenen der Phagen-Display-Biblio-
NACHGEREICHT 19 thek Ph.D.7 mit mAk Frida.
Fig. 4a zeigt das Ergebnis eines repräsentativen Kompetiti-ons-ELISA nach dem Screenen der Phagen-Display-Bibliothek Ph.D. 12 mit dem monoklonalen Antikörper „Frida".
Fig. 4b zeigt die Bindung des monoklonalen Antikörpers „Frida" an mit Mimotop-BSA beschichtete ELISA-Platten.
Fig. 5a und 5b zeigen die Ergebnisse eines repräsentativen Kompetitions-ELISA nach dem Screenen der Phagen-Display-Bibliothek Ph.D.12 mit dem monoklonalen Antikörper „Frida".
Fig. 6 zeigt die Ergebnisse eines Kompetitions-ELISA von zwei Mimotopen nach dem Screenen der Phagen-Display-Bibliothek Ph.D.12 mit dem monoklonalen Antikörper „Frida".
Fig. 7a bis 7d zeigen den Antikörper-Titer von in vivo-Ver-suchen.
Fig. 8a und 8b zeigen die Ergebnisse von zwei repräsentativen Kompetitions-ELISAs nach dem Screenen der Phagen-Display-Bibliothek Ph.D.7C7 mit dem monoklonalen Antikörper „Frida".
Fig. 9 zeigt einen in vitro-ELISA*-Test zur Detektion der Bindung zwischen „Frida" und zyklischen Mimotopen.
Fig. 10a und 10b zeigen die Ergebnisse eines Inhibitions-ELISA-Tests mit FGFPSHLIIDWLQSLS, FGFPAHVFIDWLQSLS und FGFPAHVY-IDWLQSLS.
Fig. 10a (Beschichtung ΙμΜ Peptid. Detektion algGl)
NACHGEREICHT
Frida 2,5 ng mAk Frida Pept.Nr. 2 pg 20 pg Peptid Peptid p4073 pl358 nur Puffer Original-Epitop irrelevantes Peptid C-FGFPEHLLVDFLQSLS irrelevantes Peptid ΤΪ55 5TSS 0,44 0,1 1,08 0,91 p4361 p4362 FGFPAHVFIdwlqsls fgfpahvyidwlqsls Frl2/3/84 ext2 VSlOVFI Frl2/3/84 ext2 VSI^VYI 0,82 0,16 0,75 0,15
Fig. 10b (Beschichtung ΙμΜ Peptid. Detektion algGl)
Frida 2,5 ng mAk Frida Pept. Nr. 2 pg 20 pg Peptid Peptid p4073 pl358 nur Puffer Original-Epitop irrelevantes Peptid C-FGFPEHLLVDFLQSLS irrelevantes Peptid 084 Ö7S 0,64 0,15 0,88 0,77 p4325 FGFPSHLIIDWLQSLS Frl2/3/55 ext2 RA^WL 0,42 0,1
Fig. 11 zeigt die in-vivo-Induktion von gegen CETP gerichte- 20 ten Antikörpern durch Mimotope der Erfindung, die an Mäuse verabreicht werden. Balb/c-Mäuse / 30 pg Peptid, 2 Injektionen in 2-wöchigen Intervallen. S3 = 2 Wochen nach der 3. Injektion.
Alum als Adjuvans. Titer gegen ursprüngliches Epitop (p4073) induziert durch Injektion von Mimotopen. Beschichtung der Vertiefungen: 50 μΐ von 1 pM p4073-BSA oder 1 pg/ml aktiviertes KLH. Detektion: algG (1:2000): injiziertes Original irrelevan-Peptid-BSA Epitop- tes Pep-
Gruppe 1 KLH KLH Gruppe 2 Original-Epitop p4073-KLH Gruppe 3 C-FGFPQHLTTDWLQSLS p4369-KLH Gruppe 4 C-FGFPSHLIIDWAQSLS p4324-KLH Gruppe 5 C-FGFPSHLIIDWLQSLS P4325-KLH Gruppe 6 C—FGFPSHLIIDWSQSLS p4366-KLH Gruppe 7 C-FATPSHLIIDWLQSLS p4345-KLH Gruppe 8 C-FAFPAHVSIDWLQALA P4328-KLH Gruppe 9 C-PGFPAHVSIDWLQSLS P4340-KLH Gruppe 10 C-WGFPAHVSIDWLQSLS p4341-KLH Gruppe 11 C-FSFPAHVSIDWLQSLS P4342-KLH Gruppe 12 C-FYFPAHVSIDWLQSLS P4343-KLH Gruppe 13 C-FDFPAHVSIDWLQSLS P4344-KLH Gruppe 14 C-FGFPAHVSIDWLQLLS P4347-KLH Gruppe 15 C-FGFPAHVSIDWLQYLS p4351-KLH Gruppe 16 C-FGFPAHVSIDWLQSIS p4352-KLH Gruppe 17 C-FGFPAHVSIDWLQSLT p4353-KLH Gruppe 18 C-FGFPAHISIDWLQSLS p4358-KLH Gruppe 19 C-FGFPAHIIIDWLQS LS p4359-KLH Gruppe 20 C-FGFPAHVFIDWLQSLS p4361-KLH BSA tid-BSA 2.040 400 8.600 10 14.000 12.900 10 12.570 7.600 10 2.930 1.820 10 4.700 3.600 10 8.380 1.270 10 10.100 2.740 400 18.100 15.640 10 10.350 5.500 10 4.620 1.610 10 5.580 2.900 10 12.200 3.580 10 12.000 9.160 10 2.950 2.400 10 19.680 12.070 10 11.200 8.650 10 16.500 12.940 10 8.540 5.340 10 17.940 9.530 10
Fig. 12a und 12b zeigen die in vivo-Induktion von CETP-spe-zifischen Antikörpern durch die Verabreichung der Mimotope der Erfindung. Titer zu p4073 und seine Korrelation zu Titern zu CETP von ausgewählten Gruppen (die hohe Titer gegen p4073 aufweisen) : Gr. 4, Gr. 9, Gr. 10, Gr. 14, Gr. 16-20 / Gr. 1 (KLH), Gr. 2 (ursprüngliches Epitop) als Kontrollen. Beschichtung der Vertiefungen: 50 pl von 1 pM Peptid-BSA oder CETP: GST-CETP 1:20/Detektion: algG (1:2000):
NACHGEREICHT 21 KLH p4073 p!358
Gr.l / KLH/Alum KLH 1,4 0,16 0,15 Gr. 2 / p4073-KLH/Alum Original-Epitop 1,33 0, 69 0,15 Gr. 3 / p4369-KLH/Alum C-FGFPQHLTTDWLQSLS 1,49 0,73 0,15 Gr. 4 / p4324-KLH/Alum C-FGFPSHLIIDWAQSLS 1,34 0,19 0,18 Gr. 9 / p4340-KLH/Aluin C-PGFPAHVSIDWLQSLS 1,46 0,78 0,14 Gr.10 / p4341-KLH/Alum C-WGFPAHVSIDWLQSLS 1,35 0,33 0,13 Gr.14 / p4347-KLH/Alum C-FGFPAHVSIDWLQLLS 1,45 0,2 0,13 Gr.16 / p4352-KLH/Alum C-FGFPAHVSIDWLQSIS 1,49 0,34 0,17 Gr.17 / p4353-KLH/Alum C-FGFPAHVSIDWLQSLT 1,42 1,42 0,13 Gr. 18 / p4358-KLH/Alum C-FGFPAHISIDWLQSLS 1,44 1,04 0,25 Gr.19 / p4359-KLH/Alum C-FGFPAHIIIDWLQSLS 1,48 0, 46 0,13 Gr. 20 / p4361-KLH/Aluxn C-FGFPAHVFIDWLQSLS 1,52 1,55 0,15 rekombinant. GST-CETP Ron troll GST allein Kanin- chen- CETP Kanin chen- Serum Gr.l / KLH/Alum KLH 0,35 0,13 0,19 0,12 Gr.2 / p4073-KLH/Alum Original-Epitop 1,49 0,22 1,25 0,15 Gr. 3 / p 4 3 6 9-KLH/Alum C-FGFPQHLTTDWLQSLS 0,45 0,12 0,21 0,11 Gr. 4 / p4324-KLH/Alum C-FGFPSHLIIDWAQSLS 0,58 0,14 0,28 0,42 Gr. 9 / p4340-KLH/Alum C-PGFPAHVSIDWLQSLS 0,49 0,13 0,21 0,09 Gr. 10 / p4341-KLH/Alum C-WGFPAHVSIDWLQSLS 0,39 0,12 0,18 0,1 Gr. 14 / p4347-KLH/Alum C-FGFPAHVSIDWLQLLS 0,35 0,14 0,2 0,11 Gr.16 / p4352-KLH/Alum C-FGFPAHVSIDWLQSIS 0,48 0,14 0,28 0,11 Gr. 17 / p4353-KLH/Alum C-FGFPAHVSIDWLQSLT 0,57 0,14 0,39 0,14 Gr. 18 / p4358-KLH/Alum C-FGFPAHISIDWLQSLS 0,68 0,2 0,58 0,1 Gr.19 / p4359-KLH/Alum C-FGFPAHIIIDWLQSLS 0,79 0,12 0,54 0,1 Gr.20 / p4361-KLH/Alum C-FGFPAHVFIDWLQSLS 1,64 0,12 1,51 0,26
