ES2258773T3 - Medicamento que contiene al menos una parte de la proteina ul84 del citomegalovirus, uso de polipeptidos que se corresponden con la secuencia de aminoacidos de la proteina ul84 y procedimiento para la introduccion de ul84 en celulas diana. - Google Patents
Medicamento que contiene al menos una parte de la proteina ul84 del citomegalovirus, uso de polipeptidos que se corresponden con la secuencia de aminoacidos de la proteina ul84 y procedimiento para la introduccion de ul84 en celulas diana.Info
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Abstract
EL CITOMEGALOVIRUS ES UN AGENTE PATOGENO IMPORTANTE EN DIFERENTES GRUPOS PROBLEMATICOS TALES COMO PACIENTES INMUNOSUPRIMIDOS, NEONATOS O PACIENTES TRASPLANTADOS. SE DA A CONOCER EL EMPLEO COMO MEDICAMENTOS DE UNOS POLIPEPTIDOS QUE SE CORRESPONDEN, AL MENOS EN PARTE, CON LA SECUENCIA DEL UL84, Y EL USO DEL CORRESPONDIENTE GEN EN UNOS VECTORES DE TRANSFERENCIA ADECUADOS.
Description
Medicamento que contiene al menos una parte de
la proteína UL84 del citomegalovirus, uso de polipéptidos que se
corresponden con la secuencia de aminoácidos de la proteína UL84 y
procedimiento para la introducción de UL84 en células diana.
El objeto de la presente invención son
medicamentos que contienen al menos un polipéptido o proteína, que
en lo que respecta a la secuencia de aminoácidos se corresponde al
menos parcialmente con la proteína UL84 del citomegalovirus humano.
Estos polipéptidos se pueden usar para la inhibición de la
multiplicación de citomegalovirus humanos (en lo sucesivo CMVH de
forma abreviada), en donde bien se administran los polipéptidos de
forma habitual o bien se incorporan los genes que codifican para
estos polipéptidos con ayuda de vectores adecuados en las células
diana y se expresan ahí.
El citomegalovirus humano (CMVH) es un virus
ampliamente extendido. Se podría prever aproximadamente el 50% de
la población en Europa Central como seropositiva y en consecuencia
estas personas portan consigo el virus en una forma latente.
El CMVH provoca un cuadro de enfermedad similar
a la mononucleosis infecciosa, pero sin embargo rara vez personas
sanas sufren una enfermedad inducida por el CMVH.
Determinados grupos de riesgo como, por ejemplo,
recién nacidos y sobre todo pacientes inmunosuprimidos, así como
receptores de transplantes, se pueden ver amenazados por infecciones
por CMVH. Se pueden producir cuadros de enfermedad con peligro de
muerte o también que llevan a pérdida de la vista como sepsis,
pneumonía, colitis o retinitis. Estas complicaciones se dan sobre
todo tras transplantes de órganos, en infecciones por VIH, en
terapia con citoestáticos y en recién nacidos tras infección
prenatal.
Las manifestaciones clínicas de la infección por
CMVH son muy diversas. Por un lado se puede generar una infección
generalizada en el sentido de una sepsis, pero es frecuente que se
concentre la ocurrencia de la enfermedad sobre un sistema orgánico,
de modo que es deseable un tratamiento terapéutico localizado. A las
manifestaciones orgánicas más importantes pertenecen la pneumonía,
enfermedades gastrointestinales (por ejemplo, gastritis, úlceras en
estómago/tracto intestinal), la retinitis, úlceras de la piel
(especialmente en pacientes de SIDA) así como procesos estenosantes
de los vasos (por ejemplo, tras angioplastia coronaria trasluminal
percutánea = PTCA, tras transplante de corazón).
En muchos de estos cuadros de enfermedad es
necesaria una terapia duradera, virostática, de modo en esto es muy
ventajoso un principio de terapia, que conduzca a una "inmunidad
intracelular" contra CMVH.
En la actualidad se dispone para la terapia de
infecciones por CMVH esencialmente de dos medicamentos, a saber,
ganciclovir y foscamet. Esas dos sustancias atacan a la ADN
polimerasa codificada viral, cuya función inhiben. Pero estas
sustancias tienen desventajas agravantes. Estas muestran un perfil
de toxicidad remarcado, de modo que es necesario en 20 a 40% de
todos los pacientes tratados una interrupción de la terapia. Por
otro lado se trata de una terapia virostática, que en parte se
requiere durante prolongados periodos de tiempo de tratamiento. Por
tanto da lugar muy fácilmente a la entrada de variantes de virus
resistentes y con ello ya no se produce la actividad de estos
medicamentos.
En el marco de la presente invención se usan
polipéptidos que intervienen en la regulación genética del
citomegalovirus.
Como es general en los virus del herpes, el
ciclo de replicación del CMVH se subdivide en tres fases distintas,
que se designan como inmediata temprana (muy pronto), temprana
(pronto) y tardía (tarde). De forma inmediata tras la entrada del
virus en las células diana se producen para la expresión de un
número limitado de proteínas, las denominadas proteínas inmediatas
tempranas, que se pueden clasificar inmunológicamente. Estas
proteínas inmediatas tempranas tienen en parte una función
transactivadora, estas pueden activar por tanto promotores virales
y conducen con ello a la siguiente fase de la expresión génica
viral, por tanto a la fase temprana o pronta. Al mismo tiempo
algunas de estas proteínas inmediatas tempranas modifican también la
expresión génica celular y pueden influir sobre promotores virales
heterólogos.
En esto es esencial para una activación de
promotores tempranos virales la proteína IE2, que presenta una masa
molecular de 86 kDa y se designa en la bibliografía también como
IE86, IE80 o IE2-86. La proteína IE86 es necesaria
para la estimulación de la expresión génica temprana, mientras que
otras proteínas IE pueden desempeñar un efecto adicional de
refuerzo.
En el marco de la presente invención se demostró
que otra proteína que se deriva del CMVH, la proteína UL84, inhibe
por un lado la función de transactivación de IE86 y por otro lado
refuerza la regulación negativa mediada por IE86 del
potenciador/promotor de IE1/2. En base a este conocimiento se podría
comprobar que una expresión de la proteína UL84 inhibe la
multiplicación de virus durante la fase temprana inmediata del ciclo
de replicación del CMVH.
En el marco de la presente invención se podría
aclarar la interacción de la proteína IE86 con la proteína UL84
codificada viral. Para ello se construyó en primer lugar un vector
de expresión eucariótico, que fusionó la proteína UL84 del CMVH con
un péptido antígeno (epítopo FLAG). Esto permitió la detección
inmunológica de la proteína con ayuda de un anticuerpo monoclonal
dirigido contra el epítopo FLAG. Células COS7 se
co-transfectaron por un lado con este vector de
expresión de UL84 y por otro lado con un vector que expresó la
proteína IE86. Un análisis de inmunoprecipitación subsiguiente
mostró que la UL84 puede permitir, independientemente de otras
proteínas virales, una interacción estable con IE86. Esto se
confirmó también mediante un ensayo in vitro, un denominado
análisis "pull down".
