MX2007009164A - Construcciones de acido nucleico. - Google Patents

Construcciones de acido nucleico.

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Abstract

Una construccion de acido nucleico que comprende una secuencia promotora quimerica y un sitio de clonacion para la insercion de una secuencia de codificacion en enlace operable con el promotor quimerico, en donde la secuencia promotora quimerica comprende: (a) una secuencia promotora temprana inmediata hCMV; (b) el exon 1 y al menos una parte del exon 2 del gen temprano inmediato principal hCMV; y (c) un intron heterologo provisto en el lugar de la region del intron A del gen temprano inmediato principal hCMV.

Description

CONSTRUCCIONES DE ACIDO NUCLEICO CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a los campos de la biología molecular e inmunología y generalmente a reactivos útiles en técnicas de inmunización de ácido nucleico. Más específicamente, la invención se refiere a construcciones de ácido nucleico para la expresión de polipéptidos y en particular polipéptidos antigénicos, particularmente antígenos de influenza así como la expresión de polipéptidos adyuvantes y a estrategias de inmunización de ácido nucleico que utilizan tales reactivos ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La terapia de gen y la inmunización de ácido nucleico son métodos prometedores para el tratamiento y prevención tanto de enfermedades adquiridas como heredadas.
Estas técnicas proveen la transferencia de un ácido nucleico en un sujeto con la subsiguiente expresión in vivo . La transferencia se puede lograr transfectando las células o tejidos del sujeto ex vivo y reintroduciendo el material transformado en el hospedero. Alternativamente, el ácido nucleico se puede administrar in vivo directamente al receptor . Cada una de estas técnicas requiere la expresión eficiente de ácido nucleico en la célula transfectada, para proveer una cantidad suficiente del producto de gen Ref. : 184479 terapéutico o antigénico. Se conocen varios factores que afectan los niveles de expresión obtenidos, incluyendo la eficiencia de la transfección, y la eficacia con la cual el gen o secuencia de interés se transcribe y el ARNm traducido. Se han descrito en la técnica un número de sistemas de expresión, cada uno de los cuales típicamente consiste de un vector que contiene una secuencia de gen o nucleótido de de interés operablemente enlazado a las secuencias de control de la expresión. Estas secuencias de control incluyen secuencias de promotor trascripcionales y secuencias de inicio y terminación trascripcional . Los promotores comúnmente utilizados para sistemas de expresión de células de mamífero incluyen el promotor temprano de SV40, un promotor de citomegalovirus (CMV, por sus siglas en inglés) tal como el promotor temprano inmediato CMV (Chapman y otros (1991) Nucí . Acids Res . 19:3979-3986), el promotor de larga repetición de terminal (LTR) del virus de tumor de mama de ratón, el promotor tardío principal de adenovirus (Ad MLP, por sus siglas en inglés) y el promotor del virus simple de herpes (HSV, por sus siglas en inglés), entre otros. Los promotores no virales, tales como el promotor derivado del gen de metalotioeneina de murino también es comúnmente utilizado . Los sistemas de expresión por lo general incluyen elementos moduladores trascripcionales, referidos como "potenciadores" . Los potenciadores son ampliamente definidos como un agente de actuación cis, el cual cuando está operablemente enlazado a una secuencia promotora/gen incrementará la trascripción de esa secuencia de gen. Los potenciadores pueden funcionar desde posiciones que están más lejos de la secuencia del interés que otros elementos de control de expresión (por ejemplo, promotores), y pueden operar cuando se colocan en cualquier orientación relativa a la secuencia del ínteres (Banerji y otros. (1981) Cell 27:299-308, deVilleirs y otros. (1981) Nucí . Acids Res 9: 6251 -6264) . Los potenciadores se han identificado de un número de fuentes virales, incluyendo el virus de polioma, de virus de BK, citomegalovirus (CMV) , adenovirus, el virus de simio 40 (SV40), el virus de sarcoma de Moloney, el virus de papiloma de los bovino y virus de sarcoma de Rous (deVilleirs y otros supra , Rosenthal y otros. (1983) Science 222:749-755, Hearing y otros (1983) Cell 33:695-703, Weeks y otros, (1983) Mol . Cell . Biol . 3:1222-1234, 5 Levmson y otros, (1982) Na ture 295: 568-572, y Luciw y otros, (1983) Cell 33: 705-716) . Un numero de sistemas de expresión para la inmunización de acido nucleico y la terapia de gen hacen uso a promotor temprano inmediato del hCMV. Ver por ejemplo las Patentes de Estados Unidos Nos. 5168062 y 5385839 de Stinski, y la especificación de Patente EP 0323997 Bl . Los vectores de expresión que utilizan el promotor temprano inmediato hCMV incluyen por ejemplo, pWRG7128 (Roy y otros, Vaccine 19, 764-778, 2001), y pBC12/CMV y pJW4303 que se mencionen en WO 95/20660. Chapman y otros reportó niveles reducidos de expresión del promotor temprano inmediato hCMV en ausencia del intrón A hCMV. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se ha estado desarrollado una construcción de ácido nucleico utilizando las secuencias de promotor/expresión virales manipuladas que proveen la expresión mejorada de las secuencias de codificación heterólogas en células hospederas. La construcción es adecuada para la expresión eficiente de genes y particularmente genes que codifican el antígeno, y que por consiguiente se puede utilizar en la inmunización de ácido nucleico. La construcción se puede también utilizar para expresar los polipéptidos adyuvantes. La construcción puede ser provista en partículas portadoras, para uso en la inmunización de ácido nucleico mediada por partículas. En una modalidad especialmente preferida de la invención la construcción codifica un antígeno de influenza, un fragmento inmunogénico del mismo o una variante inmunogénica del mismo. En una modalidad adicional especialmente preferida la construcción codifica un polipéptido adyuvante. Por consiguiente, la presente invención provee una construcción de ácido nucleico adecuada para distribuir a un sujeto por inducción una respuesta inmune contra el antígeno de hemaglutinina (HA) del virus de influenza, cuya construcción comprende : (i) una secuencia promotora quimérica que comprende : (a) la secuencia promotora temprana inmediata hCMV; (b) el exón 1 y por lo menos una parte del exón 2 del gen temprano inmediato principal hCMV; y (c) un intrón heterólogo provisto en lugar de la región del intrón A del gen temprano inmediato principal hCMV; (ii) una secuencia de codificación enlazada de manera operable con el promotor quimérico, en donde la secuencia de codificación codifica un antígeno de hemaglutinina (HA) de virus de influenza, un fragmento inmunogénico del mismo o una variante inmunogénica de dicho antígeno o fragmento que tiene por lo menos 80% de homología de aminoácido a dicho antígeno o fragmento; (iii) una secuencia líder no-traducida que se deriva de la secuencia de antígeno HBVpreS2, la secuencia de e-antígeno HBV o la secuencia de antígeno HSV de tipo 2gD y que está en un enlace operable con el promotor quimérico; y (iv) una secuencia potenciadora que se deriva de una región no traducida 3' (UTR) de una secuencia HBsAg o de una secuencia de gen temprano inmediato CMV de simio, que está operablemente enlazada con el promotor quimérico y la cual está en dirección 3' de la secuencia de codificación. La presente invención también provee una construcción de ácido nucleico adecuada para distribuir a un sujeto por inducción una respuesta inmune contra el antígeno de hemaglutinina (HA) del virus de influenza, cuya construcción comprende: (i) una secuencia promotora quimérica que comprende : (a) una secuencia promotora temprana inmediata del hCMV; (b) el exón 1 y por lo menos una parte del exón 2 del gen temprano inmediato principal hCMV; y (c) un intrón heterólogo provisto en lugar de la región del intrón A del gen temprano inmediato principal hCMV; (ii) una secuencia de codificación enlazada de manera operable con el promotor quimérico, en donde la secuencia de codificación codifica un antígeno de hemaglutinina (HA) de virus de influenza, un fragmento inmunogénico del mismo o una variante inmunogénica de dicho antígeno o fragmento que tiene por lo menos 80% homología de aminoácido a dicho antígeno o fragmento. Además, la presente invención provee una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia promotora quimérica y un sitio de clonación para inserción de una secuencia de codificación en un enlace operable con el promotor quimérico, en donde la secuencia promotora quimérica comprende : (a) una secuencia promotora temprana inmediata del hCMV; (b) el exón 1 y por lo menos una parte del exón 2 del gen temprano inmediato principal hCMV; y (c) un intrón heterólogo provisto en lugar de la región del intrón A del gen temprano inmediato principal hCMV. En una instancia preferida, la construcción comprende una secuencia de codificación insertada en el sitio de clonación. De esta forma, una secuencia de codificación se puede proveer en el sitio de clonación. En una modalidad preferida adicional una construcción de la invención además puede comprender: (a) una secuencia líder no-traducida que se deriva de la secuencia de antígeno HBVpreS2, una secuencia de e-antígeno HBV o secuencia de antígeno HSV de tipo 2 gD, y que está operable enlazada con el promotor quimérico; y/o (b) una secuencia potenciadora que se deriva de una región no-traducida 3' (UTR) de una secuencia HBsAg, o una UTR 3 ' de una secuencia de gen temprano inmediato CMV de simio y que está operable enlazada con el promotor quimérico, en donde la secuencia potenciadora está en dirección 3' del sitio de clonación. La invención también provee una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia promotora y una secuencia de codificación operablemente enlazada al promotor, en donde la construcción además comprende: (a) una secuencia líder no-traducida que se deriva de la secuencia de antígeno HBVpreS2, la secuencia de e-antígeno HBV, o una secuencia de antígeno HSV de tipo 2gD, que está operablemente enlazada a la secuencia de codificación y al promotor que es heterólogo a la secuencia de codificación; y/o (b) una secuencia promotora 3' de y operablemente enlazada a la secuencia de codificación, en donde la secuencia potenciadora se deriva de una UTR 3' de una secuencia de HBsAg, o una UTR 3' de una secuencia de gen temprano inmediato CMV de simio, y a la secuencia de codificación es heteróloga a la secuencia potenciadota 3'. La invención también provee una construcción de ácido nucleico que comprende: (i) una secuencia promotora quimérica que comprende : (a) una secuencia promotora temprana inmediata del hCMV; (b) el exón 1 y por lo menos una parte del exón 2 del gen temprano inmediato principal hCMV; y (c) un intrón heterólogo provisto en lugar de la región del intrón A del gen temprano inmediato principal hCMV; y (ii) el sitio de clonación para inserción de una secuencia de codificación en enlace operable con el promotor quimérico; y (iii) (a) una secuencia líder no-traducida que se deriva de la secuencia de antígeno HBV preS2, una secuencia e-antígeno HBV o secuencia de antígeno HSV de tipo 2gD y que está operablemente enlazada al promotor quimérico; y/o (b) una secuencia potenciadora que se deriva de una región no traducida 3' (UTR) y una secuencia de HBsAg, o una UTR 3' de la secuencia de gen temprano inmediato CMV de simio y que está operablemente enlazada con el promotor quimérico, en donde la secuencia potenciadora está en sentido descendente del sitio de clonación. La invención también provee una construcción de ácido nucleico que comprende: (i) una secuencia promotora; (ii) una secuencia líder no-traducida derivada de la secuencia de antígeno HBV preS2, la secuencia e-antígeno HBV o la secuencia de antígeno HSV de tipo 2gD; y (iii) una secuencia de codificación operablemente enlazada a (i) y (ii) en donde la secuencia de codificación es heteróloga a la secuencia líder no-traducida. La invención también provee una construcción de ácido nucleico que comprende: (i) una secuencia promotora; (ii) una secuencia de codificación operablemente enlazada a la secuencia promotora (i); y (iii) una secuencia potenciadora 3' de y operablemente enlazada a la secuencia de codificación (ii); en donde la secuencia potenciadora (iii) se deriva de un UTR 3' de una secuencia de HBsAg o una UTR 3' de una secuencia de gen temprano inmediata CMV de simio, y la secuencia de codificación (ii) es heteróloga a la secuencia potenciadora 3 ' . La presente invención también provee una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia promotora y una secuencia de codificación operablemente enlazada al promotor, en donde la construcción además comprende : (a) una secuencia líder no-traducida que se deriva de la secuencia de antígeno HBVpreS2, la secuencia de e-antígeno HBV, o una secuencia de antígeno HSV de tipo 2gD, que está operablemente enlazada a la secuencia de codificación y al promotor que es heterólogo a la secuencia de codificación; y/o (b) una secuencia promotora 31 de y operablemente enlazada a la secuencia de codificación, en donde la secuencia potenciadora se deriva de una UTR 3' UTR de una secuencia de HBsAg, o una UTR 31 de una secuencia de gen temprano inmediato CMV de simio, y a la secuencia de codificación es heteróloga a la secuencia potenciadota 3'. La presente invención provee además una población de construcciones de ácido nucleico en donde la población comprende por lo menos dos diferentes construcciones de la invención. En otra instancia, la invención provee una secuencia promotora quimérica aislada purificada que comprende : (a) una secuencia promotora temprana inmediata hCMV; (b) el exón 1 y por lo menos una parte del exón 2 del gen temprano inmediato principal del hCMV; y (c) un intrón heterólogo provisto en lugar de la región del intrón A del gen temprano inmediato principal del hCMV. La invención también provee un método de obtener la expresión en células de mamífero de un polipéptido de interés, cuyo método comprende transferir en las células una construcción de ácido nucleico, una población de construcciones de ácido nucleico o partículas cubiertas de la invención; las partículas cubiertas, adecuadas para la distribución desde un dispositivo de distribución mediado por partículas, cuyas partículas comprenden partículas portadoras cubiertas con una construcción de ácido nucleico de la invención, la construcción incluye una secuencia de codificación que codifica el polipéptido; un receptáculo de dosificación para un dispositivo de distribución mediado por partículas que comprende las partículas cubiertas; una dispositivo de distribución mediado por partículas cargado con las partículas cubiertas; un método para inmunización de ácido nucleico que comprende administrar a un sujeto de una cantidad efectiva de partículas cubiertas de la invención; - una composición farmacéutica que comprende una construcción de ácido nucleico de la invención o una población de construcciones de ácido nucleico de la invención junto con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable; - una composición de vacuna que comprende una construcción de ácido nucleico de la invención o una población de construcciones de ácido nucleico de la invención o de partículas cubiertas de la invención. También se provee el uso de una construcción de ácido nucleico de la invención, una población de construcciones de ácido nucleico de la invención o de partículas cubiertas de la invención en la fabricación de un medicamento para la inmunización de ácido nucleico. Estos y otros objetos, aspectos, modalidades y ventajas de la presente invención se les ocurrirán fácilmente a los expertos en la técnica en vista de la descripción de la presente . BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 ilustra los niveles de expresión del antígeno del superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg) obtenido utilizando varios vectores de expresión del plásmido . La Figura 2 muestra el efecto de la inclusión del intrón en la expresión de HBsAg en células SCC15 y de beta-gal en células de B16 (promedio de tres experimentos) . La Figura 3 muestra el efecto de un intrón A de insulina de rata y la UTR 3' en la expresión de beta-gal en células SCC15 (promedio de tres experimentos). La Figura 4 muestra el efecto del intrón A de insulina de la rata y la UTR 3' HSVgD en la expresión de SCC 15 (promedio de tres experimentos). La Figura 5 muestra el efecto del intrón A de insulina de la rata y la UTR 3' HBV en la expresión de SEAP en células SCC15 y células B16 (tres repeticiones por línea de células) .
La Figura 6 muestra la habilidad de los péptidos de señal heterólogos para dirigir la secreción de SEAP o del fragmento hFc en células B16. La Figura 7 ilustra los niveles de anticuerpos detectados en el suero de ratones inmunizados con ácidos nucleicos que codifican el antígeno contenido en una variedad de vectores de expresión de plásmido. La Figura 8 es una representación diagramática del vector de expresión pPJV. La Figura 9 es una representación diagramática de PPJV7389. La Figura 10 es una representación diagramática de PPJV7400. La Figura 11 es una representación diagramática de pPJV7468. La Figura 12 es una representación diagramática de PPJV7563. La Figura 13 establece la composición base para PPJV7563. La Figura 14 provee una gráfica de flujo de la derivatización de los plásmidos pPJV7563 y pPJVl 671. Las Figuras 15 (a) -15 (f) proveen los mapas de los plásmidos clave en la construcción de pPJVl671. La Figura 16 provee un mapa de característica de pPJVl671 y provee una comparación de secuencia de las secuencias de la terminal N del antígeno H3 de Panamá HA natural y del antígeno HA de H3 Panamá codificado por el pPJVl 671. La Figura 17 muestra las concentraciones de anticuerpo de inhibición de hemaglutinación en puercos vacunados con pPJVl671. La Figura 18 muestra las reacciones de la piel locales después de la distribución epidérmica mediada por partícula de pPJVl671 a seres humanos. La Figura 19 muestra las concentraciones de anticuerpo de inhibición de hemaglutinación en puercos inmunizados con una vacuna trivalente basada en PMED. Las concentraciones Hl específicas para los virus H3 , Hl y B se muestran para dos dispositivos PMED. La Figura 20 es una representación diagramática de pPML778 . Las Figuras 21 (a) -21 (k) muestran la secuencia comentada de pPML7789. La Figura 22 es una representación diagramática de pPJV2012. La Figura 23 es una gráfica de flujo para la construcción de pPJV2012. Las Figuras 24 (a) -24 (e) proveen la secuencia comentada de pPJV2012. La Figura 25 es una representación diagramática del vector pPJV7788. La Figura 26 es una representación diagramática del vector pPJV7788 que muestra los sitios de restricción. La Figura 27 es una representación diagramática de pICP27. La Figura 28 es la secuencia de aminoácido (SEC ID NO: 65) de ICP27 de la cepa MS de HSV-2 con base en la secuencia de nucleótido de pICP27. La diferencia del aminoácido individual entre la secuencia publicada de ICP27 de la cepa HSV-2 MS (asparagina=N) y la cepa HG52 (lisina) está en tipo oscuro. La secuencia identificada como el epítopo CD8 putativo en la cepa HSV-2 MS está subrayada. Las Figuras 29a-29b muestran la identificación de un epítopo ICP27 dominante en ratones Balb/c. Fig.29a: bazo(S) y células del nodulo linfático (N) de ratones Balb/c infectados con HSV-2 (BS y BN, respectivamente) o ratones C57BL/6 (CS y CN) se ensayaron para actividad ELISPOT IFN-? utilizando grupos de varios péptidos (C1-C12, R1-R6) descritos en el Ejemplo 22. Se colocaron en placas 5 x 105 células en cada cavidad y los resultados se tabularon como negativo (cuadros vacíos), débil (<25 ELISPOT/cavidad, cuadros grises) o fuerte (>25 ELISPOT/cavidad, cuadros negros). Fig.29b: Secuencias de dos péptidos (SEC ID NO:66 y 67) reconocidos por las células de ratones Balb/c resaltando un epítopo HSV-2 Dd potencial (negritas) y una región (subrayada) correspondiente a un epítopo HSV-I identificado previamente (Banks y otros, J. Virol. 67, 613-616, 1993). La Figura 30 reporta la caracterización de la respuesta Balb/c a ICP27 utilizando un ensayo ELISPOT IFN-?. Las células de bazo de ratones Balb/c infectados se ensayaron para la actividad ELISPOT IFN-? utilizando el grupo de péptidos hecho de todos los péptidos de péptidos ICP27 (Pool), o péptidos individuales HGPSLYRTF (Pl, SEC ID NO: 68) y LYRTFAANPRA (P2, SEC ID NO: 69). Se colocaron en placas 5 x 105 células en cada cavidad y los resultados se expresaron como número de ELISPOT/cavidad. Además, se trató una alícuota de una muestra celular de bazo con perlas magnéticas para consumir la muestra de células CD8+ como se describe en el Ejemplo 22. La muestra original (+CD8) y la muestra consumida (-CD8) se ensayaron para la actividad ELISPOT IFN-? utilizando el grupo de péptidos hecho de todos los péptidos de ICP27 (Grupo) . Las Figuras 31a-31c muestran la correlación entre la protección del ataque HSV-2 y la producción de citocinas específicas de ICP27. Los grupos de 16 ratones recibieron inmunizaciones primarias y de refortalecimiento de ADN PMED consistiendo de la vacuna de ADN pICP27 con y sin el vector pPJV2013 CT DEI (subunidad doble A+B) o subunidad del vector LT DEI pPJV2012 (doble A+Bl) . El pICP27 para vector de DEI fue de una relación de 9:1. Panel A: datos de supervivencia del ataque postulado. La mitad de los animales en cada grupo se estimuló dos semanas después de la segunda inmunización con 50 LD50 de HSV-2. Los paneles B y C: ICP27 específico de ICP27 y producción de IFN-? y TNF-a en cada grupo, respectivamente. Los animales restantes se sacrificaron al mismo tiempo y los esplenocitos se recolectaron para la medición de la producción de citosina específica de ICP27 utilizando un kit de arreglo de perlas citométrico. La Figura 32 muestra el papel de IFN-? y TNF- a en la protección del ataque letal HSV-2-evaluación de morbidez. Los grupos de 4 ratones recibieron inmunizaciones primarias y de refortalecimiento con la vacuna de ADN de pICP27 PMED con (4 grupos) o sin (1 grupo) el vector A+B LT DEI doble pPJV2012. El pICP27 para el vector de DEI estuvo en una relación de 9:1. Los animales fueron atacados intranasalmente durante dos semanas después con 50 LD50 de HSV-2. Para el consumo de la célula T, los ratones recibieron inyecciones intraperitoneales conteniendo 200 µg de anticuerpo monoclonal específico para IFN-? y/o TNF-a en los días -2, 0, 2, 4, 6, y 8, con relación al ataque del virus como se describió en el Ejemplo 22. Los animales se monitorearon para mortalidad (% de supervivencia) y morbidez, las puntuaciones en una escala de 0 a 4 de acuerdo con el siguiente programa: 4, sano; 3, pelo encrespado, estornudos; 2, ulceraciones en los ojos o traseros, movimiento reducido; 1, encorvados, poco movimiento; 0, muerto. La Figura 33 muestra el papel de las poblaciones de T-célula en la protección del reto letal HSV-2. Cinco grupos de 4 ratones recibieron inmunizaciones principales y de refortalecimiento con la vacuna de ADN pICP27 PMED con (+LT5 4 grupos) o sin (-LT, 1 grupo) del vector DEI A+B LT doble PJV2012. El pICP27 para el vector de DEI estuvo en la relación 9:1. Los animales se atacaron intranasalmente con 50 LD5o de HSV-2 dos semanas después. Tres grupos de los animales inmunizados con ICP27+LT DEI se trataron con inyecciones intraperitoneales de 90 µg de anticuerpos monoclonales específicos de aCD4 y/o aCD8, en los días -2 y 0 como relación al ataque del virus. Con el fin de mantener ADN total en el grupo solo de pICP27 (indicado como -LT) igual a los grupos pICP27 + LT, el vector vacío se agregó al grupo solo de ICP27. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS SEC ID NO:l es una secuencia promotora temprana inmediata hCMV (GenBank #M60321, X17403) SEC ID NO: 2 es una secuencia de los exones 1 y 2 del gen temprano inmediato principal hCMV (GenBank #M60321, X17403) SEC ID NO: 3 es una secuencia de intrón A de insulina de la rata (GenBank #J00748) SEC ID NO: 4 es la secuencia de un promotor quimérico de acuerdo con la presente invención SEC ID NO: 5 es una secuencia líder de la secuencia de UTR 5' del antígeno HBV pre S2 (GenBank #M54923) SEC ID NO: 6 es una secuencia líder de la secuencia UTR 5' gD de tipo 2 HSV (GenBank #Z86099) SEC ID NO: 7 es una secuencia líder de la secuencia UTR 5' del e-antígeno HBV (GenBank #M54923) SEC ID NO: 8 es la secuencia UTR 3' HBVenh (GenBank #AF143308) SEC ID NO: 9 es la secuencia UTR 3' del gen temprano inmediato de simio (GenBank #M16019) SEC ID NO: 10 es la secuencia de poli A de globina de conejo (GenBank #K03256) SEC ID NO: 11 es una secuencia poli A de gen temprano inmediato sCMV de simio (GenBank #M16019) SEC ID NO: 12 es una secuencia poli A del gen gB HSV2 (GenBank #Z86099) SEC ID NO: 13 es secuencia poli A del gen temprano HPV16 (GenBank #K02718) SEC ID NO: 14 es la secuencia del vector de expresión pPJV. SEC ID NO: 15 es el iniciador de un JF93 de PCR SEC ID NO: 16 es el iniciador F110 PCR SEC ID NO: 17 es el iniciador GWl de PCR SEC ID NO: 18 es el iniciador JF254 de PCR SEC ID NO: 19 es el iniciador GW150 de PCR SEC ID NO:20 es el iniciador JF255 de PCR SEC ID NO:21 es el iniciador DSl de PCR SEC ID NO: 22 es el iniciador DAI de PCR SEC ID NO:23 es el iniciador JF301 de PCR SEC ID NO: 24 es el iniciador JG302 de PCR SEC ID NO:25 es el iniciador JF84 de PCR SEC ID NO:26 es el iniciador JF225 de PCR SEC ID NO:27 es el iniciador JF335 de PCR SEC ID NO:28 es el iniciador JF336 de PCR SEC ID NO: 29 es el iniciador JF358 de PCR SEC ID NO: 30 es el iniciador JF365 de PCR SEC ID NO: 31 es el iniciador JF393 de PCR SEC ID NO: 32 es el iniciador JF406 de PCR SEC ID NO: 33 es el iniciador JF256 de PCR SEC ID NO: 34 es el iniciador JF257 de PCR SEC ID NO: 35 es el iniciador JF320 de PCR SEC ID NO: 36 es el iniciador JF321 de PCR SEC ID NO: 37 es el iniciador JF386 de PCR SEC ID NO: 38 es el iniciador FcAS de PCR SEC ID NO: 39 es el oligonucleótido JF354 SEC ID NO: 0 es el iniciador JF355 de PCR SEC ID NO: 1 es el iniciador JF356 de PCR SEC ID NO: 2 es el oligonucleótido JF348 SEC ID NO: 43 es el iniciador JF349 de PCR SEC ID NO: 44 es el iniciador JF350 de PCR SEC ID NO: 45 es el oligonucleótido JF351 SEC ID NO: 46 es el iniciador JF352 de PCR SEC ID NO: 47 es el iniciador JF353 de PCR SEC ID NO: 48 es el iniciador JF430 de PCR SEC ID NO: 49 es el iniciador JF442 de PCR SEC ID NO: 50 es el iniciador JF421 de PCR SEC ID NO: 51 es el iniciador JF444 de PCR SEC ID NO: 52 es la secuencia promotora del virus de Pseudorabia (PRV) . SEC ID NO: 53 es la secuencia promotora del virus de sarcoma de Rous (RSV) . SEC ID NO: 54 provee la secuencia de nucleótido del vector pPJV1671 y de la secuencia de aminoácido del antígeno HA H3N2 codificado. SEC ID NO: 55 provee la secuencia de aminoácido sola del antígeno HA H3N2 codificado por pPJV1671. SEC ID NO: 56 provee la secuencia de aminoácido N-terminal natural de antígeno HA de Panamá H3. SEC ID NO: 57 provee la secuencia de aminoácido N-terminal para el antígeno HA de Panamá H3 codificado por pPJV1671. SEC ID NO: 58 provee la secuencia de consenso de las secuencias SEC ID Nos 56 y 57. SEC ID NO: 59 provee la secuencia de nucleótido del vector pPML7789 y de secuencia de aminoácido del antígeno de VN1194H5. SEC ID NO: 60 provee la secuencia de aminoácido sola del antígeno de VN1194H5. SEC ID NO: 61 provee la secuencia de nucleótido del vector pPJV2012. SEC ID NO: 62 provee la secuencia de nucleótido del vector PJV7788. SEC ID NOS: 63 y 64 son los cebadores 5' y 3' utilizados en el Ejemplo 22 para amplificar el ADN de la cepa MS de HSV-2. SEC ID NO: 65 es la secuencia de aminoácido de ICP27 de la cepa del MS de HSV-2 con base en la secuencia de nucleótido de pICP27, Ejemplo 22. SEC ID NO: 66 y 67 son péptidos 45 y 46 reconocidos por células de ratones Balb/c en el Ejemplo 22. SEC ID NO: 68 es una secuencia de aminoácido de nuevo homólogos contenidos en los péptidos 45 y 46. SEC ID NOS: 69 y 70 son regiones de aminoácido de HSV-2 ICP27 y HSV-1 ICP27 que difieren por un aminoácido. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Antes de describir la presente invención con detalle, se entiende que esta invención no está limitada a las moléculas o parámetros del procedimiento particularmente ilustrados los cuales por supuesto pueden variar. También se entiende que la terminología utilizada en la presente es para el propósito de describir modalidades particulares de la invención solamente, y no pretende ser limitante. Además, la práctica de la presente invención utilizará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de virología, microbiología, biología molecular, técnicas de ADN recombinantes e inmunología todos los cuales están dentro de la experiencia de la técnica. Dichas técnicas se ejemplifican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Sambrook, y otros., Molecular Cloning: A Labora tory Manual (2da Edición, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach , vol. I & II (D. Glover, ed.); Ol igonucleotide Syn thesis (N. Gait, ed. , 1984); A Practi cal Guide to Molecular Cloning (1984); y Fundamental Virology. 2a. Edición, vol. I & II (B. N. Fields and D. M. Knipe, ed. ) . Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas en la presente, ya sea supra o infra , se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Se debe observar que, como se utiliza en la especificación y las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "uno" y "el, la" incluyen referentes plurales a menos que el contenido dicte claramente lo contrario . En instancias en donde se especifica un agente particular como comprendiendo unidades particulares, en una instancia preferida el agente puede consistir esencialmente de dichas unidades. A. Definiciones A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado que el comúnmente entendido por un experto en la técnica para el cual pertenece la invención. Aunque un número de métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos aquí se pueden utilizar en la práctica de la presente invención, los materiales y métodos preferidos se describen aquí. En la descripción de la presente invención, se utilizarán los siguientes términos, y pretenden estar definidos como se indica a continuación. El término "inmunización de ácido nucleico" se utiliza aquí para referirse a la introducción de una molécula de ácido nucleico que codifica uno o más antígenos o polipéptidos una célula hospedera para la expresión in vivo del antígeno o de antígenos. La molécula de ácido nucleico se puede introducir directamente en el sujeto receptor, tal como a través de inyección intramuscular o intradérmica estándar; distribución de partículas transdérmicas; inhalación; tópicamente, o a través de modos de administración orales, intranasales o mucosal. Particularmente, el ácido nucleico se puede administrar a través de la distribución de partículas transdérmicas. La molécula alternativamente se puede introducir ex vivo en células que se han sido removidas de un sujeto. En este último caso, las células contienen la molécula de ácido nucleico de interés se reintroducen en el sujeto de tal forma que se puede montar una respuesta inmune contra el antígeno codificado por la molécula de ácido nucleico. Las moléculas de ácido nucleico utilizadas en la inmunización son generalmente referidas en la presente como "vacunas de ácido nucleico". Cualquiera de los ácidos nucleicos mencionados pueden estar presentes en dichas vacunas y en particular las construcciones de ácido nucleico mencionadas aquí pueden estar presentes. El término "adyuvante" significa un material o composición capaz de específica o no específicamente alterar, mejorar, dirigir, redirigir, potenciar o iniciar una respuesta inmune específica de antígeno. De esta forma, la coadministración de un adyuvante con un antígeno puede dar como resultado una dosis inferior o menos dosis del antígeno siendo necesario para lograr una respuesta inmune deseada en el sujeto al cual el antígeno se administra, o la coadministración puede dar como resultado una respuesta inmune cualitativa y/o cuantitativamente diferente en el sujeto. En particular, la administración del adyuvante puede dar como resultado una respuesta inmune mejorada tal como una de mayor magnitud y/o duración. La efectividad de un adyuvante se puede determinar a través de la administración del adyuvante con una composición de vacuna en paralelo con una composición de vacuna sola a animales y anticuerpos de comparación y/o inmunidad mediada celular en dos grupos utilizando ensayos estándares tales como radioinmunoensayo, ELISA, y ensayos CTL. Las construcciones de la invención pueden expresar uno o más polipéptidos adyuvantes. Por "portador centra L" significa un portador en el cual un ácido nucleico hospedero (por ejemplo, ADN, ARN) se cubre con el fin de impartir un tamaño de partícula definido así como una densidad suficientemente alta para lograr el momento requerido para la penetración de membrana celular, de tal forma que la molécula hospedera se puede distribuir utilizando técnicas mediadas por partícula (por ejemplo, la patente de E. U. A. 5,100,792). Los portadores centrales típicamente incluyen materiales tales como tungsteno, oro, platino, ferrito, poliestireno y látex. Ver, por ejemplo, Parti cle Bombardmen t Technology for Gene Transfer, (1994) Yang, N. ed., Oxford University Press, New Cork, NY págs. 10-11. Por "jeringa sin aguja" significa un instrumento que distribuye una composición en partículas transdérmicamente sin la ayuda de la aguja convencional para perforar la piel. Las jeringas sin aguja para uso con la presente invención se explican aquí.
El término distribución "transdérmica" significa intradérmico (por ejemplo, en la dermis o epidermis) transdérmico (por ejemplo, "percutáneo") y administración transmucosa, es decir, distribución por medio del paso de un antígeno dentro o a través de la piel o tejido mucoso. Ver, por ejemplo, Transdermal Drug Delivery: Developmen tal Issues and Research Ini tia tives , Hadgraft and Guy (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1989); Con trolled Drug Delivery: Fundamen táis and Applica tions , Robinson and Lee (eds.), Marcel Dekker Inc., (1987); y Transdermal Delivery of Drugs, Vols. 1-3, Kydonieus and Berner (eds.), CRC Press, (1987). De esta forma, el término abarca la distribución de una jeringa sin aguja como se describe en la patente de E. U. A. 5,630,796, así como la distribución mediada por partículas como se describe en la patente de E. U. A. No. 5,865,796. Un "polipéptido" se utiliza en el sentido más amplio para referirse a un compuesto de dos o más aminoácidos de subunidad, análogos del aminoácido, u otros peptidomiméticos. Las subunidades pueden estar enlazadas a través de enlaces con péptidos o a través de otros enlaces, por ejemplo, éster, éter, etc. Como se utiliza aquí, el término "aminoácido" se refiere ya sea a aminoácidos naturales y/o no naturales o sintéticos, incluyendo glicina y ambos isómeros ópticos D o L, y análogos de aminoácidos y peptidomiméticos. Un péptido de tres o más aminoácidos es comúnmente denominado un oligopéptido si la cadena de péptido es corta. Si la cadena de péptido es larga, el péptido es típicamente denominado un polipéptido o una proteína. Un "antígeno" se refiere a cualquier agente, generalmente una macromolécula, que puede provocar una respuesta inmunológica en un individuo. El término se puede utilizar para referirse a una macromolécula individual o a una población homogénea o heterogénea de macromoléculas antigénicas. Como se utiliza aquí, "antígeno" generalmente se utiliza para referirse a una molécula de proteína o porción de la misma que contiene uno o más epítopos. Un "antígeno" puede comprender, por ejemplo, un polipéptido de existencia natural, un fragmento de dicho polipéptido que es inmunogénico o una forma variante de cualquiera que retiene la inmunogenicidad. En una instancia preferida, en donde se refiere un fragmento o una variante, la respuesta inmune generada puede preferiblemente ser capaz de reconocer el polipéptido adicional a partir del cual se deriva el fragmento o variante. Para los propósitos de la presente invención, los antígenos se pueden obtener o derivar de cualquier fuente apropiada. Para el propósito de la presente invención, un "antígeno" incluye una proteína que tiene modificaciones, tales como eliminaciones, adiciones y sustituciones (generalmente conservadoras en naturaleza) para la secuencia nativa, mientras la proteína mantenga suficiente inmunogenicidad. Estas modificaciones pueden ser deliberadas, por ejemplo a través de mutagénesis dirigida al sitio, o pueden ser accidentales, tales como a través de mutaciones de hospederos que producen los antígenos. En una modalidad particularmente preferida de la invención el antígeno utilizado o codificado puede ser un antígeno de influenza, un fragmento inmunogénico de un antígeno de influenza o una variante inmunogénica de ambos. Una "respuesta inmune" contra un antígeno de interés es el desarrollo en un individuo de una respuesta inmune humoral y/o celular al antígeno. Para propósitos de la presente invención, una "respuesta inmune humoral" se refiere a una respuesta inmune mediada por moléculas de anticuerpo, mientras una "respuesta inmune celular" es una mediada por linfocitos T y/o otras células de glóbulos blancos. Los términos "molécula de ácido nucleico" y "polinucleótido" se utilizan intercambiablemente aquí y se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, ya sea desoxiribonucleótidos o ribonucleótidos, o análogos de los mismos. Los polinucleótidos pueden tener cualquier estructura tridimensional y pueden llevar a cabo cualquier función, conocida o desconocida. Los ejemplos no limitantes de polinucleótidos incluyen un gen, un fragmento de gen, exones, intrones, ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia, ARN ribosomal, ribosimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácidos nucleicos e cebadores. Un polinucleótido típicamente está compuesto de una secuencia específica de cuatro bases de nucleótido: adenina (A) ; citosina (C) ; guanina (G) ; y timina (T) (uracil (U) para timina (T) cuando el polinucleótido es ARN) . De esta forma, el término secuencia de ácido nucleico es la representación alfabética de una molécula de polinucleótido. Esta representación alfabética se puede capturar en bases de datos en una computadora que tiene una unidad de procesamiento central y se utiliza para aplicaciones bioinformáticas tales como investigaciones genómicas funcionales y homología. Un "vector" es capaz de transferir las secuencias de ácido nucleico a células objetivo (por ejemplo, vectores virales, vectores no virales, portadores particulados, y liposomas). Las células objetivo pueden ser procarióticas o eucarióticas. Típicamente, "una construcción de vector", "vector de expresión" y "vector de transferencia de", significan cualquier construcción de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de un gen de interés y que puede transferir secuencias de gen a células objetivo. De esta forma, el término incluye la clonación y los vehículos de expresión, así como vectores virales. Un "plásmido" es un vector en la forma de un elemento genético extracromosómico . Una secuencia de ácido nucleico que "codifica" un antígeno seleccionado es una molécula de ácido nucleico que se transcribe (en el caso de ADN) y se traduce (en el caso de ARNm) en un polipéptido in vi tro o in vivo cuando se coloca bajo el control de secuencias reguladoras apropiadas. Los límites de la secuencia de codificación se determinan a través de un codón de inicio en el término 5' (amino) y un codón de detección de traducción en el término "carboxi 3 ' " . Para los propósitos de la invención, tales secuencias de ácido nucleico pueden incluir, pero no se limitan a, ADNc de ARNm viral, procariótico o eucariótico, secuencias genómicas de ADN o ARN viral o procariótico, y aún secuencias de ADN sintéticas, una secuencia de terminación de trascripción se puede localizar en 3' para la secuencia de codificación. En algunos casos una secuencia transcrita puede dar origen a múltiples polipéptidos, por ejemplo una trascripción puede contener múltiples marcos de lectura abiertos (ORF, por sus siglas en inglés) y también uno o más sitios de entrada de ribosoma interna (IRES, por sus siglas en inglés) para permitir la traducción de ORF después del primer ORF. Una trascripción se puede traducir para dar un polipéptido que subsiguientemente se divide para dar una pluralidad de polipéptidos. En algunos casos una construcción de ácido nucleico puede dar origen a múltiples transcripciones y por lo tanto una pluralidad de polipéptidos. Un "promotor" es una secuencia de nucleótido que inicia y regula la trascripción de un polinucleótido que codifica el polipéptido. Los promotores pueden incluir promotores inducibles (en donde la expresión de una secuencia de polinucleótido operablemente enlazada al promotor se induce a través de un analito, co-factor, proteína reguladora, etc.), promotores reprimibles (en donde la expresión de una secuencia de polinucleótido operablemente enlazada al promotor se reprime a través de un analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), y promotores constitutivos. Se pretende que el término "promotor" o "elemento de control" incluya regiones promotoras de longitud completa y segmentos funcionales (por ejemplo, trascripción o a traducción de control) de estas regiones. "Operablemente enlazado" se refiere a una configuración de elementos en donde los componentes así descritos se configuran para llevar a cabo su función usual. De esta forma, un promotor operablemente enlazado dado a una secuencia de aminoácido es capaz de efectuar la expresión de esa secuencia cuando las enzimas apropiadas están presentes. El promotor no necesita ser contiguo a la secuencia, mientras funcione para dirigir la expresión del mismo. De esta forma, por ejemplo, la intervención de secuencias transcritas pero no traducidas pueden estar presentes entre la secuencia promotora y la secuencia de ácido nucleico, y la secuencia promotora aún puede considerarse "operablemente enlazada" a la secuencia de codificación. "Recombinante" se utiliza aquí para describir una molécula de ácido nucleico (polinucleótido) de ADNc genómico, de origen semisintético o sintético, en virtud de este origen o manipulación no está asociado con toda una porción del polinucleótido con el cual está asociado por naturaleza y/o está enlazado a un polinucleótido diferente de aquel al cual está enlazado en naturaleza. Dos secuencias de ácido nucleico están contenidas dentro de una sola molécula de ácido nucleido recombinante son "heterólogas" con relación entre sí cuando no están anormalmente asociadas una con la otra en naturaleza. Los homólogos de polinucleótidos son referidos en la presente. Típicamente un polinucleótido que es homólogo a otro polinucleótido es al menos 70% homólogo al polinucleótido, preferiblemente por lo menos 75, 80 o 90% y preferiblemente por lo menos el 95%, 97% o 99% homólogo al mismo. Los métodos para medir la homología son bien conocidos en la técnica, y serán entendidos por los expertos en la técnica que en el presente contexto, la homología se calcula en base de identidad de ácido nucleico. Dicha homología puede, por ejemplo, existir sobre una región de al menos 15, preferiblemente al menos 30, por ejemplo por lo menos 40, 60 o 100 o más nucleótidos contiguos. La región de homología puede ser sobre al menos 150, preferiblemente por menos 200 y más preferiblemente sobre al menos 300 nucleótidos. La región de homología se puede relacionar con cualquiera de los elementos referidos en la presente con relación a las construcciones de ácido nucleico de la invención. En algunos casos, la región de homología puede ser sobre la región completa en cuestión, tal como por ejemplo, sobre la región completa de cualquiera de los elementos especificados aquí. Los niveles de homología de aminoácido equivalentes a aquellos referidos en relación a la homología de nucleótido anterior pueden estar presentes. De esta forma, cualquiera de los niveles anteriormente mencionados de homología puede aplicarse al nivel de aminoácido. La homología en el nivel de aminoácido puede, por ejemplo, ser sobre al menos 15, preferiblemente al menos 25, preferiblemente sobre al menos 50%, aún más preferiblemente al menos 75 y más preferiblemente sobre al menos 100 aminoácidos. La región de homología puede ser sobre la longitud completa del elemento en cuestión. Los métodos para medir la homología del polinucleótido o identidad son conocidos en la técnica. Por ejemplo el paquete UWGCG provee el programa BESTFIT que se puede utilizar para calcular la homología (por ejemplo, utilizado con su configuración por omisión) (Devereux y otros (1984) Nuclei c Acids Research 12, p387-395). Los algoritmos PILEUP y BLAST también se pueden utilizar para calcular secuencias de la homología o las secuencias alineadas (típicamente con sus configuraciones por omisión), por ejemplo como se describe en Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300; Altschul, S. F. y otros (1990) J Mol Biol 215:403-10. El software para llevar a cabo el análisis BLAST está públicamente disponible a través del Centro Nacional para información de Biotecnología (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo involucra primero identificar el par se secuencias con alta puntuación (HSP) a través de la identificación de palabras cortas en longitud W en la secuencia de consulta que ya sea coincida o satisfaga la puntuación T del umbral valuado positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en la secuencia de la base de datos. T es referida como el umbral de puntuación de palabra contigua (Altschul y otros, supra ) . Estos aciertos de palabras contiguas iniciales actúan como fuentes para iniciar las búsquedas para encontrar HSP que los contiene. Los aciertos de palabra se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia mientras la puntuación de la alineación acumulativa se puede incrementar. Las extensiones para los aciertos de palabra en cada dirección se detienen cuando: la puntuación de alineación acumulativa va de cero hacia abajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuo de puntuación negativa; o cuando se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLAST utiliza por omisión una longitud de palabra (W) de 11, la matriz de puntuación (B) de 50, de la matriz de puntuación BLOSUM 62 (ver Henikoff and Henikoff (1992) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 89:10915-10919), la expectación (E) de 10, M=5, N=4, y una comparación de ambas cepas. El algoritmo BLAST lleva a cabo un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias; ver, por ejemplo, Karlin and Altschul (1993) Proc. Na ti , Acad. Sci . USA 90:5873-5787. Una medida de la similitud provista por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que provee una indicación de la probabilidad a través de la cual una coincidencia entre dos secuencias de nucleótido o aminoácido podría ocurrir por casualidad. Por ejemplo, una secuencia se considera similar a otra secuencia si la probabilidad de la suma más pequeña en comparación con la primera secuencia de la segunda secuencia es menor de aproximadamente 1, preferiblemente menor de aproximadamente 0.1, más preferiblemente menor de aproximadamente 0.01, y más preferiblemente menor de 0.001.
