KR20070100403A - 핵산 구조물 - Google Patents

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KR20070100403A
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파우더젝트 백신, 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 (a) hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열; (b) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 엑손 1 및 적어도 일부의 엑손 2; 및 (c) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 인트론 A 영역 대신에 제공된 이종성 인트론을 포함하는 키메릭 프로모터 서열 및 키메릭 프로모터와의 작동가능한 연결로 코딩 서열을 삽입하기 위한 클로닝 부위를 포함하는 핵산 구조물에 관한 것이다.
핵산 구조물, hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열, 키메릭 프로모터 서열, 면역화, 엑손, 인트론

Description

핵산 구조물 {NUCLEIC ACID CONSTRUCTS}
본 발명은 분자 생물학 및 면역학 분야에 관한 것으로서, 일반적으로 핵산 면역화 기술에 유용한 제제에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 폴리펩티드 및 그 중에서도 항원성 폴리펩티드, 특히 인플루엔자 항원의 발현 뿐만 아니라, 아쥬반트 폴리펩티드의 발현을 위한 핵산 구조물 및 이러한 제제를 사용한 핵산 면역화 방법에 관한 것이다.
유전자 요법 및 핵산 면역화는 후천성 및 선천성 질환 둘다의 치료 및 예방을 위한 기대되는 접근법이다. 이들 기술은 목적하는 핵산을 대상체에 전달하고 이어서 생체내에서 발현시키는 것을 제공한다. 전달은 대상체의 세포 또는 조직을 생체외에서 형질감염시키고 형질전환된 물질을 숙주에 재도입함으로써 수행될 수 있다. 별법으로, 핵산을 수용체에 직접적으로 생체내 투여할 수 있다.
이러한 기술은 각각 충분량의 치료 또는 항원 유전자 산물을 제공하기 위해 형질감염된 세포에서 핵산의 효과적인 발현을 필요로 한다. 형질감염 효율, 해당 유전자 또는 서열이 전사되고 mRNA가 번역되는 효율을 비롯한, 다수의 인자가 수득되는 발현 수준에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.
수많은 발현 시스템이 당업계에 개시되어 있으며, 통상적으로 이들은 각각 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된 해당 유전자 또는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터로 이루어져 있다. 이들 조절 서열은 전사 프로모터 서열, 및 전사 개시 및 종결 서열을 포함한다. 포유동물 세포 발현 시스템에 통상 사용되는 프로모터는 그 중에서도 특히 SV40 초기 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 예를 들어 CMV 즉시형 초기 (immediate early) 프로모터 (문헌 [Chapman et al (1991) Nucl. Acids Res. 19: 3979-3986]), 마우스 유방 종양 바이러스 긴 말단 반복 (LTR) 프로모터, 아데노바이러스 주요 말기 프로모터 (Ad MLP) 및 단순 포진 바이러스 (herpes simplex virus: HSV) 프로모터를 포함한다. 비-바이러스성 프로모터, 예를 들어 뮤린 메탈로티오네인 유전자로부터 유도된 프로모터도 일반적으로 사용된다.
발현 시스템은 종종 전사 조절자 요소 ("인핸서"라 함)를 포함한다. 인핸서는 광범위하게 프로모터/유전자 서열에 작동가능하게 연결되었을 때 그 유전자 서열의 전사를 증가시키는 시스-작용제 (cis-acting agent)로서 정의된다. 인핸서는 다른 발현 조절 요소 (예: 프로모터)보다 해당 서열로부터 훨씬 더 떨어진 위치에서 기능할 수 있으며, 해당 서열에 대해 어떤 배향으로 위치하여도 작동할 수 있다 (문헌 [Banerji et al. (1981) Cell 27: 299-308], 문헌 [deVilleirs et al. (1981) Nucl. Acids Res 9: 6251-6264]). 폴리오마 바이러스, BK 바이러스, 사이토메갈로바이러스 (CMV), 아데노바이러스, 원숭이 바이러스 40 (SV40), 몰로니 육종 바이러스, 소 유두종 바이러스 및 로우즈 육종 바이러스를 비롯한 다수의 바이러스 공급원으로부터의 인핸서가 확인되었다 (상기 드빌레르(deVilleirs) 등의 문 헌, 문헌 [Rosenthal et al. (1983) Science 222: 749-755], 문헌 [Hearing et al. (1983) Cell 33: 695-703], 문헌 [Weeks et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 1222-1234], 문헌 [Levinson et al. (1982) Nature 295: 568-572], 및 문헌 [Luciw et al. (1983) Cell 33: 705-716]).
핵산 면역화 및 유전자 요법을 위한 수많은 발현 시스템은 hCMV 즉시형 초기 프로모터를 사용한다. 예를 들어, 미국 특허 제5168062호 및 제5385839호 (Stinski) 및 EP 특허 제0323997 B1호를 참조한다. hCMV 즉시형 초기 프로모터를 사용하는 발현 벡터는, 예를 들어 pWRG7128 (문헌 [Roy et al, Vaccine 19,764-778, 2001]), 및 pBC12/CMV 및 pJW4303 (국제 공개 번호 WO 95/20660에서 언급됨)을 포함한다. 챕먼 (Chapman) 등 (1991)은 hCMV 인트론 A의 부재하에서 hCMV 즉시형 초기 프로모터로부터의 발현 수준 감소를 보고하였다.
<발명의 요약>
숙주 세포에서 이종성 코딩 서열의 발현 증대를 제공하는 조작된 바이러스 프로모터/발현 서열을 사용하여 핵산 구조물을 개발하였다. 구조물은 유전자 및 그 중에서도 항원-코딩 유전자의 효과적인 발현에 적합하여, 핵산 면역화에 사용될 수 있다. 구조물은 또한 아쥬반트 폴리펩티드를 발현시키는데 사용될 수 있다. 구조물은 입자-매개형 핵산 면역화에 사용하기 위해 캐리어 입자 상에 제공될 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 구조물은 인플루엔자 항원, 그의 면역원성 단편 또는 이들의 면역원성 변이체를 코딩한다. 추가로 특히 바람직한 실시양태에서, 구조물은 아쥬반트 폴리펩티드를 코딩한다.
따라서, 본 발명은
(i) (a) hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열;
(b) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 엑손 1 및 적어도 일부의 엑손 2; 및
(c) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 인트론 A 영역 대신에 제공된 이종성 인트론
을 포함하는 키메릭 프로모터 서열;
(ii) 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 항원, 그의 면역원성 단편, 또는 상기 항원 또는 단편과 80％ 이상의 아미노산 상동성을 갖는 상기 항원 또는 단편의 면역원성 변이체를 코딩하는, 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결된 코딩 서열;
(iii) HBVpreS2 항원 서열, HBV e-항원 서열 또는 HSV 타입 2gD 항원 서열로부터 유도되고 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결된 비-번역 리더 서열; 및
(iv) HBsAg 서열 또는 원숭이 CMV 즉시형 초기 유전자 서열의 3' 비번역 영역 (UTR)으로부터 유도되고, 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결되며, 코딩 서열의 하류에 있는 인핸서 서열
을 포함하는, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 대상체에 전달하기에 적합한 핵산 구조물을 제공한다.
또한, 본 발명은
(i) (a) hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열;
(b) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 엑손 1 및 적어도 일부의 엑손 2; 및
(c) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 인트론 A 영역 대신에 제공된 이종성 인트론
을 포함하는 키메릭 프로모터 서열; 및
(ii) 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 항원, 그의 면역원성 단편, 또는 상기 항원 또는 단편과 80％ 이상의 아미노산 상동성을 갖는 상기 항원 또는 단편의 면역원성 변이체를 코딩하는, 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결된 코딩 서열
을 포함하는, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 대상체에 전달하기에 적합한 핵산 구조물을 제공한다.
추가로, 본 발명은
(a) hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열;
(b) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 엑손 1 및 적어도 일부의 엑손 2; 및
(c) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 인트론 A 영역 대신에 제공된 이종성 인트론
을 포함하는 키메릭 프로모터 서열 및 키메릭 프로모터와의 작동가능한 연결로 코딩 서열을 삽입하기 위한 클로닝 부위를 포함하는 핵산 구조물을 제공한다.
바람직한 예에서, 구조물은 클로닝 부위에 삽입된 코딩 서열을 포함한다. 따라서, 코딩 서열이 클로닝 부위에서 제공될 수 있다.
추가로 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 구조물은
(a) HBVpreS2 항원 서열, HBV e-항원 서열 또는 HSV 타입 2gD 항원 서열로부터 유도되고 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결된 비-번역 리더 서열; 및/또는
(b) HBsAg 서열의 3' 비번역 영역 (UTR) 또는 원숭이 CMV 즉시형 초기 유전자 서열의 3'UTR로부터 유도되고, 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결되며, 클로닝 부위의 하류에 있는 인핸서 서열
을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 프로모터 서열 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하는 핵산 구조물을 제공하고, 상기 구조물은
(a) HBVpreS2 항원 서열, HBV e-항원 서열 또는 HSV 타입 2gD 항원 서열로부터 유도되고, 코딩 서열 및 코딩 서열에 대해 이종성인 프로모터와 작동가능하게 연결된 비-번역 리더 서열; 및/또는
(b) 코딩 서열의 3'에 존재하고 이에 작동가능하게 연결된 인핸서 서열을 더 포함하고, 상기 인핸서 서열은 HBsAg 서열의 3'UTR 또는 원숭이 CMV 즉시형 초기 유전자 서열의 3'UTR로부터 유도되고, 상기 코딩 서열은 3' 인핸서 서열에 대해 이종성이다.
본 발명은 또한
(i) (a) hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열;
(b) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 엑손 1 및 적어도 일부의 엑손 2; 및
(c) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 인트론 A 영역 대신에 제공된 이종성 인트론
을 포함하는 키메릭 프로모터 서열;
(ii) 키메릭 프로모터와의 작동가능한 연결로 코딩 서열을 삽입하기 위한 클로닝 부위;
(iii) (a) HBVpreS2 항원 서열, HBV e-항원 서열 또는 HSV 타입 2gD 항원 서열로부터 유도되고 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결된 비-번역 리더 서열; 및/또는
(b) HBsAg 서열의 3' 비번역 영역 (UTR) 또는 원숭이 CMV 즉시형 초기 유전자 서열의 3'UTR로부터 유도되고, 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결되며, 클로닝 부위의 하류에 있는 인핸서 서열
을 포함하는 핵산 구조물을 제공한다.
본 발명은 또한
(i) 프로모터 서열;
(ii) HBVpreS2 항원 서열, HBV e-항원 서열 또는 HSV 타입 2gD 항원 서열로부터 유도된 비-번역 리더 서열; 및
(iii) (i) 및 (ii)와 작동가능하게 연결된 코딩 서열
을 포함하고, 상기 코딩 서열은 비-번역 리더 서열에 대해 이종성인 핵산 구조물을 제공한다.
본 발명은 또한
(i) 프로모터 서열;
(ii) 프로모터 서열 (i)과 작동가능하게 연결된 코딩 서열; 및
(iii) 코딩 서열 (ii)의 3'에 존재하고 이에 작동가능하게 연결된 인핸서 서열
을 포함하고, 상기 인핸서 서열 (iii)은 HBsAg 서열의 3'UTR 또는 원숭이 CMV 즉시형 초기 유전자 서열의 3'UTR로부터 유도되고, 상기 코딩 서열 (ii)는 3' 인핸서 서열에 대해 이종성인 핵산 구조물을 제공한다.
본 발명은 또한 프로모터 서열 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하는 핵산 구조물을 제공하고, 상기 구조물은
(a) HBVpreS2 항원 서열, HBV e-항원 서열 또는 HSV 타입 2gD 항원 서열로부터 유도되고, 코딩 서열 및 코딩 서열에 대해 이종성인 프로모터와 작동가능하게 연결된 비-번역 리더 서열; 및/또는
(b) 코딩 서열의 3'에 존재하고 이에 작동가능하게 연결된 인핸서 서열을 더 포함하고, 상기 인핸서 서열은 HBsAg 서열의 3'UTR 또는 원숭이 CMV 즉시형 초기 유전자 서열의 3'UTR로부터 유도되고, 상기 코딩 서열은 3' 인핸서 서열에 대해 이종성이다.
본 발명은 추가로 본 발명의 2개 이상의 상이한 구조물을 포함하는 핵산 구조물의 집합체를 제공한다.
또다른 예에서, 본 발명은
(a) hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열;
(b) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 엑손 1 및 적어도 일부의 엑손 2; 및
(c) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 인트론 A 영역 대신에 제공된 이종성 인트론
을 포함하는, 정제되고 단리된 키메릭 프로모터 서열을 제공한다.
본 발명은 또한
- 본 발명의 핵산 구조물, 핵산 구조물의 집합체 또는 코팅된 입자를 포유동물 세포에 전달하는 것을 포함하는, 포유동물 세포에서 해당 폴리펩티드의 발현을 수득하는 방법;
- 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 서열을 포함하는 본 발명의 핵산 구조물로 코팅된 캐리어 입자를 포함하는, 입자-매개형 전달 기구로부터의 전달에 적합한 코팅된 입자;
- 코팅된 입자를 포함하는 입자 매개형 전달 기구를 위한 투여 용기;
- 코팅된 입자를 부하한 입자 매개형 전달 기구;
- 유효량의 본 발명의 코팅된 입자를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 핵산 면역화 방법;
- 본 발명의 핵산 구조물 또는 본 발명의 핵산 구조물의 집합체를 제약상 허용되는 캐리어 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물;
- 본 발명의 핵산 구조물 또는 본 발명의 핵산 구조물의 집합체 또는 본 발명의 코팅된 입자를 포함하는 백신 조성물
을 제공한다.
또한 핵산 면역화를 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 핵산 구조물, 본 발명의 핵산 구조물의 집합체 또는 본 발명의 코팅된 입자의 용도가 제공된다.
본 발명의 상기 및 기타 목적, 측면, 실시양태 및 이점이 본원의 기술내용에 비추어 당업자에게 쉽게 이해될 것이다.
도 1은 다양한 플라스미드 발현 벡터를 사용하여 수득되는 B형 간염 바이러스 표면 항원 (HBsAg)의 발현 수준을 나타낸다.
도 2는 SCC15 세포에서의 HBsAg의 발현 및 B16 세포에서의 β-gal의 발현에 있어서 인트론 포함의 효과를 나타낸다 (3회 실험의 평균).
도 3은 SCC15 세포에서의 β-gal의 발현에 있어서 래트 인슐린 인트론 A 및 HBV3'UTR의 효과를 나타낸다 (3회 실험의 평균).
도 4는 SCC15 세포에서의 HSVgD의 발현에 있어서 래트 인슐린 인트론 A 및 HBV3'UTR의 효과를 나타낸다 (3회 실험의 평균).
도 5는 SCC15 및 B16 세포에서의 SEAP의 발현에 있어서 래트 인슐린 인트론 A 및 HBV3'UTR의 효과를 나타낸다 (세포주당 3회 반복).
도 6은 B16 세포에서 SEAP 또는 hFc 단편을 직접 분비하는 이종성 시그널 펩티드의 능력을 나타낸다.
도 7은 다양한 플라스미드 발현 벡터에 포함된 항원-코딩 핵산으로 면역화된 마우스의 혈청에서 검출된 항체의 수준을 나타낸다.
도 8은 pPJV 발현 벡터의 도식적 표시이다.
도 9는 pPJV7389의 도식적 표시이다.
도 10은 pPJV7400의 도식적 표시이다.
도 11은 pPJV7468의 도식적 표시이다.
도 12는 pPJV7563의 도식적 표시이다.
도 13은 pPJV7563에 대한 염기 조성을 나타낸다.
도 14는 플라스미드 pPJV7563 및 pPJV1671의 유도체화의 흐름도를 제공한다.
도 15는 pPJV1671의 제작에서 핵심 플라스미드의 지도를 제공한다.
도 16은 pPJV1671의 특징 지도을 제공하고 천연 H3 Panama HA 항원 및 pPJV1671에 의해 코딩된 H3 Panama HA 항원의 N 말단 서열의 서열 비교를 제공한다.
도 17은 pPJV1671로 백신 접종한 돼지에서 혈구응집반응 억제 항체 역가를 나타낸다.
도 18은 pPJV1671을 인간에게 입자 매개형 상피 전달한 후의 국부 피부 반응을 나타낸다.
도 19는 PMED 기반의 3가 백신으로 면역화된 돼지에서의 혈구응집반응 억제 항체 역가를 나타낸다. H3, H1 및 B 바이러스에 대해 특이적인 HI 역가가 2 PMED 기구에 대해 나타나 있다.
도 20은 pPML7789의 도식적 표시이다.
도 21은 pPML7789의 주해된 서열을 나타낸다.
도 22는 pPJV2012의 도식적 표시이다.
도 23은 pPJV2012의 제작을 위한 흐름도이다.
도 24는 pPJV2012의 주해된 서열을 제공한다.
도 25는 벡터 pPJV7788의 도식적 표시이다.
도 26은 제한 부위를 나타내는 벡터 pPJV7788의 도식적 표시이다.
도 27은 pICP27의 도식적 표시이다.
도 28은 pIC27의 뉴클레오티드 서열을 기반으로 하는 HSV-2의 MS 균주로부터의 ICP27의 아미노산 서열 (서열 65)이다. HSV-2 균주 MS (아스파라긴=N) 및 균주 HG52 (리신)로부터의 ICP27의 공개된 서열 사이의 단일 아미노산 차이는 볼드체로 나타나 있다. HSV-2 균주 MS에서 추정 CD8 에피토프로서 확인된 서열은 밑줄을 그었다.
도 29는 Balb/c 마우스에서 우세한 ICP27 에피토프의 확인을 나타낸다. A: HSV-2 감염된 Balb/c 마우스로부터의 비장(S) 및 림프절(N) 세포 (각각 BS 및 BN) 또는 C57BL/6 마우스로부터의 비장 및 림프절 세포 (CS 및 CN)를 실시예 22에 기재된 다양한 펩티드 풀 (C1-C12, R1-R6)을 사용하여 IFN-γ ELISPOT 활성에 대해 분석하였다. 5 x 105개의 세포를 각각의 웰에 플레이팅하고 결과를 음성 (빈 칸), 약함 (<25 ELISPOT/웰, 회색 칸) 또는 강함 (>25 ELISPOT/웰, 검정 칸)으로서 표로 만들었다. B: 이미 확인된 HSV-1 에피토프 (문헌 [Banks et al, J. Virol. 67, 613-616, 1993])에 상응하는 잠재적인 HSV-2 Dd 에피토프 (볼드체) 및 영역 (밑줄친 부분)을 강조한 Balb/c 마우스로부터의 세포에 의해 인식된 2개 펩티드의 서열 (서열 66 및 서열 67).
도 30은 IFN-γ ELISPOT 분석법을 사용하여 ICP27에 대한 Balb/c 반응의 특징을 기록한다. 감염된 Balb/c 마우스로부터의 비장 세포를 ICP27 (풀)로부터의 모든 펩티드로 구성된 펩티드 풀, 또는 각각의 펩티드 HGPSLYRTF (P1, 서열 68) 및 LYRTFAANPRA (P2, 서열 69)를 사용하여 IFN-γ ELISPOT 활성에 대해 분석하였다. 5 x 105개의 세포를 각각의 웰에 플레이팅하고 결과를 1웰당 ELISPOT의 갯수로 표현하였다. 또한, 비장 세포 샘플의 분취물을 실시예 22에 기재된 바와 같이 자기 비드로 처리하여 CD8+ 세포의 샘플을 제거하였다. 원래의 샘플 (+CD8) 및 제거된 샘플 (-CD8)을 ICP27 (풀)로부터의 모든 펩티드로 구성된 펩티드 풀을 사용하여 IFN-γ ELISPOT 활성에 대해 분석하였다.
도 31은 HSV-2 공격(challenge)에 대한 방어와 ICP27-특이적 사이토킨 생산 사이의 상관관계를 나타낸다. 16마리의 마우스로 구성된 군을 CT DEI 벡터 pPJV2013 (이중 A+B 하위단위) 또는 하위단위 LT DEI 벡터 pPJV2012 (이중 A+B)를 포함하는 pICP27 DNA 백신 및 그렇지 않은 pICP27 DNA 백신으로 이루어진 1차 및 2차 (booster) PMED DNA로 면역화하였다. pICP27 대 DEI 벡터의 비율은 9:1이었다. 패널 A: 공격접종 후 생존 데이터. 각각의 군에서 동물의 절반을 2차 면역화 후 2주에 50 LD50의 HSV-2로 공격접종하였다. 패널 B 및 패널 C: 각각의 군에서 ICP27-특이적 IFN-γ 및 TNF-α 생산. 세포측정 비드 어레이 키트를 사용하여 ICP27-특이적 사이토킨 생산을 측정하기 위해 나머지 동물을 동시에 참수하여 비장세포를 수집하였다.
도 32는 HSV-2의 치명적인 공격에 대한 방어에서 IFN-γ 및 TNF-α의 역할을 나타낸다 - 발병률 평가. 4마리의 마우스로 구성된 군을 pPJV2012 이중 A+B LT DEI 벡터를 포함하거나 (4군) 그렇지 않은 (1군) pICP27 PMED DNA 백신으로 1차 및 2차 면역화하였다. pICP27 대 DEI 벡터의 비율은 9:1이었다. 동물을 2주 후에 50 LD50의 HSV-2로 비강내로 공격접종하였다. T-세포 제거를 위해, 마우스에 실시예 22에 기재된 바와 같이 바이러스 공격의 -2, 0, 2, 4, 6 및 8일 째에 IFN-γ 및/또는 TNF-α에 대해 특이적인 모노클로날 항체 200 ㎍을 함유하는 복강내 주입액을 투여하였다. 동물을 하기 방식에 따라 0 내지 4의 등급으로 등급을 매겨 사망률 (생존률％) 및 발병률에 대해 모니터링하였다: 4, 건강함; 3, 곤두선 털, 재채기; 2, 눈이나 둔부에 상처, 움직임 둔화; 1, 몸을 둥글게 구브림, 움직임 거의 없음; 0, 사망.
도 33은 HSV-2의 치명적인 공격에 대한 방어에서 T-세포군의 역할을 나타낸다. 4마리의 마우스로 구성된 5개의 군을 pPJV2012 이중 A+B LT DEI 벡터를 포함하거나 (+LT, 4군) 그렇지 않은 (-LT, 1군) pICP27 PMED DNA 백신으로 1차 및 2차 면역화하였다. pICP27 대 DEI 벡터의 비율은 9:1이었다. 동물을 2주 후에 50 LD50의 HSV-2로 비강내로 공격접종하였다. ICP27+LT DEI-면역화된 동물로 구성된 3개의 군을 바이러스 공격의 -2 및 0일 째에 αCD4 및/또는 αCD8-특이적 모노클로날 항체 90 ㎍의 복강내 주입액으로 처치하였다. pICP27 단독 군 (-LT로 표시함)에서 총 DNA를 pICP27 +LT 군과 대등하게 유지하기 위해, 엠프티 벡터(empty vector)를 pICP27 단독 군에 첨가하였다.
<서열의 간단한 설명>
서열 1은 hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열이다 (진뱅크(GenBank) #M60321, X17403).
서열 2는 hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 엑손 1 및 2로부터의 서열이다 (진뱅크 #M60321, X17403).
서열 3은 래트 인슐린 인트론 A 서열이다 (진뱅크 #J00748).
서열 4는 본 발명에 따른 키메릭 프로모터의 서열이다.
서열 5는 HBVpreS2 항원 5'UTR 서열로부터의 리더 서열이다 (진뱅크 #M54923).
서열 6은 HSV 타입 2gD 5'UTR 서열로부터의 리더 서열이다 (진뱅크 #Z86099).
서열 7은 HBV e-항원 5'UTR 서열로부터의 리더 서열이다 (진뱅크 #M54923).
서열 8은 HBVenh 3'UTR 서열이다 (진뱅크 #AF143308).
서열 9는 원숭이 즉시형 초기 유전자 3'UTR 서열이다 (진뱅크 #M16019).
서열 10은 토끼 글로빈 폴리A 서열이다 (진뱅크 #K03256).
서열 11은 원숭이 sCMV 즉시형 초기 유전자 폴리A 서열이다 (진뱅크 #M16019).
서열 12는 HSV 2gB 유전자 폴리A 서열이다 (진뱅크 #Z86099).
서열 13은 HPV16 초기 유전자 폴리A 서열이다 (진뱅크 #K02718).
서열 14는 pPJV 발현 벡터의 서열이다.
서열 15는 PCR 프라이머 JF93이다.
서열 16은 PCR 프라이머 F110이다.
서열 17은 PCR 프라이머 GW1이다.
서열 18은 PCR 프라이머 JF254이다.
서열 19는 PCR 프라이머 GW150이다.
서열 20은 PCR 프라이머 JF255이다.
서열 21은 PCR 프라이머 DS1이다.
서열 22는 PCR 프라이머 DA1이다.
서열 23은 PCR 프라이머 JF301이다.
서열 24는 PCR 프라이머 JF302이다.
서열 25는 PCR 프라이머 JF84이다.
서열 26은 PCR 프라이머 JF225이다.
서열 27은 PCR 프라이머 JF335이다.
서열 28은 PCR 프라이머 JF336이다.
서열 29는 PCR 프라이머 JF357이다.
서열 30은 PCR 프라이머 JF365이다.
서열 31은 PCR 프라이머 JF393이다.
서열 32는 PCR 프라이머 JF406이다.
서열 33은 PCR 프라이머 JF256이다.
서열 34는 PCR 프라이머 JF257이다.
서열 35는 PCR 프라이머 JF320이다.
서열 36은 PCR 프라이머 JF321이다.
서열 37은 PCR 프라이머 JF386이다.
서열 38은 PCR 프라이머 FcAS이다.
서열 39는 올리고뉴클레오티드 JF354이다.
서열 40은 PCR 프라이머 JF355이다.
서열 41은 PCR 프라이머 JF356이다.
서열 42는 올리고뉴클레오티드 JF348이다.
서열 43은 PCR 프라이머 JF349이다.
서열 44는 PCR 프라이머 JF350이다.
서열 45는 올리고뉴클레오티드 JF351이다.
서열 46은 PCR 프라이머 JF352이다.
서열 47은 PCR 프라이머 JF353이다.
서열 48은 PCR 프라이머 JF430이다.
서열 49는 PCR 프라이머 JF442이다.
서열 50은 PCR 프라이머 JF421이다.
서열 51은 PCR 프라이머 JF444이다.
서열 52는 슈도라비즈 바이러스 (Pseudorabies virus: PRV) 프로모터 서열이 다.
서열 53은 로우즈 육종 바이러스 (Rous sarcoma virus: RSV) 프로모터 서열이다.
서열 54는 pPJV1671 벡터의 뉴클레오티드 서열 및 코딩된 H3N2 HA 항원의 아미노산 서열을 제공한다.
서열 55는 pPJV1671에 의해 코딩된 H3N2 HA 항원 단독의 아미노산 서열을 제공한다.
서열 56은 H3 Panama HA 항원의 천연 N 말단 아미노산 서열을 제공한다.
서열 57은 pPJV1671에 의해 코딩된 H3 Panama HA 항원의 N 말단 아미노산 서열을 제공한다.
서열 58은 서열 56 및 서열 57의 컨센서스(consensus) 서열을 제공한다.
서열 59는 pPML7789 벡터의 뉴클레오티드 서열 및 VN1194H5 항원의 아미노산 서열을 제공한다.
도 60은 VN1194H5 항원 단독의 아미노산 서열을 제공한다.
도 61은 pPJV2012 벡터의 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
서열 62는 PJV7788 벡터의 뉴클레오티드 서열을 제공한다.
서열 63 및 서열 64는 HSV-2의 MS 균주의 DNA를 증폭시키기 위해 실시예 22에서 사용된 5' 및 3' 프라이머이다.
서열 65는 pICP27의 뉴클레오티드 서열을 기반으로 하는 HSV-2의 MS 균주로부터의 ICP27의 아미노산 서열이다 (실시예 22).
서열 66 및 서열 67은 실시예 22에서 Balb/c 마우스로부터의 세포에 의해 인식된 펩티드 45 및 펩티드 46이다.
서열 68은 펩티드 45 및 펩티드 46에 포함된 상동성을 갖는 9개 아미노산 서열이다.
서열 69 및 서열 70은 1개의 아미노산이 상이한 HSV-2 ICP27 및 HSV-1 ICP27의 아미노산 영역이다.
본 발명을 상술하기에 앞서, 본 발명이 특정 예시된 분자 또는 공정 파라미터로 제한되지 않는다 (물론 그 자체가 변화할 수 있다)는 것을 알아야 한다. 또한, 본원에 사용된 용어는 단지 본 발명의 특정 실시양태를 설명하기 위한 것으로서 제한적인 것이 아니라는 것을 알아야 한다. 또한, 본 발명의 실시는, 달리 언급하지 않는 한, 바이러스학, 미생물학, 분자 생물학, 재조합 DNA 기술 및 면역학의 통상의 방법 (모두 통상적 기술에 속한다)을 이용할 것이다. 이러한 기술은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들면, 문헌 [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989)]; 문헌 [DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.)]; 문헌 [Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984)]; 문헌 [A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)]; 및 문헌 [Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & II (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.)]을 참조한다.
본원에 인용된 상기 또는 하기의 모든 공개물, 특허 및 특허출원은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는, 단수형 ("a," "an" 및 "the")은 명세서에서 명확하게 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다는 것을 주목해야 한다.
특정한 물질이 특정한 단위를 포함하는 것으로 명시되는 경우에는, 바람직한 경우에 상기 물질은 그러한 단위를 주성분으로 할 수 있다.
A. 정의
달리 언급하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 대등한 수많은 방법 및 물질이 본 발명의 실시에 사용될 수 있으나, 본원에는 바람직한 물질 및 방법이 기재된다.
본 발명을 기재함에 있어, 하기 용어가 사용될 것이며 하기 나타낸 바와 같이 정의하고자 한다.
용어 "핵산 면역화"는 본원에서 1개 이상의 선택된 항원 또는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 항원 또는 항원들의 생체내 발현을 위해 숙주 세포에 도입하는 것을 나타내고자 사용된다. 핵산 분자는, 예를 들어 표준 근육내 또는 피내 주사; 경피 입자 전달; 흡입에 의해; 국소적으로, 또는 경구, 비강내 또는 점막 방식의 투여에 의해 수용 대상체에 직접적으로 도입될 수 있다. 특히, 핵산은 경피 입자 전달을 통해 투여될 수 있다. 별법으로, 분자는 대상체로부터 채취한 세포에 생체외에서 도입될 수 있다. 이러한 후자의 경우에, 해당 핵산 분자를 함유하는 세포는 핵산 분자에 의해 코딩되는 항원에 대해 면역 반응이 일어날 수 있도록 대상체에 재도입된다. 본원에서는 이러한 면역화에 사용되는 핵산 분자를 일반적으로 "핵산 백신"이라 한다. 본원에서 언급한 임의 핵산은 본원에서 언급한 그러한 백신 및 그 중에서도 핵산 구조물에 존재할 수 있다.
용어 "아쥬반트 (adjuvant)"는 항원 특이적 면역 반응을 특이적으로나 비특이적으로 변화, 증대, 지시, 재지시, 강화 또는 개시할 수 있는 물질 또는 조성물을 의도한다. 따라서, 항원과 함께 아쥬반트를 공동-투여하면, 항원이 투여되는 대상체에서 목적하는 면역 반응을 달성하는데 보다 낮은 또는 적은 투여량의 항원이 필요하게 되거나, 대상체에서 질적으로 및/또는 양적으로 상이한 면역 반응을 야기할 수 있다. 특히, 아쥬반트의 투여는 증대된 면역 반응, 예를 들면 보다 큰 정도 및/또는 지속성 중의 하나를 초래할 수 있다. 아쥬반트의 효과는 백신 조성물 단독 투여와 유사하게 아쥬반트를 백신 조성물과 함께 동물에 투여하고, 방사면역분석법, ELISA 및 CTL 분석법과 같은 표준 분석법을 이용하여 2개의 군에서 항체 및/또는 세포 매개된 면역을 비교함으로써 측정할 수 있다. 본 발명의 구조물은 1개 이상의 아쥬반트 폴리펩티드를 발현할 수 있다.
"코어 캐리어 (core carrier)"는 게스트 핵산 (예: DNA, RNA)이 규정한 입자 크기 및 세포막 투과에 필요한 운동량 (momentum)을 달성하기에 충분한 고밀도를 부여하도록 코팅되어, 게스트 분자가 입자-매개형 기술을 이용하여 전달될 수 있도록 하는 캐리어를 의미한다 (예를 들어 미국 특허 제5,100,792호 참조). 코어 캐리어는 통상적으로 텅스텐, 금, 백금, 페라이트, 폴리스티렌 및 라텍스와 같은 물질을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, (1994) Yang, N. ed., Oxford University Press, New York, NY pages 10-11]을 참조한다.
용어 "바늘 없는 주사기"는 피부를 찌르기 위한 통상의 바늘의 도움 없이 미립자 조성물을 경피로 전달하는 도구를 의미한다. 본 발명에 사용하기 위한 바늘 없는 주사기가 본원에서 논의된다.
용어 "경피" 전달은 피내 (예: 진피 또는 상피로), 경피 (예: "피하") 및 경점막 투여, 즉 피부 또는 점막 조직 내로 또는 이들을 관통한 제제의 통과에 의한 전달을 의도한다. 예를 들어, 문헌 [Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft and Guy (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1989)]; 문헌 [Controlled Drug Delivery: Fundamentals and Applications, Robinson and Lee (eds.), Marcel Dekker Inc., (1987)]; 및 문헌 [Transdermal Delivery of Drugs, Vols. 1-3, Kydonieus and Berner (eds.), CRC Press, (1987)]을 참조한다. 따라서, 상기 용어는 미국 특허 제5,630,796호에 개시된 바늘 없는 주사기로부터의 전달 및 미국 특허 제5,865,796호에 개시된 입자-매개형 전달을 포함한다.
"폴리펩티드"는 광범위한 의미로 2개 이상의 하위단위 아미노산, 아미노산 유사체 또는 다른 펩티드모방체의 화합물을 나타내기 위해 사용된다. 하위단위는 펩티드 결합에 의해 또는 다른 결합, 예를 들어 에스테르, 에테르 등에 의해 연결될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "아미노산"은 글리신, 및 D 또는 L 광학 이성체를 포함한 천연 및/또는 비천연 또는 합성 아미노산, 및 아미노산 유사체 및 펩티드모방체를 나타낸다. 3개 이상의 아미노산으로 구성된 펩티드는 펩티드 쇄가 짧은 경우 일반적으로 올리고펩티드로 지칭된다. 펩티드 쇄가 길면, 펩티드는 통상적으로 폴리펩티드 또는 단백질로 지칭된다.
"항원"은 개체에서 면역학적 반응을 도출할 수 있는 임의 제제, 일반적으로는 거대분자를 나타낸다. 상기 용어는 개개의 거대분자, 또는 동종의 또는 이종의 항원성 거대분자군을 나타내기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 "항원"은 일반적으로 1개 이상의 에피토프를 함유하는 단백질 분자 또는 그의 일부를 나타내기 위해 사용된다. "항원"은 예를 들면 천연 폴리펩티드, 면역원성인 그러한 폴리펩티드의 단편 또는 면역원성을 보유하는 이들의 변이체 형태를 포함할 수 있다. 바람직한 예에서, 단편 또는 변이체가 언급되는 경우, 발생한 면역 반응은 바람직하게는 단편 또는 변이체가 유도된 원래 폴리펩티드를 인식할 수 있다.
본 발명의 목적상, 항원은 적절한 공급원으로부터 수득되거나 유도될 수 있다. 본 발명의 목적상, "항원"은 단백질이 충분한 면역원성을 유지하는 한, 천연 서열에 (일반적으로 자연 상태로는 보존적인) 결실, 부가 및 치환과 같은 변형이 일어난 단백질을 포함한다. 이들 변형은, 예를 들어 부위 지정 돌연변이유발을 통한 의도적인 것일 수 있거나, 또는 항원을 생산하는 숙주의 돌연변이에 의한 것과 같이 우발적일 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, 이용되거나 코딩된 항원은 인플루엔자 항원, 인플루엔자 항원의 면역원성 단편 또는 이들의 면역원성 변이체일 수 있다.
해당 항원에 대한 "면역 반응"은 개체에서 그 항원에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응의 발달이다. 본 발명의 목적상, "체액성 면역 반응"은 항체 분자에 의해 매개되는 면역 반응을 나타내고, "세포성 면역 반응"은 T-림프구 및/또는 다른 백혈구에 의해 매개되는 면역 반응이다.
용어 "핵산 분자" 및 "폴리뉴클레오티드"는 본원에서 상호교환하여 사용되며, 임의 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태인 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 이들의 유사체를 나타낸다. 폴리뉴클레오티드는 3차원 구조를 가질 수 있으며, 공지되거나 공지되지 않은 기능을 수행할 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 비-제한적 예는 유전자, 유전자 단편, 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 운반 RNA, 리보솜 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의 서열의 단리된 DNA, 임의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머를 포함한다.
폴리뉴클레오티드는 통상적으로 4개의 뉴클레오티드 염기: 아데닌 (A); 시토신 (C); 구아닌 (G); 및 티민 (T) (폴리뉴클레오티드가 RNA인 경우 티민 (T) 대신에 우라실 (U))의 특정 서열로 구성된다. 따라서, 용어 핵산 서열은 폴리뉴클레오티드 분자를 알파벳 표시한 것이다. 이러한 알파벳 표시를 중앙 프로세싱 유니트를 갖는 컴퓨터에서 데이터베이스에 입력하여 기능 유전체학 및 상동관계 검색과 같은 생물정보학 적용에 사용할 수 있다.
"벡터"는 핵산 서열을 표적 세포에 전달할 수 있다 (예: 바이러스 벡터, 비-바이러스 벡터, 미립자 캐리어 및 리포솜). 표적 세포는 원핵세포 또는 진핵세포일 수 있다. 통상적으로, "벡터 구조물", "발현 벡터" 및 "유전자 전달 벡터"는 해당 유전자의 발현을 지시할 수 있고 유전자 서열을 표적 세포에 전달할 수 있는 핵산 구조물을 의미한다. 따라서, 상기 용어는 바이러스 벡터 뿐만 아니라, 클로닝 및 발현 비히클을 포함한다. "플라스미드"는 염색체외 유전자 요소의 형태인 벡터이다.
선택된 항원을 "코딩"하는 핵산 서열은 적절한 조절 서열의 제어하에 있을 때 생체내에서 또는 시험관내에서 폴리펩티드로 전사 (DNA의 경우) 및 번역 (mRNA의 경우)되는 핵산 분자이다. 코딩 서열의 경계는 5' (아미노) 말단에 있는 개시 코돈 및 3' (카르복시) 말단에 있는 번역 정지 코돈에 의해 결정된다. 본 발명의 목적상, 이러한 핵산 서열은 바이러스, 원핵성 또는 진핵성 mRNA로부터의 cDNA, 바이러스 또는 원핵성 DNA 또는 RNA로부터의 게놈 서열, 및 합성 DNA 서열을 포함할 수 있으나, 이들로 한정되지는 않는다. 전사 종결 서열은 코딩 서열의 3'에 위치할 수 있다.
몇몇 경우에 전사된 서열은 복수 폴리펩티드를 발생시킬 수 있는데, 예를 들면 전사체가 복수 오픈 리딩 프레임 (ORF)과 또한 1개 이상의 내부 리보솜 결합 부위 (IRES)를 함유하여 최초 ORF 이후에 ORF들의 번역을 가능하게 할 수 있다. 전사체는 번역되어, 복수 폴리펩티드를 제공하도록 추후 절단되는 폴리펩티드를 제공할 수 있다. 몇몇 경우에, 핵산 구조물은 복수 전사체를 발생시켜 복수 폴리펩티드를 발생시킬 수 있다.
"프로모터"는 폴리펩티드-코딩 폴리뉴클레오티드의 전사를 개시 및 조절하는 뉴클레오티드 서열이다. 프로모터는 유도성 프로모터 (프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 분석물, 보조인자, 조절 단백질 등에 의해 유도되는 경우), 억제성 프로모터 (프로모터에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현이 분석물, 보조인자, 조절 단백질 등에 의해 억제되는 경우), 및 구성 프로모터를 포함할 수 있다. 용어 "프로모터" 또는 "조절 요소"는 전장 프로모터 영역 및 이들 영역의 기능적 (예: 전사 또는 번역의 제어) 절편을 포함하는 것을 의도한다.
"작동가능하게 연결된"은 그렇게 기재된 성분들이 이들의 통상의 기능을 수행하도록 배치된 요소의 배열을 나타낸다. 따라서, 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 주어진 프로모터는 적절한 효소가 존재하는 경우 이 서열의 발현을 수행할 수 있다. 프로모터는 서열의 발현을 지시하도록 기능하는 한, 서열과 인접할 필요는 없다. 따라서, 예를 들어, 개재된 비번역 전사 서열이 프로모터 서열 사이에 존재할 수 있고, 핵산 서열 및 프로모터 서열은 여전히 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 것으로 간주될 수 있다.
"재조합체"는 본원에서, 기원(origin) 또는 조작에 의해, 자연적으로 회합되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 회합하지 않고/않거나 자연적으로 연결되는 폴리뉴클레오티드 이외의 폴리뉴클레오티드에 연결된, 게놈, cDNA, 반합성 또는 합성 기원의 핵산 분자 (폴리뉴클레오티드)를 기술하기 위해 사용된다. 단일 재조합체 핵산 분자에 함유된 2개의 핵산 서열은 자연적으로는 이들이 서로와 보통 회합하지 않는 경우에 서로에 대해 "이종성"이다.
폴리뉴클레오티드의 상동체가 본원에서 언급된다. 통상적으로, 또다른 폴리뉴클레오티드와 상동관계에 있는 폴리뉴클레오티드는 그 폴리뉴클레오티드와 70％ 이상, 바람직하게는 75, 80 또는 90％ 이상, 보다 바람직하게는 95％, 97％ 또는 99％ 이상의 상동성을 갖는다. 상동성의 측정 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 본 명세서에서 상동성은 핵산 동일성(identity)에 기초하여 계산된다는 것을 당업자가 알 것이다. 이러한 상동성은 예를 들면, 15개 이상, 바람직하게는 30개 이상, 예를 들어 40, 60 또는 100개 이상의 인접한 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 존재할 수 있다. 상동성을 갖는 영역은 150개 이상, 바람직하게는 200개 이상, 보다 바람직하게는 300개 이상의 뉴클레오티드에 걸쳐 존재할 수 있다. 상동성을 갖는 영역은 본 발명의 핵산 구조물과 관련하여 본원에서 언급한 임의 요소에 관한 것일 수 있다. 몇몇 경우에, 상동성을 갖는 영역은 해당 영역 전체, 예를 들면 본원에서 명시된 임의 요소의 전체 영역에 걸쳐서 존재할 수 있다.
상기에서 뉴클레오티드 상동성과 관련하여 언급한 것과 등가 수준의 아미노산 상동성이 존재할 수 있다. 따라서, 상기 언급한 수준의 상동성이 아미노산 수준에서도 적용될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 수준에서의 상동성은 15개 이상, 바람직하게는 25개 이상, 보다 바람직하게는 50개 이상, 보다 더욱 바람직하게는 75개 이상, 훨씬 더욱 바람직하게는 100개 이상의 아미노산에 걸쳐서 존재할 수 있다. 상동성을 갖는 영역은 해당 요소의 전체 길이에 걸쳐서 존재할 수 있다.
폴리뉴클레오티드 상동성 또는 동일성을 측정하는 방법이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, UWGCG 패키지가 상동성을 계산하는데 사용 (예를 들어 이의 디폴트 설정으로 사용됨)될 수 있는 BESTFIT 프로그램을 제공한다 (문헌 [Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395]).
또한, PILEUP 및 BLAST 알고리즘을 사용하여 (통상적으로 이들의 디폴트 설정으로) 예를 들어, 문헌 [Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36: 290-300]; 문헌 [Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215: 403-10]에 개시된 바와 같이 상동성을 계산하거나 서열을 정렬할 수 있다.
BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학 정보 센터(National Centre for Biotechnology Information) (http://www.ncbi.nlm.nih. gov/)에서 공개적으로 이용가능하다. 이러한 알고리즘은 먼저, 데이터베이스 서열에 있는 동일한 길이의 단어(word)와 정렬하였을 때 일부 포지티브 값의 역치 스코어 T와 일치하거나 이를 충족하는 의문의 서열 중의 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써, HSP (high scoring sequence pair)를 확인하는 것을 포함한다. T는 확장 단어 스코어 역치 (neighbourhood word score threshold)라 한다 (상기 알츠훌(Altschul) 등의 문헌 참조). 이러한 초기의 확장 단어 일치는 이들을 함유하는 HSP를 찾는 검색을 개시하기 위한 근거로서 작용한다. 단어 일치는 누적되는 정렬 스코어가 증가할 수 있는 한, 각각의 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 각각의 방향에서 단어 일치의 연장은, 1개 이상의 네가티브-스코어링 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적되는 정렬 스코어가 0 이하가 되거나; 서열의 말단에 도달했을 때 중지된다. BLAST 알고리즘 변수 W, T 및 X가 감도 및 정렬 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 디폴트로서 단어 길이 (W) 11, BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (문헌 [Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919] 참조) 정렬 (B) 50, 기대치 (E) 10, M=5, N=4 및 두 가닥의 비교를 사용한다.
BLAST 알고리즘은 2개의 서열 사이의 유사성에 대한 통계학적 분석을 수행한다 (예를 들어 문헌 [Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 유사성의 한 측정은 최소 누적 확률 (smallest sum probability; P(N))이며, 이는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이에 일치가 우연히 발생할 수 있는 확률의 지표를 제공한다. 예를 들어, 제1 서열을 제2 서열과 비교할 때 최소 누적 확률이 약 1 미만, 바람직하게는 약 0.1 미만, 보다 바람직하게는 약 0.01 미만, 가장 바람직하게는 약 0.001 미만인 경우, 서열은 또다른 서열과 유사한 것으로 간주된다.
상동체는 통상적으로 백그라운드보다 상당히 높은 수준으로 관련 폴리뉴클레오티드와 혼성화된다. 상동체와 폴리뉴클레오티드 사이의 상호작용에 의해 발생된 시그널 수준은 통상적으로 "백그라운드 혼성화 (background hybridisation)" 강도의 10배 이상, 바람직하게는 100배 이상이다. 상호작용의 강도는, 예를 들면 프로브를, 예를 들어 32P으로 방사성 표지함으로써 측정할 수 있다. 선택적 혼성화는 통상적으로 중간 내지 높은 엄격함의 조건 (예를 들어, 0.03 M 염화나트륨 및 0.003 M 시트르산나트륨, 약 50 ℃ 내지 약 60 ℃)을 이용하여 달성된다.
엄격한 혼성화 조건은 50％ 포름아미드, 5x 덴하르트 용액 (Denhardt's Solution), 5x SSC, 0.1％ SDS 및 100 ㎍/ml 변성 연어 정자 DNA를 포함할 수 있으며, 세척 조건은 37℃에서의 2x SSC, 0.1％ SDS에 이어 68℃에서의 1x SSC, 0.1％ SDS를 포함할 수 있다. 적절한 혼성화 조건의 정의는 당업계의 기술에 속한다. 예를 들어, 상기 샘브록(Sambrook) 등의 문헌을 참조한다.
상동체는 3, 5, 10, 15, 20 미만 또는 그 이상의 수 미만의 돌연변이 (각각은 치환, 복제, 결실 또는 삽입일 수 있다)에 의해 관련 폴리뉴클레오티드에서 서열이 상이할 수 있다. 이러한 돌연변이는 상동체의 30개 이상, 예를 들면 40개, 60개 또는 100개 이상의 접해 있는 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐 측정될 수 있다. 몇몇 예에서는 돌연변이가 상동체의 전체 영역에 걸쳐서 측정될 수 있다. 폴리뉴클레오티드가 폴리펩티드를 코딩하는 경우, 치환은 바람직하게는 코딩되는 아미노산에서 "보존적" 변화를 일으킨다. 이들은 하기 표 1에 따라 정의된다. 두번째 컬럼의 동일한 블럭에 있는 아미노산 및 바람직하게는 세번째 컬럼의 동일한 행에 있는 아미노산은 보존적 변화에서 서로로 치환될 수 있다.