Para estudiar los efectos funcionales de esta
interacción se usaron construcciones reporteras que expresan la
luciferasa con control de distintos promotores homólogos y
heterólogos, junto con los plásmidos de expresión UL84 y/o IE86 en
experimentos de co-transfección. Estos ensayos
dieron lugar al sorprendente hallazgo de que la proteína UL84
inhibió muy fuertemente y dependiendo de la dosis la transactivación
mediada por IE86, mientras que por sí sola no influyó en los
promotores estudiados. Esto se podría comprobar tanto para el
promotor del virus de inmunodeficiencia humano como también para un
promotor viral del CMVH, a sabe el promotor de UL112.
Además es esencial la activación de los
promotores tempranos virales para un progreso del ciclo de
replicación, en el marco de la presente invención resultó que una
expresión de UL84 en momentos tempranos inmediatos puede inhibir la
replicación del CMVH. Esto se podría confirmar mediante dos ensayos
distintos. Tras transfección de células U373 permisivas para el CMVH
con el plásmido que expresa la proteína UL84 y a continuación
superinfección con CMVH no se podría detectar en células que
expresan UL84 antígeno viral temprano alguno. Esto es una clara
indicación de la inhibición de la expresión génica temprana con
UL84.
En otro ensayo se establecieron líneas celulares
que expresaban la proteína UL84. Tras infección de estas células con
CMVH a penas se podría detectar proteína inmediata temprana; esto
muestra que las células se pueden infectar principalmente. Sin
embargo no se llegó a la expresión de proteínas tempranas. Al mismo
tiempo se podrían observar si los cambios morfológicos típicos para
el CMVH de las células, se daban lugar también a una destrucción de
las células infectadas. Una expresión de UL84 al comienzo de la
infección puede inhibir por tanto de forma eficiente la replicación
de CMVH. Esto retorna con una neutralización de la actividad de
transactivación de la proteína IE86, que está mediada por una
interacción proteína/proteína específica y altamente afín.
En base a los conocimientos adquiridos en el
marco de la presente invención es posible por tanto proporcionar
medicamentos que presenten polipéptidos, que en lo que respecta a la
secuencia de aminoácidos se corresponden a la de la proteína pUL84
al menos parcialmente. En el marco de la presente invención se
encontró que la región N-terminal de la proteína
UL84 es necesaria para la unión al potenciador/promotor de IE 1/2 y
por tanto está presente en estos medicamentos en la forma de
realización preferida.
De forma alternativa a esto se puede pasar
también el gen que codifica para la proteína UL84 con ayuda de un
vector a las células y hacer que se exprese ahí. Los vectores de
este tipo contienen al menos una parte del gen que codifica para
UL84. Por tanto, son objeto de la presente invención medicamentos
que presentan un polipéptido, que comprende al menos una parte de la
secuencia de aminoácidos de la proteína UL84 del citomegalovirus o
un polipéptido homólogo a esta, en los que se presenta una homología
de al menos el 80%.
Preferiblemente estos medicamentos presentan un
polipéptido, cuya secuencia de aminoácidos se corresponde a la de la
proteína UL84 al menos parcialmente, en los que esta secuencia de
aminoácidos está representada en la figura 1.
Las preparaciones farmacéuticas de acuerdo con
la invención presentan preferiblemente polipéptidos, cuya secuencia
de aminoácidos se corresponde al menos a la de la región
N-terminal de la proteína UL84. En la forma de
realización especialmente preferida están comprendidos al menos los
180 aminoácidos N-terminales de la proteína
UL84.
Las preparaciones farmacéuticas de acuerdo con
la invención sirven preferiblemente para el tratamiento de una
infección de citomegalovirus humano.
En correspondencia se pueden usar los
polipéptidos usados de acuerdo con la invención, que comprenden al
menos una parte de la secuencia de aminoácidos de la proteína UL84
del citomegalovirus humano, o ácidos nucleicos que codifican para
los mismos, para terapia o profilaxis de una infección de
citomegalovirus humano.
Los polipéptidos usados de acuerdo con la
invención o los ácidos nucleicos que codifican para estos, se pueden
usar en procedimientos en los que se introduce un gen que codifica
para al menos una parte de la proteína UL84 con ayuda de vectores
adecuados en las células diana deseadas y luego se expresa la
proteína UL84 en estas células. Los procedimientos de este tipo
sirven para la reducción de la multiplicación de citomegalovirus
humanos.
En cuanto a los medicamentos usados se pueden
tratar de aquellos que se formulan con ayuda de procedimientos
convencionales. Es importante que el polipéptido llegue en forma no
modificada a las células diana y luego pueda penetrar en las
células diana. En tanto se seleccionen formas de administración por
vía oral se debe asegurar que el medicamento pueda superar el paso
estómago-intestino sin modificarse.
La proteína UL84 es conocida ya que tanto la
secuencia de ácido nucleico como también de aminoácidos se
publicaron con anterioridad. En la figura 1 se representa la
secuencia de ácido nucleico y de aminoácidos de UL84.
Debido a que en cuanto a la proteína UL84 usada
de acuerdo con la invención se trata de una proteína vírica, la
presente invención comprende también polipéptidos homólogos a UL84.
La homología representa una referencia del grado de coincidencia de
dos secuencias de proteína. Homología del 50% significa, por
ejemplo, que 50 de 100 posiciones de aminoácidos en la secuencia
coinciden. En el presente caso están comprendidas por la invención
también aquellas proteínas que son al menos homólogas en el 80% con
la proteína pUL84. Esto significa que coinciden 8 de 10 aminoácidos
en la secuencia comparable.
Debido a que en el marco de la presente
invención se encontró que la región N-terminal es
necesaria para la unión al potenciador/promotor de IE1/2, los
medicamentos de acuerdo con la invención comprenden al menos esta
región N-terminal, en la que deben estar presentes
al menos 180 aminoácidos terminales de la proteína UL84.
Es también posible no usar el polipéptido para
la terapia, sino el gen o gen parcial que codifica para la proteína
UL84. En cuanto a este uso se lleva el gen con un vector de
expresión a las células diana deseadas y se expresa luego en las
células la proteína UL84 o el polipéptido parcial. Se puede usar
esto por una parte para la terapia de infecciones por CMVH ya
existentes y por otra parte para la profilaxis frente a infecciones
por CMVH inminentes.
