PT1379273E - Adjuvantes à base de ácidos nucleicos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "ADJUVANTES À BASE DE ÁCIDOS NUCLEICOS"

CAMPO DA INVENÇÃO A invenção relaciona-se com os campos da biologia molecular e imunologia, e genericamente relaciona-se com técnicas de imunização com ácidos nucleicos. Mais especificamente, a invenção relaciona-se com polinucleótidos que codificam um adjuvante, e com estratégias de imunização que utilizam esses polinucleótidos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Foram descritas na arte técnicas para a injecção de ADN e ARNm em tecido de mamíferos para fins de imunização contra um produto de expressão. Demonstrou-se que as técnicas, aqui designadas "imunização com ácidos nucleicos", desencadeiam respostas imunes tanto humorais como mediadas por células. Por exemplo, demonstrou-se que soros de murganhos imunizados com uma construção de ADN que codifica a glicoproteína do envelope, gpl60, reagem com gpl60 recombinante em imunoensaios, e demonstrou-se que linfócitos dos murganhos injectados proliferam em resposta a gpl20 recombinante. Wang et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90: 4156-4160. Analogamente, murganhos imunizados com um gene da hormona do crescimento humana (hGH) demonstraram uma resposta imune baseada em anticorpos. Tang et al. (1992) Nature 356: 152-154. Demonstrou-se que a injecção intramuscular de ADN que codifica a nucleoproteína -2- da gripe activada por um promotor de mamífero desencadeia uma resposta de células T citotóxicas (CTL) CD8+ que pode proteger murganhos contra a estimulação letal subsequente com o vírus. Ulmer et al. (1993) Science 259: 1745-1749. Os estudos imuno-histoquímicos do sítio da injecção mostraram que o ADN foi absorvido pelos mieloblastos, e foi possível demonstrar a produção citoplasmática de proteína virai durante pelo menos 6 meses. A US 5980898 relaciona-se com imunização transcutânea.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um objectivo principal da invenção é proporcionar uma composição adjuvante à base de polinucleótidos tal como definida nas reivindicações anexas. A primeira e segunda sequências de ácidos nucleicos podem estar presentes na mesma ou em diferentes construções de ácidos nucleicos. As regiões de codificação da subunidade truncada podem ser obtidas ou derivadas da mesma exotoxina bacteriana de ADP-ribosilação e, em certas formas de realização preferidas, a exotoxina bacteriana de ADP-ribosilação é uma toxina da cólera (CT, do inglês "cholera toxin") ou uma enterotoxina termolábil de E. coli (LT, do inglês, "labile enterotoxin") . Além disso, pelo menos uma das regiões de codificação da subunidade truncada pode ser geneticamente modificada para destoxificar o péptido da subunidade por ela codificado, por exemplo em que a região de codificação da subunidade A truncada foi modificada geneticamente para afectar negativamente ou inactivar a actividade da ADP-ribosil transferase no produto de expressão constituído pelo péptido da subunidade. É também um objectivo principal da invenção proporcionar uma composição adjuvante à base de polinucleótidos contendo uma primeira e segunda sequências -3- de ácidos nucleicos, em que a primeira sequência de ácidos nucleicos é uma região de codificação da subunidade A modificada obtida ou derivada de uma exotoxina bacteriana de ADP-ribosilação, e a segunda sequência de ácidos nucleicos é uma região de codificação da subunidade B obtida ou derivada de uma exotoxina bacteriana de ADP-ribosilação. A região de codificação da subunidade A modificada e a referida região de codificação da subunidade B codificam cada uma delas uma subunidade peptidica matura, e a região de codificação da subunidade A modificada foi modificada geneticamente para resultar na deleção de um motivo KDEL ou RDEL C-terminal no péptido da subunidade por ela codificado.

Tal como acima, a primeira e segunda sequências de ácidos nucleicos podem estar presentes na mesma ou em diferentes construções de ácidos nucleicos. As regiões de codificação da subunidade truncada podem ser obtidas ou derivadas da mesma exotoxina bacteriana de ADP-ribosilação e, em certas formas de realização preferidas, a exotoxina bacteriana ribosilante de ADP é uma toxina da cólera (CT) ou uma enterotoxina termolábil de E. coli (LT). Além disso, pelo menos uma das regiões de codificação da subunidade truncada pode ser geneticamente modificada para destoxificar o péptido da subunidade por ela codificado, por exemplo em que a região de codificação da subunidade A truncada foi modificada geneticamente para alterar ou inactivar a actividade de ADP-ribosil transferase no produto de expressão do péptido da subunidade.