지방족 비극성 G A P
I L V
극성-하전되지 않음 C S T M
N Q
극성-하전됨 D E
K R
방향족 H F W Y
용어 "단편"은 보다 큰 물질의 보다 작은 부분을 나타낸다. 본원에서 언급한 특정 요소의 단편이 본 발명에서 이용될 수 있다. 특히, 이러한 단편은 원래 요소의 기능을 일부 또는 전체, 그 중에서도 본원에서 언급한 기능을 보유할 것이다. 바람직한 예에서 항원의 단편은 면역원성을 보유할 수 있고 아쥬반트의 단편은 아쥬반트로서 작용하는 능력을 보유할 수 있다. 몇몇 예에서, 단편은 원래 길이의 50％ 이상, 바람직하게는 60％ 이상, 보다 바람직하게는 70％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 80％ 이상, 훨씬 더욱 바람직하게는 90％ 이상 및 또한 보다 더욱 바람직하게는 95％ 이상일 수 있다. 단편은 원래 길이와 동등하거나 원래 길이의 상기 비율 미만일 수 있다.
용어 "개체" 및 "대상체"는 본원에서, 인간 및 다른 영장류, 예를 들면 비-인간 영장류, 예컨대 침팬지 및 다른 원숭이 (ape 및 monkey) 종; 농장 동물, 예컨대 소, 양, 돼지, 염소 및 말; 가정용 포유류, 예컨대 개 및 고양이; 마우스, 래트 및 기니아 피그와 같은 설치 동물 뿐만 아니라 돼지를 포함하는 실험 동물; 닭, 칠면조 및 다른 가금류 새, 오리, 거위와 같은 가정용, 야생 및 사냥용 새를 포함한 새 등을 포함하나, 이들로 한정되지는 않는 척색동물 아문의 일원을 나타내기 위해 상호교환하여 사용된다. 상기 용어는 특정 연령을 지시하지 않는다. 따라서, 성체 및 신생 개체를 둘다 포함하고자 한다. 본원에 기재된 방법은 이들 척추동물 모두의 면역계가 유사하게 작동하기 때문에 상기 척추동물 종 모두에 사용하고자 한다.
몇몇 예에서, 본 발명은 임의의 적합한 대상체 및 그 중에서도 주어진 종의 임의의 적합한 대상체를 면역화하는데 사용될 수 있다. 바람직한 예에서, 임의의 적합한 인간 대상체가 면역화될 수 있다. 따라서, 대상체의 어떤 특정 군에 중점을 두지 않고 예를 들면 가능한 한 많은 대상체를 면역화할 수 있다. 예를 들면, 대상체 집단 전체로서, 또는 가능한 한 많은 대상체를 면역화할 수 있다. 특히, 본 발명이 인플루엔자를 치료하는데 사용되는 경우 및 특히 인플루엔자의 범유행성 균주에 대해 면역화하는데 사용되는 경우에는, 본 발명의 구조물을 임의의 대상체 및 바람직하게는 가능한 한 많은 대상체를 면역화하는데 사용할 수 있다.
다른 경우에, 대상체 또는 개체는 감염 위험에 처해 있거나 감염이 특히 해로운 대상체 또는 개체일 수 있다. 감염은 바람직한 예에서 호흡기 감염일 수 있다. 특히, 본 발명이 호흡기 감염 및 그 중에서도 인플루엔자를 예방하거나 치료하는데 사용되는 경우, 대상체는 인간일 수 있다. 몇몇 경우에는, 본 발명의 핵산 구조물을 위험 군의 특정 대상에 선택적으로 또는 우선적으로 투여할 수 있다. 이는, 예를 들면 인플루엔자의 비-범유행성 균주에 대해 면역화하기 위해 구조물을 투여하는 경우일 수 있다. 몇몇 경우에는, 대상체가 예를 들어 하기 범주 중 하나 이상에 속할 수 있다:
- 호흡기 장애 및/또는 심장 문제 및 그 중에서도 천식, 기종, 기관지염 및/또는 만성 폐색성 폐 질환 (COPD)을 앓고 있는 대상체;
- 당뇨병, 면역 억제, 면역 결핍, 겸상적혈구 병증 및/또는 신장 질환과 같은 만성 의학적 증상을 앓고 있는 대상체;
- 50세 이상, 바람직하게는 60세 이상, 보다 바람직하게는 65세 이상, 보다 더욱 바람직하게는 75세 이상 및 훨씬 더욱 바람직하게는 80세 이상의 대상체;
- 2세 이하, 특히 6 내지 23개월, 예를 들면 18개월 이하의 유아;
- 장기간에 걸친 아스피린 요법 중인 대상체 및 그 중에서도 6개월 내지 18세의 대상체;
- 임신한 여성 및 그 중에서도 인플루엔자 시즌 동안 임신 기간의 제2 또는 제3의 삼분기인 임신한 여성;
- 요양원 또는 장기 보호시설의 체류자; 및/또는
- 상기 대상체들의 간병인 또는 상기 대상체들과 정기적으로 접촉할 가능성이 있는 자.
B. 일반적 개요
본 발명은 이종성 코딩 서열, 및 그 중에서도 항원-코딩 유전자를 숙주 세포에서 효과적으로 발현하게 하는 핵산 구조물에 관한 것이다. 구조물은 몇몇 예에서, 1개 이상의 아쥬반트 폴리펩티드를 발현할 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명은 키메릭 프로모터 서열 및 클로닝 부위를 포함하거나, 몇몇 실시양태에서는 이들을 주성분으로 하여 코딩 서열이 클로닝 부위에 삽입되었을 때 코딩 서열이 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결되는 핵산 구조물을 제공한다. 본 발명은 또한 클로닝 부위 또는 클로닝 부위들에 삽입된 코딩 서열을 갖는 구조물을 제공한다. 코딩 서열은 본원에서 언급한 폴리펩티드 및 그 중에서도 항원 및 특히 본원에서 언급한 항원 및 아쥬반트 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 구조물은 코딩 서열 및 그 중에서도 항원, 그의 면역원성 단편 또는 이들의 면역원성 변이체를 코딩하는 코딩 서열을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 코딩 서열은 인플루엔자 항원, 그의 면역원성 단편 또는 이들의 면역원성 변이체를 코딩한다. 추가로 바람직한 실시양태에서, 코딩 서열은 아쥬반트 폴리펩티드 및 그 중에서도 ADP 리보실화 박테리아 독소 하위단위, 아쥬반트 활성을 갖는 그의 단편 또는 아쥬반트 활성을 갖는 이들의 변이체를 코딩할 수 있다.
키메릭 프로모터는
(a) hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열;
(b) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 엑손 1 및 적어도 일부의 엑손 2; 및
(c) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 인트론 A 영역 대신에 제공된 이종성 인트론
을 포함하거나, 몇몇 실시양태에서는 이들을 주성분으로 한다.
hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열 (a)는
(i) 천연 hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열;
(ii) 그의 기능적 상동성 변이체; 또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 단편
을 포함할 수 있다.
일반적으로, 서열 (a)는 약 100 내지 600개, 바람직하게는 200 내지 600개, 예를 들어 400 내지 600개의 뉴클레오티드를 포함한다. 통상적으로, 서열 (a)는 전사 인자 또는 RNA 중합효소에 결합하는 (i)에 존재하는 서열, 또는 이들 서열 대신에 동일한 전사 인자 및 RNA 중합효소에 결합할 수 있는 이들 서열의 상동체를 포함한다. 통상적으로, 이러한 서열 또는 이들의 상동체는 (i)에서와 동일한 순서 및/또는 실질적으로 동일한 상대적 간격으로 프로모터 서열 (a)에 존재한다.
일반적으로, (i)은 적어도 hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 뉴클레오티드 -100 내지 -1, 통상적으로 -150 내지 -1, 예를 들어 -500 내지 -1 또는 -600 내지 -1을 포함한다. 서열 (i)은 통상적으로 hCMV 코어 프로모터 서열을 포함하며, 또한 hCMV 즉시형 초기 프로모터에 존재하는 1개 이상의 인핸서 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, (i)은 미국 특허 제6218140호에 개시된 것처럼 뉴클레오티드 -118 내지 -1, 또는 -524 내지 -1, 또는 미국 특허 제5385839호에 개시된 것처럼 뉴클레오티드 -62 내지 1 또는 -465 내지 -1을 포함할 수 있다.
일반적으로, (i)은 프로모터 서열에서 통상 발견되는 TATA 박스 또는 CAAT 박스를 포함한다. 바람직하게는, 이 서열은 hCMV 즉시형 초기 프로모터에 1개 이상의 반복 서열을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, (i)은 서열 1을 포함한다. 추가로 바람직한 실시양태에서, (i)은 서열 54의 뉴클레오티드 903-1587을 포함한다. 또다른 실시양태에서, (i)은 서열 14의 뉴클레오티드 903-1587을 포함할 수 있다. 추가로 바람직한 실시양태에서, (i)은 서열 57의 뉴클레오티드 1002-1686 또는 2624-3308을 포함할 수 있다. 추가로 바람직한 실시양태에서, (i)은 서열 61의 뉴클레오티드 1815-1935 및/또는 1948-2632를 포함할 수 있고, 특히 서열 61의 뉴클레오티드 1948-2632를 포함할 수 있다. 또다른 바람직한 실시양태에서는 뉴클레오티드 1815-1935가 사용될 수 있다.
본 발명의 특히 바람직한 실시양태에서, hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열 (a)는
(i) 서열 1, 서열 54의 뉴클레오티드 903-1587, 서열 61의 뉴클레오티드 1815-1935, 서열 61의 뉴클레오티드 1948-2632, 서열 62의 뉴클레오티드 1002-1686 및/또는 서열 62의 뉴클레오티드 2624-3308의 뉴클레오티드 서열;
(ii) (i)의 서열 중 하나 이상과 80％ 이상의 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 (i)의 기능적 변이체; 및/또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 단편
을 포함한다.
몇몇 예에서, 단편은 이러한 서열의 300개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 400개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 500개 이상의 뉴클레오티드 및 보다 더욱 바람직하게는 600개 이상의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 단편은 800개 이하, 600개 이하 또는 400개 이하의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열은 공지된 방법을 이용해 수득될 수 있다. 천연 hCMV 즉시형 초기 프로모터는 표준 기술을 이용하여 바이러스 샘플로부터 직접 단리될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5385839호는 hCMV 프로모터 영역의 클로닝을 개시하고 있다. hCMV 즉시형 초기 프로모터의 서열은 진뱅크 #M60321 (hCMV Towne 균주) 및 X17403 (hCMV Ad169 균주)로 입수가능하다. 따라서, 천연 서열을 공지된 서열에 기초하여 PCR 프라이머를 이용해 PCR함으로써 단리할 수 있다. DNA를 수득 및 단리하기 위해 사용되는 기술에 대한 설명은 예를 들어 상기 샘브룩 등의 문헌을 참조한다. 또한, 적합한 hCMV 프로모터 서열은 기존 플라스미드 벡터로부터 단리될 수 있다. 또한, 프로모터 서열은 합성 생산될 수 있다.
기능적 변이체 (ii) 또는 단편 (iii)은 일반적으로 천연 프로모터 (i)의 활성을 보유하고/하거나 보완하는 것이다. 통상적으로, 이러한 활성은 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드, 특히 hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 전사를 일으키는 (개시 및 조절을 포함함) 능력이다. 한 실시양태에서, 변이체 또는 단편은, 예를 들어 hCMV 바이러스가 세포를 감염시키고/시키거나 세포에서 복제하는 능력을 보유하도록 하면서, hCMV 바이러스에서의 천연 프로모터의 활성을 보완할 수 있다.
상동성 변이체 (ii) 또는 단편 (iii)을 (i)의 활성을 보유하고/하거나 보완하는 능력에 대해 분석할 수 있다. 예를 들어, 변이체 또는 단편을 천연 hCMV 즉시형 초기 프로모터가 결손된 돌연변이체 hCMV에 기능 (예를 들면, 감염 및/또는 복제 능력)을 회복하는 능력에 대해 분석할 수 있다.
상동성 변이체 (ii) 또는 단편 (iii)을 하기 비교 발현 분석법을 이용해 유용성에 대해 시험할 수 있다. 시험 프로모터 서열이 기본 벡터(base vector)에서 천연 hCMV 즉시형 초기 프로모터 대신에 교환된다. 통상적으로, 기능적 변이체 또는 단편은 기본 벡터를 사용하여 제공되는 발현의 50％ 이상, 예를 들어 60, 70, 80, 90％ 이상의 발현을 가능하게 한다. 기능적 변이체 또는 단편은 본원에서 언급한 발현 수준을 제공할 수 있다. 몇몇 예에서, 변이체 또는 단편은 활성의 50％, 100％, 150％, 200％, 300％ 이상의 증가와 같이 보다 높은 수준의 발현을 제공할 수 있다. 일반적으로, 발현은 1개 이상, 바람직하게는 2개의 대조 세포형에서 제공된다. 통상적으로, 대조 세포는 포유동물 HEK 293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 또는 COS 세포이다. 대조 세포는 몇몇 예에서 SCC-15 또는 B16 숙주 세포일 수 있다.
추가적으로 또는 이와 달리, 프로모터 서열을 하기 비교 면역원성 분석법으로 시험할 수 있다. 시험 프로모터 서열이 기본 벡터에서 천연 hCMV 즉시형 초기 프로모터 대신에 교환된다. 기능적 프로모터 서열은 통상적으로 1개 이상, 바람직하게는 2개의 항원으로 기본 벡터에 의해 달성되는 것과 적어도 같거나 그보다 높은 항체 역가를 제공한다. 바람직하게는 항체 역가는 기본 벡터로 제공되는 것보다 5％, 10％, 20％, 30％ 또는 40％ 이상 더 높다. 몇몇 경우에, 항원 역가의 수준은 본원에서 언급한 것들일 수 있다. 적합한 항원은 HBsAg, HSV 2gD 및 flu-M2 항원이다. 특히 바람직한 항원은 인플루엔자 항원이다. 인플루엔자 항원은 HA, NA, M2, NP, M1, PB1, PB2, PA, NS1 및 NS2 항원 및 그 중에서도 HA, NA 및 M2 항원을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서 항원은 HA 또는 그의 단편 또는 이들의 변이체이다. 이러한 분석법에 따라, 천연 프로모터 서열 (i)의 기능적 상동성 변이체 (ii) 또는 기능적 단편 (iii)은 통상적으로 천연 서열에 의해 달성되는 최고 항체 역가가 가능한 것이다. 몇몇 예에서, 항체 역가는 본원에서 언급한 수준을 포함하여 이들보다 약간 낮을 수 있다.
본 발명의 구조물이 아쥬반트 폴리펩티드를 코딩하는 경우에, 비교 면역원성 시험은 표준 항원을 이용하여, 불명확한 아쥬반트 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 시험 벡터를 표준 아쥬반트 벡터와 비교함으로써 이용될 수 있다. 예를 들면, 시험 아쥬반트 벡터는 공지된 아쥬반트 폴리펩티드의 단편 또는 변이체를 코딩할 수 있고 항원과 함께 투여되었을 때 면역 반응을 촉진하는 그의 능력에 있어서 공지된 아쥬반트 폴리펩티드를 발현하는 표준 벡터와 비교될 수 있다. 단편 또는 변이체는 본원에서 언급한 활성 수준을 가질 수 있고, 특히 표준 아쥬반트의 아쥬반트 활성의 50％ 이상, 바람직하게는 75％ 이상, 보다 바람직하게는 85％ 이상 및 보다 더욱 바람직하게는 100％ 이상을 제공할 것이다. 바람직하게는 시험 벡터와 표준 벡터는 시험 중인 아쥬반트/폴리펩티드를 코딩하는 서열과 관계없이, 동일하거나, 또는 적어도 실질적으로 동일할 것이다.
상술된 바와 같이, 구조물은 hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 엑손 1 및 엑손 2로부터 유도되는 서열을 포함하는 엑손 서열 (b)를 포함할 수 있다. 엑손은 자연 상태에서 인트론에 의해 일반적으로 분리되어 있는 코딩 서열이다. 천연 hCMV 주요 즉시형 초기 유전자에서, 엑손 1 및 엑손 2는 천연 인트론 A에 의해 통상 분리된다. 본 키메릭 구조물에서는, 엑손 2 서열이 일반적으로 개재되는 인트론 서열 없이 엑손 1 서열의 3'에 위치하여, 엑손 1 및 엑손 2 서열이 접해 있다.
엑손 서열 (b)는
(i) 천연 엑손 서열, 통상적으로 엑손 1 및 (전체 또는 일부의) 엑손 2;
(ii) (i)의 기능적 상동성 변이체; 또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 단편
을 포함할 수 있다.
서열 (i)은 천연 hCMV 주요 즉시형 초기 유전자 엑손 1 서열의 약 50 내지 100％, 예를 들어 60 내지 90％ 또는 70 내지 80％를 포함할 수 있다. 통상적으로, 천연 엑손 1 서열의 50％ 이상, 예를 들어 60％, 70％, 80％, 90％ 이상이 존재한다. 또한, 엑손 서열 (b)는 엑손 2 서열의 적어도 일부를 포함한다. 서열 (i)에서, 통상적으로 천연 엑손 2의 2개 이상의 염기, 예를 들어 2 내지 9개, 2 내지 7개 또는 3 내지 5개의 염기가 존재한다. 천연 엑손 2 서열의 100％를 포함하는 이들 이하, 예를 들어 천연 엑손 2 서열의 5 내지 95％, 20 내지 80％ 또는 40 내지 60％가 존재할 수 있다. 통상적으로, 상동성 변이체는 천연 서열에 대해 언급한 상기 길이를 갖는다.
바람직하게는, (i)은 서열 2를 포함한다. 추가로 바람직한 실시양태에서, (i)은 서열 54의 뉴클레오티드 1588-1718을 포함한다. 추가로 바람직한 실시양태에서, (i)은 서열 14의 뉴클레오티드 1588-1718을 포함한다. 또다른 바람직한 예에서, (i)은 서열 51의 뉴클레오티드 1684-1814 및/또는 2633-2763을 포함한다. 추가로 바람직한 실시양태에서, (i)은 서열 62의 뉴클레오티드 1687-1817 및/또는 3309-3439를 포함할 수 있다.
따라서 특히 바람직한 실시양태에서, 키메릭 프로모터의 엑손 서열 (b)는
(i) 서열 2, 서열 54의 뉴클레오티드 1588-1718, 서열 61의 뉴클레오티드 1684-1814, 서열 61의 뉴클레오티드 2633-2763, 서열 62의 뉴클레오티드 1687-1817 및/또는 서열 62의 뉴클레오티드 3309-3439의 뉴클레오티드 서열;
(ii) (i)의 서열 중 하나 이상과 80％ 이상의 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 (i)의 기능적 변이체; 및/또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 단편
을 포함한다.
적합한 엑손 서열 (b)는 공지된 방법을 이용해서 수득할 수 있다. DNA를 수득 및 단리하기 위해 이용되는 기술에 대한 설명은 예를 들어 상기 샘브룩 등의 문헌을 참조한다. 천연 hCMV 주요 즉시형 초기 유전자 서열을 표준 기술을 이용하여 바이러스의 샘플로부터 직접 단리할 수 있다 (예를 들어 문헌 [MacLean, A (1998) "Preparation of HSV-DNA and Production of Infectious Virus" in Herpes Simplex Virus Protocols S. Brown, A Maclean, editors, Humana Press, Totowa, NJ, pp. 19-26] 참조). 엑손 1 및 엑손 2의 위치를 포함하는 hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 서열은 진뱅크 #M60321, X17403으로 이용가능하다. 따라서, 적절한 제한 부위에서 천연 주요 유전자 서열을 절단함으로써 또는 공지된 서열에 기초하여 PCR 프라이머를 사용하여 PCR함으로써 천연 엑손 1 및 엑손 2 서열을 단리할 수 있다. 별법으로, 적합한 엑손 서열은 기존 플라스미드 벡터, 예를 들어 pWRG7128로부터 단리될 수 있다. 또한, 엑손 서열은 클로닝 보다는 합성에 의해 생산될 수 있다. 변이체 서열은 부위 지정 돌연변이유발과 같은 통상의 방법으로 쉽게 구성될 수 있다.
일반적으로, 엑손 서열은, 본 발명의 구조물에 존재하는 경우 발현을 증대시켜, 통상적으로 상기 언급한 천연 엑손 1 및 엑손 2 서열 (i)과 거의 동등한 증대를 초래할 것이다.
엑손 서열을 하기 비교 발현 분석법을 이용하여 기능성에 대해 분석할 수 있다. 시험 엑손 서열이 기본 벡터에서 기존의 엑손 서열 대신에 교환된다. 일반적으로, 엑손 서열은 이 서열이 발현을 방해하지 않으며, 바람직하게는 1개 이상, 바람직하게는 2개의 대조 세포형에서 기본 벡터와 비교하여 발현을 증가시킨다면, 기능적이다. 통상적으로, 대조 세포는 포유동물 HEK293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 또는 COS 세포이다. SCC15 또는 B16 세포가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 발현을 5％, 10％, 20％, 30％ 또는 40％ 이상 증가시킨다. 발현은 본원에서 언급한 수준으로 증가할 수 있다. 이러한 분석법에 따라, 천연 엑손 서열 (i)의 기능적 상동성 변이체 (ii) 또는 기능적 단편 (iii)은 천연 서열에 의해 제공되는 발현 증가의 50％를 초과한 발현 증가를 가능하게 하는 것이다. 몇몇 예에서, 발현 수준이 기본 수준에 의해 제공되는 것보다 낮을 경우에는 본원에서 언급한 수준의 감소가 있을 수 있다.
추가적으로 또는 이와 달리, 엑손 서열을 하기 비교 면역원성 분석법으로 시험할 수 있다. 시험 엑손 서열이 기본 벡터에서 기존의 엑손 서열 대신에 교환된다. 기능적 엑손 서열은 통상적으로 1개 이상, 바람직하게는 2개의 항원으로 기본 벡터에 의해 달성되는 것과 적어도 같거나 그보다 높은 항체 역가를 제공한다. 바람직하게는, 항체 역가는 기본 벡터에 의한 것보다 5％, 10％, 20％, 30％ 또는 40％ 이상 더 높다. 증가는 본원에서 언급한 수준일 수 있다. 바람직한 항원은 HBsAg, HSV 2gD 및 flu-M2 항원이다. 특히 바람직한 항원은 본원에서 언급한 것들을 포함하는 인플루엔자 항원이고, 특히 HA, NA 및 M2 항원이다. HA 항원, 그의 면역원성 단편 또는 이들의 면역원성 변이체의 사용이 특히 바람직하다. 이러한 분석법에 따라, 천연 엑손 서열 (i)의 기능적 상동성 변이체 (ii) 또는 기능적 단편 (iii)은 통상적으로 천연 서열에 의해 달성되는 최고 항체 역가가 가능한 것이다. 항체 역가 수준이 약간 낮아질 경우에는, 본원에서 언급한 수준의 감소가 있을 수 있다. 아쥬반트 벡터를 상기 논의된 것과 등가의 방식으로 평가할 수 있다.
키메릭 프로모터 구조물은 hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 천연 인트론 A 영역 대신에 이종성 인트론 (c)를 포함한다. 인트론은 유전자로부터 전사된 hnRNA로부터 스플라이싱되는 비-코딩 서열이다. 이종성 인트론은 천연 코딩 서열에 존재하지 않는 것이다.
이종성 인트론 (c)는 hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 천연 인트론 A를 전체적으로 또는 부분적으로 대체한다. 통상적으로, 천연 인트론 A는 부재한다.
일반적으로, 이종성 인트론 (c)는 엑손 서열 (b)의 3'에 존재한다.
통상적으로, 이종성 인트론 (c)는
(i) 천연 인트론;
(ii) (i)의 기능적 상동성 변이체; 또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 단편
을 포함한다.
이종성 인트론 (c)는 일반적으로 바이러스 또는 진핵성 인트론이다. 바람직하게는, 인트론은 포유동물 인트론, 특히 비-인간 인트론이고, 예를 들어 래트 인트론이 이용될 수 있다. 몇몇 예에서는 닭 인트론이 이용될 수 있다. 바람직하게는, 인트론은 인트론 A, 예를 들어 래트 인슐린 인트론 A, 닭 케라틴 인트론 A 또는 닭 심장 액틴 인트론 A이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 인트론은 래트 인슐린 인트론 A이다.
바람직한 실시양태에서, 이종성 인트론 (c)는 래트 인슐린 유전자 인트론 A 서열, 닭 케라틴 유전자 인트론 A 서열, 닭 심장 액틴 유전자 인트론 A 서열, 이들의 기능적 단편 또는 이들의 기능적 변이체로부터 선택된 서열을 포함한다.
통상적으로, 인트론 (c)는 약 50개의 뉴클레오티드 내지 약 1000개의 뉴클레오티드, 예를 들어 약 100개 내지 약 500개 뉴클레오티드의 길이를 갖는다. 인트론 (c)는, 예를 들어 50 내지 500개의 뉴클레오티드, 예컨대 100, 200, 300 또는 400개 이하의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 인트론은 천연 래트 인슐린 인트론 A의 뉴클레오티드 50-133에서 발견되는 서열 또는 이러한 서열의 상동체를 포함한다.
바람직하게는, 이종성 인트론 (c)는 진핵성 숙주 세포에서 RNA 전사체로부터 스플라이싱될 수 있다. 일반적으로, 인트론은 공여체 서열 (예: GT), 수용체 서열 (예: AG), 3' 피리미딘 풍부 영역 및 분지점 서열 중 하나 이상을 포함한다. 피리미딘 풍부 영역은, 존재하는 경우, 예를 들어 적어도 5, 8, 10개 이상의 피리미딘을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 인트론은 적어도 공여체 서열, 수용체 서열 및 분지점 서열을 포함한다. 통상적으로, 키메릭 구조물에서, 인트론 (c)는 천연 인트론 (i)의 인트론/엑손 경계에서 발견되는 엑손 서열로부터 유도되는 비-인트론 플랭킹(flaking) 서열을 포함한다. 플랭킹 엑손 서열은 천연 엑손 서열 또는 천연 서열과 실질적으로 동일한 활성을 보유하는, 예를 들어 스플라이싱 기능을 보유하는 상기 서열의 상동체일 수 있다. 통상적으로, 엑손 서열의 5 내지 10개, 바람직하게는 7 내지 10개의 염기가 인트론의 각각의 말단에 포함된다.
인트론 (c)는, 인트론이 기능적이라면 인공 인트론일 수 있다. 예를 들어, 재조합체 또는 키메릭 인트론이 사용될 수 있다. 이러한 인트론은 1개 초과의 천연 인트론으로부터의 서열을 포함할 수 있다.
통상적으로, 인트론 (c)는 전사 인자 또는 조절 단백질에 결합하는 hCMV 인트론 A에 존재하는 서열을 포함하거나, 이러한 서열 대신에 동일한 인자 또는 단백질에 결합할 수 있는 이들 서열의 상동체를 포함한다. 통상적으로, 이러한 서열 또는 이들의 상동체는 hCMV 인트론 A에서와 동일한 순서 및/또는 실질적으로 동일한 상대적 간격으로 인트론 (c)에 존재한다.
인트론 (c)는 천연 인트론 (i)의 서열이 변형되어 내부 제한 부위가 제거된 상동성 변이체 (ii)를 포함할 수 있다. 예를 들어, 내부 Nhe1 부위가 파괴된 래트 인슐린 인트론 A의 상동성 변이체가 사용될 수 있다.
바람직하게는, 인트론 (c)는
(i) 서열 3;
(ii) (i)의 기능적 상동성 변이체; 또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 단편
을 포함한다.
추가로 바람직한 예에서, (i)은 서열 54의 뉴클레오티드 1725-1857 또는 서열 14의 동일한 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 추가로 바람직한 실시양태에서, (i)은 서열 61의 뉴클레오티드 1545-1677 및/또는 2770-2902를 포함할 수 있다. 또다른 바람직한 예에서, (i)은 서열 62의 뉴클레오티드 1824-1956 및/또는 3446-3578을 포함할 수 있다.
한 바람직한 예에서, 래트 인슐린 유전자 인트론 A 서열은
(i) 서열 3, 서열 54의 뉴클레오티드 1725-1857, 서열 61의 뉴클레오티드 1545-1677, 서열 61의 뉴클레오티드 2770-2902, 서열 62의 뉴클레오티드 1824-1956 및/또는 서열 62의 뉴클레오티드 3446-3578의 뉴클레오티드 서열;
(ii) (i)의 서열 중 하나 이상과 80％ 이상의 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 (i)의 기능적 변이체; 및/또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 단편
을 포함한다.
인트론 서열 (c)는 표준 클로닝 기술을 이용하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 래트 인슐린 인트론 A 서열은 진뱅크 J00748, 닭 케라틴 인트론 A 서열은 진뱅크 J00847, 닭 심장 인트론 A 서열은 진뱅크 X02212로 이용가능하다. 인트론 서열은 공지된 서열에 기초한 프라이머를 사용하여 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 서열은 합성에 의해 제조될 수 있다. 변이체 서열은 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다.
통상적으로, 기능적 인트론 서열, 예를 들어 기능적 변이체 (ii) 또는 기능적 단편 (iii)은 천연 인트론 (i)과 실질적으로 동일한 활성을 갖고/갖거나 천연 인트론 (i)의 활성을 보완하는 것이다. 한 실시양태에서, 활성은 스플라이싱 활성이다.
인트론 (c)를 통상의 스플라이싱 분석법을 이용하여 스플라이싱 활성에 대해 시험할 수 있다. 일반적으로, 기능적 상동체 (ii) 또는 기능적 단편 (iii)은 상기 분석법에서 천연 인트론 (i)의 스플라이싱 효율의 50％ 이상, 예를 들어 60％, 70％, 80％, 90％ 및 100％까지 또는 그 이상을 나타낼 것이다.
일반적으로, 이종성 인트론 서열은, 본 발명의 구조물에 존재하는 경우 발현을 증대시킬 것이다. 통상적으로, 변이체 (ii) 또는 단편 (iii) 인트론은 천연 인트론 (i)과 거의 동등한 증대를 야기할 것이다. 몇몇 경우에, 본원에서 언급한 수준을 포함하는 발현 감소가 나타날 수 있다.
잠재적 인트론 서열 (c)의 기능성을 하기 비교 발현 분석법을 이용하여 시험할 수 있다. 이종성 인트론이 기본 벡터에서 교환된다. 일반적으로, 이종성 인트론 서열은, 서열의 추가가 1개 이상, 바람직하게는 2개의 대조 세포형에서 기본 벡터와 비교하여 발현을 25％ 이상 증가시킨다면, 기능적이다. 통상적으로, 대조 세포는 포유동물 HEK293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 또는 COS 세포이다. SCC15 또는 B16 세포가 사용될 수 있다. 발현의 증가는 적어도 35％, 45％, 55％ 이상일 수 있다. 증가는 본원에서 언급한 수준일 수 있다. 이러한 분석법에 따라, 천연 인트론 서열 (i)의 기능적 변이체 (ii) 또는 기능적 단편 (iii)은 천연 서열에 의해 달성되는 발현 증가의 50％를 초과한 발현 증가가 가능한 것이다. 발현 감소가 나타나는 경우에는, 예를 들면 본원에서 언급한 수준의 감소가 있을 수 있다.
추가적으로 또는 이와 달리, 이종성 인트론 (c) 서열을 하기 비교 면역원성 분석법을 이용해 기능성에 대해 시험할 수 있다. 인트론 (c) 서열이 기본 벡터에 추가된다. 기능적 인트론 (c) 서열은 1개 이상, 바람직하게는 2개의 항원으로 기본 벡터에 의해 달성되는 것보다 높은 항체 역가를 제공한다. 바람직하게는, 항체 역가는 기본 벡터를 사용하는 것보다 5％ 또는 10％ 이상, 예를 들어 20％, 30％ 또는 40％ 더 높다. 바람직한 항원은 HBsAg, HSV2gD 및 Flu-M2 항원이다. 특히 바람직한 항원은 본원에서 언급한 것들을 포함하는 인플루엔자 항원이고, 특히 HA, NA 및 M2 항원이다. 특히, HA 항원, 그의 면역원성 단편 또는 이들의 면역원성 변이체가 이용될 수 있다. 이러한 분석법에 따라, 천연 인트론 서열 (i)의 기능적 변이체 (ii) 또는 기능적 단편 (iii)은 통상적으로 천연 서열에 의해 달성되는 최고 항체 역가가 가능한 것이다. 몇몇 경우에는, 감소가 나타날 수 있고, 예를 들어 그 수준은 본원에서 언급한 것일 수 있다. 아쥬반트 벡터는 본원에 논의된 것과 등가의 방식으로 평가될 수 있다.
적합한 이종성 인트론 서열은 표준 클로닝 기술을 이용하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 래트 인슐린 인트론 A 서열은 진뱅크 J00748, 닭 케라틴 인트론 A는 진뱅크 J00847, 닭 심장 액틴 인트론 A는 X02212로 이용가능하다. 인트론 서열은 공지된 서열 데이터에 기초한 프라이머를 사용하여 천연 공급원으로부터 단리될 수 있다. 또한, 적합한 서열은 합성에 의해 제조될 수 있다.
구성 성분 서열 (a), (b) 및 (c)는 표준 클로닝 또는 분자 생물학 기술을 이용하여 적합하게 함께 연결되어 키메릭 프로모터를 형성할 수 있다. 바람직하게는, 인트론 서열 (c)는 엑손 서열 (b)의 3'에 제공된다. 키메릭 프로모터 구조물은 적절한 효소가 존재할 때 프로모터가 클로닝 부위에 삽입되는 코딩 서열의 발현을 수행하도록 하는 방식으로 클로닝 부위에 연결된다. 복수-클로닝 부위를 포함하는 적합한 클로닝 부위, 예를 들어 pUC19, pBC SK, pBluescript II KS, cDNA3.1, pSP72, pGEM 7Z 복수 클로닝 부위가 당업계에 공지되어 있다. 임의의 적합한 제한 부위가 예를 들면 코딩 서열을 삽입하기 위한 클로닝 부위로서 사용될 수 있다.
한 바람직한 실시양태에서, 이용되는 키메릭 프로모터는
(i) 서열 4의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 54의 뉴클레오티드 903-1857의 뉴클레오티드 서열;
(ii) (i)과 80％ 이상의 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 (i)의 기능적 변이체; 및/또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 단편
을 포함한다.
추가의 바람직한 예에서, 이용되는 키메릭 프로모터는 서열 14의 서열을 포함하는 것일 수 있다.
통상적으로, 클로닝 부위에 삽입하기 위한 (또는 삽입되는) 핵산은 치료학적으로 관련있는 폴리펩티드를 코딩한다. 코딩 서열이 핵산 면역화 또는 유전자 요법에 사용하기에 적합한 것이 바람직하다. 따라서, 핵산 삽입물은 면역성을 제공할 수 있는 서열, 예를 들어 대상체에 전달되었을 때 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 도출하는 면역원성 서열을 포함할 수 있다. 이와 달리, 핵산은 치료학적 폴리펩티드, 예를 들어 표적 세포 게놈으로부터 결손되거나 상실된 단백질 또는 목적하는 생물학적 또는 치료학적 효과 (예: 항바이러스 기능)를 갖는 비-천연 단백질을 코딩하는 1개 이상의 유전자를 포함할 수 있다. 구조물은 아쥬반트 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 유전자 질환을 치료하기 위해, 특정 질환에서 결실된 것으로 공지된 유전자에 상응하는 기능적 유전자를 대상체에 투여할 수 있다. 바람직하게는, 핵산은 DNA이다. 핵산은 몇몇 예에서는 RNA 또는 PNA일 수 있다.
몇몇 예에서, 비-코딩 RNA가 본 발명의 구조물에 의해 발현될 수 있다. 따라서 벡터는 이러한 RNA, 예를 들면 안티-센스 RNA 또는 SiRNA를 발생시킬 수 있는 영역을 클로닝 부위에 삽입할 수 있다. 안티-센스 RNA 또는 SiRNA는 예를 들면 본원에서 언급한 유전자 또는 본원에서 언급한 병원체의 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 그러나, 가장 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드가 코딩된다.
삽입하기 위한 적합한 핵산은 염증 질환, 자가면역, 만성 및 감염성 질환, 예를 들면 AIDS, 암, 신경계 질환, 심혈관 질환, 고콜레스테롤혈증과 같은 질환; 각종 혈액 질환, 예를 들면 각종 빈혈, 지중해빈혈 및 혈우병; 유전자 결함, 예를 들면 낭포성 섬유증, 고셰병 (Gaucher's Disease), 아데노신 데아미나제 (ADA) 결핍증, 기종 등의 치료에 사용되는 것들을 포함한다.
본 발명의 구조물은 증상을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 구조물은 증상을 완화하고/하거나 질환의 특정 증후 또는 모든 증후를 제거하거나 감소시키는데 사용될 수 있다. 특히 바람직한 예에서 구조물은 병원체에 대하여 대상체를 백신 접종하는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 고형 종양의 치료 방법에서, 독성 펩티드 (즉, 화학요법제, 예를 들어 리신, 디프테리아 독소 및 코브라 독 인자)를 코딩하는 유전자, 종양 억제 유전자, 예를 들어 p53, 형질전환하는 종양유전자에 대해 안티센스인 mRNA 서열을 코딩하는 유전자, 항신생물 펩티드, 예를 들어 종양 괴사 인자 (TNF) 및 다른 사이토킨을 코딩하는 유전자, 또는 형질전환하는 종양유전자의 트랜스우세 네가티브 (transdominant negative) 돌연변이체가 종양 부위에 또는 그 근처에 발현을 위해 삽입될 수 있다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 구조물은 암을 치료 또는 예방하기 위한 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 구조물은 종양 항원을 코딩할 수 있다. 종양 관련 항원의 예로는 고환암 항원, 예컨대 MAGE 부류의 일원 (MAGE 1, 2, 3 등), NY-ESO-1 및 SSX-2, 분화 항원, 예컨대 티로시나아제, gp100, PSA, Her-2 및 CEA, 돌연변이된 자기 항원 및 바이러스 종양 항원, 예컨대 종양유전자 HPV 유형으로부터의 E6 및/또는 E7이 포함되나, 이들로 한정되지는 않는다. 특정 종양 항원의 추가의 예로는 MART-1, Melan-A, p97, beta-HCG, GaINAc, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-4, MAGE-12, MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC18, CEA, DDC, P1A, EpCam, 흑색종 항원 gp75, Hker8, 고분자량 흑색종 항원, K19, Tyr1, Tyr2, pMel 17 유전자 부류의 일원, c-Met, PSM (전립선 무친 항원), PSMA (전립선 특이적 막 항원), 전립선 분비 단백질, 알파-태아단백질, CA125, CA19.9, TAG-72, BRCA-1 및 BRCA-2 항원이 포함된다.
항원이 유도될 수 있는 특정 암의 예로는 폐암, 전립선암, 유방암, 결장암, 난소암, 고환암, 창자암, 흑색종, 림프종 및 백혈병이 포함된다. 본 발명의 구조물은 또한 이러한 암을 치료 또는 예방하는데 사용될 수 있다.
유사하게, 항바이러스 및/또는 항박테리아 활성을 나타내거나 숙주의 면역계를 자극하는 것으로 공지된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 또한 포함될 수 있다. 핵산은 다양한 사이토킨 (또는 이의 기능적 단편), 예를 들어 인터루킨, 인터페론 및 콜로니 자극 인자 중 하나를 코딩할 수 있다.
바람직한 예에서, 코딩 서열은 항원, 그의 면역원성 단편 또는 이들의 면역원성 변이체를 코딩할 수 있다. 항원은 특히 바이러스, 박테리아, 기생충 또는 균류 병원체 항원 또는 종양 항원일 수 있다. 바람직한 예에서, 항원은 바이러스 항원, 그의 면역원성 단편 또는 이들의 면역원성 변이체이다.
핵산은 암, 알레르기, 중독을 포함하나, 이들로 한정되지는 않는 수많은 증상 및 하기 예시한 병원체 (이들로 한정되지 않음)에 의한 감염을 치료 또는 예방하기 위한 항원을 코딩할 수 있다: 균류, 인간 유두종 바이러스 (HPV), HIV, HSV2/HSV1, 인플루엔자 바이러스 (A, B 및 C형), 폴리오 바이러스 (Polio virus), RSV 바이러스, 리노바이러스 (Rhinovirus), 로타바이러스 (Rotavirus), A형 간염 바이러스, 노르워크 (Norwalk) 바이러스군, 장내바이러스, 아스트로바이러스 (Astrovirus), 홍역 바이러스, 파라 인플루엔자 바이러스, 이하선염 바이러스, 대상 포진 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 엡스타인-바르 바이러스 (Epstein-Barr virus), 아데노바이러스 (Adenovirus), 풍진 바이러스, 인간 T-세포 림프종 제I형 바이러스 (HTLV-I), B형 간염 바이러스 (HBV), C형 간염 바이러스 (HCV), D형 간염 바이러스, 수두 바이러스, 마르부르크 (Marburg) 및 에볼라 (Ebola)를 비롯한 바이러스; 엠. 투베르쿨로시스 (M. tuberculosis), 클라미디아 (Chlamydia), 엔. 고노르호에애 (N. gonorrhoeae), 쉬겔라 (Shigella), 살모넬라 (Salmonella), 비브리오 콜레라 (Vibrio Cholera), 트레포네마 팔리두아 (Treponema pallidua), 슈도모나즈 (Pseudomonas), 보르데텔라 페르투시스 (Bordetella pertussis), 브루셀라 (Brucella), 프란시스셀라 툴로렌시스 (Franciscella tulorensis), 헬리코박터 필로리 (Helicobacter pylori), 렙토스프리아 인테로가우스 (Leptospria interrogaus), 레지오넬라 뉴모필라 (Legionella pnumophila), 예르시니아 페스티스 (Yersinia pestis), 스트렙토코쿠스 (Streptococcus) (A 및 B형), 뉴모코쿠스 (Pneumococcus), 메닌고코쿠스 (Meningococcus), 헤모필루스 인플루엔자 (Hemophilus influenza) (b형), 톡소플라마 곤디 (Toxoplama gondii), 콤플리박테리오시스 (Complybacteriosis), 모락셀라 카타르할리스 (Moraxella catarrhalis), 도노바노시스 (Donovanosis), 및 악티노미코시스 (Actinomycosis)를 비롯한 박테리아; 캔디다증 및 아스페르질루스증을 비롯한 균류 병원체; 촌충, 편충, 회충, 아메바증, 편모충증, 크립토스포리듐 (Cryptosporidium), 쉬토소마 (Schitosoma), 뉴모시스티스 카리니 (Pneumocystis carinii), 트리코모나스감염증 및 선모충병을 포함한 기생충 병원체. 또한, 핵산은 다수의 수의학적 질환, 예를 들어 구제역 (Foot and Mouth disease), 코로나바이러스 (Coronavirus), 파스테우렐라 물토시다 (Pasteurella multocida), 헬리코박터 (Helicobacter), 스트론질루스 불가리스 (Strongylus vulgaris), 악티노바실루스 플레우로뉴모니아 (Actinobacillus pleuropneumonia), 소 바이러스성 설사 바이러스 (BVDV), 클렙시엘라 뉴모니애 (Klebsiella pneumoniae), 이. 콜라이 (E. coli), 보르데텔라 페루투시스 (Bordetella pertussis), 보루데텔라 파라페르투시스 (Bordetella parapertussis) 및 보르데텔라 브로치셉티카 (Bordetella brochiseptica)에 대한 적합한 면역 반응을 제공하는데 사용될 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명의 핵산 구조물은 백신으로의 용도를 발견할 수 있다. 본 발명의 백신은 본원에서 언급한 병원체 및 증상에 대해 백신 접종하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 핵산 구조물 또는 본 발명의 핵산 구조물의 집합체 또는 본 발명의 코팅된 입자를 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
한 바람직한 예에서, 본 발명의 핵산 구조물은 아데노비리대 (adenoviridae) (예를 들어 인간 아데노바이러스를 포함함), 헤르페스비리대 (herpesviridae) (예를 들어 HSV-1, HSV-2, EBV, CMV 및 VZV를 포함함), 파포바비리대 (papovaviridae) (예를 들어 HPV를 포함함), 폭스비리대 (poxviridae) (예를 들어 천연두 및 우두를 포함함), 파르보비리대 (parvoviridae) (예를 들어 파르보바이러스 B19를 포함함), 레오비리대 (reoviridae) (예를 들어 로타바이러스를 포함함), 코로나비리대 (coronaviridae) (예를 들어 SARS를 포함함), 플라비비리대 (flaviviridae) (예를 들어 황열병, 웨스트 나일 바이러스 (West Nile virus), 뎅기열, C형 간염 및 진드기-매개 뇌염을 포함함), 피코나비리대 (picornaviridae) (폴리오, 리노바이러스, 및 A형 간염을 포함함), 토가비리대 (togaviridae) (예를 들어 풍진 바이러스를 포함함), 필로비리대 (filoviridae) (예를 들어 마르부르크 및 에볼라를 포함함), 파라믹소비리대 (paramyxoviridae) (예를 들어 파라인플루엔자 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 이하선염 및 홍역을 포함함), 랍도비리대 (rhabdoviridae) (예를 들어 광견병 바이러스를 포함함), 분야비리대 (bunyaviridae) (예를 들어 한탄 바이러스 (Hantaan virus)를 포함함), 오르토믹소비리대 (orthomyxoviridae) (예를 들어 인플루엔자 A, B 및 C 바이러스를 포함함), 레트로비리대 (retroviridae) (예를 들어 HIV 및 HTLV를 포함함) 및 헤파드나비리대 (hepadnaviridae) (예를 들어 B형 간염을 포함함)의 일원으로부터의 항원을 코딩할 수 있다. 추가로 바람직한 예에서 항원은 수의학적 질환의 원인인 병원체로부터의 항원일 수 있으며, 특히 예를 들어 레오바이러스 (Reovirus) (예를 들어 아프리카 마역 또는 청설병 바이러스) 및 헤르페스 바이러스 (Herpes virus) (말 헤르페스를 포함함)를 비롯한 바이러스 병원체로부터의 항원일 수 있다. 항원은 구제역 바이러스로부터의 항원일 수 있다. 추가로 바람직한 예에서 항원은 진드기-매개 뇌염 바이러스, 뎅기열 바이러스, SARS, 웨스트 나일 바이러스 및 한탄 바이러스로부터의 항원일 수 있다.
또다른 바람직한 경우에, 항원은 레트로비리대 (예를 들어 HTLV-I; HTLV-II; 또는 HIV-1 (HTLV-III, LAV, ARV, hTLR 등으로도 알려짐))로부터의 항원일 수 있다. 특히 HIV로부터의 항원 및 그 중에서도 HIVIIIb, HIVSF2, HTVLAV, HIVLAI, HIVMN; HIV-1CM235, HIV-1; 또는 HIV-2로부터의 단리물이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 항원은 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 항원일 수 있다. 바람직한 HIV 항원의 예로는 gp120, gp160, gp41, gag 항원, 예컨대 p24gag 및 p55gag 뿐만 아니라, HIV의 pol, env, tat, vif, rev, nef, vpr, vpu 또는 LTR 영역으로부터 유도된 단백질이 포함된다. 특히 바람직한 경우에 항원은 HIV gp120 또는 HIV gp120의 일부일 수 있다. 항원은 면역결핍 바이러스 항원일 수 있으며, 예를 들면 SIV 또는 고양이 면역결핍 바이러스 항원일 수 있다.
따라서, 코딩된 폴리펩티드는 항원, 그의 면역원성 단편 또는 이들의 면역원성 변이체일 수 있다. 단편 또는 변이체는 예를 들어 임의 수준의 상동성, 원래 항원의 길이에 대한 비율, 및 본원에서 명시한 기능성 및 그 중에서도 면역 반응을 일으키는 능력을 가질 수 있다. 몇몇 예에서, 핵산 구조물의 코딩 서열은 변형되어 발현을 최적화할 수 있다. 예를 들면, 코돈 용도는 대상체의 전형적인 코돈 용도로 변형될 수 있다. 대상체의 컨센서스 Kozak 서열은 또한 개시 코돈 주위의 천연 서열로 치환될 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구조물은 인플루엔자 항원, 그의 면역원성 단편 또는 이들의 면역원성 변이체를 코딩하는 코딩 서열을 포함한다. 단편 및/또는 변이체는 임의 수준의 서열 상동성, 단편 길이 및/또는 본원에서 명시한 기능성 수준을 가질 수 있다. 특히, 바람직하게는 구조물의 코딩 서열은 인플루엔자 바이러스 항원, 인플루엔자 바이러스 항원의 면역원성 단편 또는 이들과 80％의 아미노산 상동성을 갖는 면역원성 변이체를 코딩한다.
예를 들어, 인플루엔자 항원은 인플루엔자 NP (핵단백질/뉴클레오캡시드 단백질), HA (헤마글루티닌), NA (뉴라미니다아제), M1, M2, PB1, PB2, PA, NS1 및/또는 NS2 항원일 수 있거나 이러한 항원의 단편 또는 변이체일 수 있다. 바람직한 실시양태에서 코딩된 항원은 HA, NA 및/또는 M2 인플루엔자 항원, 또는 이러한 항원의 단편 또는 변이체일 수 있다. 특히 바람직한 예에서, 코딩된 항원은 HA 또는 NA 항원, 또는 이러한 항원의 단편 또는 변이체일 수 있고, 특히 HA 항원, 또는 이러한 항원의 단편 또는 변이체일 수 있다.