La presente invención se aclara más
detalladamente mediante las figuras adjuntas:
La figura 1 muestra la secuencia de ácido
nucleico y de aminoácidos derivada de esta del marco de lectura
abierto para UL84 del citomegalovirus humano, cepa AD169.
La figura 2 representa una representación
esquemática del plásmido de expresión eucariótico
pcDNA-UL84.
La figura 3 representa la prueba de una
interacción independiente de otras proteínas virales de pUL84 y
EI186 mediante inmunoprecipitación y análisis
"pull-down". En la figura significan:
A) se transfectaron células
COS-7 bien transfectadas de forma fingida o con los
plásmidos de expresión pHM121 (IE86) y/o pcDNAUL84. Después del
marcado radiactivo de proteínas celulares se prepararon lisados
celulares y se estudiaron mediante inmunoprecipitación con el
anticuerpo monoclonal específico de IE86 2.9.5. M: marcador de gran
tamaño, trazo 1: lisado de células transfectadas de forma fingida;
trazo 2, lisado de células que se habían transfectado con pHM121;
trazo 3, lisado de células que se habían transfectado con pHM121 y
pcDNAUL84.
B) Experimento "Pull down" con GST: las
proteínas TBP, IE1 y UL84 se marcaron radiactivamente mediante
translación in vitro y luego se incubaron bien con una
proteína de fusión GST-IE1 o bien
GST-IE2. Tras lavado intensivo de las
GST-proteínas acopladas con agarosa se
desnaturalizaron las proteínas unidas mediante calentamiento al 95%
y se analizaron mediante SDS-PAGE. M: marcador de
gran tamaño; trazos 1 a 3, las proteínas TBP, IE1 y UL84
transladadas in vitro, que se usaron para la reacción de
unión; trazos 4 a 6, TBP, IE1 y UL84 tras incubación con
GST-IE1; trazos 7 a 9, TBP, IE1 y UL84 tras unión a
GST-IE2.
La figura 4 muestra la influencia de UL84 sobre
la transactivación mediada por IE2 de promotores virales homólogos y
heterólogos.
Se cotransfectaron células U373 con plásmidos
reporteros que contenían distintos promotores además de luciferasa,
y plásmidos de expresión para IE86 (pHM134), pUL84 (pcDNAUL84) o la
proteína tat del VIH (pCT21). Después de 48 horas se lisaron las
células y se determinó la actividad de la luciferasa. En la figura
se representa la activación (como activación de x veces) tras la
cotransfección de distintos plásmidos de expresión respecto a la
actividad base del promotor (actividad del promotor tras
cotransfección del vector de clonación pcDNA3). A) como plásmido
reportero se usaron 3 \mug de una construcción promotor de
VIH-luciferasa. B) como plásmido reportero se usaron
3 \mug de una construcción promotor de
UL112-luciferasa. Trazos: 1, cotransfección con 10
\mug de pcDNA3; 2, cotransfección con 5 \mug de pcDNAUL84 y 5
\mug de pcDNA3; 3, cotransfección con 5 \mug de pHM134; 4,
cotransfección con 5 \mug de pHM134 y 5 \mug de pcDNAUL84; 5,
contransfección con 5 \mug de pCT21 y 5 \mug de pcDNA3; 6,
contransfección con 5 \mug de pCT21 y 5 \mug de pcDNAUL84. C)
como plásmido reportero se usaron 3 \mug de una construcción
promotor de UL112-luciferasa. Trazos 1,
cotransfección con 10 \mug de pcDNAUL84; 2, cotransfección con 10
\mug de pcDNAUL84; 3, cotransfección con 3 \mug de pHM134 y 7
\mug de pcDNA3; 4, cotransfección con 3 \mug de pHM134, 1 \mug
de pcDNAUL84 y 6 \mug de pcDNA3; 5, cotransfección con 3 \mug de
pHM134, 2 \mug de pcDNAUL84 y 5 \mug de pcDNA3; 6,
cotransfección con 3 \mug de pHM134, 3 \mug de pcDNAUL84 y 4
\mug de pcDNA3; 7, cotransfección con 3 \mug de pHM134, 4 \mug
de pcDNAUL84 y 3 \mug de pcDNA; 8, cotransfección con 3 \mug de
pHM134, 5 \mug de pcDNAUL84 y 2 \mug de pcDNA3; 9,
cotransfección con 3 \mug de pHM134, 6 \mug de pcDNAUL84 y 1
\mug de pcDNA3; 10, cotransfección con 3 \mug de pHM134 y 7
\mug de pcDNAUL84. D) Como construcción reportera se usaron 3
\mug de una construcción potenciador/promotor de
IE-1/2-luciferasa. Trazos: 1,
cotransfección con 10 \mug de pcDNA3; 2, cotransfección con 5
\mug de pcDNA3 y 5 \mug de pcDNAUL84; 3, cotransfección con 5
\mug de pcDNA3 y 5 \mug de pHM134; 4, cotransfección con 5
\mug de pHM134 y 5 \mug de pcDNAUL84.
La figura 5 muestra la inhibición de la
replicación de CMVH tras expresión transitoria de pUL84.
Se transfectaron células U373 con el plásmido de
expresión pcDNAUL84 y se infectaron con CMVH. A continuación se
estudió la expresión de pUL84 y del antígeno viral temprano pUL69
mediante análisis de inmunofluorescencia doble con uso de un
microscopio láser confocal. Esto mostró que en las células que
expresan pUL84 nunca se sintetizó al mismo tiempo pUL69. A)
Detección de pUL84. B) Detección de pUL69. C) superposición de las
figuras A y B.
La figura 6 muestra la inhibición de expresión
génica viral temprana tras expresión estable de pUL84.
Se establecieron líneas celulares U373 que
expresaban de forma estable pUL84. Estas líneas celulares se
infectaron con CMVH y a continuación se analizó la expresión de
proteína mediante inmunofluorescencia indirecta. A a E, línea
celular IXB1, se transfectó con pcDNAUL84 y expresó pUL84; B a F,
línea celular DC1, se transfectó con el vector de clonación pcDNA3,
no expresó pUL84. A y B, detección de pUL84 con ayuda del antígeno
monoclonal M2; C y D, detección del antígeno inmediato
temprano con ayuda de un anticuerpo monoclonal contra la
proteína IE1; E y F, detección del antígeno temprano con ayuda de un
antisuero contra la proteína UL69.
La figura 7 muestra la inhibición de la
replicación de CMVH tras expresión estable de UL84.
Las células U373 que bien eran negativas en UL84
(A a C) o bien expresaban de forma estable pUL84 (D a F) se
infectaron de forma fingida (A y D) o se infectaron con CMVH con una
M.O.I de 2 (B, C, E, F). B y E muestran el efecto citopatógeno
después de 5 días de duración de la infección, C y F después de 23
días de duración de la infección.