Em certos aspectos da invenção, as composições acima referidas podem ser proporcionadas em forma de partículas, por exemplo em que as composições são partículas adequadas para administração a partir de um dispositivo para administração de partículas. A este respeito, as presentes composições podem ser revestidas nas mesmas ou numa partícula transportadora diferente formando -4- um núcleo e por isso são adequadas para administração utilizando uma técnica de transfecção mediada por partículas. As partículas transportadoras que formam um núcleo preferidas vão ter um diâmetro médio de cerca de 0,1 a 10 pm, e podem compreender um metal tal como ouro. Consequentemente, é um objectivo adicional da invenção proporcionar um dispositivo de administração de partículas carregado com (por exemplo, contendo) uma composição em partículas tal como aqui definida. É também um objectivo principal da invenção proporcionar a utilização de uma composição contendo uma primeira e segunda sequência de ácidos nucleicos, em que cada sequência inclui uma região de codificação para uma subunidade de uma exotoxina bacteriana de ADP-ribosilação no fabrico de um medicamento para melhorar uma resposta imune num indivíduo vertebrado contra um antigénio de interesse no referido indivíduo. 0 antigénio de interesse e a composição são administrados ao indivíduo as subunidades da toxina codificadas por uma primeira e segunda sequências de ácidos nucleicos são expressas numa quantidade suficiente para desencadear uma resposta imune melhorada contra o antigénio. A primeira sequência de ácidos nucleicos contém uma região de codificação da subunidade A truncada obtida ou derivada de uma exotoxina bacteriana de ADP-ribosilação, e a segunda sequência de ácidos nucleicos contém uma região de codificação da subunidade B truncada obtida ou derivada de uma exotoxina bacteriana de ADP-ribosilação, contudo com a condição de que cada uma das regiões de codificação da subunidade truncada tem uma delecção 5' e codifica um péptido da subunidade que não tem péptido de sinal bacteriano amino terminal.

Um objectivo principal relacionado da invenção é proporcionar um método para melhorar uma resposta imune contra um antigénio de interesse num indivíduo. O método genericamente envolve: (a) administrar o antigénio de -5- interesse ao indivíduo; (b) proporcionar uma composição adjuvante compreendendo primeira e segunda sequências de ácidos nucleicos, em que a primeira sequência de ácidos nucleicos é uma região de codificação da subunidade A truncada obtida ou derivada de uma exotoxina bacteriana de ADP-ribosilação, e a segunda sequência de ácidos nucleicos é uma região de codificação da subunidade B truncada obtida ou derivada de uma exotoxina bacteriana de ADP-ribosilação; e (c) administrar a composição adjuvante ao indivíduo, com o que por introdução no indivíduo, a primeira e segunda sequências de ácidos nucleicos são expressas para proporcionar péptidos das subunidades numa quantidade suficiente para desencadear uma resposta imune melhorada contra o antigénio de interesse. As regiões de codificação da subunidade estão truncadas porque cada região de codificação tem uma deleção 5' e codifica um péptido da subunidade que não tem péptido de sinal bacteriano amino terminal.