Titer zu p4073 und ihre Korrelation zu Titern zu CETP. Die ausgewählten Gruppen weisen relativ hohe Titer gegen das ursprüngliche Peptid p4073 auf. Gr.l (KLH) und Gr.2 (Original-Peptid) als Kontrollen. Beschichtung der Vertiefungen: 50 μΐ der Kontrollen oder von CETP: GST-CETP 1:100 / Kaninchen CETP 1:100 / Detektion: algG (1:2000):
NACHGEREICHT - 22 • · · · · · • · • · · ·
Kontroll recombinant GST GST-CETP alleine
Gr. 1 / KLH/Älum KLH 0,18 0,13 Gr.2 / p4073-KLH/Alum Original-Epitop 1,26 0,43 Gr.5 / p4325-KLH/Alum C-FGFPSHLIIDWLQSLS 0,59 0,14 Gr. 6 / p4366-KLH/Alum C-FGFPSHLIIDWSQSLS 0,4 0,16 Gr.7 / p4345-KLH/Alum C-FATPSHLIIDWLQSLS 0,39 0,17 Gr. 8 / p4328-KLH/Alum C-FAFPAHVSIDWLQALA 0,45 0,15 Gr. 11 / p4342-KLH/Alum C-FSFPAHVSIDWLQSLS 0,38 0,17 Gr. 12 / p4343-KLH/Alum C-FYFPAHVSIDWLQSLS 0,61 0,14 Gr. 13 / p4344-KLH/Alum C-FDFPAHVSIDWLQSLS 0,35 0,14 Gr. 15 / p4351-KLH/Alum C-FGFPAHVSIDWLQYLS 0,54 0,45
Kanin-
Kaninchen- chen- CETP Serum
Gr.l / KLH/Alum KLH 0,47 0,16 Gr.2 / p4073-KLH/Alum Orginal-Epitop 1,42 0,25 Gr.5 / p4325-KLH/Alum C-FGFPSHLIIDWLQSLS 0,85 0,18 Gr.6 / p4366-KLH/Alum C-FGFPSHLIIDWSQSLS 0, 65 0,14 Gr.7 / p4345-KLH/Alum C-FATPSHLIIDWLQSLS 0,46 0,16 Gr.8 / p4328-KLH/Alum C-FAFPAHVSIDWLQALA 0,43 0,14 Gr.11 / p4342-KLH/Alum C-FSFPAHVSIDWLQSLS 0,41 0,12 Gr.12 / p4343-KLH/Alum C-FYFPAHVSIDWLQSLS 1,05 0,15 Gr.13 / p4344-KLH/Alum C-FDFPAHVSIDWLQSLS 0,43 0,15 Gr.15 / p4351-KLH/Alum C-FGFPAHVSIDWLQYLS 0,59 0,21
Titer zu p4073 und ihre Korrelation zu Titern zu CETP. Beschichtung der Vertiefungen: 50 μΐ von CETP: GST-CETP (03.05.2007/GW) 1:100 / GST 1:3000 / Kaninchen-CETP (07.12.2006/GW) 1:20 / Kaninchen-Serum 1:20 Detektion: algG (1:2000): rekom-
NACHGEREICHT binant. Kontroll Kanin- Kanin-GST- gst chen- chen-CETP alleine CETP Serum
Gr.l / KLH/Alum KLH 0,23 0, 16 0, 17 0, 12 gr .2 / p407 3-KLH/Alum Original-Epitop 1,08 0,13 0,46 0, 11 Gr. 3 / p4335-KLH/Alum C-FGFAAHVSIDWLQS LS 0,26 0, 15 0,14 0,1 Gr. 4 / p4348-KLH/Alum C-FGFPAHVSIDWLQWLS 0,33 0,15 0,16 0, 11 Gr. 5 / p4360-KLH/Alum C-FGFPAHLTTDWLQSLS 0,4 0,25 0,23 0, 11 Gr. 6 / p4362-KLH/Alum C-FGFPAHVYIDWLQSLS 0,86 0,14 0,94 0,13 Gr. 7 / p4354-KLH/Alum C-FGFPAHVSIDWLQS LY 0,29 0,19 0,23 0,15 Gr. 8 / p4337-KLH/Alum C-FGFPAHVSIRWLQSLS 0,24 0,12 0,14 0, 12 23
Fig. 13 zeigt die in vivo-Induktion von auf CETP gerichteten Antikörpern durch Mimotope der Erfindung, die Mäusen verabreicht werden.
Fig. 14 zeigt einen CETP-Aktivitäts-Test, wobei 0,6 μΐ Humanserum (mit endogener CETP-Aktivität) mit Serum von Wildtyp-Mäusen (keine CETP-Aktivität enthaltend), die mit KLH/Alum (negative Kontroll-Gruppe), p4703-KLH/Alum (ursprüngliches CETP-Epitop) bzw. p4361 (oder p4362 oder p4325)-Mimotop geimpft waren. Es konnte nachgewiesen werden, dass die Zugabe von 1,2 μΐ und 0,6 μΐ Serum von mit p4361-KLH/Alum geimpften Mäusen die CETP-Aktivität vollständig inhibiert und die Zugabe von 0,2 μΐ Serum diese Aktivität signifikant reduziert im Gegensatz zur Zugabe von Serum von Mäusen, die nur mit KLH/Alum-Kontrolle oder mit dem ursprünglichen Epitop (p4073-KLH/Alum) geimpft waren.
Fig. 15 zeigt, dass die Zugabe von p4325-KLH/Alum zu Humanserum die CETP-Aktivität signifikant inhibiert.
Fig. 16 zeigt, dass die Zugabe von p4361-KLH/Alum zu Humanserum die CETP-Aktivität signifikant inhibiert.
Fig. 17 zeigt, dass die Zugabe von p4362-KLH/Alum zu Humanserum die CETP-Aktivität signifikant inhibiert.
BEISPIELE
Es besteht ein starkes umgekehrtes Verhältnis zwischen der Plasma-Konzentration von Cholesterin bei Lipoproteinen mit hoher Dichte (HDLs) und dem Entstehen der koronaren Herzkrankheit (KHK). So ist das Risiko für KHK höher, wenn die HDLs abnehmen. Obwohl 33% der Patienten mit KHK niedrige Plasma-Spiegel von HDLs aufweisen, gibt es derzeit keine wirksame Therapie zur Steigerung der Plasma-Konzentration der HDLs. Diät und moderate Bewegung sind ineffektiv, Statine erreichen nur eine 5 bis 7% Steigerung des HDL, und Niacin hat Nebenwirkungen und Compliance-Profile, die seine Verwendung einschränken.
Die Inhibierung der CETP-Aktivität wurde als therapeutischer Ansatz zur Steigerung der Plasma-HDL-Spiegel vorgeschlagen. CETP ist ein Plasma-Glykoprotein, das den Transfer von neutralen Lipiden und von Phosphölipiden zwischen Lipoproteinen erleichtert und die Konzentration des Plasma-HDL- reguliert. Es wird aus mehreren Gründen erwartet, dass die Inhibierung der CETP-Aktivität die Plasma-HDL-Konzentrationen erhöht. CETP senkt die HDL-Konzentra-tionen, indem es Cholesteryl-Ester von HDLs zu VLDLs und LDLs
NACHGEREICHT 24 bewegt. Eine vorübergehende Inhibierung von CETP bei Kaninchen und Hamstern durch monoklonale Antikörper, kleine Moleküle (Si-korski, J.A., J. Med. Chem. 49 (1) (2006): 1-22) oder Antisense-Oligonukleotide bewirkt eine HDL-Steigerung. Eine Langzeit-CETP-Inhibierung mit Antisense-Nukleotiden erhöhte das Plasma-HDL und verringerte die atherosklerotischen Läsionen in einem Kaninchen-Modell der Atherosklerose. CETP-transgene Mäuse und Ratten weisen ein verringertes Plasma-HDL auf. Menschen mit verringerter CETP-Aktivität haben erhöhtes Plasma-HDL. Kürzlich wurde ein Vakzin-Ansatz vorgeschlagen. Kaninchen wurden mit einem von humanem CETP stammenden Peptid immunisiert, das eine Region von CETP enthielt, die für die Funktion des Transfers von neutralem Lipid von wesentlicher Bedeutung ist. Geimpfte Kaninchen wiesen eine verringerte CETP-Aktivität und ein verändertes Lipoprotein-Profil mit niedrigerer LDL- und höherer HDL-Konzentration auf. Weiters zeigte es sich, dass mit CETP geimpfte Kaninchen kleinere atherosklerotische Läsionen hatten als Kontroll-Tiere.