La figura 8 muestra la inhibición de la
multiplicación del virus tras infección de líneas celulares que
expresan UL84 con CMVH.
La línea celular negativa en UL84 pRcCMVDC1 y
las líneas positivas en UL84 UL84IXC5 y UL84IXB6 se infectaron con
CMVH con una M.O.I de 0,1. En distintos momentos tras la infección
(0, 3, 4, 7, 10 y 12 días) se recogió sobrenadante del cultivo
celular y se llevó a cabo una valoración de virus mediante
determinación de la "dosis infecciosa en cultivo de tejidos"
(TCID_{50}).
Para el estudio de las propiedades de pUL84 se
amplificó el marco de lectura abierto UL84 (figura 1) con uso del
cebador UL845' (TAAGAATTCATGCCACGCGTCGACCCCAACCTTCGGAAT) y UL843'
(TAATCTAGATCCC
TAGGTACCTTCGAGATCGCCGCAGACCATGGCTAAAGTGAC) con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa y se clonó por los sitios de corte EcoRI y XbaI codificados en los cebadores en el vector pSG424 (Sadowski, I. y M. Ptashne, 1989, A vector for expressing GAL4(1-147) fusions in mammalian cells, Nucleic. Acids. Research 17: 7539). Para el examen de la expresión de pUL84 tras transfección se preparó un fragmento de ADN mediante síntesis química, que codifica para un octapéptido (FLAG^{R}) y a continuación se clonó sobre Kpnl y XbaI en este plásmido (figura 2); este péptido es reconocido por anticuerpos monoclonales y se puede usar como el denominado TAG en fusión con proteínas heterólogas para examinar la expresión de la porción de proteína heteróloga en células eucarióticas. Después de la transfección del plásmido resultante pSG84TAG en células COS7 se podría detectar con ayuda del anticuerpo M2 (compañía Integra Biosciences; Tecnomara Deutschland GmbH) la expresión de la proteína de fusión pUL84::FLAG. Para el refuerzo de la expresión se reclonó a continuación el casete de expresión compuesto por la región de codificación para pUL84::FLAG con escisión con EcoRi y XbaI en el vector pcDNA3 (figura 2). Se usó el plásmido resultante pcDNAUL84 para los demás experimentos.
TAGGTACCTTCGAGATCGCCGCAGACCATGGCTAAAGTGAC) con ayuda de la reacción en cadena de la polimerasa y se clonó por los sitios de corte EcoRI y XbaI codificados en los cebadores en el vector pSG424 (Sadowski, I. y M. Ptashne, 1989, A vector for expressing GAL4(1-147) fusions in mammalian cells, Nucleic. Acids. Research 17: 7539). Para el examen de la expresión de pUL84 tras transfección se preparó un fragmento de ADN mediante síntesis química, que codifica para un octapéptido (FLAG^{R}) y a continuación se clonó sobre Kpnl y XbaI en este plásmido (figura 2); este péptido es reconocido por anticuerpos monoclonales y se puede usar como el denominado TAG en fusión con proteínas heterólogas para examinar la expresión de la porción de proteína heteróloga en células eucarióticas. Después de la transfección del plásmido resultante pSG84TAG en células COS7 se podría detectar con ayuda del anticuerpo M2 (compañía Integra Biosciences; Tecnomara Deutschland GmbH) la expresión de la proteína de fusión pUL84::FLAG. Para el refuerzo de la expresión se reclonó a continuación el casete de expresión compuesto por la región de codificación para pUL84::FLAG con escisión con EcoRi y XbaI en el vector pcDNA3 (figura 2). Se usó el plásmido resultante pcDNAUL84 para los demás experimentos.
Para comprobar si pUL84 puede permitir
independientemente de otras proteínas virales una interacción
específica con la proteína transactivadora IE86 del CMVH, se
transfectaron células COS7 bien sólo con el plásmido de expresión
IE86 pHM121 (Pachter y col. (1993) Analysis of proteins encoded by
IE-regions 1 and 2 of human cytomegalovirus using
monoclonal antibodies generated against recombinant antigens,
Virology 193: 642 a 652) o bien con una combinación de
pHM121 y pcDNAUL84. La transfección se realizó con ayuda del
procedimiento de DEAE-dextrán con uso de 10 \mug
de ADN vector (Winkler y col. (1994) UL69 of human cytomegalovirus,
an open reading frame with homology to ICP27 of herpes simplex
virus, encodes a transactivator of gene expression, J. Virol.
68: 3943 a 3954). A continuación se marcaron las proteínas
celulares mediante adición de "etiqueta
Tran-^{35}S" (ICN, Eschwege) y se analizaron
mediante inmunoprecipitación. Para ello se desprendieron las células
del recipiente de cultivo celular, se sedimentaron y se lisaron
mediante resuspensión e incubación de una hora en 1 ml de un tampón
de Tris/HCl 50 mm, pH 8,0, EDTA 5 mM, NaCl 150 mM,
NP-40 al 0,5%, PMSF 1 mM y 20 mg/ml de aprotinina.
Se incubaron 250 \mul del lisado durante 3 horas a 4ºC con
proteína A-Sepharose (Sigma Deisenhofen) y luego se
centrifugaron a 4000 rpm para la separación de sustancias
adsorbentes no específicas. El anticuerpo monoclonal específico
IE86 2.9.5 (Plachter y col. (1993) Endoteli of proteins encoded by
IE-regions 1 and 2 of human cytomegalovirus using
monoclonal antibodies generated against recombinant antigens,
Virology 193: 642 a 652) se acopló mediante incubación a 4ºC
en tampón de unión (Tris/HCl 100 mM, pH 7,4, NaCl 400 mM) junto con
IgG anti-ratón en proteína
A-Sepharose. El complejo proteína A
Sepharose-anticuerpo se mezcló luego con las
proteínas marcadas radiactivamente y se incubó durante 3 horas a
4ºC. Después de varias etapas de lavado con uso de tampón SNNTE
(Tris/HCl 50 mM, pH 7,4, EDTA 5 mM, NaCl 100 mM, sacarosa al 5%,
NP40 al 1%) se recogió el complejo en tampón de muestra que
contiene SDS para la electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)
y se analizó mediante SDS-PAGE y autoradiografía
(figura 3). Después de la transfección del plásmido de expresión
IE86 pHM121 precipitó el anticuerpo 2.9.5, una proteína con una
masa molecular de 86 kDa, que no estaba presente en las células
transfectadas de forma fingida (figura 3, A, trazos 1 y 2). Sin
embargo si se cotransfectaban las células con los plásmidos pHM121
y pcDNAUL84, se podrían detectar de este modo una proteína más, que
correspondía a pUL84 (figura 3, A, trazo 3). Esto muestra, que pUL84
puede permitir independientemente de otras proteínas virales un
complejo estable con IE86.