따라서, 본 발명의 특히 바람직한 구조물에서 코딩된 항원은 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA), 그의 면역원성 단편 또는 이들과 80％의 아미노산 서열 상동성을 갖는 면역원성 변이체이다. 추가로 바람직한 예에서 코딩된 항원은 인플루엔자 뉴라미니다아제 (NA), M2, 이들의 면역원성 단편 또는 이들과 80％의 아미노산 서열 상동성을 갖는 면역원성 변이체이다.
바람직한 예에서, 본 발명의 구조물은 1개 초과의 폴리펩티드 및 그 중에서도 1개 초과의 인플루엔자 항원, 그의 면역원성 단편 또는 이들의 면역원성 변이체를 코딩할 수 있다. 1개 초과의 항원이 이용되는 경우에는, 바람직한 예에서 HA 항원 및 NA 항원, 또는 이러한 항원의 단편 또는 변이체가 함께 이용될 수 있다.
본 발명의 구조물이 1개 초과의 인플루엔자 항원, 면역원성 단편, 또는 이들의 면역원성 변이체를 발현하는 예에서, 코딩된 2개 이상의 상이한 항원, 단편 또는 변이체는 상이한 균주의 인플루엔자 바이러스로부터의 동일한 인플루엔자 폴리펩티드 항원이다.
한 바람직한 실시양태에서 항원은 인플루엔자의 H5N1 균주 및 그의 면역원성 단편 항원일 수 있고, 면역원성을 보유하는 이들의 변이체가 이용될 수 있다. 특히, 항원은 H5N1 균주 항원 또는 이러한 항원의 단편일 수 있다.
몇몇 예에서, 항원은 천연 인플루엔자 폴리펩티드의 단편 또는 변이체일 수 있다. 예를 들면, 항원은 본원에서 언급한 다양한 단편 길이를 갖는 것들을 포함하는 천연 인플루엔자 폴리펩티드의 하위-영역에 상응할 수 있다. 항원은 천연 인플루엔자 항원의 변이체 또는 이러한 항원의 단편의 변이체일 수 있다. 바람직하게는 이러한 변이체 및/또는 단편은 이들이 유도된 항원 및 그 중에서도 인플루엔자 바이러스를 인식할 수 있는 면역 반응을 일으킬 수 있을 것이다.
인플루엔자 항원은 임의의 인플루엔자 바이러스로부터의 항원일 수 있다. 항원은 인플루엔자 바이러스 A, B 또는 C, 특히 인플루엔자 A 및/또는 B로부터의 항원일 수 있다. 항원은 변이체 인플루엔자 균주 및 그 중에서도 인플루엔자 균주의 감염성 또는 병원성 증가와 관련있는 변이체 균주로부터의 항원일 수 있다. 항원은 예를 들면 세계보건기구에 의해 인플루엔자 백신 용도로 매년 확인되는 균주 중 하나로부터의 항원일 수 있으며, 특히 그러한 용도로 WHO에 의해 확인된 항원일 수 있다. 바람직한 예에서, 본 발명의 핵산 구조물, 핵산 집합체, 제약 조성물 또는 백신은 3개의 인플루엔자 균주 및 그 중에서도 특정 해에 WHO 또는 그에 상당하는 다른 기관에 의해 확인된 3개의 균주 각각의 항원을 코딩할 수 있다.
바람직한 예에서, 코딩된 인플루엔자 항원 중 하나 이상이 범유행성 인플루엔자 균주로부터 기원할 수 있다. 따라서, 인플루엔자 항원, 면역원성 단편 또는 이들의 변이체는 범유행성 인플루엔자 균주로부터의 항원일 수 있다. 범유행성 균주로부터의 항원을 코딩하는 구조물은 예를 들면 투여되거나, 그 자체에 존재할 수 있다. 다른 예에서는, 구조물은 또한 다른 항원을 코딩하거나, 다른 항원을 코딩하는 다른 구조물과 함께 투여될 수 있다. 바람직한 경우에, 범유행성 인플루엔자 균주로부터의 항원 및 비-범유행성 인플루엔자 균주로부터의 항원은 동일하거나 별개의 구조물에서 코딩될 수 있다. 특히, 범유행성 인플루엔자 항원 및 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의 비-범유행성 인플루엔자 균주로부터의 항원이 투여될 수 있고, 바람직하게는 3, 4 또는 5개의 비-범유행성 인플루엔자 균주 각각으로부터의 항원이 투여될 수 있으며, 보다 바람직하게는 3 또는 4개의 비-범유행성 인플루엔자 균주 각각으로부터의 항원이 투여될 수 있다.
몇몇 예에서, 구조물은 1개 초과의 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 특히, 구조물은 1개 초과의 항원을 코딩할 수 있고, 특히 1개 초과의 인플루엔자 항원을 코딩할 수 있다. 예를 들어, 구조물은 2, 3, 4, 5, 6개 이상의 폴리펩티드 및 그 중에서도 항원을 발현할 수 있다. 바람직한 경우에, 구조물은 3, 4, 5개 이상의 상이한 폴리펩티드 및 그 중에서도 항원을 코딩할 수 있다. 보다 더욱 바람직한 경우에 구조물은 3, 4, 또는 5개의 상이한 폴리펩티드 및 그 중에서도 항원을 코딩할 수 있다. 훨씬 더욱 바람직한 경우에, 구조물은 3 또는 4개의 상이한 폴리펩티드, 그 중에서도 항원, 특히 인플루엔자 항원을 코딩할 수 있다. 항원 중 1개 이상이 본 발명의 키메릭 프로모터를 사용하여 발현될 것이고 바람직하게는 모든 항원이 본 발명의 키메릭 프로모터를 사용하여 발현될 것이다. 통상적으로, 항원은 각각 본 발명의 별개의 키메릭 프로모터로부터 발현될 수 있다. 몇몇 경우에는, 단독 프로모터를 사용하여 복수 폴리펩티드를 발생시키는 전사체를 생산할 수 있다. 몇몇 예에서, 다수의 항원이 융합 단백질로서 발현될 수 있다.
바람직한 예에서, 본 발명의 구조물은 범유행성 인플루엔자 항원, 그의 면역원성 단편 또는 이들의 면역원성 변이체, 및 1개 이상의 비-범유행성 인플루엔자 항원, 그의 면역원성 단편 또는 이들의 면역원성 변이체를 코딩한다.
본 발명의 핵산 구조물은 백신으로 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 핵산 구조물, 핵산 구조물의 집합체 또는 코팅된 캐리어 입자를 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 백신은 적합한 제약학적 캐리어 또는 부형제를 포함할 수 있다. 백신은 아쥬반트 및 그 중에서도 본 발명의 아쥬반트 구조물을 포함할 수 있다. 별법으로, 백신은 이러한 아쥬반트와 별개로, 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다.
한 바람직한 예에서, 본 발명은 상이한 항원, 그의 면역원성 단편 또는 이들의 면역원성 변이체를 코딩하는 본 발명의 2개 이상의 상이한 구조물을 포함하는 다가 백신을 제공한다. 항원은 본원에서 언급한 것들일 수 있다. 바람직한 예에서, 본 발명은 상이한 인플루엔자 항원, 그의 면역원성 단편 또는 이들의 면역원성 변이체를 코딩하는 본 발명의 2개 이상의 상이한 구조물을 포함하는 다가 백신을 제공한다. 다른 예에서, 다가 백신을 제공하기 위해 복수 항원이 동일한 구조물로부터 발현될 수 있거나 단일 및 복수 항원을 코딩하는 구조물의 조합체가 사용될 수 있다.
추가로 바람직한 예에서, 본 발명의 다가 백신은 3, 4 또는 5개의 상이한 항원, 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체 및 그 중에서도 인플루엔자 항원, 단편 또는 이들의 변이체를 코딩하는 3가, 4가 또는 5가 백신일 수 있다.
또다른 바람직한 예에서, 다가 백신을 포함하는 본 발명의 백신은 범유행성 인플루엔자 항원, 그의 면역원성 단편 또는 이들의 면역원성 변이체를 코딩하는 구조물을 포함할 수 있다. 다가 백신은 범유행성 인플루엔자 항원, 면역원성 단편 또는 이들의 면역원성 변이체를 코딩할 수 있고, 또한 예를 들어 3, 4 또는 5개의 상이한 인플루엔자 균주로부터의 항원, 그의 면역원성 단편 또는 이들의 면역원성 변이체를 코딩할 수 있다.
아쥬반트는 본 발명의 백신에 존재하거나 본 발명의 백신과 동시에, 별개로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 특히, 본 발명은 ADP 리보실화 박테리아 독소 하위단위, 아쥬반트 활성을 갖는 그의 단편 또는 아쥬반트 활성을 갖는 그의 변이체를 코딩하는 본 발명의 1개 이상의 구조물을 포함하는 백신을 제공한다.
1개 초과의 항원을 발현하는 핵산 구조물을 사용하여 다가 백신, 즉 복수의 상이한 항원 및 그 중에서도 인플루엔자 항원에 대해 면역화하기 위한 백신을 생산할 수 있다. 몇몇 예에서, 인플루엔자 항원 또는 인플루엔자 항원들, 및 상이한 병원체로부터의 항원 또는 항원들이 제공될 것이다. 따라서, 본원에서 언급한 구조물, 핵산 구조물의 집합체, 백신, 제약 조성물 및 코팅된 캐리어 입자는 인플루엔자 항원을 코딩하는 구조물을 포함할 수 있고, 동일한 구조물 또는 상이한 구조물이 상이한 병원체로부터의 항원을 코딩할 수 있다. 본원에서 언급한 다양한 다가 인플루엔자 구조물, 집합체 및 백신은 또한 상이한 병원체로부터의 항원 또는 항원들을 코딩할 수 있다.
몇몇 경우에, 코딩된 항원은 동일한 병원체로부터의 항원일 것이다. 몇몇 예에서, 상이한 항원이 동일한 바이러스로부터의 항원일 것이다. 따라서, 바람직한 예에서, 모든 항원은 인플루엔자 항원일 것이다. 복수 항원이 동일한 균주의 인플루엔자 바이러스로부터 기원할 수 있고, 따라서 상기 인플루엔자 바이러스의 다수의 상이한 폴리펩티드로부터 기원할 수 있다. 이와 달리, 복수 항원이 상이한 균주의 바이러스 및 그 중에서도 인플루엔자 바이러스 항원일 수 있다. 다가 구조물 및/또는 백신의 경우에 2개 이상 및 바람직하게는 3개, 4개 또는 5개 이상의 상이한 인플루엔자 각각으로부터의 항원이 선택될 수 있다. 항원은 예를 들면 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 이상의 상이한 균주로부터의 항원일 수 있고, 특히 3, 4 또는 5개의 균주로부터의 항원이 이용될 수 있고, 보다 더욱 바람직하게는 3 또는 4개의 상이한 균주로부터의 항원이 이용될 수 있다.
다가 백신은 이와 달리 또는 추가적으로 본 발명의 복수의 상이한 구조물을 포함할 수 있고, 상기 상이한 구조물은 상이한 항원을 코딩한다. 예를 들어, 2, 3, 4, 5 또는 6개 이상의 상이한 구조물이 이용될 수 있다. 특히 바람직한 예에서, 2, 3, 4 또는 5개의 상이한 구조물 및 특히 3 또는 4개의 구조물이 이용될 수 있다. 한 예에서, 1개 초과의 구조물이 존재하는 경우, 구조물은 각각 단일 항원을 코딩한다. 추가의 예에서, 구조물은 2, 3, 4, 5개 이상의 상이한 항원, 특히 3 또는 4개의 상이한 항원을 코딩할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 복수 구조물 및 그 중에서도 상기 언급한 조합체를 포함하는 핵산 구조물의 집합체를 제공한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 2개 이상의 상이한 구조물을 포함하는 핵산 구조물의 집합체를 제공한다. 핵산 구조물은 서로에 대해 적합한 양으로 존재할 수 있다. 통상적으로, 핵산 구조물은 각각 서로에 대해 대략 1:10의 중량비로 존재한다.
핵산 구조물의 집합체는 다가 백신을 생산하는데 사용되고 본 발명의 다양한 방법에서 사용될 수 있다. 다가 백신은 또한 이들이 1개 초과의 항원을 코딩하는 본 발명의 구조물을 포함하기 때문에 다가일 수 있다.
한 바람직한 예에서 상이한 항원을 코딩하는 2개 이상의 상이한 구조물을 포함하는 핵산의 집합체가 제공된다. 특히, 본 발명은 인플루엔자 항원, 그의 면역원성 단편 또는 이들의 면역원성 변이체를 코딩하는 2개 이상의 상이한 구조물을 포함하는 집합체를 제공한다. 이러한 핵산 구조물의 집합체에서 바람직하게는 2개 이상의 상이한 항원이 상이한 인플루엔자 균주로부터의 동일한 인플루엔자 폴리펩티드, 예컨대 HA 항원일 수 있다. 인플루엔자 항원을 코딩하는 2개 이상의 상이한 구조물이 존재하는 집합체에서, 바람직하게는 2개 이상의 상이한 항원, 단편 또는 변이체는 동일하거나 상이한 인플루엔자 균주로부터의 상이한 인플루엔자 폴리펩티드로부터의 것일 수 있다. 추가로 바람직한 집합체는 각각 상이한 인플루엔자 균주의 항원 또는 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 코딩하는 3개 이상의 상이한 구조물을 포함하는 핵산 구조물의 집합체를 포함한다.
또다른 바람직한 예에서, 본 발명은 항원, 그의 면역원성 단편 또는 이들의 면역원성 변이체를 코딩하는 1개 이상의 구조물 및 ADP 리보실화 박테리아 독소 하위단위, 아쥬반트 활성을 갖는 그의 단편 또는 아쥬반트 활성을 갖는 그의 변이체를 코딩하는 1개 이상의 구조물을 포함하는 핵산 구조물의 집합체를 제공한다. 항원, 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 코딩하는 구조물은 각각 통상적으로 ADP 리보실화 박테리아 독소 하위단위, 아쥬반트 활성을 갖는 그의 단편 또는 아쥬반트 활성을 갖는 그의 변이체를 코딩하는 구조물 각각에 대해 약 10:1 내지 1:10의 중량비로 존재한다. 중량비는 약 10:1 내지 약 1:1일 수 있고, 예를 들면 약 9:1이다.
복수 폴리펩티드가 코딩되는 경우에, 1개 이상의 폴리펩티드를 코딩하는 구조물의 조합체 및 복수 구조물이 이용될 수 있다. 예를 들어 3개의 항원이 코딩되는 경우에는, 한 구조물이 3개의 항원을 모두 코딩할 수 있거나, 한 구조물이 2개의 항원을 코딩하고 또다른 구조물이 1개의 항원을 코딩할 수 있거나, 예를 들어 각각 1개의 항원을 코딩하는 3개의 구조물이 이용될 수 있다. 4개의 항원이 코딩되는 경우에는, 이들은 4, 3, 2 또는 1개의 구조물을 통해 코딩될 수 있으며, 상기 구조물은 각각 1, 2, 3 또는 4개의 상이한 항원을 코딩한다. 한 예에서, 가능한 한 적은 구조물이 이용될 수 있는데, 예를 들면 1개 또는 2개의 구조물만이 이용될 수 있다. 본 발명은 또한 핵산의 집합체 및 핵산 구조물의 이러한 조합체를 포함하는 백신을 제공한다.
바람직한 예에서, 본 발명은 범유행성 인플루엔자 바이러스로부터의 항원을 코딩하는 구조물과, 또한 3, 4 또는 5개 및 그 중에서도 3 또는 4개의 비-범유행성 인플루엔자 항원을 코딩하는 구조물을 포함하는 다가 백신 또는 핵산의 집합체를 제공한다. 비-범유행성 인플루엔자 항원은 범유행성 인플루엔자 항원과 동일한 구조물에서 또는 상이한 구조물에서 코딩될 수 있다. 바람직한 예에서, 3, 4 또는 5개의 다른 비-범유행성 인플루엔자 항원이 별개의 구조물 또는 구조물들 및 그 중에서도 별개의 단일 구조물에서 코딩될 수 있다. 또다른 예에서, 범유행성 항원을 코딩하는 구조물은 또한 1개 이상의 다른 항원을 코딩할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 핵산 구조물이 아쥬반트를 코딩하거나 별개의 구조물이 아쥬반트를 코딩할 것이다. 본 발명의 집합체, 조성물 및 백신은 이러한 아쥬반트 구조물을 포함하거나 이들과 동시에, 순차적으로 또는 별개로 투여될 수 있다. 따라서, 코딩 서열을 삽입하기 위한 클로닝 부위에 삽입된 서열은 아쥬반트로서 작용할 수 있는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다.
따라서 한 예에서, 본 발명은 코딩 서열이 ADP 리보실화 박테리아 독소 하위단위, 아쥬반트 활성을 갖는 그의 단편 또는 이들과 80％의 아미노산 상동성을 갖고 아쥬반트 활성을 갖는 이들의 변이체를 코딩하는 핵산 구조물을 포함한다. 바람직한 예에서, 핵산 구조물은 ADP 리보실화 박테리아 독소 하위단위, 아쥬반트 활성을 갖는 그의 단편 또는 아쥬반트 활성을 갖는 이들의 변이체를 포함하는 2개의 코딩 서열을 포함하고, 이들은 각각 이러한 키메릭 프로모터에 연결되어 있다.
ADP 리보실화 박테리아 독소 하위단위, 아쥬반트 활성을 갖는 그의 단편 또는 아쥬반트 활성을 갖는 이들의 변이체를 코딩하는 2개의 코딩 서열은 한 예에서 반대 방향으로 배향될 수 있다. 또다른 예에서 ADP 리보실화 박테리아 독소 하위단위, 아쥬반트 활성을 갖는 그의 단편 또는 아쥬반트 활성을 갖는 이들의 변이체를 코딩하는 2개의 코딩 서열은 동일한 방향으로 배향될 수 있다. 키메릭 프로모터에 연결된 1개 초과의 코딩 서열을 포함하는 본 발명의 구조물에서, 프로모터는 동일한 방향으로 배향되거나, 상이한 방향으로 배향되거나, 3개 이상의 그러한 프로모터가 있을 경우에는 이들이 혼합된 상태일 수 있다.
바람직한 예에서, 아쥬반트 구조물에서 코딩된 아쥬반트는 ADP-리보실화 박테리아 독소일 수 있다. 이들은 디프테리아 독소 (DT), 백일해 독소 (PT), 콜레라 독소 (CT), 이. 콜라이 이열성 독소 (LT1 및 LT2), 슈도모나즈 내독소 A, 슈도모나즈 외독소 S, 비. 세레우스 (B. cereus) 세포외효소, 비. 스패리쿠스 (B. sphaericus) 독소, 씨. 보툴리늄 (C. botulinum) C2 및 C3 독소, 씨. 리모숨 (C. limosum) 세포외효소, 및 씨. 페르프린젠스 (C. perfringens), 씨. 스피리포르마 (C. spiriforma), 씨. 디피실 (C. difficile) 및 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) EDIN으로부터의 독소를 포함한다. 대부분의 ADP-리보실화 박테리아 독소는 A 및 B 하위단위를 포함한다. 구조물은 A 하위단위, B 하위단위를 발현하고/발현하거나 두 하위단위를 둘다 발현할 수 있다..
바람직한 예에서, 핵산 구조물은 이. 콜라이 이열성 독소 및/또는 콜레라 독소를 코딩할 수 있으며, 특히 이. 콜라이 이열성 독소를 발현할 수 있다. CT 하위단위 A 및 B 유전자의 전체 서열에 대한 진뱅크 등록은 Locus VIBCTXABB (등록번호 D30053)에서 찾을 수 있으며, LT 하위단위 A 및 B 유전자의 전체 서열에 대한 진뱅크 등록은 Locus AB0116677 (등록번호 AB011677)에서 찾을 수 있다. 특히 바람직한 예에서, 본 발명의 구조물은 벡터 pPJV2012 및/또는 pPJV7788에 의해 코딩된 LT A 및/또는 LT B 하위단위 또는 아쥬반트 활성을 보유하는 이러한 하위단위의 단편 또는 아쥬반트 활성을 보유하는 이들의 변이체를 코딩할 수 있다. 본 발명의 구조물은 벡터 pPJV2012 및/또는 pPJV7788의 LT A 및/또는 LT B 하위단위, 아쥬반트 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 그의 단편 또는 아쥬반트 활성을 갖는 이들의 변이체에 대한 코딩 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 예에서, 본 발명의 구조물은 LT A 및 LT B 코딩 서열을 둘다 갖는다.
또다른 바람직한 예에서, 구조물은 서열 61에 의해 제공된 벡터 PJV2012의 서열 또는 이와 60％의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 추가의 예에서, 구조물은 서열 62에 의해 제공된 벡터 PJV7788의 서열 또는 이와 60％의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.
구조물은 특정 아쥬반트의 활성 변이체 또는 단편을 발현할 수 있다. 변이체 또는 단편은 이것이 유도된 폴리펩티드의 아쥬반트 활성의 적어도 일부를 보유한다면 활성이라고 할 것이다. 따라서, 변이체 및/또는 단편은 항원과 함께 아쥬반트가 투여되지 않을 경우 나타나는 면역 반응과 비교하여 특정 항원에 대한 면역 반응을 향상시킬 수 있을 것이다. 코딩된 서열은 CT A 및/또는 B 하위단위의 활성 단편 또는 변이체일 수 있으며, 특히 LT A 및/또는 B 하위단위의 활성 단편일 수 있다. 이용될 수 있는 변이체 및 단편은 예를 들면 변이체 및 단편과 관련하여 본원에서 언급한 길이, 서열 상동성 수준 또는 다른 특징을 가질 수 있다. 이들은 예를 들면 특정 항원을 사용하여 비교 면역원성 분석법을 수행한 후, 아쥬반트 기본 벡터 및 아쥬반트를 코딩하는 변이체 백터로 나타나는 결과를 비교함으로써 평가될 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서 구조물은 LTA 및/또는 LTB 하위단위를 코딩할 수 있으며, 특히 둘다 코딩할 수 있다. 구조물은 특히 바람직한 예에서 그 서열이 본원에 제공된 pPJV2012 또는 pPJV7788일 수 있다.
본 발명의 아쥬반트 구조물은 항원 또는 항원을 코딩하는 핵산과 동시에, 순차적으로 또는 별개로 투여될 수 있다. 바람직한 예에서 본 발명의 아쥬반트 구조물은 항원을 코딩하는 본 발명의 구조물과 동시에, 순차적으로 또는 별개로 투여될 수 있다. 아쥬반트 구조물 및 항원을 코딩하는 구조물을 포함하는 조성물 및 백신이 제공되고, 마찬가지로 그 위에 제공된 두 유형의 구조물로 코팅된 코어 캐리어 또는 아쥬반트 구조물로 코딩된 코어 캐리어와 항원을 코딩하는 구조물로 코팅된 다른 코어 캐리어의 혼합물이 제공된다.
독소 하위단위는 천연 시그널 서열이 제거될 수 있다. 외독소의 천연 시그널 서열은 진핵성 시그널 서열에 의해 대체될 수 있고, 특히 닭 리소자임 시그널 펩티드에 의해 대체될 수 있다. 천연 외독소 하위단위는 변형되어 독성이 제거될 수 있다. A 하위단위는 변형되어 ADP-리보실 트랜스퍼라제 활성을 파괴하거나 불활성화할 수 있다. 몇몇 경우에 외독소 하위단위는 독성을 보유할 수 있다. 따라서, 몇몇 예에서 외독소 하위단위는 독성이 제거되지 않을 수 있다.
따라서, 본 발명의 아쥬반트 구조물은 특정 항원에 대한 면역 반응을 증대시키는데 사용될 수 있다. 증대된 면역 반응은 보다 큰 정도 또는 지속성의 면역 반응을 수반할 수 있다. 이는 항원이 다시 직면하게 되면 면역 반응이 아쥬반트가 투여되지 않은 것보다 크다는 것을 의미할 수 있다. 증대된 면역 반응은 보다 높은 항체 역가를 초래할 수 있다. 몇몇 구조물 및 그 중에서도 외독소 하위단위를 발현하는 구조물의 경우에, 아쥬반트는 해당 항원에 대한 증강된 세포성 반응 및 T 헬퍼 1-유사 면역 반응을 일으킬 수 있다.
아쥬반트 구조물은 본원에서 언급한 다른 구조물과 함께 투여되거나, 이들과 함께 백신 중에 존재하거나, 이들과 함께 핵산의 집합체 중에 존재할 수 있다. 아쥬반트 구조물은 또한 본원에서 언급한 것들을 포함하는 항원 또는 항원들 및 그 중에서도 인플루엔자를 코딩하는 것들을 코딩하는 구조물을 코딩하거나, 이들과 함께 투여될 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 구조물은 면역증강제 및/또는 면역억제제를 코딩할 수 있다. 바람직한 예에서, 구조물은 인터페론 알파, 베타 및/또는 감마, 인터류킨-1, -2, -4, -5, -7, -10, -12, -13, -18, -23 및 -24, GM-CSF, G-CSF, TGF-베타, B7.1, B7.2, CTLA-4, CD40 리간드, CD40, OX40, OX40 리간드, Flt-3 리간드, TRAIL, TRANCE, Fas 리간드, TNF 알파, MCP-1 알파, PF-4, SLC, MIP-3 알파, IP-10 중 하나 이상을 코딩할 수 있다. 몇몇 예에서 이러한 구조물은 다른 구조물, 특히 본 발명의 구조물 및 그 중에서도 항원을 코딩하는 구조물과 동시에, 별개로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 구조물은 폴리아데닐화 시그널을 포함할 수 있다. 클로닝 부위에 삽입하기 위한 핵산은 폴리아데닐화 (폴리A) 서열을 포함할 수 있다. 이러한 폴리A 서열은 일반적으로 코딩 서열과 동질의 것이다. 이와 달리, 이종성 폴리A 서열이 본 발명의 핵산 구조물에 제공될 수 있다. 통상적으로, 폴리A 서열은 클로닝 부위의 하류에 제공되어 클로닝 부위에 삽입된 코딩 서열에 작동가능하게 연결되도록 할 것이다. 표준 클로닝 기술을 이용하여 적합한 폴리A 서열을 구조물에 포함시킬 수 있다. 이러한 폴리A 서열은 당업계에 공지되어 있다.
폴리A 서열은
(i) 천연 폴리A 서열;
(ii) (i)의 기능적 상동성 변이체; 또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 단편
일 수 있다.
천연 폴리A 서열 (i)은, 예를 들어 토끼 베타 글로빈 유전자 폴리A, 사람 유두종 바이러스 (HPV) 초기 또는 말기 유전자 폴리A, HSV-2gB 유전자 폴리A, 원숭이 CMV 즉시형 초기 유전자 폴리A 또는 HSVgD 말기 유전자 폴리A일 수 있다. 폴리아데닐화 서열은 토끼 베타-글로빈 유전자, 인간 유두종 바이러스 (HPV) 초기 또는 말기 유전자, HSV-2gB 유전자, 원숭이 CMV 즉시형 초기 유전자 및 HSVgD 말기 유전자로부터 선택된 유전자의 폴리아데닐화 서열로부터 유도될 수 있다.
바람직하게는, 천연 폴리A 서열 (i)은 서열 10 (진뱅크 K03256), 서열 11 (진뱅크 M16019), 서열 12 (진뱅크 Z80699) 및 서열 13 (진뱅크 K02718)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특히 바람직한 폴리A 서열은 서열 54의 뉴클레오티드 4243-4373을 포함하거나 그의 기능적 상동성 변이체 또는 단편이다. 바람직한 폴리A 서열은 또한 서열 14의 뉴클레오티드 2556-2686에 의해 제공되거나 그의 기능적 단편 또는 변이체 또한 이용될 수 있다.
추가로 바람직한 예에서, 본 발명의 구조물에 이용되는 폴리아데닐화 시그널은
(i) 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 54의 뉴클레오티드 4243-4373, 서열 61의 뉴클레오티드 906-1038, 서열 61의 뉴클레오티드 4375-4050 및/또는 서열 62의 뉴클레오티드 2463-2593의 뉴클레오티드 서열;
(ii) (i)의 서열 중 하나 이상과 80％ 이상의 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 (i)의 기능적 변이체; 및/또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 단편
을 포함할 수 있다.
일반적으로, 기능적 폴리A 서열은 폴리아데닐화 활성을 보유하는 것이다.
폴리A 서열은 일반적 발현 분석법을 이용하여 RNA 전사체의 폴리아데닐화를 일으키는 능력에 대해 시험할 수 있다. 기능적 상동성 변이체 (ii) 또는 기능적 단편 (iii)은 통상적으로 이 분석법에서 천연 폴리A 서열의 폴리A 활성의 50％ 이상, 예를 들어 60％, 70％, 80％ 또는 그 이상을 나타낸다.
일반적으로, 폴리A 서열은, 본 발명의 구조물에 존재하는 경우 발현을 증대시켜, 통상적으로 상기 언급한 천연 폴리A 서열 (i)과 거의 동등한 증대를 초래할 것이다.
또한, 폴리A 서열은 하기 비교 발현 분석법을 이용하여 기능성에 대해 분석할 수 있다. 시험 폴리A 영역이 기본 벡터에서 RBGpA 대신에 교환된다. 시험 폴리A는 폴리A가 발현을 방해하지 않으며, 바람직하게는 1개 이상, 바람직하게는 2개의 대조 세포형에서 기본 벡터와 비교하여 발현을 증가시킨다면, 기능적인 것으로 간주된다. 바람직하게는, 발현을 5％, 10％, 20％, 30％, 40％ 또는 50％ 이상 증가시킨다. 증가는 본원에서 언급한 수준일 수 있다. 몇몇 경우에 본원에서 언급한 수준을 포함하는 감소가 있을 수 있다. 바람직한 세포형은 포유동물 HEK293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 또는 COS 세포이다. 이 분석법에 따라, 통상적으로 상동성 변이체 (ii) 또는 단편 (iii)은, 천연 폴리A 서열 (i)에 의해 달성되는 발현 증가의 50％를 초과한 발현 증가가 가능하다면, 기능적이다.
이와 달리 또는 추가적으로, 폴리A 서열은 하기 비교 면역원성 분석법으로 활성에 대해 시험할 수 있다. 폴리A 서열이 기본 벡터에서 RBGpA 대신에 교환된다. 기능적 폴리A 서열은 1개 이상, 바람직하게는 2개의 항원으로 기본 벡터에 의해 달성되는 것과 적어도 같거나 그보다 높은 항체 역가를 제공한다. 바람직하게는, 항체 역가는 기본 벡터로 달성되는 것보다 5％, 10％ 이상, 예를 들어 20％, 30％ 또는 40％ 더 높다. 몇몇 예에서 본원에서 언급한 증가 또는 감소가 나타날 수 있다. 바람직한 항원은 HBsAg, HSV2gD 및 Flu-M2 항원이다. 특히 바람직한 항원은 본원에서 언급한 것들을 포함하는 인플루엔자 항원 및 그 중에서도 HA, NA 및 M2 항원이다. 특히, HA 항원, 또는 그의 면역원성 단편 또는 이들의 면역원성 변이체가 이용될 수 있다. 상동성 변이체 (ii) 또는 단편 (iii)은, 통상적으로 천연 폴리A 서열 (i)에 의해 달성되는 최고 항체 역가가 가능하다면, 기능적이다.
핵산 구조물은 클로닝 부위에 삽입되는 코딩 서열의 발현에 영향을 미치는 추가의 조절 서열을 포함할 수 있다. 구조물은 비-번역 리더 서열을 포함할 수 있다. 이 서열은 키메릭 프로모터와의 작동가능한 연결로, 따라서 또한 클로닝 부위에 삽입되는 코딩 서열과의 작동가능한 연결로 구조물에 제공된다. 리더는 삽입된 코딩 서열의 발현을 위한 번역 개시 부위를 제공하며, 통상적으로 Kozak 서열을 포함한다.
통상적으로, 비-번역 리더 서열은
(i) 천연 비-번역 리더 서열;
(ii) (i)의 기능적 상동성 변이체; 또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 단편
을 포함한다.
통상적으로 리더 서열은 전사 성분 또는 조절 단백질과 결합하는 (i)에 존재하는 서열, 또는 동일한 성분 또는 단백질과 결합할 수 있는 이들 서열의 상동체를 포함한다. 통상적으로 이러한 서열 또는 그의 상동체는 (i)에서와 동일한 순서 및/또는 실질적으로 동일한 상대적 간격으로 리더 서열에 존재한다. 일반적으로 리더 서열은 삽입된 코딩 서열의 발현을 위한 번역 개시 부위를 포함한다. 통상적으로 리더 서열은 Kozak 서열을 포함한다.
일반적으로 비-번역 리더 서열은 약 10 내지 약 200개의 뉴클레오티드, 예를 들면 약 15 내지 150개의 뉴클레오티드, 바람직하게는 15 내지 약 130개의 뉴클레오티드 길이를 갖는다. 예를 들면 15, 50, 75 또는 100개의 뉴클레오티드를 포함하는 리더 서열이 사용될 수 있다.
일반적으로 기능적 비-번역 리더 서열은 리더 서열과의 작동가능한 연결로 코딩 서열의 발현을 위한 번역 개시 부위를 제공할 수 있는 것이다. 통상적으로 기능적 변이체 (ii) 또는 단편 (iii)은 서열과의 작동가능한 연결로 통상적으로 코딩 서열의 발현을 촉진하거나 증대시키는데 있어서, 천연 서열 (i)과 실질적으로 동일한 활성을 갖고/갖거나 천연 서열 (i)의 활성을 보완한다.
변이체 (ii) 또는 단편 (iii)은 표준 프로토콜을 이용하여 천연 리더 서열과 비교하여 비-번역 리더 서열로서의 활성에 대해 시험할 수 있다. 예를 들어, 천연 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 천연 리더 서열 (i)을 포함하는 발현 벡터를 제조할 수 있으며, 적합한 숙주 세포, 예를 들어 포유동물 HEK 293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 또는 COS 세포에서 발현을 모니터링할 수 있다. 천연 리더 서열이 상동성 변이체 또는 단편에 의해 대체된 시험 구조물을 제조할 수 있으며, 동일한 숙주 세포에서 발현을 다시 모니터링할 수 있다. 일반적으로, 변이체 (ii) 또는 단편 (iii)은 천연 서열에 의해 제공되는 발현의 50％ 이상, 예를 들어 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 100％ 또는 그 이상을 제공한다. 몇몇 경우에 본원에서 언급한 발현의 증가 또는 감소가 나타날 수 있다.
또한, 잠재적 리더 서열은 하기 비교 발현 분석법으로 유용성에 대해 시험할 수 있다. 시험 리더 서열이 기본 벡터에서 HBVpreS2 5'UTR 대신에 교환된다. 기능적 리더 서열은 발현을 방해하지 않으며, 바람직하게는 1개 이상, 바람직하게는 2개의 대조 세포형에서 기본 벡터와 비교하여 발현을 증가시킨다. 일반적으로, 발현은 5％, 10％, 20％, 30％, 40％ 또는 50％ 이상 증가된다. 바람직한 세포형은 포유동물 HEK293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 또는 COS 세포이다. 이 분석법에 따라, 상동성 변이체 (ii) 또는 단편 (iii)은 통상적으로, 천연 리더 서열에 의해 달성되는 발현 증가의 50％를 초과한 발현 증가가 가능하다면, 기능적이다.
이와 달리 또는 추가적으로, 리더 서열은 하기 비교 면역원성 분석법으로 활성에 대해 시험할 수 있다. 리더 서열이 기본 벡터에서 HBVpreS2 5'UTR 대신에 교환된다. 기능적 리더 서열은 1개 이상, 바람직하게는 2개의 항원으로 기본 벡터에 의해 달성되는 것과 적어도 같거나 그보다 높은 항체 역가를 제공한다. 바람직하게는, 항체 역가는 기본 벡터를 사용하는 것보다 5％, 10％, 20％, 30％ 또는 40％ 이상 더 높다. 바람직한 항원은 HBsAg, HSV2gD 및 Flu-M2 항원이다. 특히 바람직한 항원은 본원에서 언급한 것들을 포함하는 인플루엔자 항원 및 그 중에서도 HA, NA 및 M2 항원이다. 특히, HA 항원, 또는 그의 단편 또는 변이체가 이용될 수 있다. 상동성 변이체 (ii) 또는 단편 (iii)은 통상적으로, 천연 리더 서열 (i)에 의해 달성되는 최고 항체 역가가 가능하다면, 기능적이다. 그러나, 몇몇 예에서 본원에서 언급한 발현 수준의 감소가 나타날 수 있다.
적합한 리더 서열을 표준 프로토콜을 이용해 수득할 수 있다. 예를 들어, HBVpreS2 항원 서열, HBV e-항원 서열 및 HSV 타입 2gD 항원 서열이 각각 진뱅크 M54923, M54923 및 Z86099로 이용가능하다. 프라이머를 이 공지된 서열에 기초하여 고안하여 상동 서열을 단리하는데 사용할 수 있다. 리더 서열을 공지된 서열에 기초하여 합성할 수 있다.
일반적으로 천연 서열 (i)은 진핵성 서열 또는 바이러스 서열, 특히 진핵생물을 감염시키는 바이러스의 서열이다. 바람직하게는 천연 서열 (i)은 HBV 또는 HSV 서열, 예를 들면 HBVpreS2 항원 서열, HBV e-항원 서열, 또는 HSV 타입 2gD 항원 서열이다. 특히 바람직하게는, (i)은 서열 5, 서열 6 및 서열 7로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가로 바람직한 예에서, 비-번역 리더 서열은 서열 54의 뉴클레오티드 1864-1984 또는 서열 14를 포함한다. 이들 서열의 기능적 단편 또는 변이체 또한 이용될 수 있다.
한 예에서, 비-번역 리더 서열은
(i) 서열 5, 서열 6, 서열 7 또는 서열 54의 뉴클레오티드 1864-1984의 뉴클레오티드 서열;
(ii) (i)과 80％ 이상의 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 (i)의 기능적 변이체; 및/또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 단편
을 포함한다.
이러한 비-번역 리더 서열이 본 발명의 구조물에 이용될 수 있다.
핵산 구조물은 인핸서 서열을 포함할 수 있다. 인핸서 서열은 통상적으로 키메릭 프로모터 및 삽입된 코딩 서열과 작동가능한 연결로 클로닝 부위의 3'에 제공되며, 삽입된 서열의 전사를 증가시키도록 작용한다.
일반적으로, 인핸서는
(i) 천연 인핸서;
(ii) (i)의 기능적 상동성 변이체; 또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 단편
을 포함한다.
인핸서 서열은 일반적으로 약 50 내지 약 850개의 뉴클레오티드, 예를 들어 약 75 내지 약 500개의 뉴클레오티드를 포함한다. 약 100, 200, 300 또는 400개의 뉴클레오티드의 인핸서가 사용될 수 있다.
통상적으로, (i)은 진핵성 또는 바이러스 인핸서, 특히 진핵생물을 감염시키는 바이러스의 인핸서이다. 통상적으로, 이러한 인핸서는 유전자의 3' 비-번역 영역 (3'UTR)에서 나타난다. 바람직하게는, (i)은 HBV 또는 CMV 인핸서, 예를 들어 HBsAg 3'UTR 또는 원숭이 CMV 즉시형 초기 유전자 3'UTR이다. 바람직하게는, (i)은 서열 8 또는 서열 9를 포함한다. 바람직하게는 (i)은 서열 54의 뉴클레오티드 3699-4231을 포함할 수 있다. 또다른 바람직한 예에서 (i)은 서열 14의 뉴클레오티드 2012-2544를 포함할 수 있다. 이들 서열의 기능적 단편 또는 변이체가 이용될 수 있다.
일반적으로, 구조물에서 인핸서는 전사 성분 또는 조절 단백질, 예를 들어 전사 인자와 결합하는 (i)에서 발견되는 서열, 또는 동일한 성분 또는 단백질과 결합하는 이들 서열의 상동체를 포함한다. 바람직하게는, 이들 서열은 (i)에서와 동일한 순서 및/또는 실질적으로 동일한 상대적 간격으로 인핸서에 존재한다.
일반적으로, 기능적 인핸서는 인핸서 서열에 작동가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 코딩 서열의 발현을 증대 또는 증가시키는 것이다. 통상적으로, 기능적 상동성 변이체 (ii) 또는 단편 (iii)은 천연 인핸서 (i)과 실질적으로 동일한 활성 (예를 들어, 발현의 증대)을 갖고/갖거나 천연 인핸서 (i)의 활성을 보완한다.
인핸서 활성은 인핸서 트랩 분석법을 이용하여 분석할 수 있다. 프로토콜이 당업계에 공지되어 있다. 기능적 상동성 변이체 (ii) 또는 단편 (iii)은 바람직하게는 이러한 분석법에서 천연 인핸서에 의해 나타나는 인핸서 활성의 50％ 이상을 제공한다. 통상적으로, 활성은 천연 인핸서의 활성의 적어도 60％, 70％, 80％, 90％, 100％ 이상이다. 일반적으로, 기능적 변이체 (ii) 또는 단편 (iii)은 이 분석법에서 천연 인핸서 (i)의 활성을 보완할 수 있다. 예를 들어 본원에서 언급한 증가 또는 감소가 나타날 수 있다.
한 바람직한 예에서, 인핸서 서열은
(i) 서열 8, 서열 9, 서열 54의 뉴클레오티드 3699-4231, 서열 61의 뉴클레오티드 3831-4363 및/또는 서열 62의 뉴클레오티드 4507-5038의 뉴클레오티드 서열;
(ii) (i)의 서열 중 하나 이상과 80％ 이상의 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 (i)의 기능적 변이체; 및/또는
(iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 단편
을 포함한다.
또한, 인핸서 유용성은 하기 비교 발현 분석법을 이용해 시험할 수 있다. 시험 3'UTR 서열이 기본 벡터에서 교환된다. 3'UTR은 이 서열이 발현을 방해하지 않으며, 바람직하게는 이 분석법에서 1개 이상, 바람직하게는 2개의 대조 세포형에서 기본 벡터와 비교하여 발현을 증가시킨다면 유용성을 갖는다. 바람직하게는, 발현은 5％, 10％, 20％, 30％, 40％ 또는 50％ 이상 증가된다. 바람직한 세포형은 포유동물 HEK293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 또는 COS 세포이다. 이러한 분석법에 따라, 상동성 변이체 (ii) 또는 단편 (iii)은, 천연 인핸서 서열 (i)에 의해 달성되는 발현 증가의 50％를 초과한 발현 증가가 가능하다면, 기능적이다.
추가적으로 또는 이와 달리, 인핸서 서열은 하기 비교 면역원성 분석법으로 활성에 대해 시험할 수 있다. 3'UTR이 기본 벡터에서 교환된다. 기능적 인핸서 서열은 1개 이상, 바람직하게는 2개의 항원으로 기본 벡터에 의해 달성되는 것과 적어도 같거나 그보다 높은 항체 역가를 제공한다. 바람직하게는, 항체 역가는 기본 벡터를 사용하는 것보다 5％, 10％, 20％, 30％ 또는 40％ 이상 더 높다. 바람직한 항원은 HBsAg, HSV2gD 및 Flu-M2 항원이다. 특히 바람직한 항원은 본원에서 언급한 것들을 포함하는 인플루엔자 항원이고, 특히 HA, NA 및 N2 항원이다. 특히, HA, 또는 그의 단편 또는 변이체가 이용될 수 있다. 상동성 변이체 (ii) 또는 단편 (iii)은, 천연 인핸서 서열 (i)에 의해 달성되는 최고 항체 역가가 가능하다면, 기능적이다.
적합한 인핸서 서열은 표준 클로닝 방법을 이용해 수득될 수 있다. 예를 들어, HBsAg 3'UTR 서열 또는 원숭이 CMV 즉시형 초기 유전자 3'UTR 서열을 진뱅크 AF143308 및 M16019로 입수할 수 있다. 프라이머를 이 공지된 서열에 기초하여 고안하여 상동성 서열을 단리하는데 사용할 수 있다.
몇몇 예에서, 복수 폴리펩티드가 단일 구조물에 의해 코딩되는 경우, 구조물의 크기를 축소하기 위해 특정 서열을 생략하는 것이 바람직할 수 있다. 특히, 구조물은 발현될 폴리펩티드를 코딩하는 서열 또는 서열들에 작동가능하게 연결된 비-번역 리더 서열을 코딩하는 영역 및/또는 인핸서가 없을 수 있다. 예를 들어, 이는 3, 4, 5개 또는 그 이상의 폴리펩티드가 동일한 구조물로부터 발현되는 경우, 및 그 중에서도 3, 4 또는 5개의 폴리펩티드가 동일한 구조물로부터 발현되는 경우일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 핵산 구조물은 이종성 폴리A 서열, 이종성 리더 서열 및 이종성 인핸서를 포함하며, 이들은 모두 삽입된 코딩 서열의 효과적인 발현을 위해 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결된다.
추가의 측면에서, 본 발명은 또한
(i) 프로모터 서열;
(ii) HBVpreS2 항원 서열, HBV e-항원 서열 또는 HSV 타입 2gD 항원 서열로부터 유도된 비-번역 리더 서열; 및
(iii) (i) 및 (ii)에 작동가능하게 연결된 코딩 서열
을 포함하거나, 때로는 이들을 주성분으로 하고, 상기 코딩 서열은 비-번역 리더 서열에 대해 이종성인 핵산 구조물을 제공한다.
통상적으로, 프로모터 서열 (i)은 바이러스 또는 진핵성 프로모터 서열로부터 유도된다. 프로모터 서열은 천연 프로모터 서열, 천연 서열의 기능적 상동체 또는 이들의 기능적 단편일 수 있다. 적합한 천연 프로모터는, 예를 들어 hCMV 즉시형 초기 프로모터, 슈도라비즈 바이러스 (PRV) 프로모터 또는 로우즈 육종 바이러스 (RSV) 프로모터를 포함한다. 바람직하게는, 천연 프로모터는 서열 52 또는 서열 53을 포함한다.
프로모터가 기능적이라면, 상기 기재된 키메릭 프로모터와 같은 인공 프로모터 구조물이 사용될 수 있다.
기능적 프로모터 서열은 일반적으로 적합한 숙주 세포에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 전사를 일으킬 수 있는 (개시 및 조절을 포함함) 것이다.
프로모터 서열은 일반적 발현 분석법을 이용하여 프로모터 활성에 대해 시험할 수 있다. 천연 프로모터 서열의 기능적 상동체 또는 단편은 통상적으로 이러한 분석법에서 천연 서열에 의해 제공되는 발현의 50％ 이상, 예를 들어 60, 70, 80 또는 90％ 이상을 제공한다.
비-번역 리더 서열 (ii)는 상기 기재한 바와 같다. 적합한 코딩 서열 (iii)은 키메릭 프로모터 구조물과 관련하여 이미 기재된 것들을 포함한다. 그러나, 본 발명의 측면에서, 코딩 서열은 비-번역 리더 서열에 대해 이종성이다. 본 발명의 구조물은 통상적으로 이미 기재된 바와 같이 코딩 서열과 동질일 수 있거나, 또는 구조물에서 이종성 폴리A 서열로서 제공될 수 있는 폴리A 서열을 포함한다. 적합한 폴리A 서열은 이미 기재되었다. 구조물은 추가로 코딩 서열의 3' 인핸서 서열을 포함할 수 있다. 적합한 인핸서 서열은 키메릭 프로모터 구조물과 관련하여 상기 기재한 바와 같다.
또 다른 측면에서, 본 발명은
(i) 프로모터 서열;
(ii) 프로모터 서열 (i)에 작동가능하게 연결된 코딩 서열; 및
(iii) 코딩 서열 (ii)의 3'에 존재하고 이에 작동가능하게 연결된 인핸서 서열
을 포함하거나, 몇몇 실시양태에서는 이들을 주성분으로 하고, 상기 인핸서 서열 (iii)은 HBsAg 서열의 3'UTR 또는 원숭이 CMV 즉시형 초기 유전자 서열의 3'UTR로부터 유도되며, 상기 코딩 서열 (ii)는 3' 인핸서 서열에 대해 이종성인, 핵산 구조물을 제공한다.
구조물은 키메릭 프로모터 구조물과 관련하여 이미 기재된 것들과 같은 비-번역 리더 서열을 포함할 수 있다.