Das Problem des oben angesprochenen anti-CETP-Vakzin-Ansat-zes ist, dass die Vakzin-Formulierung ein Selbst-Peptid aufweist und daher die natürliche Toleranz gegen Selbst-Antigene brechen muss. Die Erfindung beschreibt ein CETP-Mimotop, das zur Impfung verwendet werden kann: Das Mimotop soll die Produktion von Antikörpern gegen CETP induzieren. Das CETP-Mimotop hat keine Selbst-Sequenz und muss daher keine Toleranz brechen. Somit wird die Induktion einer anti-CETP-Antikörper-Antwort stark erleichtert. Das Mimotop wird mit einem monoklonalen Antikörper (mAk) und (im Handel erhältlichen) Peptid-Bibliotheken identifiziert. Ein monoklonaler Anti-CETP-Antikörper wird verwendet, der die CETP-Aktivität neutralisiert. Dieser mAk detektiert eine Sequenz innerhalb der C-terminalen 26 Aminosäuren von CETP, die für eine neutrale j Lipid-Transfer-Aktivität nötig ist.
Beispiel 1: Erzeugung von monoklonalen Antikörpern zur Verwendung für das Screenen von Phagen-Display-Bibliotheken A.) 2 Antikörper, die aus „Fusion F" stammen:
Balb/c-Mäuse wurden mit dem Original-CETP-Epitop C-FG-FPEHLLVDFLQSLS (16 C-terminale Aminosäuren des CETP-Proteins), gekoppelt an KLH und Alum als Adjuvans, immunisiert. 2 Hybridom-Klone (beide IgGl) wurden gereinigt und zum Screenen verwendet: F5AF9G4 („Paula") und F6F11D1 („Felix").
NACHGEREICHT 25
Diese zwei monoklonalen Antikörper erkennen das injizierte Epitop sowie CETP-Protein in ELISA. Sie können auch im Western Blot verwendet werden, um CETP-Protein nachzuweisen (rekombinan-tes, in Bakterien exprimiertes Protein sowie aus Kaninchen-Serum isoliertes Protein). Beide Antikörper hemmen nicht die CETP-En-zym-Aktivität (getestet mit dem Roar CETP Activity Assay Kit, vgl. z.B. US 5,585,235; US 5,618,683; US 5,770,355). B.) 2 Antikörper, die aus „Fusion I" stammen:
Balb/c-Mäuse wurden mit Original-CETP-Epitop C-FG-FPEHLLVD-FLQSLS (16 C-terminale Aminosäuren des CETP-Proteins), gekoppelt an KLH,und Alum als Adjuvans, immunisiert. 2 Hybridom-Klone (beide IgGl) wurden gereinigt und zum Screenen verwendet: I2G6H5 („Frida") und I2G6H7 („James")
Diese zwei monoklonalen Antikörper erkennen das injizierte Epitop sowie das CETP-Protein in ELISA. Sie können auch im Western Blot verwendet werden, um CETP-Protein nachzuweisen (rekom-binantes, in Bakterien exprimiertes Protein sowie aus Kaninchen-Serum isoliertes Protein). Im Gegensatz zu den aus „Fusion F" (vgl. A) stammenden Antikörpern, hemmen beide Antikörper, „Frida" und „James", die CETP-Enzym-Aktivität (getestet mit dem Roar CETP Activity Assay Kit).
Beispiel 2: Phagen-Display, in-vitro-Inh±bitions-ELISA und in vivo-Testen von Mimotopen
Die in diesem Beispiel verwendeten Phagen-Display-Bibliothe-ken waren:
Ph.D.7: New England BioLabs E8102L (lineare 7mer-Bibliothek)
Ph.D. C7C: New England BioLabs E8121L (7mer-Bibliothek, zy- klisierte Peptide)
Ph.D.12: New England BioLabs E8111L (lineare 12mer-Biblio- thek)
Phagen-Display erfolgte gemäß dem Protokoll des Herstellers (www.neb.com).
Nach 2 oder 3 nachfolgenden „Panning"-Runden wurden einzelne Phagen-Klone herausgenommen, und die Phagen-Überstände wurden ELISA auf Platten, die mit Antikörper beschichtet waren, der für den Schwenkvorgang verwendet wurde, unterzogen. Phagen-Klone, die in diesem ELISA positiv waren (starkes Signal für das Ziel, aber kein Signal für unspezifische Kontrolle) wurden sequenziert. Aus DNA-Sequenzen wurden Peptid-Sequenzen abgeleitet. Diese Peptide wurden synthetisiert und im Inhibitions-ELISA charakterisiert.
NACHGEREICHT 1. In vitro-Inhibitions-Assay (ELISA)
Verschiedene Mengen der Peptide (2 und 20 pg, wie in den entsprechenden Figuren angegeben), die vom Phagen-Display stammten, wurden mit dem für den Screening-Prozess verwendeten monoklonalen Antikörper inkubiert. Peptide, die die nachfolgende Bindung des Antikörpers an das Original-CETP-Epitop verringerten (C-terminale 16 Aminosäuren des CETP-Proteins) , das auf ELISA-Platten beschichtet war, wurden als inhibierend angesehen. 2. In vivo-Testen von Mimotopen
Inhibierende sowie einige nicht-inhibierende Peptide wurden an KLH gekoppelt und Mäusen (Wildtyp- oder CETP-transgene Mäuse; subkutan in die Flanke oder intradermal in die Ohren) oder Kaninchen (subkutan in die Flanke) zusammen mit einem geeigneten Adjuvans (Aluminiumhydroxid und Gerbu 100 für Mäuse und Aluminiumhydroxid oder CFA/IFA für Kaninchen) injiziert.
Die Titer zu injizierten Peptiden sowie zum Original-CETP-Epitop wurden bestimmt. Außerdem wurde für ausgewählte Seren auch die Immunantwort auf das CETP-Protein gemessen. 3. Ergebnisse 3.1. Screenen mit 2 aus „Fusion F" stammenden Antikörpern: „Paula" und „Felix" 3.1.1. Phagen-Disolav-Bibliothek Ph.D.7 3.1.1.1. Screenen mit dem monoklonalen Antikörper „Paula" 17 Sequenzen wurden bei diesem Screening identifiziert: P2_8 P2_9 P2_ll P2_12 P2_15 P2_16 P3 2
SYHATFL TMAFPLN
HYHGAFL EHHDIFL
SSLELFL P3 6, 14, 28 P3_9 P3_13 P3_16 P3_17 P3_18 P3_19 P3 21
TGLSVFL WMPSLFY SMPWWFF TMPLLFW
DTWPGLE
SMPPIFY
MPLWWWD
SMPNLFY
RMPPIFY
NPFEVFL
NACHGEREICHT - 27 - - 27 - P3_25 P3 26
TLPNWFW
SMPLTFY
Das Ergebnis eines repräsentativen Kompetitions-ELISA ist in Fig. 1 gezeigt. 3.1.1.2. Screening mit dem monoklonalen Antikörper „Felix" 6 Sequenzen wurden identifiziert, die die Bindung des monoklonalen Antikörpers „Felix" in in vitro-Kompetitionsversuchen inhibieren:
F2-9 C SFLDTLT F3-6 C NFLKTLS F3-18 C DFLRTLT F3-23 C AFLDTLV F3-34 C TFLSSLA F3-38 C GFLDSLM
Zusätzliche 12 Sequenzen wurden identifiziert, die die Bindung des monoklonalen Antikörpers „Felix" in in vitro-Kompetiti-onsversuchen nicht inhibieren:
F2-2+5 SPHPHFL F2-6 NFMSIGL F2-16/F3-30 SQFLASL F2-29 SNFLKTL F3-l-_ TGFLATL F3-ll-_ WSWPGLN F3-17- IAWPGLD F3-32- SKFMDTL F3-41- SDFLRAL F3-44-_ SMPMVFY F3-49- YEWVGLM F3-64- KGFLDHL
Alle Mimotope, die die Bindung des monoklonalen Antikörpers „Felix" in vitro binden, wurden an KLH gekoppelt und subkutan (in die Flanke, s.c.) oder intradermal (i.d.) in Wildtyp-Mäuse (Mäuse haben kein CETP-Protein), CETP-tg-Mäuse bzw. Kaninchen injiziert und induzierten eine Immunantwort auf das injizierte Peptid mit allen Adjuvantien, die getestet wurden (Alum und CFA („complete
NACHGEREICHT
Freund's adjuvant", komplettes Freundsches Adjuvans); Gerbu). Für alle oben angeführten in vitro-inhibierenden Mimotope konnten bei Mäusen und Kaninchen Antikörper entdeckt werden, die auf das Original-CETP-Epitop reagierten. Für 5 von 6 Mimotopen (siehe unten und Tabelle 1) konnten Antikörper, die mit gereinigtem humanem CETP und mit rekombinant exprimiertem humanem CETP reagierten, in ELISAs aus Kaninchen-Seren nachgewiesen werden:
F2-9 C SFLDTLT F3-6 C NFLKTLS F3-18 C DFLRTLT F3-34 C TFLSSLA F3-38 C GFLDSLM
Subkutane Injektionen in die Flanke wurden in Woche 1, Woche 3 und Woche 7 mit 30 pg Peptid-KLH pro Maus gegeben. Intradermale Injektionen ins Ohr wurden in Woche 1, Woche 3 und Woche 6 mit 10 pg Peptid-KLH pro Maus gegeben. Seren wurden 2 Wochen nach der 3. Injektion genommen. Vakzin-Formulierung mit Alum (immer 1 mg pro Maus): bis zu 250 pl, injiziert in eine Flanke.