Para asegurar y para demostrar adicionalmente
que esta interacción es independiente de las modificaciones
post-translacionales de la proteína IE86, se realizó
un análisis "pull down". Para ello se expresaron
procarióticamente las proteínas IE86 e IE1 del CMVH como fusiones
con glutationa-S-transferasa (GST) y
se purificaron mediante acoplamiento a
glutationa-agarosa (Pharmacia, Friburgo) (Lang y
col., (1995) Functional interaction between the human
cytomegalovirus 86-kilodalton IE2 protein and the
cellular transcription factor CREB, J. Virol., 69: páginas
6030 a 6037). Paralelamente a esto se marcaron radiactivamente la
proteína que se une a TATA TBP, la proteína EI1 del CMVH y la
proteína UL84 con uso del sistema TNT (Promega, Heidelberg) mediante
translación in vitro con adición de
^{35}S-metionina. Las proteínas de fusión GST (100
ng, acoplada a glutationa-agarosa) se incubaron
durante 10 minutos en 200 ml de tampón ELB (NaCl 125 mM, HEPES 50
mM, pH 7,0, NP-40 al 0,1%, PMSF 1 mM, DTT 0,5 mM,
EDTA 0,5 mM) con 1 mg/ml de albúmina de suero bovino. Luego se
añadieron 5 \mul de la proteína de ensayo translacionada in
vitro. Tras una incubación adicional durante 12 horas a 4ºC se
lavaron las proteínas acopladas con agarosa cinco veces con 1 ml de
tampón ELB, se recogieron en tampón de muestra SDS, se calentaron
hasta 95ºC y se analizaron con SDS-PAGE. La
autoradiografía dio que la proteína UL84 translacionada in
vitro se había unido a GST-IE2, mientras que no
se observaba interacción alguna con el GST-IE1
usado como control de especificidad (figura 3, B, trazos 6 y 9).
pUL84 interaccionó con GST-IE2 con aproximadamente
la misma eficiencia que la proteína que se une a TATA TBP, para los
estudios anteriores no se mostró una unión fuerte a IE2 (figura 3,
B, trazos 7 y 9). pUL84 puede interaccionar por tanto
independientemente de modificaciones
post-translacionales con la proteína
IE-2. Otros experimentos
"pull-down" con proteínas UL84 cortas
carboxi-terminales mostraron que un mutante de
deleción, que se había producido mediante escisión con Pvul, era más
eficiente en GST-IE2. Por consiguiente se encuentra
un dominio de interacción de pUL84 en los 180 aminoácidos (AS)
aminoterminales de la proteína que comprende en total 586 AS.
La proteína IE86 es un transactivador fuerte de
promotores homólogos y heterólogos y en esta función es esencial
para la conducción de la fase temprana de la expresión génica viral.
Para estudiar las actividades funcionales de la interacción de IE86
con pUL84, se llevaron a cabo análisis de expresión transitorios con
uso de la línea celular permisiva del CMVH U373 MG. Como reportero
se usó el gen de la luciferasa, antes que los distintos promotores,
como el promotor del virus de inmunodeficiencia humano (promotor de
VIH), que fueron clonados del promotor de UL112 temprano del CMVH o
del potenciador/promotor de IE-1/2 del CMVH. 3
\mug de este plásmido reportero se cotransfectaron con 5 \mug
respectivos de pcDNAUL84 o pHM134 (plásmido de expresión de IE86)
sólo o con una combinación de ambos vectores (Lang y col. (1995)
Functional interaction between the human cytomegalovirus
86-kilodalton IE2 protein and the cellular
transcription factor CREB, J. Virol., in press). La cantidad de ADN
transfectado en total se mantuvo mediante constante mediante adición
de ADN del vector de clonación pcDNA3 hasta una cantidad de ADN del
preparado de transfección de 15 \mug. La transfección se realizó
con uso del procedimiento de DEAE-dextrán (Arit y
col. (1994) Identification of binding sites for the
86-kilodalton IE2 protein of human cytomegalovrus
within an IE2-responsive viral early promoter, J.
Virol. 68: 4117 a 4125). Después de 48 horas de incubación
se renovaron las células en 1 ml de tampón de extracción (fosfato de
potasio 100 mM, pH 7,8, DTT 1 mM) y se lisaron mediante
congelación/descongelación tres veces. Se separaron los detritus
celulares no solubles mediante centrifugación. Se mezclaron luego
iguales cantidades del sobrenadante con 100 \mul de tampón de
reacción (fosfato de potasio 100 mM, pH 7,8, MgSO_{4} 15 mM, ATP 5
mM) y se determinó la actividad de la luciferasa mediante
inyección de 100 \mul de tampón de ensayo con luciferina 1 mM
(Boehringer, Mannheim) con uso de un luminómetro (Berthold,
Wildbad). Cada transfección se repitió al menos tres veces. Si se
cotransfecta la construcción de promotor de VIH con pcDNAUL84 sólo,
no se podría observar ninguna actividad modificada en comparación
con la transfección del vector de clonación pcDNA3; por consiguiente
pUL84 sólo no daría efecto alguno sobre este promotor (figura 4, A,
trazos 1 y 2). La cotransfección del plásmido de expresión IE86
pHM134 condujo a una activación de aproximadamente 60 veces de este
promotor (figura 4, A, trazo 3). Si se usase sin embargo una
combinación de pcDNAUL84 y pHM137, se llegaría a una fuerte
reducción de la transactivación mediada por IE86 del promotor de
VIH (figura 4, A, trazo 4). Este efecto negativo de UL84 era
específico, ya que la transactivación por el transactivador homólogo
del VIH, la proteína tat, no se veía influenciada por la
cotransfección de pcDNAUL84 (figura 4, A, trazos 5 y 6). La
regulación negativa de la transactivación de IE86 no se pudo
observar sólo en el promotor de VIH, sino también en un promotor
temprano del CMVH, el promotor de UL112; también aquí la
contransfección de pcDNAUL84 condujo junto con pHM137 a una
reducción drástica de la activación, que se observó con pHM137 sólo
(figura 4, B, trazos 3 y 4). Este efecto se reveló como dependiente
de la dosis: se usaron cantidades crecientes en
pcDNA-UL84 con una cantidad constante de pHM137, de
modo que se llegó a un refuerzo claro del efecto negativo (figura
4, C, trazos 4 a 10). Además de un efecto de transactivación, la
proteína IE86 tiene también una función autoregulatoria negativa:
puede reprimir su propia expresión, de modo que la actividad del
promotor responsable de ello, el potenciador/promotor de
IE-1/2, se ve influenciado negativamente (Pizzomo y
col. (1990) The IE2 gene products of human cytomegalovirus
especifically down-regulate expression from the
major immediate-early promoter through a target
sequence located near the cap site, J. Virol. 64: 6154 a
6165). Se usó este promotor como fusión con luciferasa en
experimentos de cotransfección, se muestra de este modo que pUL84,
que no eleva la represión provocada por IE86 de este promotor, sino
que incluso la reforzó (figura 4, D, trazos 3 y 4). Por esto pUL84
neutralizó de forma completamente específica la función de
transactivación de IE86 mientras que la función autoregulatoria
negativa se mantiene o incluso se refuerza.
