JP2008528020A - 核酸構築物 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図16
Description
(i)(a)hCMV前初期プロモーター配列;
(b)hCMV主要前初期遺伝子のエクソン1、及びエクソン2の少なくとも一部;並びに
(c)hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられる異種イントロン;
を含むキメラプロモーター配列、
(ii)キメラプロモーターに機能し得るように連結されたコード配列であって、インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン(HA)抗原、その免疫原性断片、又は前記抗原若しくは断片と少なくとも80%のアミノ酸相同性を有する前記抗原若しくは断片の免疫原性バリアントをコードする前記コード配列、
(iii)HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、又はHSV 2gD型抗原配列由来であって、キメラプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列、並びに
(iv)HBsAg配列の3’非翻訳領域(UTR)由来、又はサルCMV前初期遺伝子配列の3’UTR由来であって、キメラプロモーターに機能し得るように連結され、かつコード配列の下流にあるエンハンサー配列を含んでなる前記核酸構築物を提供する。
(i)(a)hCMV前初期プロモーター配列;
(b)hCMV主要前初期遺伝子のエクソン1、及びエクソン2の少なくとも一部;並びに
(c)hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられる異種イントロン;
を含むキメラプロモーター配列、並びに
(ii)キメラプロモーターに機能し得るように連結されたコード配列であって、インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン(HA)抗原、その免疫原性断片、又は前記抗原若しくは断片と少なくとも80%のアミノ酸相同性をもつ前記抗原若しくは断片の免疫原性バリアントをコードする前記コード配列、を含んでなる前記核酸構築物を提供する。
(a)hCMV前初期プロモーター配列;
(b)hCMV主要前初期遺伝子のエクソン1、及びエクソン2の少なくとも一部;並びに
(c)hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられる異種イントロン;
を含む、前記核酸構築物を提供する。
(a)HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、又はHSV 2gD型抗原配列由来であって、かつキメラプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列、及び/又は
(b)HBsAg配列の3’非翻訳領域(UTR)、若しくはサルCMV前初期遺伝子配列の3’UTR由来であって、キメラプロモーターに機能し得るように連結され、かつコード配列の下流に位置するエンハンサー配列を含むことができる。
(a)HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、又はHSV 2gD型抗原配列由来であって、コード配列、及び当該コード配列とは異種のプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列;及び/又は
(b)コード配列の3’側エンハンサー配列で、かつコード配列に機能し得るように連結された3’側エンハンサー配列であって、該エンハンサー配列はHBsAg配列の3’UTR、若しくはサルCMV前初期遺伝子配列の3’UTR由来で、かつコード配列が3’エンハンサー配列とは異種であるエンハンサー配列を含む前記核酸構築物を提供する。
(i)(a)hCMV前初期プロモーター配列;
(b)hCMV主要前初期遺伝子のエクソン1及び少なくともエクソン2の一部;並びに
(c)hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられる異種イントロンを含んでなるキメラプロモーター配列;並びに
(ii)キメラプロモーターと機能し得るように連結されるコード配列挿入用のクローニング部位;並びに
(iii)(a)HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、若しくはHSV 2gD型抗原配列に由来し、キメラプロモーターと機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列;及び/又は
(b)HBsAg配列の3’非翻訳領域(UTR)、若しくはサルCMV前初期遺伝子配列の3’UTRに由来し、キメラプロモーターと機能し得るように連結されたエンハンサー配列であって、そのエンハンサー配列がクローニング部位の下流にある、前記エンハンサー配列;
を含んでなる核酸構築物を提供する。
(i)プロモーター配列;
(ii)HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、又はHSV 2gD型抗原配列に由来する非翻訳リーダー配列;並びに
(iii)(i)及び(ii)に機能し得るように連結されたコード配列;
を含んでなる核酸構築物であって、前記コード配列は非翻訳リーダー配列とは異種である、前記核酸構築物を提供する。
(i)プロモーター配列;
(ii)プロモーター配列(i)に機能し得るように連結されたコード配列;及び
(iii)コード配列(ii)の3’側エンハンサー配列で、かつコード配列(ii)に機能し得るように連結された3’側エンハンサー配列;
を含んでなる核酸構築物であって、エンハンサー配列(iii)がHBsAg配列の3’UTR又はサルCMV前初期遺伝子配列の3’UTRに由来し、コード配列(ii)は3’側エンハンサー配列とは異種である前記核酸構築物を提供する。
(a)HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、若しくはHSV 2gD型抗原配列由来であって、コード配列及び当該コード配列とは異種のプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列;並びに/又は
(b)コード配列の3’側エンハンサー配列で、かつコード配列に機能し得るように連結された3’側エンハンサー配列であって、該エンハンサー配列はHBsAg配列の3’UTR由来、若しくはサルCMV前初期遺伝子配列の3’UTR由来であり、かつコード配列が3’エンハンサー配列とは異種であるエンハンサー配列をさらに含む前記核酸構築物を提供する。
(a)hCMV前初期プロモーター配列;
(b)hCMV主要前初期遺伝子のエクソン1及びエクソン2の少なくとも一部;並びに
(c)hCMV主要前初期遺伝子のイントロンAの代わりに与えられる異種イントロン;
を含んでなる前記配列を提供する
本発明はまた、以下のものを提供する。すなわち、
−哺乳動物細胞において目的のインフルエンザポリペプチドの発現を得るための方法であって、前記細胞に本発明の核酸構築物、核酸構築物の集団、又は被覆粒子を移入することを含んでなる前記方法、
−粒子を介したデリバリーデバイスによる送達に適した被覆粒子であって、ポリペプチドをコードするコード配列を含む本発明の核酸構築物で被覆された担体粒子を含んでなる被覆粒子、
− 被覆粒子を含んでなる粒子を介したデリバリーデバイス用の投薬容器、
− 被覆粒子を充填した粒子を介したデリバリーデバイス、
− 本発明の被覆粒子の有効量を被験体に投与することを含む核酸免疫付与の方法、
− 本発明の核酸構築物、又は本発明の核酸構築物の集団を、製薬上許容される担体若しくは賦形剤と共に含む医薬組成物、
− 本発明の核酸構築物、本発明の核酸構築物の集団、又は本発明の被覆粒子を含んでなるワクチン組成物である。
他に特に定めない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は全て、本発明の属する技術分野の当業者に広く理解されるものと同じ意味を持つ。本明細書に記載の方法及び材料と類似した、又は同等の多くの方法及び材料を、本発明の実施に際して使用することができるが、好ましい材料及び方法は本明細書に記載されている。
− 糖尿病、免疫抑制、免疫不全症、鎌状赤血球貧血、及び/又は腎臓病等の慢性的病気を伴った患者;
− 少なくとも50歳、好ましくは少なくとも60歳、より好ましくは少なくとも65歳、より一層好ましくは少なくとも75歳、そしてさらに好ましくは少なくとも80歳の患者;
− 2歳未満の子供、特に6〜23ヶ月、例えば18ヶ月未満の子供;
− 長期アスピリン療法を受けている患者、特に6ヶ月〜18歳の者;
− 妊婦、特にインフルエンザシーズン期間に妊娠2〜3ヶ月に入る妊婦;
− 養護施設又は長期介護施設の住人;並びに/あるいは
− 上記いずれかの介護福祉士、又はそれらの者と通常接触しそうな人。
本発明は、宿主細胞において異種コード配列、特に抗原をコードする遺伝子の効率的な発現を可能にする、核酸構築物に関する。構築物は、いくつかの例で、一以上のアジュバントポリペプチドを発現することができる。さらに具体的には、本発明は、キメラプロモーター配列及びクローニング部位を含んでなる核酸構築物、又は、実施形態によっては、基本的にキメラプロモーター配列及びクローニング部位からなる核酸構築物を提供する。コード配列がクローニング部位に挿入される場合、そのコード配列は機能し得るようにキメラプロモーターと連結する。本発明はまた、クローニング部位に挿入されたコード配列を有する構築物を提供する。コード配列は、本明細書で言及した、いずれかのポリペプチド、具体的には抗原、特に本明細書に記載のいずれかの抗原及びアジュバントポリペプチドをコードすることができる。
(a)hCMV前初期プロモーター配列;
(b)hCMV主要前初期遺伝子のエクソン1、及び少なくともエクソン2の一部;並びに
(c) hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられる異種イントロン。
(i)天然のhCMV前初期プロモーター配列;
(ii)機能的に相同な上記のバリアント;又は
(iii)(i)若しくは(ii)の機能性断片。
(i)配列番号1、配列番号54のヌクレオチド903〜1587、配列番号61のヌクレオチド1815〜1935、配列番号61のヌクレオチド1948〜2632、配列番号62のヌクレオチド1002〜1686、及び/若しくは配列番号62のヌクレオチド2624〜3308のヌクレオチド配列、
(ii)(i)の機能性バリアントであって、(i)の一以上の配列と少なくとも80%のヌクレオチド配列相同性を有する前記バリアント、並びに/又は
(iii)(i)若しくは(ii)の機能性断片。
(i)天然型エクソン配列、典型的にはエクソン1、及び(全体若しくは一部の)エクソン2;
(ii)機能性のある(i)の相同バリアント;又は
(iii)(i)若しくは(ii)の機能性フラグメント。
(i)配列番号2のヌクレオチド配列、配列番号54のヌクレオチド1588〜1718、配列番号61のヌクレオチド1684〜1814、配列番号61のヌクレオチド2633〜2763、配列番号62のヌクレオチド1687〜1817、及び/若しくは配列番号62のヌクレオチド3309〜3439のヌクレオチド配列、
(ii)(i)の配列と少なくとも80%のヌクレオチド配列相同性を有する一以上の(i)の機能性バリアント、並びに/又は
(iii)(i)若しくは(ii)の機能性断片。
(i)天然のイントロン;
(ii)(i)の機能性相同バリアント;又は
(iii) (i)又は(ii)の機能性断片。
(i) 配列番号3;
(ii) (i)の機能性相同バリアント;又は
(iii) (i)又は(ii)の機能性断片。
(i)配列番号3のヌクレオチド配列、配列番号54のヌクレオチド1725〜1857、配列番号61のヌクレオチド1545〜1677、配列番号61のヌクレオチド2770〜2902、配列番号62のヌクレオチド1824〜1956、及び/又は配列番号62のヌクレオチド3446〜3578のヌクレオチド配列;
(ii)一以上の(i)の配列と少なくとも80%のヌクレオチド配列相同性を有する(i)の機能性バリアント;並びに/或いは
(iii)(i)又は(ii)の機能性断片。
(i)配列番号4のヌクレオチド配列、若しくは配列番号54のヌクレオチド903〜1857のヌクレオチド配列;
(ii)(i)の配列と少なくとも80%のヌクレオチド配列相同性を有する(i)の機能性バリアント;及び/又は
(iii)(i)若しくは(ii)の機能性断片を含む。
(i) 天然のポリA配列;
(ii) (i)の機能性相同バリアント;又は
(iii) (i)又は(ii)の機能性断片。
(i)配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号54のヌクレオチド4243〜4373、配列番号61のヌクレオチド906〜1038、配列番号61のヌクレオチド4375〜4050、及び/若しくは配列番号62のヌクレオチド2463〜2593のヌクレオチド配列;
(ii)一以上の(i)の配列と少なくとも80%のヌクレオチド配列相同性を有する(i)の機能性バリアント;並びに/又は
(iii)(i)若しくは(ii)の機能性断片。
(i) 天然の非翻訳リーダー配列;
(ii) (i)の機能性相同バリアント;又は
(iii) (i)又は(ii)の機能性断片。
(i)配列番号5、配列番号6、配列番号7、若しくは配列番号54のヌクレオチド1864〜1984のヌクレオチド配列;
(ii)(i)の配列と少なくとも80%のヌクレオチド配列相同性を有する(i)の機能性バリアント;及び/又は
(iii)(i)若しくは(ii)の機能性断片。
(i) 天然エンハンサー;
(ii) (i)の機能性相同バリアント;又は
(iii) (i)若しくは(ii)の機能性断片。