La homología típicamente hibridiza con el polinucleótido relevante a un nivel significativamente arriba del fondo. El nivel de señal generado por la interacción entre el homólogo y el polinucleótido es típicamente de al menos 10 veces, preferiblemente al menos 100 veces, tan intenso como "hibridación de fondo". La intensidad de la interacción se puede medir, por ejemplo, radio marcando la sonda, por ejemplo, con 32P. La hibridación selectiva típicamente se logra utilizando condiciones de medio de alta restricción, (por ejemplo, 0.03 M de cloruro de sodio y 0.003 M de citrato de sodio a aproximadamente 50°C a aproximadamente 60°C. Las condiciones de hibridación estrictas pueden incluir 50% de formamida, 5 x de solución de Denhardt, 5x SSC, 0.1% de SDS y 100 µg/ml, de ADN de esperma de salmón desnaturalizado y las condiciones de lavado pueden incluir 2x de SSC, 0.1% de SDS a 37°C seguido por lx de SSC, 0.1% de SDS a 68°C. La definición apropiada de las condiciones de hibridación está dentro de la experiencia en la técnica. Ver, por ejemplo, Sambrook y otros, supra . El homólogo puede diferir de una secuencia en el polinucleótido relevante a través de menos de 3, 5, 10, 15, 20 o más mutaciones (cada una de las cuales puede ser una sustitución, duplicación, eliminación o inserción) . Estas mutaciones se pueden medir sobre una región de al menos 30, por ejemplo al menos 40, 60 ó 100 o más nucleótidos contiguos del homólogo. En algunos casos las mutaciones se pueden medir sobre la región completa del homólogo. Cuando un polinucleótido codifica un polipéptido, las sustituciones preferiblemente crean cambios "conservadores" en el aminoácido codificado. Estos se definen de acuerdo con la Tabla 1 siguiente. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferiblemente en la misma línea en la tercera columna se pueden sustituir uno con el otro en cambios conservadores . Tabla 1 ALIFATICO No Polar G A P I L V Polar no cargado C S T M N Q Polar cargado D E K R AROMÁTICO H F W Y El término "fragmento" indica una parte más pequeña de una entidad más grande. Los fragmentos de elementos específicos referidos en la presente se pueden utilizar en la invención. En particular, dichos fragmentos retendrán alguna o toda la funcionalidad del elemento original y en particular cualquiera de las funciones mencionadas aquí. En instancias preferidas un fragmento de un antígeno puede retener la inmunogenicidad y un fragmento de un adyuvante la habilidad para actuar como un adyuvante. En algunas instancias, un fragmento puede ser al menos 50%, preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 70%, aún más preferiblemente al menos 80%, más de preferencia al menos 90% y aún más preferiblemente al menos 95% de longitud del original. Un fragmento puede ser igual a o menos que dichos porcentajes de la longitud del original. Los términos "individual" y "sujeto" se utilizan de manera intercambiable en la presente para referirse a cualquier miembro del suborden de la corbata, incluyendo, sin limitación, humanos y otros primates, incluyendo primates no humanos tales como chimpancés y otros monos y especies de changos; animales de granja tales como ganado, carneros, puercos, cabras y caballos; mamíferos domésticos tales como perros y gatos; animales de laboratorio incluyendo roedores tales como ratones, ratas y conejillos de indias así como puercos; pájaros, incluyendo domésticos, salvajes y aves de casa tales como pollos, gallos y otros pájaros gallináceos, patos, gansos y similares. El término no denota ninguna edad particular, de esta forma, tanto individuos adultos como recién nacidos pretenden estar cubiertos. Los métodos descritos en la presente son previstos para el uso en cualquiera de las especies de vertebrados anteriores, ya que los sistemas inmunes de todos estos vertebrados operan similarmente . En algunas instancias, la invención se puede utilizar para inmunizar cualquier sujeto adecuado y en particular cualquier sujeto adecuado de una especie dada. En una instancia particular, cualquier sujeto humano adecuado puede inmunizarse. De esta forma, se puede inmunizar tanto sujetos como sea posible, por ejemplo, se pueden inmunizar sin énfasis sobre cualquier de sujetos grupo particular. Por ejemplo, una población de sujetos como un todo, o tantos como sea posible, se puede inmunizar. En particular, cuando la invención se está utilizando para tratar influenza, y especialmente para inmunizar contra una cepa pandémica de influenza, las construcciones de la invención se pueden utilizar para inmunizar cualquier sujeto y preferiblemente a tantos sujetos como sea posible. En otros casos, el sujeto o individuo puede ser uno con riesgo de infección o para el cual la infección podría se particularmente perjudicial. La infección puede, en una instancia preferida, ser una infección respiratoria. En particular, cuando la invención se está utilizando para prevenir o para tratar una infección respiratoria y en particular contra influenza, el sujeto puede ser un ser humano. En algunos casos, las construcciones de ácido nucleico de la invención se pueden administrar con preferencia, primero, a grupos de riesgo particular. Éste puede, por ejemplo, ser el caso de administración de construcciones para inmunizar contra las cepas no pandémicas de influenza. En algunos casos los sujetos pueden, por ejemplo, caer en una o más de las siguientes categorías: - un sujeto con un trastorno respiratorio y/o problemas cardíacos y en particular que tiene asma, enfisema, bronquitis y/o enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD, por sus siglas en inglés); un sujeto con una condición médica crónica tal como diabetes, supresión inmune, deficiencia inmune, enfermedad de la célula de hoz y/o enfermedad de riñon; un sujeto con edad de hasta por lo menos 50 años, preferiblemente de al menos 60 años, más preferiblemente al menos 65 años, aún más preferiblemente al menos 75 años de edad y aún más preferiblemente de al menos 80 años de edad; un niño en edad de 2 años o menos, en particular de 6 a 23 meses, por ejemplo 18 meses o menos; un sujeto en terapia de aspirina crónica y en particular en la edad de 6 meses a 18 años; una mujer embarazada y en particular una que estará en su segundo o tercer trimestre de embarazo durante la etapa de la influenza; un residente de una residencia de ancianos o instalación de cuidado a largo plazo; y/o un trabajador de cuidados para cualquiera de los anteriores que probablemente caerá en contacto regular con ellos B. Introducción General La invención se refiere a construcciones de ácido nucleico que permiten la expresión eficiente de secuencias de codificación heterólogas, y en particular genes que codifican el antígeno, en células hospederas. Las construcciones pueden, en algunos casos, expresar uno o más polipéptidos adyuvantes. Más específicamente, la invención provee construcciones de ácido nucleico que comprenden, o en algunas modalidades, que consisten esencialmente de una secuencia promotora quimérica y un sitio de clonación, tal como cuando una secuencia de codificación se inserta en el sitio de clonación, la secuencia de codificación está operablemente enlazada al promotor quimérico. La invención también provee construcciones con secuencias de codificación insertadas en el sitio o sitios de clonación. Las secuencias de codificación pueden codificar cualquiera de los polipéptidos referidos en la presente y en particular un antígeno y especialmente cualquiera de los antígenos y polipéptidos adyuvantes mencionados aquí. En una modalidad especialmente preferida las construcciones comprenden una secuencia de codificación y en particular una secuencia de codificación que codifica un antígeno, un fragmento inmunogénico del mismo o una variante inmunogénica de ambos. En una modalidad especialmente preferida las secuencias de codificación codifican un antígeno de influenza, un fragmento inmunogénico de la misma o una variante inmunogénica de ambos. En una modalidad referida adicional la secuencia de codificación puede codificar un polipéptido adyuvante y en particular una subunidad de toxina bacteriana de ribosilación ADP, un fragmento de la misma con actividad adyuvante o una variante de cualquiera con actividad adyuvante. El promotor quimérico comprende, o en algunas modalidades consiste esencialmente de: (a) una secuencia promotora temprana inmediata hCMV; (b) el exón 1 y por lo menos una parte del exón 2 del gen temprano inmediato principal hCMV; y (c) un intrón heterólogo provisto en lugar de la región del intrón A del gen temprano inmediato principal hCMV. La secuencia promotora temprana inmediata hCMV (a) puede comprender: (i) una secuencia promotora temprana inmediata hCMV nativa; (ii) una variante homologa funcional de la misma; o (iii) un fragmento funcional de (i) o (ii) . En la secuencia general (a) comprende aproximadamente 100 a 600, preferiblemente 200 a 600, por ejemplo 400 a 600 nucleótidos. La secuencia típicamente (a) comprende las secuencias presentes en (i) que enlazan factores de trascripción o polimerasa de ARN, o en lugar de cualquiera de estas secuencias, homólogos de estas secuencias capaces de unirse a los mismos factores de trascripción y polimerasa de ARN. Típicamente dichas secuencias o sus homólogos están presentes en la secuencia promotora (a) en el mismo orden y/o substancialmente la misma separación relativa como en (i ) . Generalmente, (i) comprende al menos de los nucleótidos -100 a -1, típicamente -150 a -1, por ejemplo -500 a -1 ó -600 a -1 del gen temprano inmediato principal hCMV. La secuencia (i) típicamente comprende la secuencia promotora central hCMV y también puede incluir uno o más elementos potenciadores presentes en el promotor temprano inmediato hCMV. Por ejemplo, (i) puede comprender de los nucleótidos -118 a -1, ó -524 a -1 como en US 6218140, o de los nucleótidos -62 a l ó -465 a -1 como en US 538 5839. Generalmente (i) incluye una caja TATA o una caja CAAT comúnmente encontrada en las secuencias promotoras. Preferiblemente la secuencia incluye una o más de las secuencias de repetición en el promotor temprano inmediato hCMV. En una modalidad preferida, (i) comprende el SEC ID NO: 1. En una modalidad preferida adicional, (i) comprende los nucleótidos 903 a 1587 de SEC ID NO: 54. En otra modalidad (i) puede comprender los nucleótidos 903 a 1587 de SEC ID NO: 14. En una modalidad preferida adicional (i) puede comprender los nucleótidos 1002 a 1686 ó 2624 a 3308 de SEC ID No. 57. En una modalidad preferida más (i) puede comprender los nucleótidos 1815 a 1935 y/o 1948 a 2632 de SEC ID No. 61 y en particular los nucleótidos 1948 a 2632 de SEC ID No.61. En otra modalidad preferida los nucleótidos 1815 a 1935 se pueden utilizar. En una modalidad particularmente preferida de la invención la secuencia promotora temprana inmediata hCMV (a) comprende: (i) la secuencia de nucleótido de SEC ID No. 1, nucleótidos 903 a 1587 de SEC ID No. 54, los nucleótidos 1815 a 1935 de SEC ID NO.: 61, los nucleótidos 1948 a 2632 de SEC ID NO. 61, los nucleótidos 1002 a 1686 de SEC ID NO. 62 y/o los nucleótidos 2624 a 3308 de SEC ID NO: 62; (ii) una variante funcional de (i) que tiene al menos 80% de homología de secuencia de nucleótido una o más de las secuencias de (i); y/o (iii) un fragmento funcional de (i) o (ii) . En algunas instancias, un fragmento puede comprender por lo menos 300 nucleótidos, preferiblemente por lo menos 400 nucleótidos, más preferiblemente por lo menos 500 nucleótidos y aún más preferiblemente por lo menos 600 nucleótidos en cada secuencia. El fragmento puede comprender hasta 800, hasta 600 o hasta 400 nucleótidos. Una secuencia promotora temprana inmediata hCMV puede obtenerse utilizando métodos conocidos. Un promotor temprano inmediato hCMV nativo se puede aislar directamente de una muestra del virus, usando técnicas estándares. US 5385839, por ejemplo, describe la clonación de una región promotora hCMV. La secuencia del promotor temprano inmediato hCMV está disponible en Genbank #M60321 (hCMV cepa Towne) y X17403 (cepa hCMV Adl69). Una secuencia nativa podría por consiguiente aislarse a través de PCR utilizando cebadores PCR con base en la secuencia conocida. Ver, por ejemplo Sambrook y otros, supra , para una descripción de las técnicas utilizadas para obtener y aislar ADN. Una secuencia promotora hCMV adecuada también podría aislarse de un vector de plásmido existente. Las secuencias promotoras también se pueden producir sintéticamente. Una variante funcional (ii) o fragmento (iii) es generalmente una que retiene y/o complementa la actividad del promotor nativo (i). Típicamente esta actividad es la habilidad para causar (incluyendo la iniciación y regulación) de la transcripción de un polinucleótido operablemente enlazado, en particular el gen temprano inmediato principal hCMV. En una modalidad, la variante o fragmento podría ser capaz de complementar la actividad del promotor nativo en un virus hCMV, por ejemplo permitiendo que el virus detenga la habilidad de infectar y/o replicarse en las células. Una variante homologa (ii) o fragmento (iii) se puede ensayar para la habilidad para retener y/o complementar la actividad de (i) . Por ejemplo, una variante o fragmento se puede ensayar para la habilidad para restaurar la funcionalidad (tal como la habilidad de infección y/o replicación) para el mutante hCMV en donde el promotor temprano inmediato hCMV nativo está defectuoso. Una variante homologa (ii) o fragmento (iii) se puede probar para utilidad utilizando el ensayo de expresión comparativo siguiente. La secuencia promotora de prueba se intercambia en el vector base en lugar del promotor temprano inmediato hCMV nativo. Típicamente, una variante funcional o fragmento permite por lo menos 50%, por ejemplo, 60, 70, 80, 90% o más de la expresión provista utilizando el vector base. Una variante o fragmento funcional puede proveer cualquiera de los niveles de expresión referidos aquí. En algunos casos, la variante o fragmento puede se provisto a un nivel más alto de expresión tal como al menos 50%, 100%, 150%, 200%, 300% o más incremento en actividad. Generalmente, la expresión es provista en por lo menos uno, pero preferiblemente dos, tipos de células de referencia. Típicamente, las células de referencia son células HEK 293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 o COS de mamíferos. Las células de referencia pueden ser células hospederas SSC-15 o B16 en algunos casos. Adicional o alternativamente, la secuencia promotora puede probarse en el ensayo de inmunogenicidad comparativo siguiente. La secuencia promotora de prueba se intercambia en el vector base en lugar del promotor temprano inmediato hCMV nativo. Una secuencia promotora funcional típicamente provee concentraciones de anticuerpo que al menos tan altas como o mayores que aquellas logradas por el vector base con al menos uno, preferiblemente dos antígenos. Las concentraciones de anticuerpo preferibles son de al menos 5%, 10%, 20%, 30% o 40% mayores que las del vector base. En algunos casos, el nivel de las concentraciones de antígeno puede ser cualquiera de las referidas aquí. Los antígenos adecuados son antígenos HBsAg, HSV 2gD y flu-M2. Los antígenos particularmente preferidos son los antígenos de influenza. Los antígenos de influenza incluyen los antígenos HA, NA, M2, NP, Ml, PBl, PB2, PA, NSl y NS2 y en particular los antígenos HA, NA y M2. En una modalidad especialmente preferida el antígeno HA o un fragmento del mismo o una variante de cualquiera. De acuerdo con los ensayos, una variante homologa funcional (ii) o fragmento funcional (iii) de la secuencia promotora nativa (i) es típicamente una que permite las concentraciones de anticuerpo más altas logradas por la secuencia nativa. En algunos casos, la concentración del anticuerpo puede ser ligeramente inferior incluyendo cualquiera de los niveles mencionados aquí. En instancias en donde una construcción de la invención codifica un polipéptido adyuvante, la prueba de inmunogenicidad comparativa se puede utilizar con un antígeno estándar y comparando un vector de prueba que codifica un polipéptido de actividad adyuvante conocida con un vector adyuvante estándar. Por ejemplo, un vector adyuvante de prueba puede codificar un fragmento o variante de un polipéptido adyuvante conocido y puede compararse contra un vector estándar que expresa el polipéptido adyuvante conocido en su habilidad para promover una respuesta inmune cuando se administra con un antígeno. Un fragmento o variante puede tener cualquiera de los niveles de actividad mencionados aquí y en particular proveerá al menos 50%, preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 85% y aún más preferiblemente al menos 100% de la actividad del adyuvante del adyuvante estándar. Preferiblemente, el vector de prueba y el vector estándar serán idénticos, o al menos substancialmente idénticos, aparte de las secuencias que codifican el adyuvante/polipépt ido bajo prueba. Como se mencionó anteriormente, la construcción puede comprender la secuencia de exón (b) que comprende la secuencia derivada del exón 1 y del exón 2 del gen temprano inmediato principal hCMV. Los exones son secuencias de codificación, que en naturaleza están generalmente separadas por intrones. En el gen temprano inmediato principal hCMV nativo, los exones 1 y 2 están usualmente separados por el intrón A nativo. En la presente construcción quimérica la secuencia del exón 2 está generalmente colocada en 3' de la secuencia del exón 1, sin intervenir en la secuencia del intrón, de tal forma que las secuencias del exón 1 y el exón 2 están contiguas. La secuencia de exón (b) puede comprender: (i) la secuencia de exón nativa, típicamente el exón 1 y (completo o parcial) el exón 2; (ii) una variante homologa de (i) que es funcional; o (iii) un fragmento funcional de (i) o (ii) . La secuencia (i) puede comprender de aproximadamente 50 a 100% de la secuencia del exón 1 del gen temprano inmediato principal hCMV, por ejemplo, de 60 a 90% ó 70 a 80%. Típicamente al menos 50% de la secuencia del exón 1 natural está presente, tal como 60%, 70%, 80%, 90% o más. La secuencia de exón (b) también comprende por lo menos una parte de la secuencia del exón 2. En la secuencia (i), típicamente 2 o más bases del exón 2 nativo, por ejemplo 2 a 9, 2 a 7 ó 3 a 5 bases están presentes. Hasta e incluyendo el 100% de la secuencia del exón 2 natural, por ejemplo 5 a 95%, 20 a 80% ó 40 a 60% de la secuencia del exón 2 natural pueden estar presentes. Típicamente, la variante homologa tiene cualquiera de las longitudes anteriormente mencionadas para la secuencia nativa. Preferiblemente (i) comprende el SEC ID No. 2. En una modalidad preferida adicional (i) comprende los nucleótidos 1588 a 1718 de SEC ID NO. 54. En una modalidad preferida adicional (i) comprende los nucleótidos 1588 a 1718 de SEC ID No. 14. En otra instancia preferida (i) comprende los nucleótidos 1684 a 1814 y/o 2633 a 2763 de SEC ID No. 51. En una modalidad preferida más, (i) puede comprender los nucleótidos 1687 a 1817 y/o 3309 a 3439 de SEC ID NO: SEC ID No.62. De esta forma, en modalidades particularmente preferidas la secuencia de exón (b) del promotor quimérico comprende : (i) la secuencia de nucleótidos de SEC ID No.2, la secuencia de nucleótido de los nucleótidos 1588 a 1718 de SEC ID No. 54, los nucleótidos 1684 a 1814 de SEC ID NO: 61, los nucleótidos 2633 a 2763 de SEC ID NO: 61, los nucleótidos 1687 a 1817 de SEC ID No: 62 y/o los nucleótidos 3309 a 3439 de SEC ID No: 62; (ii) la variante funcional de (i) que tiene al menos 80% de homología de secuencia de nucleótido a una o más de las secuencias de (i); y/o (iii) un fragmento funcional de (i) o (ii) . La secuencia de exón adecuada (b) se puede obtener utilizando métodos conocidos. Ver, por ejemplo, Sambrook y otros, supra , para una descripción de las técnicas utilizadas para obtener y aislar ADN. La secuencia del gen temprano o principal hCMV nativo se puede aislar directamente de una muestra de virus, utilizando técnicas estándar (ver, por ejemplo, MacLean, A (1998) "Preparation of HSV-DNA and Production of Infectious Virus" in Herpes Simplex Virus Protocols S. Brown, A Maclean, editors, Humana Press, Totowa, NJ, pp.19-26). La secuencia de un gen temprano inmediato principal hCMV, incluyendo la ubicación del exón 1 y el exón 2, está disponible en Genbank #M60321, X17403. Las secuencias del exón 1 y 2 nativas podrían por consiguiente aislarse cortando la secuencia del gen principal nativo en los sitios de restricción apropiados a través de PCR utilizando cebadores de PCR con base en las secuencias conocidas. Las secuencias de exón adecuadas podrían alternativamente aislarse de un vector de plásmido existente, tal como pWRG7128. Las secuencias de exón también se pueden producir sintéticamente, en lugar de clonarse. Las secuencias variantes pueden fácilmente construirse a través de metodologías de rutina tal como mutagénesis dirigida al sitio.
Generalmente la secuencia de exón, cuando está presente en la construcción de la invención, mejora la expresión, típicamente causando una mejora comparable con la secuencia del exón 1 y 2 nativa (i) mencionadas anteriormente. La secuencia de exón puede ensayarse para funcionalidad utilizando el ensayo de expresión comparativo siguiente. La secuencia de exón de prueba se intercambia en el vector base en lugar de la secuencia de exón ya presente. Generalmente la secuencia de exón es funcional si la secuencia no anula la expresión, pero preferiblemente incrementa la expresión en al menos una, preferiblemente dos tipos de célula de referencia cuando se compara con el vector base. Típicamente, las células de referencia son células HEK293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 o Cos de mamífero. Se pueden utilizar las células SSC15 o B16. Preferiblemente, la expresión se incrementa al menos 5%, 10%, 20%, 30% ó 40%. La expresión se puede incrementar a través de cualquiera de los niveles mencionados aquí. De acuerdo con este ensayo, una variante homologa funcional (ii) o fragmento funcional (iii) de la secuencia de exón natural (i) es una que típicamente permite por lo menos 50% de mejora de expresión provista por la secuencia natural. En algunos casos, cuando el nivel de expresión es inferior que aquel dado por el nivel base, la disminución puede ser cualquiera de los niveles mencionados aquí . Adicional o alternativamente, la secuencia de exón se puede probar en el ensayo de inmunogenicidad comparativo siguiente. La secuencia de exón de prueba se intercambia en el vector basa en lugar de la secuencia de exón ya presente. La secuencia de exón funcional provee concentraciones de anticuerpo que son típicamente al menos tan altas o más altas que aquellas logradas por el vector base con al menos uno, preferiblemente dos antígenos. Las concentraciones de anticuerpo preferiblemente son de al menos 5%, 10%, 20%, 30% ó 40% mayores que con el vector base. El incremento puede ser cualquiera de los niveles mencionados aquí. Los antígenos preferidos son los antígenos HBsAg, HSV 2gD y flu-M2. Los antígenos especialmente preferidos son antígenos de influenza, incluyendo cualquiera de los mencionados aquí y en particular los antígenos HA, NA y M2. El uso del antígeno HA, un fragmento inmunogénico del mismo o una variante inmunogénica de ambos es especialmente preferido. De acuerdo con este ensayo, una variante homologa funcional (ii) o fragmento funcional (iii) de la secuencia de exón natural (i) es una que típicamente permite concentraciones de anticuerpo más altas logradas por la secuencia natural. En casos en donde el nivel de la concentración del anticuerpo es ligeramente inferior, la disminución puede ser cualquiera de los niveles mencionados aquí. Los vectores adyuvantes pueden evaluarse en una forma equivalente como se explicó anteriormente . La construcción promotora quimérica comprende el intrón heterólogo (c) en lugar de la región de intrón A nativa del gen temprano inmediato principal hCMV. Un intrón es una secuencia de no-codificación que se divide del ARNhn transcrito de un gen. Un intrón heterólogo es uno que no está presente en la secuencia de codificación por naturaleza. El intrón heterólogo (c) reemplaza completa o parcialmente, al intrón A nativo del gen temprano inmediato principal hCMV. Típicamente, el intrón nativo A está ausente. En general el intrón heterólogo (c) es 3' de la secuencia del exón (b) . Típicamente el intrón heterólogo (c) comprende: (i) un intrón natural; (ii) una variante homologa funcional de (i); o (iii) un fragmento funcional de (i) o (ii) . El intrón heterólogo (c) es en general un intrón viral o eucariótico. Preferiblemente el intrón es un intrón de mamífero, en particular un intrón no humano, por ejemplo se puede utilizar un intrón de rata. En algunos casos, se puede emplear un intrón de pollo. Preferiblemente el intrón es un intrón A, por ejemplo, el intrón A de insulina de rata, el intrón A de queratina de pollo, o el intrón A de actinia cardiaca de pollo. En una modalidad especialmente preferida el intrón es el intrón A de insulina de rata. En una modalidad preferida el intrón heterólogo (c) comprende una secuencia seleccionada de la secuencia del intrón A del gen de insulina de rata, la secuencia del intrón A del gen de queratina de pollo, la secuencia del intrón A del gen de actina cardiaca de pollo, un fragmento funcional de cualquiera de estos o una variante funcional de cualquiera de los anteriores. Típicamente el intrón (c) tiene una longitud de aproximadamente 50 nucleótidos a aproximadamente 1000 nucleótidos, por ejemplo de aproximadamente 100 a aproximadamente 500 nucleótidos. El intrón (c) puede por ejemplo, comprender de 50 a 500 nucleótidos, tal como hasta 100, 200, 300 ó 400 nucleótidos. Preferiblemente el intrón comprende la secuencia encontrada en aproximadamente los nucleótidos 50 a 133 del intrón A de insulina de rata nativo, o un homólogo de esta secuencia. Preferiblemente el intrón heterólogo (c) es capaz dividirse de una trascripción de ARN en una célula hospedera eucariótica. En general el intrón comprende uno o más de una secuencia donadora (tal como GT) , una secuencia aceptora (tal como AG) , una región rica en pirimidina 3' y una región de punto de ramificación. La región rica y de pirimidina, si está presente, puede incluir, por ejemplo, al menos 5, 8, 10 o más pirimidinas. Preferiblemente, el intrón comprende por lo menos una secuencia donadora, una secuencia aceptora, y una secuencia de punto de ramificación. Típicamente en la construcción quimérica, el intrón (c) comprende secuencias de flanqueo no de intrón que se derivan de las secuencias de exón encontradas en los límites del intrón/exón del intrón natural (i) . La secuencia del exón de flanqueo puede ser una secuencia de exón nativa o un homólogo de esta secuencia que retiene substancialmente la misma actividad que la secuencia nativa, por ejemplo, retiene la función de empalme. Típicamente de 5 a 10, preferiblemente de 7 a 10 bases de secuencia de exón se incluyen en cada extremo del intrón. El intrón (c) puede ser un intrón artificial, siempre que intrón sea funcional. Por ejemplo, un intrón recombinante o quimérico se puede utilizar dicho intrón puede comprender la secuencia de más de un intrón natural. Típicamente el intrón (c) comprende secuencias presentes en el intrón A hCMV que unen factores de trascripción o proteínas reguladoras o en lugar de cualquiera de estas secuencias, homólogos de estas secuencias capaces de unirse a los mismos factores o proteínas. Típicamente dichas secuencias o sus homólogos están presentes en el intrón (c) en el misma orden y/o substancialmente la misma separación relativa como en el intrón A hCMV. El intrón (c) puede comprender una variante homologa (11) en donde la secuencia del intrón natural (i) ha sido modificada para remover un sitio de restricción interno. Por ejemplo, una variante homologa del intrón A de insulina de rata se puede utilizar en donde se ha destruido el sitio Nhel interno. Preferiblemente, el intrón (c) comprende: (i) SEC ID No.3; (n) una variante homologa funcional de (i); o (m) un fragmento funcional de (i) o de (n) . En una instancia preferida adicional, (i) puede comprender los nucleótidos 1725 a 1857 de SEC ID NO: 54 o los mismos nucleotidos de SEC ID No. 14. En una modalidad preferida adicional (i) puede comprender los nucleótidos 1545 a 1677 y/o 2770 a 2902 de SEC ID NO: 61. En otra modalidad preferida, (i) puede comprender los nucleótidos 1824 a 1956 y/o 3446 a 3578 de SEC ID NO: 62. En una modalidad preferida, la secuencia del intrón A del gen de insulina de rata comprende: (i) la secuencia de nucleótidos de SEC ID No. 3, la secuencia de nucleotidos de los nucleótidos 1725 a 1857 de SEC ID No.54, los nucleótidos 1545 a 1677 de SEC ID NO: 61, los nucleotidos 2770 a 2902 de SEC ID NO: 61, los nucleotidos 1824 a 1956 de SEC ID NO: 62 y/o los nucleótidos 3446 a 3578 de SEC ID NO: 62; (n) una variante funcional de (i) que tiene al menos 80% de homología de secuencia de nucleótido a uno o más de las secuencias de (i); y/o (iii) un fragmento funcional de (i) o (ii) . La secuencia de intrón (c) se puede obtener utilizando técnicas de clonación estándar. Por ejemplo, la secuencia del intrón A de insulina de rata está disponible en GenBank J00748, la secuencia del intrón A de queratina de pollo en GenBank J00847, y la secuencia del intrón A cardiaca de pollo en GenBank X02212. La secuencia de intrón se puede aislar de fuentes naturales utilizando cebadores basados en la secuencia conocida. La secuencia se puede preparar sintéticamente. Las secuencias variantes se pueden obtener a través de mutagénesis. Típicamente una secuencia de intrón funcional, por ejemplo, una variante funcional (ii) o un fragmento funcional (iii) es una que tiene substancialmente la misma actividad que, y/o complementa la actividad de un intrón natural (i) . En una modalidad la actividad es la actividad de empalme. Las secuencias de intrón (c) se pueden probar para la actividad de empalme utilizando un ensayo de empalme de rutina. En general un homólogo funcional (ii) o fragmento funcional (iii) mostrará al menos 50%, por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90% y hasta 100% o más de la eficiencia de empalme del intrón natural (i) en el ensayo. En general la secuencia de intrón heteróloga, cuando está presente en la construcción de la invención, mejorará la expresión. Típicamente, un intrón de variante (ii) o fragmento (iii) causará una mejora comparable con el intrón natural (i). En algunos casos, se podría ver una disminución en la expresión incluyendo cualquiera de los niveles mencionados aquí. La funcionalidad de la secuencia del intrón potencial (c) se puede probar utilizando el ensayo de expresión comparativo siguiente. El intrón heterólogo se intercambia en el vector base. Generalmente, la secuencia del intrón heteróloga es funcional si la adición de la secuencia incrementa la expresión en al menos uno, preferiblemente dos tipos de células de referencia en 25% o más, comparado con el vector base. Típicamente las células de referencia son células HEK293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 o COS de mamíferos. Las células SSC15 o B16 se pueden utilizar. El incremento en la expresión puede ser de al menos 35%, 45%, 55% o más. El incremento puede ser cualquiera de los niveles mencionados aquí. De acuerdo con este ensayo, una variante funcional (i) o fragmento funcional (ii) de la secuencia de intrón natural (i) es típicamente una que permite más del 50% de la mejora de expresión lograda por la secuencia natural. En los casos en donde la disminución en la expresión se ve en la disminución puede, por ejemplo, ser cualquiera de los niveles mencionados aquí.
Una secuencia de intrón heteróloga (c) puede, por ejemplo adicional o alternativamente probarse para funcionalidad utilizando el ensayo de inmunogenicidad comparativo siguiente. La secuencia de intrón (c) se agrega al vector base. Una secuencia de intrón funcional (c) provee concentraciones de anticuerpo que son mayores que aquellas logradas por el vector base con al menos uno, preferiblemente dos antígenos. Preferiblemente, las concentraciones de anticuerpo son al menos 5 o 10%, por ejemplo 20%, 30% ó 40% mayores que con el vector base. Los antígenos preferidos son los antígenos HBsAg, HSV2gD y Flu-M2. Los antígenos especialmente preferidos son los antígenos de influenza, incluyendo cualquiera de aquellos mencionados aquí y en particular los antígenos HA, NA y M2. En particular, el antígeno de HA, ?n fragmento inmunogénico del mismo o una variante inmunogénica de ambos se puede utilizar. De acuerdo con este ensayo, una variante funcional (ii) o fragmento funcional (iii) de una secuencia de intrón natural (i) típicamente es una que permite que se logren concentraciones de anticuerpo más altas a través de la secuencia natural. En algunos casos una disminución podría verse, los niveles pueden, por ejemplo, ser cualquiera de los mencionados aquí. Los vectores adyuvantes se pueden evaluar en una forma como se explicó en cualquier lugar aquí. La secuencia de intrón heteróloga adecuada se puede obtener utilizando técnicas de clonación estándar. Por ejemplo, la secuencia del intrón A de insulina de rata está disponible en GenBank J00748, el intrón A de queratina de pollo en GenBank J00847, y el intrón A de actinia cardiaca de pollo en X02212. La secuencia de intrón se puede aislar de fuentes nativas utilizando cebadores basados en los datos de secuencia conocidos. La secuencia adecuada también se puede preparar sintéticamente. Las secuencias de componente (a), (b) y (c) se pueden proveer adecuadamente enlazadas para formar un promotor quimérico utilizando clonación estándar o técnicas de biología molecular. Preferiblemente, la secuencia de intrón (c) es provista en 3 ' de la secuencia de exón (b) . La construcción del promotor quimérico está enlazada a un sitio de clonación, en tal forma que el promotor efectuará la expresión de la secuencia de codificación insertada en el sitio, cuando están presentes las enzimas apropiadas. Los sitios de clonación adecuados, incluyendo sitios de multi-clonación son conocidos en la técnica, por ejemplo los sitios de multiclonación pUC19, pBC SK, pBluescript II KS, CDNA3.1, pSP72, pGEM 7Z. Cualquier sitio de restricción adecuado puede, por ejemplo, utilizarse como un sitio de clonación para insertar las secuencias de codificación. En una modalidad preferida, el promotor quimérico empleado comprende: (i) la secuencia de nucleótido de SEC ID No. 4 o la secuencia de nucleótido de los nucleótidos 903 a 1857 de SEC ID No. 54; (ii) una variante funcional de (i) que tiene al menos 80% de homología de secuencia de nucleótido a (i); y/o (iii) un fragmento funcional de (i) o de (ii) . En una modalidad preferida adicional, el promotor quimérico utilizado puede ser uno que comprende la secuencia de SEC ID NO: 14. Típicamente, un ácido nucleico para inserción (o insertado) en el sitio de clonación codifica un polipéptido terapéuticamente relevante. Se prefiere que la secuencia de codificación sea adecuada para uso en la inmunización de ácido nucleico o terapia de gen. El inserto de ácido nucleico puede de esta forma comprender una secuencia capaz de proveer inmunidad, por ejemplo una secuencia inmunogénica que provoca una respuesta inmune humoral y/o celular cuando se distribuye a un sujeto. Alternativamente, el ácido nucleico puede comprender unos o más genes que codifican un polipéptido terapéutico, por ejemplo, una proteína defectuosa o carente de un genoma celular objetivo o una proteína no nativa que tiene un efecto biológico o terapéutico deseado (por ejemplo, una función antiviral) . La construcción puede codificar un polipéptido adyuvante. Para el tratamiento de trastornos genéticos, los genes funcionales correspondientes a los genes conocidos como siendo deficientes en un trastorno particular se pueden administrar a un sujeto. Preferiblemente, el ácido nucleico es ADN. El ácido nucleico puede en algunos casos ser ARN o HAP. En algunos casos un ARN no de codificación se puede expresar a través de una construcción de la invención. De esta forma el vector puede haber sido insertado en el sitio de clonación en una región que pueda dar origen al ARN, por ejemplo un ARN anti-sentido o ARNSi. El ARN anti-sentido o ARNSi puede, por ejemplo, inhibir la expresión de cualquiera de los genes mencionados aquí, o un gen de cualquiera de los patógenos mencionados aquí. Sin embargo, en la modalidad más preferida, se codifica un polipéptido. Los ácidos nucleicos adecuados para inserción incluyen aquellos utilizados para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, autoinmunes, enfermedades crónicas e infecciosas, incluyendo trastornos tales como SIDA, cáncer, enfermedades neurológicas, enfermedades cardiovasculares, hipercolestemia; varios trastornos sanguíneos incluyendo varias anemias, talasemia o hemofilia; defectos genéticos tales como fibrosis cística, enfermedad de Gaucher, deficiencia de aminasa de adenosina (ADA, por sus siglas en inglés), enfisema, etc. Las construcciones en la invención se pueden utilizar para tratar o prevenir una condición. Las construcciones se pueden utilizar para mejorar una condición y/o eliminar o reducir un síntoma particular, o todos, de un trastorno. En una instancia preferida particularmente las construcciones se pueden utilizar para vacunar a un sujeto contra un patógeno. Por ejemplo, en los métodos para el tratamiento de tumores sólidos, los genes que codifican péptidos tóxicos (es decir, agentes quimioterapéuticos tales como ricina, toxina de difteria y el factor de venoma de cobra) , genes supresores de tumor tales como p53, genes que codifican secuencias de ARNm que son anti-sentido para los oncogenes de transformación, péptidos antineoplásticos tales como el factor de necrosis de tumor (TNF, por sus siglas en inglés) y otras citocinas, o mutantes negativos transdominantes de oncogenes de transformación, se pueden insertar para la expresión en o cerca del sitio de tumor. En una modalidad preferida una construcción de la invención puede codificar un polipéptido para tratar o prevenir un cáncer. En una modalidad particularmente preferida una construcción de la invención puede codificar un antígeno de tumor. Ejemplos de antígenos asociados con tumor incluyen, pero no se limitan a, antígenos de cáncer en los testículos tales como los miembros de la familia MAGE (MAGE 1, 2, 3 etc.), NY-ESO-1 y SSX-2, diferenciación de antígenos tales como tirosinasa, gplOO, PSA, Her-2 y CEA, antígenos automutados y antígenos de tumor viral tales como E6 y/o E7 de los tipos HPV oncogénicos. Los ejemplos adicionales de antígenos de tumor particulares incluyen MART-1, Melan-A, p97, beta-HCG, GalNAc, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-4, MAGE-12, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC18, CEA, DDC, PÍA, EpCam, el antígeno de melanoma gp75, Hker 8, antígeno de melanoma de alto peso molecular, K19, Tyrl, Tyr2, miembros de la familia del gen 17 pMel, c-Met, PSM (antígeno de mucina de próstata) , PSMA (antígeno de membrana específica de próstata) , proteína que secreta la próstata, alfa-fetoproteína, antígeno CA125, CA19.9, TAG-72, BRCA-1 y el antígeno BRCA-2. Los ejemplos de cánceres particulares que el antígeno puede derivar incluyen aquellos de cánceres de pulmón, próstata, pecho, colon, ovario, testículos, intestino, melanoma, un linfoma y una leucemia. Las construcciones de la invención también se pueden utilizar para tratar o prevenir tales cánceres. Similarmente, los ácidos nucleicos que codifican polipéptidos conocidos para desplegar actividad antiviral y/o antibacteriana, o estimular el sistema inmune del hospedero, también se pueden incluir. El ácido nucleico puede codificar una de las varias citocinas (o fragmentos funcionales de la misma), tales como interleucinas, interferones y factores estimuladores de colonia.