Ainda outro objectivo principal da invenção é proporcionar a utilização de uma composição compreendendo uma primeira e segunda sequência de ácidos nucleicos, em que cada sequência inclui uma região de codificação para uma subunidade de uma exotoxina bacteriana de ADP-ribosilação no fabrico de um medicamento para melhorar uma resposta imune num indivíduo vertebrado contra um antigénio de interesse no referido indivíduo. 0 antigénio de interesse e a composição são administrados ao indivíduo de tal modo que as subunidades de toxina codificadas por uma primeira e segunda sequências de ácidos nucleicos são expressas numa quantidade suficiente para desencadear uma resposta imune melhorada contra o antigénio. A primeira sequência de ácidos nucleicos contém uma região de codificação da subunidade A modificada obtida ou derivada de uma exotoxina bacteriana de ADP-ribosilação, e a segunda sequência de ácidos nucleicos contém uma região de -6- codificação da subunidade B obtida ou derivada de uma exotoxina bacteriana de ADP-ribosilação, contudo com a condição de que a região de codificação da subunidade A modificada e a região de codificação da subunidade B codifica cada uma delas um péptido de subunidade matura, e com a condição adicional de que a região de codificação da subunidade A modificada foi modificada geneticamente para delecionar um motivo KDEL ou RDEL C-terminal no péptido da subunidade por ela codificada. É um objectivo principal relacionado da invenção proporcionar um método para melhorar uma resposta imune contra um antigénio de interesse num indivíduo, em que o método envolve: (a) administrar o antigénio de interesse ao indivíduo; (b) proporcionar uma composição adjuvante compreendendo uma primeira e segunda sequências de ácidos nucleicos, em que a primeira sequência de ácidos nucleicos é uma região de codificação da subunidade A modificada obtida ou derivada de uma exotoxina bacteriana de ADP-ribosilação, e a segunda sequência de ácidos nucleicos é uma região de codificação da subunidade B obtida ou derivada de uma exotoxina bacteriana de ADP-ribosilação; e (c) administrar a composição adjuvante ao indivíduo, com o que, por introdução no indivíduo, a primeira e segunda sequências de ácidos nucleicos são expressas para proporcionar péptidos das subunidades numa quantidade suficiente para desencadear uma resposta imune melhorada contra o antigénio de interesse. As subunidades regiões de codificação das subunidades estão modificadas na medida em que cada uma codifica um péptido de subunidade matura, mas a região de codificação da subunidade A foi modificada geneticamente para delecionar um motivo KDEL ou RDEL C-terminal no péptido da subunidade por ela codificada.

Nas utilizações e métodos da invenção, a administração das composições adjuvantes envolve a transfecção de células do indivíduo com uma composição -7- adjuvante de polinucleótido de acordo com a presente invenção. Cassetes e/ou vectores de expressão contendo as moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção podem ser utilizadas para transfectar as células, e a transfecção é realizada em condições que permitem a expressão dos péptidos das subunidades no seio do indivíduo. 0 método pode abranger ainda um ou mais passos de administração ao indivíduo de pelo menos uma composição secundária. 0 procedimento de transfecção realizado durante a imunização pode ser efectuado in vivo ou ex vivo (por exemplo, para obtenção de células transfectadas que são subsequentemente introduzidas no indivíduo antes da realização de um passo de imunização secundária). Quando se utilize a transfecção in vivo, as moléculas de ácidos nucleicos podem ser administradas ao indivíduo por meio de injecção intramuscular ou intradérmica de ADN do plasmídeo ou, de preferência, administradas ao indivíduo utilizando uma técnica de administração mediada por partículas. As composições de vacinas (contendo o antigénio de interesse) podem ser proporcionadas na forma de qualquer composição de vacina adequada, por exemplo, na forma de uma composição de subunidades de péptidos, na forma de uma composição de vacina de ácidos nucleicos ou na forma de uma composição de vacina de vírus da gripe completo ou fraccionado.

Em certos métodos, o antigénio de interesse e a composição adjuvante são administrados ao mesmo sítio no indivíduo. Por exemplo, a composição adjuvante e o antigénio de interesse podem ser administrados simultaneamente (por exemplo, proporcionados numa única composição de vacina). Em certas formas de realização preferidas, o adjuvante e, opcionalmente o antigénio de interesse, é administrado em forma de partículas, por exemplo em que a composição adjuvante foi revestida numa partícula transportadora que forma um núcleo e é administrada ao indivíduo utilizando uma técnica de administração mediada por partículas.

Nestes métodos, a administração das composições adjuvantes de polinucleótido da presente invenção de preferência resulta numa resposta imune celular aumentada contra o antigénio de interesse co-administrado. Essa resposta imune melhorada pode ser genericamente caracterizada por títulos aumentados de linfócitos T CD4+ e/ou CD8+ produtores de interferões, actividade de linfócitos T citotóxicos (CTL) específicos para o antigénio, e uma resposta imune semelhante a células auxiliares T de tipo 1 (Thll) contra o antigénio de interesse (caracterizada por títulos aumentados de anticorpo específico do antigénio das subclasses tipicamente associadas à imunidade celular (por exemplo, IgG2a), normalmente com uma redução concomitante de títulos de anticorpos das subclasses tipicamente associadas à imunidade humoral (por exemplo, IgGl)) em vez de uma resposta imune semelhante a células T auxiliares de tipo 1 (Th2) como a que é normalmente produzida quando se imuniza um indivíduo utilizando uma exotoxina bacteriana de ADP-ribosilação adjuvante tal como CT ou LT.