En base al hallazgo anteriormente citado resultó
la hipótesis de que una expresión de pUL84 al comienzo del ciclo de
replicación debería conducir a un aumento del efecto de
transactivación de IE86 y con ello a una inhibición de la
replicación de CMVH. Esto se estudió en primer lugar mediante la
expresión transitoria de pUL84, sobreinfección por CMVH y a
continuación análisis de inmunofluorescencia de la expresión de la
proteína. Se transfectaron células U373 con 10 \mug de pcDNAUL84
con uso del procedimiento de coprecipitación con fosfato de calcio.
Aproximadamente 24 horas después se infectaron las células con CMVH
con un M.O.I (multiplicidad de infección) de 2. Después de otras 60
horas se fijaron las células mediante incubación de 10 minutos en
metanol enfriado con hielo. Siguió luego una coloración doble de las
células para el análisis por inmunofluorescencia: la expresión del
pUL84 expresado transitoriamente se pudo detectar con el anticuerpo
M2 monoclonal de ratón dirigido contra la
FLAG^{R}-TAG (Integra BioSciences, Tecnomara
Deutschland GmbH); la expresión génica viral temprana se analizó
mediante un antisuero preparado en conejos contra la proteína UL69
expresada temprano-tarde (Winkler y col. (1994)
UL69 of human cytomegalovirus, an open reading frame with homology
to ICP27 of herpes simples virus, encodes a transactivator of gene
expression, J. Virol. 68: 3943 a 3954). Los anticuerpos se
diluyeron en tampón PBSo (NaCl 138 mM, KCl 2,7 mM, Na_{2}HPO_{4}
6,5 mM, KH_{2}PO_{4} 1,5 mM) (anticuerpos M2: 1:1000; antisuero
UL69: 1:200) y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC con las
células. Después de lavar tres veces con PBSO_{4} se diluyeron un
anticuerpo cabra-anti-ratón
conjugado con rodamina (TRITC) (Dianova, Hamburgo) y un anticuerpo
cerdo-anti-liebre conjugado con
fluoresceína (FITC) (Dako, Glostrup, Dinamarca) a 1:40 cada uno en
PBSo y se incubaron de nuevo durante 30 minutos a 37º junto con las
células. Después de otras tres etapas de lavado más se conservaron
las células y las células coloreadas específicamente se analizaron
con ayuda de microscopía láser confocal con uso del sistema MRC600
de la compañía Bio-Rad, Munich. A este respecto se
detectaron por separado en primer lugar células coloreadas con
rodamina (coloración rojo, específica de UL84) y fluoresceína
(coloración verde, específica de UL69) (figura 5, A, B) y a
continuación se superponen los dos marcos de fluorescencia (figura
5, C). Como se observa a modo de ejemplo en la figura 5, este
experimento mostró que en las células que sintetizan la UL84 no se
detectaba el antígeno UL69 expresado temprano. Esto fue el primer
indicio de una inhibición de la replicación de CMVH por la expresión
de pUL84.
Para aclarar adicionalmente el efecto
inhibitorio de pUL84 sobre la replicación de CMVH, se establecieron
líneas celulares U373-MG que expresaban de forma
estable pUL84. Para tal fin se transfectaron células U373 con 10
\mug del vector pcDNAUL84 o del vector de clonación pcDNA3, que
contenían ambos el gen Neo como marcador de selección, mediante
coprecipitación con fosfato de calcio. Aproximadamente 48 horas
después de la transfección se añadieron geneticina (500 \mug/ml)
al medio de cultivo celular. Después de aproximadamente 4 semanas de
duración de la selección se habían formado clones celulares que se
aislaron y se subcultivaron en placas de 24 pocillos. A continuación
se probó con ayuda de inmunfluorescencia indirecta y del anticuerpo
monoclonal M2 la expresión génica de pUL84 de este clon celular.
Con ello se llegó a establecer 10 líneas celulares que expresaron la
pUL84 con diferente eficiencia. Las líneas celulares que expresan
fuertemente se usaron para estudios de infección: para ello se
infectaron líneas celulares que expresan pUL84 y líneas
seleccionadas paralelamente, que no sintetizan UL84, con CMVH con un
M.O.I de 2. Aproximadamente 60 horas tras la infección se fijaron
las células mediante tratamiento con metanol y se analizaron por
inmunofluorescencia indirecta. Como se muestra a modo de ejemplo en
la figura 6 para dos líneas celulares, se puede detectar en la línea
IXB1 con ayuda del anticuerpo monoclonal M2 una clara expresión de
UL84, mientras que el DC1 era negativo (figura 6, A, B). La
coloración de las células con un anticuerpo monoclonal contra el
antígeno inmediato temprano IE1 del CMVH dio lugar en ambas líneas
celulares a una fuerte reactividad; esto mostró que el CMVH había
infectado ambas líneas celulares (figura 6, C, D). Sin embargo, si
se usa el antisuero contra la proteína UL69 expresada
temprano-tarde, se podrían observar en la línea
celular DC1 negativa en UL84 señales fuertes, mientras que en la
línea IXB1 positiva en UL84 no se presentaba expresión de antígeno
significativa alguna. Por ello se detuvo en IXB1 mediante la
expresión de UL84 el ciclo de replicación sobre la planicie de la
expresión génica inmediata temprana. Esto se podría confirmar
también en duración prolongada de la infección. Para ello se
infectaron la línea celular IXC5 positiva en UL84 y la línea DC2
negativa con CMVH con un M.O.I de 2 y se valoran en lo que respecta
a sus cambios morfológicos, que son típicos del ciclo de replicación
del CMVH. Después de 5 días de duración de la infección se podría
detectar en la línea CD2 un fuerte efecto citopatógeno (CPE),
mientras que en la línea IXC5 no se reconoce cambio alguno (figura
7, B, E). Después de 23 días de duración de la infección se lisaron
casi todas las células de la línea DC1; para IXC5 ni se pudo
reconocer CPE alguno ni anterior ni posterior (figura 7, C, F).