En una instancia preferida, las secuencias de codificación pueden codificar un antígeno, un fragmento inmunogénico del mismo o una variante inmunogénica de ambos. El antígeno puede ser en particular un antígeno de patógeno viral, bacterial, de parásito o fúngico o un antígeno de tumor. En una instancia preferida, el antígeno es antígeno viral, un fragmento inmunogénico del mismo o una variante inmunogénica de ambos. El ácido nucleico puede codificar un antígeno para el tratamiento o prevención de un número de condiciones que incluyen pero no se limitan a cáncer, alergias, toxicidad e infección a través de un patógeno tal como pero no limitándose a, hongo, virus incluyendo el virus de papiloma humanos (HPV, por sus siglas en inglés), VIH, HSV2/HSV1, virus de influenza (tipo A, B y C) , virus del polio, virus RSV, Rinovirus, Rotavirus, virus de hepatitis A, el grupo de virus Norwaik, enterovirus, Astrovirus, virus de sarampión, virus de para-influenza, virus de paperas, virus de Varicela Zoster, Citomegalovirus, virus de Epstein-Barr, adenovirus, virus de rubéola, virus del tipo I de linfoma de célula T humana, (HTLV-I), virus de hepatitis B (HBV), virus de hepatitis C (HCV) , virus de hepatitis D, virus de viruela, Marburg y Ebola; bacterias incluyendo M. tuberculosis , Chlamydia , N. gonorrhoeae , Shigella , Salmonella , Vibrio Cholera , Treponema pallidua , Pseudomonas , Bordetella pertussis , Brucella , Franciscella tulorensis , Helicobacter pylori , Leptospria interrogaus , Legionella pnumophila , Yersinia pestis, Streptococcus (tipos A and B) , Pneumococcus , Meningococcus , Hemophilus infl uenza (tipo b) , Toxopla a gondii , Complybacteriosis , Moraxella ca tarrhalis , Donovanosis , y Actinomycosis; patógenos fúngicos incluyendo Candidiasis y Aspergillosis ; patógenos parasíticos incluyendo solitaria, lombrices, ascárides, amibas, Giardiasis, Criptosporidio, Schitosoma, Pneumocystis carinii, tricomoniasis y triquinosis. El ácido nucleico también puede utilizarse para proveer una respuesta inmune adecuada contra numerosas enfermedades veterinarias, tales como enfermedades de fiebre aftosa, coronavirus, Pasteurella mul tocida , Helicobacter, Strongylus vulgaris , Actinobacillus pleuropneumonia , virus de diarrea viral de bovino (BVDV, por sus siglas en inglés), Klebsiella pneumoniae, E. coli , Bordetella pertussis , Bordetella parapertussis and Bordetella brochisepti ca . De esta forma, en un aspecto, las construcciones de ácido nucleico de la presente invención pueden encontrar uso en una vacuna. Las vacunas de la invención se pueden utilizar para vacunar contra cualquiera de los patógenos y condiciones mencionados aquí. De esta forma, la invención provee una composición de vacuna que comprende una construcción de ácido nucleico de la invención o una población de construcciones de ácido nucleico de la invención o partículas cubiertas de la invención. En una instancia preferida una construcción de ácido nucleico de la invención puede codificar un antígeno de un miembro de adenoviridae (incluyendo por ejemplo un adenovirus humano), herpesvirida e (incluyendo por ejemplo HSV-1, HSV-2, EBV, CMV y VZV), papovaviridae (incluyendo por ejemplo HPV), poxviridae (incluyendo por ejemplo viruela y vacuna), parvoviridae (incluyendo por ejemplo parvovirus B19) , reoviridae (por ejemplo incluyendo un rotavirus), coronaviridae (incluyendo por ejemplo SARS), flaviviridae (incluyendo por ejemplo fiebre amarilla, virus del Nilo del oeste, dengue, hepatitis C, y encefalitis de marca de nacimiento), pi cornaviridae (incluyendo polio, rinovirus, y hepatitis A), togaviridae (incluyendo por ejemplo el virus de rubéola), fi loviridae (incluyendo por ejemplo Marburg y Ebola), paramyxoviridae (incluyendo por ejemplo un virus de parainfluenza, virus sisticial respiratorio, paperas y sarampión), rhabdoviridae (por ejemplo incluyendo el virus de rabia), bunyaviridae (incluyendo por ejemplo el virus Hantaan), orthomyxoviridae (incluyendo por ejemplo el virus de influenza A, B y C) , retroviridae (incluyendo por ejemplo el VIH y HTLV) y hepadnaviridae (incluyendo por ejemplo hepatitis B) . En una instancia preferida adicional el antígeno puede estar en la forma de un patógeno responsable de una enfermedad veterinaria y en particular puede ser de un patógeno viral, incluyendo, por ejemplo, un renovirus (tal como la enfermedad del caballo africano o virus de la lengua azul) y virus de herpes (incluyendo herpes de equino) . El antígeno puede ser uno del virus de la enfermedad de fiebre aftosa. En una instancia preferida adicional el antígeno puede estar en la forma de un virus de encefalitis de marca de nacimiento, virus de dengue, SARS, virus del oeste del Nilo y el virus Hantaan. En otro caso preferido el antígeno puede estar en la forma de un retroviradae (por ejemplo HTLV-I; HTLV-11; o VIH-1 (también conocido como HTLV-111, LAV, ARV, hTLR, etc.)). En particular de VIH y en particular los aislados HlVIllb, HIVSF2, HTVLAV, HIVLAI, HIVMN; VIH-1CM235, VIH-1; o HIV-2. En una modalidad particularmente preferida, el antígeno puede ser un antígeno de virus de inmunodeficiencia humana (VIH) . Los ejemplos de antígenos de VIH incluyen, por ejemplo, antígenos gpl20, gp 160 gp41, gag tales como p24gag y p55gag, también como proteínas derivadas de las regiones pol, env, tat, vif, rev, nef, vpr, vpu o LTR de VIH. En un caso particularmente preferido el antígeno puede ser el VIH gpl20 o una porción de VIH gpl20. El antígeno puede estar en la forma de un virus de inmunodeficiencia, y puede, por ejemplo, ser de SIV o un virus de inmunodeficiencia de felino . De esta forma, el polipéptido codificado puede ser un antígeno, un fragmento inmunogénico del mismo, o una variante inmunogénica del mismo. El fragmento o variante puede, por ejemplo, tener cualquiera de los niveles de homología, proporción de longitud del antígeno original, y funcionalidad especificada aquí y en particular la habilidad para dar origen a una respuesta inmune. En algunos casos, la secuencia de codificación de la construcción de ácido nucleico puede haber sido modificado para optimizar la expresión. Por ejemplo, el uso del codón se puede modificar a aquel típico del sujeto. Una secuencia Kozak de consenso para el sujeto también puede substituirse por la secuencia de existencia natural alrededor del codón de inicio. En una modalidad especialmente preferida la construcción de ácido nucleico de la invención comprende una secuencia de codificación que codifica un antígeno de influenza, un fragmento inmunogénico de la misma, o una variante inmunogénica de ambos. El fragmento y/o variante pueden tener cualquiera de los niveles de homología de secuencia, longitudes de fragmento y/o niveles de funcionalidad especificados aquí. En particular, preferiblemente una secuencia de codificación de la construcción codifica un antígeno de virus de influenza, un fragmento inmunogénico de un antígeno de virus de influenza o una variante inmunogénica con 80% de homología de aminoácido para cualquiera de los anteriores.
Por ejemplo el antígeno de influenza puede ser un antígeno NP de influenza (nucleoproteína/proteína de nucleocapsida) , HA (hemaglutinina), NA (neuraminidasa), Ml, M2, PBl, PB2, PA, NSl y/o NS2 o puede ser un fragmento o variante de dichos antígenos. En una modalidad preferida el antígeno codificado puede ser el antígeno de influenza HA, NA y/o M2 o un fragmento o una variante de dichos antígenos. En una instancia especialmente preferida, el antígeno codificado puede ser un antígeno HA o NA o un fragmento o variante de dichos antígenos y en particular un antígeno HA o un fragmento o variante de dicho antígeno. De esta forma, en una construcción especialmente preferida de la invención el antígeno codificado es hemaglutinina de influenza (HA) , un fragmento inmunogénico de la misma o una variante inmunogénica con 80% de homología de secuencia de aminoácido para cualquiera. En una instancia preferida adicional el antígeno codificado es Neuraminidasa de influenza (NA), M2, un fragmento inmunogénico de cualquier o una variante inmunogénica con 80% de homología de secuencia de aminoácido para cualquiera de los anteriores. En una instancia preferida, una construcción de la invención puede codificar más de un polipéptido y en particular más de un antígeno de influenza, un fragmento inmunogénico o una variante inmunogénica de ambos. En instancias en donde se va a utilizar más de un antígeno en una instancia preferida se pueden utilizar los antígenos HA y NA juntos o un fragmento o una variante de dichos antígenos. En instancias en donde una construcción de la invención expresa más de un antígeno de influenza, fragmento inmunogénico, o variante inmunogénica de ambos, por lo menos dos de los diferentes antígenos, fragmentos o variantes codificados son del mismo polipéptido de influenza de diferentes cepas del virus de influenza. En una modalidad preferida el antígeno puede estar en la forma de la cepa H5N1 de los fragmentos de influenza e inmunogénicos de la misma y variantes de ambos que retienen inmunogenicidad se pueden utilizar. En particular, el antígeno puede estar en la forma de la cepa H5N1 o un fragmento de dicho antígeno. En dichas instancias, el antígeno puede ser un fragmento o variante de un polipéptido de influenza de existencia natural. Por ejemplo, el antígeno puede corresponder a una sub-región de un polipéptido de influenza de existencia natural que incluye cualquiera de las varias longitudes de fragmento referidas aquí. El antígeno puede ser una variante de un antígeno de influenza de existencia natural o de un fragmento de dicho antígeno. Preferiblemente dichas variantes y/o fragmentos serán capaces de dar origen a una respuesta inmune capaz de reconocer el antígeno y en particular el virus de influenza del cual se derivan el fragmento o la variante. El antígeno de influenza puede estar en la forma de cualquier virus de influenza. El antígeno puede ser del virus de influenza A, B o C, en particular de influenza A y/o B. El antígeno puede estar en la forma de una cepa de influenza variante y en particular una cepa variante asociado con una inefectividad incrementada o patogenicidad de la cepa de influenza. El antígeno puede, por ejemplo, estar en la forma de una de las cepas identificadas anualmente por la Organización Mundial de la Salud a utilizarse en vacunas de influenza y en particular puede ser un antígeno identificado por WHO para dicho uso. En una instancia preferida, una construcción de ácido nucleico, población de ácidos nucleicos, composición farmacéutica o vacuna de la invención pueden codificar un antígeno de cada una de las tres cepas de influenza y en particular las tres cepas identificadas por WHO u otras autoridades equivalentes en un año particular. En una instancia preferida, uno o más de los antígenos de influenza codificados pueden originarse de una cepa de influenza pandémica. De esta forma, el antígeno de influenza, el fragmento inmunogénico o una variante de cualquiera puede estar en la forma de una cepa de influenza pandémica. Una construcción que codifica el antígeno a partir de la cepa pandémica puede, por ejemplo, administrarse, o estar presente, por sí mismo. En otros, la construcción también puede codificar, o administrarse con otras construcciones que codifican, otros antígenos. En un caso particular, un antígeno de una cepa de influenza pandémica y un antígeno de una cepa de influenza no pandémica pueden codificarse ya sea en la misma o separadas construcciones. En particular, un antígeno de gripe pandémica y un antígeno de 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más cepas de influenza no pandémica se pueden administrar, preferiblemente un antígeno de cada una de 3, 4 ó 5 cepas de influenza no pandémicas se pueden administrar y aún más preferiblemente un antígeno de cada una de las 3 ó 4 cepas de influenza no pandémicas se pueden administrar . En algunas instancias, la construcción puede codificar más de un polipéptido. En particular, una construcción puede codificar más de un antígeno y especialmente más de un antígeno de influenza. Por ejemplo, la construcción puede expresar dos, tres, cuatro, cinco, seis o más polipéptidos y en particular antígenos. En un caso preferido, la construcción puede codificar tres, cuatro, cinco o más diferentes polipéptidos y en particular antígenos. En un caso aún más preferido la construcción puede codificar tres, cuatro o cinco diferentes polipéptidos y en particular antígenos. En aún un caso más preferido la construcción puede codificar tres o cuatro diversos polipéptidos, en particular antígenos y especialmente antígenos de influenza. Al menos uno de los antígenos se expresará utilizando el promotor quimérico de la invención y preferiblemente todos los antígenos se expresaran de esta forma. Típicamente, cada antígeno puede expresarse de un promotor quimérico separado de la invención. En algunos casos, se puede utilizar un solo promotor para generar una trascripción que da origen a una pluralidad de polipéptidos. En algunos casos, se pueden expresar varios antígenos como una proteína de fusión. En una instancia preferida, una construcción de la invención codifica un antígeno de influenza pandémico, un fragmento inmunogénico de la misma, o una variante inmunogénica de ambos y uno o más antígenos de influenza no pandémicos, fragmentos inmunogénicos de lo mismo o variantes inmunogénicas de cualquiera. Las construcciones de ácido nucleico de la invención se pueden utilizar en una vacuna. De esta forma, la invención provee una composición de vacuna que comprende una construcción de ácido nucleico, una población de construcciones de ácido nucleico o partículas portadoras cubiertas de la invención. La vacuna puede comprender un portador excipiente farmacéuticamente adecuado. La vacuna puede comprender un adyuvante y en particular una construcción adyuvante de la invención. Alternativamente, la vacuna puede administrarse separadamente, secuencialmente o simultáneamente con dicho coadyuvante. En una instancia preferida, la invención provee una vacuna multivalente que comprende por lo menos dos diferentes construcciones de la invención que codifican diferentes antígenos, fragmentos inmunogénicos de los mismos, o variantes inmunogénicas de cualquiera. El antígeno puede ser cualquiera de aquellos mencionados aquí. En una instancia preferida, la invención provee una vacuna multivalente que comprende al menos dos diferentes construcciones de la invención que codifican diferentes antígenos de influenza, fragmentos inmunogénicos de la misma o variantes inmunogénicos de cualquiera. En instancias alternativas, una pluralidad de antígenos se puede expresar de la misma construcción para proveer una vacuna multivalente o combinaciones de construcciones que codifican antígenos individuales y plurales se pueden utilizar. En una instancia preferida adicional, una vacuna multivalente de la invención puede ser una que es una vacuna trivalente, tetravalente o pentavalente que codifica tres, cuatro o cinco diferentes antígenos, fragmentos inmunogénicos o variantes inmunogénicas y en particular el antígeno de influenza, fragmentos o variantes de ambos. En otra instancia preferida una vacuna de la invención, que incluye vacunas multivalentes, puede comprender una construcción que codifica un antígeno de influenza pandémico, fragmentos inmunogénicos de los mismos o variantes inmunogénicas de cualquiera. Una vacuna multivalente puede codificar un antígeno de influenza pandémico, un fragmento inmunogénico, o una variante inmunogénica de ambos y también, por ejemplo, un antígeno de cada una de los tres, cuatro o cinco diferentes cepas de influenza, fragmentos inmunogénicos de los mismos o variantes inmunogénicas de cualquiera. Un adyuvante puede estar presente en una vacuna de la invención o administrarse simultanea, separada o secuencialmente con una vacuna de la invención. En particular, la invención provee una vacuna que comprende por lo menos una construcción de la invención que codifica un sub?nidad de toxina bacteriana de ribosilación ADP, fragmento de la misma con una actividad adyuvante o variante de la misma con actividad adyuvante. Las construcciones de ácido nucleico que expresan más de un antígeno se puede utilizar para generar vacunas multivalentes, es decir una vacuna prevista para inmunizar contra una pluralidad de diferentes antígenos y en particular contra antígenos de influenza. En algunos casos, serán provistos un antígeno o antígenos de influenza y un antígeno o antígenos de un patógeno diferente. De esta forma, cualquiera de las construcciones, poblaciones de construcciones de ácido nucleico, vacunas, composiciones farmacéuticas, partículas portadoras cubiertas mencionados aquí pueden comprender una construcción que codifica un antígeno de influenza y ya sea la misma construcción, o diferentes construcciones, pueden codificar antígenos de diferentes patógenos. Las varias construcciones de influenza multivalentes, poblaciones y vacunas mencionadas aquí también pueden codificar un antígeno o antígenos de un patógeno diferente . En algunos casos, los antígenos asociados tendrán la forma del mismo patógeno. En algunos casos, los diferentes antígenos serán todos del mismo virus. De esta forma, en una instancia preferida, todos los antígenos serán antígenos de influenza. La pluralidad de antígenos puede venir de la misma cepa del virus de influenza y por lo tanto pueden ser de varios diferentes polipéptidos de virus de influenza. Alternativamente, la pluralidad de antígenos puede ser de diferentes cepas de virus y en particular virus de influenza. En el caso de construcciones multivalentes y/o antígenos de vacunas de al menos dos y preferiblemente por lo menos tres, cuatro o cinco diferentes cepas de influenza se pueden seleccionar. Los antígenos pueden, por ejemplo, ser de 2, 3, 4, 5, 6 o más diferentes cepas, en particular antígenos de tres, cuatro o cinco cepas se pueden utilizar, y aún más preferiblemente de tres o cuatro diferentes cepas. Las vacunas multivalentes puede alternativa o adicionalmente comprender una pluralidad de diferentes construcciones de la invención con las diferentes construcciones codificando diferentes antígenos. Por ejemplo, por lo menos 2, 3, 4, 5, ó 6 diferentes construcciones se pueden utilizar. En una instancia particularmente preferida, 2, 3, 4 ó 5 diferentes construcciones y especialmente tres o cuatro construcciones se pueden utilizar. En una instancia, cuando más de una construcción está presente, cada construcción codifica un antígeno singular. En una instancia adicional, las construcciones pueden codificar 2, 3, 4, 5 o más diferentes de antígenos, preferiblemente 3 ó 4 diferentes antígenos . La invención también provee una población de construcciones de ácido nucleico en donde la población comprende una pluralidad de construcciones de la invención y en particular cualquiera de las combinaciones mencionadas anteriormente. De esta forma, la invención provee una población de construcciones de ácido nucleico en donde la población comprende por lo menos dos diferentes construcciones de la invención. Las construcciones de ácido nucleico pueden estar presentes en cualquier cantidad adecuada relativas entre sí. Típicamente, cada construcción de ácido nucleico está presente en una relación de peso de aproximadamente 1:10 entre sí. Las poblaciones de construcciones de ácido nucleico se pueden utilizar para generar vacunas multivalentes y en los varios métodos de la invención. Las vacunas multivalentes también pueden ser multivalentes porque comprenden cualquiera de las construcciones de la invención que codifican más de un antígeno. En una instancia preferida una población de ácidos nucleico es provista en donde la población comprende al menos dos diferentes construcciones que codifican diferentes antígenos. En particular, la invención provee una población que comprende al menos dos diferentes construcciones que codifican antígenos de influenza, fragmentos inmunogénicos de los mismos o variantes inmunogénicas de cualquiera. En dicha población de construcciones de ácido nucleico preferiblemente al menos dos de los diferentes antígenos pueden estar en la forma del mismo polipéptido de influenza, tal como HA, de diferentes cepas de influenza. En poblaciones con al menos dos diferentes construcciones que codifican antígenos de influenza estén presentes, preferiblemente por lo menos dos de los diferentes antígenos, los fragmentos o variantes están en la forma de diferentes polipéptidos de influenza pueden estar en la forma de la misma o diferente cepa de influenza. Las poblaciones preferidas adicionales incluyen una población de construcciones de ácido nucleico en donde la población comprende por lo menos tres diferentes construcciones con cada uno codificando un antígeno de una cepa de influenza diferente o un fragmento inmunogénico o variante inmunogenica . En otra instancia preferida, la invención provee una población de construcciones de ácido nucleico que comprenden al menos una construcción que codifica un antígeno, un fragmento inmunogénico del mismo, o una variante inmunogénica de ambos y al menos una construcción que codifican una subunidad de toxina bacteriana de ribosilación ADP, fragmento del mismo con actividad adyuvante o variante del mismo con actividad adyuvante. El o cada construcción que codifica un antígeno, fragmento inmunogénico o variante inmunogénica típicamente está presente en una relación de peso de aproximadamente 10:1 a 1:10 con respecto al o cada construcción que codifica la subunidad de toxina bacteriana de ribosilación ADP, fragmento del mismo con actividad adyuvante o variante del mismo con actividad adyuvante. La relación de peso puede ser de aproximadamente 10:1 a aproximadamente 1:1, por ejemplo aproximadamente 9:1. En instancias en donde se van a codificar una pluralidad de polipéptidos, cualquier combinación de construcciones que codifica uno o más polipéptidos y una pluralidad de construcciones se pueden utilizar. Por ejemplo, cuando se van a codificar tres antígenos, una construcción puede codificar los tres, una construcción puede codificar dos y otro construcción un antígeno, o tres construcciones cada una codifica un antígeno puede, por ejemplo, utilizarse.
En instancias en donde cuatro antígenos van a codificarse, se pueden codificar a través de cuatro, tres, dos o una construcción, cada construcción codificando un, dos, tres, o cuatro diferentes antígenos. En una instancia, se pueden utilizar tan pocas como sea posible construcciones, por ejemplo solamente una o dos construcciones se pueden utilizar. La invención también provee poblaciones de ácidos nucleicos y vacunas que comprenden dichas combinaciones de construcciones de ácido nucleico. En una instancia preferida, la invención provee una vacuna multivalente o población de ácidos nucleicos que comprende una construcción que codifica un antígeno de un virus de influenza pandémico y que también codifica 3, 4 ó 5 y en particular 3 ó 4 antígenos de influenza no pandémicos. Los antígenos de influenza no pandémicos pueden codificarse en la misma construcción que el antígeno de influenza pandémico o en diferentes construcciones. En una instancia preferida los 3, 4 ó 5 antígenos de influenza no pandémicos diferentes se pueden codificar en una construcción separada o construcciones y en particular en una sola construcción separada. En otra instancia, la construcción que codifica el antígeno pandémico puede también codificar uno o más de los otros antígenos. En algunas modalidades, la construcción de ácido nucleico codificará un adyuvante o una construcción separada puede hacer esto. Cualquiera de las poblaciones, composiciones y vacunas de la invención puede comprender, o pueden administrarse simultánea, secuencial o separadamente con dicha construcción adyuvante. De esta forma, las secuencias insertadas en el sitio de clonación para la inserción de una secuencia de codificación pueden codificar un polipéptido que puede actuar como un adyuvante. De esta forma, en una instancia la invención comprende una construcción de ácido nucleico en donde la secuencia de codificación codifica una subunidad de toxina bacteriana de ribosilación ADP, un fragmento de la misma con una actividad adyuvante o una variante de cualquiera con una actividad adyuvante que también tiene 80% de homología de aminoácido para cualquiera de los anteriores. En una instancia preferida, la construcción de ácido nucleico comprende dos secuencias de codificación que comprenden una subunidad de toxina bacteriana de ribosilación ADP, un fragmento de la misma con actividad adyuvante o variante de cualquiera con actividad adyuvante, en donde cada una está enlazada al promotor quimérico. Las dos secuencias de codificación que codifican una subunidad de toxina bacteriana de ribosilación ADP, fragmento de la misma con una actividad adyuvante o variante de cualquiera con actividad adyuvante puede ser, en una instancia, estar en orientación inversa. En otra instancia las dos secuencias de codificación que codifican una subunidad de toxina bacteriana de ribosilación ADP, fragmento de la misma con actividad adyuvante o variante de cualquiera con actividad adyuvante puede estar en la misma orientación. En cualquiera de las construcciones de la invención que comprenden más de una secuencia de codificación enlazada a un promotor quimérico, los promotores pueden estar en la misma orientación, en diferentes orientaciones, o una mezcla de dos en donde existen tres o más de dichos promotores. En una instancia preferida, el adyuvante codificado en cualquiera de las construcciones adyuvantes puede ser una toxina bacteriana de ribosilación ADP. Éstas incluyen la toxina de difteria (DT) , la toxina de tosferina (PT), la toxina de cólera (CT) , las toxinas lábiles al calor E. coli (LT1 y LT2), endotoxina A Pseudomonas, exotoxina S Pseudomonas , exoenzima de B cereus, toxina B . sphaericus , toxinas C botulin um C2 y C3, exoenzima C. limosum, así como toxinas de C. perfringens , C spiri forma y C. diffi ci le y Staphylococcus a ureus EDIN. La mayor parte de las toxinas bacterianas de ribosilación ADP contienen subunidades A y B. La construcción puede expresar la subunidad A, la subunidad B y/o ambas subunidades. En una instancia preferida, la construcción de ácido nucleico puede codificar la toxina lábil de calor de E . col i y/o la toxina de cólera y en particular puede expresar la toxina lábil de calor E . col i . Una entrada a GenBank para las secuencias completas de los genes de la subunidad A y B CT se puede encontrar en Locus VIBCTXABB (No. de acceso D30053), mientras una entrada de GenBank para las secuencias completas de los genes de la subunidad A y B LT se puede encontrar en locus AB0116677 (No. de acceso AB011677). En una instancia particularmente preferida, una construcción de la invención puede codificar las subunidades LT A y/o LT B codificadas por los vectores pPJV2012 y/o pPJV7788 o un fragmento de dicha subunidad que retiene la actividad adyuvante o una variante de cualquiera que retiene la actividad adyuvante. Una construcción de la invención puede comprender las secuencias de codificación para las subunidades LT A y/o LTB de los vectores pPJV2012 y/o pPJV7788, un fragmento de los mismos que codifica un polipéptido que tiene actividad adyuvante o una variante de cualquiera que tiene actividad adyuvante. En una instancia preferida una construcción de la invención tiene tanto las secuencias de codificación del LT A y LTB. En otra instancia preferida, la construcción puede comprender la secuencia del vector PJV2012 provista por la SEC ID No: 61 o una secuencia con 60% de identidad de secuencia de la misma. En una instancia adicional, la construcción puede comprender la secuencia del vector PJV7788 provisto por SEC ID No: 62 o una secuencia con 60% de identidad de secuencia del mismo. La construcción puede expresar una variante activa o fragmento de un adyuvante particular. La variante o fragmento se dirá que es activa si retiene por lo menos actividad adyuvante del polipéptido del que se deriva. De esta forma, la variante y/o fragmento aún serán capaces de mejorar la respuesta inmune contra un antígeno particular en comparación con la respuesta inmune vista cuando no se administra ningún adyuvante con el antígeno. La secuencia codificada pueden ser fragmentos activos o variantes de las subunidades A y/o B CT y en particular pueden ser fragmentos activos de las subunidades A y/o B LT . Las variantes y fragmentos que se pueden utilizar pueden, por ejemplo, tener cualquiera de las longitudes, niveles secuencia de homología u otras características mencionadas aquí para variantes y fragmentos. Estas pueden, por ejemplo, evaluarse utilizando el ensayo de inmunogenicidad comparativo utilizando un antígeno particular y después comparando los resultados vistos con un vector base adyuvante y un vector variante que codifica un adyuvante. En una modalidad particularmente preferida la construcción puede codificar las subunidades LTA y/o LTB y en particular ambas. La construcción puede, en una instancia particularmente preferida ser pPJV2012 o pPJV7788 de las secuencias para las cuales se proveen. Cualquiera de las construcciones adyuvantes de la invención se puede administrar simultánea, secuencial o separadamente con un antígeno o un ácido nucleico que codifica un antígeno. En una instancia preferida una construcción de adyuvante de la invención se puede administrar simultánea, secuencial o separadamente con una construcción de la invención que codifica un antígeno. Las composiciones y vacunas que comprenden una construcción adyuvante y una construcción que codifica un antígeno se proveen, como portadores centrales cubiertos con ambos tipos de construcciones provistas en ellos o mezclas de portadores centrales cubiertos con una construcción adyuvante y otros portadores centrales cubiertos con una construcción que codifica un antígeno. La subunidad de toxina puede haber tenido su secuencia de señal de existencia natural eliminada. Las secuencias de señal natural de las exotoxinas se pueden reemplazar por una secuencia de señal eucariótica y en particular a través del péptido de señal de lisozima de pollo. Una subunidad de exotoxina de ocurrencia natural puede haber sido modificada para desintoxicar la toxina. La subunidad A puede haber sido modificada para interrumpir o inactivar la actividad de transferasa de ribosilación ADP. En algunos casos, las subunidades de exotoxina pueden retener la toxicidad. De esta forma, en algunas instancias las subunidades de exotoxina pueden no haber sido desintoxicadas.