As vantagens da presente invenção incluem, mas são estão limitadas à aptidão das presentes composições adjuvantes para proporcionar um efeito adjuvante significativo e melhorar assim a imunogenicidade de um antigénio co-administrado num indivíduo imunizado, bem como a aptidão para favorecer uma resposta imune semelhante a Thl contra o antigénio co-administrado que é vantajosa num produto de vacina.

Estes e outros objectivos, aspectos, formas de realização e vantagens da presente invenção irão prontamente ocorrer aos que têm experiência corrente da matéria com base na descrição aqui apresentada. -9-

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um mapa de restrição e um mapa funcional do plasmideo pPJV2002 que contém uma sequência de codificação truncada para um péptido da subunidade A da toxina da cólera (CT) (CTA), em que o plasmideo contém ainda o promotor do gene precoce imediato do citomegalovirus humano (hCMV) e a sequência do intrão A associado, e a sequência de codificação para o péptido do sinal do activador de plasminogénio de tecido humano para permitir a secreção de células de mamífero do produto de expressão de CTA truncado. A figura contém ainda a sequência de ácidos nucleicos completa (SEQ ID NO: 1) para o plasmideo pPJV2002. A Figura 2 é um mapa de restrição e mapa funcional do plasmideo pPJV2003 que contém uma sequência de codificação truncada para um péptido da subunidade B da toxina da cólera (CT) (CTB), em que o plasmideo contém ainda o promotor do gene precoce imediato do hCMV e a sequência do intrão A associado, e a sequência de codificação para o péptido do sinal do activador do