통상적으로, 프로모터 서열 (i)은 바이러스 또는 진핵성 프로모터 서열로부터 유도된다. 프로모터 서열은 천연 프로모터 서열, 천연 서열의 기능적 상동체 또는 이들의 기능적 단편일 수 있다. 적합한 천연 프로모터는, 예를 들어 hCMV 즉시형 초기 프로모터, 슈도라비즈 바이러스 (PRV) 프로모터 또는 로우즈 육종 바이러스 (RSV) 프로모터를 포함한다. 바람직하게는, 천연 프로모터는 서열 52 또는 서열 53을 포함한다.
프로모터가 기능적이라면, 상기 기재된 키메릭 프로모터와 같은 인공 프로모터 구조물이 사용될 수 있다.
기능적 프로모터 서열은 일반적으로 적합한 숙주 세포에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 전사를 일으킬 수 있는 (개시 및 조절을 포함함) 것이다.
프로모터 서열은 일반적 발현 분석법을 이용하여 프로모터 활성에 대해 시험할 수 있다. 천연 프로모터 서열의 기능적 상동체 또는 단편은 통상적으로 이러한 분석법에서 천연 서열에 의해 제공되는 발현의 50％ 이상, 예를 들면 60, 70, 80 또는 90％ 이상을 제공한다.
적합한 코딩 서열 (ii)는 키메릭 프로모터 구조물과 관련하여 이미 언급한 것들을 포함한다. 그러나, 본 측면에서, 코딩 서열은 3' 인핸서 서열에 대해 이종성이다. 본 구조물의 인핸서 서열 (iii)은 상기 기재되어 있다. 또한, 본 구조물은 통상적으로 폴리A 서열을 포함한다. 키메릭 프로모터 구조물의 경우에서와 같이, 이러한 폴리A 영역은 코딩 서열 (ii)와 동질일 수 있거나 구조물에서 이종성 폴리A 성분으로 제공될 수 있다.
본 발명의 임의 측면에 따른 구조물은 시그널 펩티드 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 핵산 구조물은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 시그널 펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 시그널 펩티드 서열은 프로모터와의 작동가능한 연결로 삽입되어, 시그널 펩티드가 발현되고 또한 프로모터와의 작동가능한 연결로 코딩 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드의 분비를 촉진하도록 한다.
통상적으로, 시그널 펩티드 서열은 10 내지 30개의 아미노산, 예를 들어 15 내지 20개의 아미노산으로 구성된 펩티드를 코딩한다. 종종 아미노산은 우세하게 소수성이다. 통상적으로, 시그널 펩티드는 발현 세포의 소포체에 대한 시그널 펩티드를 갖는 성장하는 폴리펩티드 쇄를 표적으로 한다. 시그널 펩티드는 소포체에서 절단되어 골지체를 통한 폴리펩티드의 분비를 가능하게 한다.
본 발명에 사용하기 위한 시그널 펩티드는
(i) 천연 시그널 펩티드 서열;
(ii) 시그널 펩티드 활성을 보유하는 (i)의 상동성 변이체; 또는
(iii) 시그널 펩티드 활성을 보유하는 (i) 또는 (ii)의 단편
을 포함할 수 있다.
서열 (i)은, 예를 들어 인간 조직 플라스미노겐 활성자 시그널 펩티드 (hTPAsp) (진뱅크 L00141), 아프로티닌 시그널 펩티드 (진뱅크 AAD13685), 담배 엑스텐신(extensin) 시그널 펩티드 (진뱅크 JU0465), 또는 닭 리소자임 시그널 펩티드 (진뱅크 AF410481)일 수 있다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 시그널 펩티드는 이종성 단백질의 분비를 가능하게 하는 것이다. 기능적 시그널 펩티드는 시험 시그널 펩티드의 효과를 공지된 시그널 펩티드, 예를 들어 인간 조직 플라스미노겐 활성자 시그널 펩티드 (hTPAsP)의 효과와, 또한 시그널 펩티드가 없는 경우의 효과와 비교하는 분석법으로 확인될 수 있다. 하기에 나타낸 비교 발현 분석법이 하기와 같이 변형되어 이용될 수 있다. 시험 시그널 펩티드 존재, hTPAsp 존재 또는 시그널 펩티드 부재의 기본 벡터를 포함하는 분비 발현 벡터를 제작한다. 천연 시그널 펩티드가 없는 폴리펩티드에 대한 코딩 서열을 벡터에 삽입하고 이 벡터를 대조 숙주 세포로 형질전환시킨다. 바람직하게는, 세포는 포유동물 HEK293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 또는 COS 세포이다. 세포 배지를 폴리펩티드 발현 수준에 대해 분석한다. 기능적 시그널 펩티드는 1개 이상, 바람직하게는 2개의 폴리펩티드로 시그널 펩티드가 없는 벡터보다 높은 수준의 폴리펩티드 분비를 가능하게 한다. 통상적으로, 분비는 5％ 이상, 보다 바람직하게는 10％ 이상, 예를 들어 20 또는 50％ 이상 더 높다. 통상적으로, 분비 수준은 hTPAsp를 사용하여 얻어지는 수준과 거의 동등하다. 몇몇 경우에는, 본원에서 언급한 증가 또는 감소가 나타날 수 있다.
바람직한 예에서, 시그널 펩티드는 인간 조직 플라스미노겐 활성자 시그널 펩티드 (hTPAsp), 아프로티닌 시그널 펩티드, 담배 엑스텐신 시그널 펩티드 및 닭 리소자임 시그널 펩티드로부터 선택된다.
발현 세포의 외부로 코딩된 단백질, 특히 항원을 분비시키면 많은 이점이 있을 수 있다. 예를 들어, 증가된 항원 분비는 면역 세포 (대식세포, 랑게르한스 세포, B-세포, T-세포 등)에 의한 항원 흡수 및 반응을 증가시키고, 항원이 혈류 및 시그널 세포 (사이토킨)에 도달하는 것을 가능하게 하며, 항원이 세포 리간드를 찾고 기능 (항체, 독소, 예를 들면 콜레라 독소, 이. 콜라이 LT)을 발휘하여 정상적인 세포 생화학 과정 (세포 수용체)에 참여하는 것을 가능하게 할 수 있다.
본 발명의 구조물은 플라스미드의 형태일 수 있다. 본 발명의 핵산 구조물은 플라스미드 발현 벡터의 형태일 수 있다. 바람직한 예에서, 본 발명의 구조물은 DNA 구조물일 수 있다. 별법의 예에서, 구조물은 RNA 또는 PNA 구조물일 수 있다.
이때, 벡터는 추가의 요소, 예를 들어 복제 개시점 또는 선별 유전자를 포함할 수 있다. 이러한 요소가 당업계에 공지되어 있으며, 표준 기술을 이용하여 포함시킬 수 있다. 한 실시양태에서, 플라스미드 벡터는 서열 14의 서열을 갖는다. 이와 달리, 구조물은 바이러스 벡터 구조물에 포함될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구조물은 본원에 정의된 키메릭 프로모터를 2개 이상 포함할 수 있다. 따라서, 구조물은 복수의 키메릭 프로모터를 포함할 수 있으며, 특히 구조물은 2개, 3개, 4개, 5개 이상의 키메릭 프로모터를 가질 수 있다. 키메릭 프로모터는 바람직하게는 코딩 서열의 삽입을 위한 클로닝 부위에 각각 별개로 작동가능하게 연결될 것이다. 따라서, 구조물은 2, 3, 4, 5개 이상의 코딩 서열을 발현할 수 있다. 발현된 코딩 서열은 본원에서 명시한 것들 일 수 있다. 바람직한 예에서, 구조물은 2개의 키메릭 프로모터를 가지며, 각각의 프로모터는 이들과 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 갖는다. 특히, 2개의 프로모터는 서로로부터 멀어지는 방향으로 전사될 수 있다. 다른 실시양태에서, 프로모터는 서로를 향하여 전사될 수 있다. 따라서, 프로모터는 반대 방향으로 배향되거나 몇몇 경우에는 동일한 방향으로 배향된다.
특히, 2개의 프로모터를 갖는 구조물은, 본원에서 언급한 것들을 포함하는 ADP-리보실화 박테리아 독소의 A 및 B 하위단위, 바람직하게는 LT A 및 B 하위단위를 발현할 수 있다. 그러나, 복수의 프로모터를 갖는 구조물은 본원에서 언급한 코딩 서열의 임의 조합을 발현할 수 있다. 추가로 바람직한 측면에서, 복수의 프로모터를 갖는 구조물은 본원에서 언급한 인플루엔자 항원의 임의 조합을 포함하는 복수의 인플루엔자 항원을 발현할 수 있다. 또다른 바람직한 측면에서, 구조물은 범유행성 인플루엔자 항원, 그의 면역원성 단편 또는 이들의 면역원성 변이체, 및 본원에서 언급한 1개 이상의 코딩 서열을 발현할 수 있다.
구조물이 복수의 키메릭 프로모터를 갖는 경우에, 이들은 각각 본원에서 언급한 서열을 포함하거나 이와 작동가능하게 연결될 수 있다. 특히 바람직한 예에서, 1개 이상의 프로모터의 이종성 인트론은 래트 인슐린 유전자 인트론 A 서열일 수 있다. 또한, 1개 이상의 키메릭 프로모터는 바람직하게는 HBVpre-S2의 5'UTR을 포함할 수 있다. 1개 이상의 프로모터는 토끼 베타-글로빈 유전자의 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다.
바람직한 경우에, 본 발명의 핵산 구조물은 2개의 키메릭 프로모터 서열을 포함할 수 있으며, 각각의 프로모터 서열은 삽입된 코딩 서열을 갖는 클로닝 부위에 작동가능하게 연결되고, 여기서 각각의 키메릭 프로모터는
(a) hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열;
(b) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 엑손 1 및 적어도 일부의 엑손 2; 및
(c) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 인트론 A 영역 대신에 제공된 이종의 인트론
을 포함하고, 한 키메릭 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 서열은 LTA 하위단위를 코딩하고 다른 키메릭 프로모터에 연결된 코딩 서열은 LTB 하위단위를 코딩한다. 따라서, 이 구조물은 하위단위를 둘다 발현할 수 있다. 바람직하게는,
- 각각의 프로모터의 이종성 인트론은 래트 인슐린 유전자 인트론 A 서열이고;
- 각각의 LT 하위단위를 코딩하는 서열은 HBVpre-S2의 5'UTR에 작동가능하게 연결되고/되거나;
- LT 코딩 서열은 토끼 베타-글로빈 유전자 폴리아데닐화 서열에 작동가능하게 연결된다.
특히 바람직한 예에서, 벡터 pPJV7563 및/또는 pPJV1671의 1개 이상의 요소가 본 발명의 핵산 구조물에 이용될 수 있다. 이러한 요소의 기능적 단편 또는 변이체가 이용될 수 있다. 특히, 표 3에 명시된 pPJV1671의 요소, 이러한 요소의 기능적 변이체 또는 이들의 기능적 단편이 이용될 수 있다. 마찬가지로, 실시예 5에 명시된 pPJV7563의 요소, 이러한 요소의 기능적 변이체 또는 이들의 기능적 단편이 이용될 수 있다. 바람직하게는, pPJV7563 및/또는 pPJV1671의 1개 이상의 요소 자체의 서열이 이용될 수 있다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 구조물 pPML7789의 상응하는 요소가 이용될 수 있고 이들의 위치는 특히 도 21에 나타나 있으며 서열 목록이 본원에 제공된다. 추가의 바람직한 예에서, 벡터 pPJV2012 및 pPJV7788의 상응하는 요소가 이용될 수 있고, 특히 표 6 및 표 8에 나타낸 요소가 이용될 수 있다. 벡터 pPML7789, pPJV2012 및 pPJV7788의 요소의 기능적 단편 및 변이체 또한 본 발명의 구조물에 이용될 수 있다.
한 바람직한 예에서, 본 발명의 구조물은 키메릭 프로모터에 작동가능하게 연결되도록 (i) 또는 (ii)의 서열에 인플루엔자 항원, 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 코딩하는 서열을 삽입하는 것과 관계없이,
(i) 서열 14로서 제공된 벡터 pPJV7563의 서열;
(ii) (i)의 서열과 60％의 서열 동일성을 갖는 서열
을 포함한다. 바람직한 예에서, 이러한 구조물의 코딩 서열은 HA 항원, 그의 면역원성 변이체 또는 이들의 면역원성 단편을 코딩한다.
본 발명의 추가로 바람직한 예에서, 벡터가 서열 54로서 제공된 벡터 pPJV1671의 서열 또는 이와 60％의 서열 상동성을 갖는 서열을 포함하는 것인 구조물이 제공된다. 또다른 바람직한 예에서 서열 50으로서 제공된 벡터 pPML7789의 서열 또는 이와 60％의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
바람직한 예에서, pPJV7563 및/또는 pPJV1671의 CMV 프로모터, 비-번역 리더 서열, 래트 인슐린 인트론 A, 비-번역 리더 서열, HBV 인핸서 및/또는 토끼 폴리A 서열, 또는 이들 서열의 기능적 변이체 또는 단편이 이용된다. 특히 바람직한 예에서 pPJV7563 및/또는 pPJV1671의 래트 인슐린 인트론 A 및/또는 HBV 인핸서, 또는 이들 서열의 기능적 단편 또는 변이체가 이용된다. 특히, 래트 인슐린 인트론 A 및 HBV 인핸서가 둘다 이용되거나, 이들 서열의 기능적 단편 또는 변이체가 이용된다. 또다른 바람직한 예에서, pPML7789, pPJV2012, pPJV7788의 상응하는 서열, 이들 서열의 기능적 단편 또는 이들 서열의 변이체가 이용될 수 있다.
구조물이 다수의 폴리펩티드 및 그 중에서도 항원을 코딩하는 예에서, 구조물의 크기를 축소하기 위해 특정 서열이 생략될 수 있다. 예를 들면, 구조물은 특히 3, 4, 5개 이상의 항원이 코딩되는 경우에 인핸서 및/또는 비-번역 리더 서열이 없을 수 있다. 동일한 갯수의 항원을 코딩하는 다른 구조물에서 이들 서열은 여전히 존재할 수 있다.
특히 바람직한 예에서, 벡터 pPJV7563을 사용하여 목적하는 코딩 서열 및 그 중에서도 항원, 예를 들면 본원에서 언급한 항원에 대한 코딩 서열을 클로닝한다. 바람직한 예에서 목적하는 인플루엔자 항원, 그의 단편 또는 변이체가 벡터로 클로닝된다. 몇몇 경우에는 pPJV7563에 변형이 있을 수 있다. 예를 들면, 카나마이신 내성 유전자를 대안의 유전자 및 그 중에서도 대안의 선택가능하거나 선별가능한 표지로 교환할 수 있다. 본 발명의 핵산 구조물은 선택가능한 표지를 포함할 수 있다. pPJV7563의 pUC19 플라스미드 기본구조는 변형되거나 상이한 플라스미드 기본구조로 대체될 수 있다. pPJV7563의 특정 요소는 예를 들면, 동일한 기능을 발휘하는 요소 및 그 중에서도 pPJV7563에서의 서열의 기능적 변이체 또는 단편으로 교환될 수 있다. 몇몇 예에서 pPJV7563은 특정 요소를 대체될 요소와 동일한 기능을 하는 본원에서 언급한 요소로 대체함으로써 변형될 수 있다. pPJV1671이 이용되는 경우에는 pPJV1671에 유사한 변형이 있을 수 있다. 또한 유사한 변형이 본원에서 언급한 벡터 및 그 중에서도 pPML7789, pPJV2012 및 pPJV7788에 있을 수 있다. pPML7789, pPJV2012 및 pPJV7788의 코딩 서열은 본원에서 언급한 코딩 서열로 교환될 수 있다. pPJV2012 및 pPJV7788의 경우에 벡터의 코딩 서열 1개 또는 2개가 교환될 수 있다.
한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구조물은 키메릭 프로모터에 작동가능하게 연결되도록 목적하는 코딩 서열을 삽입하는 것과 관계없이,
(i) 서열 14로서 제공된 벡터 pPJV7563의 서열;
(ii) (i)의 서열과 60％의 서열 동일성을 갖는 서열
을 포함한다. 바람직한 예에서, 코딩 서열은 항원을 코딩한다. 특히, 인플루엔자 항원, 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 코딩하는 코딩 서열이 (i) 또는 (ii)의 서열에 삽입되어 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결된다.
구조물은 삽입된 코딩 서열을 고려하거나 또는 이들을 무시하여도 (i)의 서열과 60％의 서열 동일성을 가질 수 있다. 구조물은 본원에서 명시한 서열 동일성 값 및 그 중에서도 70％ 이상, 바람직하게는 80％ 이상, 보다 바람직하게는 90％ 이상 및 보다 더욱 바람직하게는 95％ 이상의 값을 가질 수 있다. 바람직한 실시양태에서 구조물은 코딩 서열의 삽입과 관계없이 pPJV7563이다.
또다른 서열이 pPJV7563의 서열에 추가되어 본 발명의 또다른 구조물을 생산할 수 있다. 예를 들면 본 발명의 1개 이상의 키메릭 프로모터가 이러한 프로모터와 작동가능하게 연결될 수 있는 본원에서 언급한 서열과 함께 추가될 수 있다. pPJV7563의 클로닝 부위는 상이한 제한 단편의 클로닝 및 그 중에서도 상이한 단편으로서 코딩 서열의 클로닝이 가능하도록 변형될 수 있다. 유사한 변형이 본원에서 언급한 벡터 및 그 중에서도 pPML7789, pPJV2012 및 pPJV7788에 있을 수 있다.
또다른 바람직한 예에서, 본 발명의 구조물은 항원을 코딩하는 pPJV1671의 코딩 서열 일부 또는 전체를 상이한 항원을 코딩하는 서열로 대체함으로써 제조될 수 있다. 다시, pPJV7563과 관련하여 상기 논의된 변형이 또한 pPJV1671에도 있을 수 있다. 이러한 변형은 또한 pPML7789에도 있을 수 있다. pPJV2012 및 pPJV7788의 코딩 서열은 또한 다른 목적하는 코딩 서열 및 그 중에서도 항원을 코딩하는 서열로 대체될 수 있다.
다른 바람직한 예에서, 본 발명의 구조물은
- 서열 54로서 제공된 벡터 pPJV1671의 서열 또는 이와 60％의 서열 동일성을 갖는 서열;
- 서열 59로서 제공된 벡터 pPML7789의 서열 또는 이와 60％의 서열 동일성을 갖는 서열;
- 서열 61로서 제공된 벡터 pPJV2012의 서열 또는 이와 60％의 서열 동일성을 갖는 서열;
- 서열 62로서 제공된 벡터 pPJV7788의 서열 또는 이와 60％의 서열 동일성을 갖는 서열
을 포함한다.
이러한 예에서, 구조물은 본원에서 명시된 서열 동일성 비율 및 그 중에서도 pPJV7563과 관련하여 상기 명시한 서열 동일성 비율을 가질 수 있다.
본 발명의 구조물은 본원의 표에서 명시된 요소 및 그 중에서도 표 3, 6 및 8에서 명시된 것들을 포함할 수 있다. 이러한 서열의 기능적 단편, 및 이러한 서열의 변이체 및 그의 단편 또한 이용될 수 있다. 바람직한 예에서, 벡터가 아쥬반트 벡터인 경우에는 표 6 및/또는 표 8에서 명시된 1개 이상의 요소, 또는 이러한 서열의 단편 또는 변이체가 존재할 수 있다.
본 발명은 또한 폴리펩티드 및 그 중에서도 항원에 대한 코딩 서열을 이러한 서열이 없는 본 발명의 벡터에 삽입하는 것을 포함하는 본 발명의 구조물의 제조 방법을 제공한다. 코딩 서열은 본원에서 언급한 항원을 코딩할 수 있다. 바람직한 예에서, 본 발명은 선택된 코딩 서열을 pPJV7563, pPJV1671 또는 본원에서 논의된 벡터의 변형된 형태 중 하나에 도입하는 것을 포함하는 상기 방법을 제공한다. 이들은 pPML7789, pPJV2012 및/또는 pPJV7788 및 그 중에서도 pPML7789에 삽입될 수 있다. 몇몇 경우에 또다른 코딩 서열이 삽입되고/삽입되거나 기존의 코딩 서열이 상이한 코딩 서열로 대체될 수 있다.
본 발명은 또한 프로모터 서열 및 프로모터에 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 제공하고, 여기서 구조물은
(a) HBVpreS2 항원 서열, HBV e-항원 서열 또는 HSV 타입 2gD 항원 서열로부터 유도되고, 코딩 서열 및 코딩 서열에 대해 이종성인 프로모터와 작동가능하게 연결된 비-번역 리더 서열; 및/또는
(b) 코딩 서열의 3'에 존재하고 이에 작동가능하게 연결된 인핸서 서열을 더 포함하고, 상기 인핸서 서열은 HBsAg 서열의 3'UTR 또는 원숭이 CMV 즉시형 초기 유전자 서열의 3'UTR로부터 유도되고, 상기 코딩 서열은 3' 인핸서 서열에 대해 이종성이다.
벡터의 다양한 요소는 본원에서 명시한 것들일 수 있다. 한 예에서, 프로모터 서열 (i)은 hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열, 슈도라비즈 바이러스 프로모터 서열 및 로우즈 육종 바이러스 프로모터 서열로부터 선택된다. 또다른 예에서, 프로모터는 본원에서 논의된 키메릭 프로모터 중 하나이다.
또다른 예에서, 본 발명은 정제되고 단리된 키메릭 프로모터를 제공하고, 상기 키메릭 프로모터는 본원에서 정의된 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 구조물은 세포 또는 세포 물질이 실질적으로 없거나 이들과 회합될 수 있다. 이는 실질적으로 단리된 형태이거나, 실질적으로 정제된 형태일 수 있으며, 이 경우 일반적으로 제조시의 건조 질량 또는 폴리뉴클레오티드의 90％ 이상, 예를 들어 95％, 98％ 또는 99％ 이상을 포함할 것이다.
본 핵산 분자는 프로모터와의 작동가능한 연결로 폴리뉴클레오티드의 발현을 위해, 적합한 숙주 세포에 전달될 수 있다. 바람직하게는, 숙주 세포는 포유동물 세포, 특히 인간 세포이다. 이러한 세포에 핵산을 전달하는 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면 덱스트란 매개형 형질감염, 인산칼슘 침전, 전기천공 및 세포핵으로의 직접적인 미세주입을 포함한다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 벡터로 형질전환가능한 세포를 제공한다.
상기 기재된 바와 같이, 구조물에서 핵산 코딩 서열은 치료학적으로 관련있는 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 따라서, 본 구조물은 표준 유전자 전달 프로토콜을 이용하는 핵산 면역화 또는 유전자 요법에 사용될 수 있다. 적합한 유전자 전달 방법은 후술되는 바와 같이 당업계에 공지되어 있다. 핵산 분자는 직접적으로 대상체에 전달되거나, 이와 달리 대상체로부터 유도된 세포에 생체외에서 전달된 후 이 세포가 대상체에 재이식될 수 있다. 바람직한 예에서, 구조물은 대상체에 직접적으로 전달되고, 여기서 코딩된 폴리펩티드는 항원, 특히 인플루엔자 항원이다. 본원에서 언급한 전달 경로 및 그 중에서도 경피 전달이 이용될 수 있다. 본 발명의 아쥬반트 구조물을 투여하여 항원 및 그 중에서도 본 발명의 구조물로부터 발현된 항원에 대한 면역 반응을 증대시킬 수 있다.
본 발명은 또한 핵산 면역화를 위한 의약의 제조에 있어서 본 발명의 핵산 구조물 또는 본 발명의 핵산 구조물의 집합체 또는 본 발명의 코팅된 입자의 용도를 제공한다. 의약은 주사, 경피 입자 전달, 흡입에 의해, 국소적으로, 경구로, 비강내로, 또는 경점막으로 전달되는 것일 수 있다. 바람직한 예에서, 의약은 바늘 없는 주사에 의해 전달된다.
핵산 면역화 또는 유전자 요법에 사용하는 경우, 핵산 구조물은 통상의 제약 제제로서 제형화될 수 있다. 이는 당업자에게 이용가능한 표준 제약 제형화 화학법 및 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 1개 이상의 핵산 서열 (DNA 플라스미드와 같이 적합한 벡터 형태로 존재함)을 함유하는 조성물을 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제 또는 비히클과 배합하여 액제를 제공할 수 있다. 따라서 본 발명의 핵산 구조물 및 제약상 허용되는 캐리어 또는 부형제를 포함하는 제약 조성물도 제공된다. 바람직한 예에서 제약 조성물은 본원에서 언급한 것들을 포함하는, 본 발명의 복수의 구조물 또는 본 발명의 구조물의 집합체를 포함할 수 있다.
보조 물질, 예를 들어 습윤제 또는 유화제, pH 완충 물질 등이 부형제 또는 비히클 중에 존재할 수 있다. 이들 부형제, 비히클 및 보조 물질은 일반적으로 지나친 독성 없이 투여될 수 있고, 백신 조성물의 경우에는, 조성물이 투여된 개체에서 면역 반응을 유도하지 않을 제약 제제이다. 제약상 허용되는 부형제는 액체, 예컨대 물, 식염수, 폴리에틸렌글리콜, 히알루론산, 글리세롤 및 에탄올을 포함하며, 이들로 한정되지는 않는다. 또한, 제약상 허용되는 염, 예를 들어 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 포스페이트, 술페이트 등과 같은 무기산 염; 및 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트와 같은 유기산 염 등이 포함될 수 있다. 또한, 필수적이지는 않으나, 제제는 특히 펩티드, 단백질 또는 다른 유사 분자가 조성물에 포함되는 경우 이들을 위한 안정화제로서 작용하는 제약상 허용되는 부형제를 함유하는 것이 바람직하다. 펩티드를 위한 안정화제로도 작용하는 적합한 캐리어의 예는 제약학적 등급의 덱스트로즈, 슈크로즈, 락토즈, 트레할로즈, 만니톨, 소르비톨, 이노시톨, 덱스트란 등을 포함하나, 이들로 한정되지는 않는다. 다른 적합한 캐리어는 전분, 셀룰로즈, 인산나트륨 또는 인산칼슘, 시트르산, 타르타르산, 글리신, 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 및 이들의 조합물을 포함하나, 이들로 한정되지는 않는다. 제약상 허용되는 부형제, 비히클 및 보조 물질에 대한 자세한 논의는 본원에 참조로 포함되는 문헌 [REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N. J. 1991)]에서 찾을 수 있다.
또한, 핵산 흡수 및/또는 발현의 특정 촉진자 ("형질감염 촉진제"), 예를 들어 부피바카인(bupivacaine), 카디오독소(cardiotoxin) 및 슈크로즈와 같은 촉진자, 및 핵산 분자의 전달에 통상 사용되는 리포솜 제제 또는 지질 제제와 같은 형질감염 촉진 비히클이 조성물에 포함될 수 있다. 핵산 분자의 전달을 위한 음이온 및 중성 리포솜이 광범위하게 이용가능하며 널리 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Liposomes: A Practical Approach, (1990) RPC New Ed., IRL Press] 참조). 또한, 양이온 지질 제제가 핵산 분자의 전달에 사용하기 위한 널리 공지된 비히클이다. 적합한 지질 제제는 DOTMA (N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드) (상표명 리포펙틴 (LipofectinTM)으로 입수가능), 및 DOTAP (1,2-비스(올레일옥시)-3-(트리메틸암모니오)프로판)을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7416]; 문헌 [Malone et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6077-6081]; 미국 특허 제5,283,185호 및 미국 특허 제5,527,928호, 및 국제 공개 번호 WO 90/11092, 국제 공개 번호 WO 91/15501 및 국제 공개 번호 WO 95/26356을 참조한다. 이들 양이온 지질은 바람직하게는 중성 지질, 예를 들어 DOPE (디올레일 포스파티딜에탄올아민)와 함께 사용될 수 있다. 상기 지질 제제 또는 리포솜 제제에 첨가될 수 있는 추가의 형질감염-촉진 조성물은 스페르민 유도체 (예를 들어 국제 공개 번호 WO 93/18759 참조) 및 막-투과성 화합물, 예를 들어 GALA, 그라미시딘 S(Gramicidine S) 및 양이온성 담즙염 (예를 들어 국제 공개 번호 WO 93/19768 참조)을 포함한다.
별법으로, 본 발명의 핵산 분자는 캡슐화되거나, 미립자 캐리어 상에 흡착되거나, 이와 회합될 수 있다. 적합한 미립자 캐리어는 폴리메틸 메타크릴레이트 중합체로부터 유도된 것들 뿐만 아니라, 폴리(락티드) 및 폴리(락티드-코-글리콜리드)로부터 유도된 PLG 미세입자를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Jeffery et al. (1993) Pharm. Res. 10: 362-368]을 참조한다. 또한, 다른 미립자계 및 중합체, 예를 들어 폴리리신, 폴리아르기닌, 폴리오르니틴, 스페르민, 스페르미딘과 같은 중합체 및 이들 분자의 접합체가 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 구조물은 핵산 응축제 및 금속 이온 킬레이트화제의 존재하에 캐리어 상에 침전된다. 바람직한 응축제는 양이온 중합체, 특히 폴리아민, 및 그 중에서도 폴리아르긴 또는 폴리리신을 포함한다. 바람직한 예에서 폴리아민은 (Arg)4 또는 (Arg)6이다. 본 발명의 코팅된 캐리어 입자를 제조하는데 이용될 수 있는 것은 WO2004/208560에 논의된 기술을 참조할 수 있다.
일단 제형화되면, 조성물은 다양한 공지된 경로 및 기술을 이용하여 생체내에서 대상체에 전달될 수 있다. 예를 들어, 액제는 주사가능한 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로서 제공되고, 통상의 바늘 및 주사기를 이용하거나 액체 제트 주입 시스템을 이용하여 비경구, 피하, 피내, 근육내, 정맥내 주사를 통해 투여될 수 있다. 또한, 액제는 피부 또는 점막 조직에 국소적으로 투여되거나 호흡기 또는 폐 투여에 적합한 미분된 스프레이로서 제공될 수 있다. 다른 투여 방식은 경구 투여, 좌제 및 능동적 또는 수동적 경피 전달 기술을 포함한다.
별법으로, 조성물은 생체외에서 투여될 수 있으며, 예를 들어 대상체에 형질전환된 세포를 전달 및 재이식하는 것이 공지되어 있다 (예: 덱스트란-매개형 형질감염, 인산칼슘 침전, 전기천공 및 세포핵으로의 직접적인 미세주입).
조성물은 투여량 제형과 상용가능하고 예방 및/또는 치료 유효량인 양으로 대상체에 투여된다. 적절한 유효량은 비교적 광범위한 범위에 속하지만 통상의 시도로 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 필요량을 결정하는데 있어 "Physicians Desk Reference" 및 "Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics"이 유용하다. 예를 들어, 일반적으로 폴리뉴클레오티드의 유효량은 약 0.001 내지 1000 ㎍, 바람직하게는 0.001 내지 1OO ㎍, 보다 바람직하게는 0.01 내지 10.0 ㎍의 범위에 속하는 것으로 예상된다. 몇몇 예에서, 투여량은 0.1 내지 100 ㎍, 바람직하게는 0.5 내지 25 ㎍일 수 있다. 투여량이 바늘 없는 주사를 통해 투여되는 경우에, 투여량은 0.1 내지 25 ㎍, 바람직하게는 0.5 내지 10 ㎍, 보다 바람직하게는 1 내지 5 ㎍일 수 있다. 특히 투여량은 4 ㎍일 수 있다. 몇몇 경우에, 투여량은 예를 들어 1, 2, 3, 4 또는 5차례의 바늘 없는 주사와 같이 복수의 바늘 없는 주사를 통해 제공될 수 있다.
몇몇 경우에 초기 투여 후에 구조물의 후속 투여가 수행될 수 있다. 특히, 초기 면역화 후에 대상체에 2차 면역화가 제공될 수 있다. 2차 면역화는 예를 들면 본원에서 언급한 것들 중에서 선택된 투여량일 수 있다. 대상체 투여는 예를 들면 초기 투여 후에 1주, 2주, 1개월, 2개월 또는 6개월 이상일 수 있다.
한 예에서, 본 발명의 핵산 구조물은 또다른 핵산 구조물과 함께 사용될 수 있다. 한 경우에, 핵산 구조물은 아쥬반트의 발현과 관련하여 본원에 기재된 것들 중 하나일 수 있으며, 다른 구조물은 1개 이상의 항원을 코딩하는 구조물일 수 있다. 바람직한 경우에, 이들 구조물이 둘다 본 발명의 키메릭 프로모터를 사용할 수 있다. 2개 이상의 제제가 본원에서 제공되는 경우에 이들은 특히 별개로, 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
한 구조물이 아쥬반트를 발현하고 다른 구조물이 항원 또는 항원들을 발현하는 경우에, 항원은 특히 HSV, HPV 또는 간염 바이러스 (특히 B형 간염 바이러스) 항원일 수 있다. 항원은 특히 HSV ICP0, ICP4, ICP22 및 ICP27 항원일 수 있으며, 바람직하게는 4개 모두이다. 특히 바람직한 경우에, 항원은 본원에서 언급한 것들을 포함하는 인플루엔자 항원 및 그 중에서도 HA, NA 및/또는 M2, 특히 HA 및 NA, 특히 HA일 수 있다. 이러한 항원이 발현되는 경우에, 아쥬반트 구조물은 특히 LTA 및/또는 LTB, 특히 둘다를 발현할 것이다. 본원에서 언급한 아쥬반트 구조물은 항원을 코딩하는 구조물과 동시에, 별개로 또는 순차적으로 이용될 수 있다.
본 발명의 2개의 물질은 별개로, 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 2개의 구조물은 별개로, 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 2개의 구조물은 동일하거나 상이한 조성물로 투여될 수 있다. 특히, 한 구조물이 아쥬반트 효과를 갖는 경우, 2개의 구조물은 아쥬반트 효과가 나타나도록 전달될 것이다. 즉, 발생하는 면역 반응은 아쥬반트가 항원과 함께 투여되지 않은 경우보다 크고/크거나 장기간 동안 지속될 것이다. 바람직한 예에서, 2개의 구조물은 동일한 조성물로, 바람직하게는 동일한 캐리어 입자 상에서 전달될 수 있다. 다른 경우에 구조물을 담지한 캐리어 입자는 또다른 구조물을 담지한 캐리어 입자와 혼합될 수 있다. 이러한 투여 계획은 본원에서 논의된 복수 구조물의 조합체 경우에도 이용될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 핵산 구조물은 입자-매개형 전달 기술을 이용해 표적 세포에 전달된다. 핵산 제제를 전달하기 위한 입자 매개형 방법이 당업계에 공지되어 있다.
따라서, 바람직한 예에서 본 발명은 본 발명의 핵산 구조물 또는 본 발명의 핵산 구조물의 집합체로 코팅된 캐리어 입자를 포함하는 코팅된 입자를 제공한다. 특히, 코팅된 입자는 입자-매개형 전달 기구로의 전달을 위해 적합하다.
입자 매개형 전달을 위한 입자는 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용해 본 핵산 분자를 캐리어 입자 (예: 코어 캐리어)에 코팅함으로써 형성될 수 있다. 캐리어 입자는 입자 매개형 전달 기구로의 세포내 전달을 위해 통상적으로 사용되는 입자 크기의 범위에 있는 적합한 밀도를 갖는 물질로부터 선택된다. 통상적으로, 캐리어 입자의 직경은 0.1 내지 5 ㎛, 예를 들어 0.5 내지 3 ㎛, 바람직하게는 1 내지 2 ㎛이다. 몇몇 경우에, 입자는 직경이 1 내지 3 ㎛일 수 있다. 최적 캐리어 입자 크기는, 물론, 표적 세포의 직경에 따라 다를 것이다.
통상적으로, 캐리어 입자는 비활성 금속 중에서 선택된다. 금속은 이들이 생리학적으로 활성이 아니라는 점에서 비활성이다. 본 발명의 목적상, 예를 들어 철, 코발트, 니켈, 구리, 은, 카드뮴, 하프늄, 탄탈, 텅스텐, 백금, 금 및 스테인리스강이 사용될 수 있으며, 특히 텅스텐, 금, 백금 및 이리듐 캐리어 입자가 사용될 수 있다. 텅스텐 및 금 입자가 바람직하다. 따라서, 바람직한 예에서, 본 발명은 금 또는 텅스텐인 코팅된 캐리어 입자를 제공한다. 텅스텐 입자는 평균 직경 0.5 내지 2.0 ㎛가 쉽게 이용가능하다. 이러한 입자가 입자의 가속 전달 방법에 사용하기 위한 최적 밀도를 갖고 DNA로의 매우 효율적인 코팅을 가능하게 하지만, 텅스텐은 특정 세포형에 잠재적으로 독성일 수 있다. 또한, 금 입자 또는 미세결정 금 (예: 금 분말 A1570; 미국 뉴저지주 이스트 뉴워크 소재의 엥겔하드 코포레이션 (Engelhard Corp.))이 본 발명의 방법에 사용될 것이다. 금 입자는 균일한 크기를 제공하고 (1 내지 3 ㎛의 입자 크기 (알파 케미컬즈(Alpha Chemicals)), 0.95 ㎛를 포함한 입자 크기 (미국 뉴저지주 사우쓰 플레인필드 소재의 데구사(Degussa))), 감소된 독성을 제공한다. 미세결정 금은 통상적으로 0.1 내지 5 ㎛ 범위의 다양한 입자 크기 분포를 제공한다. 그러나, 불규칙한 표면적의 미세결정 금이 핵산으로의 매우 효율적인 코팅을 제공한다.
DNA 또는 RNA를 금 또는 텅스텐 입자에 코팅 또는 침전시키기 위한 수많은 방법이 공지되고 기술되어 있다. 대부분의 이러한 방법은 일반적으로 예정량의 금 또는 텅스텐을 플라스미드 DNA, CaCl2 및 스페르미딘과 배합한다. 균일한 반응 혼합물이 되도록 생성된 용액을 코팅 절차 동안 연속적으로 볼텍싱한다. 핵산을 침전시킨 후, 코팅된 입자를 적합한 막에 옮기고, 사용 전에 건조시키며, 샘플 모듈 또는 카세트의 표면에 코팅하거나, 특히 입자 매개형 전달 기구에 사용하기 위한 전달 카세트에 부하할 수 있다.
별법으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 미립자 조성물로서 제형화될 수 있다. 제형화는 상기 기재된 표준 제약 제형 화학법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 적합한 조성물을 제공하기 위해 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제 또는 비히클과 배합될 수 있다. 이어서, 제형화된 조성물은 단순 증발 (공기 건조), 진공 건조, 분무 건조, 동결 건조 (냉동건조), 분무-동결 건조, 분무 코팅, 침전, 임계 유체 입자 제형화 등과 같은 표준 기술을 이용하여 입자로서 제조된다. 필요한 경우, 생성된 입자는 본원에 참조로 포함된 공동 소유의 국제 공개 번호 WO 97/48485에 개시된 기술을 이용해 치밀화될 수 있다.
이들 방법은 입자 크기가 약 0.01 내지 약 250 ㎛, 바람직하게는 약 10 내지 약 150 ㎛, 가장 바람직하게는 약 20 내지 약 60 ㎛이고; 입자 밀도가 약 0.1 내지 약 25 g/cm3이며; 벌크 밀도가 약 0.5 내지 약 3.0 g/cm3 또는 그 이상인 핵산 입자를 수득하는데 이용될 수 있다.
핵산 분자를 포함하는 입자가 형성되면, 이들은 단일 단위 투여 또는 복수투여 용기로 포장될 수 있다. 따라서 본 발명은 또한 본 발명의 코팅된 입자를 포함하는 입자 매개형 전달 기구를 위한 투여 용기도 제공한다. 이러한 용기는 적당량의 입자를 밀봉한 밀폐된 용기를 포함할 수 있다. 입자는 멸균 제형으로서 포장될 수 있으며, 이렇게 밀폐된 용기는 대상체에 전달되어 사용될 때까지 제형의 멸균을 유지하도록 디자인될 수 있다. 용기는 바람직하게는 입자 매개형 전달 기구에 직접 사용하도록 적합화된다. 통상적으로, 이러한 용기는 캡슐, 호일 파우치, 사세이(sachet), 카세트 등의 형태를 취한다. 또한, 입자 전달 기구는 적합한 용량의 입자를 포함하는 예비-부하된 상태로 제공될 수 있다. 또한, 예비-부하된 기구는 이어서 밀폐된 용기에 미리 포장될 수 있다.
입자가 포장되는 용기는 조성물을 확인하고 관련 용량 정보를 제공하기 위해 추가로 표지를 붙일 수 있다. 또한, 용기는 정부 기관, 예를 들어 식약청에 의해 규정된 형태의 공지문 (여기서, 공지문은 제조물에 대한 연방법 하에 정부 기관에 의한 승인을 나타낸다), 인간 투여를 위한 그 안에 포함된 핵산 제제의 용법 또는 판매에 대해 표지를 붙일 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 코팅된 입자가 부하된 입자 매개형 전달 기구를 제공한다. 바람직하게는, 전달 기구는 바늘 없는 주사기이다. 입자-매개형 전달에 적합한 입자 가속 기구가 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 통용되는 유전자총 기구(gene gun device)는 표적 세포를 향해 코팅된 캐리어 입자를 추진하기 위해 폭발적, 전기적 또는 기체 방출을 이용한다. 코팅된 캐리어 입자는 이동가능한 캐리어 시트에 탈착가능하게 부착되거나, 기체 스트림이 통과하는 표면을 따라 제거가능하게 부착되어, 표면으로부터 입자를 들어올리고 이를 표적물을 향하여 가속시킬 수 있다. 기체 방출 기구의 예가 미국 특허 제5,204,253호에 개시되어 있다. 폭발형 기구가 미국 특허 제4,945,050호에 개시되어 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 전기적 방출 기구의 한 예가 미국 특허 제5,120,657호에 개시되어 있다. 또다른 전기적 방출 기구가 미국 특허 제5,149,655호에 개시되어 있다. 이들 특허는 모두 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
또한, 입자는 바늘 없는 주사기, 예를 들어 미국 특허 제5,630,796호 (Bellhouse et al.) ("PowderJect® 바늘 없는 주사기") 및 국제 공개 번호 WO 94/24263, 국제 공개 번호 WO 96/04947, 국제 공개 번호 WO 96/12513 및 국제 공개 번호 WO 96/20022 (이들 모두 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 것들을 사용하여 투여될 수 있다.
미국 특허 제5,630,796호에 개시된 것과 같은 기구가, 상단으로부터 하단으로 순차적으로 기체 실린더, 입자 카세트 또는 패키지 및 관련 소음기 매체를 갖는 초음속 노즐을 포함하는 펜-모양의 도구로서 제공될 수 있다. 입자는 적합한 용기, 예를 들어 자체-포함된 밀봉 유니트를 형성하기 위해 워셔(washer)-모양의 스페이서(spacer)로 가열-밀봉되는 2개의 파열가능한 중합체 막으로 형성된 카세트에 제공된다. 막 물질은 초음속 유동이 개시되는 조건을 지시하는 특정 모드의 개방 및 파열 압력을 달성하도록 선택될 수 있다.
기구는 작동시 실린더로부터 기구 내의 팽창 챔버로 압축된 기체를 방출하도록 작동된다. 방출된 기체는 입자 카세트와 접촉하고, 충분한 압력이 되면 카세트 막을 갑작스럽게 부러뜨려 입자를 추후 전달을 위한 초음속 노즐로 몰아간다. 이 노즐은 소정량의 입자를 예정된 면적의 표적 표면으로 전달하기 위한 특정 기체 속도 및 유동 패턴을 달성하도록 디자인된다. 소음기는 초음속 기체 유동에 의해 발생되는 소음을 줄이기 위해 사용된다.
또한, 국제 공개 번호 WO 96/20022에 개시된 전달 시스템은 분말 조성물을 가속하고 전달하기 위해 압축된 기체 공급원의 에너지를 사용한다. 이는 입자를 가속시키기 위해 기체 유동 대신 충격파를 사용하는 미국 특허 제5,630,796호의 시스템과 구별된다. 보다 특히, 가요성 돔(dome) 뒤에서 발생된 충격파에 의해 제공되는 순간적 압력 상승이 돔의 후면에 타격을 주어, 표적물 표면의 방향으로 가요성 돔의 갑작스러운 외전(eversion)을 일으킨다. 이러한 갑작스러운 외전은 분말 조성물 (돔의 외측에 위치함)을 충분한 속도, 따라서 운동량으로 발사시켜 표적 조직, 예를 들어 구강 점막 조직을 투과한다. 분말 조성물은 완전한 돔 외전 시에 방출된다. 또한, 돔은 고압 기체 유동을 완전히 포함하여 고압 기체 유동은 조직과 접촉하지 않는다. 기체가 이러한 전달 작동 동안에 방출되지 않기 때문에, 이 시스템은 본질적으로 조용하다. 이러한 디자인은, 예를 들어 입자를 최소 침윤성 수술 부위에 전달하기 위한 다른 에워싸이거나 그렇지 않으면 민감한 적용에 이용될 수 있다.
입자는 대상체에 직접적으로 생체내에서 전달되거나, 대상체로부터 채취한 세포에 세포외에서 전달될 수 있고, 형질전환된 세포는 대상체에 재이식될 수 있다. 생체내 전달의 경우, 입자 주입은 통상적으로 피하, 상피, 피내, 점막내 (예: 비강, 직장 및/또는 질), 복강내, 정맥내, 경구 또는 근육내 경로를 통한 것이다. 바람직하게는, 최종 분화된 세포에 전달된다; 그러나, 입자는 또한 분화되지 않았거나 부분적으로 분화된 세포, 예를 들어 혈액의 줄기 세포 및 피부 섬유아세포에 전달될 수 있다. 가장 바람직하게는, 피부 상피 세포에 전달된다.
입자는 투여 제형과 상용성인 방식으로 예방 및/또는 치료 유효량인 양으로 대상체에 투여된다. 본 미립자 조성물의 "치료 유효량"은 질환 또는 증상 증후를 치료 또는 예방하기에 충분하며, 통상의 실험으로 결정될 수 있는 비교적 광범위한 범위에 속할 것이다. 일반적으로, 입자는 1회 투여당 핵산 0.001 내지 1000 ㎍, 보다 바람직하게는 0.01 내지 10.0 ㎍의 양으로 전달된다. 그러나, 정확한 필요량은 치료되는 개체의 연령 및 일반적 증상, 및 선택된 특정 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라, 기타 인자에 따라 다를 것이다. 적합한 유효량은 임상 시험을 통해 쉽게 결정될 수 있다. 필요량을 결정하는데 있어 "Physicians Desk Reference" 및 "Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics"가 유용하다.
분석법
비교 발현 분석법
요소의 유용성에 대한 적합한 시험으로 그 요소가 폴리펩티드의 발현에 효과적인가를 결정한다. 바람직한 예에서, 폴리펩티드는 인플루엔자 항원, 그의 변이체 또는 이들의 단편일 수 있다. 요소의 유용성을 시험하기 위한 비교의 기본은 "기본 벡터"이며, 이는 일반적으로 (달리 언급하지 않는 한) hCMV 프로모터, hCMV 엑손 1, hCMV 엑손 2의 9개 염기, HBVpreS2로부터의 5'UTR 및 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화 영역을 갖고, 코딩 서열의 발현을 유도하도록 위치한다. 통상적으로, 기본 벡터는 pPJV7384, pPJV 7401, pPJV 7450 또는 pPJV 7533이다. 몇몇 예에서, 상기 언급한 요소를 갖는 본원에서 언급한 벡터가 기본 벡터로서 이용될 수 있다. 한 예에서, pPJV1671이 기본 벡터로서 이용될 수 있다. pPJV2012, pPJV7788 및 pPML 7789 또한 기본 벡터로서 이용될 수 있다.
기본 벡터, 이종성 인트론 및 3'UTR이 추가되거나, 기본 벡터에서 프로모터 서열, 엑손, 5'UTR 및 폴리A 부위가 시험 발현 벡터를 형성하기 위해 교환된다. 본원에서 논의된 벡터의 요소가 시험 서열과 교환되어 기본 벡터와 비교된다. 따라서, 기능적 변이체 또는 단편을 시험할 수 있다.
기본 벡터 및 시험 벡터는 적합한 숙주 세포로 형질전환되고, 세포는 폴리펩티드 발현 수준에 대해 분석된다. 바람직하게는, 포유동물 숙주 세포가 사용된다. 적합한 세포는 포유동물 HEK 293T, CHO, HeLa, BHK, 3T3 또는 COS 세포를 포함한다. 몇몇 예에서, SCC15 또는 B16 세포가 이용될 수 있다.