(i)配列番号8、配列番号9、配列番号54のヌクレオチド3699〜4231、配列番号61のヌクレオチド3831〜4363、及び/若しくは配列番号62のヌクレオチド4507〜5038のヌクレオチド配列;
(ii)一以上の(i)の配列と少なくとも80%のヌクレオチド配列相同性を有する(i)の機能性バリアント;並びに/又は
(iii)(i)若しくは(ii)の機能性断片。
(i) プロモーター配列;
(ii) HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列又はHSV タイプ 2gD抗原配列に由来する非翻訳リーダー配列;及び
(iii) (i)及び(ii)と機能し得るように連結されたコード配列であって、そのコード配列が非翻訳リーダー配列に対して異種性である、前記コード配列。
(i) プロモーター配列;
(ii) プロモーター配列(i)に機能し得るように連結されたコード配列;及び
(iii) コード配列(ii)の3'側に、機能し得るように連結されたエンハンサー配列;
上記において、エンハンサー配列(iii)は、HBsAg配列の3'UTR、又はサルCMV前初期遺伝子配列の3'UTRに由来し、コード配列(ii)は、エンハンサー配列に対して異種性である。
(i) 天然シグナルペプチド配列;
(ii) シグナルペプチド活性を保持する、(i)の相同バリアント;又は
(iii) シグナルペプチド活性を保持する、(i)若しくは(ii)の断片。
(a) hCMV前初期プロモーター配列;
(b) hCMV主要前初期遺伝子のエクソン1、及び少なくともエクソン2の一部;並びに
(c) hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられる異種イントロン、
を含んでなり、一方のキメラプロモーターに機能し得るように連結されたコード配列はLTAサブユニットをコードし、もう一方に結合したコード配列はLTBサブユニットをコードする。したがって、この構築物は2つのサブユニットをいずれも発現することができる。好ましくは:
− 各プロモーターの異種イントロンはラットインスリン遺伝子イントロンA配列である;
− 各LTサブユニットをコードする配列は、HBV pre-S2の5'UTRに機能し得るように連結されている;及び/又は
− LTをコードする配列は、ウサギβグロビン遺伝子ポリアデニル化配列に機能し得るように連結される。
(i)配列番号14で提供されるpPJV7563ベクターの配列;
(ii)(i)の配列と少なくとも60%の配列相同性をもつ配列。
(i)配列番号14で提供されるpPJV7563ベクターの配列;
(ii)(i)の配列と少なくとも60%の配列相同性をもつ配列。
− 配列番号54で提供されるpPJV1671ベクターの配列、又はその配列と少なくとも60%の配列同一性を持つ配列、
− 配列番号59で提供されるpPML7789ベクターの配列、又はその配列と少なくとも60%の配列同一性を持つ配列、
− 配列番号61で提供されるpPJV2012ベクターの配列、又はその配列と少なくとも60%の配列同一性を持つ配列、
− 配列番号62で提供されるpPJV7789ベクターの配列、又はその配列と少なくとも60%の配列同一性を持つ配列。
(a)HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、若しくはHSV 2gD型抗原配列由来であって、前記構築物のコード配列、及び当該コード配列とは異種のプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列;並びに/又は
(b)前記構築物のコード配列の、かつコード配列に機能し得るように連結された3’側エンハンサー配列であって、HBsAg配列の、又は又はサルCMV前初期遺伝子配列の3’ UTR非翻訳領域(UTR)由来で、かつコード配列が3’エンハンサー配列と異種であるエンハンサー配列。
比較発現アッセイ
エレメントの有用性についての適切なテストは、エレメントがポリペプチドの発現で示す効果を測定するものである。好ましい例で、ポリペプチドを、インフルエンザ抗原、そのバリアント、又はいずれかの断片とすることができる。エレメントの有用性を調べるための比較の基準は、「基本ベクター」であり、通常(特に明記しない限り)、コード配列の発現を駆動するように配置された、hCMVプロモーター、hCMVエクソン1、hCMVエクソン2の9塩基、HBV preS2由来の5'UTR、及びウサギβグロビンポリアデニル化領域を有するプラスミドである。一般的に、基本ベクターは、pPJV7384、pPJV7401、pPJV7450又はpPJV7533である。いくつかの場合で、上記のエレメントを有する本明細書に記載したいずれかのベクターを基本ベクターとして使用することができる。ある例では、pPJV1671を基本ベクターとして使用することができる。pPJV2012、pPJV7788、及びpPML7789もまた、基本ベクターとして使用できる。
発現するポリペプチドが抗原である場合、さらなるテストを行い、機能的な、又は特に好ましい構築エレメントを同定することができる。特に、このようなテストは、抗原が、例えばインフルエンザ抗原、その断片、又はいずれかのバリアントである場合に、行うことができる。アッセイでは、免疫応答に対するエレメントの効果を、供試生物に発現ベクターを送達した後に測定する。抗原に対する抗体レベルは、免疫応答を判断する最も簡単な方法である。マウス群に基本ベクター、又は上記のように構築されたテストベクターをワクチン接種する。適当な時間の後、血清を採取し、抗体レベルを分析する。
下記は、本発明を実施するための具体的な実施形態の実施例である。実施例は説明のためにのみ提供されるのであって、決して本発明の範囲を限定するためのものではない。
標準的なPCR条件
ベクターの構築に使用する標準的なPCR条件は、下記の通りとした:1x PCR コア バッファー w/ 1.5mM MgCl2(Promega Corporation, Madison, WI)、0.400μM 各プライマー、200μM 各dNTP (USB, Inc, Cレベルand, OH)、2.5μ Taqポリメラーゼ(Promega Corporation, Madison, WI)、1.0 ng テンプレートDNA、水で100μlとし、ミネラルオイル(Aldrich Chemical, Inc, Milwaukee, WI)でおおう。PTC-200サーモサイクラー(MJ Research, Inc, Waltham, MA)をプログラムして以下の型どおりの操作を行った:95℃にて4分、(95℃にて1分/55℃にて1分15秒/72℃にて1分)を30サイクル、72℃にて10分、4℃に保持。QIAquick PCR Purification キット (Qiagen Inc, Valencia, CA)を用いて増幅産物をPCR反応液から取り出した後、制限酵素(New England Biolabs, Beverly, MA)で切断した。
HBsAg発現のために、多数のプラスミド発現ベクターを構築した。
(i) hCMV前初期プロモーター配列、hCMV主要前初期遺伝子の第1のエクソン、第1のイントロン、及び部分的な第2のエクソン、フランキング領域(HBV preS2 5'UTR由来の配列、及び3'転写後応答エレメント)を有するHBsAgコード配列、並びにウシ成長ホルモンポリアデニル化領域(BGHpA)を含有するpWRG7128(非特許文献9)。
pWRG7128は、JF93(配列番号15)及びF110(配列番号16)を用いて標準的な条件でPCR増幅を行い、Sal1及びBamH1で切断して、CMVプロモーター、エクソン1、及びエクソン2の一部の配列を含有する挿入断片を単離した。pAM6(ATCC, Mannassas, VA)を、BamH1及びBstX1で切断して、HBsAgの5'UTR及び約70%のHBsAgコード領域を含有する挿入断片を単離した。pJV7284をSal1及びBstX1で切断して、ベクター断片を生成し、その断片内に2つの挿入断片を結合して、pJV7293を得た。
pPJV7293をXho1及びXba1で切断して、CMVプロモーター/エクソン、並びにHBsAgコード配列の5'末端とともに5'UTRを含有する挿入断片を生成した。pWRG7128をXba1及びBcl1で切断して、HBsAgコード配列の大部分、及び3'UTRを含有する挿入断片を生成した。pPJV7284をXho1及びBgl2で切断して、ベクター断片を生じ、それに2つの挿入断片を結合して、結果としてpPJV7382を得た。
プラスミドp5'rInsから、プライマーGW150(配列番号19)及びJF255(配列番号20)を用いて、ラットインスリンイントロンA(RIA)をPCR増幅した。PCR産物をBamH1で切断し、BamH1で直鎖状としたpPJV7382に挿入して、pPJV7389を得た。
pPJV7384をBstX1及びEcoR1で切断して、HBsAgコード領域の3'末端及びRBGpAを含有する挿入断片を生成した。pPJV7389をBstX1及びEcoR1で切断してベクター断片を生成し、それに挿入断片を結合して、pPJV7387が得られた。
HSVgDの発現のために、多数のプラスミド発現ベクターが構築された。
(a) HBsAgコード配列を、ATG開始コドンのすぐ下流でインフレームのNhe1と置き換え、続いてHBV Enhのすぐ5'側にBamH1部位を有するstuffer断片がある、pWRG7284(pPJV7284)の誘導体である、pPJV7334。
HSV2 gDに対するコード領域を、ウイルスDNAストック(Advanced Biotech, Inc, Columbia, MD)から、プライマーDS1(配列番号21)及びDA1(配列番号22)を用いてPCR増幅し、Nhe1及びEcoR1で切断して、挿入断片を生成した。pWRG7202をNhe1及びEcoR1で切断してベクター断片を生じ、それに前記挿入断片を結合して、pPJV7391が得られた。
pPJV7392のイントロンのない形を、下記のように構築した。pPJV7384をHindIII及びNde1で切断し、カナマイシン耐性遺伝子の5'末端及びCMVプロモーターを含有する挿入断片を単離した。pPJV7384をNde1及びSsp1で切断して、CMVプロモーターの3'末端、CMVエクソン1/2及びHBsAg由来5'UTRの5'末端を含有する挿入断片を単離した。これらの挿入断片を、Hind3-Ssp1断片を除去したpPJV7392に挿入し、pPJV7399が得られた。
pPJV7392のRIA型を、下記のように構築した。pPJV7384をHindIII及びNde1で切断して、カナマイシン耐性遺伝子の5'末端及びCMVプロモーターを含有する挿入断片を単離した。pPJV7387をNde1及びSsp1で切断して、CMVプロモーターの3'末端、CMVエクソン1/2(一部)、RIA及びHBsAg由来5'UTRの5'末端を含有する挿入断片を単離した。これらの挿入断片を、Hind3-Ssp1断片を除去したpPJV7392に挿入し、pPJV7400が得られた。
pPJV7399の3'UTRを欠いた形を、下記のように構築した。pPJV7391をBsp120I及びBgl2で切断して、HSV2 gD遺伝子の3'末端を含有する挿入断片を単離した。pPJV7284をBgl2及びEcoR1で切断して、RBGpAシグナルを単離した。これらの挿入断片を、Bsp120I-EcoR1断片を除去したpPJV7399に挿入し、その結果pPJV7401を得た。
pPJV7400の3'UTRを欠いた形を、下記のように構築した。pPJV7391をBsp120I及びBgl2で切断して、HSV2 gD遺伝子の3'末端を含有する挿入断片を単離した。pPJV7284をBgl2及びEcoR1で切断して、RBGpAシグナルを単離した。これらの挿入断片を、Bsp120I-EcoR1断片を除去したpPJV7400に結合し、その結果pPJV7402が得られた。
(a) pPJV7450 (CMV(イントロンなし)、HBsAg 5'UTR及びRBGpA)
Flu M2のコード領域を、プラスミドpFL-M2(Joel Haynes, pPJV)から、プライマーJF301(配列番号23)及びJF302(配列番号24)を用いてPCR増幅し、Nhe1及びBgl2を用いて切断し、挿入断片を生成した。pPJV7401をNhe1及びBgl2を用いて切断し、ベクター断片を生成し、それに挿入断片を結合してpPJV7450を得た。
3'UTR断片を、pPJV7389から、プライマーJF84(配列番号25)及びJF225(配列番号26)を用いてPCR増幅し、Bsp120Iで切断し、T4 DNAポリメラーゼで埋め込んで、Bgl2リンカー(カタログ番号1036、New England Biolabs)をつける。その後、断片をBgl2及びEcoR1で切断し、HBsAgの3'UTR、及びRBGpA領域を含有する挿入断片を単離した。pPJV7450をBgl2及びEcoR1で切断して、ベクター断片を生成し、それに挿入断片を結合して、pPJV7452が得られた。
pPJV7450のRIA含有型を下記のように構築した:pPJV7389をBamH1で切断して、RIAを含有する挿入断片を単離した。pPJV7450をBamH1で切断してベクター断片を生じ、それに挿入断片を結合して、その結果pPJV7458が得られた。
HBsAgの3'UTRを含有する形のpPJV7458を、下記のように構築した:pPJV7452をBgl2及びEcoR1で切断して、HBsAg 3'UTR及びRBGpAを含有する挿入断片を生成した。pPJV7458をBgl2及びEcoR1で切断して、ベクター断片を生じ、それに挿入断片を結合して、pPJV7468を得た。
(a) pPJV7488 (CMV(イントロンなし)、HBsAg 3’UTR、HBsAg 5'UTR及びRBGpA)
CMV-β-gal(Clontech)を、プライマーJF335(配列番号27)及びJF336(配列番号28)を用いてPCR増幅し、Nhe1及びBgl2で切断して、βガラクトシダーゼをコードする挿入断片を単離した。pPJV7452をNhe1及びBgl2で切断してベクター断片を生成し、それに挿入断片を結合して、pPJV7488を得た。