Para el análisis de la producción de virus se
infectaron las líneas CD1 (ninguna expresión de UL84) así como IXB6
e IXC5 (expresión de UL84) con CMVH con una multiplicidad de la
infección de 0,1/células. Después de distintos tiempos tras la
infección se recogió sobrenadante del cultivo celular y se congeló
hasta el análisis a -80ºC. Para la determinación de la denominada
"dosis infecciosa en cultivo de tejidos" 50 (TCID50) se
sembraron fibroblastos de prepucio humano sobre placas de 96
pocillos (2 x 10^{4} células por pocillo). Al día siguiente, tras
crecimiento de subconfluencia de las células se prepararon series de
dilución de los sobrenadantes infecciosos individuales (10^{-1} –
10^{-9} en diez etapas) y se usaron respectivamente en
preparaciones múltiples para infección de las células. Después de
incubación de 24 horas a 37ºC se fijaron las células para el
posterior análisis con metanol (-20ºC/10 minutos). Para la
detección de la expresión de la proteína inmediata temprana
IE1-pp72 se añadió sobrenadante de cultivo del
anticuerpo monoclonal BS500 (Biotest) sin diluir a las células y se
incubó durante 45 minutos a 37ºC en una cámara húmeda. Después de
etapas de lavado múltiple en PBS se añadió para la detección de la
reacción antígeno-anticuerpo específica un
anticuerpo dirigido contra inmunoglobulina de ratón secundario, que
se acoplaba con peroxidasa (Dako HRP P 0260; diluido a 1:500) y se
incubó en la cámara húmeda durante 45 minutos a 37ºC. Después de
nuevas etapas de lavado se comprobó la presencia de actividad de
peroxidasa mediante la adición de AEC y H_{2}O. A continuación se
determinó en microscopio inverso en la dilución correspondiente el
número de cultivos (pocillos), en los que se detectaba antígeno de
CMVH, y después con el esquema de valoración dado se determinó la
TCID_{50} para las respectivas líneas celulares y los distintos
momentos de tiempo.
| Límite de clases | -9 | -8 | -7 | -6 | -5 | -4 | -3 | -2 | -1 |
| Cultivos inf. | |||||||||
| Media de clases | -8,5 | -7,5 | -6,5 | -5,5 | -4,5 | -3,5 | -2,5 | -1,5 | |
| Aumento | |||||||||
| Productos: media | |||||||||
| de clases x | |||||||||
| aumento del | |||||||||
| número en | |||||||||
| cultivos inf. | |||||||||
| Log TCID 50/100 \mul = suma de productos/número de cultivos individuales por dilución (por ejemplo 4). |
Los resultados de los experimentos se
representan en la figura 8. Tras infección de las líneas celulares
DC1 negativas en UL84 se llegó después de 7 días a la liberación de
virus infeccioso en el sobrenadante del cultivo. Después de 12 días
tras la infección resultó una TCDI_{50} de 10.000. Por contra las
dos líneas celulares IXB6 e IXC5 (expresión de UL84) mostraron una
TCID_{50} que se encontraba dos órdenes de magnitud por debajo.
Además de esto no se encontró en ambos cultivos aumento alguno en la
producción de virus después de 10 y 12 días.
Estos resultados muestran que la expresión de
UL84 en células inhibe la producción de virus infecciosos casi por
completo. Además de esto al contrario que para la línea celular
negativa en UL84 no se mostró aumento significativo alguno de la
producción de virus tras 10 y 12 días. Esto significa que en base a
las variaciones en la expresión de UL84, las células individuales
en las líneas IXB1 e IXB5 son infectadas de forma productiva con
CMVH y se sintetizan pequeñas cantidades de virus que sin embargo
este virus liberado no se puede multiplicar en base al bloqueo de
replicación en la mayoría de las células de la población.
En conjunto estos experimentos muestran por
tanto que pUL84 puede inhibir de forma eficiente la replicación del
CMVH.
El gen que codifica para la proteína UL84 se
puede incorporar a las células diana deseadas con ayuda de vectores
de adenovirus con replicación defectuosa. Los vectores de adenovirus
con replicación defectuosa de este tipo se usaron in vivo,
por ejemplo, para la introducción del producto génico del
retinoblastoma en células musculares de los vasos lisas, para
evitar con ello la generación de restenosis tras PTCA (Chang y col.
(1995) Cytostatic gene therapy for vascular proliferative disorders
with a constitutively active from of the retinoblastoma gene
product, Science 267: 518 a 522). Debido a que el CMVH se
prevé como agente etiológico de este proceso, se puede incorporar
el gen que codifica para UL84 con ayuda de los vectores de
adenovirus mencionados anteriormente en las células. Con ello se
proporciona una posibilidad de intervención terapéutica de la
generación de restenosis.
El sistema de vectores de adenovirus con
replicación defectuosa se usó in vivo e in vitro
igualmente para la incorporación de un gen
alfa-1-antitripsina en células del
epitelio del pulmón (Rosenfeld y col. (1991)
Adenovirus-mediated transfer of a recombinant alpha
1-antitrypsin gene to the lung epithelium in
vivo, Science 252: 431 a 434). En la pneumonía
condicionada por CMVH se infectan especialmente las células del
epitelio. La introducción del gen de UL84 con ayuda de los vectores
anteriormente descritos conduce por tanto al efecto terapéutico
deseado.
Se describieron vectores víricos
adeno-asociados por parte de McLaughlin y col.
(1988) Adeno-associated virus general transduction
vectors: analysis of proviral structures, J. Virol. 62: 1963
a 1973. Estos vectores tienen la ventaja de la transferencia
estable de información genética en células diana, ya que estos se
integran en el genoma celular.
Tales vectores se usaron, por ejemplo, para la
transferencia de un gen de la gamma-globulina humana
a células madre hematopoyéticas (Millar y col. (1994) Recombinant
adeno-associated virus
(rAAv)-mediated expression of a human
gamma-globin gene in human
progenitor-derived erythroid cells, Proc. Natl.
Acad. Sci. Estados Unidos 91: 10183 a 10187). Las
enfermedades inducidas por CMV representan un problema considerable
especialmente tras transplantes de médula ósea. Las células
sanguíneas y sus células precursoras son un órgano diana de la
replicación del CMV e intervienen de forma predominante en la
diseminación del virus. La incorporación de UL84 en las células
madre de la médula ósea con ayuda de los vectores víricos
adeno-asociados anteriormente mencionados representa
una forma de realización adicional de la presente invención.