통상적으로, 기능적 요소는 기본 벡터와 비교되는, 예를 들어 최소한 동일하거나 보다 큰 발현을 야기한다. 바람직하게는, 발현을 1개 초과의 세포형에서 1개 초과의 코딩 서열로 시험한다. 몇몇 예에서, 기능적 요소는 기본 벡터보다 약간 낮은 발현, 예를 들면 기본 벡터의 발현의 25％ 이상, 특히 50％ 이상, 바람직하게는 60％ 이상, 보다 바람직하게는 70％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 80％ 이상, 훨씬 더욱 바람직하게는 90％ 이상 및 또한 더욱 바람직하게는 90％ 이상의 발현을 초래할 수 있다. 통상적으로, 특정 요소의 변이체 또는 단편이 그러한 수준의 발현을 나타낸다면, 이들은 특정 요소의 기능적 변이체 또는 단편을 의미하는 것으로 간주될 수 있다. 그러나, 바람직하게는 기능적 변이체 및 단편은 상기 논의된 기본 벡터보다 높은 발현을 초래할 것이다. 증가율은 예를 들면 상기 언급한 비율일 수 있다.
적합한 실험 프로토콜이 예를 들어 하기 실시예 1 내지 18에서 제공된다.
비교 면역원성 분석법
발현될 폴리펩티드가 항원인 경우, 기능적 또는 특히 바람직한 구조물 요소를 확인하기 위해 추가의 시험을 수행할 수 있다. 특히, 이러한 시험은 항원이 예를 들어 인플루엔자 항원, 그의 단편 또는 이들의 변이체인 경우에 수행될 수 있다. 이러한 분석법에서, 면역 반응에 있어서 요소의 효과는 발현 벡터를 시험 유기체에 전달한 후 측정된다. 항원에 대한 항체 수준이 면역 반응을 판단하기 위한 가장 용이한 방법이다. 마우스 군을 기본 벡터 또는 상기한 바와 같이 제작된 시험 벡터로 백신 접종한다. 적합한 시간 후에 혈청을 수집하고 항체 수준에 대해 분석한다.
이 실험은 2회 수행되며, 두 실험에서 모든 군으로부터의 항체 수준을 플로팅한다. 기능적 요소는 통상적으로 두 실험에서 기본 벡터에 의한 것과 적어도 같거나 그보다 높은 특정 항원에 대한 항체 역가를 초래할 것이다. 바람직하게는, 그 결과는 발현 패널에서 요소(들)의 유용성의 폭을 입증하기 위해 1개 초과의 항원으로 나타난 것일 것이다. 몇몇 예에서, 기능적 요소는 기본 벡터로 나타나는 것보다 약간 낮은 항체 역가, 예를 들면 기본 벡터로 나타나는 항체 역가의 25％ 이상, 특히 50％ 이상, 바람직하게는 60％ 이상, 보다 바람직하게는 70％ 이상, 보다 더욱 바람직하게는 80％ 이상, 훨씬 더욱 바람직하게는 90％ 이상 및 또한 보다 더욱 바람직하게는 90％ 이상의 항체 역가를 초래할 수 있다. 통상적으로, 특정 요소의 변이체 또는 단편이 그러한 항체 역가를 초래한다면, 이들은 특정 요소의 기능적 변이체 또는 단편을 의미하는 것으로 간주될 수 있다. 그러나, 바람직하게는 기능적 변이체 및 단편은 상기 논의된 바와 같이 기본 벡터에 의한 것보다 높은 역가를 초래할 것이다. 증가율은 예를 들면 상기 논의된 비율일 수 있다.
아쥬반트 벡터 또한, 시험 아쥬반트 벡터와 표준 아쥬반트를 둘다 동일한 항원과 함께 투여하여 시험 아쥬반트 벡터를 표준 아쥬반트와 비교함으로써 평가할 수 있다. 두 벡터의 아쥬반트 효과를 대조군으로서 단독 투여된 항원을 사용하여 비교한다. 본원에서 언급한 아쥬반트 벡터가 표준으로서 이용될 수 있다. 아쥬반트 효과의 증가율 또는 감소율은 본원에서 언급한 수준일 수 있다.
적합한 실험 프로토콜이 하기 실시예 14에서 예시적으로 제공된다. 적합한 프로토콜이 또한 하기 실시예 15 내지 18에 기재되어 있다.
C. 실험
하기는 본 발명을 수행하기 위한 특정 실시양태의 실시예이다. 실시예는 단지 설명을 목적으로 하는 것으로서, 어떠한 식으로든 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
사용된 수치 (예: 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 기하도록 노력하였으나, 일부 실험 오차 및 편차는 허용되어야 한다.
방법
표준 PCR 조건
벡터의 제작을 위해 이용되는 표준 PCR 조건은 하기와 같다: 1.5 mM MgCl2 (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가 코포레이션(Promega Corporation))를 함유하는 1 x PCR 코어 완충액, 각각 0.400 μM의 프라이머, 각각 200μM의 dNTP (미국 오하이오주 클리브랜드 소재의 USB, 인크.), 2.5 μ Taq 중합효소 (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가 코포레이션), 1.0 ng 주형 DNA, 물 (100 ㎕가 될 때까지), 및 무기 오일 (미국 위스콘신주 밀워키 소재의 알드리치 케미컬, 인크.(Aldrich Chemical, Inc.)) 오버레이. PTC-200 열순환반응기 (미국 매사추세츠주 월텀 소재의 MJ 리서치, 인크.(MJ Research, Inc.))를 하기와 같이 작동하도록 프로그래밍하였다: 4'@95℃, 30 사이클의 (1'@95℃/1'15"@55℃/1'@72℃), 10'@72℃, 4℃ 유지). 제한 효소 (미국 매사추세츠주 베버리 소재의 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs))로 절단하기 전에 QIAquickaPCR 정제 키트 (미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 퀴아겐, 인크.(Qiagen Inc.))를 사용해 PCR 반응으로부터의 증폭 산물을 분리하였다.
모든 PCR 산물을 증폭이 정확한가를 확인하기 위해 클로닝 후에 서열분석하였다.
실시예 1: B형 간염 바이러스 표면 항원 ( HBsAg ) 벡터 패널의 제작
HBsAg의 발현을 위한 다수의 플라스미드 발현 벡터를 제작하였다.
출발 물질
(i) pWRG7128 (문헌 [Roy, M, et. al. Vaccine (2001) 19: 764-778]): hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열, hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 제1 엑손, 제1 인트론 및 제2 엑손 일부, 플랭킹 영역 (HBVpreS2 5'UTR 유도된 서열 및 3' 전사후 반 응 요소)을 갖는 HBsAg 코딩 서열 및 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 영역 (BGHpA)을 포함.
(ii) pPJV7284: 토끼 글로빈 폴리아데닐화 영역 (RBGpA)이 BGHpA로 교체된 pWRG7128의 유도체.
(a) pPJV7384 ( CMV ( 인트론 부재), HBVpreS2 5' UTR 및 RBGpA )
pWRG7128을 표준 조건을 이용하면서 JF93 (서열 15) 및 F110 (서열 16)을 사용해 PCR 증폭하고, Sal1 및 BamH1으로 절단하여 CMV 프로모터, 엑손 1 및 엑손 2 일부 서열을 포함하는 삽입 단편을 단리하였다. pAM6 (미국 버지니아주 마나사스 소재의 ATCC)를 BamH1 및 BstX1로 절단하여 HBsAg의 5'UTR 및 HBsAg 코딩 영역의 약 70％를 포함하는 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7284을 Sal1 및 BstX1으로 절단하여 벡터 단편을 생산하고, 이 벡터 단편에 상기 2개의 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7293를 생산하였다.
pWRG7128을 프라이머 GW1 (서열 17) 및 JF254 (서열 18)을 사용해 PCR 증폭하고, BstX1 및 Bgl2로 절단하여 HBsAg 코딩 영역의 3'-말단을 포함하는 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7293를 BstX1 및 Bgl2로 절단하여 벡터 단편을 생산하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 벡터 pPJV7384를 생산하였다.
(b) pPJV7382 ( CMV ( 인트론 부재), HBsAg 3' UTR , HBVpreS2 5' UTR 및 RBGpA )
pPJV7293를 Xho1 및 Xba1로 절단하여 CMV 프로모터/엑손 및 HBsAg 코딩 서열의 5'-말단과 함께 5'UTR를 포함하는 삽입 단편을 생산하였다. pWRG7128를 Xba1 및 Bcl1로 절단하여 HBsAg 코딩 서열의 대부분 및 3'UTR를 포함하는 삽입 단편을 생산하였다. pPJV7284을 Xho1 및 Bgl2로 절단하여 벡터 단편을 생산하고, 이 벡터 단편에 상기 2개의 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7382를 생산하였다.
(c) pPJV7389 ( CMV ( RIA ), HBsAg 3' UTR , HBVpreS2 5' UTR 및 RBGpA )
래트 인슐린 인트론 A (RIA)를 프라이머 GW150 (서열 19) 및 JF255 (서열 20)을 사용해 플라스미드 p5'rIns로부터 PCR 증폭하였다. PCR 산물을 BamH1로 절단하고 BamH1-선형화한 pPJV7382에 삽입하여 pPJV7389를 생산하였다.
(d) pPJV7387 ( CMV ( RIA ), HBVpreS2 5' UTR 및 RBGpA )
pPJV7384를 BstX1 및 EcoR1로 절단하여 HBsAg 코딩 영역의 3'-말단 및 RBGpA를 포함하는 삽입 단편을 생산하였다. pPJV7389를 BstX1 및 EcoR1로 절단하여 벡터 단편을 생산하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7387를 생산하였다.
실시예 2: 단순 포진 바이러스 당단백질 D 항원 ( HSVgD ) 벡터 패널의 제작
HSVgD의 발현을 위한 다수의 플라스미드 발현 벡터를 제작하였다.
출발 물질
(a) pPJV7334: ATG 개시 코돈의 바로 하류에서 HBsAg 코딩 서열이 인-프레임 Nhe1으로 대체되고, HBV Enh (인핸서)의 가까이에 있는 5'에서 스터퍼 단편(stuffer fragment)이 BamH1로 대체된 pWRG7284 (pPJV 7284)의 유도체.
(b) pWRG7202: 코딩 서열이 Nhe1 부위의 하류에서 인간 조직 플라스미노겐 활성자 (TPA) 시그널 펩티드와 융합하는 것을 가능하게 하는 스터퍼 단편을 갖는 pGem3Z (프로메가)의 유도체.
(a) pPJV 7392 ( CMV (천연 인트론 ), HBsAg 3' UTR , HBsAg 5' UTR 및 RBGpA )
HSV 2gD에 대한 코딩 영역을 프라이머 DS1 (서열 21) 및 DA1 (서열 22)를 사용하여 바이러스 DNA 스톡 (미국 메릴랜드주 컬럼비아 소재의 어드밴스드 바이오테크, 인크.(Advanced Biotech, Inc.))으로 PCR 증폭하고, Nhe1 및 EcoR1로 절단하여 삽입 단편을 생산하였다. pWRG7202를 Nhe1 및 EcoR1로 절단하여 벡터 단편을 생산하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7391를 생산하였다.
pPJV7391을 Nhe1 및 Bgl2으로 절단하여 HSV 2gD 코딩 서열을 포함하는 삽입 단편을 생산하였다. pPJV7334를 Nhe1 및 BamH1로 절단하여 벡터 단편을 생산하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7392를 생산하였다. 이 벡터는 하기 발현 요소로 이루어진다: hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열, hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 제1 엑손, 제1 인트론 및 제2 엑손 일부, HBsAg로부터의 5'UTR, HSV 2gD 유전자에 대한 코딩 서열, HBsAg로부터의 3'UTR, 및 RBGpA.
(b) pPJV7399 ( CMV ( 인트론 부재), HBsAg 3' UTR , HBsAg 5' UTR 및 RBGpA )
pPJV7392의 인트론 없는 형태를 하기와 같이 제작하였다. pPJV7384를 HindIII 및 Nde1로 절단하여 카나마이신 내성 유전자의 5' 말단 및 CMV 프로모터를 포함하는 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7384를 Nde1 및 Ssp1로 절단하여 CMV 프로모터의 3' 말단, CMV 엑손 1/2 및 HBsAg로부터의 5'UTR의 5' 말단을 포함하는 삽입 단편을 단리하였다. 이들 삽입 단편을 pPJV7392에 삽입하고 이로부터 Hind3-Ssp1 단편을 제거하여 pPJV7399를 생산하였다.
(c) pPJV 7400 ( CMV ( RIA ), HBsAg 3' UTR , HBsAg 5' UTR 및 RBGpA )
pPJV7392의 RIA 형태를 하기와 같이 제작하였다. pPJV7384를 HindIII 및 Nde1로 절단하여 카나마이신 내성 유전자의 5' 말단 및 CMV 프로모터를 포함하는 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7387을 Nde1 및 Ssp1로 절단하여 CMV 프로모터의 3' 말단, CMV 엑손 1/2 (일부), RIA, 및 HBsAg로부터의 5'UTR의 5' 말단을 포함하는 삽입 단편을 단리하였다. 이러한 삽입 단편을 pPJV7392에 삽입하고, 이로부터 Hind3-Ssp1 단편을 제거하여 pPJV7400을 생산하였다.
(d) pPJV 7401 ( CMV ( 인트론 부재), HBsAg 5' UTR 및 RBGpA )
pPJV7399의 3'UTR이 없는 형태를 하기와 같이 제작하였다. pPJV7391을 Bsp120I 및 Bgl2로 절단하여 HSV 2gD 유전자의 3' 말단을 포함하는 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7284를 Bgl2 및 EcoR1로 절단하여 RBGpA 시그널을 단리하였다. 이러한 삽입 단편을 pPJV7399에 삽입하고, 이로부터 Bsp120I-EcoR1 단편을 제거하여 pPJV7401를 생산하였다.
(e) pPJV7402 ( CMV ( RIA ), HBsAg 5' UTR 및 RBGpA )
pPJV7400의 3'UTR이 없는 형태를 하기와 같이 제작하였다. pPJV7391을 Bsp120I 및 Bgl2로 절단하여 HSV 2gD 유전자의 3' 말단을 포함하는 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7284를 Bgl2 및 EcoR1로 절단하여 RBGpA 시그널을 단리하였다. 이러한 삽입 단편을 pPJV7400에 라이게이션하고, 이로부터 Bsp120I-EcoR1 단편을 제거하여 pPJV7402를 생산하였다.
실시예 3: Flu M2 항원 벡터 패널의 제작
(a) pPJV 7450 ( CMV ( 인트론 부재), HBsAg 5' UTR 및 RBGpA )
Flu M2에 대한 코딩 영역을 프라이머 JF301 (서열 23) 및 JF302 (서열 24)를 사용해 플라스미드 pFL-M2 (Joel Haynes, pPJV)으로 PCR 증폭하고, Nhe1 및 Bgl2로 절단하여 삽입 단편을 생산하였다. pPJV7401을 Nhe1 및 Bgl2로 절단하여 벡터 단편을 생산하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7450를 생산하였다.
(b) pPJV 7452 ( CMV ( 인트론 부재), HBsAg 3' UTR , HBsAg 5' UTR 및 RBGpA )
3'UTR 단편을 프라이머 JF84 (서열 25) 및 JF225 (서열 26)를 사용해 pPJV7389로 PCR 증폭하고, Bsp120I로 절단하고, T4 DNA 중합효소로 채우고, Bgl2 링커 (cat# 1036, 뉴 잉글랜드 바이오랩스)와 연결하였다. 이어서, 이 단편을 Bgl2 및 EcoR1로 절단하여 HBsAg의 3'UTR 및 RBGpA 영역을 포함하는 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7450을 Bgl2 및 EcoR1로 절단하여 벡터 단편을 생산하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7452를 생산하였다.
(c) pPJV7458 ( CMV ( RIA ), HBsAg 5' UTR 및 RBGpA )
RIA를 포함하는 pPJV7450의 형태를 하기와 같이 제작하였다. pPJV7389를 BamH1로 절단하여 RIA 포함 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7450을 BamH1으로 절단하여 벡터 단편을 생산하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7458을 생산하였다.
(d) pPJV7468 ( CMV ( RIA ), HBsAg 3' UTR , HBsAg 5' UTR 및 RBGpA )
HBsAg의 3'UTR을 포함하는 pPJV7458의 형태를 하기와 같이 제작하였다. pPJV7452를 Bgl2 및 EcoR1로 절단하여 HBsAg 3'UTR 및 RBGpA를 포함하는 삽입 단편 을 생산하였다. pPJV7458을 Bgl2 및 EcoR1로 절단하여 벡터 단편을 생산하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7468을 생산하였다.
실시예 4: β-gal 벡터 패널의 제작
(a) pPJV 7488 ( CMV ( 인트론 부재), HBsAg 3' UTR , HBsAg 5' UTR 및 RBGpA )
CMV-베타 (클론테크(Clontech))를 프라이머 JF335 (서열 27) 및 JF336 (서열 28)을 사용해 PCR 증폭하고, Nhe1 및 Bgl2로 절단하여 β-갈락토시다제를 코딩하는 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7452를 Nhe1 및 Bgl2로 절단하여 벡터 단편을 생산하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7488을 생산하였다.
(b) pPJV7533 ( CMV ( 인트론 부재), HBsAg 5' UTR 및 RBGpA )
pPJV7450을 Bgl2 및 EcoR1로 절단하여 RBGpA를 포함하는 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7488을 Bgl2 및 EcoR1로 절단하여 벡터 단편을 생산하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7533을 생산하였다.
(c) pPJV 7551 ( CMV ( RIA / Nhe1 ), HBsAg 3' UTR , HBsAg 5' UTR 및 RBGpA )
pPJV7530 (실시예 5 참조)을 Xho1 및 BamH1로 절단하여 CMV 프로모터부터 RIA까지를 포함하는 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7488을 Xho1 및 BamH1로 절단하여 벡터 단편을 생산하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7551을 생산하였다.
(d) pPJV7552 ( CMV ( RIA / Nhe1 ), HBsAg 5' UTR 및 RBGpA )
pPJV7530을 Xho1 및 BamH1로 절단하여 CMV 프로모터부터 RIA까지를 포함하는 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7533을 Xho1 및 BamH1로 절단하여 벡터 단편을 생산 하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7552를 생산하였다.
실시예 5: pPJV 발현 벡터 ( pPJV7563 )의 제작
(a) pPJV 7496
pPJV7389를 프라이머 JF357 (서열 29) 및 JF365 (서열 30)를 사용해 PCR 증폭하고, T4 DNA 중합효소로 처리하여 말단을 무디게 한 후, Sal1로 절단하여 카나마이신 내성물을 코딩하는 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7389를 Ava1로 절단하고, T4 DNA 중합효소로 처리하여 말단을 무디게 한 후, Sal1로 절단하여 벡터 단편을 단리하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7496을 생산하였다.
(b) pPJV7530
pPJV7389을 프라이머 JF393 (서열 31) 및 JF406 (서열 32)을 사용해 PCR 증폭하고, Bgl2 및 BamH1로 절단하여 내부 Nhe1 부위가 없는 RIA를 포함하는 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7496을 BamH1으로 절단하여 벡터 단편을 제조하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7530을 생산하였다.
(c) pPJV7549
pPJV7468을 BamH1 및 EcoR5로 절단하여 M2 및 HBV 3'ENH의 일부를 포함하는 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7530을 BamH1 및 EcoR5로 절단하여 벡터 단편을 제조하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7549를 생산하였다.
(d) pPJV 7563
프라이머 JF256 (서열 33) 및 JF257 (서열 34)를 어닐링하여 복수 클로닝 부 위로 이루어진 삽입 단편을 제조하였다. pPJV7549를 Nhe1 및 Bgl2로 절단하여 벡터 단편을 제조하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7563를 생산하였다. pPJV7563 플라스미드 지도가 도 12에 나타나 있다. pPJV7563 플라스미드에 대한 기본 조성이 도 13에 나타나 있다. 플라스미드 pPJV7563의 성분 및 이들의 위치는 하기와 같다:
1-44 트랜스포존 903 서열
45-860 트랜스포존 903으로부터의 카나마이신 내성 코딩 서열
861-896 트랜스포존 903 서열
897-902 Sal1 부위
903-1587 CMV 프로모터
1588-1718 CMV 즉시형 초기 유전자로부터의 비-번역 리더 서열
1719-1724 BamH1과 BglII 제한 효소의 융합
1725-1857 래트 인슐린 인트론 A
1858-1863 BamH1 부위
1864-1984 HBV 표면 항원 5'-비번역 리더
1985-1993 합성 개시 코돈/Nhe1 클로닝 부위
1994-2011 합성 클로닝 부위
2012-2544 HBV 인핸서
2545-2555 기존 (old) 벡터 서열. NCBI 데이터베이스와 일치 없음
2556-2686 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화 영역
2687-3759 pUC19 벡터 서열
실시예 6. 모델 항원으로서 인간 분비 알칼리 포스파타제 ( SEAP ) 및 인간 IgG Fc 단편 (hFc)를 사용한 시그널 펩티드 발현 패널의 제작
(i) pPJV7507 ( hTPAsp 및 SEAP )
pSEAP-Basic (클론테크)을 프라이머 JF320 (서열 35) 및 JF321 (서열 36)을 사용해 PCR 증폭하고, Nhe1 및 Bgl2로 절단하여 인간 SEAP 단편으로 이루어진 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7079 (Macklin, et. al.)를 Nhe1 및 Bgl2로 절단하여 벡터 단편을 제조하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7507을 생산하였다.
(ii) pPJV 7508 ( hTPAsp 및 hFc)
인간 DNA를 프라이머 JF386 (서열 37) 및 FcAS (서열 38)로 PCR 증폭하고, Nhe1 및 Bgl2로 절단하여 인간 IgG Fc 단편으로 이루어진 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7079를 Nhe1 및 Bgl2로 절단하여 벡터 단편을 제조하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7508을 생산하였다.
(iii) 아프로티닌 시그널 펩티드 코딩 서열의 제조
합성 올리고 JF354 (서열 39)를 프라이머 JF355 (서열 40) 및 JF356 (서열 41)을 사용해 PCR 증폭하여 아프로티닌 시그널 펩티드에 대한 코딩 서열을 생산하였다.
(iv) 담배 엑스텐신 시그널 펩티드 코딩 서열의 제조
합성 올리고 JF348 (서열 42)을 프라이머 JF349 (서열 43) 및 JF350 (서열 44)을 사용해 PCR 증폭하여 담배 엑스텐신 시그널 펩티드에 대한 코딩 서열을 생산하였다.
(v) 닭 리소자임 시그널 펩티드 코딩 서열의 제조
합성 올리고 JF351 (서열 45)을 프라이머 JF352 (서열 46) 및 JF353 (서열 47)을 사용해 PCR 증폭하여 닭 리소자임 시그널 펩티드에 대한 코딩 서열을 생산하였다.
(a) Flu M2 항원 시그널 펩티드 패널
pPJV7499 (CMV(인트론 부재), HBsAg 5'UTR, RBGpA, 아프로티닌 시그널 펩티드)
pPJV7497 (CMV(인트론 부재), HBsAg 5'UTR, RBGpA, 담배 엑스텐신 시그널 펩티드)
pPJV7500 (CMV(인트론 부재), HBsAg 5'UTR, RBGpA, 닭 리소자임 시그널 펩티드)
시그널 펩티드에 대한 코딩 서열을 Spe1 및 Nhe1로 절단하여 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7450을 Nhe1로 절단하여 벡터 단편을 제조하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7499 (아프로티닌), pPJV7497 (담배 엑스텐신), 및 pPJV7500 (닭 리소자임)을 생산하였다.
(b) SEAP 시그널 펩티드 패널
pPJV7513 (CMV(인트론 부재), HBsAg 5'UTR, RBGpA, 아프로티닌 시그널 펩티드)
pPJV7512 (CMV(인트론 부재), HBsAg 5'UTR, RBGpA, 담배 엑스텐신 시그널 펩티드)
pPJV7510 (CMV(인트론 부재), HBsAg 5'UTR, RBGpA, 닭 리소자임 시그널 펩티드)
pPJV7499, 7497 및 7500을 Xho1 및 Nhe1로 절단하여 이 플라스미드의 CMV 프로모터부터 시그널 펩티드 코딩 서열까지로 이루어진 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7507을 Xho1 및 Nhe1으로 절단하여 벡터 단편을 제조하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7513 (아프로티닌), pPJV7512 (담배 엑스텐신), 및 pPJV7510 (닭 리소자임)을 생산하였다.
(c) hFc 시그널 펩티드 패널
pPJV7524 (CMV(인트론 부재), HBsAg 5'UTR, RBGpA, 아프로티닌 시그널 펩티드)
pPJV7525 (CMV(인트론 부재), HBsAg 5'UTR, RBGpA, 담배 엑스텐신 시그널 펩티드)
pPJV7526 (CMV(인트론 부재), HBsAg 5'UTR, RBGpA, 닭 리소자임 시그널 펩티드)
pPJV7499, 7497 및 7500을 Xho1 및 Nhe1로 절단하여 이 플라스미드의 CMV 프로모터로부터 시그널 펩티드 코딩 서열까지로 이루어진 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7508을 Xho1 및 Nhe1으로 절단하여 벡터 단편을 제조하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7524 (아프로티닌), pPJV7525 (담배 엑스텐신 ), 및 pPJV7526 (닭 리소자임)을 생산하였다.
실시예 7: 인간 분비 알칼리 포스파타제 ( SEAP ) 패널의 제작
(a) pPJV7531 ( CMV ( 인트론 부재), HBsAg 5' UTR , RBGpA , 닭 리소자임 시그널 펩티드)
pPJV7510을 Sal1 및 Bgl2로 절단하여 CMV 프로모터부터 리소자임 시그널 펩티드까지를 포함하는 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7450을 Sal1 및 Bgl2로 절단하여 벡터 단편을 제조하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7531을 생산하였다.
(b) pPJV7554 ( CMV ( RIA / Nhe1 ), HBsAg 5' UTR , RBGpA , 닭 리소자임 시그널 펩티드)
pPJV7530을 Xho1 및 BamH1으로 절단하여 CMV 프로모터부터 RIA까지를 포함하는 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7531을 Xho1 및 BamH1으로 절단하여 벡터 단편을 제조하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7554를 생산하였다.
(c) pPJV7568 ( CMV ( 인트론 부재), HBsAg 3' UTR , HBsAg 5' UTR , RBGpA , 닭 리소자임 시그널 펩티드)
pPJV7563을 Bgl2 및 EcoR1으로 절단하여 HBV 3'UTR 및 RBGpA를 포함하는 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7531을 Bgl2 및 EcoR1으로 절단하여 벡터 단편을 제조하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7568을 생산하였다.
(d) pPJV7572 ( CMV ( RIA / Nhe1 ), HBsAg 3' UTR , HBsAg 5' UTR , RBGpA , 닭 리소자 임 시그널 펩티드)
pPJV7563을 Bgl2 및 EcoR1으로 절단하여 HBV 3'UTR 및 RBGpA를 포함하는 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7554를 Bgl2 및 EcoR1으로 절단하여 벡터 단편을 제조하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7572를 생산하였다.
실시예 8: 닭 케라틴 및 닭 심장 액틴 인트론을 사용한 β-gal 및 HBsAg 벡터의 제작
(a) pPJV7557 (β-gal, CMV (cA 인트론 ), HBsAg 3' UTR , HBsAg 5' UTR 및 RBGpA )
닭 DNA를 프라이머 JF430 (서열 48) 및 JF442 (서열 49)를 사용해 PCR 증폭하고, Bgl2 및 BamH1으로 절단하여 닭 심장 액틴으로부터의 인트론 및 플랭킹 엑손 서열로 이루어진 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7488을 BamH1으로 절단하여 벡터 단편을 제조하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7557을 생산하였다.
(b) pPJV7558 (β-gal, CMV (cK 인트론 ), HBsAg 3' UTR , HBsAg 5' UTR 및 RBGpA )
닭 DNA를 프라이머 JF421 (서열 50) 및 JF444 (서열 51)를 사용해 PCR 증폭하고, Bgl2 및 BamH1으로 절단하여 닭 케라틴 유전자로부터의 인트론 및 플랭킹 엑손 서열로 이루어진 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7488을 BamH1으로 절단하여 벡터 단편을 제조하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여, pPJV7558을 생산하였다.
(c) pPJV7578 ( HBsAg , CMV (cA 인트론 ), HBsAg 3' UTR , HBsAg 5' UTR 및 RBGpA )
pPJV7557을 Sal1 및 BamH1으로 절단하여 CMV 프로모터부터 인트론 영역까지로 이루어진 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7496을 Sal1 및 BamH1으로 절단하여 벡터 단편을 제조하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7558을 생산하였다.
(d) pPJV7579 ( HBsAg , CMV (cK 인트론 ), HBsAg 3' UTR , HBsAg 5' UTR 및 RBGpA )
pPJV7558을 Sal1 및 BamH1으로 절단하여 CMV 프로모터부터 인트론 영역까지로 이루어진 삽입 단편을 단리하였다. pPJV7496을 Sal1 및 BamH1으로 절단하여 벡터 단편을 제조하고, 이 벡터 단편에 상기 삽입 단편을 라이게이션하여 pPJV7579를 생산하였다.
실시예 9: HBsAg 벡터 패널에 의한 항원 발현의 시험관내 분석
1일째에, SCC15 (ATCC) 또는 B16 (기원 불명, ATCC에서 입수가능) 세포를 20 내지 40％의 융합성으로 6개의 웰 조직 배양 평판에 플레이팅하고, 인큐베이터에서 밤새 성장시켰다. 숙주 세포를 ATCC에서 권장되는 배지에서 증식시켰다.
2일째에, 형질감염 반응을 수행하였다. 시험할 각각의 벡터에 대해, 20 ㎕의 Lipofectin® 시약 (미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 라이프 테크놀러지즈, 인크.(Life Technologies, Inc.))을 180 ㎕의 Optimem® 배지 (미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재의 라이프 테크놀러지즈, 인크.)에 첨가하고, 45분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 시험할 각각의 벡터에 대해, 2 ㎍의 벡터를 40분에 200 ㎕의 Optimem®로 혼합하였다. 45분에, 벡터 및 Lipofectin® 용액을 함께 혼합하고, 추가의 10분 동안 실온에서 방치하였다. 이러한 최종 인큐베이션 동안, 플레이팅된 숙주 세포를 인큐베이터로부터 제거하고, Optimem® 배지로 2회 세척하였다. 10분에, 1.6 ml의 Optimem®을 Lipofectin®/벡터 혼합물에 첨가하고, 1 ml의 생성 혼합물을 2개의 세포 웰 각각에 첨가하였다. 숙주 세포를 인큐베이터에 넣고, 5시간 동안 방해 없이 방치한 후 Lipofectin®/벡터 혼합물을 제거하고, 표준 세포 보존 배지로 대체하였다.
배지를 교환한 지 18 내지 24시간 후, 50 내지 100 ㎕의 세포 보존 배지를 조직 배양 평판으로부터 제거하고, 샘플을 AUSZYME® 모노클로날 진단 키트 (미국 일리노이주 애보트 파크 소재의 애보트 래보러토리즈(Abbott Laboratories))에 제공된 반응 용기에 넣어 항원 발현에 대해 분석하였다. 시험 샘플의 부피를 PBS로 200 ㎕의 부피가 되게 하고, 50 ㎕의 접합체 및 반응 비드를 각각의 샘플에 첨가하였다. 용기를 40℃에서 80분 동안 인큐베이션한 후, 웰을 모든 액체 반응 성분이 없도록 세척하였다. 비드를 새로운 튜브에 옮긴 후, 300 ㎕의 색상 전개 완충액을 첨가하였다. 30분에, 1 M 황산을 첨가해 색상 전개 반응을 중지시키고, 반응물의 흡광도를 490 nm에서 측정하였다. 도 1에 나타낸 데이터는 2회 실험으로부터의 이중 웰의 평균 흡광도 판독값이다.
도 1에 나타난 바와 같이, 기본 벡터 (CMV 프로모터, 엑손 및 폴리아데닐화 영역)에 RIA, HBV 3'UTR 또는 이들 모두의 추가로 SCC15 세포에서 HBsAg의 발현이 증가하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, 기본 벡터 (CMV 프로모터, 엑손, HBV 3'UTR 및 폴리아데닐화 영역)에 닭 케라틴 또는 닭 심장 액틴 인트론의 추가로 SCC15 세포에서 HBsAg의 발현이 증가하였다.
실시예 10: β-gal 벡터 패널에 의한 항원 발현의 시험관내 분석
SCC-15 또는 B16 숙주 세포를 실시예 9에 기재된 바와 같이 형질감염시켰다.
배지를 교환한 지 18 내지 40시간 후, 배지 상층액을 제거하고, 세포를 PBS로 세척하였다. 세척액을 제거한 후, 세포를 5분 동안 500 ㎕의 용해 완충액 (50 mM NaP04, 0.1％ Triton X-100, pH 7)에서 인큐베이션하고 이어서 플라스틱 접시로부터 세포를 물리적으로 긁어내어 세포를 용해시켰다. 용해물을 2분 동안 미세원침하여 세포 파편을 제거하고 10 내지 25 ㎕의 세정 용해물을 500 ㎕의 반응 완충액 (80 μg/ml o-니트로페닐 갈락토피라노시드, 50 mM NaP04, pH 7)에 첨가하고, 10 내지 20분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 500 ㎕의 1 M Na2CO3을 첨가해 반응을 중지시키고, 405 nm에서 판독하였다. 데이터를 기본 벡터에 대한 향상된 (인트론, HBVenh 또는 둘 모두를 포함) 벡터의 발현비로 나타내었다.
기본 벡터 (CMV 프로모터, 엑손 및 폴리아데닐화 영역)에 RIA, HBV 3'UTR 또는 이들 둘다의 추가로 두 세포주 모두에서 β-gal의 발현이 증가하였다. SCC15 세포에 대한 결과가 도 3에 나타나 있다. 기본 벡터 (CMV 프로모터, 엑손, HBV 3'UTR 및 폴리아데닐화 영역)에 닭 케라틴 또는 닭 심장 액틴 인트론의 추가로 두 세포주 모두에서 β-gal의 발현이 증가하였다. B16 세포에 대한 결과가 도 2에 나타나 있다.
실시예 11: HSV gD 벡터 패널에 의한 항원 발현의 시험관내 분석
SCC15 또는 B16 숙주 세포를 실시예 9에 기재된 바와 같이 형질감염시켰다. 형질감염한 지 18시간 후, 평판을 15분 동안 얼음에 놓았다. 이어서, 각각의 웰을 2 ml의 PBS (미국 메릴랜드주 워커빌 소재의 바이오휘태커(Biowhittaker))로 세척하였다. 세포를 PBS 중에 희석된 0.05％ 글루테르알데히드 (미국 펜실베니아주 워링톤 소재의 폴리사이언시즈 인크.(Polysciences Inc.))로 고정시키고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 모든 후속 인큐베이션을 실온에서 1시간 동안 지속하고, 각각의 인큐베이션 사이의 세척은 상기한 바와 같았다. 평판을 PBS 중의 2 ml의 5％ 분유 (미국 뉴욕주 멜빌 소재의 바이오 라드 래보러토리즈(Bio Rad Laboratories))로 차단하였다. 2％ 분유/PBS/0.05％ Tween-20® (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마(Sigma)) 중의 항-gD 모노클로날 (미국 메릴랜드주 컬럼비아 소재의 ABI)의 1:1000 희석물 1 ml과 함께 인큐베이션하고, 이어서 PBS/0.1％ Tween-20® 중의 염소 항-마우스 HRP (미국 메릴랜드주 개티스버그 소재의 KPL)의 1:2500 희석물 1 ml과 인큐베이션하였다. 1 ml의 TMB 마이크로웰 기질 (미국 메릴랜드주 오윙스 밀즈 소재의 바이오FX(BioFX))을 사용해 색상을 전개시켰다. 반응을 1 M H2SO4로 중지시키고, 액체를 플라스틱 큐벳으로 옮긴 후, 광학 밀도를 450 nm에서 판독하였다. 데이터를 기본 벡터에 대한 향상된 (인트론, HBVenh 또는 둘 모두를 포함) 벡터의 발현비로 나타내었다.
기본 벡터 (CMV 프로모터, 엑손 및 폴리아데닐화 영역)에 HBV 3'UTR과 함께 또는 이들 없이 RIA의 추가로 두 세포주 모두에서 HSV gD의 발현이 증가하였다. SCC15 세포에 대한 결과가 도 4에 나타나 있다.
실시예 12: SEAP 벡터 패널에 의한 항원 발현의 시험관내 분석
SCC15 또는 B16 숙주 세포를 실시예 9에 기재된 바와 같이 형질감염시켰다. 배지를 교환한 지 18 내지 40시간 후, 배지 상층액을 제거하고, 30분 동안 70℃에서 가열하였다. 10 내지 25 ㎕의 열-불활성화된 상층액을 1/10 부피의 1OO mM 1-호모아르기닌과 함께 5분 동안 인큐베이션하였다. 500 ㎕의 알칼리 포스파타제 반응 완충액 (cat # 172-1063, 바이오-라드, 지시에 따라 제조됨)을 용해물에 첨가하고, 10 내지 20분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 500 ㎕의 1 M NaOH을 첨가해 반응을 중지시키고, 405 nm에서 판독하였다. 데이터를 기본 벡터에 대한 향상된 (인트론, HBVenh 또는 둘 모두를 포함) 벡터의 발현비, 또는 인간 TPA 시그널 펩티드 벡터에 대한 실험 시그널 펩티드의 발현비로 나타내었다.
도 5에 나타난 바와 같이, 기본 벡터 (CMV 프로모터, 엑손 및 폴리아데닐화 영역)에 RIA, HBV 3'UTR 또는 이들 둘다의 추가로 B16 세포에서 SEAP의 발현이 증가하였다. 뜻밖에, 기본 벡터 (CMV 프로모터, 엑손 및 폴리아데닐화 영역)에 HBV 3'UTR의 추가만으로 SCC15 세포에서 SEAP의 발현이 증가하였다.
소 아프로티닌, 닭 리소자임 또는 담배 엑스텐신으로부터의 시그널 펩티드의 성숙한 SEAP의 N-말단에의 추가로 SEAP가 2개의 세포주 모두의 세포 배지 상층액으 로 효율적으로 분비되었다. B16 세포에 대한 결과가 도 6에 나타나 있다.
실시예 13: 인간 IgG Fc 단편 시그널 펩티드 패널에 의한 항원 발현의 시험관내 분석
SCC15 또는 B16 숙주 세포를 실시예 9에 기재한 바와 같이 형질감염시켰다. 배지 상층액을 배지 교환 18 내지 40 시간 후 제거하였다.
ELISA 평판 (코스타(Costar))을 4℃에서 웰당 100 ㎕의 염소 항-인간 IgG (시그마 #13382, 카보네이트 코팅 완충액 중에 1/1000 희석)와 함께 밤새 인큐베이션하였다. 모든 후속 인큐베이션을 각각의 인큐베이션 사이에 세척 (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.1％ Brij-35, pH 8.0)하면서 실온에서 1시간 동안 지속하였다. 이어서, 웰을 PBS 중의 100 ㎕의 5％ 분유로 차단시킨 후, 희석 완충액 (2％ 분유, PBS, 0.05％ Tween-20®) 중의 연속 희석된 배지 상층액과 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 웰당 100 ㎕의 염소 항-인간 IgG/HRP (시그마 #A6029, 희석 완충액 중에 1/5000 희석)와 함께 인큐베이션한 후, 100 ㎕의 TMB 마이크로웰 기질을 사용하여 색상을 전개시켰다. 100 ㎕의 1 M H2SO4로 반응을 중지시키고, 450 nm에서 판독하였다. 데이터를 인간 TPA 시그널 펩티드 벡터에 대한 실험 시그널 펩티드의 발현비로 나타내었다.
소 아프로티닌, 닭 리소자임 또는 담배 엑스텐신으로부터의 시그널 펩티드의 인간 Fc 단편의 N-말단에의 추가로 hFc가 2개의 세포주 모두의 세포 배지 상층액으로 효율적으로 분비되었다. B16 세포에 대한 결과가 도 6에 나타나 있다.
실시예 14: 마우스의 면역화를 위한 HBsAg , HSVgD 및 Flu- M2 플라스미드 발현 벡터의 이용
(a) 면역화를 위한 카트리지의 제조
시험할 각각의 플라스미드에 대해, 25 mg의 2 마이크로미터 금 분말을 미세원침 튜브에 넣어 칭량하였다. 250 ㎕ 분취량의 50 mM 스페르미딘 (미국 위스콘신주 밀워키 소재의 알드리치 케미컬, 인크.)을 첨가한 후, 튜브를 볼텍싱하고, 신속히 초음파 처리하였다. 금을 미세원침하고, 스페르미딘을 새로운 100 ㎕의 분취물로 대체하였다. 금을 볼텍싱하여 재현탁시키고, 25 ㎍의 DNA를 튜브에 첨가한 후, 혼합하였다. 튜브를 가볍게 볼텍싱하면서, 100 ㎕의 10％ CaCl2 (미국 일리노이주 디어필드 소재의 후지사와 USA, 인크.(Fujisawa USA, Inc.))을 첨가해 DNA를 금 비드에 침전시켰다. 침전 반응을 벤치탑에서 10분 동안 진행한 후, 신속한 미세원침 회전으로 금을 수집하고, 무수 에탄올 (미국 캘리포니아주 가드나 소재의 스펙트럼 퀄리티 프로덕츠, 인크.(Spectrum Quality Products, Inc.))로 3회 세척하여 과량의 침전 반응물을 제거하였다. 세척된 금/DNA 복합체를 무수 에탄올 중의 0.05 mg/ml 폴리비닐피롤리돈 (360KD, 미국 캘리포니아주 가드나 소재의 스펙트럼 퀄리티 프로덕츠, 인크.) 3.6 ml에 재현탁시켰다. 이어서, 금/DNA 복합체로 Tefzela 튜브의 내측을 코팅한 튜브 터너 (파우더젝트 백신즈(PowderJect Vaccines))에 위치된 Tefzela 튜브 (미국 일리노이주 시카고 소재의 맥마스터-카르(McMaster-Carr))에 상기 슬러리를 주입하였다. 튜브 터닝 절차가 완료된 후, 마우스에 전달 하기 위해 XR1 기구 (파우더젝트 백신즈)에 부하되는 0.5" "쇼트 (shot)"의 백신으로 튜브를 절단하였다.
(b) 백신접종 절차
생후 4 내지 6주령의 마우스를 Ketaseta (포트 닷지(Fort Dodge))와 Rompuna (바이엘(Bayer))의 혼합물로 마취하였다. 복부를 전기 클리퍼로 면도하여 전모하고, 백신의 2 비-중첩 "쇼트"를 면도한 부위에 XR1 기구 (450 psi)를 통해 전달하였다. 동물을 우리에 넣고, 백신접종 6주 후에 채혈하였다. HBsAg 발현 벡터를 평가하는데 Balb/c 마우스를 사용하였으며, HSV-gD 및 Flu M2 발현 벡터를 평가하는데 스위스 웹스터(Swiss Webster) 마우스를 사용하였다.
항- HBsAg 항체에 대한 혈청의 분석
6주째에, 혈액 샘플을 백신접종한 동물로부터 수득하였다. 이들 샘플로부터 분리된 혈청을 AUSAB® EIA 진단 키트 (미국 일리노이주 애보트 파크 소재의 애보트 래보러토리즈)가 제공된 반응 용기의 웰에 넣었다. 첨가되는 혈청의 부피는 샘플의 항체 역가에 따라 다르며, 샘플을 샘플 희석 완충액으로 희석하여 정량화 패널로 수득가능한 값의 범위에 속하도록 하였다. AUSAB® 정량화 패널 (미국 일리노이주 애보트 파크 소재의 애보트 래보러토리즈)의 각각의 바이알로부터 200 ㎕를 반응 용기의 웰에 첨가하였다. 각각의 웰에 비드를 첨가한 후, 용기를 밀봉하고, 40℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 웰을 모든 액체 반응 성분이 없도록 세척하였다. 각각의 세척한 웰에 200 ㎕의 접합체 혼합물을 첨가한 후, 용기를 밀봉하고, 40℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 웰을 모든 액체 반응 성분이 없도록 세척하였다. 비드를 새로운 튜브에 옮긴 후, 300 ㎕의 색상 전개 완충액을 첨가하였다. 30분에, 1 M 황산을 첨가해 색상 전개 반응을 중지시키고, 반응물의 흡광도를 Quantum II® 분광광도계 (미국 일리노이주 애보트 파크 소재의 애보트 래보러토리즈)로 490 nm에서 측정하였다. 분광광도계는, 샘플의 흡광도를 정량화 패널로 만든 표준 곡선과 비교함으로써 샘플의 항체 수준을 계산하였다. 이어서, 이들 항체 수준을 희석 인자에 대해 보정하였다. 도 7에 나타낸 데이터는 특정 벡터로 백신접종한 모든 동물의 기하 평균 역가이다.
항-Flu M2 항원 항체에 대한 혈청의 분석
96-웰 코스타 배지-결합 ELISA 평판 (미국 펜실베니아주 피츠버그 소재의 피셔 사이언티픽(Fisher Scientific))을 1 μg/ml 농도의 PBS (미국 메릴랜드주 워커빌 소재의 바이오휘태커) 중의 합성 Flu M2 펩티드 (미국 매사추세츠주 홉킨톤 소재의 QCB/바이오소스(QCB/Biosource))로 코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 평판을 1O mM Tris (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)/150 mM NaCl (피셔 사이언티픽)/0.1％ Brij-35 (시그마)로 3회 세척하고, 이어서 PBS 중의 5％ 분유 (미국 뉴욕주 멜빌 소재의 바이오 라드 래보러토리즈)로 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 모든 후속 인큐베이션은 1시간 동안 실온에서 수행하였으며, 각각의 인큐베이션 사이의 세척은 상기한 바와 같다. 샘플 마우스 혈청, 표준물 (고역가, 항-M2 마우스 혈청) 및 음성 대조군 (항-HBsAg 마우스 혈청)을 2％ 분유/PBS/0.05 ％ Tween-20® (시그마) 중에서 희석하고, ELISA 평판에서 인큐베이션하였다. 2％ 분유/PBS/0.05％ Tween-20® 중에서 1:8000으로 희석한 염소 항-마우스 IgG (H+L) 비오틴 접합된 항체 (미국 알라바마주 버밍햄 소재의 서던 바이오테크놀러지 어소시에이트(Southern Biotechnology Associate)), 이어서 PBS/0.1％ Tween-20® 중에서 1:8000으로 희석한 스트렙타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제 접합체 (서던 바이오테크놀러지)와 인큐베이션하였다. TMB 기질 (미국 메릴랜드주 오윙스 밀즈 소재의 바이오FX)을 사용하여 색상을 전개시켰다. 1 M H2SO4로 반응을 중지시키고, 평판을 Emax 정밀 미세평판 판독기 (미국 캘리포니아주 서니베일 소재의 몰리큘러 디바이시즈(Molecular Devices))로 450 nm에서 판독하였다. 4개-변수 분석을 이용한 SoftMax Pro 4.1 소프트웨어 (몰리큘러 디바이시즈)를 사용하여 종점 역가를 계산하였다. 역가를 미리-측정된 역가를 갖는 표준 혈청에 대해 표준화하여 분석-대-분석 및 평판-대-평판의 차이를 최소화하였다. 그 결과가 도 7에 나타나 있다.
항- HSV gD 항원 항체에 대한 혈청의 분석
96-웰 코스타 배지-결합 ELISA 평판 (미국 펜실베니아주 피츠버그 소재의 피셔 사이언티픽)을 1 μg/ml 농도의 PBS (미국 메릴랜드주 워커빌 소재의 바이오휘태커) 중의 HSV gD (미국 뉴욕주 이타카 소재의 바이럴 테라퓨틱스(Viral Therapeutics)) 단백질로 코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 평판을 1O mM Tris (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마)/150 mM NaCl (피셔 사이언티픽)/0.1％ Brij-35 (시그마)로 3회 세척하고, PBS 중의 5％ 분유 (미국 뉴욕주 멜빌 소재의 바이오 라드 래보러토리즈)로 1시간 동안 실온에서 차단하였다. 모든 후속 인큐베이션은 1시간 동안 실온에서 수행하였으며, 각각의 인큐베이션 사이의 세척은 상기한 바와 같다. 샘플 마우스 혈청, 표준물 (고역가, 항-gD 마우스 혈청) 및 음성 대조군 (항-HBsAg 마우스 혈청)을 2％ 분유/PBS/0.05％ Tween-20 (시그마) 중에서 희석하고, ELISA 평판에서 인큐베이션하였다. 2％ 분유/PBS/0.05％ Tween 20 중에서 1:8000으로 희석한 염소 항-마우스 IgG (H+L) 비오틴 접합된 항체 (미국 알라바마주 버밍햄 소재의 서던 바이오테크놀러지 어소시에이트), 이어서 PBS/0.1％ Tween-20 중에서 1:8000으로 희석한 스트렙타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제 접합체 (서던 바이오테크놀러지)와 인큐베이션하였다. TMB 기질 (미국 메릴랜드주 오윙스 밀즈 소재의 바이오FX)을 사용하여 색상을 전개시켰다. 1 M H2SO4로 반응을 중지시키고, 평판을 Emax 정밀 미세평판 판독기 (미국 캘리포니아주 서니베일 소재의 몰리큘러 디바이시즈)로 450 nm에서 판독하였다. 4개-변수 분석을 이용한 SoftMax Pro 4.1 소프트웨어 (몰리큘러 디바이시즈)를 사용하여 종점 역가를 계산하였다. 역가를 미리-측정된 역가를 갖는 표준 혈청에 대해 표준화하여 분석-대-분석 및 평판-대-평판의 차이를 최소화하였다. 그 결과가 도 7에 나타나 있다.