plasminogénio de tecidos humano para permitir a secreção de células de mamífero do produto de expressão de CTB truncado. A figura contém ainda a sequência de ácidos nucleicos completa (SEQ ID NO: 2) para o plasmideo pPJV2003. A Figura 3 é um mapa de restrição e mapa funcional do plasmideo pPJV2006 que contém uma sequência de codificação truncada para um péptido de CTA, em que a sequência de codificação de CTA truncada foi adicionalmente modificada para delecionar um motivo KDEL C-terminal no péptido da subunidade por ela codificada. 0 plasmideo contém ainda o promotor do gene precoce imediato do hCMV e -10- a sequência de intrão A associado, e a sequência de codificação para o péptido do sinal de activador de plasminogénio de tecidos humano para permitir a secreção de células de mamífero do produto de expressão de CTA truncado. A figura contém ainda a sequência de ácidos nucleicos completa (SEQ ID NO: 3) para o plasmídeo pPJV200 6. A Figura 4 é um mapa de restrição e mapa funcional do plasmídeo pPJV2004 que contém uma sequência de codificação truncada de um péptido da subunidade A da enterotoxina termolábil de E. coli (LT) (LTA) , em que o plasmídeo contém ainda o promotor do gene precoce imediato do hCMV e a sequência do intrão A associado, e a sequência de codificação para o péptido do sinal de activador de plasminogénio dos tecidos humano para permitir a secreção de células de mamífero do produto de expressão de LTA truncado. A figura contém ainda a sequência de ácidos nucleicos completa (SEQ ID NO: 4) para o plasmídeo PPJV2004. A Figura 5 é um mapa de restrição e mapa funcional do plasmídeo pPJV2005 que contém uma sequência de codificação truncada para um péptido da subunidade B de LT (LTB), em que o plasmídeo contém ainda o promotor do gene precoce imediato do hCMV e a sequência de intrão A associado, e a sequência de codificação para o péptido do sinal do activador de plasminogénio dos tecidos humano para permitir a secreção de células de mamífero do produto de expressão de LTB truncado. A Figura contém ainda a sequência de ácidos nucleicos completa (SEQ ID NO: 5) para o plasmídeo pPJV2005. A Figura 6 é um mapa de restrição e mapa funcional do plasmídeo pPJV2007 que contém uma sequência de -11- codificação truncada para um péptido de LTA, em que a sequência de codificação de LTA truncada foi adicionalmente modificada para delecionar um motivo RDEL C-terminal no péptido da subunidade por ela codificada. 0 plasmideo contém ainda o promotor do gene precoce imediato do hCMV e a sequência do intrão A associado, e a sequência de codificação para o péptido do sinal de activador de plasminogénio dos tecidos humano para permitir a secreção de células de mamífero do produto de expressão de LTA truncado. A figura contém ainda a sequência de ácidos nucleicos completa (SEQ ID NO: 6) para o plasmideo pPJV2007. A Figura 7 mostra os resultados do ELISA realizado no Exemplo 5. 0 histograma representa a concentração recíproca logarítmica do anticorpo anti-gpl20 presente nos animais que recebem, da esquerda para a direita na figura, Formulação #1 contendo o vector pWRG7054 vazio ("EmpVec"); Formulação #2 contendo o EmpVec (pWRG7054) e o plasmideo pCIA-EnvT ("gpl20"); Formulação #3 contendo o EmpVec (pWRG7054) combinado com os vectores adjuvantes pPJV2002 e pPJV2003 ("CTA/B"); Formulação #4 contendo o plasmideo pCIA-EnvT ("gpl20") combinado com os vectores adjuvantes pPJV2002 e pPJV2003 ("CTA/B"); Formulação #5 contendo o plasmideo pCIA-EnvT ("gpl20") combinado com os vectores adjuvantes pPJV2006 e pPJV2003 ("CTAKDEL/B"); ou nenhuma composição de vacina e/ou adjuvante ("natural"). A Figura 8 mostra os resultados do ELISA in situ realizado no Exemplo 5. 0 histograma representa o nível relativo da produção de IFN-γ específica para gpl20 nos esplenócitos obtidos de animais que recebem, da esquerda para a direita na figura, Formulação #1 contendo o vector pWRG7054 vazio ("EmpVec"); Formulação #2 contendo o EmpVec (pWRG7054) e o plasmideo pCIA-EnvT ("gpl20"); Formulação #3 -12- contendo o EmpVec (pWRG7054) combinado com os vectores adjuvantes pPJV2002 e pPJV2003 ("CTA/B"); Formulação #4 contendo o plasmídeo pCIA-EnvT ("gpl20") combinado com os vectores adjuvantes pPJV2002 e pPJV2003 ("CTA/B"); ou Formulação #5 contendo o plasmideo pCIA-EnvT ("gpl20") combinado com os vectores adjuvantes pPJV2006 e pPJV2003 ("CTA-KDEL/B"). A Figura 9 ilustra os resultados do ensaio ELISPOT realizado no Exemplo 5. 0 histograma representa os níveis relativos de esplenócitos produtores de IFN-γ obtidos de animais que recebem, da esquerda para a direita na figura, Formulação #1 contendo o vector pWRG7054 vazio ("EmpVec"); Formulação #2 contendo o EmpVec (pWRG7054) e o plasmideo pCIA-EnvT ("gpl20"); Formulação #3 contendo o EmpVec (pWRG7054) combinado com os vectores adjuvantes pPJV2002 e pPJV2003 ("CTA/B"); Formulação #4 contendo o plasmideo pCIA-EnvT ("gpl20") combinado com os vectores adjuvantes pPJV2002 e pPJV2003 ("CTA/B"); ou Formulação #5 contendo o plasmídeo pCIA-EnvT ("gpl20") combinado com os vectores adjuvantes pPJV2006 e pPJV2003 ("CTA-KDEL/B"). A Figura 10 mostra os resultados do ELISA realizado no Exemplo 6. Nesta figura, os valores da média geométrica da absorvência representam a concentração do anticorpo anti-HBcAg presente em amostras de soro (a quatro diluições diferentes) colhido na imunização de reforço (semana 6 do estudo) de animais que recebem ou Formulação #1 contendo o plasmideo do vector HBcAg/HBsAg (pWRG7193); ou Formulação #2 contendo o plasmideo do vector HBcAg/HBsAg (pWRG7193) combinado com os vectores adjuvantes pPJV2002 e pPJV2003 ("CTA/B"). A Figura 11 mostra os resultados do ELISA realizado no Exemplo 6. Nesta figura, os valores da média geométrica -13- da absorvência representam a concentração de anticorpo anti HBcAg presente em amostras de soro (a quatro diluições diferentes) colhidas 2 semanas após a imunização de reforço (semana 8 do estudo) de animais que recebem ou Formulação #1 contendo o plasmideo do vector HBcAg/HBsAg (pWRG7193); ou Formulação #2 contendo o plasmideo do vector HBcAg/HBsAg (pWRG7193) combinado com os vectores adjuvantes pPJV2002 e pPJV2003 ("CTA/B"). A Figura 12 mostra os resultados do ELISA realizado no Exemplo 7. 0 histograma representa as razões log IgGl:: IgG2a logarítmicas de cada grupo de imunização que recebe, da esquerda para a direita na figura, Formulação #1 contendo o plasmideo pM2-FL ("M2") combinado com o controlo do plasmideo do vector vazio (pWRG7054); Formulação #2 contendo o plasmideo pM2-FL combinado com os vectores adjuvantes CTA/B de pPJV2002 e pPJV2003 ("M2 + CT"); ou Formulação #7 contendo o plasmideo pM2-FL combinado com os vectores adjuvantes LTA/B pPJV2004 e pPJV2005 ("M2 + LT").