De esta forma, las construcciones adyuvantes de la invención pueden utilizarse para mejorar una respuesta inmune contra un antígeno particular. La respuesta inmune mejorada puede involucrar una respuesta inmune de una magnitud mayor o duración. Esto puede significar que cuando el antígeno se reencuentra con la respuesta inmune entonces es mayor que si no se administra el adyuvante. La respuesta inmune mejorada puede dar como resultado concentraciones de anticuerpo mayores. En el caso de algunas construcciones, y en particular aquellas que expresan subunidades de exotoxina, el adyuvante puede dar como resultado una respuesta celular aumentada y una respuesta inmune de tipo adyuvante 1 T contra el antígeno en cuestión. Las construcciones del adyuvante se pueden administrar, estar presentes en una vacuna con, o estar presentes en una población de ácidos nucleicos con cualquiera de las construcciones mencionadas aquí. Las construcciones de adyuvante también pueden codificar, o administrarse con una construcción que codifica, un antígeno o antígeno, que incluye cualquiera de estos mencionado aquí y en particular aquellos que codifican la influenza. En una modalidad, una construcción de la invención puede codificar un inmunoestimulador y/o un inmunosupresor. En una instancia preferida una construcción puede codificar uno o más de interferón alfa, beta y/o gamma, interleucina-1, -2, -4, -5, -7, -10, -12, -13, -18, -23 y -24, el ligando GMCSF, G-CSF, TGF-beta, B7.1, B7.2, CTLA-4, CD40, los ligandos CD40, OX40, OX40, el ligando Flt-3, TRAIL, TRANCE, el ligando Fas, alfa TNF, alfa MCP-1, PF-4, SLC, MIP-3 alfa, IP-10. En algunos casos dicha construcción se pueden administrar simultánea, separada o secuencialmente con cualquier otra construcción, en particular uno de la invención y especialmente una construcción que codifica un antígeno. Una construcción de la invención puede comprender una señal de poliadenilación. El ácido nucleico para la inserción en el sitio de clonación puede comprender una secuencia de poliadenilación (poliA) . Dicha secuencia poliA es generalmente nativa para la secuencia de codificación. Alternativamente, puede ser provista una secuencia poliA heteróloga en la construcción de ácido nucleico de la invención. Típicamente la secuencia poliA será provista en dirección 3' del sitio de clonación, de tal forma que está operativamente enlazada a la secuencia de codificación insertada en el sitio de clonación. Se puede incluir cualquier secuencia poliA adecuada en la construcción utilizando técnicas de clonación estándar. Dichas secuencias de poliA son conocidas en la técnica. La secuencia poli A puede ser: (i) una secuencia poli A natural; (ii) una variante homologa funcional de (i); o (iii) un fragmento funcional de (i) o de (ii). La secuencia poli A natural (i) puede ser, por ejemplo, una poli A del gen de globina beta de conejo, una poli A del gen temprano o tardío del virus de papiloma humano (HPV) , una poli A del gen HSV-2gB, una poli A del gen temprano inmediato de CMV de simio, o poli A del gen tardío HSVgD. Las secuencias de poliadenilación se pueden derivar de una secuencia de poliadenilación de un gen seleccionado de aquellos del gen de globina beta de conejo, los genes tempranos o tardíos del virus de papiloma humano (HPV) , el gen HSV-2gB, el gen temprano inmediato CMV de simio y el gen tardío HSVgD. Preferiblemente la secuencia poli A natural (i) se selecciona del grupo que consiste de SEC ID No. 10 (GenBank K03256), SEC ID No. 11 (GenBank M16019), SEC ID No. 12 (GenBank Z80699) y SEC ID No. 13 (GenBank K02718) . Una secuencia poli A particularmente preferida comprende los nucleótidos 4243 a 4373 de SEC ID NO: 54 o es una variante homologa funcional o fragmento de la misma. Una secuencia poli A preferida también es provista por medio de los nucleótidos 2556 a 2686 de SEC ID No. 14 o un fragmento funcional o una variante de cualquiera también se puede utilizar . En una instancia preferida adicional, la señal de poliadenilación utilizada en la construcción de la invención puede comprender: (i) la secuencia de nucleótido de SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11, SEC ID NO: 12, SEC ID NO: 13, los nucleótidos 4243 a 4373 de SEC ID NO: 54, los nucleótidos 906 a 1038 de SEC ID No: 61, los nucleótidos 4375 a 4050 de SEC ID No: 61, y/o los nucleótidos 2463 a 2593 de SEC ID No: 62; (ii) una variante funcional de (i) que tiene al menos 80% de homología de secuencia de nucleótido para uno o más de las secuencias de (i); y/o (iii) un fragmento funcional de (i) o de (ii) . En general, una secuencia poli A funcional es una que retiene la actividad de poliadenilación. Una secuencia poli A se puede probar para la habilidad para atraer aproximadamente la poliadenilación de una trascripción de ARN utilizando un ensayo de expresión de rutina. Una variante homologa funcional (ii) o fragmento funcional (iii) típicamente muestra por lo menos 50%, por ejemplo 60%, 70%, 80% o más de la actividad poli A de la secuencia poli A natural en el ensayo. Generalmente, la secuencia poli A, cuando está presente en la construcción de la invención, mejora la expresión, típicamente causando una mejora comparable con la secuencia poli A natural (i) mencionada anteriormente. Una secuencia poli A también puede ensayarse para la funcionalidad utilizando el ensayo de expresión comparativo siguiente. Una región poli A de prueba se intercambia en el vector base en el lugar de RBGpA. Una poli A de prueba se considera funcional si la poli A no anula la expresión, pero preferiblemente incrementa la expresión en al menos una pero preferiblemente dos tipos de células, comparado con el vector base. Preferiblemente existe un incremento en la expresión de al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40% ó 50% o más. El incremento puede ser cualquiera de los niveles anteriormente mencionados aquí. En algunos casos, puede ocurrir una disminución, incluyendo cualquiera de los niveles mencionados aquí. Los tipos de célula preferidos son HEK293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 o COS de mamífero. También se pueden utilizar células SSC15 o B16. De acuerdo con el ensayo, típicamente una variante homologa (ii) o fragmento (iii) es funcional si permite más de 50% de la mejora en la expresión lograda por la secuencia poli A natural (i) . Alternativa o adicionalmente, las secuencias poli A se pueden probar para la actividad en el ensayo de inmunogenicidad comparativo siguiente. La secuencia poli A se intercambia en el vector base en lugar de RBGpA. Una secuencia poli A funcional provee concentraciones de anticuerpo que son al menos tan altas como la mayor de aquellas logradas por el vector base con al menos uno, preferiblemente dos antígenos. Preferiblemente las concentraciones del anticuerpo son de al menos 5%, 10%, por ejemplo 20%, 30% ó 40% o mayores que aquellas logradas con el vector base. En algunas instancias cualquiera de los aumentos o disminuciones mencionados aquí se pueden ver. Los antígenos preferidos son los antígenos HBsAg, HSV2gD y Flu-M2. Los antígenos especialmente preferidos son el antígeno de influenza, incluyendo cualquiera de aquellos mencionados aquí y en particular los antígenos HA, NA y M2. En particular, el antígeno HA, o un fragmento inmunogénico del mismo o una variante inmunogénica de ambos se puede utilizar. Una variante homologa (ii) o fragmento (iii) es típicamente funcional si permite que se logren las concentraciones de anticuerpo más grandes a través de la secuencia poli A natural ( i) . La construcción de ácido nucleico puede comprender secuencias de control adicionales que tienen influencia sobre la expresión de una secuencia de codificación insertada en el sitio de clonación. La construcción puede incluir una secuencia líder no traducida. La secuencia es provista en la construcción en enlace operable con el promotor quimérico, y por consiguiente también con la secuencia de codificación insertada en el sitio de clonación. La líder provee un sitio de inicio de traducción para la expresión de una secuencia de codificación insertada y típicamente incluye una secuencia Kozak. Típicamente, la secuencia líder no traducida comprende : (i) una secuencia líder no traducida natural; (11) una variante homologa funcional de (i); o (m) un fragmento funcional de (i) o (11). Típicamente, la secuencia líder comprende secuencias presentes en (i) que se unen a los componentes de trascripción o proteínas regu Ladoras , u homólogos de estas secuencias que son capaces de unirse a los mismos componentes o proteínas. Típicamente dichas secuencias o sus homólogos están presentes en la secuencia líder en la misma orden y/o substancialmente la misma separación que (i) . En general la secuencia líder comprende un sitio de inicio de traducción en la expresión de una secuencia de codificación insertada. Típicamente la secuencia líder incluye una secuencia Kozak. En general la secuencia líder no traducida tiene una longitud de aproximadamente 10 a aproximadamente 200 nucleótidos, por ejemplo, de aproximadamente 15 a 150 nucleótidos, preferiblemente 15 a aproximadamente 130 nucleótidos. Las secuencias líderes comprenden, por ejemplo, 15, 50, 75 ó 100 nucleótidos se pueden utilizar. Generalmente, una secuencia líder no traducida funcional es una que es capaz de proveer un sitio de inicio de traducción para la expresión de una secuencia de codificación en un enlace operable con la secuencia líder. Típicamente una variante funcional (n) o fragmento (iii) tiene substancialmente la misma actividad que y/o complementa la actividad de la secuencia natural (i), usualmente en la facilitación o mejoramiento de la expresión de una secuencia de codificación en enlace operable con la secuencia. Una variante (ii) o fragmento (iii) se puede probar para actividad como una secuencia líder no traducida relativa a la secuencia líder natural utilizando protocolos estándar. Por ejemplo, los vectores de expresión se pueden preparar comprendiendo una secuencia líder natural (i) operablemente enlazada a su secuencia de codificación nativa, y la expresión se monitorea en las células hospederas adecuadas, por ejemplo, las células HEK 293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 o COS de mamífero. Las construcciones de prueba pueden prepararse en donde la secuencia líder natural se reemplaza por una variante homologa o fragmento y la expresión se monitorea otra vez en las mismas células hospederas. En general, una variante (ii) o fragmento (iii) provee al menos 50%, tal como 60%, 70%, 80%, 90% ó 100% o más de la expresión provista por la secuencia natural. En algunos casos cualquiera de los incrementos o disminuciones en la expresión mencionada aquí se pueden ver. Una secuencia líder potencial también se puede probar para utilidad en el ensayo de expresión comparativo siguiente. Por lo menos una secuencia líder se intercambia de en el vector base en lugar de HBV pre S2 5 'UTR. Una secuencia líder funcional no anula la expresión pero preferiblemente incrementa la expresión en al menos una pero preferiblemente dos tipos de células de referencia, comparado con el vector base. En general la expresión se incrementa por al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40% ó 50%. Los tipos de célula preferidos son las células HEK293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 o COS de mamíferos. De acuerdo con el ensayo, una variante homologa (ii) o fragmento (iii) es típicamente funcional si permite más del 50% de mejoramiento en la expresión logrado por la secuencia líder natural. Alternativa o adicionalmente, una secuencia líder se puede probar para la actividad en el ensayo de inmunogenicidad comparativo siguiente. Una secuencia líder se intercambia en el vector base en lugar de HBV pre S2 5 'UTR. Una secuencia líder funcional provee concentraciones de anticuerpo que son al menos tan altas como la más alta de aquellas logradas por el vector base, con al menos uno preferiblemente dos antígenos. Preferiblemente las concentraciones de anticuerpo son de al menos 5%, 10%, 20%, 30% ó 40% mayores que con el vector base. Los antígenos preferidos son los antígenos HBsAg, HSV 2gD y Flu-M2. Los antígenos especialmente preferidos son antígenos de influenza, incluyendo cualquiera de aquellos mencionados aquí y en particular los antígenos HA, NA y M2. En particular, el antígeno HA, o un fragmento o variante del mismo se pueden utilizar. Una variante homologa (ii) o fragmento (iii) es típicamente funcional si permite las concentraciones de anticuerpo más altas permitidas por la secuencia líder natural (i). Sin embargo, en algunos casos unos de los niveles disminuidos de la expresión mencionados aquí se pueden ver. La secuencia líder adecuada se puede obtener utilizando protocolos estándar. Por ejemplo, la secuencia de antígeno HBV preS2, la secuencia de e-antígeno HBV y la secuencia de antígeno gD de tipo 2 HSV están disponibles en GenBank M54923, M54923 y Z86099 respectivamente. Los cebadores se pueden diseñar con base en esta secuencia conocida y utilizarse para aislar secuencias homologas. Las secuencias líderes pueden sintetizarse con base en secuencias conocidas. En general la secuencia natural (i) es una secuencia eucariótica o una secuencia viral, en particular, de un virus que infecta a un eucariota. Preferiblemente, la secuencia natural (i) es la secuencia HBV o HSV, por ejemplo la secuencia del antígeno HBV preS2, la secuencia del e-antígeno HBV, o la secuencia de antígeno gD de tipo 2 HSV. Particularmente preferiblemente, (i) se selecciona del grupo que consiste de SEC ID No.5, SEC ID No. 6 y SEC ID No. 7. En una instancia preferida adicional, la secuencia líder no traducida comprende los nucleótidos 1864-1984 de SEC ID NO: 54 o SEC ID NO: 14. Los fragmentos funcionales o variantes de ambos de estas secuencias también se pueden utilizar En una instancia, la secuencia líder no traducida comprende : (i) la secuencia de nucleótidos SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO:7 o nucleótidos 1864 a 1984 de SEC ID NO: 54. (ii) una variante funcional de (i) que tiene al menos 80% de homología de secuencia de nucleótido para (i); y/o (iii) el fragmento funcional de (i) o de (ii) . Dicha secuencia líder no traducida se puede utilizar en cualquiera de las construcciones de la invención. La construcción de ácido nucleico puede comprender una secuencia potenciadora. Una secuencia potenciadora típicamente es provista en 3' del sitio de clonación, operablemente enlazada tanto con el promotor quimérico como la secuencia de codificación insertada, y actúa para incrementar la trascripción de la secuencia insertada. En general el potenciador comprende: (i) un potenciador natural; (ii) una variante homologa funcional de (i); o (iii) un fragmento funcional de (i) o de (ii) . La secuencia potenciaidora comprende generalmente de aproximadamente 50 a aproximadamente 850 nucleótidos, por ejemplo, de aproximadamente 75 a aproximadamente 500 nucleótidos. Los potenciadores de aproximadamente 100, 200, 300 o 400 nucleótidos pueden ser utilizados. Típicamente (i) es un potenciador eucariótico o viral, particularmente, de un virus que infecta eucariotes. Usualmente dichos potenciadores ocurren en la región no traducida 3' (UTR 3') de un gen. Preferiblemente (i) es un potenciador HBV o CMV, por ejemplo un UTR 3' HBs Ag o un UTR 3' del gen temprano inmediato CMV. Preferiblemente (i) comprende SEC ID NO: 8 o SEC ID NO: 9. Preferiblemente (i) puede los nucleótidos 3699-4231 de SEC ID NO: 54. En otra instancia preferida (i) puede comprender los nucleótidos 2012 a 2544 de SEC ID NO: 14. Los fragmentos o variantes funcionales de cualquiera de estas secuencias se pueden utilizar. En general, el potenciador en la construcción comprende las secuencias encontradas en (i) que unen componentes de trascripción o proteínas reguladoras, por ejemplo factores de la trascripción, u los homólogos de estas secuencias que se unen a los mismos componentes o proteínas. Preferiblemente estas secuencias están presentes en el potenciador en el misma orden y/o substancialmente la misma separación que en (i) . Generalmente un potenciador funcional es uno que mejora o incrementa la expresión de un polinucleótido, por ejemplo, una secuencia de codificación, que está operablemente enlazada a la secuencia potenciadora. Típicamente una variante homologa funcional (ii) o fragmento (iii) tiene substancialmente la misma actividad (por ejemplo, el mejoramiento de la expresión) como y/o contempla la actividad del potenciador natural (i). La actividad potenciadora se puede ensayar utilizando un ensayo de trampa de potenciador. Los protocolos son conocidos en la técnica. Una variante homologa funcional (ii) o fragmento (iii) preferiblemente provee al menos 50% de la actividad potenciadora mostrada por el potenciador natural en dicho ensayo. Típicamente la actividad es de al menos 60%, el 70%, el 80%, 90, 100% o más de la actividad del potenciador natural. En general, una variante funcional (ii) o fragmento (iii) es capaz de complementar la actividad del potenciador natural (i) en el ensayo. Cualquiera de los aumentos o disminuciones referidas en la presente pueden, por ejemplo, ser vistos. En una instancia preferida, la secuencia potenciadora comprende: (i) la secuencia de nucleótido de SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, los nucleótidos 3699 a 4231 de SEC ID NO:54, los nucleótidos 3831 a 4363 del SEC ID NO: 61 y/o 4507 a 5038 de SEC ID NO: 62. (ii) una variante funcional de (i) que tiene al menos 80% de homología de secuencia de nucleótido para una o más de las secuencias de (i); y/o (iii) un fragmento funcional de (i) o de (ii) . La utilidad potenciadora también se puede probar utilizando el ensayo de expreeión comparativo establecido a continuación. Una secuencia UTR 3' de prueba se intercambia en el vector base. Una UTR 3' tienen la utilidad si no anula la expresión, pero preferiblemente incrementa la expresión en por lo menos uno pero preferiblemente dos tipos de células de referencia comparados con los vectores base en el ensayo. Preferiblemente la expresión se incrementa en al menos 5%, 10%, 20%, 30%, 40% o 50%. Los tipos de célula preferidos son las células HEK293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 o COS de mamífero. De acuerdo con este ensayo, una variante homologa (ii) o fragmento (iii) es típicamente funcional si permite más del 50% de la mejora de expresión lograda por la secuencia potenciadora natural (i). Adicional o alternativamente, las secuencias potenciadoras se pueden probar para actividad en el ensayo de inmunogenicidad comparativo siguiente. Un UTR 3' se intercambia en el vector base. La secuencia potenciadora funcional provee concentraciones de anticuerpo que son al menos tan altas o mayores que aquellas logradas por vector base con al menos uno, preferiblemente dos antígenos. Preferiblemente las concentraciones del anticuerpo son de al menos 5%, 10%, 20%, 30% o 40% mayores que con el vector base. Los antígenos preferidos son los antígenos HBs Ag, de HSV2gD y Flu-M2. Los antígenos especialmente preferidos son antígenos de influenza, incluyendo cualquiera de aquellos mencionados aquí y en particular los antígenos Ha, NA y M2. Particularmente, HA puede utilizarse o un fragmento o variante del mismo. Una variante homologa (ii) o fragmento (iii) es funcional si permibe que la concentración del anticuerpo más alta permitida por la secuencia potenciadora natural (i) . La secuencia potenciadora adecuada se puede obtener utilizando métodos de clonación estándares. Por ejemplo, la secuencia UTR 3' HBsAg o la secuencia UTR 3' del gen temprano inmediato CMV de simio se pueden evaluar en GenBank AF143308 y M16019. Los cebadores se pueden diseñar con base en su secuencia conocida y utilizar para secuencias homologas aisladas . En algunas instancias, cuando una pluralidad de polipéptidos es codificada a través de una sola construcción, puede ser deseable omitir las secuencias particulares para reducir el tamaño de la construcción. Particularmente, una construcción puede carecer de un potenciador y/o región de codificación en la secuencia líder no traducida operablemente enlazada a la secuencia o secuencias de codificación del polipéptido que se va a expresar. Esto puede, por ejemplo, ser el caso en donde tres, cuatro, cinco o más polipéptidos se expresan de la misma construcción y particularmente tres, cuatro o cinco polipéptidos se expresan de la misma construcción . En una modalidad preferida, la construcción de ácido nucleico comprende una secuencia poli A heteróloga, una secuencia líder heteróloga y un potenciador heterólogo, todos operablemente enlazados con el promotor quimérico, para la expresión eficiente de una secuencia de codificación insertada. En un aspecto más, la presente invención también provee una construcción de ácido nucleico que comprende, o algunas veces consiste esencialmente de: (i) una secuencia prcmotora (ii) una secuencia líder no-traducida derivada de la secuencia de antígeno de HBV preS2, una secuencia de e-antígeno de HBV o la secuencia de antígeno gD del tipo 2 HSV; y (iii) una secuencia de codificación operablemente enlazada a (i) y (ii) en donde la secuencia de codificación es heteróloga para la secuencia líder no-traducida. Típicamente la secuencia promotora (i) se deriva de una secuencia promotora viral o eucariótica. La secuencia promotora puede ser una secuencia promotora natural, un homólogo funcional de la secuencia natural o un fragmento funcional de cualquiera. Los promotores naturales adecuados incluyen, el promotor temprano inmediato hCMV, el promotor del virus de Pseudorabia (PRV) o el promotor del virus de sarcoma Rous (RSV) . Preferiblemente el promotor natural comprende SEC ID NO: 52 o SEC ID NO: 53. Una construcción promotora artificial, dicho como la promotora quimérica descrita anteriormente, se puede utilizar, siempre el promotor sea funcional. Una secuencia promotora funcional es generalmente una que puede causar (incluyendo iniciar y regular) la trascripción de una secuencia de codificación operablemente enlazada en una célula hospedera adecuada. Una secuencia promotora se puede probar para actividad promotora utilizando un ensayo expresión de rutina. Un homólogo o fragmento funcional de una secuencia promotora natural típicamente provee al menos 50%, por ejemplo, o al menos 60, 70, 80 o 90% de expresión provista por la secuencia natural en dicho ensayo. La secuencia líder no-traducida (ii) se describe anteriormente. Las secuencias de codificación adecuadas (iii) incluyen aquellas ya descritas con relación a construcción promotora quimérica. Sin embargo, en el presente aspecto de la invención, la secuencia de codificación es heteróloga para secuencia líder no-traducida. La presente construcción típicamente incluye una secuencia poli A, que ya está descrita, que puede ser nativa para la secuencia de codificación, o provista como una secuencia poli A heteróloga en la construcción. Las secuencias poli A adecuadas ya han sido descritas. La construcción adicionalmente puede incluir una secuencia potenciadora 3' de la secuencia de codificación. Las secuencias potenciadoras adecuadas se describen anteriormente con relación a la construcción de promotor quimérico. En otro aspecto, la invención provee una construcción de ácido nucleico que comprende, o en algunas modalidades que consisten esencialmente de: (i) una secuencia promotora; (ii) una secuencia de codificación operablemente enlazada a la secuencia promotora (i) y; (iii) una secuencia potenciadora 3' de y operablemente enlazada a la secuencia de codificación (ii); en donde la secuencia potenciadora (iii) se deriva de la UTR 3' de una secuencia HBsAg, o un UTR 3' de una secuencia del gen temprano inmediato CMV de simio, y la secuencia de codificación (ii) es heterólogos a la secuencia potenciadora . La construcción puede incluir una secuencia líder no-traducida dichos como aquellas ya descritas con relación a la construcción promotora quimérica.
Típicamente la secuencia promotora (i) se deriva de una secuencia promotora viral o eucariótica. La secuencia promotora puede ser una secuencia promotora natural, un homólogo funcional de la secuencia natural o un fragmento funcional de cualquiera. Los promotores naturales adecuados incluyen, por ejemplo, el promotor temprano inmediato hCMV, el promotor del virus de Pseudorabia (PRV), o promotor del virus del sarcoma Rous (RSV) . Preferiblemente el promotor natural comprende SEC ID NO: 52 o SEC ID NO: 53. Una construcción promotora artificial, como el promotor quimérico descrito anteriormente, se puede utilizar, si el promotor es funcional. Una secuencia promotora funcional es generalmente una que es capaz causar (incluyendo iniciar y regular) la trascripción de una secuencia de codificación operablemente enlazada en una célula hospedera adecuada. Una secuencia promotora se puede probar para actividad promotora utilizando un ensayo de expresión de rutina. Los homólogos o fragmentos funcionales de una secuencia promotora natural típicamente proveen por lo menos 50%, por ejemplo, o al menos 60, 70, 80 o el 90% o la expresión provista por la secuencia natural en dicho ensayo. Las secuencias de codificación adecuadas (ii) incluyen aquellas ya mencionadas con relación a la construcción promotora quimérica. Sin embargo, en el presente aspecto, la secuencia de codificación es heteróloga a la secuencia promotora 3'. La secuencia promotora (iii) de la construcción se describió anteriormente. La presente construcción también incluye típicamente una secuencia poli A. Como es el caso en la construcción promotora quimérica, esta región poli A puede ser nativa para la secuencia de codificación (ii) o puede ser provista como componente poli A heterólogo en la construcción. Una construcción de acuerdo con cualquier aspecto de la presente invención puede comprender una secuencia de péptido de señal. De esta forma, una construcción de ácido nucleico puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de señal que está operablemente enlazado a la secuencia de codificación. La secuencia de péptido de señal se inserta en un enlace operable con el promotor tal como el péptido de señal se expresa y facilita la secreción de un polipéptido codificado por la secuencia de codificación también operablemente enlazada con el promotor. Típicamente una secuencia de péptido de señal codifica un péptido de 10 a 30 aminoácidos por ejemplo 15 a 20 aminoácidos. Por lo general los aminoácidos son predominantemente hidrofóbicos. En una situación típica, un péptido de señal activa una cadena de polipéptido en crecimiento que lleva el péptido de señal al retículo endoplásmico de la célula de expresión. El péptido de señal se divide en el retículo endoplásmico, permitiendo la secreción del polipéptido a través del aparato Golgi. Un péptido de señal para el uso en la invención puede comprender: (i) una secuencia de péptido de señal natural; (ii) una variante homologa de (i) que retiene la actividad del péptido de señal; o (iii) un fragmento de (i) o de (ii) que retiene la actividad de péptido de señal. La secuencia (i) puede ser por ejemplo un péptido de señal activador de plasminógeno de tejido humano (hTPAsp) (GenBank L00141), el péptido de señal de aprotinina (GenBank AAD13685), el péptido de señal del extensina de tabaco (GenBank JU0465), o péptido de señal de lisozima del pollo (GenBank AF410481) . Un péptido de señal, adecuado para uso en la presente invención, es una que habilitará la secreción de proteínas heterólogas. Un péptido de señal funcional puede identificarse en un ensayo que compara el efecto del péptido de señal de prueba con el efecto de un péptido conocido, por ejemplo, el péptido de señal activador de plasminógeno de tejido humano (hTPAsP) y con el efecto de no tener ningún péptido de señal. El ensayo de expresión comparativo establecido a continuación se puede utilizar pero con la siguiente modificación. Los vectores de expresión de secreción se construyen conteniendo el vector base con ya sea péptido de señal de prueba, hTPAsp o sin péptido de señal. Las secuencias de codificación para los polipéptidos despliegan sus péptidos de señal de existencia natural se insertan en los vectores y los vectores transformados en células hospederas de referencia. Preferiblemente las células son células HEK293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 o COS de mamífero. El medio de la célula se analiza para niveles de expresión de polipéptido. Un péptido funcional de señal habilita la secreción del polipéptido en nivel más alto que un vector que carece de un péptido de señal con al menos uno, preferiblemente dos polipéptidos. Típicamente, la secreción es 5% mayor, o preferiblemente 10% mayor o más, por ejemplo 20 o 50% mayor o más. Típicamente, los niveles de secreción son comparables con aquellos obtenidos utilizando hTPAsp. En algunos casos, cualquier incremento o disminución referida pueden ser vistos. En una instancia preferida, el péptido de señal se selecciona del péptido de señal activador de plasminógeno de tejido humano (hTPAsp), péptido de señal de aprotinina, péptido de señal de extensina de tabaco, y de péptido de señal del lisozima del pollo. Al permitir la secreción de la proteína codificada fuera de una célula de expresión puede tener un número de ventajas, particularmente cuando la proteína es un antígeno.
Por ejemplo, la secreción de antígeno incrementada podría permitir una mayor absorción del antígeno y respuesta a través de las células inmunes (macrófagos, células de Langerhan, células B, células T, etc.), habilitar la capacidad del antígeno para alcanzar la corriente sanguínea y las células de señal (citocinas), habilitar un antígeno para encontrar los ligandos celulares y efectuar una función (anticuerpos, toxinas tales como la toxina del cólera, E . coli LT) y participar en los procedimientos bioquímicos celulares normales (receptores celulares). Una construcción de la invención puede estar en la forma de un plásmido. Una construcción de ácido nucleico de la invención puede estar en la forma de vector de expresión de plásmido. En una instancia preferida, una construcción de la invención puede ser una construcción de ADN. En instancias alternativas, la construcción puede ser una construcción del RNA o HAP. El vector entonces puede incluir elementos adicionales, tales como un origen de replicación o genes del selector. Dicho elementos son conocidos en la técnica y pueden incluirse utilizando técnicas estándares. En una modalidad, el vector de plásmido tiene la secuencia en SEC ID NO: 14. Alternativamente, la construcción se puede incluir en una construcción del vector viral. En algunas modalidades, la construcción de ácido nucleico de la invención puede comprender dos o a más promotores quiméricos definidos aquí. De esta forma, la construcción puede comprender una pluralidad de promotores quiméricos y en particular la construcción puede tener dos, tres, cuatro, cinco o más promotores quiméricos. Los promotores quiméricos preferiblemente estarán cada uno operablemente enlazados en forma separada al sitio de clonación para la inserción de una secuencia de codificación. De esta forma, la construcción puede expresar dos, tres, cuatro, cinco o más secuencias de codificación. Las secuencias de codificación expresadas pueden ser cualquiera de aquellas especificadas aquí. En una instancia preferida, la construcción tiene dos promotores quiméricos con cada uno teniendo una secuencia de codificación operablemente enlazada a ellos. En particular, los dos promotores se pueden transcribir lejos uno del otro. En otras modalidades, los promotores pueden ser transcritos uno hacia el otro. De esta forma, los promotores pueden estar en una orientación invertida o en algunos casos en la misma orientación. En particular, las construcciones con dos promotores puede expresar las subunidades A y B de una toxina bacteriana de ribosilación ADP, incluyendo cualquiera de aquellas mencionadas aquí y preferiblemente una LTA y subunidad B. Sin embargo, las construcciones con los múltiples promotores pueden expresar cualquier combinación de secuencias de codificación mencionadas aquí. En un aspecto preferido adicional, las construcciones con los múltiples promotores pueden expresar una pluralidad de antígenos de influenza, incluyendo combinaciones de cualquiera de los antígenos de influenza mencionados aquí. En otro aspecto preferido, una construcción puede expresar un antígeno de influenza pandémico, un fragmento inmunogénico del mismo o una variante inmunogénica de ambos y uno o más de cualquiera de las secuencias de codificación mencionadas aquí. En los casos en donde la construcción tiene múltiples promotores quiméricos cada uno puede comprender, o estar operablemente enlazado a, cualquiera de las secuencias mencionadas aquí. En una instancia particularmente preferida, el intrón heterólogo de uno o más de los promotores puede ser la secuencia del intrón A del gen de la insulina de rata. Uno o más de los promotores quiméricos también puede preferiblemente comprender la UTR 5' de HBVpre-S2. Uno o más de los promotores puede comprender la secuencia de poli adenilación del gen de beta globina del conejo. En una instancia preferida, la construcción de ácido nucleico de la invención puede comprender dos secuencias promotoras quiméricas, cada secuencia promotora estando operablemente enlazada a un sitio de clonación que tiene una secuencia de codificación insertada en el mismo, en donde cada promotor quimérico comprende: (a) una secuencia promotora temprana inmediata hCMV; (b) el exón 1 y por lo menos una parte del exón 2 del gen temprano inmediato principal hCMV; y (c) un intrón heterólogo provisto en lugar de la región del intrón A del gen temprano inmediato principal del hCMV. Con la secuencia de codificación operablemente enlazada a un promotor quimérico que codifica una subunidad LTA y la secuencia de codificación enlazada a la otra codificación de una subunidad LTB. La construcción además puede expresar ambas subunidades. Preferiblemente: el intrón heterólogo de cada promotor es la secuencia del intrón A del gen de insulina de rata; - la secuencia que codifica cada subunidad LT está operablemente enlazada al UTR 5' de HBVpre-S2; y/o una secuencia de codificación LT que está operablemente enlazada a la secuencia de poliadenilación del gen de beta globina de conejo. En una instancia especialmente preferida, uno o más de los elementos de los vectores pPJV7563 y/o pPJVl671 puede utilizarse en una construcción de ácido nucleico de la invención. Los fragmentos o variantes funcionales de dichos elementos se pueden utilizar. En particular, cualquiera de los elementos de pPJV1671 especificado en la Tabla 3, las variantes funcionales de dichos elementos o los fragmentos funcionales de cualquiera se pueden utilizar. Similarmente, cualquiera de los elementos de pPJV7563 especificados en el Ejemplo 5, las variantes funcionales de dichos elementos o los fragmentos funcionales de cualquiera se pueden utilizar. Preferiblemente, las secuencias de uno o más de los elementos de pPJV7563 y/o pPJVl671 por sí mismos se pueden utilizar. En otra modalidad preferida, los elementos correspondientes de la construcción pPML7789 se pueden utilizar y la ubicación de éstos se indica en particular en la Figura 21 y en el listado de secuencias provistos aquí. En instancias preferidas adicionales, los elementos correspondientes a los vectores pPJV2012 y pPJV778 se pueden utilizar y en particular aquellos elementos indicados en las Tablas 6 y 8 se pueden utilizar. Los fragmentos y variantes funcionales de los elementos de los vectores pPML77895, pPJV2012 y pPJV7788 también se pueden utilizar en las construcciones de la invención . En una instancia preferida, una construcción de la invención comprende: (i) la secuencia del vector pPJV7563 provisto como SEC ID NO: 14; (ii) una secuencia con 60% de identidad de secuencia para la secuencia de (i), a parte de la inserción de la secuencia que codifica el antígeno de influenza, un fragmento inmunogénico o variante inmunogénica en la secuencia de (i) o (ii) de tal forma que está operablemente enlazada al promotor quimérico. En una instancia preferida, una secuencia de codificación de dicha construcción codifica un antígeno HA, una variante inmunogénica del mismo o un fragmento inmunogénico de cualquiera. En instancias preferidas adicionales de la invención una construcción es provista cuando el vector comprende la secuencia del vector pPJV1671 provisto como SEC ID NO: 54 o una secuencia con 60% de identidad de secuencia del mismo. En otra instancia preferida, el vector comprende la secuencia del vector pPML7789 provisto como SEC ID NO: 59 o una secuencia con 60% de identidad de secuencia del mismo. En una instancia preferida, el promotor CMV, la secuencia líder no traducida, el intrón A de insulina de rata, la secuencia líder no traducida, el potenciador HBV y/o la secuencia poli A de conejo de pPJV7563 y/o pPJVl671 se utilizan o una variante o fragmento de dicha secuencia. En una instancia particularmente preferida el intrón A del intrón de la insulina de la rata y/o el potenciador de HBV de pPJV7563 y/o pPJV1671 se utilizan o el fragmento funcional o variante de dicha secuencia. En particularmente, tanto el intrón A de insulina de rata como el potenciador HBV se utilizan o un fragmento funcional o variante de dicha secuencia se emplea. En otra instancia preferida las secuencias correspondientes de PML7789, pPJV2012, pPJV7788, fragmentos funcionales de dichas secuencias o variantes de dichas secuencias se pueden utilizar. En instancias en donde la construcción codifica varios polipéptidos y particularmente antígenos, las secuencias particulares se pueden omitir para reducir el tamaño de la construcción. Por ejemplo, las construcciones pueden carecer de un potenciador y/o una secuencia líder no traducida, particularmente cuando tres, cuatro, cinco o más antígenos se codifican. En otras construcciones que codifican el mismo número de antígenos estas secuencias aún pueden estar presentes. En una instancia particularmente preferida, el vector pPJV7563 del vector se utiliza para clonar la secuencia de codificación deseada en y en particular las secuencias de codificación para un antígeno tal como, por ejemplo, cualquiera de los antígenos mencionados aquí. En una instancia preferida un antígeno de influenza deseado, un fragmento o una variante del mismo se clona en el vector. Las modificaciones pueden en algunos casos hacerse a pPJV7563. Por ejemplo, el gen de resistencia a Canamicina se puede intercambiar por un gen alternativo y en particular un marcador seleccionable o clasificable alternativo. Cualquiera de las construcciones de ácido nucleico de la invención puede comprender marcadores seleccionables. La estructura del plásmido pUC19 de pPJV7563 se puede modificar o reemplazar con una estructura de plásmido diferente. Los elementos específicos de pPJV7563 pueden, por ejemplo, intercambiarse con cualquier elemento que cumpla con la misma función y particular variantes funcionales o fragmentos de las secuencias en pP JV7563. En algunas instancias, pP JV7563 se pueden modificar a través del reemplazo de un elemento particular con cualquiera de los elementos referidos aquí que tienen la misma función que el elemento que se va a reemplazar. Similares modificaciones se pueden hacer a pPJV1671 cuando se está utilizando. Similares modificaciones también se pueden hacer a cualquiera de los vectores mencionados aquí y en particular pPML7789, pPJV2012 y pPJV7788. Las secuencias de codificación de pPML7789, pPJV2012 y pPJV7788 se pueden intercambiar por cualquiera de las secuencias de codificación mencionadas aquí. En el caso de pPJV2012 y pPJV7788 una o ambas secuencias de codificación de los vectores se pueden intercambiar. En una modalidad preferida una construcción de ácido nucleico de la invención comprende: (i) la secuencia del vector pPJV7563 provisto como SEC ID NO: 14; (ii) una secuencia con 60% de identidad de secuencia para la secuencia de (i), aparte de la inserción de las secuencias de codificación deseadas de tal forma que están operablemente enlazadas al promotor quimérico. En una instancia preferida, las secuencias de codificación codifican un antígeno. Particularmente, una secuencia de codificación que codifica un antígeno de influenza, un fragmento inmunogénico o variante inmunogénica se inserta en la secuencia de (i) o de (ii) de tal forma que está operablemente enlazada al promotor quimérico. La construcción puede tener 60% de identidad de secuencia a la secuencia (i) tomando en cuenta las secuencias de codificación insertadas o desechándolas. La construcción puede tener cualquiera de los valores de identidad de secuencia especificados aquí, y en particular, al menos 70%, preferiblemente por lo menos 80%, más preferiblemente por lo menos 90% y más preferiblemente por lo menos 95%. En una modalidad preferida la construcción es pPJV7563 a parte de la inserción de las secuencias de codificación. Las secuencias adicionales se pueden adicionar a la secuencia de pPJV7563 para generar construcciones adicionales de la invención. Por ejemplo, unos o más promotores quiméricos de la invención se pueden agregar juntos con cualquiera de las secuencias mencionadas aquí las cuales pueden estar en un enlace operable a dicho promotor. El sitio de clonación de pPJV7563 se puede modificar para permitir la clonación de diferentes fragmentos de restricción y en particular la clonación de las secuencias de codificación como fragmentos diferentes. Las modificaciones similares se pueden hacer a cualquiera de los vectores mencionados aquí y en particular a pPML7789, pPJV2012 y pPJV7788. En otra instancia preferida, una construcción de la invención puede hacerse a través del reemplazo de algunas o todas las secuencias de codificación de pPJV1671 que codifica un antígeno con secuencias de codificación a diferentes antígenos. Otra vez, cualquiera de las modificaciones explicadas anteriormente con la relación pPJV7563 también puede hacerse para modificar pPJV1671. Dichas modificaciones también se pueden hacer a pPML7789. Las secuencias de codificación de pPJV2012 y pPJV7788 también se pueden se pueden reemplazar con otras secuencias de codificación deseadas y en particular aquellas que codifican un antígeno. En otras instancias preferidas, la construcción de la invención comprende la: secuencia del vector pPJV1671 provisto como SEC ID NO: 54 o una secuencia con 60% de identidad de la secuencia del mismo; - secuencia del vector pPML7789 provisto como SEC ID NO: 59 o una secuencia con 60% de identidad de secuencia del mismo; secuencia del vector pPJV2012 provisto por SEC ID NO: 61 o una secuencia con 60% de identidad de secuencia del mismo; secuencia del vector pPJV7788 provisto por el SEC ID NO: 62 o una secuencia con 60% de identidad de secuencia del mismo. En dichas instancias, la construcción puede tener cualquiera de los porcentajes de identidades unas de secuencia especificados aquí, y en particular aquellos especificados con relación a pPJV7563. Una construcción de la invención puede comprender cualquiera de los elementos especificados en las tablas aquí y en particular aquellas especificadas en las Tablas 3, 6 y 8. Los fragmentos funcionales de dichas secuencias y variantes de dichas secuencias y sus fragmentos también se pueden utilizar. En una instancia preferida, cuando el vector es un vector adyuvante uno o más de los elementos especificados por las Tablas 6 y/o 8 puede estar presentes o un fragmento o una variante de dichas secuencias. La invención también provee un método para generar una construcción de la invención que comprende insertar las secuencias de codificación para un polipéptido y particularmente un antígeno en un vector de la invención que carece de dichas secuencias. Las secuencias de codificación pueden codificar cualquiera de los antígenos mencionados aquí. En una instancia preferida, la invención provee un método que comprende insertar las secuencias de codificación seleccionadas en pPJV7563, pPJV1671 o una de las versiones modificadas de los vectores explicados aquí. Estas se pueden insertar en pPML7789, pPJV2012 y/o pPJV7788 y en particular pPML7789. En algunos casos, se puede inserta una secuencia de codificación adicional y/o una secuencia de codificación ya presente se puede reemplazar en una secuencia de codificación diferente . La invención también provee una secuencia promotora y una secuencia de codificación operablemente enlazadas al promotor, en donde la construcción además comprende: (a) una secuencia líder no-traducida que se deriva de la secuencia de antígeno HBVpreS2, la secuencia de e-antígeno HBV o la secuencia de antígeno de tipo 2gD HSV, que está operablemente enlazada a secuencia de codificación y promotora que es heteróloga a la secuencia de codificación; y/o (b) una secuencia potenciadora 3' de y operablemente enlazada a la secuencia de codificación, en donde la secuencia potenciadora se deriva de un UTR 3' de una secuencia HBsAg o un UTR 3' de una secuencia de gen temprano inmediato CMV de simio, y la secuencia de codificación es heteróloga a la secuencia potenciadora 3' . Los varios elementos del vector pueden ser cualquiera de aquellos especificados en la presente. En una instancia, la secuencia promotora (i) se selecciona de la secuencia promotora temprana inmediata hCMV, la secuencia promotora del virus de Pseudorabia y la secuencia promotora del virus de sarcoma de Rous. En otra, la promotora es una de los promotores quiméricos explicados aquí. En otra instancia, la invención provee un promotor quimérico aislado purificado en donde el promotor quimérico es cualquiera de aquellos definidos aquí. Una construcción de polinucleótido de la invención puede estar substancialmente libre de o asociada con las células o con el material celular. Puede estar en una forma substancialmente aislada, o puede estar en una forma substancialmente purificada, en cuyo caso generalmente comprenderá por lo menos el 90% por ejemplo al menos 95%, 98% o 99% del polinucleótido o la masa seca en la preparación . Las moléculas de ácido nucleico presenten se pueden derivar para células hospederas adecuadas, para la expresión de un polinucleótido en enlace operable con el promotor. Preferiblemente, las células hospederas son células de mamífero, particularmente células humanas. Los métodos adecuados para distribuir ácidos nucleico a dichas células son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, transfección mediada por dextrina, precipitación de fosfato de calcio, electroporación y microinyección directa en el núcleo. De esta forma la invención provee una transformación de célula con un vector de la invención.
Como se describió anteriormente, una secuencia de codificación de ácido nucleico en una construcción puede codificar un polipéptido terapéutico relevante. Las construcciones presentes pueden por consiguiente utilizarse para la inmunización de ácido nucleico o terapia de gen utilizando protocolos de distribución de gen estándar. Los métodos adecuados para la distribución de gen son conocidos en la técnica, como se explican a continuación. Las moléculas de ácido nucleico se pueden distribuir ya sea directamente a un sujeto, o alternativamente, distribuidas ex vivo a células derivadas del sujeto a partir de los cual las células reimplantan en el sujeto. En una instancia preferida, las construcciones se distribuyen directamente al sujeto cuando el polipéptido codificado es un antígeno, particularmente un antígeno de influenza. Cualquiera de las rutas de distribución mencionadas aquí se pueden utilizar y en particular la distribución transdérmica. Las construcciones adyuvantes de la invención se pueden administrar para mejorar la respuesta inmune contra un antígeno y en particular contra un antígeno expresado de una construcción de la invención. La invención también provee el uso de una construcción de ácido nucleico de la invención o una población de construcciones de ácido nucleico de la invención o partículas cubiertas de la invención en la fabricación de un medicamento para la inmunización de ácido nucleico. El medicamento puede ser uno que se distribuye a través de inyección, distribución de partículas transdérmicas, inhalación, tópicamente, oralmente, intranasalmente o transmucosalmente . En una instancia preferida, el medicamento que se va a distribuir a través de inyección sin aguja. Para uso en inmuni zación de ácido nucleico o terapia del gen, las construcciones de ácido nucleico se pueden formular como preparaciones farmacéuticas convencionales. Esto se puede hacer utilizando químicas y metodologías de formulación farmacéutica, que están disponibles para los expertos en la técnica. Por ejemplo, las composiciones que contienen una o más secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, presentes en una forma de vector adecuado tal como un plásmido de ADN) se pueden combinar con uno o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables para proveer una preparación líquida. De esta forma también se proveen composiciones farmacéuticas que comprende una construcción de ácido nucleico de la invención y un portador de excipiente farmacéuticamente aceptable. En una instancia preferida una composición farmacéutica puede comprender una pluralidad de construcciones de la invención o una población de construcciones de la invención o incluyendo cualquiera de aquellas mencionadas aquí. Las sustancias auxiliares, tales como agentes de humectación o emulsificación, sustancias reguladoras de pH y similares, pueden estar presentes en el excipiente o vehículo. Estos excipientes, vehículos y sustancias auxiliares son generalmente agentes farmacéuticos que pueden administrarse sin una indebida toxicidad y que, en el caso de composiciones de vacuna no inducirán una respuesta inmune en el individuo que recibe la composición. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, líquidos tales como agua, salina, polietilenglicol, ácido hialurónico, glicerol y etanol . Las sales farmacéuticamente aceptables se también se pueden incluir aquí, por ejemplo, sales de ácido mineral tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos, y similares; y las sales de ácidos orgánicos tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, y similares. También se prefiere, aunque no se requiere, que la preparación contenga un excipiente farmacéuticamente aceptable que sirve como estabilizador, particularmente para moléculas de péptido, proteína u otras moléculas similares si se van a incluir en la composición. Ejemplos de portadores adecuadas que también pueden actuar como estabilizadores para los péptidos incluyen, sin limitación, grados de dextrosa farmacéutica, sacarosa, lactosa, el trehalosa, manitol, sorbitol, inositol, dextrina, y similares. Otro portadores adecuados incluyen, otra vez sin limitación, almidón, celulosa, fosfatos de sodio o calcio, ácido cítrico, ácido tartárico, glicina, polietilenglicoles de alto peso molecular (PEG), y combinación de los mismos. Una discusión minuciosa de excipientes farmacéuticamente aceptables, vehículos y sustancias auxiliares está disponible en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co . , N. J. 1991), incorporada aquí por referencia. Ciertos facilitadores de la absorción y/o expresión de ácido nucleico ("agentes de facilitación de transfección") también se pueden incluir en las composiciones, por ejemplo, facilitadores tales como bupivacaina, cardiotoxina y sacarosa, y vehículos que facilitan la transfección tales como preparaciones liposómicas o lípidas que rutinariamente se utilizan para distribuir moléculas de ácido nucleico. Los liposomas aniónicos y neutrales están ampliamente disponibles y también son conocidos para la distribución de moléculas de ácido nucleico (ver, por ejemplo, Liposomes : A Pra cti cal Approa ch, (1990) RPC New Ed., IRL Press). Las preparaciones lípidas catiónicas también son vehículos bien conocidos para uso en la distribución de moléculas de ácido nucleico. Las preparaciones de lípido adecuadas incluyen DOTMA (N-[l (2,3-dioleiloxi) propil] -N, N, N-cloruro de trietilamonio) , disponible bajo el nombre comercial de Lipofectin™, y DOTAP (1, 2-bis (oleiloxi) -3- (trimetilamonio) propano) , ver, por ejemplo Feigner y otros. (1987) Proc . Na ctl . Acad. Sci . USA 84:7413-7416; Malone y otros. (1989) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 86:6077-6081; Patentes de E. U. A. Nos. 5,283,185 y ,527,928 y publicación internacional No. WO 90/11092, WO 91/15501 y WO 95/26356. Estos lípidos catiónicos pueden preferiblemente utilizarse en asociación con un lípido neutral, por ejemplo DOPE ( fosfatiletanolamina de dioleilo) . Aún otras composiciones que facilitan la transfección adicionales que se pueden agregar a las preparaciones de lípido o de liposomas anteriores incluye derivados de espermina (ver, por ejemplo, la Publicación Internacional No. WO 93/18759) y compuestos de permeabilización de membrana tales como GALA, y sales de bilis catiónica (ver, Publicación Internacional No. WO 93/19768). Alternativamente, las moléculas de ácido nucleico de la presente invención se pueden encapsular, adsorber a, o asociar con, portadores en partículas. Los portadores en partículas adecuadas incluyen aquellos derivados de polímeros de metacrilato de polimetilo, así como micropartículas PLG derivadas de poli (lactida) y poli (lactida-co-glicolida) . Ver, por ejemplo, Jeffery y otros (1993) Pharm . Res . 10:362-368. Otros sistemas y polímeros también se pueden utilizar, por ejemplo, polímeros tales como polilisina, poliarginina, polihornitina, espermina, espermidina, así como conjugados de estas moléculas. En una modalidad preferida, las construcciones de la invención son precipitadas sobre portadores en la presencia de un agente de condensación de ácido nucleico y un agente de quelatación de un ion metálico.