실시예 15: 플라스미드 pPJV1671 (인플루엔자 DNA 백신 벡터)의 제작
인플루엔자 A/Panama/2007/99 (H3N2)의 헤마글루티닌 (HA) 항원을 코딩하고 발현할 수 있는 플라스미드 pPJV1671을 제작하였다.
pPJV1671의 제작은 하기 주요 3 단계로 가장 잘 설명된다:
(i) 발현 유전자의 클로닝;
(ii) 벡터 기본구조의 가공; 및
(iii) 최종 플라스미드의 가공.
발현 유전자의 클로닝
인플루엔자 HA에 대한 코딩 서열을 주형 리보핵산 (RNA)의 공급원으로서 질병 통제 및 예방 센터 (Centers for Disease Control and Prevention; 미국 조지아주 애틀란타 소재)로부터 입수한 A/Panama/2007/99의 샘플을 사용하여 표준 역전사효소-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR) 클로닝 기술에 의해 수득하였다.
발현 유전자 HA의 클로닝에 하기 단계가 이용되었다:
* A/Panama/2007/99 (H3N2)의 RNA 절편 4의 dsDNA 단편의 RT-PCR 생산;
* 이. 콜라이에서 표준 pUC19-기반 벡터에서 RNA 절편 4의 DNA 클론의 증식;
* RNA 절편 4 클론 내에서 H3 Panama HA 코딩 서열의 서열 분석; 및
* 제2 PCR 반응으로 pPJV7563 DNA 백신 "엠프티" 벡터 (NheI 및 Bsp120I)와 융화가능한 말단을 갖는 H3 Panama HA 코딩 서열 (그의 ATG 코돈 없음)을 포함하는 DNA 단편 생산.
벡터 기본구조 pPJV7563 의 가공
pPJV1671을 위한 플라스미드 기본구조는 pPJV7563이다. pPJV7563에서 플라스미드 기본구조 서열의 대부분은 또한 수많은 인간 임상 실험에서 평가된 DNA 백신 벡터인 pWRG7128에서도 발견된다. 본 단락은 pPJV7563의 제작을 위한 개요를 제공한다. 상세한 흐름도는 pPJV7563 및 pPJV1671의 제작에 관한 도 14로 제공되 며, 플라스미드 pWRG7128 및 pPJV1671의 핵심 요소의 비교 (표 2)가 하기에 표로 제공되었다. pPJV1671의 지도는 도 16에 나타나 있다.
벡터 기본구조: 플라스미드 WRG7128 (HBsAg) 및 pPJV1671 (인플루엔자 HA)의 핵심 요소의 비교
변화 설명 변화에 대한 이유 또는 목적 변화의 생물학적 효과 또는 의의 또는 가능한 효과
pPJV1671에서 카나마이신 내성 유전자 단편은 pWRG7128에 사용된 것보다 적은 354개 염기였다. 벡터로부터 외래 서열을 제거하기 위한 것임. 백신 효과 또는 안전성에 있어서 부정적인 변화가 예견되지 않았다.
pWRG7128에서 CMV 프로모터의 상류에서 Sph1-Pst1 링커가 제거되었다. 벡터로부터 외래 서열을 제거하기 위한 것임. 이러한 제한 부위는 앞으로의 백신 제작에서 보다 효과적으로 이용됨. 백신 효과 또는 안전성에 있어서 부정적인 변화가 예견되지 않았다.
CMV로부터 인트론 A가 제거되었고 pPJV1671에서 CMV 엑손1이 CMV 엑손 2의 나머지 9개 염기에 융합되었다. CMV 엑손이 융합되어 스플라이싱된 pWRG7128 전사체의 5'-UTR을 재형성하였음. CMV 엑손의 융합이 백신 효과 또는 안전성 프로파일에 변화를 주어서는 안된다.
래트 인슐린 유전자로부터의 인트론 A가 융합된 CMV 엑손과 HBsAg의 5'-UTR 사이에 삽입되었다. CMV 인트론 A 서열을 기능적 대체물로 대체하기 위한 것임. 래트 인슐린 인트론 A를 백신 벡터에 추가하는 것은 항원 발현을 증가시키고 이어서 항체 반응을 증가시키는 것으로 나타났다.
폴리아데닐화 영역이 소 성장 호르몬에서 토끼 베타-글로빈으로 교체되었다. 대안의 폴리아데닐화 시그널을 이용하기 위한 것임. 백신 효과 또는 안전성에 있어서 부정적인 변화가 예견되지 않았다.
최종 플라스미드 pPJV1671 의 가공
2 주요 단계가 기본구조 pPJV7563 (도 14에 예시됨)으로부터 최종 플라스미드 pPJV1671을 가공하는데 관여하고, 이들은:
* pPJV7563으로부터 Nhe1-Bgl II 부위를 제거하고;
* H3 Panama HA 코딩 서열을 pPJV7563에 삽입하여 최종 pPJV1671 (H3 Panama HA DNA 백신 벡터)를 수득하는 것이다.
pPJV1671의 전체 서열 분석으로 하기 표 3에 열거된 모든 벡터 기본구조 및 HA 코딩 서열을 확인하였다.
pWRG7128 과 pPJV1671 의 비교
HBsAg를 코딩하는 임상 시험된 pWRG7128과 H3 Panama HA를 코딩하는 인플루엔자 백신 pPJV1671 벡터 사이의 벡터 기본구조의 주요 차이점이 상기 표 2에 나타나 있다. 여기에는 인간 사이토메갈로바이러스 (hCMV) 인트론 A 요소 대신에 래트 인슐린 인트론 A를 사용하는 것과 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 서열 대신에 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 서열을 사용하는 것이 포함된다. 기재된 pPJV1671을 이용한 광범위한 동물 연구로 소/대 동물 둘다에서의 양호한 인플루엔자 DNA 백신 성능을 확인하였다. 플라스미드 pPJV1671은 또한 하기 실시예 16에서 논의된 바와 같이 상기 DNA 백신의 PMED 후에 인간에서 잘 기능하였다.
pPJV1671 의 특징 및 기능 지도
pPJV1671의 기능 지도가 도 16에 나타나 있다. 이 지도의 특징은 표 3에 열거되어 있다. 플라스미드 pPJV1671은 hCMV 즉시형 초기 프로모터, 및 엑손 1 및 2로부터의 5' 비-코딩 서열을 이용하였다. 상기 프로모터는 래트 인슐린 인트론 A 및 HBVpre-S2 유전자의 5' UTR에 연결되었다. H3 Panama HA 코딩 서열의 번역은 컨센서스 Kozak 번역 개시 서열에서 벡터에 고정된 ATG 코돈에서 개시되었다. HA 코딩 서열 다음은 HBV 전사 인핸서 (HBV enh)이었다. 최종적으로, 전사 종결은 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 부위에 의해 촉진되었다.
A/Panama/2007/99 (H3N2)의 HA 유전자의 천연 ATG 번역 개시 코돈이 번역 개시를 위한 Kozak 컨센서스 서열과 맞지 않기 때문에, 번역 개시를 위해서 pPJV7563 DNA 백신 벡터에 의해 제공된 ATG 요소를 사용하도록 결정하였다. DNA 백신 벡터로부터의 항원 발현은 Kozak 컨센서스와 맞는 ATG 코돈을 사용하였을 때 증대되었다. 벡터-제공된 ATG 코돈의 사용 (NheI 부위에의 삽입을 통해)은 도 16에 나타낸 바와 같이 HA 유전자의 코딩 서열의 아미노 말단에서 최소 2-아미노산 삽입을 초래하였다.
pPJV1671 에서 뉴클레오티드 서열의 기원
pPJV1671에 대한 상세한 제작 기술 및 서열분석 보고는 이 플라스미드 내의 모든 뉴클레오티드 위치의 기원을 지정할 수 있게 하였다. 벡터 성분 서열과 진뱅크 데이터베이스 사이의 BLAST 정렬로 정확한 성분 정렬이 실제로 이루어졌음을 확인하였다.
플라스미드 pPJV1671을 구성하는 성분의 확인
염기 번호 성분 확인
1-896 tn903 서열에 의해 플랭킹된 카나마이신 내성 유전자 (Tn903, pUC4K 단편 1-44 및 861-896)
897-902 Sal 1 클로닝 부위/pUC 19 MCS
903-1587 CMV 프로모터
1588-1718 CMV 엑손 1/2 융합
1719-1724 BamH1/Bgl2 융합
1725-1857 래트 인슐린 인트론 A
1858-1863 BamH1 클로닝 부위
1864-1984 HBsAg의 비-코딩 preS2 영역
1985-1987 ATG 개시 코돈
1988-1993 Nhe1 클로닝 부위
1994-3688 H3N2 HA 코딩 서열
3689-3691 정지 코돈
3692 H3 Panama 3' UTR로부터의 G 뉴클레오티드
3693-3698 Bsp 120I 클로닝 부위
3699-4231 HBV 인핸서
4232-4242 클로닝 인공물. 불명 기원
4243-4373 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화 영역
4374-4379 EcoR1 클로닝 부위
4380-5446 PUC19 벡터
pPJV1671 의 서열 (마스터 세포 뱅크(Master Cell Bank))
새로 제작한 pPJV1671 플라스미드로부터 제조된 퀴아겐 메가프렙(Megaprep) DNA를 사용하여 파우더젝트 연구팀 (PowderJect Research Department)이 서열분석하였다. 실제 서열 데이터는 pPJV1671에 대해 예상되었던 이론상의 서열과 100％ 일치하였다. 제조 과정 중의 서열분석 또한 플라스미드 서열이 이론상의 조사 서열과 100％ 일치한다는 것을 나타냈다. 다양한 플라스미드 요소 및 서열에서의 위치가 상기 표 3에 나타나 있다.
실시예 16: pPJV1671 의 비임상적 평가: 대 동물 모델에서 1가 인플루엔자 DNA 백신 pPJV1671의 면역원성
가축으로서의 돼지 모델을 이용하여 pPJV1671 (생산 방법은 상기 실시예 15에 기재되어 있음)의 면역원성을 연구하였다. 이 연구에서 생후 8주령의 가축 백색 돼지 (거세한 수퇘지 및 새끼를 낳지 않은 암퇘지)를 이용하였다. 혈구응집반응 억제 (HI) 항체 역가를 후보 연구 동물에서 측정하였고 이 연구에 참여한 모든 동물에 대해서 1:10 미만이었다.
각각 8마리의 동물로 구성된 2개의 군을 pPJV1671 DNA 백신의 PMED에 의해 백신접종하였다. 두 군 모두 4주 간격으로 1차 및 2차 면역화되었다. 각각의 면역화는 피부에 나란히 2회 투여하는 것으로 이루어진다. DNA 백신의 각각의 투여량은 0.5 mg의 금 입자의 표면에 응축된 DNA 1 ㎍ 이었다. DNA 백신을 500 psi 헬륨 압력에서 작동하는 XR-1 임상용 및 연구용 기구로 전달하였다.
돼지를 0일째에 백신 접종하고, 28일째에 2차 접종하며, 2차 접종 후 2주인 42일째에 채혈하였다. 표준 HI 분석법을 이용하여 혈청을 HI 항체 반응에 대해 시험하였다. 이 연구의 결과가 도 17에 나타나 있고, 이는 pPJV1671 DNA 백신이 시험 동물의 100％에서 유의한 HI 항체 역가를 유도한다는 것을 보여주며, 여기서 1:40을 충분히 초과하는 평균 HI 항체 역가가 인간에서 인플루엔자에 대한 방어를 위한 HI 항체 역가를 대신한다.
실시예 17: 인간에서 인플루엔자 DNA 백신 구조물을 평가하는 임상 실험
서론
제I기 용량 증가 임상 연구를 수행하여, A/Panama/2007/99 (H3N2)로부터의 HA (헤마글루티닌) 유전자를 함유하는 1가 PMED 인플루엔자 DNA 백신인 pPJV1671 DNA 백신의 안전성 및 면역원성을 평가하였다. 연구가 종료될 때까지 백신접종으로 인한 국부성 및 전신성 부작용을 모니터링함으로써 안전성을 평가하였다. 혈청 혈구응집반응-억제 (HI) 항체 수준을 측정함으로써 면역원성을 평가하였다.
12명의 건강한 성인으로 구성된 3개의 군에 1, 2 또는 4 PMED 투여로서, DNA 백신 1, 2 또는 4 ㎍을 0일째에 단일 용량으로 투여하였다. PMED 인플루엔자 DNA 백신은 3가지 투여 수준 모두에서 혈청 혈구응집반응-억제 (HI) 항체 반응을 도출하였고, 최고 투여 수준으로 백신접종된 대상체에서 최고 반응 및 가장 일정한 반응이 도출되었다. 항체 반응은 시험 최종 시점 56일째에 가장 높았다. 처치-관련 부반응성(reactogenicity)은 백신 부위에서 처음에는 자기-제어되는 미약한 내지 보통의 피부 반응으로 제한되었다. 이러한 결과는 생산된 인플루엔자 DNA 백신의 안전성 및 면역원성의 지표를 제공한다.
물질 및 방법
백신 및 전달 시스템
임상 플라스미드의 경우, HA 코딩 서열을 주형 RNA의 공급원으로서 A/Panama/2007/99 바이러스의 샘플을 사용하여 표준 역전사효소-중합효소 연쇄반응 (RT-PCR) 클로닝 기술에 의해 수득하였다 (바이러스는 질병 통제 및 예방 센터의 J. Katz가 제공하였음). H3 Panama HA 코딩 서열을 상기 실시예 15에 기재된 바와 같이 pPJV7563에 삽입하여 최종 pPJV1671 H3 Panama HA DNA 백신 벡터를 수득하였다. pPJV1671의 전체 서열 분석으로 모든 벡터 기본구조 및 HA 코딩 서열을 확인하였다.
플라스미드 pPJV1671을 스트라트만 게엠베하 (Strathman GmbH, 독일 하노버 소재)에서 의약품생산규정 (good mamufacturing practices)에 따라 제조하였다. 플라스미드 DNA를 1 내지 3 ㎛의 금 입자 상에 코팅하고, 이미 개시된 방법 (문헌 [Roy et al., (2001) Vaccine 19:764-78])을 사용하여 파우더젝트 XR-1 기구를 사용하여 PMED 용으로 제형화하였다. 각각의 용량은 공칭값으로 0.5 mg의 금에 코팅된 1 ㎍의 DNA를 함유하였다. 분석된 백신 품질 파라미터는 금 및 DNA의 양, 시험관내 발현, 마우스에서의 면역역가 및 미생물함량(bioburden) 및 내독소의 부재를 포함하였다.
환자 집단 및 설정
임상기 연구를 미국 네브라스카주 링컨에 소재하는 MDS 파르마 서비시즈(MDS Pharma Services)에서 수행하고, 지역 임상 시험 심사위원회에서 승인을 받았다. 36명의 성인 지원자가 등록하였다 (표 4).
연구 집단의 통계적 데이터
제1군 제2군 제3군
군당 사람수 12 12 12
평균 연령 (년) 31 31 32
연령 범위 (년) 20-48 20-50 21-49
남성:여성 7:5 4:8 5:7
예비백신접종 16 (5-40) 17 (5-40) 12 (5-40)
HAI GMT (범위)
피실험자들은 그들이 건강하고, 19 내지 50세이고, 임신기나 수유기가 아니고, 서면동의서를 제출할 수 있고, 인플루엔자 A/Panama에 대한 예비백신접종 혈구응집반응 억제 (HI) 역가가 10 이상 내지 40 이하라면 유자격자로 간주되었다.
제외의 이유는 지난 6개월 이내의 면역억제 요법, 피부병력, 면역화 부위의 흉터, 기태(mole), 벤 상처 또는 문신, 금 알레르기, 금요법 경험, 지난 12개월 이내의 인플루엔자 백신접종, 현재 인플루엔자-유사 증후가 있거나 인플루엔자 진단받음 또는 인플루엔자 백신접종이 권장되지 않는 임의 의학적 증상을 포함한다.
2명의 피실험자를 제외하고는, 모든 피실험자가 연구를 완료하였고 안전성 및 면역원성에 대해 평가받았다. 한 피실험자는 추적조사(follow-up)를 실패하였고 또다른 피실험자는 비-순응적이었다. 그러나, 36명의 피실험자가 모두 예비백신접종 샘플을 제공하였고, 백신을 접종하였고, 백신접종 후 1회 이상 안전성 및 면역원성에 대해 평가받았으며, 데이터는 모든 피실험자에서 안전성 및 면역원성의 평가를 위해 이용가능하였다. 모든 연구 절차는 스코틀랜드 에든버러 (2000)에서 최종 수정된 1975년의 헬싱키 선언(Helsinki Declaration) 및 국제 임상시험관리기준(International Conference on Harmonization guidelines on Good Clinical Practice; 1996년 5월 1일, 4 단계)에 따랐다.
임상 연구 설계
피실험자를 연속식으로 군당 12명씩 3개의 처치군으로 배정하였다. PMED DNA 백신 투여는 각각 0.5 mg의 금 상의 1 ㎍의 DNA, 플라스미드 pPJV1671 (H3 Panama)을 전달하였다. 제1군에는 0일째에 상박의 내측면에 단일 백신을 투여하였다. 제2군 피실험자는 0일째에 상박 내측면의 인접한 부위에 투여된 총 2 ㎍의 DNA로 2차례 백신 면역화하였다. 제3군 피실험자는 4일째에 총 4 ㎍의 DNA를 4차례 투여하였다. 백신을 500 psi의 헬륨 압력 (선행 연구 (상기 로이(Roy) 등의 문헌 (2001), 문헌 [Rottinghaus et al. (2003) Vaccine 21(31): 4604-8] 및 문헌 [Tacket et al. (1999) Vaccines 17(22): 2826-9])에서 잘 견디는 것으로 나타난 압력)에서 파우더젝트 XR-1 기구를 사용하여 투여하였다.
임상 안전성 및 면역원성 평가
백신접종 부위 반응을 모니터링하고 연구 중의 국부성 및 전신성 부작용의 발생률을 기록함으로써 안전성을 평가하였다. 모든 피실험자들을 면역화할 때, 면역화 후 1시간 및 면역화 후 2시간에 백신 안전성 및 국부적 관용성에 대해 평가하였다. 피실험자들을 3, 7, 14, 21, 28, 56 및 180일째에 국부적 관용성에 대해 추가로 평가하였다. 전신성 부작용을 물리적 시험, 바이탈 사인, 실험실 안전성 시험 및 항 이중가닥 DNA 항체 시험에 의해 모니터링하였다. 이들 시험은 면역화 전 및 그 후에 수행되었다.
이미 개시된 방법 (Kendal, et al (1982) Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance. US Department of Health and Human Services, Public Health Services, Centers for Disease Control: B17-35)의 변형된 방법을 사용하여, A/Panama/2007/99에 대한 HAI 역가를 측정하기 위해 0일째 (면역화 전) 및 면역화 후 14, 21 및 56일째에 혈액 샘플을 수집함으로써 백신 각각의 면역원성을 측정하였다.
임상 데이터 분석
안전성 데이터를 표로 만들었다. 각각의 HI 역가를 통상 동일하거나 유사한 결과를 얻는 2 독립 측정의 기하 평균 (GMT)로서 기록하였다. 샘플이 10 (분석법의 검출 한계) 미만의 역가를 갖는다면 역가 5로 지정하였다. 각각의 군에 대하여, 각 시점에서의 GMT 및 95％ 신뢰구간 (CI)을 대수적으로 변환된 역가를 사용하여 계산하였다. 각 시점에서, 각 투여 군의 기준으로부터의 GMT 비율을 SAS내의 CATMOD 절차를 사용하여 카이 제곱 검정에 의해 비교하였다. 3개의 군 사이의 GMT 차이 또한 비교하였다.
혈청전환율 (HAI 역가가 면역화 전 역가보다 4배 이상 증가한 피실험자 비율) 및 혈청방어율 (40 이상의 면역화 후 역가를 달성한 피실험자 비율)을 계산하고 로짓 반응 연결 함수로 반응율(％)을 비교하기 위해 SAS내의 CATMOD 절차를 사용하여 카이 제곱 검정에 의해 군들 사이에 비교하였다.
결과
안전성 및 부반응성
국부성 반응을 모든 백신 투여 부위 84곳에서 평가하였다 (도 18). 3개의 군 모두로부터의 국부 피부 반응 등급 (총 84곳의 백신접종 부위)을 평균하였다. 피부 반응을 하기 기준에 따라 등급을 매겼다:
- 홍반: 0 = 관찰되지 않음; 1 = 붉어짐; 2 = 약간 붉게 달아오름(mild sunburn); 3 = 극도로 붉어짐.
- 부종: 0 = 관찰되지 않음; 1 = 거의 두꺼워지지 않음; 2 = 뚜렷하게 두꺼워짐; 3 = 크고 단단한 발진.
- 변색: 0 = 관찰되지 않음; 1 = 거의 관찰되지 않음; 2 = 뚜렷하게 변색됨; 3 = 갈색 구두약같은 변색.
- 박피: 0 = 관찰되지 않음; 1 = 미세한 백색 비듬처럼 박피; 2 = 일광화상처럼 박피; 3 = 두껍고 황색의 피각질.
- 가려움/불쾌함: 0 = 관찰되지 않음; 1 = 약간 가렵거나 접촉시 피부가 쓸린듯이 약간 아픔; 2 = 보통으로 가렵거나 피부가 쓸린듯이 아픔.
선행 연구 (상기 문헌 [Roy et al. (2001), Rottinghaus et al. (2003)] 및 태킷(Tacket) 등 (1999)의 문헌 참조)를 근거로 예상된 바와 같이, 피실험자들에게 국부성 피부 반응이 일어났지만, 심한 (등급 = 3) 범위의 국부성 반응은 일어나지 않았다. 출혈이나 피부 손상은 보고되지 않았다. 전형적인 국부성 반응은 미약한 내지 보통의 홍반, 부종 및 피부 변색과, 때로는 가려움/불쾌함, 이어서 약간의 피부 표면 박피를 특징으로 하였다.
흔하지 않은 국부성 반응은 점상출혈 (2/84 부위), 약간의 멍 (2/84 부위) 및 작은 가피 (15/84 부위)를 포함하였다. 부종은 일반적으로 백신접종 후 14일이 경과하면 자연 치유되지만, 홍반 및 피부 변색은 28일간 지속되었다. 총 84곳의 백신접종 부위 중에서, 미약한 피부 변색은 백신접종 후 56일째에 30곳에서, 180일째에 21곳에서 여전히 나타났다. 한 피실험자는 또한 180일째에 2곳에서 멍이 발견되었다.
연구 중에 관찰된 전신성 부작용은 미약한 수준이었고 처치와 무관한 것으로 간주되었다. 면역화 후 7 내지 56일째에 보고된 부작용은 두통 (10명의 피실험자에게서 11건), 피로 (3명의 피실험자에게서 4건), 근육통 (1명의 피실험자에게서 3건), 열병 (2명의 피실험자에게서 2건), 손에서 한기 (2명의 피실험자에게서 2건), 요통 (1명의 피실험자에게서 2건), 및 구역질, 관절통, 근육 긴장, 떨림, 간헐성 고혈압 및 간헐성 저혈압 (1명의 피실험자에게서 1건)을 포함하였다. 항-이중가닥 DNA 항체는 검출되지 않았다. 개괄적으로 모든 연구군에서 국부성 및 전신성 부작용 프로파일은 PMED에 의해 전달된 인플루엔자 DNA 백신의 안전성의 지표를 제공하였다.
항체 반응
피실험자들 중 10 이상 내지 40 이하의 인플루엔자 A/Panama에 대한 HI 역가를 갖는 자들을 예비-선별하였지만, 몇몇 피실험자들은 백신접종 당일에 10 이하의 역가를 가졌다. 기준 HI 역가는 모두 40 미만이었고, 군들 사이에 기준 역가의 유의한 차이는 없었다 (p=0.439; 상기 표 4 참조).
면역화는 3개의 군 모두에서 모든 시점에 기하 평균 역가 (GMT)의 유의한 상승을 초래하였다 (하기 표 5에 나타냄).
혈청 항체 반응, 혈청전환율 및 혈청방어율
군 경과일 혈청전환율a(％) 혈청방어율b(％) 평균 GMT 증가 (배)
1 0 - 17(2/12) -
14 8(1/12) 42(5/12) 1.4
21 17(2/12) 33(4/12) 1.7
56 33(4/12) 58(7/12) 2.8 c
2 0 - 33(4/12) -
14 17(2/12) 50(6/12) 1.7
21 8(1/12) 58(7/12) 2.1
56 67(8/12) 92(11/12) 3.9
3 0 - 8(1/12) -
14 17(2/12) 25(3/12) 1.8
21 33(4/12) 67(8/12) 3.4
56 64(7/11) 100(11/11) 8.1
a 혈청전환율은 백신접종 전 음의 역가 (10 이하)에서 백신접종 후 40 이상의 역가로의 전환, 또는 항체 역가의 유의한 증가, 즉 백신접종 전 역가가 10 이상인 경우에 백신접종 전후의 역가가 4배 이상 증가한 것으로 정의됨. b 혈청방어율은 40 이상의 면역화 후 역가를 달성하는 피실험자의 비율로 정의됨. c CPMP 조건을 충족시키는 값은 볼드체로 나타냄.
투여량-반응 방식에서 보다 높은 HI 역가 및 보다 높은 혈청전환율(％)을 가지려는 경향이 있지만, 3개의 군 사이에 GMT, 혈청방어율(％) 또는 혈청전환율(％)에 있어서 통계적 차이는 없었다. 3가지 백신 투여 수준 모두에서, GMT, 혈청전환율(％) 및 혈청방어율(％)은 백신접종 후 시간의 함수로서 증가하였고, 56일째에 최고 역가를 가졌다 (표 5 참조). 56일 경과시 제1군에서 피실험자의 33％가 혈청전환하였고, 58％가 혈청방어 HAI 역가를 달성하였으며, GMT는 2.8배 증가하였다. 제2군에서는, 56일째에 혈청전환율이 67％이었고, 피실험자의 92％가 혈청방어하였으며 GMT가 3.9배 증가하였다. 최고 및 가장 일정한 역가는 제3군에서 56일째에 관찰되었고, 여기서는 100％ 혈청방어율이 관찰되었고 GMT가 기준보다 8.1배 증가하였다. 제3군에서, 몇몇 혈청방어한 피실험자가 비교적 높은 기준 HAI 역가로 인해 역가의 4배 이상의 증가를 나타내지 않았기 때문에 혈청전환율은 100％ 미만이었다.
논의
본 실시예에 기재된 작업은 인플루엔자 예방에 효과적인 것으로 예견되는, 항-인플루엔자 항체 반응의 가장 성공적인 발생을 제공하였다.
면역학적 분석으로 모든 투여 수준이 항-인플루엔자 항체 반응을 발생시킨다는 것을 입증하였다. 1년 인플루엔자 백신의 인가를 위한 CPMP (Committee for Proprietary Medical Products) 지침에 대한 비교는 1 ㎍ 투여군이 기하 평균 역가 (GMT)에 있어서 56일째에 조건을 만족시켰고, 2 ㎍ 투여군이 3가지 기준 (혈청전환율, 혈청방어율 및 GMT) 모두에 있어서 56일째에 조건을 만족시켰고, 4 ㎍ 투여군이 GMT에 있어서 21일째에, 3가지 기준 모두에 있어서 56일째에 조건을 만족시킨다는 것을 나타냈다.
백신 부위 반응을 비롯한 총 320건의 치료-유발 부작용 (AE)이 투여받은 36명의 피실험자 중 34명 (94％)에 의해 보고되었다. 연구 중에 1건의 SAE; 발의 골절이 보고되었는데, 이것은 연구 백신과 관련있는 것 같지 않다. 7명의 피실험자에게 FDA-보고가능범위에 있는 AE가 발생하였지만, 이들은 모두 연구 백신과 관련있는 것 같지 않다. AE 대부분 (71％)은 중증도가 미약하였다. 보고된 대부분의 일반적인 AE는 두통이었다 (모든 피실험자의 53％). AE로 인해 연구를 중단한 피실험자는 없었다. 총 89건의 백신접종 부위-관련 AE가 투여받는 36명의 피실험자 중 27명에 의해 보고되었고, 미약한 적용 부위 통증이 12명의 피실험자 (33％)에 의해 보고된 가장 일반적인 국부성 AE이었다. 3 등급 (심각)으로 평가되고, 따라서 부작용으로 간주되는 국부성 부반응성의 측정은 평가되지 않았다. 전형적인 백신접종 부위 반응은 홍조/홍반, 부종, 박피, 변색 및 딱지/가피 형성을 포함하였다.
결론적으로, pPJV1671의 투여는 모든 피실험자에게 잘 관용되었고 강력한 항-인플루엔자 항체 반응을 도출하였다. 최고 투여량 4 ㎍은 1년 인플루엔자 백신의 인가를 위한 CPMP에 의한 조건을 21일째에 충족시켰다.
실시예 18: 돼지에서 3가 DNA 백신의 비-임상적 평가
3개의 2001-2002 인플루엔자 백신주의 HA 분자를 코딩하는 3개의 DNA 백신 벡터를 제작하여 관련 동물 모델에서 인간 3가 인플루엔자 DNA 백신 후보의 면역원성을 평가하였다. 역사적으로, 인간 피부와 돼지 피부의 구성이 매우 유사하기 때문에 인간에서 PMED DNA 백신을 위한 모델로서 가축으로서의 돼지가 사용되었다. 인간에서 PMED DNA 백신 성능의 예견자로서 돼지 모델의 적절성은 돼지에서의 양호한 백신 성능이 인간에서도 반영되는 B형 간염 표면 항원 DNA 백신의 제I기 인간 임상 실험에 의해 입증되었다.
3개의 2001-2002 인간 인플루엔자 백신주 샘플 (A/Panama/2007/99 (H3N2), A/New Caledonia/20/99 (H1N1) 및 B/Victoria/5/00)을 질병 통제 센터 (CDC)로부터 입수하고 역전사효소/중합효소 연쇄반응 (RT-PCR) 실험에 사용하여 상응하는 HA 항원을 코딩하는 DNA 단편을 생산하였다. 하기 단계가 최종 3개의 HA DNA 백신 벡터를 개발하는데 이용되었다:
* A/Panama/2007/99 (H3N2), A/New Caledonia/20/99 (H1N1) 및 B/Victoria/5/00의 RNA 절편 #4의 dsDNA 단편의 RT-PCR 생산;
* 이. 콜라이에서 표준 pUC19-기반 벡터에서 RNA 절편 #4 DNA 클론의 증식
* RNA 절편 #4 클론 내에서 HA 코딩 서열의 서열분석;
* 2차 PCR 반응 (실제 HA 유전자 서열 데이터 기반)으로 pPJV7563 DNA 백신 발현 벡터 (NheI 및 Bsp120I)와 융화가능한 말단을 갖는 HA 코딩 서열 (ATG 코돈 없음)을 포함하는 각각의 바이러스로부터 DNA 단편 생산;
* 3개의 HA 코딩 서열 단편을 임상 DNA 백신 벡터 pPJV7563에 삽입하여 3개의 최종 DNA 백신 벡터 수득;
* 3개의 벡터 모두에서 HA 코딩 서열을 서열분석하여 돌연변이가 일어나지 않았음을 확인.
생산된 벡터는 본 발명의 키메릭 프로모터를 이용하였다. 따라서, 벡터는 인간 사이토메갈로바이러스 (hCMV) 즉시형 초기 프로모터, 및 즉시형 초기 엑손 1 및 2로부터의 5' 비-코딩 서열을 이용하였다. 상기 프로모터는 래트 인슐린 인트론 A 및 B형 간염 바이러스 (HBV) pre-S2 유전자의 5' 비번역 영역 (UTR)에 연결되었다. HA 코딩 서열의 번역은 컨센서스 Kozak 번역 개시 서열에서 벡터에 고정된 ATG 코돈에서 개시되었다. HA 코딩 서열 다음은 HBV의 전사 인핸서 (HBVenh)이었다. 최종적으로, 전사 종결은 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 부위에 의해 촉진되었다.
HA 유전자의 천연 ATG 번역 개시 코돈이 번역 개시를 위한 Kozak 컨센서스 서열과 맞지 않기 때문에, pPJV7563 DNA 백신 벡터에 의해 제공된 ATG 요소가 번역 개시를 위해 사용되었다. DNA 백신 벡터로부터의 항원 발현은 일반적으로 Kozak 컨센서스와 맞는 ATG 코돈을 사용하였을 때 증대되었다. 벡터-제공된 ATG 코돈 (NheI 부위의 삽입을 통한 것)의 사용은 HA 항원의 코딩 서열의 아미노 말단에서 최소 2-아미노산 삽입을 초래하였다.
이들 벡터의 면역원성을 가축으로서의 돼지 모델에서 3가 제형으로 평가하였다. 3개의 벡터를 1:1:1로 혼합하고 투여마다 0.5 mg의 금을 사용하여 금 1 mg당 DNA 총 2 ㎍의 속도로 금 입자 상으로 제형화하였다. 각각의 면역화는 DNA 총 2 ㎍ 및 금 총 1 mg으로 나란한 PMED 투여 2회로 이루어진다. 백신접종 방법은 4주 간격으로 이러한 면역화 2차례를 포함한다. 인플루엔자-접종하지 않은 돼지를 이용된 실제 전달 기구를 기준으로 하여 2개의 면역화 군으로 나누었다. 한 군의 동물에는 다양한 동물에서 여러 항원에 대한 면역 반응을 유도하는데 성공적으로 사용되었던 재사용가능한 "연구" PMED 기구를 사용하여 3가 인플루엔자 DNA 백신을 접종하였다. 또다른 군의 동물은 HBV DNA 백신을 사용하여 인간에게 성공적으로 백신접종하는데 사용되었던 임상 기구를 이용하여 면역화하였다. 상기 후자의 기구는, 연구 기구와 소통되는 12-쇼트 재사용가능한 노즐 대신에 "단일 쇼트" 플라스틱 일회용 노즐을 이용한다는 점에서 연구 기구와 상이하다.
2차 면역화 후 2주에, 혈청 샘플을 수집하고 상동성 H3, H1 및 B 바이러스에 대해 특이적인 혈구응집반응-억제 (HI) 항체 역가를 측정하였다. 이들 데이터를 도 19에 나타내었다. 100％ 혈청전환율이 두 기구를 이용한 H3 및 B 항원에 대해 관찰되었고 1:40을 충분히 초과하는 기하 평균 HI 역가가 인플루엔자에 대한 면역원성을 위해 필요한 것으로 일반적으로 생각되는 수준을 대신한다. 얻어진 데이터는 이러한 기술 플랫폼이 인간에서 상당한 반응을 도출할 수 있을 것이라는 것을 나타낸다.
H1-특이적 면역 반응은 낮았다. 이는 플라스미드 생산 중에 H1 DNA 백신 벡터에서 일어난 H1 HA 유전자의 재배열 때문인 것으로 후에 판명되었다. 이러한 재배열은 제형 및 백신접종 전의 DNA의 초기 분석에서 검출되지 않았지만, 보다 엄격한 분석에 의해 검출될 것이다. H3 및 B 벡터를 사용한 결과에 따라, H1-특이적 반응은 기능적 플라스미드를 이용하였을 때보다 현저히 높을 것 같다.
실시예 19: 플라스미드 pPJV2012 의 제작
플라스미드 pPJV2012를 제작하였다. pPJV2012는 장관독소원성 이. 콜라이의 이열성 독소 (LT)의 A 및 B 하위단위를 발현한다. 생체내 pPJV2012로부터 기능적 LT 독소의 발현을 이용하여 pPJV2012와 공동-투여된 플라스미드로부터 발현된 다른 단백질에 대한 면역 반응을 증대시킬 수 있었다.
LT는 단일 A 하위단위, 및 동일한 B 하위단위의 오량체로 구성되어 있다. LT는 이. 콜라이로부터 발현되고 분비되며 B 하위단위의 오량체를 통해 창자 세포 상의 GM1 강글리오시드에 결합한다. 독소는 내부화되어 이어서 A 하위단위가 과도한 cAMP의 생산 및 창자강에 걸쳐서 전해질 평형의 파괴를 활성화한다 (문헌 [Tauschek, et al (2002) Proc Natl Acad Sci, USA 99: 7066-7071]). 따라서 생체내 발현된 LT의 생물학적 활성을 위해서는 발현 세포로부터의 분비를 매개하는 시그널과 함께 A 및 B 하위단위 둘다의 생산이 필요하다. LT A 및 B 하위단위를 코딩하는 플라스미드 벡터는 입자 매개형 상피 전달 (문헌 [Arrington et al (2002) J Virol 76 (9): 4536-46])을 이용하여 공동-전달된 다수의 바이러스 항원에 대해 유도된 면역 반응을 증가시키는 것으로 나타났다.
LT 독소의 A 및 B 하위단위에 대한 코딩 서열 외에도, pPJV2012는 또한 효과적인 유전자 발현을 위한 본 발명의 키메릭 프로모터 서열, 토끼 베타 글로빈 폴리A 서열, 발현 세포로부터의 분비를 매개하는 시그널 서열, 카나마이신 내성 유전자 및 박테리아 복제 개시점을 도입하였다. 플라스미드는 도 22에 나타나 있다.
플라스미드 pPJV2012를 하기 단계를 통해 제작하였다:
* 이. 콜라이 게놈 DNA로부터의 LT A 코딩 서열의 PCR 증폭 및 중간체 플라스미드에 삽입;
* LT A 코딩 서열의 절단 및 CMV 프로모터의 제어하에 "수용체" 플라스미드에 삽입;
* 이. 콜라이 게놈 DNA로부터의 LT B 코딩 서열의 PCR 증폭 및 말단절단형(truncated) CMV 프로모터의 제어하에 중간체 플라스미드에 삽입;
* LT A 발현 카세트의 절단.
생산된 플라스미드 pPJV2012는 포유동물 세포에서 LT의 하위단위를 둘다 발현하였다.
pPJV2012 에서 프로모터 및 인핸서 서열
LT A 하위단위는 CMV 즉시형 초기 (IE) 프로모터로부터 발현되었다. LT B 하위단위는 말단절단형 CMV IE 프로모터로부터 발현되었다. 두 유전자 모두의 발현을 증대시키기 위해 추가 서열, 구체적으로 HBVpre-S2 5' UTR (문헌 [Moriarty et al (1981) Proc Natl Acad Sci USA 78:2606-2610]), CMV 엑손 1/2 (천연 인트론의 제거에 의해 함께 스플라이싱된 처음 2개의 CMV IE 엑손으로 구성된 것), 래트 인슐린 인트론 A (문헌 [Lomedico et al (1979) Cell 2: 545-558]) 및 토끼 베타 글로빈 폴리A (rGpA)를 포함하였다. 발현 세포로부터의 분비를 위해, 닭 리소자임 시그널 펩티드 (GLSP; 진뱅크 등록번호 CR390743)를 LT 하위단위 둘다를 위해 삽입하였다. 또한, 발현을 향상시키기 위해 HBV env 인핸서 (문헌 [Vannice and Levinson (1988) J Virol. 62: 1305-1313])를 A 하위단위 다음에 삽입하였다.
LT A 및 B 하위단위의 클로닝
이. 콜라이 균주 E078:H11을 ATCC (catalogue #35401)로부터 입수하고, A 및 B 하위단위를 진뱅크 등록 파일 AB011677을 참조로 고안된, 5' 및 3' 말단에 대해 상동성인 프라이머를 사용하여 별개의 PCR 반응에 의해 증폭시켰다. 두 하위단위에 대한 생산된 코딩 서열은 아미노 말단에서 발견되는 박테리아 시그널 펩티드를 코딩하는 서열을 포함하지 않았다. A 및 B 하위단위 단편을 별개로 플라스미드 WRG7054에 라이게이션하였다.
pPJV2012 의 제작
LT A 코딩 서열을 절단하여 pPJV7592의 벡터 기본구조 및 CMV 프로모터, 5'-비번역 영역 및 CLSP를 포함하는 pPJV7572로부터 유도된 단편과 라이게이션하였다. 생산된 플라스미드를 A1이라고 하였다. A1을 절단하여 pPJV7592로부터의 단편과 라이게이션하여 복수 클로닝 부위를 재형성하고, 생산된 플라스미드를 수용체라 하였다: 이는 pPJV2012의 LT A 성분을 제공하였다.
LT B 코딩 서열을 절단하여 pPJV7591의 벡터 기본구조 및 비번역 영역의 3' 말단 및 CLSP를 포함하는 pPJV7572로부터 유도된 단편과 라이게이션하였다. 생산된 플라스미드를 공여체라 하고 이는 pPJV2012의 LT B 성분을 제공하였다.
pPJV2012를 생산하기 위해, LT B 발현 카세트를 포함하는 공여체로부터의 단편을 수용체로부터 유도된 벡터 단편과 라이게이션하였다. 생산된 플라스미드는 포유동물 세포에서 LT A 및 B를 둘다 발현하였다.
pPJV2012 에서 뉴클레오티드 서열의 기원
pPJV2012를 전체 서열분석하여 데이터베이스와 정렬하여 각 서열의 기원을 지정하였다. 하기 표 6에 나타낸 유도 서열은 예상된 바와 같았다.
플라스미드 pPJV2012를 구성하는 성분의 확인
염기 번호 성분 확인
1-905 카나마이신 내성 유전자를 포함하는 pUC4K-유도된 서열
906-1038 토끼 베타 글로빈 폴리A
1039-1351 LT B 하위단위 코딩 서열
1352-1357 링커 서열
1358-1417 닭 리소자임 시그널 서열
1418-1538 HBVpre-S2의 5' UTR
1539-1544 링커 서열
1545-1677 래트 인트론 A
1678-1683 링커 서열
1684-1814 CMV 엑손 1/2
1815-1935 말단절단형 CMV IE 프로모터
1936-1947 링커 서열
1948-2632 CMV 프로모터
2633-2763 CMV 엑손 1/2
2764-2769 링커 서열
2770-2902 래트 인슐린 인트론 A
2903-2908 링커 서열
2909-3029 HBVpre-S2의 5' UTR
3030-3089 닭 리소자임 시그널 펩티드
3090-3095 링커 서열
3096-3818 LT A 코딩 서열
3819-3830 링커 서열
3831-4363 HBV env 인핸서 서열
4364-4374 불명 서열
4375-4050 토끼 베타 글로빈 폴리A
4051-5578 pUC19-유도된 서열
또한 전체 인간 게놈과의 서열 상동성에 대한 BLAST 검색을 수행하여 19개 염기 정도의 짧은 가닥으로 서열 상동성을 조사하였다. "유의한 유사성 발견되지 않음"; 최대 상동성은 rGpA의 68개 염기 서열이었지만, 동일한 서열의 최장 가닥은 단지 18개의 염기였다.
pPJV2012 서열과 pPJV1671 의 비교
pPJV2012의 서열을 pPJV1671의 서열과 비교하였다. 그 결과를 하기 표 7에 나타냈다.
pPJV2012와 pPJV1671의 서열 비교
pPJV2012 서열의 염기 번호 그 서열이 pPJV1671 인플루엔자 DNA 백신에도 존재하는가?
1-896 존재함
897-905 존재하지 않음
906-1038 존재함
1039-1351 존재하지 않음
1352-1357 존재함
1358-1417 존재하지 않음
1418-1538 존재함
1539-1544 존재함
1545-1677 존재함
1678-1683 존재함
1684-1814 존재함
1815-1935 존재함
1936-1947 존재함
1948-2632 존재함
2633-2763 존재함
2764-2769 존재함
2770-2902 존재함
2903-2908 존재함
2909-3029 존재함
3030-3089 존재하지 않음
3090-3095 존재함
3096-3818 존재하지 않음
3819-3824 존재함
3825-3830 존재함
3831-4363 존재함
4364-4374 존재함
4375-4505 존재함
4512-5578 존재함
분석은 pPJV2012에서 5578개 염기쌍 중 4418개 (79％)가 pPJV1671 인플루엔자 DNA 백신에도 존재한다는 것을 나타낸다. LT A 및 B 하위단위에 대한 코딩 서열을 제외하면, pPJV2012의 4544개 염기쌍 중 4418개 (97％)가 pPJV1671에도 존재한다.
pPJV1671으로 생체내분포/융합 연구를 수행하여 각각의 경우에 융합의 증거가 발견되지 않았음을 주목한다.
실시예 20: 포유동물 세포에서 이. 콜라이 LT 하위단위를 발현하는 플라스미드 pPJV7788의 제작
플라스미드 pPJV7788을 하기 플라스미드를 사용하여 생산하였다:
pPJV7275, pPJV7284, pPJV7389, pPJV7586 및 pPJV7293으로부터 유도된 플라스미드인 pPJV7563 및pPJV7592;
CMV 프로모터의 바로 상류에 복수 클로닝 부위 (MCS)를 포함하는 pPJV7389의 유도체인 pPJV7590;
코딩된 항원의 바로 상류에 닭 리소자임 시그널 펩티드 (CLSP)에 대한 코딩 서열을 포함하는 pPJV7389의 유도체인 pPJV7572. 이는 c-말단 융합된 항원의 세포외 분비를 가능하게 한다.
(i) pPJV7785 ( LTA 수용체 플라스미드)의 제작
pPJV7563을 Sal1로 절단하고, 말단을 무디게 한 후, Nde1로 절단하여 벡터 단편을 형성하였다. pPJV7590을 Sph1로 절단하고, 말단을 무디게 한 후, Nde1로 절단하여 MCS 및 CMV 프로모터의 5' 말단을 포함하는 삽입 단편을 형성하였다. 이들 단편을 라이게이션하여 pPJV7592를 생산하였다.
pPJV7592를 Nco1 및 Bgl2로 절단하여 벡터 단편을 형성하였다. pPJV7572를Nco1 및 Nhe1로 절단하여 CMV 프로모터의 3'-말단, 5' 비-번역 영역 및 CLSP를 포함하는 삽입 단편을 형성하였다. pPJV2004를 Nhe1 및 BamH1로 절단하여 LTA 하위단위를 포함하는 삽입 단편을 형성하였다. 이들 단편을 라이게이션하여 플라스미드 pPJV7785를 생산하였다.
(ii) pPJV7787 ( LTB 공여체 플라스미드)의 제작
pPJV7389를 Nco1 및 EcoR1로 절단하여 벡터 단편을 형성하였다. pPJV7572를 Nco11 및 Nhe1로 절단하여 CMV 프로모터의 3'-말단, 5' 비-번역 영역 및 CLSP를 포함하는 삽입 단편을 형성하였다. pPJV2005를 Nhe1 및 BamH1로 절단하여 LTB 하위단위를 포함하는 삽입 단편을 형성하였다. pPJV7586을 Bgl2 및 EcoR1으로 절단하여 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화 영역을 포함하는 삽입 단편을 형성하였다. 이들 단편을 라이게이션하여 pPJV7787을 생산하였다.
(iii) pPJV7788 의 제작
pPJV7785를 Xho1 및 Mfe1로 절단하여 LTA 발현 카세트를 포함하는 벡터 단편을 형성하였다. pPJV7787을 Xho1 및 EcoR1로 절단하여 LTB 발현 카세트를 포함하는 삽입 단편을 형성하였다. 이들 단편을 라이게이션하여 포유동물 세포에 도입되면 LTA 및 LTB 하위단위를 발현할 pPJV7788을 생산하였다.