pPJV7450をBgl2及びEcoR1で切断し、RBGpAを含有する挿入断片を単離した。pPJV7488をBgl2及びEcoR1で切断して、ベクター断片を生成し、それに挿入断片を結合して、結果としてpPJV7533を得た。
pPJV7530(実施例5を参照されたい)をXho1及びBamH1で切断し、CMVプロモーターからRIAまでを含有する挿入断片を単離した。pPJV7488をXho1及びBamH1で切断してベクター断片を生じ、それに挿入断片を結合して、結果としてpPJV7551を得た。
pPJV7530をXho1及びBamH1で切断し、CMVプロモーターからRIAまでを含有する挿入断片を単離した。pPJV7533をXho1及びBamH1で切断してベクター断片を生じ、それに挿入断片を結合して、結果としてpPJV7552を得た。
(a) pPJV7496
pPJV7389をプライマーJF357(配列番号29)及びJF365(配列番号30)でPCR増幅し、T4 DNAポリメラーゼで処理して末端を平滑化し、Sal1で切断して、カナマイシン耐性をコードする挿入断片を単離した。pPJV7389をAva1で切断し、T4 DNAポリメラーゼで処理して末端を平滑化し、さらにSal1で切断してベクター断片を単離し、それに挿入断片を結合して、pPJV7496を得た。
pPJV7389をプライマーJF393(配列番号31)及びJF406(配列番号32)でPCR増幅し、Bgl2及びBamH1で切断して、配列内Nhe1部位を欠いたRIAを含有する挿入断片を単離した。pPJV7496をBamH1で切断して、ベクター断片を調製し、それに挿入断片を結合して、pPJV7530を得た。
pPJV7468をBamH1及びEcoR5で切断して、M2、及びHBV 3'ENHの一部を含有する挿入断片を単離した。pPJV7530をBamH1及びEcoR5で切断して、ベクター断片を調製し、それに挿入断片を結合して、pPJV7549を得た。
プライマーJF256(配列番号33)及びJF257(配列番号34)をアニールして、複数のクローニング部位からなる挿入断片を調製した。pPJV7549をNhe1及びBgl2で切断してベクター断片を調製し、それに挿入断片を結合してpPJV7563を得た。pPJV7563プラスミドマップは図12で与えられる。pPJV7563プラスミドの塩基組成は図13において与えられる。プラスミドpPJV7563における構成成分及びその位置は下記の通りである:
1-44 トランスポゾン903配列
45-860 トランスポゾン903由来のカナマイシン耐性コード配列
861-896 トランスポゾン903配列
897-902 Sal1部位
903-1587 CMVプロモーター
1588-1718 CMV前初期遺伝子由来の非翻訳リーダー配列
1719-1724 BamH1及びBglII制限酵素の融合
1725-1857 ラットインスリンイントロンA
1858-1863 BamH1部位
1864-1984 HBV表面抗原5'非翻訳リーダー配列
1985-1993 合成開始コドン/Nhe1クローニング部位
1994-2011 合成クローニング部位
2012-2544 HBVエンハンサー
2545-2555 古いベクター配列。NCBIデータベースと対照して該当なし
2556-2686 ウサギβグロビンポリアデニル化領域
2687-3759 pUC19ベクター配列
(i) pPJV7507 (hTPAsp及びSEAP)
pSEAP-Basic (Clontech)を、プライマーJF320(配列番号35)及びJF321(配列番号36)でPCR増幅した後、Nhe1及びBgl2で切断して、ヒトSEAP断片からなる挿入断片を単離した。pPJV7079(Macklinら)をNhe1及びBgl2で切断して、ベクター断片を調製し、それに挿入断片を結合してpPJV7507を得た。
ヒトDNAを、プライマーJF386(配列番号37)及びFcAS(配列番号38)でPCR増幅した後、Nhe1及びBgl2で切断して、ヒトIgG Fcフラグメントからなる挿入断片を単離した。pPJV7079をNhe1及びBgl2で切断して、ベクター断片を調製し、それに挿入断片を結合してpPJV7508を得た。
合成オリゴJF354(配列番号39)を、プライマーJF355(配列番号40)及びJF356(配列番号41)でPCR増幅して、アプロチニンシグナルペプチドのコード配列を生成した。
合成オリゴJF348(配列番号42)を、プライマーJF349(配列番号43)及びJF350(配列番号44)でPCR増幅して、タバコ エクステンシンシグナルペプチドのコード配列を生成した。
合成オリゴJF351(配列番号45)を、プライマーJF352(配列番号46)及びJF353(配列番号47)でPCR増幅して、ニワトリ リゾチームシグナルペプチドのコード配列を生成した。
pPJV7499 (CMV(イントロンなし)、HBsAg5'UTR、RBGpA、アプロチニンシグナルペプチド(s.p.))
pPJV7497 (CMV(イントロンなし)、HBsAg5'UTR、RBGpA、タバコエクステンシンs.p.)
PPJV7500 (CMV(イントロンなし)、HBsAg5'UTR、RBGpA、ニワトリリゾチームs.p.)
シグナルペプチドのコード配列を、Spe1及びNhe1で切断して挿入断片を単離した。pPJV7450をNhe1で切断して、ベクター断片を調製し、それに挿入断片を結合して、結果としてpPJV7499(アプロチニン)、pPJV7497(タバコエクステンシン)、及びpPJV7500(ニワトリリゾチーム)が得られた。
pPJV7513(CMV(イントロンなし)、HBsAg5'UTR、RBGpA、アプロチニンs.p.)
pPJV7512(CMV(イントロンなし)、HBsAg5'UTR、RBGpA、タバコエクステンシンs.p.)
pPJV7510(CMV(イントロンなし)、HBsAg5'UTR、RBGpA、ニワトリリゾチームs.p.)
pPJV7499、7497、及び7500をXho1及びNhe1で切断して、CMVプロモーターからプラスミドのシグナルペプチドコード配列までで構成される挿入断片を単離した。pPJV7507をXho1及びNhe1で切断して、ベクター断片を調製し、それに挿入断片を結合して、pPJV7513(アプロチニン)、pPJV7512(タバコエクステンシン)、及びpPJV7510(ニワトリリゾチーム)を得た。
pPJV7524(CMV(イントロンなし)、HBsAg5'UTR、RBGpA、アプロチニンs.p.)
pPJV7525(CMV(イントロンなし)、HBsAg5'UTR、RBGpA、タバコエクステンシンs.p.)
pPJV7526(CMV(イントロンなし)、HBsAg5'UTR、RBGpA、ニワトリリゾチームs.p.)
pPJV7499、7497、及び7500をXho1及びNhe1で切断して、CMVプロモーターからプラスミドのシグナルペプチドコード配列までで構成される挿入断片を単離した。pPJV7508をXho1及びNhe1で切断して、ベクター断片を調製し、それに挿入断片を結合して、pPJV7524(アプロチニン)、pPJV7525(タバコエクステンシン)、及びpPJV7526(ニワトリリゾチーム)を得た。
(a) pPJV7531(CMV(イントロンなし)、HBsAg5'UTR、RBGpA、ニワトリリゾチームs.p.)
pPJV7510をSal1及びBgl2で切断し、CMVプロモーターからリゾチームシグナルペプチドまでを含有する挿入断片を単離した。pPJV7450をSal1及びBgl2で切断して、ベクター断片を生成し、それに挿入断片を結合して、pPJV7531を得た。
pPJV7530をXho1及びBamH1で切断して、CMVプロモーターからRIAまでを含有する挿入断片を単離した。pPJV7531をXho1及びBamH1で切断して、ベクター断片を生成し、それに挿入断片を結合して、pPJV7554を得た。
pPJV7563をBgl2及びEcoR1で切断して、HBsAg3'UTR及びRBGpAを含有する挿入断片を単離した。pPJV7531をBgl2及びEcoR1で切断して、ベクター断片を生成し、それに挿入断片を結合して、pPJV7568を得た。
pPJV7563をBgl2及びEcoR1で切断して、HBsAg3'UTR及びRBGpAを含有する挿入断片を単離した。pPJV7554をBgl2及びEcoR1で切断して、ベクター断片を生成し、それに挿入断片を結合して、pPJV7572を得た。
(a) pPJV7557(β-gal、CMV(cAイントロン)、HBsAg3'UTR、HBsAg5'UTR、及びRBGpA)
プライマーJF430(配列番号48)及びJF442(配列番号49)を用いて、ニワトリDNAをPCR増幅し、Bgl2及びBamH1で切断して、ニワトリ心筋アクチンに由来するイントロン及びフランキングエクソン配列からなる挿入断片を単離した。pPJV7488をBamH1で切断してベクター断片を調製し、それに挿入断片を結合して、pPJV7557を得た。
プライマーJF421(配列番号50)及びJF444(配列番号51)を用いて、ニワトリDNAをPCR増幅し、Bgl2及びBamH1で切断して、ニワトリケラチン遺伝子に由来するイントロン及びフランキングエクソン配列からなる挿入断片を単離した。pPJV7488をBamH1で切断してベクター断片を調製し、それに挿入断片を結合して、pPJV7558を得た。
pPJV7557をSal1及びBamH1で切断し、CMVプロモーターからイントロン領域までで構成される挿入断片を単離した。pPJV7496をSal1及びBamH1で切断してベクター断片を調製し、それに挿入断片を結合して、pPJV7578を得た。
pPJV7558をSal1及びBamH1で切断し、CMVプロモーターからイントロン領域までで構成される挿入断片を単離した。pPJV7496をSal1及びBamH1で切断してベクター断片を調製し、それに挿入断片を結合して、pPJV7579を得た。
第1日に、SCC15(ATCC)又はB16(起源不明、ATCCにて入手可能な型)細胞を、20-40%コンフルエントとなるよう6ウェル組織培養プレートに撒き、インキュベーター内で一晩増殖させた。宿主細胞をATCC推奨の培地で増殖させた。
実施例9に記載のようにSSC15又はB16宿主細胞にトランスフェクトした。
SCC15又はB16宿主細胞に、実施例9に記載のようにトランスフェクトした。トランスフェクションの18時間後に、プレートを15分間氷上に置いた。その後、各ウェルを2mlのPBS(Biowhittaker, Walkerville, MD)で洗浄した。PBSで希釈した0.05%グルタルアルデヒド(Polysciences Inc., Warrington, PA)で細胞を固定し、室温で30分間インキュベートした。以後のインキュベーションは全て室温で1時間持続するものとし、各インキュベーションの間の洗浄は上記の通りとした。プレートを2mlの5% 粉乳含有PBS(Bio Rad Laboratories, Melville, NY)でブロックした。続いて、抗gDモノクローナル抗体(ABI, Columbia, MD)の2% 粉乳/PBS/0.05% Tween-20(登録商標)(Sigma, St. Louis, MO)による1:1000希釈物、1ml、及びヤギ抗マウスHRP(KPL, Gaithersburg, MD)のPBS/0.1% Tween-20(登録商標)による1:2500希釈物、1mlとともにインキュベーションを行った。1mlのTMBマイクロウェル基質(BioFX, Owings Mills, MD)を用いて発色させた。1M H2SO4で反応を止め、液体をプラスチックキュベットに移し、450nmで吸光度を読み取った。データは、増強された(イントロン、HBVenh、又はその両方を含有する)ベクターの基本ベクターに対する発現の比として提示される。
SCC15又はB16宿主細胞に、実施例9に記載のようにトランスフェクトした。培地交換の18から40時間後に、培養上清を採取し、70℃にて30分間加熱した。熱不活化上清10から25μlを1/10量の100mM L-ホモアルギニンとともに5分間インキュベートした。500μlのアルカリホスファターゼ反応バッファー(カタログ番号172-1063, Bio Rad, 説明書にしたがって調製)をこの溶解液に加え、37℃にて10から20分間インキュベートした。500μlの1M NaOHを添加して反応を止め、405nmで吸光度を測定した。データは、増強された(イントロン、HBVenh、又はその両方を含有する)ベクターの基本ベクターに対する発現の比、又は実験のシグナルペプチドの、ヒトTPAシグナルペプチドベクターに対する発現の比として提示される。
SCC15又はB16宿主細胞に、実施例9に記載のようにトランスフェクトした。培地交換後18から40時間までに、培養上清を採取した。
(a) 免疫化カートリッジの調製
テストするそれぞれのプラスミドについて、25mgの2ミクロン金粉末を秤量して微量遠心管に入れた。50mMスペルミジン(Aldrich Chemical, Inc, Milwaukee, WI)を250μlに分けて添加した後、微量遠心管をボルテックス撹拌し、短時間超音波処理した。微量遠心して金を分離し、スペルミジンを新たな100μlに交換した。金をボルテックスして再懸濁し、その後DNA 25μgをマイクロチューブに加えて混合した。微量遠心管を軽くボルテックスしながら、100μlの10% CaCl2(Fujisawa USA, Inc, Deerfield, IL)を添加してDNAを金ビーズ上に沈澱させた。沈澱反応を卓上で10分間続行した後、微量遠心の短時間回転によって金を採集し、無水エタノール(Spectrum Quality Products, Inc, Gardena, CA)で3回洗浄して、過剰な沈澱試薬を除去した。洗浄した金/DNA複合体を、0.05 mg/mlポリビニルピロリドン(360KD, Spectrum Quality Products, Inc, Gardena, CA)含有無水エタノール3.6ml中に再懸濁した。次に、このスラリーをテフゼルチューブ(McMaster-Carr, Chicago, IL)に注入したが、これは金/DNA複合体でテフゼルチューブの内側をコーティングするチューブターナー(PowderJect ワクチンs)内にある。チューブターニング手順が完了した後、チューブをワクチンの0.5"「ショット」に切り、マウスにデリバリーするためのXR1デバイス(PowderJect ワクチンs)内に充填した。