Los agentes condensantes preferidos incluyen polímeros catiónicos, particularmente poliaminas, y en particular poliaminas y en particular una poliargina o una polilisina. En una instancia preferida la poliamina es (Arg)4 o (Arg)6. Se hace referencia a las técnicas explicadas en WO2004/208560 que se pueden utilizar para generar partículas portadoras cubiertas de la invención. Una vez que se formulan las composiciones se pueden distribuir a un sujeto in vi vo utilizando una variedad de rutas y técnicas conocidas. Por ejemplo, las preparaciones líquidas pueden ser provistas como una solución inyectable, suspensión o emulsión y administrarse a través de inyección parenteral, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa utilizando una aguja y jeringa convencionales, o utilizando un sistema de inyección de chorro líquido. Las preparaciones líquidas también se pueden administrar tópicamente a la piel o tejido mucoso, o proveerse como aspersiones finamente divididas adecuada para administración respiratoria o pulmonar. Otros modos de administración incluyen la administración oral, supositorios, y las técnicas de distribución transdérmicas activas o pasivas. Alternativamente, las composiciones se pueden administrar ex vivo, por ejemplo distribuirse y la reimplantación de las células transformadas en un sujeto son conocidas (por ejemplo, transfección mediada dextrina, precipitación de fosfato de calcio, electroporación, y microinyección directa en el núcleo) . Las composiciones se administran a un sujeto en una cantidad que es compatible con la formulación de dosificación y que serán profiláctica y/o terapéuticamente efectivas. Una cantidad apropiada efectiva caerá en un intervalo relativamente amplio pero pueden fácilmente determinarse a través de un experto en la técnica por medio de ensayos de rutina. El "Physicians Desk Reference" y Goodman and Gilman '2 The Pharmacological Basis of Therapeutics" son útiles para los propósitos de determina la cantidad necesaria. Por ejemplo, se espera generalmente que una dosis efectiva del polinucleótido caerá dentro de una escala de aproximadamente 0.001 a 1000 µg, preferiblemente de 0.001 a 100 µg, más preferiblemente de 0.01 a 10.0 µg. En algunas instancias la dosis puede ser de 0.1 a 100 µg, preferiblemente de la 0.5 a 25 µg . En los casos en donde la dosis se administra a través de inyección sin aguja, la dosis puede en algunos casos estar en la forma de 0.1 a 25 µg, preferiblemente de 0.5 a 10 µg y preferiblemente de 1 a 5 µg. Particularmente, la dosis puede ser de 4 µg . En algunos casos, la dosis puede ser dada a través de una pluralidad de inyecciones sin aguja tales como, por ejemplo, en uno, dos, tres, cuatro o cinco inyecciones sin aguja. En algunos casos después de una administración inicial una administración subsiguiente de la construcción se puede llevar a cabo. En particular, después de una inmunización adicional a un sujeto se puede dar una inmunización de refortalecimiento. La inmunización de refortalecimiento puede ser, por ejemplo, una dosis seleccionable de cualquiera de las mencionadas aquí. La administración del sujeto puede, por ejemplo, ser al menos una semana, dos semanas, un mes, dos meses o seis meses después de la administración inicial. En una instancia, una construcción de ácido nucleico de la invención se puede utilizar en conjunción con otra construcción de ácido nucleico. En un caso, la construcción de ácido nucleico puede ser una de aquellas descritas aquí para la expresión de un adyuvante y la otra construcción puede ser una construcción que codifica unos o más antígenos. En un caso preferido, ambas construcciones pueden utilizar los promotores quiméricos de la invención. Cuando se dan dos o más agentes aquí pueden en particular administrarse de manera separada, simultánea o secuencial. En el caso en donde una construcción expresa un adyuvante y la otra un antígeno o antígenos, los antígenos pueden en particular estar en la forma de virus HSV, HPV, o hepatitis (particularmente el virus de hepatitis B) . Los antígenos pueden en particular ser antígenos HSV ICPO, ICP4, ICP 22 y/ICP 27 y preferiblemente los cuatro. En un caso especialmente preferido, los antígenos pueden ser un antígeno de influenza que incluye cualquiera de los mencionados aquí y en particular HA, NA y/o M2 y en particular HA y NA y especialmente HA. En los casos en donde antígenos se expresan, la construcción adyuvante en particular expresará LTA y/o LTB y en particular ambas. Cualquiera de las construcciones adyuvantes mencionadas aquí se puede utilizar simultánea, separada o secuencialmente con cualquiera de las construcciones que codifican un antígeno. Cualquiera de las dos entidades de la invención se puede administrar por separado, secuencialmente o simultáneamente. Las dos construcciones se pueden administrar por separado, simultáneas o secuenciales. Las dos pueden administrarse en la misma o diferentes composiciones. En particular, cuando una construcción tiene un efecto adyuvante las dos se distribuirán de manera que el efecto del adyuvante se ve, que es la respuesta inmune generada será mayor y/o durante un período más largo que si el adyuvante no había sido administrado con el antígeno. En una instancia preferida, las dos construcciones se pueden distribuir en la misma composición, preferiblemente en las mismas partículas portadoras. En otros casos las partículas portadoras que llevan una construcción se pueden mezclar con partículas portadoras que llevan otra construcción. Cualquiera de dichos esquemas de administración se puede utilizar para cualquiera de las combinaciones de una pluralidad de construcción explicadas aquí. En una modalidad preferente, las construcciones de ácido nucleico de la invención se distribuyen a células objetivo utilizando la técnica de distribución mediada por partículas. Los métodos mediados por partículas para distribución de preparaciones de ácido nucleico son conocidos en la técnica. Por lo tanto, en una instancia preferida la invención provee partículas cubiertas que comprenden partículas portadoras cubiertas con una construcción de ácido nucleico de la invención o una población de construcciones de ácido nucleico de la invención. En particular, las partículas cubiertas son adecuadas para distribución desde un dispositivo de distribución de grado por partícula. Las partículas para la distribución mediada por partícula se pueden formar a través del recubrimiento de las moléculas de ácido nucleico de la presente sobre partículas portadoras (por ejemplo, portadores centrales) utilizando una variedad de técnicas conocidas en la técnica. Las partículas portadoras se seleccionan de materiales que tienen una densidad adecuada en la escala de tamaños de partícula típicamente utilizados para distribución intracelular de un dispositivo de distribución mediado por partícula. Las partículas portadoras típicamente tienen un diámetro de 0.1 a 5 µm, por ejemplo 0.5 a 3 µm, preferiblemente 1 a 2 µm. En algunos casos, las partículas pueden tener un diámetro de 1 a 3 µm. El tamaño de partícula de portador óptimo, por supuesto, dependerá del diámetro de las células objetivo. Las partículas portadoras usualmente se seleccionan de metales inertes. Los metales son inertes en que no están fisiológico activos. Para el propósito de la invención, pueden utilizarse por ejemplo hierro, cobalto, níquel, cobre, plata, cadmio, Hafnio, tantalio, tungsteno, platino, oro, y el acero inoxidable y en particular, partículas portadoras de tungsteno, oro, platino e iridio se pueden utilizar. Las partículas de tungsteno y oro. De esta forma, en una instancia preferida, la invención provee partículas portadoras cubiertas que son de oro o tungsteno. Las partículas de tungsteno están fácilmente disponibles en tamaños promedio de 0.5 a 2.0 µm de diámetro. Aunque dichas partículas tienen densidad óptima para uso en métodos de distribución de aceleración de partícula, y permiten un recubrimiento altamente eficiente con ADN, el tungsteno puede potencialmente ser tóxico para ciertos tipos de células. Las partículas del oro u oro microcristalino (por ejemplo polvo de oro A1570, disponible de Engelhard Corp., East Newark, NJ) también encontrarán uso con los métodos presentes. Las partículas del oro proveen una uniformidad en tamaño (disponibles de Alpha Chemicals en tamaños de partícula de 1-3 µm, o disponibles de Degussa, South Plainfield, NJ en un intervalo de tamaños de partícula que incluyen 0.95 µm) y toxicidad reducida. El oro microcristalino provee una distribución de tamaño de partícula diverso, típicamente en la escala de 0.1-5 µm. Sin embargo, el área de superficie irregular del oro microcristalino provee un recubrimiento altamente eficiente con ácidos nucleicos. Son conocidos un número de métodos y se han descrito para el recubrimiento o precipitación de ADN o ARN sobre partículas del oro o tungsteno. La mayor parte de dichos métodos generalmente combina una cantidad predeterminada de oro o de tungsteno con ADN del plásmido, CaCl2, y espermidina. La solución resultante se somete a vórtice continuamente durante el procedimiento de recubrimiento para asegurar la uniformidad de la mezcla de reacción. Después de la precipitación de ácido nucleico, las partículas recubiertas se pueden transferir a membranas adecuadas y dejar secar antes de uso, recubrirse sobre superficies de un módulo de muestra o cásete, o cargarse en un cásete de distribución para uso en instrumentos de distribución mediados por una partícula particular. Como alternativa, los polinucleótidos de la invención se pueden formular como composición en partículas. La formulación se puede llevar a cabo utilizando las químicas de formulación farmacéuticas estándares anteriormente descritas. Por ejemplo, los polinucleótidos se pueden combinar con unos o más excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables para proveer una composición adecuada. Las composiciones formuladas entonces se preparan como partículas utilizando técnicas estándares tales como a través de evaporación simple (secado por aire), secado al vacío, secado por aspersión, secado por congelamiento (liofilización), secado por aspersión congelamiento, recubrimiento por aspersión, precipitación, formulación de partícula de fluido supercrítica, y similares. Si se deseadas, las partículas resultantes se pueden densificar utilizando las técnicas descritas en la Publicación Internacional de Propiedad Común No. WO 97/48485, incorporada aquí por referencia. Estos métodos se pueden utilizar para obtener partículas de ácido nucleico que tienen un tamaño en la escala de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 250 µm, preferiblemente de 10 aproximadamente 150 µm, y más preferiblemente de 20 a 60 µm; y una densidad de partícula en la escala de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 25 g/cm3, y una densidad en volumen de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 3.0 g/cm3, o mayor. Una vez que se forman, las partículas comprenden las moléculas de ácido nucleico que se pueden empacar en dosificación de unidades individuales o recipientes multidosis. La invención por consiguiente también provee un receptáculo de dosificación para un dispositivo de distribución mediado por partícula que comprende partículas cubiertas de la invención. Dichos recipientes pueden comprender un contenedor herméticamente sellado que encasilla una cantidad adecuada de partículas. Las partículas se pueden empacar como una formulación estéril, y el contenedor herméticamente sellado puede de esta forma diseñarse para conservar la esterilidad de la formulación hasta el uso en la distribución a un sujeto. Los contendores preferiblemente se adaptan para uso directo en un dispositivo de distribución mediado por partícula. Típicamente dichos contenedores toman la forma de cápsulas, bolsillos de aluminio, almohadillas, de casetes y similares. Los dispositivos de distribución de partícula también pueden ser provistos en una condición precargada conteniendo una dosificación adecuada de las partículas. El dispositivo precargado entonces puede preempacarse en un contenedor herméticamente sellado. El recipiente en donde las partículas se empacan además puede marcarse para identificar la composición y proveer la información de dosificación relevante. Además, el contenedor se puede marcar con una noticia en la forma prescrita a través de una agencia gubernamental, por ejemplo, la administración de alimentos y fármacos, en donde la noticia indica la aprobación por la agencia bajo la ley federal de la fabricación, uso o de venta de la preparación de ácido nucleico contenida ahí para administración humana. La invención también provee un dispositivo de distribución mediado por partícula cargado con partículas cubiertas de la invención. Preferiblemente, el dispositivo de distribución es una jeringa sin aguja. Los dispositivos de aceleración de partícula, adecuados para la distribución mediada por partícula son conocidos en la técnica. Por ejemplo, los dispositivos de pistola de gen actuales utilizan un explosivo, una descarga de explosivo, eléctrica o gaseosa para propulsar las partículas portadoras cubiertas hacia las células objetivo. Las partículas portadoras cubiertas pueden estar liberablemente unidas a una hoja portadora movible, o removiblemente unidas a la superficie a lo largo de la cual pasa una corriente de gas, levantando las partículas de superficie y acelerándolas hacia el objetivo. Un ejemplo del dispositivo de descarga gaseosa se describe en la Patente de E. U. A. No. 5,204,253. Un dispositivo de tipo explosivo se describe en la Patente de E. U. A. No. 4,945,050. Un ejemplo de un aparato de descarga eléctrico adecuado para uso aquí se describe en la Patente de E. U. A. No. 5,120,657. Otro aparato de descarga eléctrico se describe en la Patente de los E. U. A. No. 5,149,655. La descripción de todas estas patentes se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Las partículas también se pueden administrar utilizando un dispositivo de jeringa sin aguja, tal como aquel descrito en la Patente de E. U. A. No. 5,630,796 de Bellhouse y otros ("the PowderJect® needleless syringe device") y las publicaciones internacionales Nos. WO 94/24263, WO 96/04947, WO 96/12513 y WO 96/20022, todas las cuales se incorporan aquí por referencia. Los dispositivos tales como aquellos descritos en la Patente de E. U. A. 5,630,796 se pueden proveer como un instrumento en forma de pluma que contiene, en la orden lineal el movimiento de la parte superior a la inferior, un cilindro de gas, un cásete o un paquete de la partícula, y una boquilla supersónica con un medio silenciador asociado. Las partículas son provistas dentro de un contenedor adecuado, por ejemplo, un cásete formado por dos membranas de polímero sujetas a ruptura que están selladas por calor a un a un espaciador en forma de arandela para formar una unidad sellada autocontenida. Los materiales de membrana se pueden seleccionar para lograr un modo específico de abertura y presión de ráfaga que dicta las condiciones a las cuales el flujo supersónico se inicia. En operación, el dispositivo se activa para liberar el gas comprimido del cilindro en una cámara de expansión dentro del dispositivo. El gas liberado hace contacto con el cásete de partículas y, cuando se forma suficiente presión, repentinamente fisura la membrana del cásete intercambiando las partículas en la boquilla supersónica para la distribución subsecuente. La boquilla está diseña para lograr una velocidad específica de gas y un patrón de flujo para distribuir una cantidad de partículas a una superficie objetivo del área predefinida. El silenciador se utiliza para atenuar el ruido producido por el flujo del gas supersónico. El sistema de distribución descrito en la Publicación Internacional No. 96/20022 también utiliza la energía de una fuente de gas comprimida para acelerar y distribuir composiciones en polvo. Sin embargo, se distingue del sistema de la Patente de E. U. A. No. 5,630,796 en su uso de una onda de choque en lugar de un flujo de gas para acelerar las partículas. Más particularmente, surge una presión instantánea provista por una onda de choque generada por detrás del domo flexible que por golpear la parte trasera del domo, causando una eversión continua del domo flexible en la dirección de la superficie objetivo. Esta eversión repentina lanza con fuerza una composición en polvo (la cual está localizada en la parte exterior del domo) a una velocidad suficiente, de esta forma momentánea, para penetrar el tejido objetivo, por ejemplo, el tejido mucoso oral. La composición en polvo se libera en el punto de la eversión del domo completo. El domo también sirve para completamente contener el flujo de gas de alta presión el cual por consiguiente no se pone en contacto con el tejido. Debido a que el gas no se libera durante esta operación de distribución, el sistema es inherentemente silencioso. Este diseño se puede utilizar en otras aplicaciones encasilladas o sensibles por ejemplo, para distribuir partículas a sitios quirúrgicos mínimamente invasivos. Las partículas se pueden distribuir in vivo directamente a un sujeto, o ex vivo a células tomadas de un sujeto, las células transformadas después siendo reimplantadas el sujeto. Para la distribución in vivo, la inyección de la partícula es típicamente subcutánea, epidérmica, intradérmica, intramucosa (por ejemplo, nasalmente, rectalmente y/o vaginalmente) , intraperitonealmente, intravenosamente, oralmente o intramuscular. Preferiblemente, la distribución es para diferenciar células terminalmente; sin embargo, las partículas también se pueden distribuir para las células no diferencias o parcialmente diferenciadas tales como células de tallo de fibroblastos de sangre y piel. Más preferiblemente, la distribución es para células epidérmicas. Las partículas se administran a un sujeto en una forma compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad que será profiláctica y/o terapéuticamente efectiva. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" de la presentes composición en partículas será suficiente para causar el tratamiento o prevención de la enfermedad o síntomas de la condición, y caerá en un rango ampliamente relativo que puede determinarse a través de ensayos de rutina. Generalmente las partículas se distribuyen en una cantidad de 0.001 a 1000 µg, más preferiblemente 0.01 a 10.0 µg de ácido nucleico por dosis. Sin embargo, la cantidad exacta necesaria variará dependiendo de la edad y condición general del individuo que se está tratado y de la secuencia de nucleótido particular seleccionada, así como otros factores. Una cantidad efectiva apropiada puede fácilmente determinarse a través de la prueba clínica. El "Physicians Desk Referente" y "Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics" son útiles para los propósitos de determinar la cantidad necesaria . Ensayos Ensayo de expresión comparativo Una prueba adecuada para la utilidad del elemento determina el efecto que el elemento tiene sobre la expresión de un polipéptido. En una instancia preferida el péptido puede ser un antígeno de influenza, una variante del mismo o fragmento de cualquiera. La base de comparación para la prueba de utilidad de los elementos es un "vector base", generalmente (a menos que se indique lo contrario) un plásmido con un promotor hCMV, un exón 1 hCMV, 9 base del exón 2 hCMV, la UTR 5' de HBV preS2 y la región de poliadenilación de beta globina de conejo, colocados para conducir la expresión de una secuencia de codificación.
Típicamente, el vector base es pPJV7384, pPJV7401, pPJV7450 o pPJV7533. En algunas instancias, cualquiera de los vectores mencionados aquí con los elementos anteriormente mencionados se pueden utilizar como un vector base. En una instancia, se puede utilizar pPJV1671 como vector base. También se pueden utilizar pPJV2012, pPJV7788 y pPML7789 como vectores base. El vector base, los intrones heterólogos y los UTR 3' se adicionan, o las secuencias promotoras, exones, UTR 5' y los sitios Poli A se intercambian en los vectores base para crear los vectores de expresión de prueba. Cualquiera de los elementos de los vectores explicados aquí se puede intercambiar con una secuencia de prueba y compararse con una secuencia base. De esta forma, las variantes o fragmentos funcionales se pueden probar. Los vectores base y los vectores de prueba se transforman en células hospederas adecuadas y las células se analizan para los niveles de expresión del polipéptido. Preferiblemente se utilizan células hospederas de mamífero. Las células adecuadas incluyen las células HEK 293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 o COS de mamífero. En algunas instancias pueden utilizar las células SSC15 o B16. Típicamente, un elemento funcional causa la expresión que es comparable con el vector base, por ejemplo por lo menos el mismo que o mayor. Preferiblemente la expresión se prueba en más de un tipo de célula y con más de una secuencia de codificación. En algunas instancias, un elemento funcional puede causar la expresión que es ligeramente menor que el vector base tal como, por ejemplo, por lo menos 25%, particularmente por lo menos 50%, preferiblemente por lo menos 60%, más preferiblemente por lo menos 70%, aún más preferiblemente al menos 80%, aún más preferiblemente al menos 90% y más preferiblemente por lo menos 90% de la expresión del vector base. Típicamente, una variante o un fragmento de un elemento particular aún pueden considerarse para representar una variante o fragmento funcional de un elemento particular si muestra dichos niveles de expresión. Sin embargo, las variantes y fragmentos funcionales preferiblemente darán origen a expresiones más altas que el vector base como se explicó anteriormente. El incremento del porcentaje puede, por ejemplo, ser cualquier porcentaje mencionado anteriormente. Se proveen los protocolos experimentales adecuados, por ejemplo en los ejemplos 1 a 18 siguientes. Ensayo de inmunogenicidad comparativo Cuando el polipéptido se va a expresar en un antígeno, puede llevar a cabo una prueba adicional para identificar los elementos de construcción funcionales o particularmente preferidos. En particular, dicha prueba se puede llevar a cabo cuando el antígeno es, por ejemplo, un antígeno de influenza, un fracjmento del mismo o variante de cualquiera. En el ensayo, el efecto de un elemento sobre la respuesta inmune se determina después de la distribución de un vector de expresión a un organismo de prueba. Los niveles del anticuerpo contra el antígeno son la forma más fácil de juzgar la respuesta inmune. Los grupos de ratones se vacunaron con vectores base o vectores de prueba construidos como anteriormente. El suero se recolectó después de una cantidad apropiada de tiempo y se analizó para niveles de anticuerpo . Este experimento se llevó a cabo dos veces, y los niveles de anticuerpo de todos los grupos en ambos experimentos se graficaron. Los elementos funcionales típicamente dieron origen a por lo menos concentraciones de anticuerpo altas o tan altas en ambos experimentos para un antígeno particular que el vector base. Preferiblemente, el resultado se verá con más de un antígeno para demostrar el espíritu de utilidad del (de los) elemento (s) en ese panel de expresión. En algunas instancias, un elemento funcional puede dar origen a una concentración de anticuerpo que es ligeramente menor que la vista en el vector base, tal como, por ejemplo, al menos 25%, en particular al menos 50%, preferiblemente al lo menos 60%, más preferiblemente al menos 70%, aún más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 90% y aún más de preferencia al menos el 90% de la concentración del anticuerpo vista con el vector base. Típicamente, una variante o un fragmento de un elemento particular aún pueden considerarse que representa una variante o un fragmento funcional de un elemento particular si da origen a dicha concentración del anticuerpo. Sin embargo, las variantes y fragmentos funcionales preferiblemente darán origen a concentraciones más altas que las del vector base como se explicó anteriormente. Los incrementos del porcentaje pueden, por ejemplo, ser cualquiera de los porcentajes mencionados anteriormente. Los vectores adyuvantes también se pueden evaluar a través de la comparación de un vector adyuvante de prueba con un adyuvante estándar, ambos siendo administrados con el mismo antígeno. Una comparación del efecto adyuvante de ambos vectores se hace utilizando el antígeno administrado solo como control. Cualquiera de los vectores adyuvantes mencionados aquí puede utilizarse como un estándar. El incremento o disminución del porcentaje en el efecto del adyuvante puede ser cualquiera de aquellos niveles mencionados anteriormente. Los protocolos experimentales adecuados son provistos por ejemplo, en el Ejemplo 14 siguiente. Los protocolos adecuados también se describen en los Ejemplos 15 a 18 siguientes.
C . Experimental A continuación están los ejemplos de modalidad específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen para propósitos ilustrativos solamente, y no pretenden limitar el alcance de la presente invención en ninguna forma. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperaturas, etc.), pero algún error experimental o desviación deberá, por supuesto, permitirse. Métodos Condiciones PCR Estándar Las condiciones PCR estándar utilizadas para la construcción de vectores fueron como sigue: lx de regulador de pH central de PCR con 1.5 mM de MgCl2 (Promega Corporation, Madison, Wl), 0.400 µM de cada uno de los cebadores, 200 µM de cada dNTP (USB, inc., Cleveland, OH), 2.5 µ de polimerasa Taq (Promega Corporation, Madison, Wl), 1.0 ng de ADN de plantilla, agua para 100 µl, y una cubierta de aceite mineral (Aldrich Chemical, Inc., Milwaukee, Wl). El termociclador PTC-200 (MJ Research, inc., Waltham, MA) se programó para correr la siguiente rutina: 4'@95°C, 30 ciclos de (l'@950C/l'15"@550C/l'@720C) , 10'@72°C, 4°C fijo). Los productos de amplificación se removieron de la reacción PCR a través del uso de equipo de purificación QIAquickáPCR (Qiagen inc., Valencia, CA) antes de cortarlo con enzimas de restricción (New England Biolabs, Beverly, MA) . Todos los productos PCR se secuenciaron después de la clonación para asegurar la fidelidad de la amplificación. E emplo 1. Construcción de los paneles del vector del antigeno de superficie del virus de hepatitis B (HBsAg) Se construyeron un número de vectores de expresión de plásmido para la expresión de HBsAg. Materiales de partida (i) pWRG7128 (Roy, M, y otros Va ccine (2001) 19: 764-778), que contiene la secuencia promotora temprana inmediata del hCMV, el primer exón, el primer intrón, y un segundo exón parcial del gen temprano inmediato principal hCMV, la secuencia de codificación HBsAg con regiones de flanqueo (HBV preS2 5' UTR derivado de la secuencia y el elemento de respuesta post-transcripcional 3' ) y la región de poliadenilación de hormona de crecimiento de bovino (BGHpA) (ii) pPJV7284, un derivado de pWRG7128 que intercambia la región del poliadenilación de globina de conejo (RBGpA) para BGHpA. (a) pPJV7384 (CMV (no intrón), HBV preS2 5' UTR y RBGpA) pWRG7128 se amplificó con PCR JF93 (SEC ID NO: 15) y F110 (SEC ID NO: 16), utilizando condiciones estándares y cortando con Salí y BamHl para aislar un fragmento de inserto conteniendo el promotor CMV, la secuencia del exón 1 y parte del exón 2. pAM6 (ATCC, Mannassas, VA) se cortó con BamHl y BstXl para aislar un fragmento del inserto que contuvo 5' -UTR de HBsAg, y aproximadamente 70% de la región de codificación HBsAg. pJV7284 se cortó con Salí y BstXl para generar un fragmento del vector dentro del cual los dos fragmentos de inserto se ligaron, resultando pJV7293. pWRG7128 se amplificó con PCR con los cebadores GW1 (SEC ID NO:17) y JF254 (SEC ID NO:18) y se cortó con BstXl y Bgl2 para aislar un fragmento del inserto que contuvo el extremo 3' de la región de codificación HBsAg. pPJV7293 se cortó con BstXl y Bgl2 para generar un fragmento del vector dentro del cual el fragmento de inserto se ligó, dando como resultado el vector pPJV7384. (b) pPJV7382 (CMV (no intrón), HBsAg 3' UTR, HBV preS2 5' UTR y RBGpA) pPJV7293 se cortó con Xhol y Xbal para generar un fragmento del inserto conteniendo el promotor CMV/exones y la UTR 5' con el extremo 5' de la secuencia de codificación HBsAg. pWRG7128 se cortó con Xbal y Bcll para generar un fragmento de inserto conteniendo la mayor parte de la secuencia de codificación HBsAg, y la UTR 3' . pPJV7284 se cortó con Xhol y Bgl2 para generar el fragmento de vector dentro del cual los dos fragmentos de inserto se ligaron, resultando pPJV7382. (c) pPJV7389 (CMV (RÍA), HBsAg 3' UTR, HBV preS2 5' UTR y RBGpA) El intrón de insulina de rata A (RÍA) se amplificó con PCR del plásmido p5'rlns con los cebadores GW150 (SEC ID NO: 19) y JF255 (SEC ID NO:20). El producto PCR se cortó con BamHl y se insertó en BamHl linearizado pPJV7382, dando como resultado pPJV7389. (d) pPJV7387 (CMV (RÍA) , HBV preS2 5' UTR y RBGpA) pPJV7384 se cortó con BstXl y BcoRl para generar un fragmento de inserto conteniendo el extremo 3' de la región de codificación HBsAg, y RBGpA. pPJV7389 se cortó con BstXl y BcoRl para generar un fragmento de vector dentro del cual el fragmento del inserto se ligó, dando como resultado pPJV7387. Ejemplo 2. Construcción de los paneles de vector del antigeno de glicoproteina D de virus simple de herpes (HSVgD) Se construyeron un número de vectores de expresión de plásmido para la expresión de HSVgD. Materiales de partida (a) pPJV7334, un derivado de pWRG7284 (pPJV 7284) que reemplaza la secuencia de codificación HBsAg con un Nhel en marco directamente en dirección 3' del codón de iniciación ATG, seguido sobre un fragmento circular con un BamHl inmediatamente 5' del HBV Enh (Potenciador). (b) pWRG7202, un derivado de pGem3Z (Promega) con un fragmento circular que permite la fusión de una secuencia de codificación al péptido de señal del activador de plasminógeno de tejido humano (TPA) en dirección 3' de un sitio Nhel . (a) pPJV7392 (CMV(intrón nativo), HBsAg 3' UTR, HBsAg 5' UTR y RBGEA) La región de codificación para HSV2 gD se amplificó por PCR de una existencia de ADN viral (Advance Biotech, Inc., Columbia, MD) utilizando los cebadores DSl (SEC ID NO: 21) y DAI (SEC ID NO: 22) y se cortó con Nehl y EcoRl para generar un fragmento de inserto. pWRG7202 se cortó con Nhel y BcoRl para generar el fragmento del vector dentro del cual el fragmento del inserto se ligó, dando como resultado pPJV7391. pPJV7391 se cortó con Nhel y Bgl2 para generar un fragmento de inserto conteniendo la secuencia de codificación HSV2 gD. pPJV7334 se cortó con Nhel y BamHl para generar el fragmento del vector dentro del cual el fragmento del inserto se ligó, dando como resultado pPJV7392. Este vector consiste de los siguientes elementos de expresión: la secuencia promotora temprana inmediata hCMV, el primer exón, el primer intrón, y un segundo exón parcial, del gen temprano inmediato principal hCMV, la UTR 5' de HBsAg, la secuencia de codificación para el gen gD HSV2, El UTR 3' de HBsAg, y RBGpA. (b) pPJV7399 (CMV (no intrón), HBsAg 3' UTR HBsAg ' UTR y RBGpA) Se construyó una versión sin intrón de pPJV7392 como sigue. pPJV7384 se cortó con HindIII y Ndel para aislar un fragmento de inserto conteniendo los extremos 5' del gen de resistencia a canamicina y promotor CMV. pPJV7384 se cortó con Ndel y Sspl para aislar un fragmento del inserto conteniendo el extremo 3' del promotor CMV, el exón CMV 1/2 y el extremo 5' de la UTR 5' de HBsAg. Estos fragmentos de inserto después se insertaron en pPJV7392 a partir de lo cual el fragmento Hind3-Sspl se removió, dando como resultado pPJV7399. (c) pPJV7400 (CMV(RIA), HBsAg 3' UTR, HBsAg 5' UTR y RBGpA) Se construyó una versión RÍA de pPJV7392 como sigue. pPJV7384 se cortó con HindIII y Ndel para aislar un fragmento de inserto conteniendo los extremos 5' del gen de resistencia a canamicina y el promotor CMV. pPJV7387 se cortó con Ndel y Sspl para aislar un fragmento de inserto conteniendo el extremo 3' del promotor CMV, el exón 1/2 CMV (parcial), RÍA, y el extremo 5' de la UTR 5' de HBsAg. Estos fragmentos de inserto se insertaron en pPJV7392 a partir de lo cual el fragmento Hind3- Sspl se removió, dando como resultado pPJV7400. (d) pPJV7401 (CMV(no intrón), HBsAg 5'UTR y RBGpA) Se construyó una versión sin UTR 3' de pPJV7399, como sigue. pPJV7391 se cortó con Bspl20I y Bgl2 para aislar un fragmento de inserto conteniendo el extremo 3' del gen HSV2 gD. pPJV7284 se cortó con Bgl2 y EcoRl para aislar la señal RBGpA. Estos fragmentos de inserto se insertaron en pPJV7399 a partir de lo cual el fragmento Bspl20I-£coRl se removió, dando como resultado pPJV7401. (e) pPJV7402 (CMV (RÍA) , HBsAg 5' UTR y RBGpA) Se construyó una versión sin UTR 3' de PJV7400 como sigue. pPJV7391 se cortó con Bspl20I y Bgl2 para aislar el fragmento de inserto conteniendo el extremo 3' del gen HSV2 gD. pPJV7284 se cortó con Bgl 2 y EcoRl para aislar la señal RBGpA. Estos fragmentos de inserto se ligaron en pPJV7400 a partir de lo cual el fragmento Bspl20I-£coRl se removió, dando como resultado pPJV7402. Ejemplo 3. Construcción de los paneles del vector del antigeno Flu M2 (a) pPJV7450 (CMV(no intrón) , HBsAg 5' UTR y RBGpA Se amplificó por PCR la región de codificación para Flu M2 del plásmido pFL-M2 (Joel Haynes, pPJV) utilizando los cebadores JF301 (SEC ID NO:23) y JF302 (SEC ID NO:24) y se cortó con Nhel y Bgl2 para generar un fragmento de inserto. pPJV7401 se cortó con Nhel y Bgl2 paira generar un fragmento de vector dentro del cual el fragmento del inserto se ligó, dando como resultado pPJV7450. (b) pPJV7452 (CMV (no intrón), HBsAg 3' UTR y RBGpA) Se amplificó por PCR un fragmento UTR 3' de pPJV7389 con los cebadores JF84 (SEC ID NO:25) y JF225 (SEC ID NO: 26) se cortó Bspl20I, se rellenó con polimerasa de ADN T4, y se enlazó con los enlazadores Bgl2 (cat# 1036, New England Biolabs) . El fragmento después se cortó con Bgl2 y EcoRl para aislar un fragmento de inserto conteniendo la UTR 3' de la región HBsAg y RBGpA. pPJV7450 se cortó con Bgl2 y BcoRl para generar un fragmento de vector dentro del cual el fragmento del inserto se ligó, resultando en pPJV7452. (c) pPJV7458 (CMV (RÍA) HBsAg 5' UTR y RBGpA) Se construyó una versión de pPJV7450 conteniendo el RÍA como sigue: pPJV7389 se cortó con BamHl para aislar el fragmento de inserto conteniendo RÍA. pPJV7450 se cortó con BamHl para generar un fragmento de vector dentro del cual el fragmento de inserto se ligó, resultando en pPJV7458. (d) pPJV7468 (CMV (RÍA), HBsAg 3' UTR, HBsAg 5' UTR y RBGpA) Se construyó una versión de pPJV7458 conteniendo la UTR 3' de HBsAg como sigue: pPJV7452 se cortó con Bgl2 y BcoRl para producir un fragmento de inserto conteniendo la UTR 3' HBsAg y RBGpA. pPJV7458 se cortó con Bgl2 y BcoRl para generar un fragmento de vector dentro del cual el fragmento del inserto se ligó, resultando pPJV7468.
Ejemplo 4. Construcción de los paneles del vector Beta-gal (a) pPJV7488 (CMV (no intrón), HBsAg 3 ' UTR, HBsAg 5' UTR y RBGpA) Se amplificó por PCR CMV-beta (Clontech) con los cebadores JF335 (SEC ID NO:27) y JF336 (SEC ID NO:28) y se cortó con Nhel y Bgl2 para aislar un fragmento del inserto de codificación para beta-galactosidasa. pPJV7452 se cortó con Nhel y Bgl2 para generar un fragmento de vector dentro del cual el fragmento del insertó se ligó, dando como resultado pPJV7488. (b) pPJV7S33 (CMV (no intrón), HBsAg 5' UTR y RBGpA) pPJV7450 se cortó con Bgl2 y BcoRl para aislar un fragmento del inserto conteniendo RBGpA. pPJV7488 se cortó con Bgl2 y BcoRl para generar un fragmento de vector dentro del cual el fragmento de inserto se ligó, resultando pPJV7533. (c) pPJV7551 (CMV(RIA/?heI) , HBsAg 3 ' UTR, HBsAg 5' UTR y RBGpA) pPJV7530 (ver Ejemplo 5) se cortó con Xhol y BamHl para aislar un fragmento del inserto conteniendo el promotor CMV a través de RÍA. pPJV7488 se cortó con Xhol y BamHl para generar el fragmento del vector dentro del cual el fragmento del inserto se ligó, resultando pPJV7551. (d) pPJV7SS2 (CMV ( RIA/Nhel . HBsAg 5 'UTR y RBGpA) pPJV7530 se cortó con Xhol y BamHl para aislar un fragmento del inserto conteniendo el promotor CMV a través de RÍA. pPJV7533 con Xhol y BamHl para generar el fragmento del vector dentro del cual el fragmento del inserto se ligó, resultando pPJV7552. Ejemplo 5. Construcción de la expresión de pPJV (pPJV7563) (a) PJV7496 pPJV7389 se amplificó a través de PCR con los cebadores JF357 (SEC ID NO: 29) y JF365 (SEC ID NO: 30), se trató con polimerasa de ADN T4 para despuntar los extremos, y se cortó con Salí para aislar un fragmento del inserto que codifica la resistencia a canamicina. pPJV7389 se cortó con Ava l , se trató con polimerasa de ADN T4 para despuntar los extremos, y se cortó con Salí para aislar el fragmento del vector dentro del cual el fragmento del inserto se ligó, dando como resultado PJV7496. (b) pPJV7530 PJV7389 se amplificó a través de PCR con los cebadores JF393 (SEC ID NO: 31) y JF406 (SEC ID NO: 32) y se cortó con Bgl2 y BamHl para aislar un fragmento de inserto conteniendo el RÍA desprovisto de un sitio Nhel interno. pPJV7496 se cortó con BamHl para preparar un fragmento de vector dentro del cual el fragmento del inserto se ligó, dando como resultado pPJV7530. (c) pPJV7549 pPJV7468 se cortó con BamHl y £coR5 para aislar un fragmento de inserto conteniendo M2 y parte de HBV 3'ENH. pPJV7530 se cortó con BamHl y BcoR5 para preparar el fragmento de vector en el cual el fragmento del inserto se ligó, resultando pPJV7549. (d) pPJV7563 Los cebadores JF256 (SEC ID NO:33) y JF257 (SEC ID NO: 34) se templaron para preparar un fragmento de inserto que consiste de un sitio de clonación múltiple. pP JV7549 se cortó con Nhel y Bgl2 para preparar el fragmento del vector dentro del cual el fragmento del inserto se ligó, resultando pPJV7563. Un mapa de plásmido pPJV7563 se provee en la Figura 12. La composición base para el plásmido pPJV7563 es provista en la Figura 13. Los componentes y su posición en el plásmido pPJV7563 son como sigue: 1-44 Las secuencias del Transposon 903 45-860 Secuencia de codificación de resistencia a canamicina del Transposon 903 861-896 Secuencias del Transposon 903 897-902 Sitio Salí 903-1587 Promotor CMV 1588-1718 Secuencia líder no traducida del gen temprano inmediato de CMV 1719-1724 La fusión de las enzimas de restricción BamHl y de Bglll 1725-1857 El intrón A de insulina de rata 1858-1863 Sitio BamHl 1864-1984 Líder no traducido 5' del antígeno de superficie HBV 1985-1993 Codón de inicio sintético/sitio de clonación Nhel 1994-2011 Sitios de clonación sintéticos 2012-2544 potenciador HBV 2545-2555 Secuencia del vector Oíd. Ningún acierto contra la base de datos NCBl 2556-2686 Región de poliadenilación de beta globina de conejo 2687-3759 Secuencia del vector pUC19 Ejemplo 6. Construcción de los Paneles de Expresión del Péptido de la Señal Utilizando Fosfatasa alcalina secretada de humano (SEAP) y el fragmento IgG Fc humano (hFc) como antigenos de modelo (i) pPJV7507 (hTPAsp y SEAP) Se amplificó a través de PCR pSEAP básico (Clontech) con los cebadores JF320 (SEC ID NO: 35) y JF321 (SEC ID NO: 36) después se cortó con Nhel y Bgl2 para aislar un fragmento de inserto que consiste del fragmento SEAP humano. pPJV7079 (Macklin, y otros) se cortó con Nhel y Bgl2 para preparar un fragmento de vector dentro del cual el fragmento de inserto se ligó, resultando en pPJV7507. (ii) pP JV7508 (hTPAsp y hFc) El ADN humano se amplificó a través de PCR con los cebadores JF386 (SEC ID NO: 37) y FcAS (SEC ID NO: 38) después se cortó con Nhel y Bgl2 para aislar un fragmento del inserto que consiste del fragmento IgG Fc humano. pP JV7079 se cortó con Nhel y Bgl2 para preparar un fragmento de vector dentro del cual el fragmento del inserto se ligó, dando como resultado pPJV7508. (iii) Preparación de la Secuencia de Codificación de Péptido de Señal de Aprotinina El oligo sintético JF354 (SEC ID NO:39) se amplificó por PCR con los cebadores JF355 (SEC ID NO: 40) y JF356 (SEC ID NO: 41) para generar la secuencia de codificación para el péptido de señal de aprotinina. (iv) Preparación de la Secuencia de Codificación de Péptido de Señal de Extensina de Tabaco El oligo sintético JF348 (SEC ID NO:42) se amplificó por PCR con los cebadores JF349 (SEC ID NO: 43) y JF350 (SEC ID NO: 44) para generar la secuencia de codificación para el péptido de señal de extensina de tabaco. (v) Preparación de la Secuencia de Codificación de Péptido de Señal de Lisozima de Pollo El oligo sintético JF351 (SEC ID NO: 45) se amplificó por PCR con los cebadores JF352 (SEC ID NO: 46) y JF353 (SEC ID NO: 47) para generar la secuencia de codificación para el péptido de señal de lisozima de pollo. (a) Paneles de péptido de señal del antígeno Flu M2 pPJV7499 (CMV (no intrón), HbsAg 5'UTR, RBGpA. aprotinina s . p . ) PJV7497 (CMV (no intrón), HbsAg 5' UTR, RBGpA, extensina de tabaco s.p.) PPJV7500 (CMV (no intrón), HbsAg 5 ' UTR RBGpA lisozima de pollo s.p.) Las secuencias de codificación para los péptidos de señal se cortaron con Spel y Nhel para aislar los fragmentos de inserto. pPJV7450 se cortó con Nhel para preparar un fragmento de vector en el cual los fragmentos de inserto se ligaron, dando como resultado pPJV7499 (aprotinina), pPJV7497 (extensina de tabaco), y pPJV7500 (lisozima de pollo) . (b) Paneles de Péptido de señal SEAP pPJV7513 (CMV (no intrón), HbsAg 5' UTR, RBGpA, aprotinina s.p.) pP JV7512 (CMV (no intrón), HbsAg 5' UTR, RBGpA, extensina de tabaco sp.) pPJV7510 (CMV (no intrón), HbsAg 5' UTR, RBGpA, lisosima de pollo s.p.) pPJV7499, 7497, y 7500 se cortaron con Xhol y Nhel para aislar un fragmento de inserto que consistiendo del promotor CMV a través de la secuencia de codificación del péptido de señal de los plásmidos. pPJV7507 se cortó con Xhol y Nhel para preparar un fragmento del vector dentro del cual los fragmentos de inserto se ligaron, dando como resultado pPJV7513 (aprotinina) , pPJV7512 (extensina de tabaco) , y pPJV7510 (lisozima de pollo) . (c) Paneles del péptido de señal hFc pPJV7524 (CMV (no intrón), HbsAg 5' UTR, RBGpA, aprotinina s.p.) pP JV7525 (CMV (no intrón), HbsAg 5' UTR, RBGpA, extensina de tabaco sp.) pPJV7526 (CMV (no intrón), HbsAg 5' UTR, RBGpA, lisosima de pollo s.p.) pPJV7499, 7497, y 7500 se cortaron con Xhol y Nhel para aislar un fragmento de inserto que consistiendo del promotor CMV a través de la secuencia de codificación del péptido de señal de los plásmidos. pPJV7508 se cortó con Xhol y ?Zhel para preparar un fragmento del vector dentro del cual los fragmentos de inserto se ligaron, dando como resultado pPJV7524 (aprotinina) , pPJV7525 (extensina de tabaco) , y pPJV7526 (lisozima de pollo) . Ejemplo 7. Construcción de los paneles de fosfatasa alcalina secretada humana (SEAP) (a) pPJV7531 (CMV no intrón), HbsAg 5'UTR, RBGpA, lisosima de pollo s.p.) pPJV7510 se cortó con Salí y Bgl2 para aislar un fragmento del inserto conteniendo el promotor CMV a través del péptido de señal del lisozima. pPJV7450 se cortó con Salí y Bgl2 para generar un fragmento de vector dentro del cual el fragmento del inserto se ligó, dando como resultado pPJV7531. (b) pPJV7554 (CMV ( RIA/Nhel ) , HbsAg 5'UTR, RBGpA, lisosima de pollo s.p.) pPJV7530 se cortó con Xhol y BamHl para aislar un fragmento del inserto conteniendo el promotor CMV a través de RÍA. pPJV7531 se cortó con Xhol y BamHl para generar un fragmento de vector dentro del cual el fragmento del inserto se ligó, dando como resultado pPJV7554. (c) pPJV7568 (CMV no intrón), HBsAg 3' UTR, HbsAg 5' UTR, RBGpA, lisosima de pollo s.p.) pPJV7563 se cortó con Bgl2 y BcoRl para aislar un fragmento de inserto conteniendo la UTR 3' HBV y RBGpA. pPJV7531 se cortó con Bgl2 y EcoRl para generar un fragmento del vector dentro del cual el fragmento del inserto se ligó, dando como resultado pPJV7568. (d) pPJV7572 ( CMV ( RIA/NheI ) , HBsAg 3'UTR, HbsAg 5' UTR, RBGpA, lisosima de pollo s.p.) PJV7563 se cortó con Bgl2 y BcoRl para aislar un fragmento del inserto conteniendo UTR 3' de HBV y RBGpA. pPJV7554 se cortó con Bgl2 y EcoRl para generar el fragmento del vector dentro del cual el fragmento del inserto se ligó, dando como resultado pPJV7572.