Die Alum-Formulierung mit 1 ml pro Maus (500 pl in jede Flanke) war in lx PBS als Puffer.
Die Vakzin-Formulierung mit Gerbu Adjuvans 100 (Gerbu Kat. Nr. 3100; immer 50 pl Adjuvans pro Maus): 200 pl, 100 pl, injiziert in jede Flanke, umfassend lx HEPES als Puffer.
Tabelle 1: Ergebnisse der Titer-Bestimmung
NACHGEREICHT
Adjuvans KLH inji- P4073 p irre- ziertes (FGFPEHLLVD levant Mimotop FLQSLS) Alum s.q. (30 KLH 1:20.000 n.a. 1:400 kein Ti- pg Peptid) ter p4073-KLH CFGFPEHLLVD- 1:70.000 n.a. 1:20.000 kein Ti- FLQSLS ter p4223-KLH F2-9; C- 1:15.000 1:15.000 1:6.400 kein Ti- SFLDTLT ter - 29 - * · ί • ··* t
Adjuvans KLH inji ziertes Mimotop P4073 (FGFPEHLLVD FLQSLS) p irrelevant p4181-KLH F3-6 C-NFLKTLS 1:8.000 1:6.400 1:800 kein Titer p4184-KLH F3-18 C-DFLRTLT 1:5.000 1:10.000 1:3.000 1:2.500 p4187 F3-34 C-TFLSSLA 1:3.200 1:9.000 1:4.000 kein Titer p4188-KLH F3-38 C-GFLDSLM 1:10.000 1:9.000 1.5.000 kein Titer p4227-KLH P12-19; C-SANPRDFLETLF 1:12.800 1:10.000 1:5.000 kein Titer p4228-KLH P12-21; C-RMFPESFLDTLW 1:10.000 1:4.000 1:1.000 1:400 KLH/Gerbu s.c. (30 pg Peptid) KLH 1:70.000 n.a. 1:6.000 1:800 p4073-KLH CFGFPEHLLVD- FLQSLS 1:25.000 n.a. 1:15.000 1:200 p4223-KLH F2-9; C-SFLDTLT 1:40.000 1:25.000 1:50.000 1:1.000 p4181-KLH F3-6 C-NFLKTLS 1:20.000 1.20.000 1:8.000 1:400 p4184-KLH F3-18 C-DFLRTLT 1:27.000 1.35.000 1:15.000 1:6.000 p4187-KLH F3-34 C- 1.20.000 1.20.000 1:15.000 kein Titer Tt LSSLÄ p4188-KLH F3-38 C-GFLDSLM 1:40.000 1:35.000 1:35.000 1:400 p4227-KLH P12-19; C-SANPRDFLETLF 1.20.000 1:30.000 1.3.000 1:400 P4228-KLH P12-21; C-RMFPESFLDTLW 1:27.000 1:8.000 1:5.000 kein Titer
NACHGEREICHT
I
»*»t ·# I • · *
• ·*· V • · · · - 30 -
Adjuvans KLH inji ziertes Mimotop P4073 (FGFPEHLLVD FLQSLS) p irrelevant p4073-KLH CFGFPEHLLVD- FLQSLS 1:10.000 1:10.000 kein Titer KLH/Alum i.d. (10 pg Peptid) KLH 1:12.800 n. a. kein Titer kein Titer p4073-KLH CFGFPEHLLVD- FLQSLS 1:10.000 n.a. 1:3.200 kein Titer p4223-KLH F2-9; C-SFLDTLT 1:6.400 1:3.200 p4181-KLH F3-6 C-NFLKTLS 1:10.000 1:1.500 1:600 kein Titer p4184-KLH F3-18 C-DFLRTLT 1:15.000 1:5.000 1:1.500 kein Titer p4187-KLH F3-34 C-TFLSSLA 1:50.000 1:6.400 1:3.200 1:500 p4188-KLH F3-38 C-GFLDSLM 1:12.000 1:5.000 1:2.000 kein Titer p4227-KLH P12-19; C-SANPRDFLETLF 1:6.400 1:6.400 kein Titer kein Titer p4228-KLH P12-21; C-RMFPES FLDTLW 1:20.000 1:2.000 1:1.600 kein Titer p4298-KLH Frl2/3/84ex-t2; CFGFPAH-VSIDWLQSLS 1:25.000 1:3.200 1:1.600 kein Titer 3.1.2. Phaaen-Disolay-Bibliothek Ph.D.12 3.1.2.1. Screening mit dem monoklonalen Antikörper „Paula" Von 20 Aminosäuresequenzen, die aus diesem Screening erhalten wurden, waren 3 in in vitro-Inhibitionsversuchen inhibierend:
P12-19 SAN PRDFLETL F
P12-21 RMFPESFLDTLW
P12-37 TIYDSFLDSLAS
NACHGEREICHT
I ·» ♦ ···· «· *· ·· • · ·· · · # · * * · · ·»· 9 9 ·· • * ·····« - 31 -
Nicht-inhibierende Peptide waren: P12-5/44/46/49 P12-9 P12-24/43-_ P12-25 P12-28+42 P12-30 P12-35- P12-39- P12-42- P12-45- P12-50-_ P12-51- P12-52-_ P12-53- P12-56- P12-58- P12-61-
HQSDDKMPWWFF
KPYLLKDFLEAL
AMGPYDALDLFL
TWNPIESFLESL
YVWQDPSFTTFF
QYQTPLTFLEAL
RHISPATFLEAL
HTDSFLSTFYGD
YVWQDPSFTTFF
ADSTFTSFLQTL
GPVSIYADTDFL
DSNDTLTLAAFL
NGSPALSHMLFL
TDYDPMWVFFGY
IFPLDSQWQTFW
NESMPDLFYQPS
DWGDKYFSSFWN
Die Ergebnisse von 2 typischen Kompetitions-ELISAs sind in den Fig. 2a und 2b gezeigt.
Alle 3 Mimotope wurden an KLH gekoppelt und Wildtyp-Mäusen (Mäuse haben kein CETP-Protein), CETP-tg-Mäusen bzw. Kaninchen injiziert, und induzierten eine Immunantwort auf das injizierte Peptid mit allen getesteten Adjuvanzien (Alum und CFA; Gerbu).
Mimotop P12-19; C-SANPRDFLETLF und P12-21; C-RMFPESFLDTLW induzierten eine Immunantwort auf das Original-CETP-Epitop bei Wildtyp-Mäusen und bei Kaninchen.
Dagegen induzierte Mimotop P12-37 C-TIYDSFLDSLAS keine Antikörper-Antwort auf das Original-Epitop. 3.2. Screening mit 2 aus „Fusion I" stammenden Antikörpern: „Frida" und „James" 3.2.1. Phagen-Display-Bibliothek Ph.D.7 3.2.1.1. Screenen mit den monoklonalen Antikörpern „Frida" und „James"
Zwei verschiedene Peptid-Sequenzen wurden in diesen Screens identifiziert, 11 von 12 Klonen, die sequenziert wurden, hatten identische Sequenzen. Diese Peptide sind in in vitro-Kompetiti-onsversuchen nicht inhibierend.
NAQHGEREICHT ι : - 32 • · » · » · • ··· · · ··:: :: :ι ι
Έτΐ-2-2 Fr7-2B-65 Fr7-3-7 Fr7-3-13 Fr7-3-26 Fr7-3-32 Ja7-2-22 Ja7-3-28 Ja7-3-41 Ja7-3-52 Ja7-3-56 VSAYNNV Ja7-3-89 WPLHLWQ
Die Ergebnisse von 2 repräsentativen Kompetitions-ELISAs mit mAk „Frida" sind in den Fig. 3a und 3b gezeigt. Dasselbe Muster war bei mAk „James" zu sehen. 3.2.2. Phaaen-Disolav-Bibliothek Ph.D.12 3.2.2.1. Screenen mit dem monoklonalen Antikörper „Frida"
Frl2/2/6 TPTHYYADFSQL Frl2/2/ll LPGHLIWDSLHY Frl2/2/27 LPQTHPLHLLED Frl2/3/l Frl2/3/19 Frl2/3/88 IPYHHLVDQLHH Frl2/3/26 Frl2/3/65 YPYHVQVDVLQN Frl2/3/68 IPSHHLQDSLQL Frl2/3/12 EYAHHTSLDLRQ Frl2/3/83 EPLHFRSDRIQA Frl2/3/55 ATPSHLIIDRAQ Frl2/3/63 APKHLYADMSQA Frl2/3/84 FKPAHVSIDWLQ Frl2/3/47 MPAHLSRDLRQS Frl2/3/80 NPKHYSIDRHQA
NACHGEREICHT ft • ft··· ft t ftft • ft « ft· • • · ft ft • ft • • ·· ft · ft« • • ft • · · · • 33
Frl2/3/40 S PQHLTT DRAQA
Fr12/3/35 TPFHFAQDSWQW
Keine der in diesem Screen identifizierten 15 Aminosäuresequenzen war bei in vitro-Kompetitionsversuchen inhibierend. Die Sequenzanalyse offenbarte jedoch für viele der Mimotope eine ziemlich hohe Homologie mit der ursprünglichen Proteinsequenz. Anderseits konnte bei einigen Peptiden die Bindung des monoklonalen Antikörpers „Frida" an mit Mimotop-BSA beschichtete ELISA-Platten gezeigt werden (vgl. Fig. 4a und 4b).