4から6週齢のマウスをKetaset(Fort Dodge)及びRompun(Bayer)の混合物で麻酔した。1対の電気バリカンを用いて腹部を剪毛して、毛を取り除き、2つの重複しないワクチン「ショット」を、XR1デバイス(450psi)を通して剪毛部にデリバリーした。動物をケージに戻し、ワクチン接種後6週間の時点で採血した。Balb/cマウスを用いて、HBsAg発現ベクターを評価し、Swiss Websterマウスを用いてHSV gD及びFlu M2発現ベクターを評価した。
6週間で、血液サンプルをワクチン接種した動物から採取した。これらのサンプルから分離された血清の一定量を、AUSAB(登録商標) EIA Diagnostic キット (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)に同梱の反応容器のウェルに入れた。入れる血清の量はサンプルの抗体価によって決まり、サンプルはサンプル希釈バッファーで希釈して、定量パネルで得られる値の範囲内とした。AUSAB(登録商標)定量 パネル (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)の各バイアルから200μlを反応容器のウェルに添加した。各ウェルにビーズを添加し、その後、容器を密封して40℃にて2時間インキュベートした。その後、ウェルを洗浄して反応液の全成分を除去した。洗浄した各ウェルに、200μlのコンジュゲート混合物を添加した後、容器を密封して40℃にて2時間インキュベートした。次に、ウェルを洗浄して反応液の全成分を落とした。ビーズを新しいチューブに移した後、300μlの発色バッファーを添加した。30分で、1M硫酸の添加により発色反応を止め、反応液の吸光度をQuantum II(登録商標)分光光度計 (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL)において490nmで測定した。この分光光度計は、サンプルの吸光度を、定量パネルを用いて作成された標準曲線と比較することによって、サンプルの抗体レベルを計算する。これらの抗体レベルを次に、希釈係数で補正した。図7に示すデータは、特定のベクターでワクチン接種された全動物の力価の幾何平均である。
96ウェルCoster中結合性ELISAプレート(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)を、合成Flu M2ペプチド(QCB / Biosource, Hopkinton, MA)によって、PBS(Biowhittaker, Walkerville, MD)中1μg/mlの濃度でコートし、4℃にて一晩インキュベートした。プレートを、10mM Tris (Sigma, St. Louis, MO) / 150mM NaCl (Fisher Scientific) / 0.1% Brij-35 (Sigma)で3回洗浄した後、5% 粉乳(Bio Rad Laboratories, Melville, NY)含有PBSで、室温にて1時間ブロックした。以後のインキュベーションは全て室温で1時間とし、各インキュベーションの間の洗浄は上記の通りとした。マウス血清サンプル、標準(高力価の抗M2マウス血清)及びネガティブコントロール(抗HBsAgマウス血清)を2% 粉乳 / PBS / 0.05% Tween-20(登録商標)(Sigma)で希釈し、ELISAプレート内でインキュベートした。次にヤギ抗マウスIgG(H+L)ビオチン結合抗体(Southern Biotechnology Associate, Birmingham, AL)を2% 粉乳 / PBS / 0.05% Tween-20(登録商標)で1:8000に希釈し、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体(Southern Biotechnology)をPBS / 0.1% Tween-20で1:8000に希釈して、続行した。TMB基質(BioFX, Owings Mills, MD)を用いて、発色させた。1M H2SO4で反応を止め、プレートを、Emax 精密マイクロプレートリーダー(Molecular デバイスs, Sunnyvale, CA)を用いて450nmで測定した。SoftMax Pro 4.1 ソフトウェア(Molecular デバイスs)を用いて、4-パラメーター解析によって最終力価を計算した。力価は、アッセイごと、及びプレートごとの変動が最小限となるよう、所定の力価を有する標準血清に対して標準化した。結果を図7に示す。
96ウェルCoster中結合性ELISAプレート(Fisher Scientific, Pittsburgh, PA)を、HSVgD((Viral Therapeutics, Ithaca, NY)タンパク質によって、PBS(Biowhittaker, Walkerville, MD)中1μg/mlの濃度でコートし、4℃にて一晩インキュベートした。プレートを、10mM Tris (Sigma, St. Louis, MO) / 150mM NaCl (Fisher Scientific) / 0.1% Brij-35 (Sigma)で3回洗浄した後、5% 粉乳(Bio Rad Laboratories, Melville, NY)含有PBSで、室温にて1時間ブロックした。以後のインキュベーションは全て室温で1時間とし、各インキュベーションの間の洗浄は上記の通りとした。マウス血清サンプル、標準(高力価の抗gDマウス血清)及びネガティブコントロール(抗HBsAgマウス血清)を2% 粉乳 / PBS / 0.05% Tween-20 (Sigma)で希釈し、ELISAプレート内でインキュベートした。次にヤギ抗マウスIgG(H+L)ビオチン結合抗体(Southern Biotechnology Associate, Birmingham, AL)を2% 粉乳 / PBS / 0.05% Tween-20で1:8000に希釈し、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体(Southern Biotechnology)をPBS / 0.1% Tween-20で1:8000に希釈して、続行した。TMB基質(BioFX, Owings Mills, MD)を用いて、発色させた。1M H2SO4で反応を止め、プレートを、Emax 精密マイクロプレートリーダー(Molecular デバイスs, Sunnyvale, CA)を用いて450nmで測定した。SoftMax Pro 4.1 ソフトウェア(Molecular デバイスs)を用いて、4-パラメーター解析によって最終力価を計算した。力価は、アッセイごと、及びプレートごとの変動が最小限となるよう、所定の力価を有する標準血清に対して標準化した。結果を図7に示す。
インフルエンザA/Panama/2007/99(H3N2)のヘマグルチニン(HA)抗原をコードし、発現することができるプラスミドpPJV1671を構築した。
(i) 発現遺伝子のクローニング;
(ii) ベクター骨格の設計;及び
(iii) 最終プラスミドの設計。
インフルエンザHAのコード配列は、米国疾病対策予防センター(Centers for Disease Control and Prevention)(Atlanta, GA)から入手したA/Panama/2007/99ウイルスのサンプルをテンプレートリボ核酸(RNA)源として使用し、標準的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)クローニング技術によって得た。
・A/Panama/2007/99(H3N2)のRNAセグメント4からの、dsDNA断片のRT-PCR生成;
・標準的なpUC19ベースのベクター中の、RNAセグメント4のDNAクローンの大腸菌(E.coli)における増殖;
・RNAセグメント4クローン中のH3 Panama HAコード配列の配列解析;及び
・pPJV7563 DNAワクチン「空」ベクターに適合する末端(Nhe IとBsp 120I)を有するH3 Panama HAコード配列(そのATGコドンを含まない)を含有するDNA断片を作製するための第2のPCR反応。
pPJV1671用のプラスミド骨格はpPJV7563である。pPJV7563中のプラスミド骨格配列の大部分は、数回のヒト臨床試験において評価されているDNAワクチンベクター、pWRG7128中にも見出される。この節では、pPJV7563構築の概要を提供する。詳細なフローチャートは、図14のpPJV7563及びpPJV1671の構築で提供し、以下の、プラスミドpWRG7128及びpPJV1671における主要なエレメントの比較表(表2)を提供する。pPJV1671のマップを図16に示す。
最終プラスミドpPJV1671の、プラスミド骨格であるpPJV7563からの設計には2つの主要なステップが含まれ(図14に示すとおり)、これらのステップは:
・pPJV7563からNhe1-Bgl II部位を欠失させるステップ;及び
・H3 Panama HAコード配列をpPJV7563に挿入し、最終のpPJV1671、H3 Panama HA DNAワクチンベクターを生成するステップである。
臨床試験を行った、HBsAgをコードするpWRG7128と、H3 Panama HAをコードするインフルエンザワクチンpPJV1671ベクターとのベクター骨格中の主要な相違点は上記の表2に示される。これらの相違点には、ヒトサイトメガロウイルス(hCMV)イントロンAエレメントの代わりにラットインスリンイントロンAを使用すること、及びウシ成長ホルモンポリアデニル化配列の代わりにウサギβグロビンポリアデニル化配列を使用することが含まれる。現在報告されている、pPJV1671を用いた広範囲に及ぶ動物実験は、小型動物及び大型動物の両方においてpPJV1671がインフルエンザDNAワクチンとして優れた効果を奏することを示している。プラスミドpPJV1671は、以下の実施例16で論じるとおり、ヒトにおいてもDNAワクチンの粒子媒介表皮送達(PMED)後に優れた効果を奏する。
pPJV1671の機能マップを図16に示す。このマップの特性を表3にリストする。プラスミドpPJV1671は、hCMV前初期プロモーター、並びにエクソン1及びエクソン2に由来する5'非コード配列を利用する。このプロモーターは、ラットインスリンイントロンAとHBV pre-S2遺伝子の5'UTR(非翻訳領域)に結合している。H3 Panama HAコード配列の翻訳は、ベクターのコンセンサスKozak翻訳開始配列のコンテキスト中に固定されているATGコドンから開始する。HAコード配列にHBVの転写エンハンサー(HBVenh)が続いている。最終的に、ウサギβグロビンポリアデニル化部位によって転写終結が促進される。
pPJV1671に関する詳細な構築履歴及び配列決定の調査報告により、このプラスミド内の全てのヌクレオチド位置の起点の指定が可能となる。実際にベクター中のコンポーネントが正確に割り当てられていることを確認するため、ベクターコンポーネント配列とGenBankデータベース間でBLASTアラインメントを行った。
PowderJect Research Departmentは、新たに構築したpPJV1671プラスミドから調製したQiagen Megaprep DNAを用いて配列決定を行った。実際の配列データは、pPJV1671について予測される理論配列と100%一致していた。製造工程中の配列決定も、プラスミド配列が理論配列及び検索配列と100%一致していることを示していた。プラスミドの種々のエレメント及び配列中の位置は、上記の表3に与えられる。
pPJV1671の免疫原性を研究するため、飼育ブタのモデルを用いた。pPJV1671の作製は上記の実施例15で説明されている。この研究には8週齢の飼育白ブタ(去勢ブタと雌ブタ)を利用した。対象動物について、赤血球凝集抑制(HI)抗体力価を測定したところ、この研究に含めた全ての動物について、抗体力価は1:10未満であった。
序
pPJV1671DNAワクチン(A/Panama/2007/99(H3N2)由来のHA(ヘマグルチニン)遺伝子を含有する一価PMEDインフルエンザDNAワクチン)の安全性及び免疫原性を評価するため、第1相の用量漸増臨床研究を行った。安全性は、ワクチン接種に起因する局所及び全身の有害事象を、研究が完了するまでモニターすることによって評価した。免疫原性は、血清の赤血球凝集抑制(HI)抗体レベルを測定することによって評価した。
ワクチンと送達系
臨床プラスミド用に、テンプレートRNA源としてA/Panama/2007/99 ウイルスのサンプル(ウイルスは米国疾病対策予防センター(Centers for Disease Control and Prevention)J. Katz氏の贈与による)を用いる標準的な逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)クローニング技術によってHAコード配列を取得した。上記実施例15で説明したとおり、H3 Panama HAコード配列をpPJV7563ベクターに挿入し、最終のpPJV1671 H3 Panama HA DNAワクチンベクターを得た。pPJV1671の完全配列の解析により、全ベクター骨格とHAコード配列を確認した。
本研究の臨床段階は、MDS Pharma Services, Lincoln, NEにおいて実施し、現地の施設内治験審査委員会の承認を得た。36人の成人のボランティアが登録していた(表4)。