As Figuras 13A-13D mostram os resultados dos ensaios ELISPOT de IFN-γ e IL4 utilizados para avaliar a resposta imune à superfície do vírus da Hepatite B e antigénios do núcleo num primeiro estudo do Exemplo 8. Os 5 histogramas representam o número de manchas por 1x10 células de baço dos vários grupos experimentais. A Figura 14 mostra os resultados de sobrevivência do estudo de estimulação com vírus HSV-2 realizado no Exemplo 9.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Antes de descrever a presente invenção em pormenor, -14- entender-se-á que esta invenção não está limitada às moléculas especificamente exemplificadas ou aos parâmetros de processo que podem, é claro, variar. Entender-se-á também que a terminologia aqui utilizada é apenas para efeitos da descrição de formas de realização especificas da invenção, e não tem intenção de ser limitativa. Além disso, a prática da presente invenção vai utilizar, salvo indicação em contrário, métodos convencionais de virologia, microbiologia, biologia molecular, técnicas de ADN recombinante e imunologia, de que todos estão dentro do conhecimento corrente na arte. Essas técnicas estão plenamente explicadas na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989); ADN Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); e Fundamental Virology, 2nd Edition, vol. I & 11 (B. N. Fields e D. M. Knipe, eds.).

Deve notar-se que, tal como utilizadas nesta especificação e reivindicações anexas, as formas no singular "um", "uma" e "o, a" incluem referentes plurais salvo se o teor claramente determinar o contrário.

Definições

Salvo outra definição, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que o vulgarmente entendido por uma pessoa com conhecimentos correntes da matéria à qual respeita a invenção. Embora vários métodos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática da presente invenção, os materiais e métodos preferidos estão aqui descritos.

Na descrição da presente invenção, serão utilizados os termos seguintes, e pretendem ser definidos tal como -15- indicado adiante. 0 termo "adjuvante" pretende significar material ou composição capaz de especificamente ou não especificamente alterar, aumentar, direccionar, redireccionar, potenciar ou iniciar uma resposta imune especifica para o antigénio. Assim, a co-administração de um adjuvante com um antigénio pode resultar em que seja necessária uma dose mais baixa ou menos doses de antigénio para se obter uma resposta imune desejada no indivíduo ao qual o antigénio é administrado, ou a co-administração pode resultar numa resposta imune qualitativamente e/ou quantitativamente diferente no indivíduo. A eficácia de um adjuvante pode ser determinada pela administração do adjuvante com uma composição de vacina em paralelo com uma composição de vacina só a animais e comparando a imunidade mediada por anticorpos e/ou celular nos dois grupos utilizando ensaios normalizados tais como radioimunoensaio, ELISA, ensaios CTL e outros semelhantes, todos bem conhecidos na arte. Tipicamente, numa composição de vacina, o adjuvante é uma unidade separada do antigénio, embora uma única molécula possa ter propriedades adjuvantes e antigénicas.