Dies zeigt, dass die Bindung von monoklonalem Antikörper an immobilisierte Mimotope nicht unbedingt die Vorhersage einer Inhibierung in einem in vitro-Kompetitions-ELISA ermöglicht.
In vi tro-Inhibitionsversuche mit Variationen der Original-Sequenz FGFPEHLLVDFLQSLS (16 C-terminale AS des CETP-Proteins) zeigten, das das Entfernen von mehr als 2 Aminosäuren vom N-Ter-minus oder von mehr als 1 Aminosäure vom C-Terminus die Inhibierung beseitigt (für die monoklonalen Antikörper „Frida" und „James". „Paula" und „Felix" erkennen einen anderen Teil der Original-Sequenz).
Außerdem führt das gleichzeitige Entfernen von 2 Aminosäuren vom N-Terminus und 1 Aminosäure vom C-Terminus auch zu einem Peptid, das in vitro nicht mehr inhibiert. C-FGFPEHLLVDFLQSLS "ursprüngliche" Sequenz (Peptid stammt von CETP)/ inhibierend in vitro C- GFPEHLLVDFLQSLS Sequenz N-l / inhibierend in vitro C- FPEHLLVDFLQSLS Sequenz N-2 / inhibierend in vitro C- PEHLLVDFLQSLS Sequenz N-3 / letztendlich geringfügig inhibierend in vitro C-FGFPEHLLVDFLQSL Sequenz C-l / inhibierend in vitro C-FGFPEHLLVDFLQS Sequenz C-2 / nicht inhibierend in vitro C- FPEHLLVDFLQSL Sequenz N-2 und C-l / nicht inhibierend in vitrol
"Original" FGFPEHLLVDFLQSLS Frl2/2/6 TPTHYYADFSQL
Frl2/2/ll LPGHLIWDSLHY -
NACHGEREICHT 4 4444 94 99 94 ♦ · 44 4 9 4 4 4 4 • 4 4 4 444 4 4 44 • 4 4 9 m 9 4
Frl2/2/27 LPQTHPLHLLED Frl2/3/l IPYHHLVDQLHH Frl2/3/19 IPYHHLVDQLHH Frl2/3/88 IPYHHLVDQLHH Frl2/3/26 YPYHVQVDVLQN Frl2/3/65 Y PYHVQVDVLQN Frl2/3/68 IPSHHLQDSLQL Frl2/3/12 EYAHHTSLDLRQ Frl2/3/83 EPLHFRSDRIQA Frl2/3/55 ATPSHLIIDRAQ Frl2/3/63 APKHLYADMSQA Frl2/3/84 FKPAHVSIDWLQ Frl2/3/47 MPAHLSRDLRQS Frl2/3/80 NPKHYSIDRHQA Frl2/3/40 S PQHLTT DRAQA Frl2/3/35 TPFHFAQDSWQW
Folglich wurden bei Verwendung der Original-CETP-Sequenz als Matrize Peptid-Sequenzen, die bei dieser Phagen-Display-Vorge-hensweise erhalten wurden, am N-Terminus und/oder am C-Terminus verlängert, um zu überprüfen, ob eine in vitro-Inhibierung mit längeren Peptiden möglich ist. 3.2.2.2. Mimotope Frida Ph.D.12 und Varianten davon:
Frl2/2/6 Frl2/2/6 Extl Frl2/2/6 Ext2 Frl2/2/6 Ext3 Frl2/2/6 Ext4 Frl2/2/6 Ext5 Frl2/2/6 Ext6
Frl2/2/ll Frl2/2/ll Extl Frl2/2/ll Ext2 Frl2/2/ll Ext3 Frl2/2/ll Ext4 Frl2/2/ll Ext5
T PTHYYADFSQL TPTHYYADFSQLLS TPTHYYADFSQSLS GTPTHYYADFSQLL GT PTHYYADFSQSL FGTPTHYYADFSQSLS FGFPTHYYADFSQSLS
LPGHLIWDSLHY
LPGHLIWDSLHYL
LPGHLIWDSLHYLS
LPGHLIWDSLHSL
LPGHLIWDSLHSLS
GLPGHLIWDSLHYL
NACHGEREICHT ·· ♦ ·*·· «· ·· ·» • · ·· * t · · · · J# * · ··♦ · « ·♦ • · ♦···♦· f - 35 -
Frl2/2/ll Ext5 Frl2/2/ll Ext6 Frl2/2/ll Ext7
GLPGHLIWDSLHSL
FGLPGHLIWDSLHSLS
FGFPGHLIWDSLHSLS
Frl2/2/27
LPQTHPLHLLED
Frl2/3/l/19/88 Extl Frl2/3/l/19/88 Ext2 Frl2/3/l/19/88 Ext3 Frl2/3/l/19/88 Ext4
IPYHHLVDQLHLS IPYHHLVDQLHSLS FGIPYHHLVDQLHHLS FGFPYHHLVDQLHSLS
Frl2/3/26/65Extl Fr12/3/26/65Ext2 Frl2/3/26/65Ext3 Frl2/3/26/65Ext4
YPYHVQVDVLQNLS
YPYHVQVDVLQSLS
FGYPYHVQVDVLQNLS
FGFPYHVQVDVLQSLS
Frl2/3/68 Extl Frl2/3/68 Ext2 Frl2/3/68 Ext3 Frl2/3/68 Ext4 Frl2/3/68 Ext5
Frl2/3/83 Extl Frl2/3/83 Ext2 Frl2/3/83 Ext3 Frl2/3/83 Ext4 Frl2/3/83 Ext5
IPSHHLQDSLQLLS IPSHHLQDSLQSLS GIPSHHLQDSLQLL FGIPSHHLQDSLQLLS FGFPSHHLQDSLQSLS
EPLHFRSDRIQALS EPLHFRSDRIQSLS GEPLHFRSDRIQAL FGEPLH FRS DRIQALS FGFPLHFRSDRIQSLS
Frl2/3/55 Extl Frl2/3/55 Ext2 Frl2/3/55 Ext2 Frl2/3/55 Ext2
ATPSHLIIDRAQSLS FGFPSHLIIDRAQSLS R->W FGFPSHLIIDWAQSLS RA->WL FGFPSHLIIDWLQSLS
Frl2/3/63 Extl Frl2/3/63 Ext2 Frl2/3/63 Ext3 Frl2/3/63 Ext4 Frl2/3/84 Extl Frl2/3/84 Ext2
APKHLYADMSQALS APKHLYADMSQSLS GAPKHLYADMSQAL FGFPKHLYADMSQSLS FKPAHVSIDWLQSLS FGFPAHVSIDWLQSLS
NACHGEREICHT # »+·· ·· »· ·· • · • · · • · · t · • • ·*· · • I · • » · ♦ ♦ - 36 -
Frl2/3/47 Extl Frl2/3/47 Ext2 Frl2/3/47 Ext3 Frl2/3/47 Ext4 Frl2/3/40 Extl Frl2/3/40 Ext2 Frl2/3/40 Ext3 Frl2/3/40 Ext4 Frl2/3/35 Extl Frl2/3/35 Ext2 Frl2/3/35 Ext3 Frl2/3/35 Ext4
MPAHLSRDLRQSL MPAHLSRDLRQSLS GMPAHLSRDLRQSL FGFPAHLSRDLRQSLS SPQHLTTDRAQALS SPQHLTTDRAQSLS GSPQHLTTDRAQAL FGFPQHLTTDRAQSLS TPFHFAQDSWQWLS TPFHFAQDSWQSLS GTPFHFAQDSWQWL FGFPFHFAQDSWQSLS
Repräsentative Beispiele des Inhibitions-ELISA sind in den Fig. 5A und 5B gezeigt. Die verlängerten Peptide Frl2/3/84 Ext2 und Frl2/3/55 Ext3 zeigten eine signifikante Inhibierung: C-FGFPSHLIIDRAQSLS Frl2/3/55 Ext3 C-FGFPAHVSIDWLQSLS Frl2/3/84 Ext2
Drei zusätzliche Peptide waren in diesem Test ebenfalls inhibierend: C-FGFPYHVQVDVLQSLS Frl2/3/26/65Ext4 C-FKPAHVSIDWLQSLS Frl2/3/84 Extl C-FGFPQHLTTDRAQSLS Frl2/3/40 Ext4
Nach der Sequenzanalyse, die das Original-Epitop und alle aus den Phagen-Display-Screens stammenden Mimotope verglich, wurden zusätzliche 2 Peptide geschaffen. Für das Mimotop Frl2/3/55 Ext3 C-FGFPSHLIIDRAQSLS (inhibierend im ELISA, siehe oben) wurden die Aminosäure-Auswechslungen im Inhibitions-ELISA getestet:
Stark inhibierend: C-FGFPAHVSIDWLQSLS Frl2/3/84 Ext2
Schwach inhibierend: nachgereicht ·· · ♦+«· ·· ·· ·♦ ···* · * · t · · I* · ♦ ··· · · ♦· 4 4 4 » 4 4 4 4 4 4 4 44 4# 44 4· 4 - 37 - C-FGFPSHLIIDRAQSLS Frl2/3/55 Ext3
Peptide mit veränderten Sequenzen (inhibierend, vgl.Fig. 6): C-FGFPSHLIIDWAQSLS Frl2/3/55 Ext2 W anstatt R C-FGFPSHLIIDWLQSLS Frl2/3/55 Ext2 WL anstatt RA
Weitere bevorzugte Mimotope wurden durch den-folgenden Beispiel-Ansatz charakterisiert:
Bsp.Hr.CETP-42 C42-1 KLH/Alum - C42-2 P4073-KLH /Alum C-FGFPEHLLVDFLQSLS C42-3 P4073 LLV-LFV P4468-KLH / AJum C-FGFPEHL£VDFLQSLS C42-4 Fr12/3/84 ext2 VSI—VFI P43ei-KLH/A/um C-FGFPAHVEIDWLQSLS C42-5 Fr12/3/84ext2VSUVHI P4469-KU-/ / AJum C-FGFPAHVUIDWLQSLS 042·% Fr12/3/B4 ext2 VSM/PI p4470-KLH/A/um ofgfpahveidwlqsls C42-7 Frl20184 «02 VSUVWI P4471-KLH/Atum C-FGFPAHlflfflBWLQSLS C42-8 Fr12/3/55 *xt2 R-W 1ΙΙ-1Π P4472-KLH / Alum C-FGFPSHLEiDWAQSLS C42-9 Fr 12/3/84 ext2VSLWI FGF-PG7 SL3-LIT P4473-KLH/Alum C-EGFPAHVEIDWLCSJI C42-10 Fr12/3/84 ext2 VSM/ϊΙ P4362-KLH / Alum C-FGFPAHVUDWLQSLS Bsp. Nr. CETP-45 C45-1 KLH/Alum - 045-2 p1358-KLH/Alum neg. Kontroll-Peptld 045-3 p4073-KLH/Aium C-FGFPEHLLVDFLQSLS C45-4 Frl 2/3/84 ext2 VSLvn SLS-SUT P4474-KLH / AJum C-FGFPAHWDWLQSLjj C45 5 Frl 2/3/84 ext2 V5L-TSI P4475-KLH / Alum C-EOrPAHtSlDWLQSLS C45-6 Frl 2/3/84 ext2 VSL-Vsr p4476-KLH/Alum C-rGFPAHVSFDWLQSLS C45 7 Frl 2/3/84 ext2 VSt-VTI PAB-PEH p4477-KLH/AJum C-ir.iPEHVflDWLQSLS 045-8 Fr12/3/1/19/88 ext4 p4284-KLH/Alum C-FGFPYHHLVDQLHSLS G45-9 Frl2/3/84 «Ktl VSUVIT plns G aa p4479-KLH/Wum C-SFKPAHVEIDWLQSLS C45-10 Frl 2/3/84 ext2 VSL.VFI plus D u H-Terminus; *4361 plus D C-ßFGFPLHVFIDWLQSLS C45-11 Frl 2/3/40 exM RA-WL LTT-LfT - p436S alt Anataoach T-P P44S1-KLH/AJum C-FGFPQHLFTDWLQSI S 045-12 Fr12J356 4)42RA-4fL (vgl.C-31 und C-33; serieninhibierende ÄktivitÄt P4325-KLH/Alum C-fGFPSHUIDKLQSLS C45-13 FM2/3/84exl2FGF-FYF (vgl. C-33: Erkenn.-Protein, keine inhibierende Aktivität?) P4343-KLH J Alum C-FYFPAHVSIDWLQSLS C45-14 Kännchen-Sequenz [C-Hrt-PJLHLLVDFLQSLS *----1- 3.2.2.3. Testen von Mimotopen in vivo
Weibliche Balb/c-Mäuse, fünf Mäuse pro Gruppe, wurden subkutan mit 30 pg Peptid, an KLH gekoppelt, immunisiert. Den Kon-troll-Gruppen wurde KLH oder C-FGFPEHLLVDFLQSLS verabreicht. Als Adjuvans wurde Alum verwendet. Die verabreichten Peptide konnten alle an „Frida" binden und eine Immunantwort auf CETP induzieren, obwohl einige dieser Peptide die Bindung von CETP an „Frida" in vitro nicht inhibierten'(in einem in-vitro-Inhibitions-Test) . Der in vitro-ELISA-Assay zur Bestimmung des Antikörpertiters wurde mit gepoolten Seren nach zwei Impfungen in einem
NACHGEREICHT ·+ • M·· ·« ·· • · • t • • · · • · * ·*· « · ·· • · • Ψ * · ♦ ♦ •
- 38 - zweiwöchigen Intervall durchgeführt (S2; vgl. Fig. 7a bis 7d). Die Vertiefungen der ELISA-Platte wurden mit KLH (positive Kontrolle) , Mimotop-BSA-Konjugat, C-FGFPEHLLVDFLQSLS und einem irrelevanten Peptid-BSA-Konjugat (negative Kontrolle) beschichtet Die Detektion wurde mit Anti-Maus-IgG durchgeführt. 3.2.3. Phaaen-Disvlav-Bibliothek Ph.D.7C7 3.2.3.1. Screenen mit den monoklonalen Antikörpern „Frida" und „James" Fr2-1 ACSFAYLYRC Fr2-5 Fr2-6 Fr2-18 Fr2-19 Fr2-28 Ja2-5 J.a2-20 Ja2-23 Ja2-24 Ja2-30 ACFMGDKWVC Fr2-7 Fr2-9 ACVLYPKAIC Fr2-ll Ja2-19 ACYMGQQFVC Fr2-16 ACLTAYLHWC Fr2-20 ACTLFPVAYC Fr2-25 ACWLFPYAHC Fr2-26 ACKSINMWLC Fr2-27 ACQTINRWLC
Weil diese Mimotop-Peptide zyklisch sind, ist ihre Synthese komplizierter als die Synthese linearer Peptide. Sieben von 9 zyklischen Sequenzen wurden für die In vitro-Analyse im Inhibi-
NACHGEREICHT
00 m • 0 0· 00 • · 00 0 0 · 0 · i : • • 000 0 0 00 • 0 0 0 0 0 - 39 - tions-ELISA gewählt (vgl. Fig. 8a und 8b). Keine dieser Sequenzen inhibierte die Bindung des monoklonalen Antikörpers, der für das Phagen-Display-Screening des ursprünglichen CETP-Epitops verwendet wurde. Außerdem wurden diese Peptide, wenn sie an BSA gekoppelt und auf die ELISA-Platte aufgetragen waren, nicht vom monoklonalen Antikörper detektiert (vgl. Fig. 9) . Dies stand im Gegensatz zu Daten mit Mimotopen, die aus den Ph-D.7- oder Ph-D-12-Bibliotheken abgeleitet waren, wo die monoklonalen Antikörper an die meisten der identifizierten Mimotope banden, wenn diese Peptide an BSA gekoppelt und auf ELISA-Platten aufgetragen waren. BEISPIEL 3: CETP-Aktivitäts-Test:
Der CETP-Aktivitäts-Test wurde mit Assays durchgeführt, die im Handel erhältlich sind (z.B. ROAR CETP Activity Assay) und beispielsweise in der US 5,585,235, US 5,618,683 und US 5,770,355 beschrieben sind. Der Test wird gemäß den Empfehlungen der Hersteller durchgeführt.
NACHGEREICHT

Claims (15)

  1. ·· » » I * ···· ·· ·· ·· ·* · · · ♦ · · ♦ · ··· · · ·· • ·«···«* - 40 - Patentansprüche: 1. Verwendung einer Verbindung, welche die Aminosäuresequenz (Z1)nX1X2X3X4(Z2)ra umfasst, worin Ζχ ein anderer Aminosäurerest als C ist, Xi ein Aminosäurerest ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus D, A, R, E, S, N, T und G ist, X2 ein Aminosäurerest ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus F, A, W, R, S, L, Q, V und M ist, X3 ein Aminosäurerest ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus L, A, s, W, E, R, I und H ist, X4 ein Aminosäurerest ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Q, A, H, D, K, R, S und E ist, Z2 ein anderer Aminosäurerest als C ist, n eine ganze Zahl zwischen 0 und 9 ist, m eine ganze Zahl zwischen 0 und 3 ist, kein 4- bis 16-meres Polypeptidfragment des Cholesterin-Ester-Transport-Proteins (CETP) oder ein CETP-Epitop ist oder umfasst, wobei die Verbindung eine Bindungskapazität an einen Antikörper hat, der für das natürliche CETP-Glykoprotein spezifisch ist, oder eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SYHATFL, TMAFPLN, HYHGAFL, EHHDIFL, TGLSVFL, WMPSLFY, SMPWWFF, TMPLLFW, DTWPGLE, SMPPIFY, MPLWWWD, SMPNLFY, RMPPIFY, NPFEVFL, TLPNWFW, SMPLTFY, SPHPHFL, NFMSIGL, SQFLASL, WSWPGLN, IAWPGLD, SKFMDTL, SMPMVFY, YEWVGLM, KGFLDHL, HQSDDKMP-WWFF, YVWQDPSFTTFF, YVWQDPSFTTFF, LPQTHPLHLLED, GPVSIYADTDFL, DSNDTLTLAAFL, NGSPALSHMLFL, TDYDPMWVFFGY, IFPLDSQWQT FW, NESMP-DLFYQPS, DWGDKYFSSFWN, VSÄYNNV und WPLHLWQ zur Herstellung eines Medikaments zur Prävention und/oder Behandlung von Atherosklerose, Atherosklerose-Risiko-Krankheiten und Atherosklerose-Spätfolgen.