被験者を1グループ当たり12人の3つの治療グループに順番に割り当てた。PMEDによるDNAワクチン投与は各々、0.5mgの金に被覆した1μgのDNA、プラスミドpPJV1671(H3 Panama)を送達するものであった。第1グループは、0日目に、上腕の内側面に単独ワクチン投与を受けた。第2グループの被験者は、0日目に、2回で合計2μg DNAのワクチン接種を受け、ワクチンは上腕内側面の隣接部位に投与された。第3グループの被験者は、4日目に、4回で合計4μg DNAのワクチン投与を受けた。ワクチンは、PowderJect XR-1デバイスを500 psiのヘリウム圧力で用いて投与されたが、この圧力は、先の研究においてよく耐容されることが示されている(非特許文献9、Rottinghausら(2003) Vaccine 21(31):4604-8及びTacketら(1999) Vaccines
17(22):2826-9)。
臨床的な安全性と免疫原性の評価
ワクチン接種部位の反応をモニターし、研究中の局所及び全身の有害事象の発生を記録することにより安全性を評価した。全ての被験者は、ワクチン接種時、接種後1時間と接種後2時間の時点で、ワクチンの安全性及び局所耐性について評価を受けた。被験者は、3、7、14、21、28、56、及び180日目に局所耐性についてさらに評価を受けた。全身的有害事象は、身体検査、バイタルサイン、実験室安全性試験、及び抗二本鎖DNA抗体試験によりモニターした。これらの試験は、ワクチン接種の前及び後に実施した。
安全性データを表化した。各HI力価は、通常は同一又は類似の結果を与える2つの別々の測定値の幾何平均(GMT)として報告された。サンプルの力価が10以下であった場合、アッセイの検出限界値である力価5を割り当てた。各グループについて、各時点のGMTと95%信頼区間(CI)を、対数変換した力価を用いて計算した。各時点について、各投与量グループの基線からのGMT比を、SAS(システム)のCATMOD法を用いたカイ二乗検定により比較した。3つのグループ間のGMTの差も比較した。
安全性と反応性
84のワクチン投与部位全てについて、局所反応を評価した(図18)。3つのグループ全てから得た局所皮膚反応スコア(84の全ワクチン接種部位)を平均した。皮膚反応は、下記の基準に従ってスコア化した:
- 紅斑: 0 = なし; 1 = 紅潮; 2 = 軽度の日焼け; 3 = 真赤。
インフルエンザA/Panamaに対するHI力価の10以上40以下について被験者をプレスクリーニングしたが、数人の被験者の力価は、ワクチン接種の当日で10以下であった。基準HI力価は全て40未満であり、グループ間で基準力価に著しい相違は存在しなかった(p=0.439;上記の表4参照)。
本実施例において報告される研究は、インフルエンザ予防に有効と予測される抗インフルエンザ抗体応答を初めて成功裏に生じさせるものである。
2001-2002年インフルエンザワクチン株のHA分子をコードする3つのDNAワクチンベクターを構築し、関連動物モデルにおいて、候補ヒト三価インフルエンザDNAワクチンの免疫原性を評価した。ヒトとブタの皮膚の構造が酷似しているため、飼育ブタは歴史的にヒトにおけるPMED DNAワクチンのモデルとして使用されている。ヒトにおけるPMED DNAワクチン性能の予測の判断材料としてのブタモデルの関連性は、B型肝炎表面抗原DNAワクチンの第I相ヒト臨床試験によって示され、この試験では、ブタにおける優れたワクチン性能がヒトにおいても反映されていた。
・A/Panama/2007/99(H3N2)、A/New Caledonia/20/99(H1N1)、及びB/Victoria/5/00株のRNAセグメント#4のdsDNA断片のRT-PCR生成。
プラスミドpPJV2012 を構築した。pPJV2012は、腸管毒素原性大腸菌の易熱性毒素(LT)のAサブユニット及びBサブユニットを発現する。in vivoでのpPJV2012からの機能性LT毒素の発現は、pPJV2012と共に投与されるプラスミドから発現される他のタンパク質に対する免疫応答を増強するために用いることができる。
・大腸菌ゲノムDNAに由来するLT Aコード配列のPCR増幅及び中間プラスミドへの挿入;
・LT Aコード配列の切り出し及びCMVプロモーターの制御下にある「アクセプター」プラスミドへの挿入。
LT Aサブユニットは、CMV前初期(IE)プロモーターから発現する。LT BサブユニットはトランケートされたCMV IEプロモーターから発現する。両遺伝子の発現を高めるための付加配列、特にHBV pre-S2 5'UTR(Moriartyら (1981) Proc Natl Acad Sci USA 78: 2606-2610)、CMVエクソン1/2(天然のイントロンの欠失により一緒にスプライスされた最初の2つのCMV IEエクソンで構成される)、ラットインスリンイントロンA(Lomedicoら (1979) Cell 2: 545-558)及びウサギβグロビンポリA(rGpA)が含まれる。発現細胞からの分泌を確実にするため、両方のLTサブユニットにニワトリリゾチームシグナルペプチド(CLSP;Genbank登録番号CR390743)が挿入されている。さらに、発現を高めるため、HBV env エンハンサー(Vannice及びLevinson (1988) J Virol. 62: 1305-1313)をAサブユニットの後ろに挿入した。
大腸菌株E078:H11をATCC(カタログ#35401)から入手し、5'末端及び3'末端に相同であって、GenBank accession file AB011677を参照して設計したプライマーを用いて、別々のPCR反応によりAサブユニット及びBサブユニットを増幅した。両サブユニットについて作製されたこのコード配列は、アミノ末端に見出される細菌性シグナルペプチドをコードする配列は含まない。Aサブユニット断片とBサブユニット断片を、プラスミドWRG7054に別々に結合させた。
LT Aコード配列を切り出し、pPJV7592のベクター骨格と、CMVプロモーター、5'非翻訳領域及びCLSPを含む、pPJV7572に由来する断片に結合させた。結果として得られたプラスミドをA1とした。A1を切断し、pPJV7592に由来する断片と結合してマルチクローニングサイトを再創出し、結果として得られたプラスミドをアクセプターとした;このプラスミドはpPJV2012のLT A 成分を提供した。
下記のプラスミドを用いて、プラスミドpPJV7788を作製した:
pPJV7275、pPJV7284、pPJV7389、pPJV7586及びpPJV7293から派生したプラスミドpPJV7563とpPJV7592。
pPJV7563をSal1で切断し、平滑末端化し、Nde1で切断してベクター断片を作製した。pPJV7590をSph1で切断し、平滑末端化し、Nde1で切断してMCSとCMVプロモーターの5'末端を含有する挿入断片を作製した。これらの断片を結合し、pPJV7592を作製した。
pPJV7389をNco1とEcoR1で切断し、ベクター断片を作製した。pPJV7572をNco11とNhe1で切断し、CMVプロモーターの3'末端、5'非翻訳領域、及びCLSPを含有する挿入断片を作製した。pPJV2005をNhe1とBamH1で切断し、LTBサブユニットを含む挿入断片を作製した。pPJV7586をBgl2とEcoR1で切断し、ウサギβグロビンポリアデニル化領域を含有する挿入断片を作製した。これらの断片を連結し、pPJV7787を作製した。
pPJV7785をXho1とMfe1で切断し、LTA発現カセットを含有するベクター断片を作製した。pPJV7787をXho1とEcoR1で切断し、LTB発現カセットを含有する挿入断片を作製した。これらの断片を結合し、哺乳類細胞に導入されるとLTAサブユニット及びLTBサブユニットを発現するpPJV7788を作製した。
本発明のキメラプロモーターを利用してH5/VN1194ヘマグルチニンタンパク質を発現することができるさらなる構築物、pPML7789を作製した。実施例5に記載した構築物、pPJV7563を構築物pPML7789の骨格として用いた。
材料と方法
ウイルス
HSV-2ウイルス(Nancy Sawtell, University of Cincinnatiから贈られたMS株、ATCC VR-540及びHG52株G)をVERO細胞(ATCC CCL-81)上で増殖させ、使用前にスクロース勾配上で精製した。
全ICP27遺伝子(UL54)をpTarget(Promega, Madison WI)に組み込んだPCR断片を挿入することにより、HSV-2 ICP27(図27)をコードするプラスミドを作製した。このPCR断片は、HSV-2のMS株の精製ゲノムDNAから、5'(GCCACTCTCTTCCGACAC、配列番号63)プライマーと3'(CAAGAACATCACACGGAAC、配列番号64)プライマーを用いて増幅した。増幅された配列は、HSV-2のHG52 クローンの公開されているゲノム配列(GenBank登録番号NC_001798)のヌクレオチド114,523〜116,179に対応する。University of Wisconsin, MadisonのDNA Sequencing Core FacilityによりpICP27を完全に配列決定した。
6〜8週齢の雌Balb/cマウスに対するPMED DNAワクチン接種は先に報告されたとおりであるが(Arringtonら、J. Virol. 76, 4536-4546, 2002)、各送達が合計0.5μgのDNAワクチン/DEIベクター製剤で被覆した0.5 mgの金を含む、単一のPMED送達からなる腹部皮膚に対する各々のワクチン接種については報告されていない。このような「シングル・ショット」ワクチン接種を2回、4週間あけて投与し、第2の、すなわち「追加」ワクチン接種の2週間後に動物を屠殺又は曝露した。
MS株ウイルスに由来するICP27の誘導アミノ酸配列を、ライブラリのテンプレートとして使用した。ICP27タンパク質は、HG52株の配列とMS株の配列との間で高度に保存されているため(図28及び配列番号65参照)、このライブラリでは両方の株に対する応答を検出することができると考えられた。隣接ペプチドと11アミノ酸重複を有する長さ18アミノ酸のペプチドを用いて、ICP27の全配列に及ぶペプチドライブラリを合成した(Mimotopes, Fisher Scientific)。合計72個のペプチドを作製した。
先に報告されているとおり、新鮮な脾細胞及びリンパ節細胞上でIFN-γ ELISPOTアッセイを実施したが、刺激用抗原は、結果の項の各実験について示されるように、単一ペプチド又はペプチドプールを用いた。場合により、ELISPOTアッセイの前に、使用説明書に従って磁性ビーズ(Dynal)によりT細胞集団を枯渇させた。
2回目のワクチン接種の2週間後、新鮮な脾細胞を採取し、SM(MEMピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、及び2-メルカプトエタノールを添加したRPMI培地 + 10% ウシ胎仔血清(Invitrogen, Carlsbad, CA))中で、1ml当たり1 x 107 細胞の濃度で再懸濁した。細胞サンプルを、1ウェル当たり1 x 106細胞(100μl)の濃度で96ウェル平底プレートに撒いた。脾細胞は、100μlアリコートのICP27ペプチド含有SM又は培地単独で処理した。最終ペプチド濃度は10-8Mであった。未処理の動物から採取した対照脾細胞もペプチドと共にまたペプチドを伴わずに、さらにCon-A(最終濃度2.5 mg/ml)と共にまたCon-Aを伴わずに撒き、それぞれ陰性対照及び陽性対照としての役割を果たした。
Anesthetized Balb/cマウスの鼻腔内に約50LD50(2 x 106 PFU)のHSV株MSを含有する30 μlのPBSを曝露した。感染後20日間マウスを追跡調査し、罹患率及び死亡率についてスコア化した。罹患率は、下記のスケジュールに従って、0〜4のスケールでスコア化した:4、健康;3、毛が逆立ち、くしゃみをする;2、ただれ目又は尻痛、動作減少;1、体を丸める、動作ほとんどなし;0、死亡。曝露の前後にIFN-γ-(eBioscience, San Diego, CA (カタログ♯16-7311)及び/又はTNF-α-(カタログ♯16-7332)特異的モノクローナル抗体で処理したマウスは、ウイルス曝露に対して-2日目、0日目、2日目、4日目、6日目、及び8日目に90 μgの抗体を含む腹腔内注射を受けた。T細胞枯渇実験において、ウイルス曝露に対して-2日目及び0日目に、マウスはCD4細胞集団又はCD8細胞集団のいずれかに特異的な抗体200μgを含む腹腔内注射を受けた(ファンクショナルグレード精製抗マウスCD4、eBioscienceカタログ♯:16-0041;ファンクショナルグレード精製抗マウスCD8、eBioscience;カタログ♯:16-0081)。
Balb/cマウスにおける強力なCD8エピトープの同定
ICP27タンパク質に対するT細胞応答を同定するため、HSV-2(HG52株G)の弱毒化株を感染させた、Balb/cマウスとC57Bl/6マウスから回収した細胞上でIFN-γELISPOTアッセイを行った。T細胞を刺激するため、ICP27コード配列の全長にわたるペプチドからなるペプチドライブラリを使用した。このペプチドの長さは18アミノ酸で、隣接ペプチドと11アミノ酸だけ重複していた。ペプチドプールは、材料と方法、及び表10に記載されるとおり、6ペプチド(プールC1-C12)又は12ペプチド(プールR1-R6)のいずれかから成り、その構成は、ライブラリ内の陽性ペプチドの同定を容易にした。感染の7日後にBalb/cマウスから回収した脾臓細胞とリンパ節細胞は、プールC10、C11、R2及びR5内のペプチドに対して極めて強い応答を示し(図29A)、他の幾つかのプールにおいてはやや弱い応答を示した。C57Bl/6マウスから回収した細胞では弱い応答しか検出されなかった。陽性応答のパターンは、アッセイした脾臓細及びリンパ節細胞集団と類似していることが分かった。