Los vectores víricos
adeno-asociados (vectores AAV) se pueden usar
también para la incorporación de genes en células
post-mitóticas como, por ejemplo, tejidos neuronales
(Kaplitt y col. (1994) Long-term gene expression and
phenotypic correction using adeno-associated virus
vectors in the mammalian brain, Nat. Genet. 8: 148 a 154). El
CMV infecta sobre todo en SIDA y tras infección prenatal de
distintas regiones del sistema nervioso central. En especial se
evidencia por tanto como prometedora una incorporación intraocular
de UL84 con vectores adeno-asociados en retinitis,
ya que aquí la terapia medicamentosa actual no da resultados
exitosos a largo plazo.
Los sistemas de vectores retrovirales, de forma
similar a los vectores víricos adeno-asociados,
ofrecen la ventaja de la integración y son de utilidad para un
amplio espectro de células (excepto células
post-mitóticas) (Samons y col. (1993) Targeting of
retroviral vectors for gene therapy, Hum. Gene Ther. 4: 129 a
141). Los sistemas de vectores retrovirales se pueden usar para la
transferencia de información genética en células madre
hematopoyéticas o células del tracto gastrointestinal (Bagnis y col.
(1994) Retroviral transfer of the nlsLacZ gene into human CD34+ cell
populations and into TF-1 cells: feature prospects
in gen therapy, Hum. Gen. Ther. 5: 1325 a 1333; Yoshida y
col. (1995) Retrovirally transmitted gene therapy for gastric
carcinoma using herpes simples virus thymidine kinase gene, Cancer
75: 1467 a 1471). Los sistemas de vectores retrovirales ahí
descritos se pueden usar también para la transferencia de UL84.
La transferencia con liposomas se usó
especialmente para la introducción de genes en células epiteliales
del pulmón y vasos (Alton y col. (1993)
Non-invasive liposome-mediated gene
delibery can correct the ion transport defect in cystic fibrosis
mutant mice, Nat. Genet. 5: 135 a 142; Canonico y col. (1994)
Aerosol and intravenous transfection of human alpha
1-antitrypsin gene to lungs of rabbits, Am. J.
Respir. Cell. Mol. Biol. 10: 24 a 29; Canonico y col. (1994)
No lung toxicity after repeated aerosol or intravenous delivery of
plasmad-cationic complexes, J. Appl. Physiol.
77: 415 a 419; de Leyen y col. (1995) Gene therapy inhibiting
neointimal vascular lesion: in vivo transfer of endothelial
cell nitric oxide synthase gene, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados
Unidos 92: 1137 a 1141). Especialmente ventajosa podría ser
aquí la aplicación por inhalación en enfermedades del pulmón.
Con ayuda de la técnica dada a conocer en las
referencias bibliográficas citadas se puede someter a terapia la
pneumonía inducida por CMV. Esta técnica se puede usar también para
la introducción de UL84 en procesos completamente localizados como,
por ejemplo, en úlceras de la piel que son provocadas por CMVH, o
úlceras gastrointestinales que son causadas por CMVH.
En los sistemas de vectores indicados es posible
la incorporación de promotores específicos del tipo celular, de modo
que se puede conseguir una expresión pretendida de UL84 en
determinadas células.
En el marco de la presente invención se pueden
llegar a usar también otros sistemas de transferencia o
modificaciones de los sistemas de transferencia anteriormente
descritos con más detalle. Por ejemplo se pueden usar liposomas
combinados con virus Sendai.
(1) DATOS GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Behringwerke Aktiengesellschaft
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Emil-von-Behring-Str. 76
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- POBLACIÓN: Marburg
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 35041
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 06421-39-2205
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 06421-39-4558
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- DESIGNACIÓN DE LA INVENCIÓN: Medicamento que contiene al menos una de la proteína UL84 del citomegalovirus, uso de polipéptidos que se corresponden con la secuencia de aminoácidos de la proteína UL84 y procedimiento para la introducción...
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- AJUSTE DE LECTURA DEL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- SOPORTE DE DATOS: disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- EQUIPO INFORMÁTICO: PC Compatible de IBM
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPA)
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- DATOS DEL SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITANTE: DE 19527129.7
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 25 de Julio de 1995
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE ID SEC Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: hebra simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: genoma-ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: Si
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAAGAATTCA TGCCACGCGT CGACCCCAAC CTTCGGAAT
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS DE ID SEC Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 54 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- FORMA DE HEBRA: hebra simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: genoma-ADN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: Si
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTISENTIDO: No
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTAATCTAGAT CCCTAGGTAC CTTCGAGATC GCCGCAGACC ATGGCTAAAG TGAC
\hfill54
Claims (8)
1. Medicamento, caracterizado porque
a) comprende un polipéptido con una secuencia
que comprende al menos los 180 aminoácidos
N-terminales de la proteína UL84 del
citomegalovirus, o
b) comprende una secuencia homóloga al menos en
el 80% a la secuencia del polipéptido de la parte
a) al menos el 80% de secuencia homóloga.
2. Medicamento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el polipéptido se compone de los 180
aminoácidos N-terminales de UL84 o una secuencia con
al menos el 80% de homología con estos.
3. Medicamento según la reivindicación 2,
caracterizado porque el polipéptido se compone de los 180
aminoácidos N-terminales de UL84.
4. Medicamento según la reivindicación 1,
caracterizado porque el polipéptido se compone de la
secuencia de codificación de UL84 completa o una secuencia con al
menos el 80% de homología con esta.
5. Medicamento según la reivindicación 4,
caracterizado porque el polipéptido se compone de la
secuencia de aminoácidos de UL84 completa.
6. Medicamento según una de las reivindicaciones
1 a 4, caracterizado porque la secuencia de UL84 se
corresponde con la representación de la figura 1.
7. Polipéptido según la definición de las
reivindicaciones 1 a 6 para el uso como medicamento.
8. Uso de un polipéptido según la definición
de las reivindicaciones 1 a 6 en la preparación de un medicamento
para la profilaxis o tratamiento de una infección de citomegalovirus
humano.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19527129A DE19527129A1 (de) | 1995-07-25 | 1995-07-25 | Arzneimittel enthaltend wenigstens einen Teil des UL84-Proteins des Cytomegalovirus, Verwendung von Polypeptiden entsprechend der Aminosäuresequenz des UL84-Proteins und Verfahren zur Einführung von UL84 in Zielzellen |
| DE19527129 | 1995-07-25 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2258773T3 true ES2258773T3 (es) | 2006-09-01 |
Family
ID=7767728
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES96909160T Expired - Lifetime ES2258773T3 (es) | 1995-07-25 | 1996-04-01 | Medicamento que contiene al menos una parte de la proteina ul84 del citomegalovirus, uso de polipeptidos que se corresponden con la secuencia de aminoacidos de la proteina ul84 y procedimiento para la introduccion de ul84 en celulas diana. |
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