  2. 2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung ein Polypeptid mit 5 bis 16 Aminosäureresten ist. NACHGEREICHT 41
  3. 3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass n 7, 8 oder 9 ist, Z7 ein anderer Aminosäurerest als C ist oder ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus F, G, F, A, P, W, Y, S, G, D, L, E, K, T, P, I und M, vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus F, G, F, A, P, Y, T, S, G, K und D, und Z2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus S, L, A, W, L, N, T, I, Y und H.
  4. 4. Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass Xi ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus D, A, R, E und L, X2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus F, A, W, Q und R, X3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus L, A und S, und X4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Q, A und H.
  5. 5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass X3 D ist, X2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus F, Y und W, X3 L oder S ist und X4 Q oder H ist.
  6. 6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung die Aminosäuresequenz FX8 (F) οΡΧ9ΗΧ10ΧιιΧΐ20Χ2Χ3Χ4Χ5Χ6Χ7 umfasst, worin X8 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus G, A, F, Y und K, X9 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus E, Y, A, Q, K und S, Xio ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Η, V, L, F und I, Xu ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus L, W, S, I, F und Y/ X12 V, T, F oder I ist, X5 S oder Y ist, X6 L, A oder I ist, X7 S, N oder T ist, und o 0 oder 1 ist.
  7. 7. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung die Aminosäuresequenz X1X2X3X4X5X6X7 umfasst, worin X3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus D, S, N, T und G, X2 F ist, X3 L ist, X4 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Q, D, K, R, S und E, X5 S oder T ist, X6 L ist und X7 ein anderer Aminosäurerest als C ist, der vorzugsweise ausgewählt NACHGEREICHT 99 9 9999 99 99 ·· • · 99 9 9 9 9 • • · 9 9 999 9 9 ·· f « 9 « · * · « - 42 - ist aus der Gruppe bestehend aus S, T, A, M, F und W.
  8. 8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SSLELFL, SFLDTLT, NFLKTLS, DFLRTLT, AFLDTLV, TFLSSLA, GFLDSLM, SPHPHFL, SNFLKTL, TGFLATL, SDFLRAL, SANPRDF-LETLF, RMFPESFLDTLW, TIYDSFLDSLAS, KPYLLKDFLEAL, AMGPYDALDLFL, TWNPIESFLESL, QYQTPLTFLEAL, RHISPATFLEAL, HTDSFLSTFYGD, ADSTFTS-FLQTL, GPVSIYADTDFL, DSNDTLTLAAFL, T PTHYYADFSQL, LPGHLIWDSLHY, LPQTHPLHLLED, IPYHHLVDQLHH, YPYHVQVDVLQN, IPSHHLQDSLQL, EYAH-HTSLDLRQ, EPLHFRSDRIQA, ATPSHLIIDRAQ, APKHLYADMSQA, FKPAHVSID-WLQ, MPAHLSRDLRQS, NPKHYSIDRHQA, SPQHLTTDRAQA, TPFHFAQDSWQW, TPTHYYADFSQLLS, TPTHYYADFSQSLS, GTPTHYYADFSQLL, GTPTHYYADFSQSL, FGTPTHYYADFSQSLS, FGFPTHYYADFSQSLS, LPGHLIWDSLHY, LPGHLIWDSLHYL, LPGHLIWDSLHYLS, LPGHLIWDSLHSL, LPGHLIWDSLHSLS, GLPGHLIWDSLHYL, GLPGHLIWDSLHSL, FGLPGHLIWDSLHSLS, FGFPGHLIWDSLHSLS, LPQTHPLHLLED, IPYHHLVDQLHH, IPYHHLVDQLHLS, IPYHHLVDQLHSLS, FGIPYHHLVDQLHHLS, FGFPYHHLVDQLHSLS, YPYHVQVDVLQN, YPYHVQVDVLQNLS, YPYHVQVDVLQSLS, FGYPYHVQVDVLQNLS, FGFPYHVQVDVLQSLS, IPSHHLQDSLQL, IPSHHLQDSLQLLS, IPSHHLQDSLQSLS, GIPSHHLQDSLQLL, FGIPSHHLQDSLQLLS, FGFPSHHLQD-SLQSLS, EYAHHTSLDLRQ, EPLHFRSDRIQA, EPLHFRSDRIQALS, EPLH-FRSDRIQSLS, GEPLHFRSDRIQAL, FGEPLHFRSDRIQALS, FGFPLHFRSDRIQSLS, APKHLYADMSQA, APKHLYADMSQALS, APKHLYADMSQSLS, GAPKHLYADMSQAL, FGFPKHLYADMSQSLS, MPAHLSRDLRQS, MPAHLSRDLRQSL, MPAHLSRDLRQSLS, GMPAHLSRDLRQSL, FGFPAHLSRDLRQSLS, NPKHYSIDRHQA, TPFHFAQDSWQW, TPFHFAQDSWQWLS, TPFHFAQDSWQSLS, GTPFHFAQDSWQWL, FGFPFHFAQDS-WQSLS, ACSFAYLYRC, ACFMGDKWVC, ACVLYPKAIC, ACYMGQQFVC, ACLTAYL-HWC, ACTLFPVAYC, ACWLFPYAHC, ACKSINMWLC, ACQTINRWLC, FGFPEHLLVDFLQSLS, FGFPEHLLVDFLQSLS, FPEHLLVDFLQSL, AGFPEHLLVDFL-QSLS, FAFPEHLLVDFLQSLS, FGAPEHLLVDFLQSLS, FGFAEHLLVDFLQSLS, FGFPAHLLVDFLQSLS, FGFPEALLVDFLQSLS, FGFPEHALVDFLQSLS, FGFPEHL-AVDFLQSLS, FGFPEHLLADFLQSLS, FGFPEHLLVAFLQSLS, FGFPEHLLVDALQSLS, FGFPEHLLVDFAQSLS, FGFPEHLLVDFLASLS, FGFPEHLLVDFLQALS, FGFPEHLLVDFLQSAS, FGFPEHLLVDFLQSLA, FAFPAHLLVDFLQALA, AAFPAHL-LÄDFLQALA, SPQHLTTDRAQA, S PQHLTT DRAQALS, SPQHLTTDRAQSLS, GSPQHLTTDRAQAL, FGFPQHLTTDRAQSLS, FGFPQHLTTDWAQSLS, FGFPQHLTT-DRLQSLS, FGFPQHLTTDWLQSLS, ATPSHLIIDRAQ, ATPSHLIIDRAQSLS, FGFPS-HLIIDRAQSLS, FGFPSHLIIDWAQSLS, FGFPSHLIIDWLQSLS, FGFPSHLIIDWSQSLS, FATPSHLIIDWLQSLS, FKPAHVSIDWLQ, FKPAHVSIDWL-QSLS, FGFPAHVSIDWLQSLS, AGFPAHVSIDWLQSLS, FAFPAHVSIDWLQSLS, FGA- NACHGEREICHT * ·· · ···· ·· ι· ·· • · ·· · · ···· » · · · ··♦ « · «* I « · ·· ♦ · t * « • i · · ·· · # ·· · - 43 - PAHV SIDWLQSLS, FGFAAHVSIDWLQSLS, FGFPAHVSADWLQSLS, FGFPAHVSIDWL-QALS, FG FPAHVSIDWLQSLA, FAFPAHVSIDWLQALA, FGFAAHVSIDWLQSLS, FG-FFAHVSIDWLQSLS, FGFPAHVSIRWLQSLS, FGFPAHVSIEWLQSLS, FGFPAHVSIDWLNSLS, FGFPAHVSIDWLHSLS, AGFPAHVSIDWLQSLS, PGFP-AHVSIDWLQSLS, WGFPAHVSIDWLQSLS, FAFPAHVSIDWLQSLS, FSFPAHVSIDWLQSLS, FYFPAHVSIDWLQSLS, FDFPAHVSIDWLQSLS, FGAPAHVSIDWLQSLS, FGFPAHVSIDWLQLLS, FGFPAHVSIDWLQWLS, FGFPAHVSIDWLQNLS, FGFPAHVS I DWLQTLS , FGFPAHVSIDWLQYLS, FGFPAHVSIDWLQSIS, FGFPAHVSIDWL-QSLT, FG FPAHV SIDWLQSLY, FAFPAHVSIDWLQALA, FGFPAHVSIDRAQSLS, FGFPTHVSIDWLQSLS, FGFPFHVSIDWLQSLS, FGFPAHISIDWLQSLS, FGFPAHII-IDWLQSLS, FGFPAHLTTDWLQSLS, FGFPAHVFIDWLQSLS, FGFPAHVYIDWLQSLS, FGFPAHVSLDWLQSLS, FGFPAHVSADWLQSLS, TPTHYYADFSQSLS, FGFPAHVWIDWLQSLS, FGFPAHVFIDWLQSLN, FGFPAHFSIDWLQSLS, FGFPAHVSFDWLQSLS, FGFPEHVFIDWLQSLS, DFGFPAHVFIDWLQSLS, FGFPQHLFTDWLQSLS, FGFP-KHLLVDFLQSLS, FGFPAHVSIDWSQSLS und FGFPAHVSIDFSQSLS.