HSV-2のMS株由来のICP27配列を用いて、DNAワクチン「pICP27」を作製した(図27)。配列決定した構築物と、公開されているHG52 ICP27遺伝子配列との差は2ヌクレオチドのみであった(図28)。ヌクレオチド57位に、サイレント変化と考えられるGからAへの変化があり、484位におけるAからCへの変化は、HG52株のリシンをMS型のアスパラギンへと変化させたと考えられた。したがって、上記DNAワクチンから発現されるMS株ICP27タンパク質は、推定CD8エピトープ領域に差異がなく、該タンパク質のHG52株型とほぼ同一であったと考えられる。
pICP27DNAワクチン接種により生じた免疫応答のin vivo活性を、Balb/cマウスの予防的経鼻感染モデルで研究した。12週齢Balb/cマウスにおける、様々な投与量のHSV-2 MS株を用いた感染は、LD50の約3 x 104 PFUを確立した(データ示さず)。DNA防御実験において、50 LD50のウイルス曝露量を用いた。なぜなら、この用量は未処理の動物において常に100%の死亡率をもたらしたからである。
曝露した動物の防御におけるIFN-γ又はTNF-αのICP27-特異的産生を評価した。pICP27 + pPJV2012(LT)-ワクチンを接種した動物をINF-γ-及び/又はTNF-α-特異的モノクローナル抗体で曝露の前後数日間処理し、これらのサイトカインをin vivoで中和した。罹患率データを図32に示す。先のとおり、2つのICP27 + LT DEIワクチンの接種を受けた動物は、曝露から完全に防御され、軽度の一時的な罹患率(4動物のうち、1動物において毛が逆立っていた)しか示さなかったが、100%の未処理マウス又はpICP27ベクターのみで免疫したマウスは、曝露により罹患した。ICP27 + LT DEI製剤で免疫し、その後抗TNF-αで処理したグループにおいて、経鼻曝露接種の直後に、麻酔の合併症により1個体の死亡が観察された。重要なことに、残りの3マウスは一時的な毛の逆立ちしか示さず、完全に回復し、TNF-α産生が防御に大きく寄与した可能性が低いことを示していた。対照的に、曝露時に抗IFN-γ又は抗IFN-γ + 抗TNF-αの接種を受け、ICP27 + LT DEIで免疫した2つのグループのマウスは強く罹患し、8動物のうち7動物が死亡し、このことは防御の必須のメディエーターとしてのIFN-γの重要性を明らかに示していた。
材料と方法
インフルエンザA/Vietnam/1194/2004[H5N1]ウイルスのHAをコードするDNAプラスミドpPML7789(実施例21、図20)を金粒子上に沈着させ、PowderMed社の独占的送達技術を用いて粒子媒介表皮送達(PMED)によりマウスに送達した。
株:Balb/Cマウス
数:36匹
性別:雌
体重の範囲:15.0-19.6 g(第1手順の日)
齢:42-49日(到着日)
食餌:RM1ペレット
供給者:Charles River UK Ltd
マウスを以下の表11に示す6つのグループに分けた。マウス上で実施した手順、及びこの手順を行った日を、以下の表12に示す。標準方法に従い、血清上でHAIアッセイを行った。
NIBRG-14[H5N1]ウイルスに対するHAI力価を測定した
全ての対照が許容限度内におさまるように注意した。陰性対照項目(NIBRG-14[H5N1]ウイルス)は全てのプレート上で陰性であった。陽性対照項目(シチメンチョウ赤血球細胞)は、全てのプレート上で陽性であった。幾何平均が28、40、56又は80HAIU(40 HAIU +/- 2倍の許容限度内)となるまで第2の陽性対照項目(インフルエンザA/Chicken/Scotland/59[H5N1]ウイルスに対する抗体を含む血清)を全てのプレート上に流した。
配列番号1は、hCMV前初期プロモーター配列である(GenBank #M60321, X17403)。
配列番号2は、hCMV主要前初期遺伝子のエクソン1及び2由来の配列である(GenBank #M60321, X17403)。
配列番号3は、ラット インスリン イントロンA配列である(GenBank #J00748)。
配列番号4は、本発明によるキメラプロモーターの配列である。
配列番号5は、HBV preS2抗原5’UTR配列に由来するリーダー配列である(GenBank #M54923)。
配列番号6は、HSV 2gD型 5’UTR配列に由来するリーダー配列である(GenBank #Z86099)。
配列番号7は、HBV e抗原5’UTR配列に由来するリーダー配列である(GenBank #M54923)。
配列番号8は、HBVenh 3’UTR配列である(GenBank #AF143308)。
配列番号9は、サル前初期遺伝子3’UTR配列である(GenBank #M16019)。
配列番号10は、ウサギβグロビン ポリA配列である(GenBank #K03256)。
配列番号11は、サルsCMV前初期遺伝子ポリA配列である(GenBank #M16019)。
配列番号12は、HSV2 gB遺伝子ポリA配列である(GenBank #Z86099)。
配列番号13は、HPV16初期遺伝子ポリA配列である(GenBank #K02718)。
配列番号14は、pPJV発現ベクターの配列である。
配列番号15は、PCRプライマーJF93である。
配列番号16は、PCRプライマーF110である。
配列番号17は、PCRプライマーGW1である。
配列番号18は、PCRプライマーJF254である。
配列番号19は、PCRプライマーGW150である。
配列番号20は、PCRプライマーJF255である。
配列番号21は、PCRプライマーDS1である。
配列番号22は、PCRプライマーDA1である。
配列番号23は、PCRプライマーJF301である。
配列番号24は、PCRプライマーJF302である。
配列番号25は、PCRプライマーJF84である。
配列番号26は、PCRプライマーJF225である。
配列番号27は、PCRプライマーJF335である。
配列番号28は、PCRプライマーJF336である。
配列番号29は、PCRプライマーJF357である。
配列番号30は、PCRプライマーJF365である。
配列番号31は、PCRプライマーJF393である。
配列番号32は、PCRプライマーJF406である。
配列番号33は、PCRプライマーJF256である。
配列番号34は、PCRプライマーJF257である。
配列番号35は、PCRプライマーJF320である。
配列番号36は、PCRプライマーJF321である。
配列番号37は、PCRプライマーJF386である。
配列番号38は、PCRプライマーFcASである。
配列番号39は、オリゴヌクレオチドJF354である。
配列番号40は、PCRプライマーJF355である。
配列番号41は、PCRプライマーJF356である。
配列番号42は、オリゴヌクレオチドJF348である。
配列番号43は、PCRプライマーJF349である。
配列番号44は、PCRプライマーJF350である。
配列番号45は、オリゴヌクレオチドJF351である。
配列番号46は、PCRプライマーJF352である。
配列番号47は、PCRプライマーJF353である。
配列番号48は、PCRプライマーJF430である。
配列番号49は、PCRプライマーJF442である。
配列番号50は、PCRプライマーJF421である。
配列番号51は、PCRプライマーJF444である。
配列番号52は、仮性狂犬病ウイルス(PRV)プロモーター配列である。
配列番号53は、ラウス肉腫ウイルス(RSV)プロモーター配列である。
配列番号54は、pPJV1671ベクターのヌクレオチド配列、及びコードされたH3N2 HA抗原のアミノ酸配列を提供する。
Claims (114)
- インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン(HA)抗原に対する免疫応答を誘導するため、被験体への送達に適した核酸構築物であって、
(i)(a)hCMV前初期プロモーター配列;
(b)hCMV主要前初期遺伝子のエクソン1、及びエクソン2の少なくとも一部;並びに
(c)hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられた異種イントロン;
を含むキメラプロモーター配列、
(ii)キメラプロモーターに機能し得るように連結されたコード配列であって、インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン(HA)抗原、その免疫原性断片、又は前記抗原若しくは断片と少なくとも80%のアミノ酸相同性を有する前記抗原若しくは断片の免疫原性バリアントをコードする前記コード配列、
(iii)HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、又はHSV 2gD型抗原配列由来であって、キメラプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列、及び
(iv)HBsAg配列の3’非翻訳領域(UTR)由来、又はサルCMV前初期遺伝子配列の3’UTR由来であって、キメラプロモーターに機能し得るように連結され、かつコード配列の下流にあるエンハンサー配列、
を含んでなる前記核酸構築物。 - コード配列は二以上の前記HA、断片、又は免疫原性バリアントをコードする、請求項1に記載の核酸構築物。
- コード配列は3つ〜5つの異なるインフルエンザ株それぞれの前記HA、断片、又はバリアントをコードする、請求項2に記載の核酸構築物。
- コード配列は3つ又は4つの非パンデミックインフルエンザ株それぞれの前記HA、断片、又はバリアントをコードする、請求項3に記載の核酸構築物。
- コード配列はパンデミックインフルエンザ株の前記HA、断片、又はバリアントをコードする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸構築物。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の核酸構築物で被覆された担体粒子。
- 請求項1に記載の少なくとも2つの異なる核酸構築物で被覆された担体粒子であって、前記各構築物は異なるインフルエンザ株の前記HA、断片、又はバリアントをコードする、前記担体粒子。
- 3つ〜5つの異なる前記構築物で被覆された、請求項7に記載の担体粒子。
- 3つ又は4つの前記構築物は異なる非パンデミックインフルエンザ株の前記HA、断片、若しくはバリアントをコードする、請求項8に記載の担体粒子。
- パンデミックインフルエンザ株の前記HA、断片、若しくはバリアントをコードする前記構築物で被覆された、請求項7〜9のいずれか1項に記載の担体粒子。
- プロモーター配列、及び当該プロモーターに機能し得るように連結されたコード配列を含む核酸構築物でも同様に被覆され、前記コード配列がADPリボシル化細菌毒素サブユニット、アジュバント活性を有するその断片、又はそのいずれかのバリアントであって、アジュバント活性を有し、前記サブユニット若しくは断片と少なくとも80%のアミノ酸相同性を持つ前記バリアントをコードする、請求項6〜10のいずれか1項に記載の担体粒子。
- プロモーター配列はキメラプロモーター配列であって、当該キメラプロモーター配列が
(a)hCMV前初期プロモーター配列;
(b)hCMV主要前初期遺伝子のエクソン1、及びエクソン2の少なくとも一部;並びに
(c)hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられた異種イントロン;
を含んでなる、請求項11に記載の前記担体粒子。 - ADPリボシル化細菌毒素サブユニットはコレラトキシン・サブユニットA、コレラトキシン・サブユニットB、大腸菌易熱性毒素サブユニットA、及び大腸菌易熱性サブユニットBから選択される、請求項11又は12に記載の担体粒子。
- 核酸構築物は2つのコード配列を含み、それぞれが異なる前記サブユニット、断片又はバリアントを含む、請求項11〜13のいずれか1項に記載の担体粒子。
- 2つのコード配列はそれぞれコレラトキシン・サブユニットA及びコレラトキシン・サブユニットB、又はそれぞれ大腸菌易熱性毒素サブユニットA及び大腸菌易熱性サブユニットBをコードする、請求項14に記載の担体粒子。
- 核酸構築物は、さらに
(a)HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、又はHSV 2gD型抗原配列由来であって、かつキメラプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列、及び
(b)HBsAg配列の3’非翻訳領域(UTR)、又はサルCMV前初期遺伝子配列の3’UTR由来であって、キメラプロモーターに機能し得るように連結され、かつコード配列の下流に位置するエンハンサー配列、
を含む、請求項11〜15のいずれか1項に記載の担体粒子。 - 金粒子である、請求項6〜16のいずれか1項に記載の担体粒子。
- 請求項6〜17のいずれか1項に記載の被覆粒子を含んでなる、粒子を介したデリバリーデバイス用の投薬容器。
- 請求項6〜17のいずれか1項に記載に被覆粒子を充填した、粒子を介したデリバリーデバイス。
- 無針注射器である、請求項19に記載の粒子を介したデリバリーデバイス。
- インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン(HA)抗原に対する免疫応答を誘導するため、被験体への送達に適した核酸構築物であって、
(i)(a)hCMV前初期プロモーター配列;
(b)hCMV主要前初期遺伝子のエクソン1、及びエクソン2の少なくとも一部;並びに
(c)hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられた異種イントロン;
を含むキメラプロモーター配列、