Ejemplo 8. Construcción de los Vectores Beta-gal y HBsAg Utilizando los intrones de queratina de pollo y actinia cardiaca de pollo (a) pPJV7557 (Beta-gal, CMV (cA intrón), HbsAq 3' UTR, HbsAg 5' UTR y RBGpA) El ADN de pollo se amplificó a través de PCR con los cebadores JF430 (SEC ID NO:48) y JF442 (SEC ID NO:48) y se cortó con Bgl2 y BamHl para aislar un fragmento de inserto consistiendo de las secuencias de intrón y de exón de flanqueo a partir de actinia cardiaca de pollo. pPJV7488 se cortó con BamHl para preparar un fragmento del vector dentro del cual el fragmento de inserto se ligó, dando por resultado pPJV7557. (b) pPJV7S58 (Beta-gal, CMV(cK intrón), HbsAg 3' UTR, HbsAg 5' UTR y RBGpA) El ADN de pollo se amplificó a través de PCR con los cebadores JF421 (SEC ID NO: 50) y JF444 (SEC ID NO: 51) y se cortó con Bgl2 y BamHl para aislar un fragmento del inserto consistiendo de las secuencias de intrón y de exón de flanqueo del gen de queratina de pollo. pPJV7488 se cortó con BamHl para preparar un fragmento de vector dentro del cual el fragmento del inserto se ligó, dando por resultado pPJV7558. (c) pPJV7578 (HBsAg, CMV ( cA intrón), HbsAg 3' UTR, HbsAg 5' UTR y RBGpA) pPJV7557 se cortó con Salí y BamHl para aislar un fragmento del inserto consistiendo del promotor CMV a través de las regiones del intrón. pPJV7496 se cortó con Salí y BamHl para preparar un fragmento de vector dentro del cual el fragmento de inserto se ligó, dando como resultado pPJV7558. (d) pPJV7579 (HBsAg, CMV (cK intrón), HbsAg 3' UTR, HbsAg 5' UTR y RBGpA) pPJV7558 se cortó con Salí y BamHl para aislar un fragmento del inserto consistiendo del promotor CMV a través de las regiones del intrón. pPJV7496 se cortó con Salí y BamHl para preparar el fragmento del vector dentro del cual el fragmento del inserto se ligó, dando como resultado PJV7579. Ejemplo 9. .Análisis In Vitro de la Expresión del Antigeno a Través de los Paneles de Vector HBsAg En el día uno, se colocaron en placas las células SCC15 (ATCC) o B16 (origen desconocido, versiones disponibles en ATCC) sobre placas de cultivo de tejido de 6 cavidades a 20-40% de confluencia, y se dejaron crecer durante la noche en una incubador. Las células hospederas se propagaron en medio recomendado por ATCC. En el día dos, se llevó a cabo la reacción de transfección. Para cada vector a ser probado, se agregaron 20µl del reactivo Lipofectin® (Life Technologies Ine, Grand Island, NY) a 180µl de medio Optimem® (Life Technologies, Grand Island, NY) , y se dejaron incubar a temperatura ambiente durante 45 minutos. Para que cada vector a ser probado, se mezclaron 2µg del vector en 200µl de Optimem® a los 40 minutos. A los 45 minutos, las soluciones y el vector Lipofectin® se mezclaron juntas y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos más. Durante esta incubación final, las células hospederas en las placas se removieron de incubador y se lavaron dos veces con medio Optimem®. A los 10 minutos, se agregaron 1.6ml de Optimem® a la mezcla de Lipofectin®/vector, y se agrego lml de la mezcla resultante a cada uno de las dos cavidades de célula. Las células hospederas se regresaron al incubador y se dejaron reposar sin cambios durante 5 horas, punto en el cual la mezcla de Lipofectin®/vector se removió y se reemplazó por medios de mantenimiento de célula estándar. De las 18 a las 24 horas después del cambio de medio, se removieron de 50 al 100 µl del medio de mantenimiento de célula de las placas de cultivo de tejido y analizaron para la expresión de antígeno a través de la colocación de las muestras en los recipientes de reacción provistos en el Kit de Diagnóstico Monoclonal AUSZYME® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) . El volumen de las muestras de prueba se trajo a un volumen de 200µl con PBS, después 50µl de conjugado y se agregó una perla de reacción a cada muestra. El recipiente se incubó durante 80 minutos a 40°C, después de lo cual las cavidades se lavaron para limpiarlas de todos los componentes de reacción líquida. Las perlas se transfirieron a nuevos tubos después de lo cual se agregaron 300µl de regulador de pH de desarrollo de color. A los 30 minutos, la reacción de desarrollo de color se detuvo a través de la adición de ÍM de ácido sulfúrico, y se midió la absorbancia de la reacción a 490nm. Los datos mostrados en la Figura 1 son las lecturas de absorbancia promedio de las cavidades por duplicado de dos experimentos. Como se muestra en la Figura 1, la adición de RÍA, en UTR 3' HBV o ambos elementos a un vector base (promotor CMV, región de exón y poliadenilación) se incrementó la expresión de HBsAg en las células SCC15. Como se muestra en la Figura 2, la adición de cualquiera de la queratina de pollo, o el intrón de la actinia cardiaca de pollo al vector base (promotor CMV, exón, UTR 3' HBV y la región de poliadenilación) incrementó la expresión de HBsAg en las células SCC15. Ejemplo 10. Análisis In Vitro de la Expresión del Antigeno a Través de los Paneless de Vector Beta-gal Las células hospederas SSC-15 o B16 se transfectaron como se describió en el Ejemplo 9. De las dieciocho a las cuarenta horas después del cambio de medios, los sobrenadantes del medio se removieron y las células se lavaron con PBS. Después de la remoción del lavado, las células se usaron a través de incubación de las células en 500µl de regulador de pH de lisis (50mM NaP04, 0.1%Triton X- 100, pH 7) durante 5 minutos, seguido por el raspado físico de las células del disco de plástico. Los lisados se microfugaron durante dos minutos para remover el resto de las células y se agregaron de 10 a 25µl de lisato aclarado a 500µl de regulador de pH de reacción (800ug/ml o-nitrofenilo galactopiranosida, 50mM NaP04, pH 7) y se incubaron a 37°C de 10 5 a 20 minutos. La reacción se detuvo a través de la adición de 500µl de IM Na2C03 y la lectura a 405 nm. Los datos se presentan como la proporción de la expresión del vector mejorado (conteniendo un intrón, HBVenh, o ambos) para un vector base. La adición de RÍA, en UTR 3' HBV, o ambos elementos al vector base (promotor CMV, región de exón y poliadenilación) incrementó la expresión de beta-gal en ambas líneas celulares. Los resultados para las células SCC15 se muestran en la Figura 3. Además de la adición de cualquiera de la queratina de pollo o el intrón de la actinia cardiaca de pollo al vector base (promotor CMV, exón, la UTR 3' HBV y la región de poliadenilación) incrementó la expresión de beta-gal en ambas líneas celulares. Los resultados para las células B16 se muestran en la Figura 2. Ejemplo 11. Análisis In Vitro de la Expresión del Antigeno a través del Panel del. Vector HSV gD Las células hospederas SCC15 o B16 se transfectaron como se describe en el Ejemplo 9. Dieciocho horas después de la transfección, placas las placas se colocaron sobre hielo durante 15 minutos. Cada cavidad después se lavó con 2 ml de PBS (Biowhittaker, Walkerville, MD) . Las células se fijaron con 0.05% de gluteraldehído (Polysciences Ine, Warrington, PA) diluido en PBS y se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente. Todas las incubaciones subsiguientes duraron 1 hora a temperatura ambiente y los lavados entre cada incubación fueron como se manifestó anteriormente. Las placas se bloquearon con 2 ml de leche seca al 5% (Bio Rad Laboratories, Melville, NY) en PBS. Las incubaciones con 1 ml de una dilución de 1:1000 de monoclonal anti-gD (ABI, Colombia, MD) en la leche seca al 2%/PBS/0.05% de Tween-20®; (Sigma, St. Louis, MES) y 1 ml de una dilución de 1:2500 de HRP de anti-ratón de cabra (KPL, Gaithersburg, MD) en PBS/ 0.1% de Tween-20® siguieron. El color se desarrolló utilizando 1 ml de sustrato de microcavidad TMB (BioFX, Owings Mills, MD) . Las reacciones se detuvieron con IM de H2S0 , el líquido se transferí a través de plástico y la lectura de la densidad óptica a 450nm. Los datos se presentan como la proporción de la expresión del vector mejorado (conteniendo un intrón, HBVenh, o ambos) para un vector base. La adición de RÍA con o sin la UTR 3' HBV al vector base (promotor CMV, región del exón y poliadenilación) incrementó la expresión de HSV gD en ambas líneas celulares. Los resultados para las células SC15 se muestran en la Figura 4. Ejemplo 12. Análisis In Vitro de la Expresión del Antigeno a través de los Paneles de Vector SEAP Las células hospederas SCC15 o B16 se transfectaron como se describe en el Ejemplo 9. De las dieciocho a cuarenta horas después del cambio de medios, los sobrenadantes de los medios se removieron y se calentaron a 70°C durante 30 minutos. Se incubaron de 10 a 25µl de sobrenadantes inactivados con calor durante 5 minutos con un volumen 1/10° de lOOmM de homoarginina. Se agregaron 500µl de regulador de pH de reacción de fosfatasa alcalina (# de catálogo 172-1063, Bio-Rad, preparado de acuerdo con las instrucciones) a los lisatos y se incubaron a 37°C de 10 a 20 minutos. La reacción se detuvo a través de la adición de 500µl IM NaOH y se leyeron a 405 nm. Los datos se presentan como la proporción de la expresión del vector mejorado (conteniendo un intrón, HBVenh, o ambos) para un vector base, o la proporción de la expresión de los péptidos de señal experimentales para el vector de péptido de señal TPA humano. Como se muestra en la Figura 5, la adición del RÍA, la UTR 3' HBV o ambos elementos para el vector base (promotor CMV, región de exón y poliadenilación) incrementó la expresión de SEAP células B16. Inesperadamente, solamente la adición de la UTR 3' HBV al vector base (promotor CMV, región de exón y poliadenilación) incrementó la expresión de SEAP en células SCC15. La adición de los péptidos de señal de cualquiera de aprotinina de bovino, lisozima de pollo, o de extensina de tabaco al término N de SEAP maduro permitió la secreción eficiente de SEAP en los sobrenadantes de los medios celulares de ambas líneas celulares. Los resultados para las células B16 se muestran en la Figura 6. Ejemplo 13. Análisis In Vitro de la Expresión del Antigeno a Través del Panel de Péptido de Señal del Fragmento IgG Fc Humano Las células hospederas SCC16 o de B16 se transfectaron como se describió en el Ejemplo 9. Los sobrenadantes del medio se removieron de las dieciocho a cuarenta horas después del cambio de medio. Se incubaron placas ELISA (Costar) durante la noche en 4°C con 100 µl de IgG anti-humano de cabra (Sigma #13382, dilución 1/1000 en regulador de pH con capa de carbonato) por cavidad. Todas las incubaciones subsiguientes duraron 1 hora a temperatura ambiente con lavados (lOmM Tris, 150mM NaCl, 0.1% Brij-35, pH 8.0) entre cada incubación. Las cavidades después se bloquearon con 100 µl de 5% seco en PBS, seguido por la incubación con sobrenadantes de medios serialmente diluidos en regulador de pH de dilución (2% de leche seca, PBS, 0.05% de Tween-20®) . Esto fue seguido por la incubación con lOOµl de IgG anti-humano de cabra HRP (Sigma #A6029, dilución 1/5000 en regulador de pH de dilución) por cavidad, seguido por el desarrollo de color utilizando 100 µl de sustrato de microcavidad TMB. Las reacciones se detuvieron con lOOµl de ÍM de H2S04, y se leyeron a 450 nm. Los datos se presentaron como la proporción de la expresión de los péptidos de señal experimentales al vector de péptido de señal TPA humano. La adición de los péptidos de señal de cualquiera de aprotinina de lo bovino, lisozima de pollo, o extensina de tabaco al término N del fragmento Fc humano permitió la secreción eficiente de hFc en los sobrenadantes de medios celulares de ambas líneas celulares. Los resultados para las células B16 se muestran en la Figura 6. Ejemplo 14. Uso de los vectores de expresión del plásmido HBsAg, HSVgD y Flu-M2 para la inmunización de ratones (a) Preparación de cartuchos de inmunización Para cada plásmido a ser probado, se pesaron 25mg de 2 mieras de polvo de oro en un tubo de microfuga. Después de la adición de una alícuota de 250µl de 50 mM de espermidina (Aldrich Chemical, Ine, Milwaukee, Wl), el tubo se sometió a vórtice y se sónico brevemente. El oro se microfugó y el espermidina se reemplazó por una alícuota de 100 µl fresca. El oro se volvió a suspender mediante vórtice, después de lo cual se agregaron 25µg de ADN al tubo y se mezclaron. Mientras el tubo se sometió a vórtice ligeramente, se agregaron lOOµl de 10% de CaCl2 (Fujisawa USA, Ine, Deerfield, IL) al precipitado del ADN sobre los perlas de oro. La reacción de precipitación se dejó proseguir por 10 minutos en la mesa, después de lo cual se recolectó el oro a través de un termo de microfuga y se lavó tres veces con etanol absoluto (Spectrum Quality Products, Ine, Gardena, CA) para remover el exceso de reactivos de precipitación. El lavado del complejo de oro/ADN después se volvió a suspender en 3.6 ml de 0.05 mg/ml de polivinilpirrolidona (360KD, Spectrum Quality Products, Ine, Gardena, CA) en etanol absoluto. Esta lechada después se inyectó en un tubo Tefzelá (McMaster-Carr, Chicago, IL) localizado en el torneo del tubo (PowderJect Vaccines) que cubrió la parte interna del tubo Tefzelá con el complejo de oro/ADN. Después de que se completó el procedimiento de torneado de tubo, el tubo se cortó en "piezas" de 0.5 de la vacuna que se cargaron en el dispositivo de XR1 (PowderJect Vaccines) para la distribución a los ratones. (b) Procedimiento de vacunación Se anestesiaron ratones de cuatro a seis semanas de edad con una mezcla de Ketasetá (Fort Dodge) y Rompuná (Bayer) . Los abdómenes se rasuraron con un par de esquiladoras eléctricas para remover el pelo, y se distribuyeron dos "piezas de vacuna" no en traslape a través del dispositivo XR1 (450psi) en área rasurada. Los animales se devolvieron a sus jaulas y se hicieron sangrar seis semanas después de la vacunación. Se utilizaron ratones de Balb/c para evaluar los vectores de expresión HBsAg, y los ratones Swiss Webster se utilizaron para evaluar los vectores de expresión HSV-gD y Flu M2. Análisis de suero para anticuerpos Anti-HBsAg Se cosecharon muestras sanguíneas a las seis semanas, de animales vacunados. Un volumen del suero aislado de estas muestras se colocó en cavidades de un recipiente de reacción suministrado con el Equipo de Diagnóstico AUSAB® EIA (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) . El volumen de suero agregado depende la concentración del anticuerpo de la muestra, y la muestra se diluyó con regulador de pH de dilución de muestra para caer dentro de los valores obtenibles con un panel de cuantificación. Se agregaron 200µl de cada recipiente al panel de cuantificación AUSAB® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) las cavidades del recipiente de reacción. A cada cavidad se agregó una perla, después de lo cual el recipiente se sello y se incubó por dos horas a 40°C. Las cavidades después se lavaron de todos los componentes de reacción líquida. A cada cavidad lavada se adicionaron 200µl de la mezcla conjugada, después de lo cual el recipiente se sellado y se incubó por dos horas a 40°C. Las cavidades después se lavaron de todos los componentes de reacción líquida. Los perlas se transfirieron a nuevos tubos después de lo cual se agregó 300µl de regulador de pH de desarrollo de color. A los 30 minutos, la reacción de desarrollo de color se detuvo a través de la adición de ÍM de ácido sulfúrico, y la absorbancia de las reacciones se midió a 490nm en un espectrofotómetro Quantum II® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) . Este espectrofotómetro calcula los niveles del anticuerpo de una muestra comparando la absorbancia de la muestra con una curva estándar generada con el panel de cuantificación. Estos niveles del anticuerpo después se corrigieron para factores de dilución. Los datos mostrados en la Figura 7 son las concentraciones promedio geométricas de todos los animales vacunados con el vector particular . Análisis de Sueros para Anticuerpos del Antígeno Anti-Flu M2 Se cubrieron placas ELISA de enlace al medio Costar de 96 cavidades (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) con un péptido Flu M2sintético (QCB/Biosource, Hopkinton, MA) a una concentración de 1 ug/ml en PBS (Biowhittaker, Walkerville, MD) y se incubaron durante la noche a 4°C. Las placas se lavaron tres veces con 10 mM de Tris (Sigma, St. Louis, MO)/150mM de NaCl (Fisher Scientific) /O .1% Brij-35 (Sigma), después se bloquearon con 5% de leche seca (Bio Rad Laboratories, Melville, NY) en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Todas las subsiguientes incubaciones fueron a temperatura ambiente por una hora y los lavados entre cada incubación fueron como se manifestó anteriormente. El suero de ratón de muestra, un control estándar (concentración alta de suero de ratón anti-M2) y negativo (suero de ratón anti-HBsAg) se diluyeron en 2% de leche seca/PBS/0.05% de Tween-20® (Sigma) y se incubaron en placas ELISA. El anticuerpo del conjugado de biotina IgG (H+L) anti-ratón de cabra (Southern Biotechnology Asocíate, Birmingham, AL) se diluyó 1:8000 en 2% de leche seca/PBS/0.05% de Tween-20® y el conjugado de peroxidasa rábano picante de estreptavidina (Southern Biotechnology) se diluyó a 1:8000 en PBS/0.1% Tween-20 después. El color se desarrolló utilizando un substrato de TMB (BioFX, Owings Mills, MD) . Las reacciones se detuvieron con ÍM de H2S04 y las placas se leyeron a 450nm con un lector de microplacas de precisión Emax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . Se utilizó el software SoftMax Pro 4.1 (Molecular Devices) para calcular las concentraciones de punto final utilizando un análisis de cuatro parámetros. Las concentraciones se normalizaron al suero estándar, que había sido un concentración predeterminada, para minimizar la variación del ensayo a ensayo y de placa a placa. Los resultados se muestran en la Figura 7.
Análisis de Sueros Para Anticuerpos del Antigeno Anti-HSV gD Se cubrieron placas ELISA de enlace al medio Costar de 96 cavidades (Ficher Scientific, Pittsburgh, PA) con proteína HSV gD (Viral Therapeutics, Ithaca, NY)a una concentración en de lug/ml en PBS (Biowhittaker, Walkerville, MD) y se incubaron durante la noche en 4°C. Las placas se lavaron tres veces con lOmM Tris (Sigma, St. Louis, MO) /150mM NaCl (Fisher Scientific) /O .1% Brij-35 (Sigma), después se bloquearon con 5% de leche seca (Bio Rad Laboratories, Melville, NY) en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Todas incubaciones subsiguientes fueron a temperatura ambiente por una hora y los lavados entre cada incubación fueron como se manifestó anteriormente. El suero de ratón de muestra, un control estándar (concentración alta, de suero de ratón anti-gD) y negativo (sueros de ratón anti HBsAg) se diluyó en 2% de leche seca/PBS/0.05% Tween-20 (Sigma) y se incubó en placas ELISA. El anticuerpo del conjugado de biotina IgG (H+L) anti-ratón de cabra (Southern Biotechnology Associate, Birmingham, AL) se diluyó 1:8000 en 2% de leche seca/PBS/0.05% Tween-20 y el conjugado de peroxidasa de rábano picante de estreptavidina (Southern Biotechnology) se diluyó 1:8000 en PBS/0.1% Tween-20 siguiente. El color se desarrolló utilizando un substrato TMB (BioFX, Owings Mills, MD) . Las reacciones se detuvieron con ÍM de H2S04 y las placas se leyeron a 450nm con un lector de microplacas de precisión de Emax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . Se utilizó el software SoftMax Pro 4.1 (Molecular Devices) para calcular las concentraciones del punto final utilizando un análisis de cuatro parámetros. Las concentraciones se normalizaron a un suero estándar, el cual había sido una concentración predeterminada, para minimizar la variación de ensayo a ensayo y de placa a placa. Los resultados se muestran en la Figura 7. Ejemplo 15. Construcción del Plásmido PPJV1671, el Vector de Vacuna de ADN de influenza Se construyó el plásmido pPJV1671 el cual codifica y puede expresar el antígeno de Hemaglutinina (HA) de influenza A/Panama/2007/99 (H3N2) . La construcción de pP JV1671 mejor se describe en las tres etapas principales: (i) Clonar el gen de expresión; (ii) Modificar la estructura del vector; y (iii) Modificar el plásmido final. Clonación del gen de expresión La secuencia de codificación para HA de influenza se obtuvo a través de la técnica de clonación de reacción de cadena transcriptasa-polimerasa inversa estándar (RT-PCR) utilizando una muestra del virus A/Panama/2007/99 obtenida de los centros del control de enfermedades y prevención (Atlanta, GA) como una fuente del ácido ribonucleico plantilla (ARN) . Se utilizaron los siguientes pasos en la clonación del gen de expresión, HA: • Producción RT-PCR del fragmento ADNds del segmento ARN 4 de A/Panama/2007 /99 (H3N2); • Propagación del clon de ADN del segmento 4 de ARN en un vector basado en pUC19 en E . col i ; • Análisis de secuencia de la secuencia de codificación HA H3 Panamá dentro del clon del segmento 4 de ARN ; y • Una segunda reacción PCR para generar un fragmento de ADN que contiene la secuencia de codificación HA H3 Panamá (sin su codón ATG) con extremos compatibles con el vector "vacío" de la vacuna de ADN pPJV7563 (Nhe I y Bsp 1201) . Modificación de la Estructura del vector, pPJV7563 La estructura del plásmido para pPJV1671 es pPJV7563. El mayor parte de las secuencias de la estructura del plásmido en pPJV7563 también se encuentran en pWRG7128, un vector de vacuna de ADN que había sido evaluado en varios ensayos clínicos humanos. Esta sección provee una sinopsis de la construcción de pPJV7563. Se provee una gráfica de flujo detallada en la Figura 14 de la construcción de pPJV7563 y de pPJV1671, y una comparación tabular más adelante (Tabla 2) de los elementos claves en los plásmidos pWRG7128 y pPJV1671 se provee. El mapa de pPJV1671 se muestra en la Figura 16. Tabla 2 Comparación de los Elementos Clave en las Estructuras del vector : Plásmidos WRG7128 (HBsAg) y pPJV1671 (HA de influenza) Modificación del Plásmido final, pPJV1671 Se involucraron dos pasos principales en la modificación del plásmido final, pPJV1671, a partir la estructura, pPJV7563 (como se ilustra en la Figura 14) estos son : • Eliminación del sitio de Nhel-Bgl II de pP JV7563; y • La inserción de la secuencia de codificación H3 Panamá HA en pPJV7563 produciendo el pPJV1671 final del vector de la vacuna de ADN de H3 Panamá HA. Una análisis de secuencia completa de pPJV1671 confirmó la estructura del vector y todas las secuencias de codificación HA que se enumeran a continuación en la Tabla 3. Comparación de pWRG7128 y pPJV1671 Las diferencias principales en las estructuras del vector entre los pWRG7128 que codifican HBsAg clínicamente probados y el vector pP JV1671 de la vacuna de influenza que codifica H3 Panamá HA se muestran anteriormente en la Tabla 2. Estos incluyen el uso del intrón A de insulina de rata en lugar del elemento del intrón A de Citomegalovirus humano (hCMV) y el uso de la secuencia del poliadenilación de beta-globina de conejo en lugar de la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento de bovinos. Los estudios en animales extensivos con pPJV1671 descritos han demostrado un buen funcionamiento de la vacuna de ADN de influenza tanto en animales grandes como pequeños. El plásmido pPJV1671 también funciona bien en seres humanos después de PMED de esta vacuna de ADN como se explica a continuación en el Ejemplo 16. Característica y Mapa Funcional de pPJV1671 El mapa funcional de pPJV1671 se muestra en la Figura 16. Las características de este mapa se enumeran en la Tabla 3. El plásmido pPJV1671 utiliza el promotor temprano inmediato hCMV y las secuencias de no codificación 5' de los exones 1 y 2. Este promotor está enlazado al intrón A de insulina de rata y la UTR 5' del gen HBV pre-S2. La traducción de la secuencia de codificación Ha H3 Panamá inicia el codón ATG que está al vector en el contexto de una secuencia de iniciación de traducción Kozak de consenso. La secuencia de codificación HA es seguida por un potenciador de trascripción de HBV (HBVenh) . Finalmente, la terminación de la trascripción se facilita a través un sitio de poliadenilación de beta-globina de conejo. Debido a que el codón de iniciación de traducción ATG natural del gen HA A/Panama/2007/99 (H3N2) no se adapta a la secuencia del consenso Kozak para la iniciación de la traducción, se eligió utilizar el elemento ATG suministrado por el vector de vacuna ADN pPJV7563 para la iniciación de la traducción. La expresión del antígeno de los vectores de vacuna ADN se mejora utilizando los codones ATG que se adaptan al consenso Kozak. El uso del codón ATG suministrado por el vector (a través de la inserción en el sitio de Nhe I) da como resultado una inserción de 2-aminoácido menor en el término amino de la secuencia de codificación del gen HA como se describe en la Figura 16. Origen de las Secuencias de Nucleótidos en pPJV1671 El historial de la construcción detallada y los reportes de la secuenciación para pPJV1671 permiten la asignación de origen a todas las posiciones del nucleótido dentro de este plásmido. Las alineaciones BLAST entre las secuencias componentes de vector y la base de datos GenBank se llevaron a cabo para verificar las asignaciones del componente correcto que ciertamente se había hecho.
Tabla 3 Identificación de los Componentes que Comprenden el Plásmido pPJV1671 Secuencia de pPJV167 (Banco de Células Principal) La secuenciación se llevó a cabo a través del departamento de investigación de PowderJect utilizando ADN Qiagen Megaprep preparado del plásmido pPJV1671 recién construido. Los datos de la secuencia actual estuvieron 100% de acuerdo con la secuencia teórica pronosticada por pPJV1671. La secuenciación durante el procedimiento de fabricación también mostró que la secuencia de plásmido también estuvo 100% de acuerdo con las secuencias teóricas y de investigación. Los varios elementos del plásmido y las posiciones en la secuencia se proveen en la Tabla 3 anterior. Ejemplo 16. Evaluación de No Clinica de pPJV1671: Inmunogenicidad de la Vacuna pPJV1671 de ADN y de Influenza Monovalente en un Modelo de Animal Grande Se utilizó un modelo de puerco doméstico para investigar la inmunogenicidad de pPJV1671 en la generación de el cual se describe anteriormente en el Ejemplo 15. Se utilizaron puercos blancos domésticos de ocho semanas de edad (machos y hembras) en este estudio. Se midieron las concentraciones del anticuerpo de inhibición de Hemaglutinación (Hl) para los animales del estudio candidatos y fueron <1:10 para todos los animales que entraron en este estudio. Se vacunaron dos grupos de 8 animales cada uno por medio de PMED de la vacuna de ADN pPJV1671. Ambos grupos recibieron inmunizaciones primarias y de refortalecimiento separadas por 4 semanas. Cada inmunización consistió de dos administraciones paralelas en la piel. La dosis de la vacuna de ADN para cada administración fue de lµg de DNA condensado sobre la superficie partículas de oro de 0.5 mg . La vacuna del ADN se distribuyó con el XR-1 clínico y dispositivos de investigación operados a 500 psi de presión de helio. Los puercos, se vacunaron en el día 0, se refortalecieron en el día 28 se sangraron en el día 42, dos semanas después de la vacunación de refortalecimiento. El suero se probó para respuestas al anticuerpo Hl utilizando un ensayo Hl estándar. Los resultados de este estudio se muestran en la Figura 17 y demuestran que la vacuna de ADN pPJV167 indujo concentraciones de anticuerpo Hl significativas en 100% de los animales de prueba con concentraciones de anticuerpo Hl promedio bien en exceso del 1:40 de la concentración del anticuerpo Hl sustituto para la protección contra la influenza en seres humanos. Ejemplo 17. Evaluación del Ensayo Clinico de la Construcción de Vacuna de ADN de influenza en humanos Introducción Se llevó a cabo un estudio clínico con graduación de la dosis en la fase I para evaluar la seguridad y la inmunogenicidad de la vacuna de ADN de pPJV1671 que es una vacuna de ADN de influenza PMED monovalente conteniendo el gen HA (hemaglutinina) de A/Panama/2007/99 (H3N2) . La seguridad se evaluó monitoreando los eventos adversos locales y sistémicos de la vacunación hasta la terminación del estudio. La inmunogenicidad se evaluó midiendo niveles los niveles de anticuerpo de inhibición del suero de hemaglutinación (Hl) . Tres grupos de los 12 sujetos adultos recibieron una sola dosis en el día 0 de ya sea 1, 2 ó 4 µg de la vacuna de ADN, distribuida como 1, 2 ó 4 administraciones PMED. La vacuna de ADN de influenza PMED provocó respuestas al anticuerpo de inhibición de hemaglutinación de suero (Hl) en los 3 niveles de dosis, con las respuestas más altas y más consistentes en sujetos vacunados con el nivel de dosis más alto. Las respuestas al anticuerpo fueron mayores en el último punto en el tiempo probado, día 56. La reactogenicidad relacionada con el tratamiento se limitó a reacciones de media a moderada en el sitio de la vacuna, las cuales fueron principalmente auto-limitantes. Estos resultados proveen una indicación de la seguridad e inmunogenicidad de la vacuna del ADN para influenza generada. Materiales y métodos Vacuna y sistema de distribución Para el plásmido clínico, la secuencia de codificación HA se obtuvo a través de una técnica de clonación de reacción de cadena de polimerasa transcriptasa inversa (RT-PCR) utilizando una muestra de un virus A/Panama/2007/99 como la fuente de un ARN de plantilla (el virus fue una donación de J. Katz, Centros para el Control y Prevención de Enfermedades). La secuencia de codificación HA H3 Panamá se insertó en el vector pPJV7563 como se describe anteriormente en el Ejemplo 15 produciendo el vector de vacuna de ADN HA pPJV1671 H3 Panamá final. La análisis de secuencia completo del pPJV1671 confirmó la estructura del vector y todas las secuencias de codificación HA. El plásmido pPJV1671 se fabricó bajo buenas prácticas de fabricación en Strathman GmbH (Hannover, Germany) . El ADN de plásmido se recubrió con partículas de oro de 1-3 µm, y se formuló para PMED utilizando el dispositivo XR-1 PowderJect, utilizando métodos previamente descritos (Roy y otros, (2001) Vaccine 19:764-78). Cada dosis contuvo un valor nominal de 1 µg de ADN cubierto con 0.5 mg de oro. Los parámetros de calidad de la vacuna se analizaron incluyendo la cantidad de oro y ADN, la expresión in vi tro, la inmunopotencia en ratones, y la ausencia de biocarga y endotoxina. Pobla ción de pa cien tes y configura ción La fase clínica del estudio se condujo en MDS Pharma Services, Lincoln, NE, y se aprobó a través del comité de revisión institucional. Se enrolaron treinta y seis (36) voluntarios adultos (Tabla 4) .
Tabla 4 : Demográficos de la población de estudio Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Número por grupo 12 12 12 Edad promedio (años) 31 31 32 Intervalo de edad (años) 20-48 20-50 21-49 Hombres : Mujeres 7:5 4:8 5:7 Prevacunación 16 (5-40 17 (5-40) 12 (5-40; HAI GMT (intervalo) Los sujetos se consideraron elegibles si estuvieron saludables, en edades de 19-50, no embarazado o en lactancia, capaces de proveer un consentimiento informado por escrito, y con concentraciones de inhibición de hemaglutinación de prevacunación (Hl) para influenza A/Panama de =IO y <40. Las razones para la exclusión incluyeron la terapia de inmunosupresión de los últimos 6 meses, el historial de enfermedades en la piel, cicatrización, lunares, cortes o tatuajes en el sitio de la inmunización, alergia al oro, historial de crisoterapia, receptor de la vacuna de influenza en los últimos 12 meses, síntomas de tipo influenza o influenza diagnosticada en la temporada actual, o la presencia de cualquier condición médica en donde no se recomienda la vacunación de influenza.
Todos los sujetos completaron el estudio y se evaluaron para seguridad e inmunogenicidad, con la excepción de dos sujetos. Un sujeto perdió el seguimiento y el otro sujeto no seguía las normas. Sin embargo, ya que los 36 sujetos proveyeron una muestra de pre-vacunación, recibieron vacunación, y se evaluaron por lo menos una vez después de la vacunación para seguridad e inmunogenicidad, los datos estuvieron disponibles para evaluación de seguridad e inmunogenicidad en todos los sujetos. Todos los procedimientos del estudio fueron de acuerdo con el declaración de Helsinki de 1975, con las últimas enmiendas de Edimburgo, Escocia (2000) y la conferencia internacional de instrucciones de armonización en las buena prácticas clínicas (paso 4, mayo 1 del 1996) . Diseño del Estudio Clínico Los sujetos se asignaron a tres grupos de tratamiento, 12 por grupo, sobre bases secuenciales. Cada administración de vacuna de ADN PMED distribuyó 1 µg de ADN, el plásmido pPJV1671 (H3 Panamá) en 0.5mg de oro. El primer grupo recibió una sola administración de vacuna en el aspecto interno del brazo superior en el día 0. Los sujetos en el grupo 2 recibieron dos vacunas de inmunización en el día 0, para un total de 2 µg de ADN, se administró en los sitios adyacentes en la parte interna superior del brazo. Los sujetos en el grupo 3 recibieron 4 administraciones en el día 4, para un total de 4 µg de ADN. Las vacunas se administraron utilizando el dispositivo XR-1 PowderJect a una presión de helio de 500 psi, una presión que demostró ser bien tolerada en los estudios anteriores (Roy y otros (2001) Supra , Rottinghaus y otros (2003) Vaccine 21 (31) :4604-8 y Tacket y otros (1999) Vaccines 17 (22 ): 2826-9) . Eval ua ciones de la Seguridad e Inmunogeni cidad Clíni ca La seguridad se evaluó monitoreando las reacciones del sitio de vacunación y registrando la incidencia de eventos adversos locales y sistémicos durante el estudio. Todos los sujetos se evaluaron para seguridad de vacuna y tolerabilidad local en el momento de la inmunización, 1 hora y 2 horas después de la inmunización. Los sujetos además se evaluaron para la tolerabilidad local en los días 3, 7, 14, 21, 28, 56, y 180. Los eventos adversos sistémicos se monitorearon a través del examen físico, signos vitales, pruebas seguras de laboratorio, y la prueba del anticuerpo anti ADN de estructura de cadena doble. Estas pruebas se condujeron antes y después de la inmunización. La inmunogenicidad de cada vacuna se determinó recolectando muestras sanguíneas en el día 0 (pre-inmunización) , y en los días de 14, 21, y 56 después de la inmunización para la determinación de los concentraciones de HAI, contra A/Panama/2007/99, utilizando la modificación de un método previamente descrito (Kendal, y otros (1982). Los conceptos y procedimientos para la vigilancia de la influenza basada en laboratorio. El Departamento de E.U.A. de salud y servicios de humanos, servicios de salud pública, centros para el control de enfermedades: B17-35). Análisis de Da tos Clínicos Se tabularon los datos de seguridad. Cada concentración de Hl fue reportada como un promedio geométrico (GMT) de las dos determinaciones independientes, que usualmente produjeron los mismos o similares resultados. Una concentración de 5 fue asignada si la muestra tuvo un concentración por bajo de 10, el límite de detección del ensayo. Para cada grupo, el GMT en cada punto en el tiempo y 95% del intervalo de confidencia (Cl) se calculó utilizando concentraciones logarítmicamente transformadas. Para cada punto en el tiempo, la relación GMT de la línea base para cada grupo de dosificación se comparó mediante la prueba de chi-cuadrado utilizando el procedimiento CATMOD en SAS. Las diferencias en el GMT entre los tres grupos se compararon. Se calculó la velocidad de seroconversión (porcentaje de sujetos con el = incrementos de 4 veces en la concentración HAI sobre la concentración de pre-inmunización) , y la velocidad de seroprotección (la proporción de sujetos que lograron una concentración de =40 después de la inmunización) se calcularon y se compararon entre los grupos mediante la prueba chi-cuadrada utilizando el procedimiento CATMOD en SAS para comparar el % del respondedor con la función de enlace de la respuesta logit. Resultados Seguridad y Rea ctogeni cidad Se evaluaron las reacciones locales para los 84 sitios de administración de vacuna (Figura 18) . Las puntuaciones de la reacción de la piel local de los tres grupos (sitios de vacunación totales 84) se promediaron. Las reacciones de la piel se calificaron de acuerdo con el siguiente criterio: Eritema: 0 = ninguno; 1 = enrojecido; 2 = bronceado ligero; 3 = rojo remolacha. Edema: 0 = ninguno; 1 = apenas más grueso; 2 = notablemente más grueso; 3 = colmena grande y firme. Decoloración: 0 = ninguno; 1 = se ve escasamente; 2 = notablemente decolorada; 3 = betún marrón. Descamado: 0 = ninguno; 1 = como caspa blanca fina; 2 = pelado como quemadura de sol; 3 = más grueso, amarillo, costroso. Picazón/molestia: 0 = ninguno; 1 = picazón ligera o ligeramente irritado cuando se toca; 2 = moderadamente picazón o irritado Como se esperaba con base en los estudios previos (Roy y otros (2001), Rottinghaus y otros (2003) y Tacket y otros (1999) todos supra ) , los sujetos experimentaron reacciones dérmicas locales, sin embargo no ocurrieron reacciones locales en un intervalo severo (puntuación = 3). No hubo sangrado o daño a la piel registrado. La reacción local típica se caracterizó por un eritema, de ligero a moderado, edema, y decoloración de la piel, y ocasionalmente picazón/molestias, seguido por un descamado de piel superficial ligero. Las reacciones locales no frecuentes incluyeron hemorragia local (2/84 sitios), amoratamientos menores (2/84 sitios) y costras pequeñas (15/84 sitios). Ya que el edema generalmente se resolvió 14 días después de la vacunación, el eritema y la decoloración de la piel persistió durante 28 días. Del total de 84 sitios de vacunación, la decoloración ligera de la piel aún estuvo presente de los 30 a los 56 días y de los 21 a los 180 días después de la vacunación. Un sujeto también tuvo amoratamiento detectable en 2 sitios en el día 180. Los eventos adversos sistémicos observados durante el estudio fueron ligeros y se consideraron no relacionados con el tratamiento. Los eventos reportados de los 7 a los 56 días después de la inmunización incluyeron dolor de cabeza (11 eventos en 10 sujetos), fatiga (4 eventos en 3 sujetos), mialgia (3 eventos en 1 sujeto), fiebre (2 eventos en 2 sujetos), sensación de frío en la mano (2 eventos en 2 sujetos), dolor de espalda (2 eventos en 1 sujeto) y náusea, artralgia, rigidez muscular, estremecimientos, hipertensión intermitente, e hipotensión intermitente (1 evento cada uno en 1 sujeto) . No se detectaron anticuerpos anti-ADN de estructura de cadena doble. En general, el perfil del evento adverso local y sistémico para todos los grupos de estudio proveyó una indicación de la seguridad de la vacuna de ADN de influenza distribuida mediante PMED. Respuestas al anticuerpo Los sujetos se pre-clasificaron para concentraciones Hl para la influenza A/Panama de =IO y <40, aún algunos sujetos tuvieron concentraciones de <10 en el día de la vacunación. Las concentraciones Hl de la línea base todas fueron <40, y no hubo diferencias significativas en las concentraciones de la línea de base entre los grupos (p=0.439; ver Tabla 4 anterior). La inmunización dio como resultado elevaciones significativas en las concentraciones promedio geométricas (GMT) en todos los puntos en el tiempo en los tres grupos (como se muestra en la Tabla 5 siguiente) .