하기 표 8은 구조물 pPJV7788에서 다양한 요소의 위치를 제공한다.
pPJV7788의 성분 확인
염기 번호 성분
1-44 Tn903, pUC4K 파편
45-860 KanR (Tn903)
861-983 Tn903, pUC4K 파편
984-1001 pUC19 MCS
1002-1686 CMV Pro
1687-1817 CMV 엑손 1/2
1818-1823 Bam/Bgl 융합
1824-1956 래트 인슐린 인트론 A
1857-1962 BamH1 부위
1963-2083 HBVpre-S2의 5'-UTR
2084-2143 리소자임 SP
2144-2149 Nhe1 부위
2150-2462 LTB
2463-2593 RBGpA
2594-2623 복수 클로닝 부위
2624-3308 CMV Pro
3309-3439 CMV 엑손 1/2
3440-3445 Bam/Bgl 융합
3446-3578 래트 인슐린 인트론 A
3579-3584 BamH1
3585-3705 HBVpre-S2의 5'-UTR
3706-3765 리소자임 SP
3766-3671 Nhe1 부위
3772-4494 LTA
4495-4506 폴리링커
4507-5039 HBVenh
5040-5050 불명 기원
5051-5181 rGlob pA
5182-5187 EcoR1 부위
5188-6254 pUC19
실시예 21: 포유동물 세포에서 H5 / VN1194 헤마글루티닌 단백질을 발현하는 플라스미드 pPML7789 의 제작
본 발명의 키메릭 프로모터를 이용하여 H5/VN1194 헤마글루티닌 단백질을 발현할 수 있는 추가의 구조물 pPML7789를 생산하였다. 실시예 5에 기재된 구조물 pPJV7563을 구조물 pPML7789를 위한 기본구조로서 사용하였다.
H5/VN1194 HA 유전자에 대한 코딩 서열을 갖는 플라스미드를 PCR을 위한 주형으로서 사용하였다. PCR 프라이머를 5' 및 3' 말단 부위로 고안하여 pPJV7563으로의 삽입을 가능하게 하였다. pPJV7563을 Nhe1 및 Bsp120I로 절단하여 벡터 단편을 생산하였다. H5/VN1194 주형으로부터 증폭된 PCR 단편을 동일한 효소로 절단하여 삽입 단편을 생산하였다. 이들 두 단편을 라이게이션하여 pPML7789를 생산하였다. 코딩 서열 및 플랭킹 서열을 서열분석에 의해 확인하였다.
pPML7789에서 다양한 요소의 뉴클레오티드 위치를 하기 표 9에 나타냈다.
구조물 pPML7789의 성분
뉴클레오티드 위치 요소
처음: 1 끝: 44 Tn903, pUC4K 파편
처음: 45 끝: 860 KanR (Tn903)
처음: 861 끝: 896 Tn903, pUC4K 파편
처음: 897 끝: 902 pUC19 MCS
처음: 903 끝: 1587 CMV Pro
처음: 1588 끝: 1718 CMV 엑손 1/2
처음: 1719 끝: 1724 Bam/Bgl 융합
처음: 1725 끝: 1857 래트 인슐린 인트론 A
처음: 1858 끝: 1863 BamH1 부위
처음: 1864 끝: 1984 HBVpre-S2의 5'-UTR
처음: 1985 끝: 1993 ATG-Nhe
처음: 1994 끝: 3699 VN1194H5
처음: 3700 끝: 3705 Bsp120I 부위
처음: 3706 끝: 4238 HBVenh
처음: 4239 끝: 4249 불명 링커 서열
처음: 4250 끝: 4380 rGlob pA
처음: 4341 끝: 4341 폴리A 부위
처음: 4381 끝: 4386 EcoR1 부위
처음: 4387 끝: 5453 pUC19
실시예 22: HSV -2 ICP27 및 이. 콜라이 이열성 독소로의 DNA 면역화에 의해 발생된 강력한 방어성 세포 면역 반응
물질 및 방법
바이러스
HSV-2 바이러스 (신시내티 대학의 낸시 소텔(Nancy Sawtell)로부터 제공된 MS 균주, ATCC VR-540 및 HG52 균주 G)를 VERO 세포 (ATCC CCL-81)에서 성장시켜 사용하기 전에 슈크로즈 구배에서 정제하였다.
DNA 백신 및 DEI 벡터
전체 ICP27 유전자 (UL54)를 도입한 PCR 단편을 pTarget (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가)에 삽입함으로써 HSV-2 ICP27을 코딩하는 플라스미드 (도 27)를 생산하였다. PCR 단편을 5' 프라이머 (GCCACTCTCTTCCGACAC, 서열 63) 및 3' 프라이머 (CAAGAACATCACACGGAAC, 서열 64)를 사용하여 HSV-2의 MS 균주의 정제된 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 증폭된 서열은 HSV-2 (진뱅크 등록번호 NC_001798)의 HG52 클론의 공개된 게놈 서열의 뉴클레오티드 114,523부터 116,179에 상응하였다. 미국 매디슨 소재의 위스콘신 대학의 DNA 서열분석 핵심 연구시설에 의해 pICP27을 전체 서열분석하였다.
플라스미드 PJV2012는 단일 벡터로부터 LT의 A 및 B 하위단위를 둘다 코딩하고 이를 도 22에 나타냈다. pPJV2012의 제작은 실시예 19에 기재되어 있다. pPJV2012에서, LT A 하위단위 유전자는 하기 성분으로 이루어진 전사 단위체로부터 발현된다: 인간 사이토메갈로바이러스 (hCMV) 즉시형 초기 프로모터, hCMV로부터의 융합된 엑손 1 및 2 (비-코딩), 래트 인슐린 인트론 A, B형 간염 바이러스 (HBV) pre-S2 유전자의 5' 비-코딩 영역, ATG 코돈, 리소자임 시그널 펩티드 코딩 서열, LT A 하위단위 코딩 서열, 3' 비-코딩 HBV 전사 인핸서 영역, 및 토끼 베타 글로빈 폴리아데닐화 서열.
pPJV2012는 또한 반대 방향으로 진행하는 제2 전사 단위체로부터 LT B 하위단위 산물을 코딩한다 (도 22). LT B 전사 단위체는 LT A 산물을 코딩하는 것과 유사하지만 hCMV 및 HBV 전사 인핸서 요소의 추가 카피를 포함하지 않는다. LT A 전사 단위체에 위치하는 hCMV 및 HBV 인핸서 요소는 또한 LT B 전사 단위체로도 작용한다.
플라스미드 PJV2013 (도시되지 않음)는 pPJV2012와 유사하지만 단일 벡터로부터 콜레라 독소의 A 및 B 하위단위 산물을 둘다 코딩한다. pPJV2013 기능 지도는 도 22에 pPJV2012에 대해 나타낸 것과 동일하다.
입자-매개형 상피 전달 ( PMED )을 통한 DNA 백신접종
생후 6주 내지 8주령의 암컷 Balb/c 마우스의 PMED DNA 백신접종을, 각각의 면역화가 복부 피부에 단일 PMED 전달로 이루어지고 각각의 전달이 DNA 백신/DEI 벡터 제형 총 0.5 ㎍으로 코팅된 금 0.5 mg을 함유한다는 것을 제외하고는, 이미 개시된 바 (문헌 [Arrington et al, J. Virol. 76, 4536-4546, 2002])와 같이 수행하였다. 이러한 "단일 쇼트"의 2차례의 면역화가 4주 간격으로 이루어지고 2차 면역화 후 2주에 동물을 참수시키거나 공격접종하였다.
펩티드 풀 및 펩티드
MS 균주 바이러스로부터 유도된 ICP27에 대한 아미노산 서열을 라이브러리를 위한 주형으로서 사용하였다. ICP27 단백질은 HG52와 MS 서열 사이에 고도로 보존되어 있고 (도 28 및 서열 65 참조), 따라서 라이브러리는 두 균주에 대한 반응을 검출할 수 있을 것이다. 펩티드 라이브러리를 합성하여 (미모토프(mimotope), 피셔 사이언티픽) 18개 아미노산 길이이고 인접한 펩티드와 11개 아미노산이 중첩되는 펩티드를 사용하여 ICP27의 전체 서열을 확장하였다. 총 72개 펩티드가 제조되었다.
양성 펩티드의 확인을 용이하게 하기 위해 라이브러리를 문헌 [Tobery et al. J. Immunol. Methods 254, 59-66, 2001]에 개시된 방법을 사용하여 펩티드 풀로 나누었다. 펩티드 풀을 표 10에 나타낸 패턴을 사용하여 만들었다. 풀당 6개의 펩티드로 구성된 12개의 풀 (C1-C12라 함) 및 풀당 12개의 펩티드로 구성된 6개의 풀 (R1-R6이라 함)이 있다. 펩티드 #45 및 #46를 포함하는 풀은 볼드체로 나타냈다.
펩티드 풀 조성
C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12
R1 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23
R2 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47
R3 49 51 53 55 57 59 61 63 65 67 69 71
R4 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
R5 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50
R6 52 54 56 58 60 62 64 66 68 70 72 2
ELISPOT 분석법
자극을 위한 항원이 결과 단락에서 각각의 실험에 대해 정의된 단일 펩티드 또는 펩티드 풀인 것을 제외하고는, 이미 개시된 바와 같이 IFN-γ ELISPOT 분석법을 새로운 비장세포 및 림프절 세포에서 수행하였다. 몇몇 예에서, ELISPOT 분석법 전에, T-세포군을 제조업자의 지시에 따라 자기 비드 (다이날(Dynal))에 의해 제거하였다.
세포측정 비드 어레이 ( CBA ) 분석법
새로운 비장세포를 2차 면역화 후 2주에 수집하고 SM (RPMI 배지 + MEM 피루브산 나트륨, 비-필수 아미노산 및 2-머캅토에탄올을 보충한 10％ 태 소 혈청 (미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐(Invitrogen))) 중에 1 ml당 1 x 107개의 세포로 재현탁하였다. 세포 샘플을 편평한 바닥의 96-웰 평판에 웰당 1 x 106개의 세포 (100 ㎕)로 플레이팅하였다. 비장세포를 SM 중 ICP27 펩티드의 100 ㎕ 분취물 또는 배지-단독으로 처리하였다. 최종 펩티드 농도는 10-8 M이었다. 접종하지 않은 동물로부터의 대조 비장세포 또한 플레이팅하는데, 이때 펩티드를 함유시키거나 함유시키지 않고 Con-A (최종 농도 2.5 mg/ml)를 함유시키거나 함유시키지 않아 각각 음성 및 양성 대조군으로서 사용하였다.
평판을 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션한 다음 160 ㎕의 각각의 샘플을 수집하고 BD 세포측정 비드 어레이 (CBA) 마우스 Th1/Th2 키트 (미국 캘리포니아주 산 호세 소재의 BD 바이오사이언시즈 (BD Biosciences) (cat. #551287))를 사용하여 분석할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 간략하게 말하면, 이 키트는 마우스 IL-2, IL-4, IL-5, IFN-γ 및 TNF-α에 대해 특이적인 포획 항체로 코팅된 독특한 형광 강도를 갖는 5개의 비드 집합체를 사용한다. 5개의 비드 집합체를 함께 혼합하여 BD FACSCalibur 유동 세포측정기의 FL3 채널에 용해된 어레이를 형성하였다. 사이토킨 포획 비드를 PE-접합된 검출 항체와 혼합한 다음 표준 샘플 또는 시험 샘플과 함께 인큐베이션하여 샌드위치 복합체를 형성하였다. BD CBA 분석 소프트웨어를 사용하여 샘플 획득 후에 결과를 얻었다. 각 사이토킨의 샘플 강도를 표준 곡선과 비교하여 사이토킨 농도의 정량화를 용이하게 하였다. 샘플을 제조업자의 지시에 따라 그대로 또는 1:10으로 희석하여 전개하였다.
HSV -2 바이러스 공격접종
마취한 Balb/c 마우스에 대략 50LD50 (2 x 106 PFU)의 HSV 균주 MS를 함유하는 PBS 30 ㎕를 비강내로 공격접종하였다. 마우스를 감염 후 20일 동안 추적조사하여 발병률 및 사망률의 등급을 매겼다. 발병률을 하기 방식에 따라 0 내지 4의 등급을 매겼다: 4, 건강함; 3, 곤두선 털, 재채기; 2, 눈이나 둔부에 상처, 움직임 둔화; 1, 몸을 둥글게 구브림, 움직임 거의 없음; 0, 사망. 공격접종할 쯤에 IFN-γ- (미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 이바이오사이언스(eBioscience) (cat. # 16-7311)) 및/또는 TNF-α- (cat. # 16-7322) 특이적 모노클로날 항체로 처치한 마우스에 바이러스 공격접종의 -2, 0, 2, 4, 6 및 8일째에 항체 90 ㎍을 함유하는 주입액을 복강내 투여하였다. T-세포 제거 실험에서, 마우스에 바이러스 공격접종의 -2 및 0일째에 CD4 또는 CD8 군에 대해 특이적인 항체 200 ㎍을 함유하는 주입액을 복강내 투여하였다 (기능적 등급의 정제된 항-마우스 CD4, 이바이오사이언스 Cat#: 16-0041; 기능적 등급의 정제된 항-마우스 CD8, 이바이오사이언스 Cat#: 16-0081).
결과
Balb /c 마우스에서 강력한 CD8 에피토프의 확인
ICP27 단백질에 대한 T-세포 반응을 확인하기 위해, IFN-γ ELISPOT 분석법을 HSV-2 (HG52 균주 G)의 약독화된 균주로 감염된 Balb/c 및 C57Bl/6 마우스로부터 채취한 세포에서 수행하였다. ICP27 코딩 서열의 전체 길이를 확장하는 펩티드로 구성된 펩티드 라이브러리를 사용하여 T-세포를 자극하였다. 펩티드는 18개 아미노산 길이이고 11개 아미노산이 이웃 펩티드와 중첩되었다. 펩티드 풀은 물질 및 방법과 표 10에 기재된 바와 같이 6개 펩티드 (풀 C1-C12) 또는 12개 펩티드 (풀 R1-R6)로 구성되고, 그 구조는 라이브러리 내에서 양성 펩티드의 확인을 용이하게 한다. 감염 후 7일째에 Balb/c 마우스로부터 채취한 비장 및 림프절 세포는 풀 C10, C11, R2 및 R5 내의 펩티드에 대해 매우 강력한 반응을 나타냈고 (도 29A), 보다 약한 반응이 몇몇 다른 풀에서 나타났다. 약한 반응은 C57Bl/6 마우스로부터 채취한 세포에서 검출되었다. 양성 반응의 패턴은 분석된 비장 및 림프절 세포군에서 유사한 것으로 밝혀졌다.
IFN-γ ELISPOT 결과에 따라, 2개의 인접한 펩티드 (#45, #46)는 우세한 T-세포 에피토프를 포함하는 것으로 예견되었다. 이는 각각의 펩티드를 개별적으로 시험함으로써 확인되었다 (데이터를 도시하지 않음). 펩티드 45 및 46은 강력한 IFN-γ 분비를 자극하였고 Dd 대립유전자에 결합하는 것으로 예견되는 상동성 9개 아미노산 서열 HGPSLYRTF (도 29B, 서열 68)를 포함하였다. 흥미롭게도, 펩티드 46은 또한 Balb/c 마우스에서 HSV-1 (문헌 [Banks et al, J. Virol. 67, 613-616, 1993])으로부터의 ICP27과 관련하여 이미 개시된 에피토프에 상응하는 영역을 포함하였다. HSV-1과 HSV-2에서 ICP27 서열의 비교는 상기 영역이 한 아미노산에 의해 상이하다: HSV-2 ICP27 (LYRTFAANPRA, 서열 69)의 알라닌 (A) 잔기가 HSV-1 (LYRTFAGNPRA, 서열 70)에서는 글리신 (G)으로 대체되었다는 것을 나타냈다. 그러나, 펩티드 45가 매우 강력한 반응을 자극함에도 불구하고 상기 영역은 펩티드 45에 존재하지 않았다.
IFN-γ ELISPOT 분석법에서 펩티드 46에서 2개의 잠재적인 에피토프의 상대적인 중요성을 측정하기 위해, 펩티드 LYRTFAANPRA 및 HGPSLYRTF를 합성하여 시험하였다. 감염된 마우스로부터 단리된 비장 세포는 HGPSLYRTF 펩티드에 대해 강력하게 반응하였지만, LYRTFAANPRA 서열에 대해서는 백그라운드 초과의 반응이 검출되지 않았다. IFN-γ ELISPOT 분석법 전에 T-세포군을 제거하기 위해 자기 비드를 사용함으로써 강력한 CD8+ ICP27 반응을 초래하였다. 데이터는 강력한 CD8 반응이 서열 HGPSLYRTF에 대해 특이적인 HSV-2 ICP27 단백질에 대해 Balb/c 마우스에서 발생한다는 것을 나타낸다.
ICP27 백신에 대한 시험관내 면역 반응
HSV-2의 MS 균주로부터의 ICP27 서열을 사용하여 DNA 백신 "pICP27"을 생산하였다 (도 27). 서열분석한 구조물은 공개된 HG52 ICP27 유전자 서열과 2개의 뉴클레오티드만 차이가 있었다 (도 28). 뉴클레오티드 57에서 침묵성인 G에서 A로의 변화가 있었고, 484에서 A에서 C로의 변화는 HG52 균주에서의 리신을 MS 균주에서의 아스파라긴으로 변화시킬 것이다. 따라서 DNA 백신으로부터 발현된 MS 균주 ICP27 단백질은 추정 CD8 에피토프의 영역에서 차이가 없는 단백질의 HG52 균주의 것과 거의 동일하였다.
pICP27 DNA 백신을 사용하여 PMED에 의해 Balb/c 및 C57Bl/6 마우스를 면역화하였다. 비장세포 및 림프절 세포를 도 29에 기재된 풀의 패널에 대해 IFN-γ ELISPOT 분석법에서 시험하였다. DNA 면역화된 마우스에서 나타나는 ICP27 펩티드에 대한 양성 반응의 패턴은 감염된 마우스에서 나타나는 것과 동일하다 (데이터를 도시하지 않음).
ICP27 백신에 대한 생체내 반응
pICP27 DNA 백신접종에 의해 발생한 면역 반응의 생체내 활성을 Balb/c 마우스에서 예방을 위한 비강내 감염 모델에서 연구하였다. 생후 12주령의 Balb/c 마우스에서 HSV-2의 MS 균주의 다양한 용량으로의 감염은 대략 3 x 104 PFU의 LD50을 설정하였다 (데이터를 도시하지 않음). DNA 방어 실험에서, 50 LD50의 바이러스 공격접종 용량을 사용하였는데, 그 이유는 상기 용량이 접종하지 않은 동물에서 100％ 사망률을 일관되게 초래하였기 때문이다.
일련의 실험이 pICP27 DNA 단독으로의 면역화 (1차 및 2차)가 제한된 마우스 방어 능력을 갖는다는 것을 나타냈다. 따라서, 방어를 향상시키기 위해 콜레라 독소 (CT) 또는 이. 콜라이로부터의 이열성 독소 (LT)를 코딩하는 DEI 벡터를 ICP27 DNA 백신과 함께 공동-전달하였다. A 및 B 독소 하위단위는 두 독소 각각의 경우 동일한 플라스미드로부터 발현되었다.
마우스를 ICP27 DNA 백신 단독으로, 또는 9:1 비율로 CT 또는 LT DEI 벡터를 보충하여 (항원 DNA 0.45 ㎍ + DEI 벡터 DNA 0.05 ㎍) 면역화하였다. 면역화군당 총 16마리의 동물을 이용하여, 절반은 바이러스로 공격접종하고 나머지 절반은 ICP27-특이적 사이토킨 생산을 위한 공격접종시 참수하였다.
본 연구의 결과를 도 31에 나타냈다. 결과는 ICP27 + CT 및 ICP27-단독 제형으로의 면역화가 각각 부분 방어를 제공하고 방어를 제공하지 않는다는 것을 나타내고, 반면 100％ 방어는 ICP27 + LT 제형으로 관찰되었다 (도 31A). 이러한 결과는 DEI 벡터와 ICP27 벡터의 공동-전달이 방어를 증대시키고 DNA 면역화에서 면역증강제로서 CT에 비해 LT의 우수성을 지지한다는 것을 확인하였다. CBA 키트를 사용하여 CD8 에피토프 펩티드로의 시험관내 자극 후의 사이토킨 생산을 정량화하여 공격접종 생존률과 IFN-γ (도 31B) 및 TNF-α (도 31C) 생산 수준 사이의 양호한 상관관계를 입증하였다.
사이토킨 및 T-세포군의 역할
공격접종한 동물의 방어에서 IFN-γ 또는 TNF-α의 ICP27-특이적 생산의 역할을 조사하였다. pICP27 + pPJV2012 (LT)-백신접종된 동물을 공격접종할 쯤에 수일간 IFN-γ- 및/또는 TNF-α-특이적 모노클로날 항체로 처치하여 생체내 사이토킨을 중화하였다. 발병률 데이터를 도 32에 나타냈다. 상기와 같이, 2차례 ICP27 + LT DEI 백신을 접종한 동물은 공격접종으로부터 완전히 방어되었고 미약한 일시적인 발병 (4마리의 동물 중 1마리에서 털이 곤두섬)을 나타냈고, 접종하지 않은 마우스 또는 pICP27 벡터 단독으로 면역화된 마우스의 100％가 공격접종으로 사망하였다. ICP27 + LT DEI 제형으로 면역화한 다음 항-TNF-α로 처치한 군에서는, 마취 합병증으로 인해 비강내 공격접종 직후에 1마리의 사망이 관찰되었다. 중요한 것은, 3마리의 나머지 마우스는 단지 일시적으로 털이 곤두섰고 완전히 회복되었으며, 이는 TNF-α 생산이 방어에 유의하게 기여하는 것 같지 않다는 것을 암시한다. 반대로, 공격접종시 항-IFN-γ 또는 항-IFN-γ + 항-TNF-α를 투여한 ICP27 + LT DEI-면역화된 마우스의 2개의 군은 심하게 발병하였으며 8마리 동물 중 7마리가 사망하였고, 이는 방어의 필수적인 매개자로서 IFN-γ의 중요성을 명확하게 입증하였다.
방어에 있어서 CD4 및 CE8 군의 역할을 시험하기 위해, CD4 또는 CD8에 대한 항체를 사용하여 감염성 공격접종 전에 이들 군을 제거하였다 (도 33). 마우스를 20일에 걸쳐서 사망률에 대해 추적하면 흥미로운 패턴이 나타났다. 예상한 바와 같이, 엠프티 벡터와 함께 pICP27을 제공한 마우스는 감염으로부터 유의하게 방어되지 않았다. pICP27 + LT DEI 백신접종은 100％ 생존률을 제공하였고, 반면 유사하게 면역화된 마우스로부터 CD4 및 CD8 세포의 제거는 백신접종의 방어 효과를 없애고 마우스가 접종하지 않은 마우스와 대략 동일한 수준으로 감염되기 쉽게 한다. pICP27 + LT DEI 백신으로 면역화한 마우스에서, 감염 전 CD8 군의 제거는 마우스가 감염되도록 하고 이는 감염 또는 뇌염으로부터의 방어에 있어서 이들 세포의 중요한 역할을 암시하였다. pICP27 + LT DEI 백신접종한 마우스에서, CD4 군의 제거는 이들 마우스가 병들거나 사망하기 전에 9일 지연 (접종하지 않은 마우스와 비교하여)을 초래하였고, 이는 장기 생존에 있어서 CD4 T-세포의 역할을 시사하였다.
실시예 23: 마우스에서 인플루엔자 H5N1 DNA 백신의 면역원성
물질 및 방법
인플루엔자 A/Vietnam/1194/2004 [H5N1] 바이러스의 HA를 코딩하는 DNA 플라스미드 pPML7789 (실시예 21, 도 20)를 금 입자 상에 침전시키고 파우더메드(PowderMed) 소유의 전달 기술을 사용하여 입자 매개형 상피 전달 (PMED)에 의해 마우스에 전달하였다. 전달은 아쥬반트로서 이. 콜라이 이열성 독소 하위단위 A 및 B를 코딩하는 추가의 플라스미드 pPJV2012 (실시예 19, 도 22)와 함께 또는 이것 없이 실시하였다. pPJV2012가 존재할 경우, 이 추가의 플라스미드 및 pPML 7789 플라스미드를 동일한 금 입자 상에 침전시켰다. 이는 1:9의 중량비로 액체 형태인 pPJV2012와 pPML 7789를 우선 예비혼합한 다음 플라스미드를 금 입자 상에 공동-침전시킴으로써 수행되었다. 음성 대조군으로서, 플라스미드가 침전되지 않은 금 입자를 PMED에 의해 전달하였다. 마우스는 하기와 같았다:
계통: Balb/C 마우스
마리수: 36마리
성별: 암컷
체중 범위: 15.0 내지 19.6 g (첫번째 절차 수행 당일)
연령: 42 내지 49일 (도착 당일)
식이: RM1 펠렛형
공급자: 찰스 리버 UK 리미티드 (Charles River UK Ltd).
마우스를 하기 표 11에 나타낸 바와 같이 6개의 군으로 나누었다. 마우스에 수행한 절차 및 절차 수행일을 하기 표 12에 나타냈다. HAI 분석법을 표준 절차에 따라 혈청으로 수행하였다.
동물의 처치군 배정
군 투여 경로 각 군의 동물 마리수 처치
1 상피 6 음성 대조군 1회 투여 채혈일 -1, 채혈 및 사망일 14
2 상피 6 음성 대조군 2회 투여 채혈일 -1 및 21, 채혈 및 사망일 36
3 상피 6 pPML7789 1회 투여 채혈일 -1, 채혈 및 사망일 14
4 상피 6 pPML7789 2회 투여 채혈일 -1 및 21, 채혈 및 사망일 36
5 상피 6 pPML7789 + pPJV2012 1회 투여 채혈일 -1, 채혈 및 사망일 14
6 상피 6 pPML7789 + pPJV2012 2회 투여 채혈일 -1 및 21, 채혈 및 사망일 36
하기 절차를 X로 표시한 날에 수행하였다.
연구 수행일 0 14 21 35
트랜스폰더 이식 X
체중 X X Xb Xb
백신접종 X Xb
건강상태 등급 X X Xb Xb
항체에 대한 혈청 X Xa Xb Xb
비장 채취 Xa Xb
사망 Xa Xb
a 제1군, 제3군 및 제5군 b 제2군, 제4군 및 제6군
결과
NIBRG -14 [ H5N1 ] 바이러스에 대한 HAI 역가를 측정하였다
모든 대조군은 허용가능한 한계 내에 있는 것으로 관찰되었다. 음성 대조군 항목 (NIBRG-14 [H5N1] 바이러스)은 모든 평판에서 음성이었다. 양성 대조군 항목 (칠면조 적혈구)은 모든 평판에서 양성이었다. 제2의 양성 대조군 항목 (인플루엔자 A/닭/Scotland/59 [H5N1] 바이러스에 대한 항체를 함유하는 혈청)은 모든 평판에서 28, 40, 56 또는 80 HAIU (40 HAIU +/- 2배의 허용가능한 한계 내)의 기하 평균까지 전개되었다.
21일째에 채혈할 수 없었던 ID: 1074 (제6군) 및 21일째에 분석법을 수행하기에 수득된 혈청이 불충분했던 ID: 1059 (제4군)를 제외하고는, 모든 샘플이 0, 14 및 21일째에 10 HAIU 미만 (검출 한계 미만)이었다.
35일째에 채혈한 경우, 채혈할 수 없었던 ID: 1074 (제6군)을 제외하고 각 샘플의 기하 평균 역가를, 각 군에 대하여 군의 평균, 중앙값 및 표준 편차와 함께 계산하였다. 이들은 하기 표 13에 나타냈다.
제2군, 제4군 및 제6군의 35일째에 수득한 혈청의 HAI 역가
군 샘플 번호 GEO 평균 역가 평균 중앙값 SD
2 1047 <10 <10 <10 0
1048 <10
1049 <10
1050 <10
1051 <10
1052 <10
4 1059 28 28 24 10
1060 40
1061 40
1062 20
1063 20
1064 20
6 1071 160 164 160 40
1072 226
1073 160
1074 *
1075 160
1076 113
* 동물 한마리가 조기 사망으로 데이터 이용불가
결과는 pPML7789 플라스미드가 마우스에서 면역원성이고 이 면역원성은 pPJV2012를 포함시킴으로써 증대된다는 것을 보여준다.
따라서, 신규 핵산 구조물, 각종 구조물을 포함하는 조성물, 및 이들 구조물을 사용한 핵산 면역화 기술이 기재되었다. 본 발명의 바람직한 실시양태가 상세히 기재되었지만, 본 발명의 취지 및 범주로부터 이탈함이 없이 변형이 있을 수 있는 것으로 생각된다.
SEQUENCE LISTING <110> POWDERJECT VACCINES, INC; POWDERMED LIMITED <120> NUCLEIC ACID CONSTRUCTS <130> N93730C GCW <150> UK 0507997.5 <151> 2005-04-20 <150> US 60/672,479 <151> 2005-04-19 <150> US 60/648,382 <151> 2005-02-01 <160> 70 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 685 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <400> 1 aatattggct attggccatt gcatacgttg tatctatatc ataatatgta catttatatt 60 ggctcatgtc caatatgacc gccatgttga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa 120 tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg 180 gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg 240 tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt ggagtattta 300 cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtcc gccccctatt 360 gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac cttacgggac 420 tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggt gatgcggttt 480 tggcagtaca ccaatgggcg tggatagcgg tttgactcac ggggatttcc aagtctccac 540 cccattgacg tcaatgggag tttgttttgg caccaaaatc aacgggactt tccaaaatgt 600 cgtaataacc ccgccccgtt gacgcaaatg ggcggtaggc gtgtacggtg ggaggtctat 660 ataagcagag ctcgtttagt gaacc 685 <210> 2 <211> 131 <212> DNA <213> Human cytomegalovirus <400> 2 gtcagatcgc ctggagacgc catccacgct gttttgacct ccatagaaga caccgggacc 60 gatccagcct ccgcggccgg gaacggtgca ttggaacgcg gattccccgt gccaagagtg 120 actcaccgtc c 131 <210> 3 <211> 135 <212> DNA <213> Rattus rattus <400> 3 atcagcaagc aggtatgtac tctccagggt gggcctggct tccccagtca agactccagg 60 gatttgaggg acgctgtggg ctcttctctt acatgtacct tttgctagcc tcaaccctga 120 ctatcttcca ggtca 135 <210> 4 <211> 955 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Chimeric promoter sequence <400> 4 aatattggct attggccatt gcatacgttg tatctatatc ataatatgta catttatatt 60 ggctcatgtc caatatgacc gccatgttga cattgattat tgactagtta ttaatagtaa 120 tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac ataacttacg 180 gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc aataatgacg 240 tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt 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papillomavirus type 16 <400> 13 aattgttaca tataattgtt gtataccata acttactatt ttttcttttt tattttcata 60 tataattttt ttttttgttt gtttgtttgt tttttaataa actgttatta cttaacaatg 12 cgacacaaac gttctgcaaa acgcacaaaa cgtgcatcgg ctacccaact ttataaaaca 180 tgcaaacagg c 191 <210> 14 <211> 3759 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> pJV expression vector <220> <221> Intron <222> (1725)..(1857) <223> Rat Ins IntA <220> <221> misc_feature <222> (1)..(44) <223> Tn903, pUC4K Remnants <220> <221> misc_feature <222> (861)..(896) <223> Tn903, pUC4K Remnants <220> <221> misc_feature <222> (897)..(902) <223> pUC19 MCS <220> <221> polyA_signal <222> (2556)..(2686) <223> rGLOB pA <220> <221> polyA_site <222> (2647)..(2647) <223> PolyA_Site_1 <220> <221> promoter <222> (903)..(1587) <223> CMV Pro <220> <221> 3'UTR <222> (2012)..(2544) <223> HBVenh <220> <221> 5'UTR <222> (1864)..(1984) <223> 5'-UTR of HBV pre-S2 <220> <221> misc_feature <222> (1719)..(1724) <223> Bam/Bgl fusion <220> <221> misc_feature 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cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 3748 ttgcctgact c 3759 <210> 15 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 15 ggaggatccg gacggtgagt cactcttggc acggggaatc cg 42 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 16 ggtgaatatg gctcataaca c 21 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 17 ccgccgaaca tggagaacat cgc 23 <210> 18 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 18 cacagatctt ttgttagggt ttaaatgtat acc 33 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 19 ggaggatcct gacctggaag atagtcacc 29 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 20 ggaggatcca tcagcaagca ggtatg 26 <210> 21 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 21 ggagctagcg ggcgtttgac ctccggcgtc ggg 33 <210> 22 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 22 ggagaattca gatctcctct agtaaaacaa tggctgg 37 <210> 23 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 23 ggagctagcc ttctaaccga ggtcg 25 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 24 ggaagatctc cttactccag ctctatgctg 30 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 25 ggcgaattcc ttccgagtga gagacac 27 <210> 26 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 26 ggagtataca tttaaagggc cctaacaaaa caaaaagatg ggg 43 <210> 27 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 27 ggagctagct cgtttacttt gaccaagaac g 31 <210> 28 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 28 ggaagatctc cttatttttg acaccagacc aactgg 36 <210> 29 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 29 ggagtcgacc tgtctgctta cataaacag 29 <210> 30 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 30 cgtaatgctc tgccagtgtt acaacc 26 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 31 gaaagatctc agcaagcagg 20 <210> 32 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 32 ggaggatcct gacctggaag atagtcaggg ttgaggcaag caaaagg 47 <210> 33 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 33 ctagcgggcc ca 12 <210> 34 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 34 gatctgggcc cg 12 <210> 35 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 35 ggagctagca tcatcccagt tgaggagg 28 <210> 36 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 36 ggtagatctc ctcatgtctg ctcgaagc 28 <210> 37 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 37 ccaagctagc gacaaaactc acacatgcc 29 <210> 38 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 38 ggaagatctc gtttacccct gtcatttacc cggagacagg gagag 45 <210> 39 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 39 aagatgtcca gactctgtct ctccgtggcc ctcctcgtgc tcctcgggac actcgcc 57 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 40 ggaactagta agatgtccag actc 24 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 41 ggaagctagc ggcgagtgtc ccgag 25 <210> 42 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 42 ggaaagatgg ccagcctctt tgccacattt ctcgtggtgc tcgtgagcct cagcctcgcc 60 agcgaaagca gcgcc 75 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 43 ggaactagtg gaaagatggc cagc 24 <210> 44 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 44 ggaagctagc ggcgctgctt tcgctg 26 <210> 45 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide <400> 45 aggtctttgc taatcttggt gctttgcttc ctgcccctgg ctgctctggg g 51 <210> 46 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 46 ggaactagta ggtctttgct aatc 24 <210> 47 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 47 ggaagctagc ccccagagca gccag 25 <210> 48 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 48 ggagctagct cgtttacttt gaccaagaac g 31 <210> 49 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 49 ggaagatctc cggtgagtgg tgctg 25 <210> 50 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 50 gcaggatcca gtagacctgg agagaggaca ag 32 <210> 51 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Primer <400> 51 ggaagatcta caaggtgagc tgctgtggc 29 <210> 52 <211> 490 <212> DNA <213> Pseudo rabies virus <400> 52 tggccgcaga gcgggccggg catgcaaatc agaggcgcgc gggagacgcc tccgcgcgcc 60 cattggcccg ggcgagccga gatggccgcc gcgggggccg gacatgcaaa gtagacgcga 120 gaggaagtag ggagagaaat cccattggcc gtcgaggggc caagatggcg ccctcggggc 180 cggacatgca aagtagacgc gagaggaagt gggcgagaga aatcccattg gccgtcgatg 240 gggcaagatg gccgccgcgg gggccgggca tgcaaatggt cctcgcgagg aagttcctcg 300 cgaaatccca ttggccggcg gccgccatct tgggccgggc atgcaaagca gacggcagag 360 gaagcgggcg agaaaaatcc cattggccgg ccgtcgggga agtccgcggc gaaaatcggc 420 cattggtccg cttacctggg ggcgggctct cctcggggcg cttataagcg cggtctccat 480 cgtagcactt 490 <210> 53 <211> 495 <212> DNA <213> Rous sarcoma virus <400> 53 ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg cgagcaaaat ttaagctaca 60 acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc ttagggttag gcgttttgcg 120 ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgtatctgag gggactaggg tgtgtttagg 180 cgaaaagcgg ggcttcggtt gtacgcggtt aggagttccc tcaggatata gtagtttcgc 240 ttttgcatag ggagggggaa atgtagtctt atgcaataca cttgtagtct tgcaacatgg 300 taacgatgag ttagcaacat gccttacaag gagagaaaaa gcaccgtgca tgccgattgg 360 tggaagtaag gtggtacgat cgtgccttat taggaaggca acagacaggt ctgacatgga 420 ttggacgaac cactgaattc cgcattgcag agataattgt atttaagtgc ctagctcgat 480 acaataaacg ccatt 495 <210> 54 <211> 5446 <212> DNA <213> Artficial sequence <220> <221> Kanamycin resistance gene flanked by Tn903 sequences <222> (1)..(896) <220> <221> Sal I cloning site <222> (897)..(902) <220> <221> CMV promoter <222> (903)..(1587) <220> <221> CMV exon 1/2 fusion <222> (1588)..(1718) <220> <221> Bam H1/Bgl2 fusion <222> (1719)..(1724) <220> <221> Rat Insulin intron A <222> (1725)..(1857) <220> <221> Bam H1 cloning site <222> (1858)..(1863) <220> <221> pre S2 region of HBsAgNon-coding <222> (1864)..(1984) <220> <221> CDS <222> (1985)..(3691) <220> <221> G nucleotide from H3 Panama 3" UTR <222> (3692)..(3692) <220> <221> Bsp1201 cloning site <222> (3693)..(3698) <220> <221> HBV enhancer <222> (3699)..(4231) <220> <221> Rabbit beta globin polyadenylation region <222> (4243)..(4373) <220> <221> Eco RI cloning site <222> (4374)..(4379) <220> <221> PUC 19 vector backbone sequences <222> (4380)..(5446) <400> 54 ggcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg 60 agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa 120 agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc 180 tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg 240 tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat 300 ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca 360 tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga 420 aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcaaatgcaa ccggcgcagg 480 aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg 540 aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata 600 aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca 660 tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg 720 ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat 780 ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt 840 tcccgttgaa tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacaggtcg 900 acaatattgg ctattggcca ttgcatacgt tgtatctata tcataatatg tacatttata 960 ttggctcatg tccaatatga ccgccatgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt 1020 aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta 1080 cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga 1140 cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt 1200 tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta 1260 ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg 1320 actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt 1380 tttggcagta caccaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc 1440 accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat 1500 gtcgtaataa ccccgccccg ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct 1560 atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt 1620 ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctccg cggccgggaa cggtgcattg 1680 gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgact caccgtccgg atctcagcaa gcaggtatgt 1740 actctccagg gtgggcctgg cttccccagt caagactcca gggatttgag ggacgctgtg 1800 ggctcttctc ttacatgtac cttttgcttg cctcaaccct gactatcttc caggtcagga 1860 tcccagagtc aggggtctgt attttcctgc tggtggctcc agttcaggaa cagtaaaccc 1920 tgctccgaat attgcctctc acatctcgtc aatctccgcg aggactgggg accctgtgac 1980 gaac atg gct agc aag act atc att gct ttg agc tac att tta tgt ctg 2029 Met Ala Ser Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu 1 5 10 15 gtt ttc gct caa aaa ctt ccc gga aat gac aac agc acg gca acg ctg 2077 Val Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu 20 25 30 tgc ctg ggg cac cat gca gtg tca aac gga acg cta gtg aaa aca atc 2125 Cys Leu Gly His His Ala Val Ser Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile 35 40 45 acg aat gac caa att gaa gtg act aat gct act gag ctg gtt cag agt 2173 Thr Asn Asp Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser 50 55 60 tcc tca aca ggt aga ata tgc gac agt cct cac caa atc ctt gat gga 2221 Ser Ser Thr Gly Arg Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly 65 70 75 gaa aac tgc aca cta ata gat gct cta ttg gga gac cct cat tgt gat 2269 Glu Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His Cys Asp 80 85 90 95 ggc ttc caa aat aag gaa tgg gac ctt ttt gtt gaa cgc agc aaa 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ggg aga gtc aca gtc tct 2653 Asp Gln Ile Ser Leu Tyr Ala Gln Ala Ser Gly Arg Val Thr Val Ser 210 215 220 acc aaa aga agc caa caa act gta atc ccg aat atc gga tct aga ccc 2701 Thr Lys Arg Ser Gln Gln Thr Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro 225 230 235 tgg gta agg ggt gtc tcc agc aga ata agc atc tat tgg aca ata gta 2749 Trp Val Arg Gly Val Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val 240 245 250 255 aaa ccg gga gac ata ctt ttg att aac agc aca ggg aat cta att gct 2797 Lys Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala 260 265 270 cct cgg ggt tac ttc aaa ata cga agt ggg aaa agc tca ata atg agg 2845 Pro Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg 275 280 285 tca gat gca ccc att ggc aaa tgc aat tct gaa tgc atc act cca aat 2893 Ser Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn 290 295 300 gga agc att ccc aat gac aaa cca ttt caa aat gta aac agg atc aca 2941 Gly Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr 305 310 315 tat ggg gcc tgt ccc aga tat gtt aag caa aac act ctg aaa ttg gca 2989 Tyr Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala 320 325 330 335 aca ggg atg cgg aat gta cca gag aaa caa act aga ggc ata ttc ggc 3037 Thr Gly Met Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly 340 345 350 gca atc gcg ggt ttc ata gaa aat ggt tgg gag gga atg gtg gac ggt 3085 Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly 355 360 365 tgg tac ggt ttc agg cat caa aat tct gag ggc aca gga caa gca gca 3133 Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Thr Gly Gln Ala Ala 370 375 380 gat ctt aaa agc act caa gca gca atc aac caa atc aac ggg aaa ctg 3181 Asp Leu Lys Ser Thr Gln Ala Ala Ile Asn Gln Ile Asn Gly Lys Leu 385 390 395 aat agg tta atc gag aaa acg aac gag aaa ttc cat caa att gaa aaa 3229 Asn Arg Leu Ile Glu Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Lys 400 405 410 415 gaa ttc tca gaa gta gaa ggg aga att cag gac ctc gag aaa tat gtt 3277 Glu Phe Ser Glu Val Glu Gly Arg Ile Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val 420 425 430 gag gac act aaa ata gat ctc tgg tcg tac aac gcg gag ctt ctt gtt 3325 Glu Asp Thr Lys Ile Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val 435 440 445 gcc ctg gag aac caa cat aca att gat cta act gac tca gaa atg aac 3373 Ala Leu Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn 450 455 460 aaa ctg ttt gaa aga aca aag aag caa ctg agg gaa aat gct gag gat 3421 Lys Leu Phe Glu Arg Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp 465 470 475 atg ggc aat ggt tgt ttc aaa ata tac cac aaa tgt gac aat gcc tgc 3469 Met Gly Asn Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys 480 485 490 495 ata ggg tca atc aga aat gga act tat gac cat gat gta tac aga gac 3517 Ile Gly Ser Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp 500 505 510 gaa gca tta aac aac cgg ttc cag atc aaa ggt gtt gag ctg aag tca 3565 Glu Ala Leu Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser 515 520 525 gga tac aaa gat tgg atc cta tgg att tcc ttt gcc ata tca tgc ttt 3613 Gly Tyr Lys Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe 530 535 540 ttg ctt tgt gtt gtt ttg ctg ggg ttc atc atg tgg gcc tgc caa aaa 3661 Leu Leu Cys Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys 545 550 555 ggc aac att agg tgc aac att tgc att tga ggggccctaa caaaacaaaa 3711 Gly Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile 560 565 agatggggtt attccctaaa cttcatgggt tacgtaattg gaagttgggg gacattgcca 3771 caagatcata ttgtacaaaa gatcaaacac tgttttagaa aacttcctgt aaacaggcct 3831 attgattgga aagtatgtca aaggattgtg ggtcttttgg gctttgctgc tccatttaca 3891 caatgtggat atcctgcctt aatgcctttg tatgcatgta tacaagctaa acaggctttc 3951 actttctcgc caacttacaa ggcctttcta agtaaacagt acatgaacct ttaccccgtt 4011 gctcggcaac ggcctggtct gtgccaagtg tttgctgacg caacccccac tggctggggc 4071 ttggccatag gccatcagcg catgcgtgga acctttgtgg ctcctctgcc gatccatact 4131 gcggaactcc tagccgcttg ttttgctcgc agccggtctg gagcaaagct cataggaact 4191 gacaattctg tcgtcctctc gcggaaatat acatcgtttc gatctacgta tgatcttttt 4251 ccctctgcca aaaattatgg ggacatcatg aagccccttg agcatctgac ttctggctaa 4311 taaaggaaat ttattttcat tgcaatagtg tgttggaatt ttttgtgtct ctcactcgga 4371 aggaattctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg 4431 ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt 4491 atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa 4551 gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc 4611 gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 4671 gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 4731 gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 4791 aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 4851 ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 4911 taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 4971 tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg 5031 gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt 5091 taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg 5151 tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc 5211 tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt 5271 ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt 5331 taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag 5391 tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactc 5446 <210> 55 <211> 568 <212> PRT <213> Artficial sequence <400> 55 Met Ala Ser Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val 1 5 10 15 Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys 20 25 30 Leu Gly His His Ala Val Ser Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Thr 35 40 45 Asn Asp Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser 50 55 60 Ser Thr Gly Arg Ile Cys Asp Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Glu 65 70 75 80 Asn Cys Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Gly 85 90 95 Phe Gln Asn Lys Glu Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr 100 105 110 Ser Asn Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser 115 120 125 Leu Val Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe Asn 130 135 140 Trp Thr Gly Val Ala Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Lys Arg Arg 145 150 155 160 Ser Asn Lys Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu His Gln Leu Lys 165 170 175 Tyr Lys Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Lys Phe 180 185 190 Asp Lys Leu Tyr Ile Trp Gly Val Leu His Pro Ser Thr Asp Ser Asp 195 200 205 Gln Ile Ser Leu Tyr Ala Gln Ala Ser Gly Arg Val Thr Val Ser Thr 210 215 220 Lys Arg Ser Gln Gln Thr Val Ile Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Trp 225 230 235 240 Val Arg Gly Val Ser Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys 245 250 255 Pro Gly Asp Ile Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Ile Ala Pro 260 265 270 Arg Gly Tyr Phe Lys Ile Arg Ser Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser 275 280 285 Asp Ala Pro Ile Gly Lys Cys Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly 290 295 300 Ser Ile Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr 305 310 315 320 Gly Ala Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr 325 330 335 Gly 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Val Val Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly 545 550 555 560 Asn Ile Arg Cys Asn Ile Cys Ile 565 <210> 56 <211> 63 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> N terminal peptide of H3 Panama HA influenza antigen <400> 56 Met Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val Phe Ala 1 5 10 15 Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly 20 25 30 His His Ala Val Ser Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp 35 40 45 Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser 50 55 60 <210> 57 <211> 65 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> N terminal sequence of H3 Panama HA antigen encoded by pPJV1671 <400> 57 Met Ala Ser Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val 1 5 10 15 Phe Ala Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys 20 25 30 Leu Gly His His Ala Val Ser Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Thr 35 40 45 Asn Asp Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser 50 55 60 Ser 65 <210> 58 <211> 62 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Consensus of natural and pPJV1671 N terminal H3 Panama HA antigens <400> 58 Lys Thr Ile Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val Phe Ala Gln 1 5 10 15 Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly His 20 25 30 His Ala Val Ser Asn Gly Thr Leu Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp Gln 35 40 45 Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser 50 55 60 <210> 59 <211> 5453 <212> DNA <213> Artficial sequence <220> <221> Kanamycin resistance gene flanked by Tn903 sequences <222> (1)..(896) <220> <221> Sal I cloning site <222> (897)..(902) <220> <221> CMV promoter <222> (903)..(1587) <220> <221> CMV exon 1/2 fusion <222> (1588)..(1718) <220> <221> Bam H1/Bgl2 fusion <222> (1719)..(1724) <220> <221> Rat Insulin intron A <222> (1725)..(1857) <220> <221> Bam H1 cloning site <222> (1858)..(1863) <220> <221> pre S2 region of HBsAgNon-coding <222> (1864)..(1984) <220> <221> CDS <222> (1985)..(3697) <220> <221> Bsp1201 cloning site <222> (3700)..(3705) <220> <221> HBV enhancer <222> (3706)..(4238) <220> <221> Rabbit beta globin polyadenylation region <222> (4250)..(4380) <220> <221> Eco RI cloning site <222> (4381)..(4386) <220> <221> PUC 19 vector backbone sequences <222> (4387)..