(ii)キメラプロモーターに機能し得るように連結されたコード配列であって、インフルエンザウイルス・ヘマグルチニン(HA)抗原、その免疫原性断片、又は前記抗原若しくは断片と少なくとも80%のアミノ酸相同性を有する前記抗原若しくは断片の免疫原性バリアントをコードする前記コード配列、
を含んでなる前記核酸構築物。 - さらに
(iii)HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、又はHSV 2gD型抗原配列由来であって、キメラプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列、又は
(iv)HBsAg配列の3’非翻訳領域(UTR)、又はサルCMV前初期遺伝子配列の3’UTR由来であって、キメラプロモーターに機能し得るように連結され、かつコード配列の下流にあるエンハンサー配列、
を含んでなる、請求項21に記載の核酸構築物。 - コード配列は二以上の前記HA、断片、又は免疫原性バリアントをコードする、請求項21又は22に記載の核酸構築物。
- コード配列は3つ〜5つの異なるインフルエンザ株それぞれの前記HA、断片、又はバリアントをコードする、請求項23に記載の核酸構築物。
- コード配列は3つ又は4つの非パンデミックインフルエンザ株それぞれの前記HA、断片、又はバリアントをコードする、請求項24に記載の核酸構築物。
- コード配列はパンデミックインフルエンザ株の前記HA、断片、又はバリアントをコードする、請求項21〜25のいずれか1項に記載の核酸構築物。
- 請求項21〜26のいずれか1項に記載の核酸構築物で被覆された担体粒子。
- 請求項21に記載の少なくとも2つの異なる核酸構築物で被覆された担体粒子であって、前記各構築物は異なるインフルエンザ株の前記HA、断片、又はバリアントをコードする、前記担体粒子。
- 3〜5つの異なる前記構築物で被覆された請求項28に記載の担体粒子。
- 3つ又は4つの前記構築物は異なる非パンデミックインフルエンザ株の前記HA、断片、若しくはバリアントをコードする、請求項29に記載の担体粒子。
- パンデミックインフルエンザ株の前記HA、断片、若しくはバリアントをコードする前記構築物で被覆された、請求項28〜30のいずれか1項に記載の担体粒子。
- プロモーター配列、及び当該プロモーターに機能し得るように連結されたコード配列を含む核酸構築物でも同様に被覆され、前記コード配列がADPリボシル化細菌毒素サブユニット、アジュバント活性を有するその断片、又はそのいずれかのバリアントであって、アジュバント活性を有し、前記サブユニット若しくは断片と少なくとも80%のアミノ酸相同性を持つ前記バリアントをコードする、請求項27〜31のいずれか1項に記載の担体粒子。
- プロモーター配列はキメラプロモーター配列であって、当該キメラプロモーター配列が
(a)hCMV前初期プロモーター配列;
(b)hCMV主要前初期遺伝子のエクソン1、及びエクソン2の少なくとも一部;並びに
(c)hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられた異種イントロン;
を含んでなる、請求項32に記載の前記担体粒子。 - ADPリボシル化細菌毒素サブユニットはコレラトキシン・サブユニットA、コレラトキシン・サブユニットB、大腸菌易熱性毒素サブユニットA、及び大腸菌易熱性サブユニットBから選択される、請求項32又は33に記載の担体粒子。
- 核酸構築物は2つのコード配列を含み、それぞれが異なる前記サブユニット、断片又はバリアントを含む、請求項32〜34のいずれか1項に記載の担体粒子。
- 2つのコード配列はそれぞれコレラトキシン・サブユニットA及びコレラトキシン・サブユニットB、又はそれぞれ大腸菌易熱性毒素サブユニットA及び大腸菌易熱性サブユニットBをコードする、請求項35に記載の担体粒子。
- 核酸構築物は、さらに
(a)HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、又はHSV 2gD型抗原配列由来であって、かつキメラプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列、及び/又は
(b)HBsAg配列の3’非翻訳領域(UTR)、又はサルCMV前初期遺伝子配列の3’UTR由来であって、キメラプロモーターに機能し得るように連結され、かつコード配列の下流に位置するエンハンサー配列、
を含む、請求項32〜36のいずれか1項に記載の担体粒子。 - 金粒子である、請求項27〜37のいずれか1項に記載の担体粒子。
- 請求項27〜38のいずれか1項に記載の被覆粒子を含んでなる、粒子を介したデリバリーデバイス用の投薬容器。
- 請求項27〜38のいずれか1項に記載の被覆粒子を充填した、粒子を介したデリバリーデバイス。
- 無針注射器である、請求項40に記載の粒子を介したデリバリーデバイス。
- キメラプロモーター配列及び当該キメラプロモーターに機能し得るように連結されたコード配列を含んでなる核酸構築物であって、コード配列がインフルエンザウイルス抗原、その免疫原性断片、又は前記抗原若しくは断片と少なくとも80%のアミノ酸相同性を持つ前記抗原若しくは断片の免疫原性バリアントをコードし、並びにキメラプロモーター配列が
(a)hCMV前初期プロモーター配列;
(b)hCMV主要前初期遺伝子のエクソン1、及びエクソン2の少なくとも一部;及び
(c)hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられた異種イントロン;
を含む、前記核酸構築物。 - コードされた抗原はインフルエンザ・ヘマグルチニン(HA)、その免疫原性断片、又はいずれかと少なくとも80%のアミノ酸配列相同性を持つ免疫原性バリアントである、請求項42に記載の核酸構築物。
- コードされた抗原はインフルエンザ・ノイラミニダーゼ(NA)、M2、いずれか一方の免疫原性断片、又は前記NA、M2若しくは断片のいずれかと少なくとも80%のアミノ酸配列相同性を持つ免疫原性バリアントである、請求項42に記載の核酸構築物。
- インフルエンザ抗原、免疫原性断片、又はバリアントはパンデミックインフルエンザ株由来である、請求項42〜44のいずれか1項に記載の核酸構築物。
- 前記構築物は二以上のインフルエンザ抗原、免疫原性断片、又は免疫原性バリアントをコードする、請求項42〜45のいずれか1項に記載の核酸構築物。
- 前記構築物はパンデミックインフルエンザ抗原、その免疫原性断片、又は前記抗原若しくは断片の免疫原性バリアント、及び一以上の非パンデミックインフルエンザ抗原、その免疫原性断片、又は前記抗原若しくは断片の免疫原性バリアントをコードする、請求項46に記載の核酸構築物。
- コードされた少なくとも2つの異なる抗原、断片、又はバリアントが異なるインフルエンザウイルス株の同種のインフルエンザポリペプチド由来である、請求項46又は47のいずれか1項に記載の核酸構築物。
- キメラプロモーター配列及び当該キメラプロモーターに機能し得るように連結されたコード配列を含んでなる核酸構築物であって、前記コード配列がADPリボシル化細菌毒素サブユニット、アジュバント活性を有するその断片、又はそのいずれかのバリアントであって、アジュバント活性を有し、前記サブユニット若しくは断片と少なくとも80%のアミノ酸相同性を持つバリアントをコードしており、かつ前記キメラプロモーター配列が
(a)hCMV前初期プロモーター配列;
(b)hCMV主要前初期遺伝子のエクソン1、及びエクソン2の少なくとも一部;並びに
(c)hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられた異種イントロン;
を含む前記核酸構築物。 - ADPリボシル化細菌毒素サブユニットはコレラトキシン・サブユニットA、コレラトキシン・サブユニットB、大腸菌易熱性毒素サブユニットA、及び大腸菌易熱性サブユニットBから選択される、請求項49に記載の核酸構築物。
- 2つのコード配列を含み、それぞれが異なるサブユニット、断片又はバリアントを含み、かつそれぞれが前記キメラプロモーターに機能し得るように連結されている、請求項49又は50に記載の核酸構築物。
- 前記2つのコード配列は、それぞれコレラトキシン・サブユニットA及びコレラトキシン・サブユニットB、又はそれぞれ大腸菌易熱性毒素サブユニットA及び大腸菌易熱性サブユニットBをコードする、請求項51に記載の核酸構築物。
- 前記2つのコード配列は逆方向である、請求項51又は52に記載の核酸構築物。
- 前記2つのコード配列は同方向である、請求項51又は52に記載の核酸構築物。
- hCMV前初期プロモーター配列(a)は、
(i)配列番号1、配列番号54のヌクレオチド903〜1587、配列番号61のヌクレオチド1815〜1935、配列番号61のヌクレオチド1948〜2632、配列番号62のヌクレオチド1002〜1686、及び/若しくは配列番号62のヌクレオチド2624〜3308のヌクレオチド配列、
(ii)一以上の(i)の配列と少なくとも80%のヌクレオチド配列相同性を有する(i)の機能性バリアント、又は
(iii)(i)若しくは(ii)の機能性断片
を含む、請求項42〜54のいずれか1項に記載の核酸構築物。 - エクソン配列(b)は、
(i)配列番号2のヌクレオチド配列、配列番号54のヌクレオチド1588〜1718、配列番号61のヌクレオチド1684〜1814、配列番号61のヌクレオチド2633〜2763、配列番号62のヌクレオチド1687〜1817、及び/若しくは配列番号62のヌクレオチド3309〜3439のヌクレオチド配列、
(ii)一以上の(i)の配列と少なくとも80%のヌクレオチド配列相同性を有する(i)の機能性バリアント、又は
(iii)(i)若しくは(ii)の機能性断片
を含む、請求項42〜55のいずれか1項に記載の核酸構築物。 - 異種イントロン(c)がラットインスリン遺伝子イントロンA配列、ニワトリケラチン遺伝子イントロンA配列、ニワトリ心筋アクチン遺伝子イントロンA配列、それらいずれかの機能性断片、又は前記いずれかの機能性バリアントから選択される配列を含む、請求項42〜56のいずれか1項に記載の核酸構築物。
- ラットインスリン遺伝子イントロンA配列は、
(i)配列番号3のヌクレオチド配列、配列番号54のヌクレオチド1725〜1857、配列番号61のヌクレオチド1545〜1677、配列番号61のヌクレオチド2770〜2902、配列番号62のヌクレオチド1824〜1956、及び/又は配列番号62のヌクレオチド3346〜3578のヌクレオチド配列;
(ii)一以上の(i)の配列と少なくとも80%のヌクレオチド配列相同性を有する(i)の機能性バリアント;或いは
(iii)(i)又は(ii)の機能性断片
を含む、請求項57に記載の核酸構築物。 - キメラプロモーター配列は、
(i)配列番号4のヌクレオチド配列、若しくは配列番号54のヌクレオチド903〜1857のヌクレオチド配列;
(ii)(i)の配列と少なくとも80%のヌクレオチド配列相同性を有する(i)の機能性バリアント;又は
(iii)(i)若しくは(ii)の機能性断片
を含む、請求項42〜58のいずれか1項に記載の核酸構築物。 - 核酸構築物が
(a)HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、又はHSV 2gD型抗原配列由来であって、キメラプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列、及び/又は
(b)HBsAg配列の、又はサルCMV前初期遺伝子配列の3’非翻訳領域(UTR)由来であって、キメラプロモーターに機能し得るように連結され、かつクローニング部位の下流にあるエンハンサー配列、
をさらに含む請求項42〜59のいずれか1項に記載の核酸構築物。 - (i)配列番号14で提供されるpPJV7563ベクターの配列;又は
(ii)(i)の配列と少なくとも60%の配列同一性をもつ配列を含み、かつ
前記抗原、断片若しくはバリアントをコードする配列がキメラプロモーターに機能可能に連結されるように、前記配列(i)又は(ii)において提供される、請求項42に記載の核酸構築物。 - コード配列はHA抗原、その免疫原性バリアント、又はいずれかの免疫原性断片をコードする、請求項61に記載の核酸構築物。
- 配列番号54で提供されるpPJV1671ベクターの配列、又はその配列と少なくとも60%の配列同一性を持つ配列を含む、請求項42に記載の核酸構築物。
- 配列番号59で提供されるpPML7789ベクターの配列、又はその配列と少なくとも60%の配列同一性を持つ配列を含む、請求項42に記載の核酸構築物。
- 配列番号61で提供されるpPJV2012ベクターの配列、又はその配列と少なくとも60%の配列同一性を持つ配列を含む、請求項49に記載の核酸構築物。
- 配列番号62で提供されるpPJV7788ベクターの配列、又はその配列と少なくとも60%の配列同一性を持つ配列を含む、請求項49に記載の核酸構築物。
- プロモーター配列及び当該プロモーターに機能し得るように連結されたコード配列を含んでなる核酸構築物であって、コード配列がインフルエンザウイルス抗原、その免疫原性断片、又は前記抗原若しくは断片と少なくとも80%のアミノ酸相同性を有する前記抗原若しくは断片の免疫原性バリアントをコードし、さらに
(a)HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、若しくはHSV 2gD型抗原配列由来であって、コード配列、及び当該コード配列とは異種のプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列、並びに/或いは
(b)コード配列の3’側エンハンサー配列で、かつコード配列に機能し得るように連結された3’側エンハンサー配列であって、該エンハンサー配列はHBsAg配列、又はサルCMV前初期遺伝子配列の3’ UTR由来であり、かつ該コード配列は3’エンハンサー配列とは異種であるエンハンサー配列を含む前記核酸構築物。 - コードされた抗原はインフルエンザ・ヘマグルチニン(HA)、その免疫原性断片、又はいずれかと少なくとも80%のアミノ酸配列相同性をもつ免疫原性バリアントである、請求項67に記載の核酸構築物。