Tabla 5: Respuestas del anticuerpo al suero, velocidad de seroconversión y seroprotección Grupo Día Seroconversión Seroproteccicon Incremento GMT promedio (vez) 0 17 (2/12) 14 8 (2/12) 42 (5/12) 1.4 21 17 (2/12) 33 (4/12) 1.7 56 33(4/12) 58 (7/12) 2.8C 0 33(4/12) 14 17 (2/12) 50 (6/12) 1.7 21 8 (1/12) 58 (7/12) 2.1 56 67(8/12) 92(11/12) 3.9 0 8 (1/12) 14 17 (2/12) 25(3/12) 1.8 21 33 (4/12) 67 (8/12) 3.4 56 64(7/11) 100(11/11) 8.1 a La seroconversion se definió ya sea como una concentración de pre-vacunación negativa (=10) a una concentración de la post-vacunación =40, o un incremento significativo en la concentración del anticuerpo, es decir, por lo menos un incremento de cuatro veces entre las concentraciones de la pre y post vacunación en donde la concentración de la pre-vacunación es =IO b Velocidad de la seroprotección se define como la proporción de los sujetos que lograron una concentración de post-inmunización de =40; c Valores que cumplen con el criterio CPMP Aunque hubo una tendencia hacia las concentraciones Hl más altas y un % de seroconversión más alto en forma de dosis-respuesta, no hubo diferencias estadísticas en GMT, % de seroprotección o % de seroconversión entre los tres grupos. Para los tres niveles de dosis de vacuna, GMT, el % de seroconversión y % de seroprotección se incrementaron como una función del tiempo de post-vacunación, con las concentraciones más altas en el día 56 (ver la Tabla 5) . En el grupo 1, el 33% de los sujetos se seroconvirtió en el día 56, con el 58% logrando concentraciones HAI seroprotectivas, y un aumento GMP de 2.8 veces. En el grupo 2, la velocidad de seroconversión en el día 56 fue de 67%, con el 92% de los sujetos seroprotegidos y un aumento GMT de 3.9 veces. Las concentraciones más altas y más consistentes se observaron para el grupo 3 en el día 56, en donde se observó el 100% de seroprotección, y el GMT se incremento 8.1 veces sobre la línea base. En ese grupo, la seroconversión fue menor del 100%, porque algunos sujetos seroprotegidos no mostraron un incremento de =4 veces en concentración, debido a las concentraciones HAI de la línea base relativamente altas. Explicación El trabajo descrito en el ejemplo presente provee la primera generación exitosa de una respuesta a anticuerpo anti-influenza que se pronostica a ser efectivo para la profilaxis de influenza. El análisis inmunológico demostró que todos los niveles de dosis produjeron respuestas anticuerpos antiinfluenza. La comparación contra las instrucciones de CPMP (Comité para el Propietario de Productos Médicos) para la licenciación de vacunas contra la gripe anuales mostraron que el grupo con una dosis de lµg logró el criterio en el día 56 en la Concentración Promedio geométrica (GMT) , el grupo 2 grupos de una dosis de 2µg logró el criterio en el día 56 en los tres criterios (seroconversión, seroprotección y GMT) y en grupos con la dosis de 4µg logró el criterio en el día 21 a través de GMT y en el día 56 en los otros tres criterios. Un total de 320 eventos adversos emergentes del tratamiento (AE) , incluyendo las reacciones del sitio de vacunación, se reportaron en 34 (94%) de los 36 sujetos dosificados. Hubo 1 SAE reportado durante el estudio, una fractura de pie, considerada probablemente como estando relacionada con la vacuna del estudio. Siete (7) sujetos experimentaron AE reportables por FDA que fueron considerados probablemente como estando relacionados con la vacuna del estudio. La mayor parte (71%) de los AE fueron ligeros en severidad. El AE más común reportado fue dolor de cabeza (53% de los sujetos). No se descontinuaron ningún sujeto del estudio debido a un AE . Un total de 89 AE de relacionado con el sitio de vacunación se reportaron por 27 de los 36 sujetos dosificados con dolor en el sitio de la aplicación ligero siendo el AE local más común, reportado por 12 sujetos (33%) . No evaluaron medidas de reactogenicidad local como grado 3 (severo) y por consiguiente se consideraron eventos adversos. Las reacciones del sitio de vacunación típicas incluyeron enrojecimiento/eritema, edema, descamado, decoloración y formación de cicatriz/costra. En conclusión la administración de pPJV1671 fue bien tolerada en todos los sujetos, y provocó respuestas al anticuerpo anti-influenza potentes. La dosis superior de 4 µg cumple con el criterio en el día 21 establecido por CPMP para el licénciamiento de las vacunas de gripe anuales. Ejemplo 18. Evaluación No Clínica de la vacuna de ADN trivalente en puercos. Se construyeron tres vectores de vacuna ADN que codifican las moléculas HA de las tres cepas de vacunas de influenza 2001- 2002 para evaluar la inmunogenicidad de una vacuna de ADN de influenza trivalente humana candidato en un modelo de animal relevante. Históricamente, el puerco doméstico había sido utilizado como un modelo para vacunas de ADN PMED en humanos debido a las cercanas similitudes en las arquitecturas de la piel humana y de puerco. La relevancia del modelo de puerco como un predictor del funcionamiento de la vacuna de ADN PMED en humanos había sido demostrada por el ensayo clínico humano de fase I de una vacuna de ADN de antígeno de superficie de hepatitis B en donde el buen funcionamiento de la vacuna en puercos se reflejó en seres humanos . Las muestras de tres cepas de vacunas de influenza humana 2001-2002 (A/Panama/2007/99 (H3N2), A/New Caledonia/20/99 (H1N1), y B/Victoria/5/00 ) se obtuvieron de los Centros para el Control de Enfermedades (CDC) y se utilizaron en experimentos de reacción de cadena de polimerasa/transcriptasa inversa (RT-PCR) para generar fragmentos de ADN que codifican los antígenos HA correspondientes. Se utilizaron los siguientes pasos en el desarrollo de los tres vectores de vacuna de ADN HA finales: Producción RT-PCR de fragmentos de ADNds del segmento de ARN #4 de A/Panama/2007/99 (H3N2), A/New Caledonia/20/99 (H1N1), y B/Victoria/5/00. • Propagación de los clones de ADN del segmento #4 de ARN en un vector basado en pUC19 estándar en E. coli. • Análisis de secuencia de la secuencia de codificación HA dentro de los clones de segmento #4 de ARN. • Una segunda serie de reacciones PCR (con base en los datos de la secuencia de gen HA actual) para generar fragmentos de ADN de cada virus conteniendo la secuencia de codificación HA (sin los codones ATG) con los extremos compatibles con el vector de expresión de la vacuna de ADN PJV7563 (Nhe I y Bsp 1201) . • Inserción de los tres fragmentos de la secuencia de codificación HA en el vector pPJV7563 de vacuna de ADN clínico produciendo los tres vectores de vacuna de ADN finales . • Análisis de secuencia de la secuencia de codificación HA en los tres vectores confirmado que no han ocurrido mutaciones. Los vectores resultantes utilizan promotores quiméricos de la invención. De esta forma, el vector utiliza el promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (hCMV) y las secuencias de de codificación 5' de los exones 1 y 2tempranos inmediatos. Este promotor se enlaza al intrón A de insulina de rata y a la región no traducida 5' (UTR) del gen pre-S2 del virus de hepatitis B (HBV) . La traducción de la secuencia de codificación HA inicia en el codón ATG que esté fijo en el vector en el contexto de una secuencia de iniciación de traducción Kozak de consenso. La secuencia de codificación HA es seguida por un potenciador transcripcional de HBV (HBVenh) . Finalmente, la terminación de la trascripción se facilita a través del sitio de poliadenilación del beta-globina de conejo. Como los codones de iniciación traducción ATG naturales de los genes HA no se adaptan a la secuencia del consenso Kozak para la iniciación de la traducción, se utilizó el elemento ATG suministrado por el vector de vacuna de ADN pPJV7563 para la iniciación de la traducción. La expresión del antígeno de los vectores de vacuna de ADN generalmente se mejora utilizando los codones ATG que se adaptan al consenso Kozak. El uso del codón ATG suministrado por el vector (a través de la inserción en el sitio Nhe I) da como resultado una inserción de dos amino ácidos menores en el término amino de la secuencia de codificación del antígeno HA. La inmunogenicidad de estos vectores se evaluó en una formulación trivalente en el modelo de puerco doméstico. Los tres vectores se mezclaron 1:1:1 y se formularon en partículas de oro a una velocidad de 2µg de ADN total/mg de oro, utilizando 0.5 mg de oro por administración. Cada inmunización consistió de dos administraciones PMED tándem totalizando 2 µg de ADN y 1 mg de oro. El régimen de vacunación dos dichas inmunizaciones separadas en cuatro semanas. Los puercos nativos de influenza se dividieron en dos grupos de inmunización con base en el dispositivo de distribución actual utilizado. Un grupo de los animales recibió vacunaciones de ADN de influenza trivalente utilizando el dispositivo PMED "de investigación" reutilizable que había sido exitosamente utilizado para inducir las respuestas inmunes a los numerosos antígenos en una variedad de animales. El segundo grupo de animales recibió inmunizaciones utilizando el dispositivo clínico que se utilizó para exitosamente vacunar a seres humanos utilizando una vacuna de ADN HBV. Este último dispositivo difiere del dispositivo de investigación en que utiliza una boquilla desechable plástica de "un solo tiro" en lugar de la boquilla reutilizable de 12 tiros asociada con el dispositivo de investigación. Dos semanas después de la segunda inmunización, las muestras de suero se recolectaron y las concentraciones de anticuerpo de inhibición de hemaglutinación (Hl) específicas para los virus H3, Hl y B homólogos se midieron. Estos datos se muestran en la Figura 19. Se observó el 100% de la seroconversión para los antígenos H3 y B utilizando ambos dispositivos con concentraciones Hl promedio geométrica bien en exceso de 1:40 en el nivel sustituto comúnmente se cree que será requerido para la inmunogenicidad de la influenza. Los datos obtenidos indican que esta plataforma de tecnología será capaz de provocar respuestas significativas en seres humanos . Las respuestas inmunes específicas de Hl fueron inferiores. Esto después de determinó debido a la reconfiguración del gen HA Hl que ocurrió en el vector de vacuna ADN Hl durante la producción del plásmido. Esta reconfiguración pasó sin detectar en el análisis inicial del ADN antes de la formulación y vacunación, pero podría detectarse a través de un análisis más estricto. Con base en los resultados utilizando los vectores de H3 y B, es probable que las respuestas específicas Hl que habrían sido marcadamente mayores hubieran utilizado un plásmido funcional . Ejemplo 19. Construcción del plásmido pPJV2012 El plásmido pPJV2012 se construyó. pPJV2012 expresa las subunidades A y B de la toxina lábil al calor (LT) de Escheri chia coli enterotoxigénica . La expresión de la toxina LT funcional de pPJV2012 in vivo se puede utilizar para mejorar la respuesta inmune a otras proteínas expresadas de los plásmidos co-administrados con pPJV2012. LT es una proteína multimérica de 84 kD compuesta por una sola subunidad A y un pentámero de subunidades B idénticas. LT expresa y se secreta de E . coli y se une a la gangliosida GMl en las células intestinales a través del pentámero de las subunidades B. La toxina se internaliza y la subunidad A después activa la producción de cAMP excesivo y la interrupción del balance de electrólitos a través del lumen intestinal (Tauschek, y otros (2002) Proc Nati Acad Sci, USA 99: 7066-7071). De esta forma para la actividad biológica de LT expresada in vivo la producción de las subunidades A y B es requerida junto con señales para mediar la secreción de las células de expresión. Los vectores de plásmido que codificaban las subunidades A y B LT han demostrado que aumentan la respuesta inmune inducida a varios antígenos virales cuando se co-distribuye utilizando la distribución epidérmica mediada particular (Arrington y otros (2002) J Virol 76 (9): 4536-46). Además de las secuencias de codificación para las subunidades A y B de la toxina LT, pPJV2012 también incorpora las secuencias promotoras quiméricas de la invención para asegurar la efectiva expresión del gen, una secuencia poli A de beta globina de conejo, secuencias de señal para mediar la secreción de las células de expresión, un gen de resistencia a canamicina y un origen bacteriano de replicación. El plásmido se muestra en la Figura 22. El plásmido pPJV2012 se construyó a través de los siguientes pasos: • Amplificación PCR de la secuencia de codificación A LT del ADN genómico E . coli e inserción en el plásmido intermedios; • Escisión de la secuencia de codificación A LT y la inserción en un plásmido "aceptador" bajo el control del promotor CMV. • Amplificación de PCR de la secuencia de codificación B LT del ADN genómico E . coli e inserción en un plásmido intermedio bajo el control de un promotor CMV truncado. • Escisión del cásete de expresión A LT . El plásmido resultante, pPJV2012, la expresión de ambas subunidades de LT en células de mamífero. Secuencias promotora y potenciadora en pPJV2012 La subunidad A LT se expresó del promotor temprano inmediato CMV (IE). La subunidad B LT se expresó de un promotor IE CMV truncado. Las secuencias adicionales se incluyeron para ambos genes para mejorar la expresión, específicamente la UTR 5' HBV pre-S2 (Moriarty y otros (1981) Proc Nati Acad USA 78:2606-2610), el exón 1/2 CMV (consistiendo de los dos primeros exones CMV IE empalmados juntos a través de la eliminación del intrón natural), el intrón A de insulina de rata (Lomedico y otros (1979) Cell 2: 545-558) y poli A de beta globina de conejo (rGpA) . Para asegurar la secreción de las células de expresión el péptido de señal de lisozima de pollo (CLSP; número de acceso de Genbank CR390743) ha sido insertado para ambas subunidades LT . Además, el potenciador env HBV (Vannice y Levinson (1988) J Virol. 62: 1305-1313) se insertó después de la subunidad A para mejorar la expresión. Clona ción de las subunidades A y B LT Se obtuvo la cepa E078:H11 E . coli de TCC (catálogo #35401) , y las subunidades A y B se amplificaron a través de reacciones PCR separado utilizando cebadores homólogos a los extremos 5' y 3' , diseñados por la referencia al archivo de acceso GenBank AB011677. Las secuencias de codificación generadas para ambas subunidades no incluyen las secuencias de codificación de los péptidos de señal bacterianos encontrados en el término amino. Los fragmentos de la subunidad A y B se ligaron separadamente en el plásmido WRG7054. Construcción de pPJV2012 La secuencia de codificación A LT se extirpó y se ligó con la estructura del vector de pPJV7592, y un fragmento derivado de pPJV7572 que incluyó el promotor CMV, y las regiones no traducidas 5' y CLSP. El plásmido resultante se designo Al. Al se cortó y se ligó con un fragmento de pPJV7592 para recrear un sitio de clonación múltiple, y el plásmido resultante se designó como aceptor; esto proveyó el componente A LT de pPJV2012. La secuencia de codificación B LT se extirpó y se ligó con la estructura del vector de pPJV7591 y a un fragmento derivado de pPJV7572 que contuvo el extremo 3' de las regiones no traducidas y el CLSP. El plásmido resultante se designó como donante y proveyó el componente B LT de pPJV2012. Para generar pPJV2012 se ligó un fragmento del donador conteniendo el cásete de expresión B LT con un fragmento de vector derivado del aceptador. El plásmido resultante expresó tanto A y B LT en células de mamífero. Origen de las Secuencias de Nucleótido en pPJV2012 pPJV2012 se secuenció y alineó completamente con las bases de datos para asignar el origen de cada secuencia. Las secuencias derivadas, mostradas en la Tabla 6 siguiente, fueron como se esperaba. Tabla 6 : Identificación de Componentes que Comprenden el Plásmido pPJV2012 3030-3089 Péptido de señal de lisozima de pollo 3090-3095 Secuencia enlazadora 3096-3818 Secuencia de codificación A LT 3819-3830 Secuencia enlazadora 3831-4363 Secuencia potenciadora HBV 4364-4374 Secuencia desconocida 4375-4050 Poli A de beta globina de conejo 4051-5578 Secuencia derivada de pUC19 Además de la búsqueda BLAST se llevó a cabo para homologías de secuencia para el genoma humano completo, buscando las similitudes de secuencia en alargamientos tan cortos como 19 bases. No hubo "similitudes significativas encontradas"; el grado más alto de homología fue con una secuencia de 68 bases de rGp^, aunque el alargamiento más largo de la secuencia idéntica fue solamente de 18 bases. Compara ción de la secuencia pPJVl ßll con pPJV2012 La secuencia de pPJV2012 ha sido comparada con la de pPJV1671. Los resultados se demuestran en la Tabla 7 abajo .
Tabla 7: Comparación de la secuencia de pPJV2012 con pPJV1671 El análisis demuestra que 4418 de los 5578 pares de bases (79%) en pPJV2012 también están presentes en la vacuna de la DNA de influenza pPJV1671. Exclusivo para las secuencias de codificación para las subunidades A y B LT, 4418 de los 4544 bases par (97%) de pPJV2012 también están presentes en pPJV1671. Observar que pPJV1671 ha experimentado estudios de biodistribución/integración y en cada caso no se encontró evidencia integración. Ejemplo 20 - Construcción del plásmido pPJV7788 un plásmido que expresa las subunidades LT E. coli en células de mamífero El plásmido pPJV7788 se generó utilizando los siguientes plásmidos: pPJV7563 y pPJV7592 que son plásmidos derivados de pPJV7275, pPJV7284, pPJV7389, pPJV7586 y pPJV7293. pPJV7590 que es un derivado de pPJV7389 que incluye un sitio de clonación múltiple (MCS) inmediatamente en dirección 5' del promotor CMV. pPJV7572 que es un derivado de pPJV7389 que contiene la secuencia de codificación para el péptido en señal del lisozima del pollo (CLSP) directamente en corriente ascendente del antígeno codificado. Esto permite la secreción extracelular de los antígenos fusionados c-terminalmente fundidos. (i) Construcción de pPJV7785 (Plásmido aceptor LTA) pPJV7563 se cortó con Salí, se terminó en forma roma, y cortó con Ndel para crear un fragmento de vector. pPJV7590 se cortó con Sphl, terminó en forma roma, y cortó con Ndel para crear un fragmento de inserto conteniendo un MCS y los cinco extremos cebadores del promotor CMV. Estos fragmentos se ligaron para ?jenerar pPJV7592. pPJV7592 se cortó con Ncol y Bgl2 para crear un fragmento de vector. pPJV7572 se cortó con Ncol y Nhel para crear un fragmento de inserto conteniendo el extremo 3' del CMV, las regiones no traducidas 5', y el CLSP. pPJV2004 se cortó con Nhel y BamHl para crear un fragmento de inserto conteniendo la subunidad LTA. Estos fragmentos se ligaron para generar el plásmido pPJV7785. (ii) Construcción de pPJVllß l (Plásmido donador LTB) pPJV7389 se cortó con Ncol y EcoRl para crear el fragmento vector. pPJV7572 se cortó con Ncoll y Nhel para crear un fragmento de inserto conteniendo el extremo 3' del promotor CMV, las regiones no traducidas 5', y el CLSP. pPJV2005 se cortó con Nhel y BamHl para crear un fragmento de inserto conteniendo la subunidad LTB. pPJV7586 se cortó con Bgl2 y EcoRl para crear un fragmento de inserto conteniendo la región de poliadenilación de beta-globina de conejo. Estos fragmentos se ligaron para generar pPJV7787. (ii i) Construcción de pPJV7788 pPJV7785 se cortó con Xhol y Mfel para crea un fragmento de vector conteniendo el cásete de expresión LTA. pPJV7787 se cortó con Xhol y EcoRl para crear un fragmento de inserto conteniendo el cásete de expresión LTB. Estos fragmentos se ligaron para generar pPJV7788 que expresará las subunidades LTA y LTB cuando se introducen en células de mamífero . La Tabla 8 siguiente provee la ubicación de los varios elementos en la construcción pPJV7788. Tabla 8: ID del Componente para pPJV7788 Números Bases Componente 1-44 Tn903, remanentes pUC4K 45-860 KanR (Tn903) 861-983 Tn903, remanentes UC4K 984-1001 pUC19 MCS 1002-1686 CMV Pro 1687-1817 Exón 1/2 CMV 1818-1823 Fusión de Bam/Bgl 1824-1956 Intrón A de insulina de rata 1857-1962 Sitio BamHl 1963-2083 UTR 5' de HBV pre-S2 2084-2143 Lisozima SP 2144-2149 Sitio Nhel 2150-2462 LTB 2463-2593 RBGpA 2594-2623 Sitio de Clonación Múltiple 2624-3308 CMV Pro 3309-3439 Exón CMV 3440-3445 Fusión Bam/Bgl 3446-3578 IntA de Ins de Rata 3579-3584 BamHl 3585-3705 UTR 5' de HBV pre-S2 3706-3765 Lisozima SP 3766-3671 Sitio Nhel 3772-4494 LTA 4495-4506 Polienlazador 4507-5039 HBV enh 5040-5050 Origen desconocido 5051-5181 rGlob pA 5182-5187 Sitio EcpRl 5188-6254 pUC19 Ejemplo 21 - Construcción de pPML7789, un Plásmido que Expresa la Proteina de Hemaglutinina H5/VN1194 en células de mamífero Se generó una construcción adicional, pPML7789, capaz de expresar H5/proteína hemaglutinina VN1194 utilizado un promotor quimérico de la invención. La construcción pPJV7563 descrita en el Ejemplo 5 se utilizó como la estructura para la construcción pPML7789. Se utilizó un plásmido conteniendo la secuencia de codificación para el gen HA H5/VN1194 como la plantilla para PCR. Los cebadores PCR se diseñaron con sitios en el quinto y tercer extremos primeros para permitir la inserción en pPJV7563. pPJV7563 se cortó con Nhel y Bspl20I para generar un fragmento de vector. El fragmento PCR amplificado de la plantilla H5/VN1194 se cortó con las mismas enzimas para generar un fragmento de inserto. Estos dos fragmentos se ligaron para producir pPML7789. Las secuencias de codificación y flanqueo se verificaron a través de secuenciación . Las posiciones del nucleótido de los varios elementos en pPML7789 se indican en la Tabla 9 siguiente. Tabla 9: Componentes de la Construcción pPML7789 Posición del Nucleótido Elemento Inicio : 1 Final: 44 Tn903, Remanentes pUC4K Inicio : 45 Final: 860 Kano (Tn903) Inicio : 861 Final: 896 Tn903, Remanentes pUC4K Inicio : 897 Final: 902 pUC19 MCS Inicio : 903 Final: 1587 CMV Pro Inicio : 1588 Final: 1718 CMV Exón Vd Inicio : 1719 Final: 1724 Fusión Bam/Bgl Inicio : 1725 Final: 1857 Intrón A de Insulina de Rata Inicio : 1858 Final: 1863 Sitio BamHl Inicio: 1864 Final: 1984 UTR 5' de HBV pre-S2 Inicio: 1985 Final: 1993 ATG-Nhe Inicio : 1994 Final: 3699 VN1194H5 Ejemplo 22. Respuestas inmunes celulares protectoras potentes generadas a través de la inmunización de ADN con HSV-2 ICP27 y la toxina lábil al calor E. coli Ma teriales y métodos Virus Se hicieron crecer los virus HSV-2 (cepa MS, ATCC VR-540 y cepa G HG52 donación de Nancy Sawtell, Universidad of Cincinnati) en las células VERO (ATCC CCL-81) y se purificaron en gradientes de sacarosa antes de uso. Va cuna de ADN y vectores DEI El plásmido que codifica HSV-2 ICP27 (Figura 27) se generó a través de la inserción de un fragmento PCR incorporando el gen ICP27 completo (UL54) en un pTarget (Promega, Madison Wl) . El fragmento PCR se amplificó del ADN genómico purificado de la cepa MS de HSV-2 utilizando los cebadores 5' (GCCACTCTCTTCCGACAC, SEC ID NO: 63) y 3' (CAAGAACATCACACGGAAC, SEC ID NO:64). Las secuencias amplificadas correspondieron a los nucleótidos 114,523 a 116,179 de la secuencia del genoma publicada del clon HG52 de HSV-2 (número de acceso al GenBank NC_ 001798) . El pICP27 se secuenció en su totalidad a través de la instalación central de secuenciación de ADN en la Universidad de Wisconsin, Madison. El Plásmido PJV2012 codifica ambas subunidades A y B de LR de un solo vector y se demuestra en La Figura 22. La construcción de pPJV2012 se describe en el Ejemplo 19. En pPJV2012, el gen de la subunidad A LT se expresó a partir de una unidad de transcripción que consiste de los siguientes componentes: el promotor temprano inmediato de citomegalovirus (hCMV) , los exones 1 y 2 fusionados de hCMV (no de codificación) , intrón A de insulina de rata, la región no-codificación 5' del virus de la hepatitis B (HBV) del gen pre-S2, el codón ATG, la secuencia de codificación de péptido de señal del lisozima, la secuencia de codificación de subunidad A LT, la región mejoradora transcripcional HBV no-codificación 3' , y la secuencia de poliadenilación de beta globina de conejo. pPJV2012 también codifica el producto de la subunidad B LT de una segunda unidad de transcripción que corre en dirección opuesta (Figura 22). La unidad de transcripción B LT es similar a aquella que codifica el producto A LT pero no contiene copias adicionales de los elementos potenciadores transcripcionales hCMV y HBV. Los elementos potenciadores hCMV localizados en la unidad de transcripción A LT también sirven a la unidad de transcripción B LT . El plásmido PJV2013 (no mostrado) es similar a pPJV2012 pero codifica ambos productos de la subunidad A y B de la toxina del cólera de un solo vector. El mapa funcional pPJV2013 es idéntico a aquel mostrado para pPJV2012 en la Figura 22. Va cuna ci ón de ADN a través de di s tribución epidérmi ca mediada por pa rtí cula (PMED) La vacunación de ADN PMED de ratones Balb/c hembras de 6 a 8 semanas de edad fue como previamente se describió (Arrington y otros, J. Virol. 76, 4536-4546, 2002) excepto que cada inmunización consistió de una sola distribución PMED en la piel abdominal ventral en donde cada distribución contuvo 0.5 mg de oro cubierto con un total de 0.5 µg de la vacuna de ADN/formulación de vector DEI . Se administraron dos inmunizaciones de "una sola inyección" en 4 semanas separadas, y los animales se sacrificaron o se atacaron 2 semanas después de la segunda inmunización o inmunización de "refortalecimiento" . Grupos de péptido y péptidos Las secuencias de aminoácido derivadas de ICP27 del virus de la cepa MS se utilizaron como una plantilla para la colección. La proteína ICP27 está altamente conservada entre las secuencias HG52 y MS (ver Figura 28 y SEC ID NO: 65) de esta forma la colección podría capaz de detectar respuestas de ambas cepas. Una colección de péptidos se sintetizó (Mimotopes, Fisher Scientific) para abarcar la secuencia completa de ICP27 utilizando péptidos de 18 aminoácidos en longitud que tuvieron un traslape de 11 aminoácidos con el péptido adyacente. Se hicieron un total de 72 péptidos. Para facilitar la identificación de los péptidos positivos la colección se dividió en grupos de péptido utilizando la estrategia descrita por Tobery y otros J. Immunol. Methods 254, 59-66, 2001. Los grupos de péptidos se generaron utilizando el patrón mostrado en la Tabla 10. Hubo 12 grupos (nominados C1-C12) con 6 péptidos por grupo y 6 grupos (R1-R6) con 12 péptidos por grupo. Los grupos conteniendo los péptidos #45 y #46 están en tipo en negritas. Tabla 10: Composiciones de Grupo de Péptidos Ensayos ELISPOT Los ensayos de IFN-? ELISPOT se llevaron a cabo en esplenocitos frescos y células de nodo linfoide como se describió previamente excepto que los antígenos para la estimulación fueron péptidos individuales o grupos de péptídos como se definió para cada experimento en la sección de resultados. En algunas instancias, antes del ensayo ELISPOT, las poblaciones de células T se redujeron a través de perlas magnéticas (Dynal) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Ensayos del arreglo de perlas citométricas (CBA) Se recolectaron esplenocitos frescos dos semanas después de la segunda inmunización y se volvieron a suspender a 1 x 107 células por ml en SM (medio RPMl + 10% de suero bovino fetal suplementado con piruvato de sodio MEM, aminoácidos no esenciales, y el 2-mercaptoetanol (Invitrogen, Carisbad, CA) ) . Las muestras de célula se colocaron en placas a 1 x 106 células (100 µl) por cavidad en 96 placas de fondo plano de 96 cavidades. Los esplenocitos se trataron con 100 µl de alícuotas del péptido ICP27 en SM o medio solo. La concentración de péptido final fue de 10~8 M. Los esplenocitos de control de animales y de expertos también se colocaron en placas con o sin péptido y con y sin Con-A (2.5 mg/ml concentración final) para servir como controles negativo y positivo, respectivamente.
Las placas se incubaron a 37°C durante 48 horas y después se recolectaron 160 µl de cada muestra y se almacenaron a -20°C hasta que se ensayaron utilizando el kit Thl/Th2 de ratón del arreglo de perlas Citométrico BD (CBA) (BD Biosciences, San José, CA (cat. #551287)). Brevemente, este equipo utilizó 5 poblaciones de perlas con distintas intensidades de fluorescencia cubiertas con anticuerpos de captura específicos para ratón IL-2, IL-4, IL-5, INF-?, y TNF-a. Las cinco poblaciones de perla se mezclaron para formar el arreglo que se resuelve en el canal FL3 del citómetro de flujo de BD FACSCalibur. Las perlas capturadas por la citosina se mezclaron con los anticuerpos de detección conjugados con PE y después se incubaron con muestras estándares o de prueba para formar complejos emparedados. El software de análisis BD CBA se utilizó para generar los resultados después de la adquisición de la muestra. La intensidad de la muestra para cada citocina se comparó con las curvas estándar para facilitar la cuantificación de las concentraciones de citocina. Las muestras se corrieron puras o a una dilución de 1:10 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Reto del virus HSV-2 Los ratones Balb/c anestesiados se retaron intranasalmente con 30 µl de PBS conteniendo aproximadamente 50LD50 (2 x 106 PFU) de la cepa HSV SM. Los ratones fueron seguidos durante 20 días después de la infección y se clasificaron para morbidez y la mortalidad. La morbidez se clasificó sobre una escala de 0 a 4 de acuerdo con el siguiente programa: 4, saludable; 3, pelo rizado, estornudo; 2, erupción en los ojos o pata trasera, movimiento reducido; 1, encorvado, poco movimiento; 0, muerto. Los ratones después se trataron con IFN-? (eBioscience, San Diego, CA (cat. # 16-7311) y/o anticuerpos monoclonales específicos TNF-a (cat. # 16-7332) alrededor del tiempo del ataque recibido inyecciones intraperitoneales conteniendo 90 µg del anticuerpo en los días -2, 0, 2, 4, 6, y 8 con relación al ataque del virus. En los experimentos, de eliminación de la célula T, los ratones recibieron inyecciones íntraperitoneales conteniendo 200 µg del anticuerpo específico para cualquiera de las poblaciones CD4 o CD8 en los días -2 y 0 con relación al ataque del virus (CD4 anti-ratón purificado de grado funcional, eBioscience Cat#: 16- 0041; CD8 anti-ratón purificado de grado funcional, eBioscience; Cat#: 16-0081). Resul tados Iden tificación de un epi topo CD8 fuerte en ra tones Balb/c . Para identificar las respuestas de la célula T contra la proteína ICP27, se llevó a cabo un ensayo IFN-? ELISPOT sobre células recuperadas de ratones Balb/c y C57B1/6 infectados con una cepa atenuada de HSV-2 (cepa G HG52) . Se utilizó una colección de péptidos compuesta de péptidos que abarcan la longitud completa de la secuencia de codificación ICP27 para estimular las células T. Los péptidos fueron de 18 aminoácidos en longitud y se traslaparon los péptidos contiguos por 11 aminoácidos. Los grupos de péptido se compusieron de ya sea 6 péptidos (grupos C1-C12) o 12 péptidos (grupos R1-R6) como se describe en materiales y métodos y la Tabla 10, una configuración que facilita la identificación de péptidos positivos dentro de la colección. Se recuperaron las células del bazo y nodos linfoides de los ratones Balb/c 7 días después de la infección que mostraron respuestas muy fuertes a los péptidos dentro de los grupos CIO, Cll, R2 y de R5 (Figura 29A) con respuestas más débiles en varios otros grupos. Solamente se detectaron las respuestas débiles en células recuperadas de ratones C57B1/6. El patrón de respuestas positivas se encontró que es similar a las poblaciones de células de bazo y de nodo linfoide ensayadas . Con base en los resultados de IFN-? ELISPOT, se pronosticaron dos péptidos adyacentes (#45, #46) para contener el epítopo de célula T dominante. Esto se confirmó a través de la prueba de cada péptido individualmente (datos no mostrados) . Los péptidos 45 y 46 estimularon una secreción IFN-? fuerte y contuvieron una secuencia de 9 aminoácido homólogos HGPSLYRTF (Figura 29B, SEC ID NO: 68) que se pronostica que se une al alelo Dd. Interesantemente, el péptido 46 también contiene una región que corresponde a un epítopo descrito previamente en los ratones de Balb/c para ICP27 de HSV-1 (Banks y otros, J. Virol. 67, 613-616, 1993). La comparación de las secuencias ICP27 en HSV-1 y HSV-2 mostraron que la regiones difieren por un solo aminoácido; el residuo de alanina (a) en HSV-2 ICP27 (LYRTF AANPRA, SEC ID NO: 69) se remplazó por una glicina (G) en HSV-1 (LYRTF AGNPRA, SEC ID NO:70). La región, sin embargo, no está presente en el péptido 45 aún cuando que este péptido estimula una respuesta extremadamente fuerte. Para determinar la importancia relativa de los dos epítopos potenciales en el péptido 46 en el ensayo de IFN- ? ELISPOT, los péptidos LYRTF AANPRA y el HGPSLYRTF se sintetizaron y se probaron. Las células de bazo aisladas de los ratones infectados respondieron fuertemente al péptido HGPSLYRTF, pero no se detectó ninguna respuesta por arriba del fondo para la secuencia LYRTFAANPRA. Al utilizar perlas magnéticas para eliminar las poblaciones de célula T antes del ensayo IFN-? ELISPOT, dio como resultado una respuesta CD8+ ICP27 fuerte. Los datos indican que se genera una respuesta CD8 fuerte en ratones Balb/c hacia la proteína HSV-2 ICP27 que es específica para la secuencia HGPSLYRTF. Respues tas inmunes in vi tro a la vacuna ICP27 Se generó una vacuna de ADN, "pICP27", utilizando las secuencias ICP27 de la cepa MS de HSV-2 (Figura 27) . La construcción secuenciada tuvo solamente dos diferencias del nucleótido de la secuencia de gen HG52 ICP27 publicada (Figura 28) . Hubo un cambio de G a A en el nucleótido 57 que podría ser silencioso, y un cambio de A a C en 484 que podría cambiar una lisina en la cepa HG52 a una asparagina en la versión del MS . De esta forma, la proteína ICP27 de la cepa MS expresada de la vacuna de ADN podría ser casi idéntica a la versión de la cepa HG52 de la proteína sin diferencias en la región del epítopo CD8 putativo. La vacuna de ADN pICP27 se utilizó para inmunizar ratones Balb/c y C57B1/6 a través de PMED. Los esplenocitos y las células de nodos linfoides se probaron en el ensayo IFN-? ELISPOT contra el panel de grupos descritos en La Figura 29. El patrón de las respuestas positivas a los péptidos ICP27 encontrado en ratones inmunizados ADN fue iguales que aquellos encontrados en los ratones infectados (datos no mostrados ) . Respues tas in vivo a la va cuna de ICP27 La actividad in vivo de las respuestas inmunes generadas por la vacunación de ADN pICP27 se estudió en un modelo de infección intranasal profiláctico en ratones de Balb/c. La infección con las varias dosis de la cepa MS de HSV-2 en ratones Balb/c de 12 semanas de edad estableció un LD50 de aproximadamente 3 x 104 PFU (datos no demostrados) . En los experimentos de protección de ADN, se utilizó una dosis de ataque de virus de 50 LD50 porque esta dosis consistentemente dio como resultado 100% de mortalidad en animales sin experiencia. Una serie de experimentos demostró que la inmunización con ADN pICP27 solo (principal y refortalecimiento) tuvo habilidad limitada para proteger a los ratones. Por consiguiente, para mejorar los vectores de protección DEI que codifican la toxina de cólera (CT) o la toxina lábil al calor de E. coli (LT) se co-distribuyeron con la vacuna de ADN ICP27. Las subunidades de la toxina A y B se expresaron del mismo plásmido para cada una de las dos toxinas . Los ratones se inmunizaron con la vacuna de ADN ICP27, ya sea sola, o suplementada con los vectores CT o LT DEI a una relación de 9:1 (0.45 µg de ADN de antígeno + 0.05 µg de ADN del vector DEI) . Se utilizan un total de 16 animales por el grupo de inmunización, la mitad de los cuales se ataco con el virus y la otra mitad se sacrificó en el momento del ataque para producción de citosina específica del ICP27. Los resultados de este estudio se muestran en La Figura 31. Los resultados muestran que la inmunización con ICP27 + de CT y ICP27 solamente proveen una protección parcial y no protección, respectivamente, mientras el 100% de la protección se observó para la formulación ICP27 + LT (Figura 31A) . Estos resultados confirman que la co-distribución de los vectores DEI con el vector ICP27 mejora la protección y refuerza la superioridad de LT sobre CT como un immunoestimulador en la inmunización de la ADN. La cuantificación de la producción de citocina después de la estimulación in vitro con el péptido epítopo CD8 utilizando el kit CBA demostró una buena correlación entre la supervivencia del ataque y los niveles tanto de INF-? (Figura 31B) y TNF-a (Figura 31C) . El papel de las ci tocinas y las poblaciones de célula T El papel de la producción específica de ICP27 de IFN-? o TNF-a en la protección de animales atacados se evaluó. Los animales vacunados con pICP27 + pPJV2012 (LT) se trataron con INF-? y/o anticuerpos monoclonal específicos de TNF-a por varios días alrededor del tiempo del ataque para neutralizar las citocinas in vivo. Los datos de morbidez se muestran en La Figura 32. Como antes, los animales que recibieron dos vacunaciones ICP27 + de LT DEI estuvieron completamente protegidos del ataque y exhibieron solamente una morbidez temporal ligera (pelo rizado en 1 de 4 animales) mientras el 100% de los ratones inexpertos o ratones inmunizados con el vector pICP27 solo sucumbieron al ataque. En el grupo inmunizado con la formulación ICP27 + de LT DEI y subsecuentemente tratados con anti-TNF-a, se observó una muerte inmediatamente después de la inoculación del ataque intranasal debido a las complicaciones de la anestesia. De forma importante, los tres ratones restantes mostraron solamente el rizado de pelo temporal y recuperaron completamente indicando que la producción de TNF-a probablemente no contribuye significativamente a la protección. En contraste, los dos grupos de ratones inmunizados con ICP27+LT DEI que recibieron anti-IFN-? o anti-IFN-? + anti-TNF-a en el momento del ataque se hicieron intensamente mórbidos y 7 de los 8 animales murieron, demostrando claramente la importancia de IFN-? como mediador esencial de la protección. Para examinar el papel de las poblaciones CD4 y CD8 en la protección, se utilizaron los anticuerpos CD4 o CD8 para eliminar estas poblaciones antes del ataque infeccioso (Figura 33). Cuando los ratones fueron seguidos para mortalidad durante 20 días emergió un patrón interesante.