  9. 9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung an einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, vorzugsweise an KLH (Keyhole Limpet Hämocyanin) gekoppelt ist.
  10. 10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung zur intravenösen, subkutanen oder intramuskulären Verabreichung formuliert ist.
  11. 11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung mit einem Adjuvans, vorzugsweise mit Aluminiumhydroxid, formuliert ist.
  12. 12. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung in einer Menge von 0,1 ng bis 10 mg, vorzugsweise 10 ng bis 1 mg, inbesondere 100 ng bis 10 pg, enthalten ist.
  13. 13. Peptid, bestehend aus mindestens einer Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SYHATFL, TMAFPLN, HY-HGAFL, EHHDIFL, SSLELFL, TGLSVFL, WMPSLFY, SMPWWFF, TMPLLFW, DTWPGLE, SMPPIFY, MPLWWWD, SMPNLFY, RMPPIFY, NPFEVFL, TLPNWFW, SMPLTFY, SFLDTLT, NFLKTLS, DFLRTLT, AFLDTLV, TFLSSLA, GFLDSLM, SPHPHFL, NFMSIGL, SQFLASL, SNFLKTL, TGFLATL, WSWPGLN, IAWPGLD, NACHGEREICHT 44 SKFMDTL, SDFLRAL, SMPMVFY, YEWVGLM, KGFLDHL, SANPRDFLETLF, RM-FPESFLDTLW, TIYDSFLDSLAS, HQSDDKMPWWFF, KPYLLKDFLEAL, AMGPY-DALDLFL, TWNPIESFLESL, YVWQDPSFTTFF, QYQTPLTFLEAL, RHIS PAT FLEAL, HTDSFLSTFYGD, YVWQDPSFTTFF, ADSTFTSFLQTL, GPVSIYADTDFL, DSNDTLT-LAAFL, NGSPALSHMLFL, TDYDPMWVFFGY, IFPLDSQWQTFW, NESMPDLFYQPS, DWGDKYFSSFWN, VSAYNNV, WPLHLWQ, TPTHYYADFSQL, LPGHLIWDSLHY, LPQTHPLHLLED, IPYHHLVDQLHH, YPYHVQVDVLQN, IPSHHLQDSLQL, EYAH-HTSLDLRQ, EPLHFRSDRIQA, ATPSHLIIDRAQ, APKHLYADMSQA, FKPAHVSIDWLQ, MPAHLSRDLRQS, NPKHYSIDRHQA, SPQHLTTDRAQA, TPFHFAQDSWQW, TPTHYY-ADFSQLLS, TPTHYYADFSQSLS, GTPTHYYADFSQLL, GTPTHYYADFSQSL, FGT-PTHYYADFSQSLS, FGFPTHYYADFSQSLS, LPGHLIWDSLHY, LPGHLIWDSLHYL, LPGHLIWDSLHYLS, LPGHLIWDSLHSL, LPGHLIWDSLHSLS, GLPGHLIWDSLHYL, GLPGHLIWDSLHSL, FGLPGHLIWDSLHSLS, FGFPGHLIWDSLHSLS, LPQTHPLHLLED, IPYHHLVDQLHH, IPYHHLVDQLHLS, IPYHHLVDQLHSLS, FGIPYHHLVDQLHHLS, FGFPYHHLVDQLHSLS, YPYHVQVDVLQN, YPYHVQVDVLQNLS, YPYHVQVDVLQSLS, FGYPYHVQVDVLQNLS, FGFPYHVQVDVLQSLS, IPSHHLQDSLQL, IPSHHLQDSLQLLS, IPSHHLQDSLQSLS, GlPSHHLQDSLQLL, FGIPSHHLQDSLQLLS, FGFPSHHLQD-SLQSLS, EYAHHTSLDLRQ, EPLHFRSDRIQA, EPLHFRSDRIQALS, EPLH-FRSDRIQSLS, GEPLHFRSDRIQAL, FGEPLHFRSDRIQALS, FGFPLHFRSDRIQSLS, APKHLYADMSQA, APKHLYADMSQALS, APKHLYADMSQSLS, GAPKHLYADMSQAL, FGFPKHLYADMSQSLS, MPAHLSRDLRQS, MPAHLSRDLRQSL, MPAHLSRDLRQSLS, GMPAHLSRDLRQSL, FGFPAHLSRDLRQSLS, NPKHYSIDRHQA, TPFHFAQDSWQW, TPFHFAQDSWQWLS, TPFHFAQDSWQSLS, GTPFHFAQDSWQWL, FGFPFHFAQDSWQSLS, ACSFAYLYRC, ACFMGDKWVC, ACVLYPKAIC, ACYMGQQFVC, ACLTAYLHWC, ACT-LFPVAYC, ACWLFPYAHC, ACKSINMWLC, ACQTINRWLC, FGFPEHLLVDFLQSLS, FGFPEHLLVDFLQSLS, FPEHLLVDFLQSL, AGFPEHLLVDFLQSLS, FAFPEHLLVDFL-QSLS, FGAPEHLLVDFLQSLS, FGFAEHLLVDFLQSLS, FGFPAHLLVDFLQSLS, FGFPEALLVDFLQSLS, FGFPEHALVDFLQSLS, FGFPEHLAVDFLQSLS, FGFPEHL-LADFLQSLS, FGFPEHLLVAFLQSLS, FGFPEHLLVDALQSLS, FGFPEHLLVDFAQSLS, FGFPEHLLVDFLASLS, FGFPEHLLVDFLQALS, FGFPEHLLVDFLQSAS, FGFPEHLLVDFLQSLA, FAFPAHLLVDFLQALA, AAFPAHLLADFLQALA, SPQHLTTDRAQA, SPQHLTTDRAQALS, SPQHLTTDRAQSLS, GSPQHLTTDRAQAL, FGFPQHLTTDRAQSLS, FGFPQHLTTDWAQSLS, FGFPQHLTTDRLQSLS, FGFPQHLTTDWLQSLS, ATPSHLIIDRAQ, ATPSHLIIDRAQSLS, FGFPSHLII-DRAQSLS, FGFPSHLIIDWAQSLS, FGFPSHLIIDWLQSLS, FGFPSHLIIDWSQSLS, FATPSHLIIDWLQSLS, FKPAHVSIDWLQ, FKPAHVSIDWLQSLS, FGFPAHVSIDWLQSLS, AGFPAHVSIDWLQSLS, FAFPAHVSIDWLQSLS, FGAPAHVSIDWLQSLS, FG-FAAHVS IDWLQSLS, FGFPAHVSADWLQSLS, FGFPAHVS IDWLQALS, FGFPAHVS IDWLQSLA, FAFPAHVS IDWLQALA, FGFAAHVS IDWLQSLS, FG-FFAHVSIDWLQSLS, FGFPAHVSIRWLQSLS, FGFPAHVSIEWLQSLS, FG- IMACHGERE1CHT ·· • ···· ·· ·· ·· • · ·· • * · · • • · • • ··· · Φ ·· • « • * · * t • - 45 - FPAHVSIDWLNSLS, FGFPAHVSIDWLHSLS, AGFPAHVSIDWLQSLS, PGFPAHVSIDW-LQSLS, WG FPAHV SIDWLQSLS, FAFPAHVSIDWLQSLS, FSFPAHVSIDWLQSLS, FYFPAHVSIDWLQSLS, FDFPAHVSIDWLQSLS, FGAPAHVSIDWLQSLS, FGFPAHVSIDWLQLLS, FGFPAHVSIDWLQWLS, FGFPAHVSIDWLQNLS, FGFPAHVSIDWLQTLS, FGFPAHVSIDWLQYLS, FGFPAHVSIDWLQSIS, FGFPAHVSIDWLQSLT, FGFPAHVSIDWLQSLY, FAFPAHVSIDWLQALA, FGFPAHVSI-DRAQSLS, FGFPTHVSIDWLQSLS, FGFPFHVSIDWLQSLS, FGFPAHISIDWLQSLS, FGFPAHIIIDWLQSLS, FGFPAHLTTDWLQSLS, FGFPAHVFIDWLQSLS, FGFPAH-VYIDWLQSLS, FGFPAHVSLDWLQSLS, FGFPAHVSADWLQSLS, TPTHYYADFSQSLS, FGFPAHVSIDWSQSLS und FGFPAHVSIDFSQSLS.
  14. 14. Peptid nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Peptid an einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, vorzugsweise an KLH (Keyhole Limpet Hämocyanin), gekoppelt ist.
  15. 15. Pharmazeutische Formulierung, welche mindestens ein Peptid nach einem der Ansprüche 13 oder 14 aufweist. NACHGEREICHT
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