- コードされた抗原はインフルエンザ・ノイラミニダーゼ(NA)若しくはM2、いずれか一方の免疫原性断片、又は前記NA、M2若しくは断片と少なくとも80%のアミノ酸配列相同性を持つ免疫原性バリアントである、請求項67に記載の核酸構築物。
- コードされたインフルエンザ抗原、その免疫原性断片、又はいずれかのバリアントはパンデミックインフルエンザ株由来である、請求項67〜69のいずれか1項に記載の核酸構築物
- 二以上のインフルエンザ抗原、免疫原性断片、又は免疫原性バリアントをコードする、請求項67〜70のいずれか1項に記載の核酸構築物。
- パンデミックインフルエンザ株の抗原、その免疫原性断片、又は前記抗原若しくは断片の免疫原性バリアント、及び一以上の非パンデミックインフルエンザ株の抗原、その免疫原性断片、又は前記抗原若しくは断片の免疫原性バリアントをコードする、請求項71に記載の核酸構築物。
- 少なくとも2つの異なる抗原、断片、又はバリアントが異なるインフルエンザウイルス株の同種のインフルエンザポリペプチド由来である、請求項71又は72に記載の核酸構築物。
- プロモーター配列及び当該プロモーターに機能し得るように連結されたコード配列を含んでなる核酸構築物であって、コード配列がADPリボシル化細菌毒素サブユニット、アジュバント活性を有するその断片、又はそれらのどちらかのバリアントであって、アジュバント活性を有し、かつ前記サブユニット若しくは断片と少なくとも80%のアミノ酸相同性を持つ前記バリアントをコードし、並びに、さらに
(a)HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、又はHSV 2gD型抗原配列由来であって、コード配列、及び当該コード配列とは異種のプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列;及び/又は
(b)コード配列の3’側エンハンサー配列で、かつコード配列に機能し得るように連結された3’側エンハンサー配列であって、該エンハンサー配列はHBsAg配列、又はサルCMV前初期遺伝子配列の3’ UTR由来であり、かつ該コード配列は3’エンハンサー配列とは異種であるエンハンサー配列を含む前記核酸構築物。 - ADPリボシル化細菌毒素サブユニットはコレラトキシン・サブユニットA、コレラトキシン・サブユニットB、大腸菌易熱性毒素サブユニットA、及び大腸菌易熱性サブユニットBから選択される、請求項74に記載の核酸構築物。
- 2つのコード配列を含み、それぞれが異なるサブユニット、断片又はバリアントを含み、かつそれぞれが前記キメラプロモーターに機能し得るように連結されている、請求項74又は75記載の核酸構築物。
- 前記2つのコード配列は、それぞれコレラトキシン・サブユニットA及びコレラトキシン・サブユニットB、又はそれぞれ大腸菌易熱性毒素サブユニットA及び大腸菌易熱性サブユニットBをコードする、請求項76に記載の核酸構築物。
- 前記2つのコード配列は逆方向である、請求項76又は77に記載の核酸構築物。
- 前記2つのコード配列は同方向である、請求項76又は77に記載の核酸構築物。
- プロモーターがhCMV前初期プロモーター配列、仮性狂犬病ウイルスプロモーター配列、及びラウス肉腫ウイルスプロモーター配列から選択される、請求項67〜79のいずれか1項に記載の核酸構築物。
- 非翻訳リーダー配列は、
(i)配列番号5、配列番号6、配列番号7、若しくは配列番号54のヌクレオチド1864〜1984のヌクレオチド配列;
(ii)(i)と少なくとも80%のヌクレオチド配列相同性を有する(i)の機能性バリアント;又は
(iii)(i)若しくは(ii)の機能性断片
を含む、請求項67〜80のいずれか1項に記載の核酸構築物。 - エンハンサー配列は、
(i)配列番号8、配列番号9、配列番号54のヌクレオチド3699〜4231、配列番号61のヌクレオチド3831〜4363、及び/若しくは配列番号62のヌクレオチド4507〜5038のヌクレオチド配列;
(ii)前記(i)の配列と少なくとも80%のヌクレオチド配列相同性を有する(i)の機能性バリアント;又は
(iii)(i)若しくは(ii)の機能性断片
を含む、請求項67〜81のいずれか1項に記載の核酸構築物。 - ポリアデニル化配列をさらに含む、請求項42〜82のいずれか1項に記載の核酸構築物。
- 前記ポリアデニル化配列はウサギβグロビン遺伝子、ヒトパピローマウイルス(HPV)初期若しくは後期遺伝子、HSV-2gB遺伝子、サルCMV前初期遺伝子、及びHSVgD後期遺伝子から選択される遺伝子のポリアデニル化配列である、請求項83に記載の核酸構築物。
- 前記ポリアデニル化配列は、
(i)配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号54のヌクレオチド4243〜4373、配列番号61のヌクレオチド906〜1038、配列番号61のヌクレオチド4375〜4050、若しくは配列番号62のヌクレオチド2463〜2593のヌクレオチド配列;
(ii)前記(i)の配列と少なくとも80%のヌクレオチド配列相同性を有する(i)の機能性バリアント;又は
(iii)(i)若しくは(ii)の機能性断片
から選択される、請求項83に記載の核酸構築物。 - 配列番号14の配列を含む、請求項42に記載の核酸構築物。
- 抗原、外毒素サブユニット、断片、又はバリアントをコードする配列に機能し得るように連結されたシグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項42〜86のいずれか1項に記載の核酸構築物。
- シグナルペプチドはヒト組織プラスミノーゲン活性化因子シグナルペプチド(hTPAsp)、アプロチニンシグナルペプチド、タバコエクステンシンシグナルペプチド、及びニワトリリゾチームシグナルペプチドから選択される、請求項87に記載の核酸構築物。
- プラスミドである、請求項42〜88のいずれか1項に記載の核酸構築物。
- 請求項42〜89のいずれか1項に記載の少なくとも2つの異なる構築物を含む核酸構築物の集団。
- 請求項42〜48、61〜64、及び67〜73のいずれか1項に記載の少なくとも2つの異なる構築物を含み、該構築物は異なるインフルエンザ抗原、その免疫原性断片、又は前記抗原若しくは断片の免疫原性バリアントをコードする核酸構築物の集団。
- 少なくとも3つの異なる構築物を含み、それぞれが異なるインフルエンザ抗原、免疫原性断片、又は免疫原性バリアントをコードする請求項91に記載の核酸構築物の集団。
- 少なくとも2つの異なる抗原は異なるインフルエンザ株の同種のインフルエンザポリペプチド由来である、請求項91又は92に記載の核酸構築物の集団。
- 少なくとも2つの異なる抗原、断片、又はバリアントは同種若しくは異種のインフルエンザ株の異なるインフルエンザポリペプチド由来である、請求項91〜93のいずれか1項に記載の核酸構築物の集団。
- 請求項49〜54,65,66、及び74〜79のいずれか1項に記載の構築物を少なくとも1つ含み、該構築物は前記ADPリボシル化細菌毒素サブユニット、その断片、又はそのバリアントをコードする、請求項90〜94のいずれか1項に記載の核酸構築物の集団。
- 核酸構築物の集団であって、
(i)少なくとも一つの構築物がADPリボシル化細菌毒素サブユニット、アジュバント活性を有するその断片、又はそれらのどちらかのバリアントであって、アジュバント活性を有し、かつ前記サブユニット若しくは断片と少なくとも80%のアミノ酸相同性を持つバリアントをコードし;並びに
(ii)少なくとも一つの構築物が単純ヘルペスウイルス(HSV)抗原をコードしており;
前記サブユニット、断片若しくはバリアント、及び/又はHSV抗原をコードする配列が、キメラプロモーターに機能し得るように連結され、
当該プロモーターは
(a)hCMV前初期プロモーター配列;
(b)hCMV主要前初期遺伝子のエクソン1、及びエクソン2の少なくとも一部;並びに
(c)hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられた異種イントロンを含む前記核酸構築物の集団。 - 核酸構築物の集団であって、
(i)少なくとも一つの構築物がADPリボシル化細菌毒素サブユニット、アジュバント活性を有するその断片、又はそれらのどちらかのバリアントであって、アジュバント活性を有し、かつ前記サブユニット若しくは断片と少なくとも80%のアミノ酸相同性を持つバリアントをコードし;並びに
(ii)少なくとも一つの構築物がHSV抗原をコードしており;
前記少なくとも一つの構築物がさらに、
(a)HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、若しくはHSV 2gD型抗原配列由来であって、前記構築物のコード配列、及び当該コード配列とは異種のプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列;並びに/或いは
(b)前記構築物のコード配列の3’側エンハンサー配列で、かつコード配列に機能し得るように連結された3’側エンハンサー配列であって、該エンハンサー配列はHBsAg配列、又はサルCMV前初期遺伝子配列の3’ UTR由来であり、かつ該コード配列は3’エンハンサー配列とは異種であるエンハンサー配列をさらに含む前記核酸構築物。 - 核酸構築物の集団であって、
(i)キメラプロモーター配列、及び当該キメラプロモーター配列に機能し得るように連結されたコード配列を含んでなり、当該コード配列はADPリボシル化細菌毒素サブユニット、アジュバント活性を有するその断片、又はそれらのどちらかのバリアントでアジュバント活性を有し、かつ前記サブユニット若しくは断片と少なくとも80%のアミノ酸相同性を持つバリアントをコードし、並びに前記キメラプロモーター配列は
(a)hCMV前初期プロモーター配列;
(b)hCMV主要前初期遺伝子のエクソン1、及びエクソン2の少なくとも一部;並びに
(c)hCMV主要前初期遺伝子のイントロンA領域の代わりに与えられた異種イントロン
を含む、第1核酸構築物、並びに
(ii)少なくとも一つのHSV抗原をコードする第2核酸構築物、を含んでなる前記核酸構築物の集団。 - 核酸構築物の集団であって、
(i)プロモーター配列、及び当該プロモーターに機能し得るように連結されたコード配列を含んでなる構築物で、当該コード配列はADPリボシル化細菌毒素サブユニット、アジュバント活性を有するその断片、又はそれらのどちらかのバリアントであって、アジュバント活性を有し、かつ前記サブユニット若しくは断片と少なくとも80%のアミノ酸相同性を持つバリアントをコードし、並びに前記構築物は
(a)HBV preS2抗原配列、HBV e抗原配列、若しくはHSV 2gD型抗原配列由来であって、コード配列、及び当該コード配列とは異種のプロモーターに機能し得るように連結された非翻訳リーダー配列;並びに/或いは
(b)コード配列の3’側エンハンサー配列で、かつコード配列に機能し得るように連結された3’側エンハンサー配列であって、該エンハンサー配列はHBsAg配列、又はサルCMV前初期遺伝子配列の3’ UTR由来であり、かつ該コード配列は3’エンハンサー配列とは異種であるエンハンサー配列をさらに含む第1核酸構築物、並びに
(ii)少なくとも一つのHSV抗原をコードする第2核酸構築物、
を含んでなる前記核酸構築物の集団。 - (i)配列番号61で提供されるpPJV2012ベクターの配列、又はその配列と少なくとも60%の配列同一性を持つ配列を含む第1核酸構築物;及び
(ii)HSV抗原をコードする第2核酸構築物、
を含む、請求項99に記載の核酸構築物の集団。 - 請求項42及び55〜57のいずれか1項に記載の精製単離されたキメラプロモーター配列。
- 請求項42〜89のいずれか1項に記載の核酸構築物、又は請求項90〜100のいずれか1項に記載の核酸構築物の集団で被覆された担体粒子を含む被覆粒子。
- 担体粒子が金粒子である、請求項102に記載の被覆粒子。
- 請求項102又は103に記載の被覆粒子を含んでなる、粒子を介したデリバリーデバイス用の投薬容器。
- 請求項102又は103に記載に被覆粒子を充填した、粒子を介したデリバリーデバイス。
- 無針注射器である、請求項105に記載の粒子を介したデリバリーデバイス。
- 請求項42〜89のいずれか1項に記載の核酸構築物、又は請求項90〜100のいずれか1項に記載の核酸構築物の集団を、製薬上許容可能な担体若しくは賦形剤と共に含む医薬組成物。
- 請求項42〜89のいずれか1項に記載の核酸構築物、又は請求項90〜100のいずれか1項に記載の核酸構築物の集団を含むワクチン組成物。
- 請求項42〜48、61〜64、及び67〜73のいずれか1項に記載の少なくとも2つの異なる構築物を含む多価ワクチンであって、当該構築物は異なるインフルエンザ抗原、その免疫原性断片、又はそのいずれかの免疫原性バリアントをコードする、請求項108に記載のワクチン組成物。
- 三価、四価、又は五価インフルエンザワクチンである、請求項109に記載のワクチン組成物。
- 請求項42〜89のいずれか1項に記載の核酸構築物の、請求項90〜95のいずれか1項に記載の核酸構築物の集団の、又は請求項102若しくは103に記載の被覆粒子の、インフルエンザの予防薬製造における使用。
- 前記薬剤は注射、経皮粒子デリバリー、吸入で、局所的に、経口で、鼻腔内に、又は経粘膜で送達される、請求項111に記載の使用。
- 前記薬剤は無針注射器で送達される、請求項111又は112に記載の使用。
- 哺乳動物細胞で目的とするインフルエンザポリペプチドの発現を得るためのインビトロ方法であって、前記細胞に請求項42〜89のいずれか1項に記載の核酸構築物、請求項90〜95のいずれか1項に記載の核酸構築物の集団、又は請求項102若しくは103に記載の被覆粒子を移送することを含んでなる前記方法。
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