(5453) <400> 59 ggcgtaatgc tctgccagtg ttacaaccaa ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg 60 agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata tcaggattat caataccata tttttgaaaa 120 agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc 180 tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca acatcaatac aacctattaa tttcccctcg 240 tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat 300 ggcaaaagct tatgcatttc tttccagact tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca 360 tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga 420 aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg 480 aacactgcca gcgcatcaac aatattttca cctgaatcag gatattcttc taatacctgg 540 aatgctgttt tcccggggat cgcagtggtg agtaaccatg catcatcagg agtacggata 600 aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca 660 tctgtaacat cattggcaac gctacctttg ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg 720 ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat 780 ttatacccat ataaatcagc atccatgttg gaatttaatc gcggcctcga gcaagacgtt 840 tcccgttgaa tatggctcat aacacccctt gtattactgt ttatgtaagc agacaggtcg 900 acaatattgg ctattggcca ttgcatacgt tgtatctata tcataatatg tacatttata 960 ttggctcatg tccaatatga ccgccatgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt 1020 aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta 1080 cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga 1140 cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt 1200 tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt ccgcccccta 1260 ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttacggg 1320 actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt 1380 tttggcagta caccaatggg cgtggatagc ggtttgactc acggggattt ccaagtctcc 1440 accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa tcaacgggac tttccaaaat 1500 gtcgtaataa ccccgccccg ttgacgcaaa tgggcggtag gcgtgtacgg tgggaggtct 1560 atataagcag agctcgttta gtgaaccgtc agatcgcctg gagacgccat ccacgctgtt 1620 ttgacctcca tagaagacac cgggaccgat ccagcctccg cggccgggaa cggtgcattg 1680 gaacgcggat tccccgtgcc aagagtgact caccgtccgg atctcagcaa gcaggtatgt 1740 actctccagg gtgggcctgg cttccccagt caagactcca gggatttgag ggacgctgtg 1800 ggctcttctc ttacatgtac cttttgcttg cctcaaccct gactatcttc caggtcagga 1860 tcccagagtc aggggtctgt attttcctgc tggtggctcc agttcaggaa cagtaaaccc 1920 tgctccgaat attgcctctc acatctcgtc aatctccgcg aggactgggg accctgtgac 1980 gaac atg gct agc gag aaa ata gtg ctt ctt ttt gca ata gtc agt ctt 2029 Met Ala Ser Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val Ser Leu 1 5 10 15 gtt aaa agt gat cag att tgc att ggt tac cat gca aac aac tcg aca 2077 Val Lys Ser Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr 20 25 30 gag cag gtt gac aca ata atg gaa aag aac gtt act gtt aca cat gcc 2125 Glu Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala 35 40 45 caa gac ata ctg gaa aag aca cac aat ggg aag ctc tgc gat cta gat 2173 Gln Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp 50 55 60 gga gtg aag cct cta att ttg aga gat tgt agt gta gct gga tgg ctc 2221 Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu 65 70 75 ctc gga aac cca atg tgt gac gaa ttc atc aat gtg ccg gaa tgg tct 2269 Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser 80 85 90 95 tac ata gtg gag aag gcc aat cca gtc aat gac ctc tgt tac cca ggg 2317 Tyr Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly 100 105 110 gat ttc aat gac tat gaa gaa ttg aaa cac cta ttg agc aga ata aac 2365 Asp Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn 115 120 125 cat ttt gag aaa att cag atc atc ccc aaa agt tct tgg tcc agt cat 2413 His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Ser Ser His 130 135 140 gaa gcc tca ttg ggg gtg agc tca gca tgt cca tac cag gga aag tcc 2461 Glu Ala Ser Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Lys Ser 145 150 155 tcc ttt ttc aga aat gtg gta tgg ctt atc aaa aag aac agt aca tac 2509 Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Ser Thr Tyr 160 165 170 175 cca aca ata aag agg agc tac aat aat acc aac caa gaa gat ctt ttg 2557 Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu 180 185 190 gta ctg tgg ggg att cac cat cct aat gat gcg gca gag cag aca aag 2605 Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys 195 200 205 ctc tat caa aac cca acc acc tat att tcc gtt ggg aca tca aca cta 2653 Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu 210 215 220 aac cag aga ttg gta cca aga ata gct act aga tcc aaa gta aac ggg 2701 Asn Gln Arg Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly 225 230 235 caa agt gga agg atg gag ttc ttc tgg aca att tta aaa ccg aat gat 2749 Gln Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp 240 245 250 255 gca atc aac ttc gag agt aat gga aat ttc att gct cca gaa tat gca 2797 Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala 260 265 270 tac aaa att gtc aag aaa ggg gac tca aca att atg aaa agt gaa ttg 2845 Tyr Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Leu 275 280 285 gaa tat ggt aac tgc aac acc aag tgt caa act cca atg ggg gcg ata 2893 Glu Tyr Gly Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Met Gly Ala Ile 290 295 300 aac tct agc atg cca ttc cac aat ata cac cct ctc acc atc ggg gaa 2941 Asn Ser Ser Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu 305 310 315 tgc ccc aaa tat gtg aaa tca aac aga tta gtc ctt gcg act ggg ctc 2989 Cys Pro Lys Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu 320 325 330 335 aga aat agc cct caa aga gag aga aga aga aaa aag aga gga tta ttt 3037 Arg Asn Ser Pro Gln Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe 340 345 350 gga gct ata gca ggt ttt ata gag gga gga tgg cag gga atg gta gat 3085 Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp 355 360 365 ggt tgg tat ggg tac cac cat agc aac gag cag ggg agt ggg tac gct 3133 Gly Trp Tyr Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala 370 375 380 gca gac aaa gaa tcc act caa aag gca ata gat gga gtc acc aat aag 3181 Ala Asp Lys Glu Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys 385 390 395 gtc aac tcg att att gac aaa atg aac act cag ttt gag gcc gtt gga 3229 Val Asn Ser Ile Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly 400 405 410 415 agg gaa ttt aac aac tta gaa agg aga ata gag aat tta aac aag aag 3277 Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys 420 425 430 atg gaa gac ggg ttc cta gat gtc tgg act tat aat gct gaa ctt cta 3325 Met Glu Asp Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu 435 440 445 gtt ctc atg gaa aac gag aga act cta gac ttt cat gac tca aat gtc 3373 Val Leu Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val 450 455 460 aag aac ctt tac gac aag gtc cga cta cag ctt agg gat aat gca aag 3421 Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys 465 470 475 gag ctg ggt aac ggt tgt ttc gag ttc tat cat aaa tgt gat aat gaa 3469 Glu Leu Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu 480 485 490 495 tgt atg gaa agt gta aga aac gga acg tat gac tac ccg cag tat tca 3517 Cys Met Glu Ser Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser 500 505 510 gaa gaa gca aga cta aaa aga gag gaa ata agt gga gta aaa ttg gaa 3565 Glu Glu Ala Arg Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu 515 520 525 tca ata gga att tac caa ata ttg tca att tat tct aca gtg gcg agc 3613 Ser Ile Gly Ile Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser 530 535 540 tcc cta gca ctg gca atc atg gta gct ggt cta tcc tta tgg atg tgc 3661 Ser Leu Ala Leu Ala Ile Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys 545 550 555 tcc aat ggg tcg tta caa tgc aga att tgc att taa atgggcccta 3707 Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile 560 565 570 acaaaacaaa aagatggggt tattccctaa acttcatggg ttacgtaatt ggaagttggg 3767 ggacattgcc acaagatcat attgtacaaa agatcaaaca ctgttttaga aaacttcctg 3827 taaacaggcc tattgattgg aaagtatgtc aaaggattgt gggtcttttg ggctttgctg 3887 ctccatttac acaatgtgga tatcctgcct taatgccttt gtatgcatgt atacaagcta 3947 aacaggcttt cactttctcg ccaacttaca aggcctttct aagtaaacag tacatgaacc 4007 tttaccccgt tgctcggcaa cggcctggtc tgtgccaagt gtttgctgac gcaaccccca 4067 ctggctgggg cttggccata ggccatcagc gcatgcgtgg aacctttgtg gctcctctgc 4127 cgatccatac tgcggaactc ctagccgctt gttttgctcg cagccggtct ggagcaaagc 4187 tcataggaac tgacaattct gtcgtcctct cgcggaaata tacatcgttt cgatctacgt 4247 atgatctttt tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt gagcatctga 4307 cttctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgtgtc 4367 tctcactcgg aaggaattct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg 4427 cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 4487 cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 4547 aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 4607 gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 4667 tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 4727 agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 4787 ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 4847 taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 4907 gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 4967 gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 5027 ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg 5087 ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 5147 gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 5207 caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 5267 taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 5327 aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 5387 tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 5447 tgactc 5453 <210> 60 <211> 570 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 60 Met Ala Ser Glu Lys Ile Val Leu Leu Phe Ala Ile Val 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acttcctgta aacaggccta ttgattggaa agtatgtcaa aggattgtgg gtcttttggg 4680 ctttgctgct ccatttacac aatgtggata tcctgcctta atgcctttgt atgcatgtat 4740 acaagctaaa caggctttca ctttctcgcc aacttacaag gcctttctaa gtaaacagta 4800 catgaacctt taccccgttg ctcggcaacg gcctggtctg tgccaagtgt ttgctgacgc 4860 aacccccact ggctggggct tggccatagg ccatcagcgc atgcgtggaa cctttgtggc 4920 tcctctgccg atccatactg cggaactcct agccgcttgt tttgctcgca gccggtctgg 4980 agcaaagctc ataggaactg acaattctgt cgtcctctcg cggaaatata catcgtttcg 5040 atctacgtat gatctttttc cctctgccaa aaattatggg gacatcatga agccccttga 5100 gcatctgact tctggctaat aaaggaaatt tattttcatt gcaatagtgt gttggaattt 5160 tttgtgtctc tcactcggaa ggaattctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag 5220 gcggtttgcg tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 5280 ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 5340 caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 5400 aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 5460 atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 5520 cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 5580 ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 5640 gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 5700 accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 5760 cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 5820 cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct 5880 gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 5940 aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 6000 aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 6060 actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 6120 taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 6180 gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 6240 tagttgcctg actc 6254 <210> 63 <211> 18 <212> DNA <213> Artficial sequence <400> 63 gccactctct tccgacac 18 <210> 64 <211> 19 <212> DNA <213> Artficial sequence <400> 64 caagaacatc acacggaac 19 <210> 65 <211> 512 <212> PRT <213> Herpes Simplex Virus 2 <400> 65 Met Ala Thr Asp Ile Asp Met Leu Ile Asp Leu Gly Leu Asp Leu Ser 1 5 10 15 Asp Ser Glu Leu Glu Glu Asp Ala Leu Glu Arg Asp Glu Glu Gly Arg 20 25 30 Arg Asp Asp Pro Glu Ser Asp Ser Ser Gly Glu Cys Ser Ser Ser Asp 35 40 45 Glu Asp Met Glu Asp Pro Cys Gly Asp Gly Gly Ala Glu Ala Ile Asp 50 55 60 Ala Ala Ile Pro Lys Gly Pro Pro Ala Arg Pro Glu Asp Ala Gly Thr 65 70 75 80 Pro Glu Ala Ser Thr Pro Arg Pro Ala Ala Arg Arg Gly Ala Asp Asp 85 90 95 Pro Pro Pro Ala Thr Thr Gly Val Trp Ser Arg Leu Gly Thr Arg Arg 100 105 110 Ser Ala Ser Pro Arg Glu Pro His Gly Gly Lys Val Ala Arg Ile Gln 115 120 125 Pro Pro Ser Thr Lys Ala Pro His Pro Arg Gly Gly Arg Arg Gly Arg 130 135 140 Arg Arg Gly Arg Gly Arg Tyr Gly Pro Gly Gly Ala Asp Ser Thr Pro 145 150 155 160 Asn Pro Arg Arg Arg Val Ser Arg Asn Ala His Asn Gln Gly Gly Arg 165 170 175 His Pro Ala Ser Ala Arg Thr Asp Gly Pro Gly Ala Thr His Gly Glu 180 185 190 Ala Arg Arg Gly Gly Glu Gln Leu Asp Val Ser Gly Gly Pro Arg Pro 195 200 205 Arg Gly Thr Arg Gln Ala Pro Pro Pro Leu Met Ala Leu Ser Leu Thr 210 215 220 Pro Pro His Ala Asp Gly Arg Ala Pro Val Pro Glu Arg Lys Ala Pro 225 230 235 240 Ser Ala Asp Thr Ile Asp Pro Ala Val Arg Ala Val Leu Arg Ser Ile 245 250 255 Ser Glu Arg Ala Ala Val Glu Arg Ile Ser Glu Ser Phe Gly Arg Ser 260 265 270 Ala Leu Val Met Gln Asp Pro Phe Gly Gly Met Pro Phe Pro Ala Ala 275 280 285 Asn Ser Pro Trp Ala Pro Val Leu Ala Thr Gln Ala Gly Gly Phe Asp 290 295 300 Ala Glu Thr Arg Arg Val Ser Trp Glu Thr Leu Val Ala His Gly Pro 305 310 315 320 Ser Leu Tyr Arg Thr Phe Ala Ala Asn Pro Arg Ala Ala Ser Thr Ala 325 330 335 Lys Ala Met Arg Asp Cys Val Leu Arg Gln Glu Asn Leu Ile Glu Ala 340 345 350 Leu Ala Ser Ala Asp Glu Thr Leu Ala Trp Cys Lys Met Cys Ile His 355 360 365 His Asn Leu Pro Leu Arg Pro Gln Asp Pro Ile Ile Gly Thr Ala Ala 370 375 380 Ala Val Leu Glu Asn Leu Ala Thr Arg Leu Arg Pro Phe Leu Gln Cys 385 390 395 400 Tyr Leu Lys Ala Arg Gly Leu Cys Gly Leu Asp Asp Leu Cys Ser Arg 405 410 415 Arg Arg Leu Ser Asp Ile Lys Asp Ile Ala Ser Phe Val Leu Val Ile 420 425 430 Leu Ala Arg Leu Ala Asn Arg Val Glu Arg Gly Val Ser Glu Ile Asp 435 440 445 Tyr Thr Thr Val Gly Val Gly Ala Gly Glu Thr Met His Phe Tyr Ile 450 455 460 Pro Gly Ala Cys Met Ala Gly Leu Ile Glu Ile Leu Asp Thr His Arg 465 470 475 480 Gln Glu Cys Ser Ser Arg Val Cys Glu Leu Thr Ala Ser His Thr Ile 485 490 495 Ala Pro Leu Tyr Val His Gly Lys Tyr Phe Tyr Cys Asn Ser Leu Phe 500 505 510 <210> 66 <211> 18 <212> PRT <213> Herpes Simplex Virus 2 <400> 66 Arg Val Ser Trp Glu Thr Leu Val Ala His Gly Pro Ser Leu Tyr Arg 1 5 10 15 Thr Phe <210> 67 <211> 18 <212> PRT <213> Herpes Simplex Virus 2 <400> 67 Val Ala His Gly Pro Ser Leu Tyr Arg Thr Phe Ala Ala Asn Pro Arg 1 5 10 15 Ala Ala <210> 68 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <400> 68 His Gly Pro Ser Leu Tyr Arg Thr Phe 1 5 <210> 69 <211> 11 <212> PRT <213> Herpes Simplex Virus 2 <400> 69 Leu Tyr Arg Thr Phe Ala Ala Asn Pro Arg Ala 1 5 10 <210> 70 <211> 11 <212> PRT <213> Herpes Simplex Virus 1 <400> 70 Leu Tyr Arg Thr Phe Ala Gly Asn Pro Arg Ala 1 5 10 1

Claims (114)

  1. (i) (a) hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열;
    (b) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 엑손 1 및 적어도 일부의 엑손 2; 및
    (c) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 인트론 A 영역 대신에 제공된 이종성 인트론을 포함하는 키메릭 프로모터 서열;
    (ii) 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 항원, 그의 면역원성 단편, 또는 상기 항원 또는 단편과 80％ 이상의 아미노산 상동성을 갖는 상기 항원 또는 단편의 면역원성 변이체를 코딩하는, 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결된 코딩 서열;
    (iii) HBVpreS2 항원 서열, HBV e-항원 서열 또는 HSV 타입 2gD 항원 서열로부터 유도되고 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결된 비-번역 리더 서열; 및
    (iv) HBsAg 서열 또는 원숭이 CMV 즉시형 초기 유전자 서열의 3' 비-번역 영역 (UTR)으로부터 유도되고, 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결되며, 코딩 서열의 하류에 있는 인핸서 서열
    을 포함하는, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 대상체에 전달하기에 적합한 핵산 구조물.
  2. 제1항에 있어서, 코딩 서열이 1개 초과의 상기 HA, 단편 또는 면역원성 변이 체를 코딩하는 것인 핵산 구조물.
  3. 제2항에 있어서, 코딩 서열이 3 내지 5개의 상이한 인플루엔자 균주 각각의 상기 HA, 단편 또는 변이체를 코딩하는 것인 핵산 구조물.
  4. 제3항에 있어서, 코딩 서열이 3 또는 4개의 비-범유행성 인플루엔자 균주 각각의 상기 HA, 단편 또는 변이체를 코딩하는 것인 핵산 구조물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩 서열이 범유행성 인플루엔자 균주의 상기 HA, 단편 또는 변이체를 코딩하는 것인 핵산 구조물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 정의된 핵산 구조물로 코팅된 캐리어 입자.
  7. 구조물이 각각 상이한 인플루엔자 균주의 상기 HA, 단편 또는 변이체를 코딩하는 것인, 제1항에 정의된 2개 이상의 상이한 핵산 구조물로 코팅된 캐리어 입자.
  8. 제7항에 있어서, 3 내지 5개의 상이한 상기 구조물로 코팅된 캐리어 입자.
  9. 제8항에 있어서, 3 또는 4개의 상기 구조물이 상이한 비-범유행성 인플루엔 자 균주의 상기 HA, 단편 또는 변이체를 코딩하는 것인 캐리어 입자.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 범유행성 인플루엔자 균주의 상기 HA, 단편 또는 변이체를 코딩하는 상기 구조물로 코팅된 캐리어 입자.
  11. 제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 또한 프로모터 서열 및 프로모터와 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하는 핵산 구조물로 코팅되고, 상기 코딩 서열은 ADP 리보실화 박테리아 독소 하위단위, 아쥬반트 활성을 갖는 그의 단편 또는 아쥬반트 활성을 갖고 상기 하위단위 또는 단편과 80％ 이상의 아미노산 상동성을 갖는 이들의 변이체를 코딩하는 것인, 캐리어 입자.
  12. 제11항에 있어서, 프로모터 서열이
    (a) hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열;
    (b) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 엑손 1 및 적어도 일부의 엑손 2; 및
    (c) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 인트론 A 영역 대신에 제공된 이종성 인트론
    을 포함하는 키메릭 프로모터 서열인 캐리어 입자.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, ADP 리보실화 박테리아 독소 하위단위가 콜레라 독소 하위단위 A, 콜레라 독소 하위단위 B, 이. 콜라이(E. coli) 이열성 독소 하위단위 A 및 이. 콜라이 이열성 독소 하위단위 B로부터 선택된 것인 캐리어 입자.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 구조물이 각각 상이한 상기 하위단위, 단편 또는 변이체를 포함하는 2개의 코딩 서열을 포함하는 것인 캐리어 입자.
  15. 제14항에 있어서, 2개의 코딩 서열이 각각 콜레라 독소 하위단위 A 및 콜레라 독소 하위단위 B를 코딩하거나, 각각 이. 콜라이 이열성 독소 하위단위 A 및 이. 콜라이 이열성 독소 하위단위 B를 코딩하는 것인 캐리어 입자.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 구조물이
    (a) HBVpreS2 항원 서열, HBV e-항원 서열 또는 HSV 타입 2gD 항원 서열로부터 유도되고 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결된 비-번역 리더 서열; 및
    (b) HBsAg 서열 또는 원숭이 CMV 즉시형 초기 유전자 서열의 3' 비번역 영역 (UTR)으로부터 유도되고, 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결되며, 코딩 서열의 하류에 있는 인핸서 서열
    을 더 포함하는 것인 캐리어 입자.
  17. 제6항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 금 입자인 캐리어 입자.
  18. 제6항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 코팅된 입자를 포함하는 입자 매개형 전달 기구를 위한 투여 용기.
  19. 제6항 내지 제17항 중 어느 한 항에 정의된 코팅된 입자를 부하한 입자 매개형 전달 기구.
  20. 제19항에 있어서, 바늘 없는 주사기인 입자 매개형 전달 기구.
  21. (i) (a) hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열;
    (b) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 엑손 1 및 적어도 일부의 엑손 2; 및
    (c) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 인트론 A 영역 대신에 제공된 이종성 인트론을 포함하는 키메릭 프로모터 서열; 및
    (ii) 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 항원, 그의 면역원성 단편, 또는 상기 항원 또는 단편과 80％ 이상의 아미노산 상동성을 갖는 상기 항원 또는 단편의 면역원성 변이체를 코딩하는, 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결된 코딩 서열
    을 포함하는, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA) 항원에 대한 면역 반응을 유도하기 위해 대상체에 전달하기에 적합한 핵산 구조물.
  22. 제21항에 있어서,
    (iii) HBVpreS2 항원 서열, HBV e-항원 서열 또는 HSV 타입 2gD 항원 서열로부터 유도되고 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결된 비-번역 리더 서열; 또는
    (iv) HBsAg 서열 또는 원숭이 CMV 즉시형 초기 유전자 서열의 3' 비번역 영역 (UTR)으로부터 유도되고, 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결되며, 코딩 서열의 하류에 있는 인핸서 서열
    을 더 포함하는 핵산 구조물.
  23. 제21항 또는 제22항에 있어서, 코딩 서열이 1개 초과의 상기 HA, 단편 또는 면역원성 변이체를 코딩하는 것인 핵산 구조물.
  24. 제23항에 있어서, 코딩 서열이 3 내지 5개의 상이한 인플루엔자 균주 각각의 상기 HA, 단편 또는 변이체를 코딩하는 것인 핵산 구조물.
  25. 제24항에 있어서, 코딩 서열이 3 또는 4개의 비-범유행성 인플루엔자 균주 각각의 상기 HA, 단편 또는 변이체를 코딩하는 것인 핵산 구조물.
  26. 제21항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩 서열이 범유행성 인플루엔자 균주의 상기 HA, 단편 또는 변이체를 코딩하는 것인 핵산 구조물.
  27. 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 정의된 핵산 구조물로 코팅된 캐리어 입자.
  28. 구조물이 각각 상이한 인플루엔자 균주의 상기 HA, 단편 또는 변이체를 코딩하는 것인, 제21항에 정의된 2개 이상의 상이한 핵산 구조물로 코팅된 캐리어 입자.
  29. 제28항에 있어서, 3 내지 5개의 상이한 상기 구조물로 코팅된 캐리어 입자.
  30. 제29항에 있어서, 3 또는 4개의 상기 구조물이 상이한 비-범유행성 인플루엔자 균주의 상기 HA, 단편 또는 변이체를 코딩하는 것인 캐리어 입자.
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 범유행성 인플루엔자 균주의 상기 HA, 단편 또는 변이체를 코딩하는 상기 구조물로 코팅된 캐리어 입자.
  32. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 또한 프로모터 서열 및 프로모터와 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하는 핵산 구조물로 코팅되고, 상기 코딩 서열은 ADP 리보실화 박테리아 독소 하위단위, 아쥬반트 활성을 갖는 그의 단편 또는 아쥬반트 활성을 갖고 상기 하위단위 또는 단편과 80％ 이상의 아미노산 상동 성을 갖는 이들의 변이체를 코딩하는 것인, 캐리어 입자.
  33. 제32항에 있어서, 프로모터 서열이
    (a) hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열;
    (b) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 엑손 1 및 적어도 일부의 엑손 2; 및
    (c) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 인트론 A 영역 대신에 제공된 이종성 인트론
    을 포함하는 키메릭 프로모터 서열인 캐리어 입자.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, ADP 리보실화 박테리아 독소 하위단위가 콜레라 독소 하위단위 A, 콜레라 독소 하위단위 B, 이. 콜라이 이열성 독소 하위단위 A 및 이. 콜라이 이열성 독소 하위단위 B로부터 선택된 것인 캐리어 입자.
  35. 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 구조물이 각각 상이한 상기 하위단위, 단편 또는 변이체를 포함하는 2개의 코딩 서열을 포함하는 것인 캐리어 입자.
  36. 제35항에 있어서, 2개의 코딩 서열이 각각 콜레라 독소 하위단위 A 및 콜레라 독소 하위단위 B를 코딩하거나, 각각 이. 콜라이 이열성 독소 하위단위 A 및 이. 콜라이 이열성 독소 하위단위 B를 코딩하는 것인 캐리어 입자.
  37. 제32항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 구조물이
    (a) HBVpreS2 항원 서열, HBV e-항원 서열 또는 HSV 타입 2gD 항원 서열로부터 유도되고 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결된 비-번역 리더 서열; 및/또는
    (b) HBsAg 서열 또는 원숭이 CMV 즉시형 초기 유전자 서열의 3' 비-번역 영역 (UTR)으로부터 유도되고, 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결되며, 코딩 서열의 하류에 있는 인핸서 서열
    을 더 포함하는 것인 캐리어 입자.
  38. 제27항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 금 입자인 캐리어 입자.
  39. 제27항 내지 제38항 중 어느 한 항에 정의된 코팅된 입자를 포함하는 입자 매개형 전달 기구를 위한 투여 용기.
  40. 제27항 내지 제38항 중 어느 한 항에 정의된 코팅된 입자를 부하한 입자 매개형 전달 기구.
  41. 제40항에 있어서, 바늘 없는 주사기인 입자 매개형 전달 기구.
  42. 키메릭 프로모터 서열 및 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결된 코딩 서열 을 포함하고, 상기 코딩 서열은 인플루엔자 바이러스 항원, 그의 면역원성 단편, 또는 상기 항원 또는 단편과 80％ 이상의 아미노산 상동성을 갖는 상기 항원 또는 단편의 면역원성 변이체를 코딩하는 것이고, 상기 키메릭 프로모터 서열은
    (a) hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열;
    (b) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 엑손 1 및 적어도 일부의 엑손 2; 및
    (c) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 인트론 A 영역 대신에 제공된 이종성 인트론
    을 포함하는 것인, 핵산 구조물.
  43. 제42항에 있어서, 코딩된 항원이 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA), 그의 면역원성 단편 또는 이들과 80％ 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 면역원성 변이체인 핵산 구조물.
  44. 제42항에 있어서, 코딩된 항원이 인플루엔자 뉴라미니다아제 (NA), M2, 이들의 면역원성 단편 또는 상기 NA, M2 또는 단편과 80％ 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 면역원성 변이체인 핵산 구조물.
  45. 제42항 내지 제44항에 있어서, 인플루엔자 항원, 면역원성 단편 또는 변이체가 범유행성 인플루엔자 균주로부터의 것인 핵산 구조물.
  46. 제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 초과의 인플루엔자 항원, 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 코딩하는 핵산 구조물.
  47. 제46항에 있어서, 범유행성 인플루엔자 항원, 그의 면역원성 단편, 또는 상기 항원 또는 단편의 면역원성 변이체, 및 1개 이상의 비-범유행성 인플루엔자 항원, 그의 면역원성 단편(들), 또는 상기 항원(들) 또는 단편(들)의 면역원성 변이체(들)를 코딩하는 핵산 구조물.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 코딩된 2개 이상의 상이한 항원, 단편 또는 변이체가 상이한 균주의 인플루엔자 바이러스로부터의 동일한 인플루엔자 폴리펩티드로부터의 것인 핵산 구조물.
  49. 키메릭 프로모터 서열 및 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하고, 상기 코딩 서열은 ADP 리보실화 박테리아 독소 하위단위, 아쥬반트 활성을 갖는 그의 단편 또는 아쥬반트 활성을 갖고 상기 하위단위 또는 단편과 80％ 이상의 아미노산 상동성을 갖는 이들의 변이체를 코딩하는 것이고, 상기 키메릭 프로모터 서열은
    (a) hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열;
    (b) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 엑손 1 및 적어도 일부의 엑손 2; 및
    (c) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 인트론 A 영역 대신에 제공된 이종성 인트론
    을 포함하는 것인, 핵산 구조물.
  50. 제49항에 있어서, ADP 리보실화 박테리아 독소 하위단위가 콜레라 독소 하위단위 A, 콜레라 독소 하위단위 B, 이. 콜라이 이열성 독소 하위단위 A 및 이. 콜라이 이열성 독소 하위단위 B로부터 선택된 것인 핵산 구조물.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 각각 상이한 상기 하위단위, 단편 또는 변이체를 포함하고 각각이 상기 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결된 2개의 코딩 서열을 포함하는 핵산 구조물.
  52. 제51항에 있어서, 2개의 코딩 서열이 각각 콜레라 독소 하위단위 A 및 콜레라 독소 하위단위 B를 코딩하거나, 각각 이. 콜라이 이열성 독소 하위단위 A 및 이. 콜라이 이열성 독소 하위단위 B를 코딩하는 것인 핵산 구조물.
  53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 2개의 코딩 서열이 반대 방향으로 배향된 것인 핵산 구조물.
  54. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 2개의 코딩 서열이 동일한 방향으로 배향된 것인 핵산 구조물.
  55. 제42항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열 (a)가
    (i) 서열 1, 서열 54의 뉴클레오티드 903-1587, 서열 61의 뉴클레오티드 1815-1935, 서열 61의 뉴클레오티드 1948-2632, 서열 62의 뉴클레오티드 1002-1686 및/또는 서열 62의 뉴클레오티드 2624-3308의 뉴클레오티드 서열;
    (ii) (i)의 서열 중 하나 이상과 80％ 이상의 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 (i)의 기능적 변이체; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 단편
    을 포함하는 것인 핵산 구조물.
  56. 제42항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 엑손 서열 (b)가
    (i) 서열 2, 서열 54의 뉴클레오티드 1588-1718, 서열 61의 뉴클레오티드 1684-1814, 서열 61의 뉴클레오티드 2633-2763, 서열 62의 뉴클레오티드 1687-1817 및/또는 서열 62의 뉴클레오티드 3309-3439의 뉴클레오티드 서열;
    (ii) (i)의 서열 중 하나 이상과 80％ 이상의 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 (i)의 기능적 변이체; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 단편
    을 포함하는 것인 핵산 구조물.
  57. 제42항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 인트론 (c)가 래트 인슐린 유전자 인트론 A 서열, 닭 케라틴 유전자 인트론 A 서열, 닭 심장 액틴 유전자 인트론 A 서열, 이들의 기능적 단편 또는 이들의 기능적 변이체로부터 선택된 서열을 포함하는 것인 핵산 구조물.
  58. 제57항에 있어서, 래트 인슐린 유전자 인트론 A 서열이
    (i) 서열 3, 서열 54의 뉴클레오티드 1725-1857, 서열 61의 뉴클레오티드 1545-1677, 서열 61의 뉴클레오티드 2770-2902, 서열 62의 뉴클레오티드 1824-1956 및/또는 서열 62의 뉴클레오티드 3446-3578의 뉴클레오티드 서열;
    (ii) (i)의 서열 중 하나 이상과 80％ 이상의 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 (i)의 기능적 변이체; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 단편
    을 포함하는 것인 핵산 구조물.
  59. 제42항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 키메릭 프로모터 서열이
    (i) 서열 4의 뉴클레오티드 서열 또는 서열 54의 뉴클레오티드 903-1857의 뉴클레오티드 서열;
    (ii) (i)과 80％ 이상의 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 (i)의 기능적 변이체; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 단편
    을 포함하는 것인 핵산 구조물.
  60. 제42항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) HBVpreS2 항원 서열, HBV e-항원 서열 또는 HSV 타입 2gD 항원 서열로부터 유도되고 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결된 비-번역 리더 서열; 및/또는
    (b) HBsAg 서열 또는 원숭이 CMV 즉시형 초기 유전자 서열의 3' 비-번역 영역 (UTR)으로부터 유도되고, 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결되며, 클로닝 부위의 하류에 있는 인핸서 서열
    을 더 포함하는 핵산 구조물.
  61. 제42항에 있어서,
    (i) 서열 14로서 제공된 벡터 pPJV7563의 서열, 또는
    (b) (i)의 서열과 60％ 이상의 서열 동일성을 갖는 서열
    을 포함하고, 상기 항원, 단편 또는 변이체를 코딩하는 서열이 상기 서열 (i) 또는 (ii)에 제공되어 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결된 것인, 핵산 구조물.
  62. 제61항에 있어서, 코딩 서열이 HA 항원, 그의 면역원성 변이체 또는 이들의 면역원성 단편을 코딩하는 것인 핵산 구조물.
  63. 제42항에 있어서, 서열 54로서 제공된 벡터 pPJV1671의 서열 또는 이와 60％ 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 핵산 구조물.
  64. 제42항에 있어서, 서열 59로서 제공된 벡터 pPML7789의 서열 또는 이와 60％ 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 핵산 구조물.
  65. 제49항에 있어서, 서열 61에 의해 제공된 벡터 pPJV2012의 서열 또는 이와 60％ 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 핵산 구조물.
  66. 제49항에 있어서, 서열 62에 의해 제공된 벡터 pPJV7788의 서열 또는 이와 60％ 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 핵산 구조물.
  67. 프로모터 서열 및 프로모터와 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하고, 상기 코딩 서열은 인플루엔자 바이러스 항원, 그의 면역원성 단편, 또는 상기 항원 또는 단편과 80％ 이상의 아미노산 상동성을 갖는 상기 항원 또는 단편의 면역원성 변이체를 코딩하는 것이고,
    (a) HBVpreS2 항원 서열, HBV e-항원 서열 또는 HSV 타입 2gD 항원 서열로부터 유도되고, 코딩 서열 및 코딩 서열에 대해 이종성인 프로모터와 작동가능하게 연결된 비-번역 리더 서열; 및/또는
    (b) 코딩 서열의 3'에 존재하고 이에 작동가능하게 연결된 인핸서 서열
    을 더 포함하고, 상기 인핸서 서열은 HBsAg 서열 또는 원숭이 CMV 즉시형 초기 유전자 서열의 3' UTR로부터 유도되고, 상기 코딩 서열은 3' 인핸서 서열에 대해 이종성인, 핵산 구조물.
  68. 제67항에 있어서, 코딩된 항원이 인플루엔자 헤마글루티닌 (HA), 그의 면역원성 단편 또는 이들과 80％ 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 면역원성 변이체인 핵산 구조물.
  69. 제67항에 있어서, 코딩된 항원이 인플루엔자 뉴라미니다아제 (NA) 또는 M2, 이들의 면역원성 단편 또는 상기 NA, M2 또는 단편과 80％ 이상의 아미노산 서열 상동성을 갖는 면역원성 변이체인 핵산 구조물.
  70. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 코딩된 인플루엔자 항원, 그의 면역원성 단편 또는 이들의 면역원성 변이체가 범유행성 인플루엔자 균주로부터의 것인 핵산 구조물.
  71. 제67항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 초과의 인플루엔자 항원, 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 코딩하는 핵산 구조물.
  72. 제71항에 있어서, 범유행성 인플루엔자 균주의 항원, 그의 면역원성 단편, 또는 상기 항원 또는 단편의 면역원성 변이체, 및 1개 이상의 비-범유행성 인플루엔자 균주의 항원(들), 그의 면역원성 단편(들), 또는 상기 항원(들) 또는 단편(들)의 면역원성 변이체(들)를 코딩하는 핵산 구조물.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, 2개 이상의 상이한 항원, 단편 또는 변이체가 상이한 균주의 인플루엔자 바이러스로부터의 동일한 인플루엔자 폴리펩티드로부터의 것인 핵산 구조물.
  74. 프로모터 서열 및 프로모터와 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하고, 상기 코딩 서열은 ADP 리보실화 박테리아 독소 하위단위, 아쥬반트 활성을 갖는 그의 단편 또는 아쥬반트 활성을 갖고 상기 하위단위 또는 단편과 80％ 이상의 아미노산 상동성을 갖는 이들의 변이체를 코딩하는 것이고,
    (a) HBVpreS2 항원 서열, HBV e-항원 서열 또는 HSV 타입 2gD 항원 서열로부터 유도되고, 코딩 서열 및 코딩 서열에 대해 이종성인 프로모터와 작동가능하게 연결된 비-번역 리더 서열; 및/또는
    (b) 코딩 서열의 3'에 존재하고 이에 작동가능하게 연결된 인핸서 서열
    을 더 포함하고, 상기 인핸서 서열은 HBsAg 서열 또는 원숭이 CMV 즉시형 초기 유전자 서열의 3' UTR로부터 유도되고, 상기 코딩 서열은 3' 인핸서 서열에 대해 이종성인, 핵산 구조물.
  75. 제74항에 있어서, ADP 리보실화 박테리아 독소 하위단위가 콜레라 독소 하위단위 A, 콜레라 독소 하위단위 B, 이. 콜라이 이열성 독소 하위단위 A 및 이. 콜라이 이열성 독소 하위단위 B로부터 선택된 것인 핵산 구조물.
  76. 제74항 또는 제75항에 있어서, 각각 상이한 상기 하위단위, 단편 또는 변이체를 포함하고, 각각이 상기 키메릭 프로모터와 연결된 2개의 코딩 서열을 포함하는 핵산 구조물.
  77. 제76항에 있어서, 2개의 코딩 서열이 각각 콜레라 독소 하위단위 A 및 콜레라 독소 하위단위 B를 코딩하거나, 각각 이. 콜라이 이열성 독소 하위단위 A 및 이. 콜라이 이열성 독소 하위단위 B를 코딩하는 것인 핵산 구조물.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 상기 2개의 코딩 서열이 반대 방향으로 배향된 것인 핵산 구조물.
  79. 제76항 또는 제77항에 있어서, 상기 2개의 코딩 서열이 동일한 방향으로 배향된 것인 핵산 구조물.
  80. 제67항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열, 슈도라비즈(Pseudorabies) 바이러스 프로모터 서열 또는 로우 즈(Rous) 육종 바이러스 프로모터 서열로부터 선택된 것인 핵산 구조물.
  81. 제67항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 비-번역 리더 서열이
    (i) 서열 5, 서열 6, 서열 7, 또는 서열 54의 뉴클레오티드 1864-1984의 뉴클레오티드 서열;
    (ii) (i)과 80％ 이상의 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 (i)의 기능적 변이체; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 단편
    을 포함하는 것인 핵산 구조물.
  82. 제67항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 인핸서 서열이
    (i) 서열 8, 서열 9, 서열 54의 뉴클레오티드 3699-4231, 서열 61의 뉴클레오티드 3831-4363 및/또는 서열 62의 뉴클레오티드 4507-5038의 뉴클레오티드 서열;
    (ii) 상기 서열 (i)과 80％ 이상의 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 (i)의 기능적 변이체; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 단편
    을 포함하는 것인 핵산 구조물.
  83. 제42항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리아데닐화 서열을 더 포함 하는 핵산 구조물.
  84. 제83항에 있어서, 폴리아데닐화 서열이 토끼 베타-글로빈 유전자, 인간 유두종 바이러스 (HPV) 초기 또는 말기 유전자, HSV-2gB 유전자, 원숭이 CMV 즉시형 초기 유전자 또는 HSV gD 말기 유전자로부터 선택된 유전자의 폴리아데닐화 서열인 핵산 구조물.
  85. 제83항에 있어서, 폴리아데닐화 서열이
    (i) 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 54의 뉴클레오티드 4243-4373, 서열 61의 뉴클레오티드 906-1038, 서열 61의 뉴클레오티드 4375-4050 또는 서열 62의 뉴클레오티드 2463-2593의 뉴클레오티드 서열;
    (ii) 상기 서열 (i)과 80％ 이상의 뉴클레오티드 서열 상동성을 갖는 (i)의 기능적 변이체; 또는
    (iii) (i) 또는 (ii)의 기능적 단편
    으로부터 선택된 것인 핵산 구조물.
  86. 제42항에 있어서, 서열 14의 서열을 포함하는 핵산 구조물.
  87. 제42항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 항원, 외독소 하위단위, 단편 또는 변이체를 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 시그널 펩티드를 코딩하는 뉴 클레오티드 서열을 더 포함하는 핵산 구조물.
  88. 제87항에 있어서, 시그널 펩티드가 인간 조직 플라스미노겐 활성자 시그널 펩티드 (hTPAsp), 아프로티닌 시그널 펩티드, 담배 엑스텐신 시그널 펩티드 및 닭 리소자임 시그널 펩티드로부터 선택된 것인 핵산 구조물.
  89. 제42항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 플라스미드인 핵산 구조물.
  90. 제42항 내지 제89항 중 어느 한 항에 따른 2개 이상의 상이한 구조물을 포함하는 핵산 구조물의 집합체.
  91. 상이한 인플루엔자 항원, 그의 면역원성 단편, 또는 상기 항원 또는 단편의 면역원성 변이체를 코딩하는, 제42항 내지 제48항, 제61항 내지 제64항 및 제67항 내지 제73항 중 어느 한 항에 따른 2개 이상의 상이한 구조물을 포함하는 핵산 구조물의 집합체.
  92. 제91항에 있어서, 각각 상이한 인플루엔자 항원, 면역원성 단편 또는 면역원성 변이체를 코딩하는 3개 이상의 상이한 구조물을 포함하는 핵산 구조물의 집합체.
  93. 제91항 또는 제92항에 있어서, 2개 이상의 상이한 항원이 상이한 인플루엔자 균주로부터의 동일한 인플루엔자 폴리펩티드로부터의 것인 핵산 구조물의 집합체.
  94. 제91항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 상이한 항원, 단편 또는 변이체가 동일하거나 상이한 인플루엔자 균주로부터의 상이한 인플루엔자 폴리펩티드로부터의 것인 핵산 구조물의 집합체.
  95. 제90항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 ADP 리보실화 박테리아 독소 하위단위, 그의 단편 또는 그의 변이체를 코딩하는 제49항 내지 제54항, 제65항, 제66항 및 제74항 내지 제79항 중 어느 한 항에 따른 1개 이상의 구조물을 포함하는 핵산 구조물의 집합체.
  96. (i) 1개 이상의 구조물이 ADP 리보실화 박테리아 독소 하위단위, 아쥬반트 활성을 갖는 그의 단편 또는 아쥬반트 활성을 갖고 상기 하위단위 또는 단편과 80％ 이상의 아미노산 상동성을 갖는 이들의 변이체를 코딩하는 것이고;
    (ii) 1개 이상의 구조물이 단순 포진 바이러스 (HSV) 항원을 코딩하는 것이고,
    상기 하위단위, 단편 또는 변이체 및/또는 HSV 항원을 코딩하는 서열은
    (a) hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열;
    (b) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 엑손 1 및 적어도 일부의 엑손 2; 및
    (c) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 인트론 A 영역 대신에 제공된 이종성 인트론
    을 포함하는 키메릭 프로모터에 작동가능하게 연결된 것인, 핵산 구조물의 집합체.
  97. (i) 1개 이상의 구조물이 ADP 리보실화 박테리아 독소 하위단위, 아쥬반트 활성을 갖는 그의 단편 또는 아쥬반트 활성을 갖고 상기 하위단위 또는 단편과 80％ 이상의 아미노산 상동성을 갖는 이들의 변이체를 코딩하는 것이고;
    (ii) 1개 이상의 구조물이 HSV 항원을 코딩하는 것이고,
    상기 구조물 중 하나 이상은
    (a) HBVpreS2 항원 서열, HBV e-항원 서열 또는 HSV 타입 2gD 항원 서열로부터 유도되고, 상기 구조물의 코딩 서열 및 코딩 서열에 대해 이종성인 프로모터와 작동가능하게 연결된 비-번역 리더 서열; 및/또는
    (b) 상기 구조물의 코딩 서열의 3'에 존재하고 이에 작동가능하게 연결된 인핸서를 더 포함하고, 상기 인핸서 서열은 HBsAg 서열 또는 원숭이 CMV 즉시형 초기 유전자 서열의 3' UTR로부터 유도되고, 상기 코딩 서열은 3' 인핸서 서열에 대해 이종성인, 핵산 구조물의 집합체.
  98. (i) 키메릭 프로모터 서열 및 키메릭 프로모터와 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하고, 상기 코딩 서열은 ADP 리보실화 박테리아 독소 하위단위, 아쥬반 트 활성을 갖는 그의 단편 또는 아쥬반트 활성을 갖고 상기 하위단위 또는 단편과 80％ 이상의 아미노산 상동성을 갖는 이들의 변이체를 코딩하는 것이고, 상기 키메릭 프로모터 서열은
    (a) hCMV 즉시형 초기 프로모터 서열;
    (b) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 엑손 1 및 적어도 일부의 엑손 2; 및
    (c) hCMV 주요 즉시형 초기 유전자의 인트론 A 영역 대신에 제공된 이종성 인트론
    을 포함하는 것인, 제1 핵산 구조물; 및
    (ii) 1개 이상의 HSV 항원을 코딩하는 제2 핵산 구조물
    을 포함하는 핵산 구조물의 집합체.
  99. (i) 프로모터 서열 및 프로모터와 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 포함하고, 상기 코딩 서열은 ADP 리보실화 박테리아 독소 하위단위, 아쥬반트 활성을 갖는 그의 단편 또는 아쥬반트 활성을 갖고 상기 하위단위 또는 단편과 80％ 이상의 아미노산 상동성을 갖는 이들의 변이체를 코딩하는 것이고,
    (a) HBVpreS2 항원 서열, HBV e-항원 서열 또는 HSV 타입 2gD 항원 서열로부터 유도되고, 코딩 서열 및 코딩 서열에 대해 이종성인 프로모터와 작동가능하게 연결된 비-번역 리더 서열; 및/또는
    (b) 코딩 서열의 3'에 존재하고 이에 작동가능하게 연결된 인핸서 서열
    을 더 포함하고, 상기 인핸서는 HBsAg 서열 또는 원숭이 CMV 즉시형 초기 유 전자 서열의 3' UTR로부터 유도되고, 상기 코딩 서열은 3' 인핸서 서열에 대해 이종성인, 제1 핵산 구조물; 및
    (ii) 1개 이상의 HSV 항원을 코딩하는 제2 핵산 구조물
    을 포함하는 핵산 구조물의 집합체.
  100. 제99항에 있어서,
    (i) 서열 61에 의해 제공된 벡터 pPJV2012의 서열 또는 이와 60％ 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 제1 핵산 구조물; 및
    (ii) HSV 항원을 코딩하는 제2 핵산 구조물
    을 포함하는 핵산 구조물의 집합체.
  101. 제42항 및 제55항 내지 제57항 중 어느 한 항에 정의된, 정제되고 단리된 키메릭 프로모터 서열.
  102. 제42항 내지 제89항 중 어느 한 항에 따른 핵산 구조물 또는 제90항 내지 제100항 중 어느 한 항에 따른 핵산 구조물의 집합체로 코팅된 캐리어 입자를 포함하는 코팅된 입자.
  103. 제102항에 있어서, 캐리어 입자가 금 입자인 코팅된 입자.
  104. 제102항 또는 제103항에 정의된 코팅된 입자를 포함하는 입자 매개형 전달 기구를 위한 투여 용기.
  105. 제102항 또는 제103항에 정의된 코팅된 입자를 부하한 입자 매개형 전달 기구.
  106. 제105항에 있어서, 바늘 없는 주사기인 입자 매개형 전달 기구.
  107. 제42항 내지 제89항 중 어느 한 항에 따른 핵산 구조물 또는 제90항 내지 제100항 중 어느 한 항에 따른 핵산 구조물의 집합체를, 제약상 허용되는 캐리어 또는 부형제와 함께 포함하는 제약 조성물.
  108. 제42항 내지 제89항 중 어느 한 항에 따른 핵산 구조물 또는 제90항 내지 제100항 중 어느 한 항에 따른 핵산 구조물의 집합체를 포함하는 백신 조성물.
  109. 제108항에 있어서, 상이한 인플루엔자 항원, 그의 면역원성 단편 또는 이들의 면역원성 변이체를 코딩하는, 제42항 내지 제48항, 제61항 내지 제64항 및 제67항 내지 제73항 중 어느 한 항에 따른 2개 이상의 상이한 구조물을 포함하는 다가 백신인 백신 조성물.
  110. 제109항에 있어서, 3가, 4가 또는 5가 인플루엔자 백신인 백신 조성물.
  111. 인플루엔자의 예방을 위한 의약의 제조에 있어서 제42항 내지 제89항 중 어느 한 항에 정의된 핵산 구조물, 제90항 내지 제95항 중 어느 한 항에 정의된 핵산 구조물의 집합체 또는 제102항 또는 제103항에 정의된 코팅된 입자의 용도.
  112. 제111항에 있어서, 의약이 주사, 경피 입자 전달, 흡입에 의해, 국소적으로, 경구로, 비강내로 또는 경점막으로 전달되는 것인 용도.
  113. 제111항 또는 제112항에 있어서, 의약이 바늘 없는 주사에 의해 전달되는 것인 용도.
  114. 제42항 내지 제89항 중 어느 한 항에 정의된 핵산 구조물, 제90항 내지 제95항 중 어느 한 항에 정의된 핵산 구조물의 집합체 또는 제102항 또는 제103항에 정의된 코팅된 입자를 포유동물 세포에 전달하는 것을 포함하는, 포유동물 세포에서 해당 인플루엔자 폴리펩티드의 시험관내 발현을 수득하는 방법.
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