Como se esperaba, a los ratones que se les dio pICP27 con un vector vacío no estuvieron significativamente protegidos de la infección. La vacunación pICP27+LT DEI proveyó 100% de supervivencia, mientras la remoción de ambas células CD4 y CD8 de los ratones inmunizados similarmente abrogaron los efectos protectores de la vacunación e hicieron a los ratones susceptibles de aproximadamente el mismo nivel que los ratones sin experiencia. En los ratones inmunizados con la vacuna pICP27+LT DEI, la eliminación de la población CD8 antes de la infección causó que los ratones sucumbieran a la infección indicando un papel importante de estas células en la protección de la infección o encefalitis. En los ratones vacunados con pICP27+LT DEI, la eliminación de la población CD4 introdujo un retraso de nueve (con relación a los ratones no experimentados) antes de que estos ratones también se enfermaran y murieran, sugiriendo un papel de las células T CD4 para una supervivencia a largo plazo. Ejemplo 23: Inmunogenicidad de la vacuna de ADN a H5N1 de Influenza en ratones Materiales y métodos El plásmido de ADN pPML7789 (Ejemplo 21, Figura 20) codifica el HA del virus de influenza A/V?etnam/1194 /2004 [H5N1] se precipito sobre partículas de oro y se distribuyó a los ratones a través de una distribución epidérmica mediada por partícula (PMED) utilizando la tecnología de distribución propietaria de PowderMed. La distribución se efectuó con o sin, como un adyuvante, un plásmido pPJV2012 adicional (Ejemplo 19, Figura 22) codificando las subunidades A y B de toxina lábil al calor E. coli. Cuando pPJV2012 está presente, este plásmido adicional y el plásmido pPML7789 se precipitaron en las mismas partículas de oro. Se logró primero premezclando pPJV2012 y pPML7789 en una forma líquida a una relación de peso de 1:9 y después co-precipitando los plásmidos sobre una población de partículas de oro. Con un control negativo, las partículas del oro en las cuales no se había precipitado ningún plásmido se distribuyeron a través de PMED. Los ratones fueron como sigue: Cepa: ratones Balb/C Número: 36 Género: Hembras Escala de peso: 15.0-19.6 g (en el día del primer procedimiento) Edad: 42-49 días (en el día de la llegada) Dieta: granulos RM1 Proveedor: Charles River UK Ltd Los ratones se dividieron en seis grupos como se muestra en la Tabla 11 siguiente. Los procedimientos se llevaron a cabo en los ratones y en los días en los cuales los procedimientos tomaron lugar se muestran en la Tabla 12 siguiente. Se llevó a cabo un ensayo HAI en el suero de acuerdo con procedimientos estándares.
Tabla 11 : Asignación del Grupo de Tratamiento para Animales No . de Ruta de No. de animales Tratamiento Grupo Administración en cada grupo 1 Epidemialmente Control negativo 1 dosis Dia de sangrado-1, sangrado y selección Día 14 Epidemíalmente Control negativo 2 dosis Dia de sangrado-1 y 21, sangrado y selección Día 36 Epidemialmente pPML7789 1 dosis Día de sangrado-1, sangrado y selección Día 14 Epidemialmente pPML7789 2 dosis Día de sangrado-1 y 21, sangrado y selección Día 36 Epidemialmente pPML7789+pPJV2012 1 dosis Día de sangrado-1, sangrado y selección Día 14 Epidemialmente pPML7789+pPJV2012 2 dosis Día de sangrado-1 y 21, sangrado y selección Día 36 Tabla 12 : Se llevaron a cabo los siguientes Procedimientos en los Dias Marcados con X Dia del Estudio 0 14 21 35 Implantación del transpondedor X Peso corporal X X X" X" Vacunación X X" Puntuación de salud X X X" X -b Suero para anticuerpo X X~a X -b X" Bazos de cosecha X" Clasificación X" X" a Grupos 1, 3 y 5 solamente Grupos 2, 4 y 6 solamente Resultados Se determinaron las concen traciones de HAI contra el virus NIBRG-14 [H5N1 ] Todos los controles se observaron estando dentro los límites aceptables. El artículo del control negativo (virus NIBRG-14 [H5N1]) fue negativo en todas las placas. El artículo del control positivo (glóbulos rojos de pavo) fue positivo en todas las placas. El segundo artículo de control positivo (suero conteniendo anticuerpos al virus de influenza A/Pollo/Escocia/59 [H5N1]) corrieron en todas las placas a una media geométrica de 28, de 40, de 56 o de 80HAIU (dentro de los límites aceptables de 40 HAIU +/- 2 veces) . Todas las muestras en los días 0, 14 y 21 fueron <10HAIU (por debajo del límite de detección) con la excepción ID: 1074 (grupo 6) en el día 21 que no se pudo sangrar, y ID: 1059 (grupo 4) en el día 21 para el cual se obtuvo suero insuficiente para llevar a cabo el ensayo. Para los sangrados del día 35, con la excepción de ID: 1074 (grupo 6) que no se pudo sangrar, la concentración promedio geométrica de cada muestra se calculó, junto con la media aritmética por grupo, la desviación media y estándar para cada grupo. Estos se muestran en la Tabla 13 siguiente.
Tabla 13: Concentración HAI para los Grupos 2, 4 y 6 del Suero obtenido en el Dia 35 Grupo No. de Concentración Media Media SD Muestra Promedio GEO Aritmética 2 1047 <10 1048 <10 1049 <10 <10 <10 1050 <10 1051 <10 1052 <10 4 1059 28 1060 40 1061 40 28 24 10 1062 20 1063 20 1064 20 6 1071 160 1072 226 1073 160 160 40 1074 * 164 1075 160 1076 113 * Datos no disponibles debido a la muerte prematura de un animal Los resultados muestran que el plásmido pPML7789 es inmunogénico en ratones y que esta inmunogenicidad se mejora a través de la inclusión de pPJV2012. Por consiguiente, las construcciones de ácido nucleico novedosas, composiciones que comprenden varias construcciones, y las técnicas de inmunización de ácido nucleico utilizan estas construcciones se han descrito. Aunque las modalidades preferidas del tema de la invención han sido descritas con algún detalle, se entiende que se pueden hacer variaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conacido por la solicitante para llevcar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la inveción.

Claims (114)

  1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicciones : 1. - Una construcción de ácido nucleico adecuada para distribuirla a un sujeto para inducir una respuesta inmune contra el antígeno de hemaglutinina del virus de influenza (HA), caracterizada porque comprende: (iii) una secuencia promotora quimérica que comprende: (a) una secuencia promotora temprana inmediata hCMV; (b) el exón 1 y por lo menos una parte del exón 2 del gen temprano inmediato principal hCMV; y (c) un intrón heterólogo provisto en el lugar de la región del intrón A del gen temprano inmediato principal hCMV; (iv) una secuencia de codificación operablemente enlazada con el promotor quimérico, en donde la secuencia de codificación codifica un antígeno de hemaglutinina del virus de influenza (HA) , un fragmento inmunogénico del mismo, o una variante inmunogénica de dicho antígeno o fragmento que tiene por lo menos 80% de homología de aminoácido al antígeno o fragmento; (iii) una secuencia líder no-traducida que se deriva de la secuencia del antígeno HBVpreS2, la secuencia del e-antígeno HBV o la secuencia del antígeno del tipo 2gD HSV y que está operablemente enlazada al promotor quimérico; y (iv) la secuencia potenciadora que se deriva de la región no traducida 3' (UTR) de una secuencia HBsAg o de una secuencia del gen temprano inmediato CMV de simio, que está operablemente enlazada con el promotor quimérico y que está en corriente descendiente de la secuencia de codificación.
  2. 2. - La construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la secuencia de codificación codifica más de una de la HA, fragmento o variante inmunogénica.
  3. 3.- La construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque la secuencia de codificación codifica una HA, fragmento o variante de cada una de las tres a cinco cepas de influenza diferentes .
  4. 4.- La construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la secuencia de codificación codifica una HA, fragmento o variante de cada una de las tres o cuatro cepas de influenza no-pandémicas .
  5. 5.- La construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la secuencia de codificación codifica una HA, fragmento o una variante de una cepa de influenza pandémica.
  6. 6.- Las partículas portadoras caracterizadas porque están cubiertas con una construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores .
  7. 7.- Las partículas portadoras caracterizadas porque están cubiertas con al menos dos diferentes construcciones de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 1, en donde cada construcción codifica una HA, fragmento o variante de una cepa de influenza diferente.
  8. 8.- Las partículas portadoras de conformidad con la reivindicación 7, caracterizadas porque están cubiertas con de tres a cinco diferentes construcciones.
  9. 9.- Las partículas portadoras de conformidad con la reivindicación 8, caracterizadas porque tres o cuatro de las construcciones codifican una HA, fragmento o variante de diferentes cepas de influenza no pandémicas.
  10. 10.- Las partículas portadoras de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizadas porque están cubiertas con una construcción que codifica un HA, fragmento o variante de la cepa de influenza pandémica.
  11. 11.- Las partículas portadoras de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 6 a 10, caracterizadas porque también están cubiertas con una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia promotora y una secuencia de codificación operablemente enlazada con el promotor, en donde la secuencia de codificación codifica una subunidad de toxina bacteriana de ribosilación ADP, un fragmento de la misma con una actividad adyuvante o una variante de cualquiera de las mismas que tienen actividad adyuvante y que tiene por lo menos 80% de homología de aminoácido con la subunidad o fragmento.
  12. 12.- Las partículas portadoras de conformidad con la reivindicación 11, caracterizadas porque la secuencia promotora es una secuencia promotora quimérica que comprende: (a) una secuencia promotora temprana inmediata del hCMV; (b) el exón 1 y al menos una parte del exón 2 del gen temprano inmediato principal hCMV; y (c) un intrón heterólogo provisto en lugar de la región del intrón A del gen temprano inmediato principal del hCMV.
  13. 13.- Las partículas portadoras de conformidad con la reivindicación 11 o 12, caracterizadas porque la subunidad de toxina bacteriana de ribosilación ADP se selecciona de la subunidad A de toxina de cólera, de la subunidad B de toxina de cólera, de la subunidad A de toxina lábil al calor E. coli y de la subunidad B lábil al colar E. de coli.
  14. 14.- Las partículas portadoras de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 11 a 13, caracterizadas porque la construcción de ácido nucleico comprende dos secuencias de codificación cada una comprendiendo una subunidad, fragmento o variante diferente.
  15. 15.- Las partículas portadoras de conformidad con la reivindicación 14, caracterizadas porque las dos secuencias de codificación codifican la subunidad A de toxina del cólera y la subunidad B de toxina de cólera respectivamente o la subunidad A de toxina lábil al calor E. coli, y la subunidad B lábil al calor E. respectivamente.
  16. 16.- Las partículas portadoras de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, caracterizadas porque la construcción de ácido nucleico además comprende: (a) una secuencia líder no-traducida que se deriva de la secuencia del antígeno HBVpreS2, una secuencia e-antígeno HBV o una secuencia de antígeno de tipo 2gD HSV y que está operablemente enlazada con el promotor quimérico; y (b) una secuencia potenciadora que se deriva de la región no traducida 3' (UTR) de una secuencia HBsAg o la secuencia del gen temprano inmediato CMV de simio, que está operablemente enlazada con el promotor quimérico y que está en dirección 3 'de la secuencia de codificación.
  17. 17.- Las partículas portadoras de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 6 a 16, caracterizadas porque son partículas de oro.
  18. 18.- Un receptáculo de dosificación para un dispositivo de distribución mediado por partícula caracterizado porque comprende partículas cubiertas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 17.
  19. 19.- Un dispositivo de distribución mediado por partículas caracterizado porque está cargado con partículas cubiertas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6 a 17.
  20. 20.- Un dispositivo de distribución mediado por partículas de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque es una jeringa sin aguja.
  21. 21.- Una construcción de ácido nucleico para distribuirla a un sujeto para inducir una respuesta inmune contra el antígeno de hemaglutinina del virus de influenza (HA), caracterizada porque la construcción comprende: (i) una secuencia promotora quimérica que comprende : (a) una secuencia promotora temprana inmediata del hCMV; (b) el exón 1 y por lo menos una parte del exón 2 del gen temprano inmediato principal hCMV; y (c) el intrón heterólogo provisto en lugar de la región del intrón A del gen temprano inmediato principal hCMV; y (iii) una secuencia de codificación operablemente enlazada con el promotor quimérico, donde la secuencia de codificación codifica un antígeno de hemaglutinina del virus de influenza (HA) , un fragmento inmunogénico del mismo o una variante inmunogénica del antígeno o fragmento que tiene por lo menos 80% de homología de aminoácido para el antígeno o fragmento .
  22. 22.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque además comprende: (iii) una secuencia líder no-traducida que se deriva de la secuencia de antígeno HBVpreS2, la secuencia e-antígeno HBV, o la secuencia de antígeno de tipo 2gD HSV y que está operablemente enlazada con el promotor quimérico; o (iv) una secuencia del potenciador que se deriva de la región no traducidas 3' (UTR) de una secuencia HBsAg o de una secuencia del gen temprano inmediato CMV de simio, que está operablemente enlazada con el promotor quimérico y que está en dirección 3' de la secuencia de codificación.
  23. 23.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 21 o 22, caracterizada porque la secuencia de codificación codifica más de una de la HA, fragmento o la variante inmunogénica.
  24. 24.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque la secuencia de codificación codifica una HA, fragmento o variante de cada una de las tres a cinco diferentes cepas de influenza .
  25. 25.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la secuencia de codificación codifica una HA, fragmento o variante de cada una de las tres o cuatro cepas de influenza no pandémicas.
  26. 26.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 25, caracterizada porque la secuencia de codificación codifica una HA, fragmento o variante de una cepa de influenza pandémica .
  27. 27.- Las partículas portadoras caracterizadas porque están cubiertas con una construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26.
  28. 28.- Las partículas portadoras caracterizadas porque están cubiertas con al menos dos diferentes construcciones de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque cada construcción codifica una HA, fragmento o variante de una cepa de influenza diferente.
  29. 29.- Las partículas portadoras de conformidad con la reivindicación 28, caracterizadas porque que están cubiertas con de tres a cinco diferentes construcciones.
  30. 30.- Las partículas portadoras de conformidad con la reivindicación 29, caracterizadas porque tres o cuatro de las construcciones codifican una HA, fragmento o variante de diferentes cepas de influenza no pandémicas.
  31. 31.- Las partículas portadoras de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, caracterizadas porque están cubiertas con una construcción que codifica un HA, fragmento o variante de la cepa de influenza pandémica.
  32. 32.- Las partículas portadoras de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 27 a 31, caracterizadas porque también están cubiertas con una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia promotora y una secuencia de codificación operablemente enlazada con la promotora, en donde la secuencia de codificación codifica una subunidad de toxina bacteriana de ribosilación ADP, un fragmento de la misma con una actividad adyuvante o una variante de cualquiera de las mismas que tienen actividad adyuvante y que tiene por lo menos 80% de homología de aminoácido con la subunidad o fragmento.
  33. 33.- Las partículas portadoras de conformidad con la reivindicación 32, caracterizadas porque la secuencia promotora es una secuencia promotora quimérica que comprende: (a) una secuencia promotora temprana inmediata del hCMV; (b) el exón 1 y al menos una parte del exón 2 del gen temprano inmediato principal hCMV; y (c) un intrón heterólogo provisto en lugar de la región del intrón A del gen temprano inmediato principal del hCMV.
  34. 34.- Las partículas portadoras de conformidad con la reivindicación 32 o 33, caracterizadas porque la subunidad de toxina bacteriana de ribosilación ADP se selecciona de la subunidad A de toxina de cólera, de la subunidad B de toxina de cólera, de la subunidad A de toxina lábil al calor E. coli y de la subunidad B lábil al calor E. de coli.
  35. 35.- Las partículas portadoras de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 32 a 34, caracterizada porque la construcción de ácido nucleico comprende dos secuencias de codificación cada una comprendiendo una subunidad, fragmento o variante diferente.
  36. 36.- Las partículas portadoras de conformidad con la reivindicación 35, caracterizadas porque las dos secuencias de codificación codifican la subunidad A de toxina del cólera y la subunidad B de toxina de cólera respectivamente o la subunidad A de toxina lábil al calor E. coli, y la subunidad B lábil al calor E. respectivamente.
  37. 37.- Las partículas portadoras de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 32 a 36, caracterizadas porque la construcción de ácido nucleico además comprende: (a) una secuencia líder no-traducida que se deriva de la secuencia del antígeno HBVpreS2, una secuencia e-antígeno HBV o una secuencia de antígeno de tipo 2gD HSV y que está operablemente enlazada con el promotor quimérico; y/o (b) una secuencia potenciadora que se deriva la región no traducidas 3' (UTR) de una secuencia HBsAg o la secuencia del gen temprano inmediato CMV de simio, que está operablemente enlazada con el promotor quimérico y que está en corriente descendiente de la secuencia de codificación.
  38. 38.- Las partículas portadoras de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 27 a 37, caracterizadas porque son partículas de oro.
  39. 39. - Un receptáculo de dosificación para un dispositivo de distribución mediado por partícula caracterizado porque comprende partículas cubiertas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 38.
  40. 40.- Un dispositivo de distribución mediado por partículas caracterizado porque está cargado con partículas cubiertas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 27 a 38.
  41. 41.- Un dispositivo de distribución mediado por partículas de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque es una jeringa sin aguja.
  42. 42.- Una construcción de ácido nucleico caracterizada porque comprende una secuencia promotora quimérica y una secuencia de codificación operablemente enlazada con el promotor quimérico, en donde la secuencia de codificación codifica un antígeno del virus de influenza, un fragmento inmunogénico del mismo o una variante inmunogénica del antígeno o fragmento que tiene al menos 80% de homología de aminoácido al antígeno o fragmento y la secuencia promotora quimérica comprende: (a) una secuencia promotora temprana inmediata del hCMV; (b) el exón 1 y al menos una parte del exón 2 del gen temprano inmediato principal hCMV; y (c) un intrón heterólogo provisto en el lugar de la región del intrón A del gen temprano inmediato principal hCMV.
  43. 43.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 42 caracterizada porque el antígeno codificado es hemaglutinina de influenza (HA) , un fragmento inmunogénico del mismo o una variante inmunogénica con al menos 80% homología de secuencia de aminoácido a cualquiera .
  44. 44.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque el antígeno codificado es neuraminidasa de influenza (NA), M2 , un fragmento inmunogénico de ambos o una variante inmunogénica que tiene al menos 80% de homología de secuencia de aminoácido a cualquiera de NA, M2 o fragmento.
  45. 45.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 a 44, caracterizada porque el antígeno de influenza, el fragmento inmunogénico o la variante es de una cepa de influenza pandémica .
  46. 46.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 42 a 45, caracterizada porque la construcción codifica más de un antígeno de influenza, un fragmento inmunogénico o una variante inmunogénica.
  47. 47.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque la construcción codifica un antígeno de influenza pandémica, un fragmento inmunogénico del mismo, o una variante inmunogénica del antígeno o fragmento y uno o más antígenos de influenza no pandémicos, fragmento (s) inmunogénico del mismo o variante (s) inmunogénica del antígeno (s) o fragmento ( s) .
  48. 48.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 46 o 47, caracterizado porque al menos dos de los diferentes antígenos, fragmentos o variantes codificados son del mismo polipéptido de influenza de diferentes cepas del virus de influenza.
  49. 49.- Una construcción de ácido nucleico caracterizada porque comprende una secuencia promotora quimérica y una secuencia de codificación operablemente enlazada con el promotor quimérico, en donde la secuencia de codificación codifica una subunidad de toxina bacteriana de ribosilación ADP, un fragmento de la misma con una actividad adyuvante o una variante de cualquiera de estos que tiene actividad adyuvante y que tiene al menos 80% de homología de aminoácido con la subunidad o fragmento y la secuencia promotora quimérica comprende: (a) una secuencia promotora temprana inmediata del hCMV; (b) el exón 1 y al menos una parte del exón 2 del gen temprano inmediato principal hCMV; y (c) un intrón heterólogo provisto en lugar de la región del intrón A del gen temprano inmediato principal hCMV.
  50. 50.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque la subunidad de toxina bacteriana de ribosilación ADP se selecciona de la subunidad A de toxina de cólera, la subunidad B de toxina de cólera, la subunidad A de toxina lábil al calor E. coli, y la subunidad B lábil al calor E. coli .
  51. 51.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 49 o 50, caracterizada porque la construcción de ácido nucleico comprende dos secuencias de codificación con cada una comprendiendo una subunidad diferente, fragmento o variante y cada una operablemente enlazada al promotor quimérico.
  52. 52.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 51, caracterizada porque las dos secuencias de codificación codifican una subunidad A de toxina de cólera, y una subunidad B de toxina de cólera respectivamente o una subunidad A de toxina lábil al calor E. coli y la subnidad B lábil al calor E. coli respectivamente.
  53. 53.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 51 o 52, caracterizada porque las dos secuencias de codificación están en orientación inversa.
  54. 54.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 51 o 52, caracterizada porque las dos secuencias de codificación están en la misma orientación .
  55. 55.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 42 a 54, caracterízada porque la secuencia promotora temprana inmediata hCMV (a) comprende: (i) la secuencia de nucleótido de SEC ID NO:l, los nucleótidos 903 a 1587 de SEC ID NO:54, los nucleótidos 1815 a 1935 de SEC ID NO: 65, los nucleótidos 1948 a 2632 de SEC ID NO: 61, los nucleótidos 1002 a 1686 de SEC ID NO: 62 y/o los nucleótidos 2624 a 3308 de SEC ID NO: 62; (ii) una variante funcional de (i) que tiene al menos 80% de homología de secuencia de nucleótidos a una o más de las secuencias de (i); o (iii) un fragmento funcional de (i) o de (ii) .
  56. 56.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 42 a 55, caracterizada porque la secuencia de exón (b) comprende: (i) la secuencia de nucleótido de SEC ID NO:2, la secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 1588 a 1718 de SEC ID NO:54, los nucleótidos 1684 a 1814 de SEC ID NO: 61, los nucleótidos 2633 a 2763 de SEC ID NO: 61, los nucleótidos 1687 a 1817 del SEC ID NO: 62 y/o los nucleótidos 3309 a 3439 de SEC ID NO: 62; (ii) una variante funcional de (i) que tiene por al menos 80% homología de secuencia de nucleótidos a una o más de las secuencias de (i); o (iii) el fragmento funcional de (i) o de (ii) .
  57. 57.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 a 56, caracterizada porque el intrón heterólogo (c) comprende una secuencia seleccionada de la secuencia del intrón A del gen de insulina de rata, de la secuencia del intrón A del gen de queratina de pollo, la secuencia del intrón A del gen de actinia cardiaca de pollo, un fragmento funcional de cualquiera de estos o de una variante funcional de cualquiera de los anteriores.
  58. 58.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 57, caracterizada porque la secuencia del intrón A del gen de insulina de rata comprende: (i) la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 3, la secuencia de nucleótidos de 1725 a 1857 de SEC ID NO: 54, los nucleótidos 1545 a 1677 de SEC ID NO: 61, los nucleótidos 2770 a 2902 de SEC ID NO: 61, los nucleótidos 1824 a 1956 de SEC ID NO: 62 y/o los nucleótidos 3446 a 3578 de SEC ID NO: 62; (ii) una variante funcional de (i) que tiene al menos 80% de homología de secuencia de nucleótido a una o más de las secuencias de (i); o (iii) un fragmento funcional de (i) o de (ii) .
  59. 59.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 a 58, caracterizada porque la secuencia promotora quimérica comprende: (i) la secuencia de nucleótido de SEC ID NO: 4 o la secuencia de nucleótido de los nucleótidos 903 a 1857 de SEC ID NO:54; (ii) una variante funcional de (i) que tiene al menos 80% de homología de secuencia de nucleótido a (i); o (iii) un fragmento funcional de (i) o (ii) .
  60. 60.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 42 a 59, caracterizada porque además comprende: (a) una secuencia líder no-traducida que se deriva de la secuencia de antígeno HBVpreS2, la secuencia e-antígeno HBV o la secuencia de antígeno del tipo 2gD HSB y que está en enlace operable con la promotora quimérica; y/o (b) una secuencia potenciadora que se deriva de la región no traducida 3' (UTR) de una secuencia de HBsAg o de una secuencia del gen inmediato temprano CMV de simio y que está operablemente enlazada con el promotor quimérico, en donde la secuencia potenciadora está en dirección 3' del sitio de clonación.
  61. 61.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque comprende : (i) la secuencia del vector pPJV7563 provisto como SEC ID NO: 14, o (ii) una secuencia con al menos 60% de identidad de secuencia con la secuencia de (i); y la secuencia que codifica el antígeno, fragmento o variante se provee en la secuencia (i) o (ii) de tal forma que está operablemente enlazada al promotor quimérico.
  62. 62.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque la secuencia de codificación codifica un antígeno HA, una variante inmunogénica del mismo, o un fragmento inmunogénico de cualquiera.
  63. 63.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque comprende la secuencia del vector pPJV1671 provisto como SEC ID NO: 54 o una secuencia con al menos 60% de identidad de secuencia al mismo.
  64. 64.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque comprende la secuencia del vector pPML7789 provisto como SEC ID NO: 59 o una secuencia con al menos 60% de identidad de secuencia al mismo.
  65. 65.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque comprende la secuencia del vector pPJV2012 provisto como SEC ID NO: 61 o una secuencia con al menos 60% de identidad de secuencia al mismo.
  66. 66.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 49, caracterizada porque comprende la secuencia del vector pPJV7788 provisto como SEC ID NO: 62 o una secuencia con al menos 60% de identidad de secuencia al mismo.
  67. 67.- Una construcción de ácido nucleico caracterizada porque comprende una secuencia promotora y una secuencia de codificación operablemente enlazada al promotor, en donde la secuencia de codificación codifica un antígeno de virus de influenza, un fragmento inmunogénico del mismo o una variante inmunogénica del antígeno o fragmento que tiene al menos 80% de homología de aminoácido al antígeno o fragmento y la construcción además comprende: (a) una secuencia líder no-traducida que se deriva de la secuencia de antígeno HBVpreS2, la secuencia e-antígeno HBV o la secuencia de antígeno del tipo 2gD HSV, que está operablemente enlazada a la secuencia de codificación y al promotor que es heterólogo a la secuencia de codificación; y/o (b) la secuencia potenciadora 3' de y operablemente enlazada a la secuencia de codificación, en donde la secuencia potenciadora se deriva de un UTR 3' de una secuencia HBsAg o de una secuencia del gen temprano inmediato CMV de simio, y la secuencia de codificación es heteróloga a la secuencia potenciadora 3'.
  68. 68.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 67, caracterizada porque el antígeno codificado es hemaglutinina de influenza (HA) , un fragmento inmunogénico de la misma o una variante inmunogénica con al menos 80% de homología de secuencia de aminoácido a cualquiera.
  69. 69.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 67, caracterizada porque el antígeno codificado es neuraminidasa de influenza (NA) o M2, un fragmento inmunogénico de cualquiera o una variante inmunogénica con al menos 80% de homología de la secuencia de aminoácido al NA, M2 o fragmento.
  70. 70.- Un ácido nucleico de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 67 a 69, caracterizado porque el antígeno de influenza codificado, el fragmento inmunogénico del mismo, o la variante inmunogénica de cualquiera es de una cepa de influenza pandémica.
  71. 71.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 67 a 70, caracterizada porque la construcción codifica más de un antígeno de influenza, un fragmento inmunogénico o una variante inmunogénica.
  72. 72.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 71, caracterizada porque la construcción codifica un antígeno de influenza pandémica, un fragmento inmunogénico del mismo, o una variante inmunogénica del antígeno o fragmento y uno o más antígenos de influenza no pandémicos, fragmento (s) inmunogénico del mismo o variante(s) inmunogénica del antígeno(s) o fragmento (s ) .
  73. 73.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 71 o 72, caracterizado porque al menos dos de los diferentes antígenos, fragmentos o variantes codificados son del mismo polipéptido de influenza de diferentes cepas del virus de influenza.
  74. 74.- Una construcción de ácido nucleico caracterizada porque comprende una secuencia promotora y una secuencia de codificación operablemente enlazada al promotor, en donde la secuencia de codificación codifica una subunidad de toxina bacteriana de ríbosilación ADP, un fragmento de la misma con una actividad adyuvante o una variante de cualquiera de estos que tiene actividad adyuvante y que tiene al menos 80% de homología de aminoácido con la subunidad o fragmento y la construcción además comprende: (a) una secuencia líder no-traducida que se deriva de la secuencia del antígeno HBVpreS2, una secuencia de e-antígeno HBV o una secuencia del antígeno de tipo 2gD HSV y que está operablemente enlazada con la secuencia de codificación y el promotor que es heterólogo a la secuencia de codificación; y (b) una secuencia potenciadora 3' de y operablemente enlazada a la secuencia de codificación, en donde la secuencia potenciadora se deriva de un UTR 3' de la secuencia HBsAg o una secuencia del gen temprano inmediato CMV de simio, y la secuencia de codificación es heteróloga a la secuencia potenciadora 3 ' .
  75. 75.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 74, caracterizado porque la subunidad de toxina bacteriana de ribosilación ADP se selecciona de la subunidad A de toxina de cólera, la subunidad B de toxina de cólera, la subunidad A de toxina lábil al calor E. coli, y la subunidad B lábil al calor E. coli .
  76. 76.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 74 o 75, caracterizada porque la construcción de ácido nucleico comprende dos secuencias de codificación con cada una comprendiendo una subunidad diferente, fragmento o variante y cada una operablemente enlazada al promotor quimérico.
  77. 77.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 76, caracterizada porque las dos secuencias de codificación codifican una subunidad A de toxina de cólera, y una subunidad B de toxina de cólera respectivamente o una subunidad A de toxina lábil al calor E. coli y la subnidad B lábil al calor E. coli respectivamente.
  78. 78.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 76 o 77, caracterizada porque las dos secuencias de codificación están en orientación inversa.
  79. 79.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 76 o 77, caracterizada porque las dos secuencias de codificación están en la misma orientación .
  80. 80.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 67 a 79, caracterizada porque el promotor se selecciona de la secuencia promotora temprana inmediata hCMV, la secuencia promotora del virus de Pseudorabia y la secuencia promotora del virus de sarcoma Rous.
  81. 81.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 67 a 80, caracterizada porque la secuencia líder no-traducida comprende : (i) la secuencia de nucleótidos SEC ID NO: 5, SEC ID NO: 6, SEC ID NO:7 o los nucleótidos 1864 a 1984 de SEC ID NO: 54; (ii) una variante funcional de (i) que tiene que tiene al menos 80% de homología de secuencia de nucleótido a ( i ) ; o (iii) un fragmento funcional de (i) o (ii) .
  82. 82.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 67 a 81, caracterizada porque la secuencia potenciadora comprende: (i) la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 8, SEC ID NO: 9, los nucleótidos 3699 a 4231 de SEC ID NO:54, los nucleótidos 3831 a 4363 de SEC ID NO:61 y/o 4507 a 5038 de SEC ID NO: 62; (ii) una variante funcional de (i) que tiene al menos 80% de homología de secuencia de nucleótidos a secuencia (i) ; o (iii) un fragmento funcional de (i) o de (ii) .
  83. 83.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 42 a 82, caracterizada porque además comprende una secuencia del poliadenilación.
  84. 84.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 83, caracterizada porque la secuencia del poliadenilación es una secuencia de poliadenilación de un gen seleccionado de un gen de betaglobina de conejo, un gen temprano o tardío del virus humano de papiloma (HPV) , el gen HSV-2gB, el gen temprano inmediato CMV de simio y el gen tardío HSVgD.
  85. 85.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 83, caracterizada porque la secuencia de poliadenilación se selecciona de: (i) la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 10, SEC ID NO:ll, SEC ID NO:12, SEC ID NO:13, los nucleótidos 4243 a 4373 de SEC ID NO:54, los nucleótidos 906 a 1038 de SEC ID NO: 61, los nucleótidos 4375 a 4050 de SEC ID NO: 61 o los nucleótidos 2463 a 2593 de SEC ID NO: 62; (ii) una variante funcional de (i) que tiene al menos un 80% de homología de secuencia de nucleótidos a la secuencia dicha (i); o (iii) un fragmento funcional de (i) o (ii).
  86. 86.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada porque comprende la secuencia de SEC ID NO: 14.
  87. 87.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 42 a 86, caracterizada porque además comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido de señal que está operablemente enlazado a la secuencia de codificación del antígeno, la subunidad de exotoxina, fragmento o la variante.
  88. 88.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 87, caracterizada porque el péptido de señal se selecciona del péptido de señal activador de plasminógeno de tejido humano (hTPAsp), el péptido de señal de aprotinina, el péptido de señal de extensina de tabaco y el péptido de señal de lisozima de pollo .
  89. 89.- Una construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 42 a 88, caracterizada porque es un plásmido.
  90. 90.- Una población de construcciones de ácido nucleico caracterizada porque la población comprende por lo menos dos diferentes construcciones de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 a 89.
  91. 91.- Una población de construcciones de ácido nucleico caracterizada porque comprende por lo menos dos diferentes construcciones de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 a 48, 61 a 64 y 67 a 73 que codifican diferentes antígenos de influenza, fragmentos inmunogénicos de los mismos o variantes inmunogénicas de los antígenos o fragmentos .
  92. 92.- Una población de las construcciones de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 91, caracterizada porque comprende por lo menos tres diferentes construcciones, cada una codificando un antígeno de influenza, fragmento inmunogénico o variante inmunogénica diferente .
  93. 93.- Una población de las construcciones de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 91 o 92, caracterizada porque al menos dos de los diferentes antígenos son del mismo polipéptido de influenza de diferentes cepas influenza .
  94. 94.- Una población de las construcciones de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 91 a 93, caracterizada porque al menos dos de los diferentes antígenos, fragmentos o variantes son de diferentes polipéptidos de influenza de la misma o diferente cepa de influenza .
  95. 95.- Una población de las construcciones de ácido nucleico según de las reivindicaciones 90 a 94, caracterizada porque comprende al menos una construcción de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 49 a 54, 65, 66 y 74 a 79 que codifican la subunidad de toxina bacteriana de ribosilación ADP, un fragmento de la misma o variante de la misma .
  96. 96.- Una población de construcciones de ácido nucleico caracterizada porque: (i) al menos una construcción codifica una subunidad de toxina bacteriana de ribosilación ADP, un fragmento de de la misma con actividad adyuvante o una variante de cualquiera que tiene actividad adyuvante y tiene por lo menos 80% de homología de aminoácido a la subunidad o fragmento; y (ii) por lo menos una construcción que codifica un antígeno de virus de herpes simple (HSV) ; en donde la secuencia que codifica la subunidad, fragmento o variante y/o el antígeno HSV está operablemente enlazada a un promotor quimérico que comprende: (a) la secuencia promotora temprana inmediata hCMV; (b) el exón 1 y al menos parte del exón 2 del gen temprano inmediato principal hCMV; y (c) el intrón heterólogo provisto en lugar de la región del intrón A del gen temprano inmediato principal hCMV.
  97. 97.- Una población de construcciones de ácido nucleico caracterizada porque donde: (i) por lo menos una construcción que codifica una subunidad de toxina bacteriana de ribosilación ADP, un fragmento de la misma con actividad adyuvante o una variante de cualquiera que tiene actividad adyuvante y que tiene por lo menos 80% de homología de aminoácido a la subunidad o fragmento; y (ii) por lo menos una construcción que codifica un antígeno HSV, en donde al menos una de dichas construcciones además comprende: (a) una secuencia líder no-traducida que se deriva de la secuencia del antígeno HBVpreS2, una secuencia e-antígeno HBV o una secuencia del antígeno de tipo 2gD HSV y que está operablemente enlazada con la secuencia de codificación y el promotor que es heterólogo a la secuencia de codificación; y (b) una secuencia potenciadora 3' de y operablemente enlazada a la secuencia de codificación, en donde la secuencia potenciadora se deriva de un UTR 3' de la secuencia HBsAg o una secuencia del gen temprano inmediato CMV de simio, y la secuencia de codificación es heteróloga a la secuencia potenciadora 3' .
  98. 98.- Una población deconstrucciones de ácido nucleico caracterizada porque comprende: (i) una primera construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia promotora quimérica y una secuencia de codificación operablemente enlazada al promotor quimérico, en donde la secuencia de codificación codifica una subunidad de toxina bacteriana de ribosilación ADP, un fragmento de la misma con actividad adyuvante o una variante de cualquiera que tiene actividad adyuvante y que tiene por lo menos 80% de homología de aminoácido a la subunidad o fragmento y la secuencia promotora quimérica comprende: (a) una secuencia promotora temprana inmediata hCMV; (b) el exón 1 y por lo menos parte del exón 2 del gen temprano inmediato principal hCMV; y (c) un intrón heterólogo provisto en lugar de la región del intrón A del gen temprano inmediato principal hCMV; y (ii) una segunda construcción de ácido nucleico que codifica por lo menos un antígeno HSV.
  99. 99.- Una población de construcciones de ácido nucleico caracterizada porque comprende: (i) una primera construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia promotora y una secuencia de codificación operablemente enlazada al promotor, en donde la secuencia de codificación codifica una subunidad de toxina bacteriana de ribosilación ADP,, un fragmento de la misma con actividad adyuvante o una variante de cualquiera que tiene actividad adyuvante y que tiene al menos 80% de homología de aminoácido para la subunidad o fragmento y la construcción además comprende: (a) una secuencia líder no-traducida que se deriva de la secuencia del antígeno HBVpreS2, una secuencia e-antígeno HBV o una secuencia del antígeno de tipo 2gD HSV y que está operablemente enlazada con la secuencia de codificación y el promotor que es heterólogo a la secuencia de codificación; y (b) una secuencia potenciadora 3' de y operablemente enlazada a la secuencia de codificación, en donde la secuencia potenciadora se deriva de un UTR 3' de la secuencia HBsAg o una secuencia del gen temprano inmediato CMV de simio, y la secuencia de codificación es heteróloga a la secuencia potenciadora 3' . (ii) una segunda construcción de ácido nucleico que codifica por lo menos un antígeno HSV.
  100. 100.- Una población de construcciones de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 99, caracterizada porque comprende: (i) una primera construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia del vector pPJV2012 provisto por SEC ID NO: 61 o una secuencia con al menos 60% identidad de la secuencia del mismo; y (ii) una segunda construcción de ácido nucleico que codifica un antígeno HSV.
  101. 101.- Una secuencia promotora quimérica aislada purificada caracterizada porque la secuencia promotora quimérica es una definida en cualquiera de las reivindicaciones 42 y 55 a 57.
  102. 102.- Las partículas cubiertas caracterizadas porque comprenden partículas portadoras cubiertas con una construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 a 89 o una población de construcciones de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 90 a 100.
  103. 103.- Las partículas cubiertas de conformidad con la reivindicación 102, caracterizadas porque las partículas cubiertas son partículas de oro.
  104. 104.- Un receptáculo de dosificación para un dispositivo de distribución mediado por partícula caracterizado porque comprende partículas cubiertas como se define en la reivindicación 102 o 103.
  105. 105.- Un dispositivo de distribución mediado por partículas caracterizado porque está cargado con partículas cubiertas de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 102 o 103.
  106. 106.- Un dispositivo de distribución mediado por partículas de conformidad con la reivindicación 105, caracterizado porque es una jeringa sin aguja.
  107. 107.- Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende una construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 a 89 o una población de construcciones de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de reivindicaciones 90 a 100 junto con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
  108. 108.- Una composición de vacuna caracterizada porque comprende una construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 a 89 o una población de construcciones de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 90 a 100.
  109. 109.- Una composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 108, caracterizada porque es una vacuna multivalente que comprende al menos dos diferentes construcciones de conformidad con cualquiera reivindicaciones 42 a 48, 61 a 64, y 67 a 73 que codifican diferentes antígenos de influenza, frajmentos inmunogénicos de los mismos, o variantes inmunogénicas de cualquiera de estos.
  110. 110.- Una composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 109, caracterizada porque es una vacuna de influenza trivalente, tetravalente o pentavalente.
  111. 111.- El uso de una construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 a 89, de una población de construcciones de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 90 a 95 o partículas cubiertas de conformidad con las reivindicaciones 102 o 103 en la fabricación de un medicamento para la prevención de influenza.
  112. 112.- El uso de conformidad con la reivindicación 111, en donde el medicamento se va a distribuir a través de inyección, distribución de partícula transdérmica, inhalación, tópicamente, oralmente, íntranasalmente, o transmucosalmente .
  113. 113.- El uso de conformidad con la reivindicación 111 o 112, en donde los medicamentos se van a distribuir a través de inyección sin aguja.
  114. 114.- Un método in vi tro para la obtención de la expresión en células de mamífero de un polipéptido de influenza del interés, caracterizado porque comprende transferir en las células una construcción de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 42 a 89, de una población de construcciones de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 90 a 95 o partículas cubiertas de conformidad con las reivindicación 102 o 103.
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