Uma "composição adjuvante" pretende significar qualquer composição farmacêutica contendo um adjuvante. As composições adjuvantes podem ser administradas nos métodos da invenção enquanto em qualquer forma farmacêutica adequada, por exemplo, como um liquido, pó, creme, loção, emulsão, gel ou outro semelhante. Contudo, as composições adjuvantes preferidas vão estar na forma de partículas. Pretende-se, embora não esteja sempre afirmado explicitamente, que as moléculas tenham actividade biológica semelhante ao péptido de tipo selvagem ou purificado ou adjuvantes químicos. 0 termo "péptido" é utilizado no seu sentido mais lato para referir um composto de duas ou mais subunidades -16- de aminoácidos, análogos de aminoácidos, ou outros peptidomiméticos. As subunidades podem estar ligadas por ligações peptídicas ou por outras ligações, por exemplo éster, éter, etc. Tal como aqui utilizado, o termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e ambos os isómeros ópticos D ou L, e análogos de aminoácidos e peptidomiméticos. Um péptido de três ou mais aminoácidos é vulgarmente chamado um "oligopéptido" se a cadeia peptidica for curta. Se a cadeia peptidica for longa, o péptido é tipicamente referido como um "polipéptido" ou uma "proteína".

Um "antigénio" refere-se a qualquer agente, genericamente uma macromolécula, que pode desencadear uma resposta imunológica num indivíduo. 0 termo pode ser utilizado para referir a uma macromolécula indivíduo ou uma população homogénea ou heterogénea de macromoléculas antigénicas. Tal como aqui utilizado, "antigénio" é genericamente usado para fazer referência a uma molécula de péptido ou hidrato de carbono que contém um ou mais epitopos. Para efeitos da presente invenção, os antigénios podem ser obtidos ou derivados de uma qualquer fonte apropriada. Além disso, para efeitos da presente invenção, um "antigénio" inclui um péptido que tem modificações, tais como deleções, adições e substituições (genericamente conservadoras quanto à natureza) em relação à sequência nativa, desde que o péptido mantenha imunogenicidade suficiente. Estas modificações podem ser deliberadas, por exemplo através de mutagénese dirigida ao sítio, ou podem ser acidentais, tais como através de mutações de hospedeiros que produzem os antigénios.

Uma "resposta imune" contra um antigénio de interesse é o desenvolvimento num indivíduo de uma resposta imune humoral e/ou celular a esse antigénio. Para efeitos da presente invenção, uma "resposta imune humoral" refere- -17- se a uma resposta imune mediada por moléculas de anticorpo, enquanto uma "resposta imune celular" é uma mediada por linfócitos T e/ou outros leucócitos. 0 termo "imunização com ácidos nucleicos" é aqui utilizado para referir a introdução de uma molécula de ácido nucleico que codifica um ou mais antigénios seleccionados numa célula hospedeira para a expressão ín vivo do antigénio ou antigénios. 0 termo também abrange a introdução de uma molécula de ácido nucleico que codifica um ou mais adjuvantes seleccionados numa células hospedeira para a expressão in vivo do adjuvante ou adjuvantes. A molécula de ácido nucleico pode ser introduzida directamente no indivíduo receptor, tal como por injecção intramuscular ou intradérmica corrente; administração de partículas transdérmica; inalação; topicamente, ou pelas vias de administração oral, intranasal ou mucosal. A molécula alternativamente pode ser introduzida ex vivo em células que foram retiradas de um indivíduo. Neste último caso, células contendo a molécula de ácido nucleico de interesse são reintroduzidas no indivíduo de modo que possa ser montada uma resposta imune contra o antigénio codificado pela molécula de ácido nucleico, ou de tal modo que o adjuvante codificado pela molécula de ácido nucleico possa exercer o seu efeito adjuvante.

Os termos "molécula de ácido nucleico" e "polinucleótido" são aqui utilizados intercambiavelmente e referem-se a uma forma polimérica de nucleótidos de qualquer comprimento, quer desoxirribonucleótidos ou ribonucleótidos, ou os seus análogos. Os polinucleótidos podem ter qualquer estrutura tridimensional, e podem desempenhar qualquer função, conhecida ou desconhecida. Os exemplos não limitativos de polinucleótidos incluem um gene, um fragmento de gene, exões, intrões, ARN mensageiro (ARNm), ARN de transferência, ARN ribossómico, ribozimas, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos -18- ramificados, plasmídeos, vectores, ADN isolado de qualquer sequência, ARN isolado de qualquer sequência, sondas de ácidos nucleicos e iniciadores.

Um polinucleótido é tipicamente constituído por uma sequência específica de quatro bases nucleotídicas: adenina (A) ; citosina (C) ; guanina (G) ; e timina (T) (uracilo (U) por timina (T) quando o polinucleótido é ARN). Assim, o termo sequência de ácidos nucleicos é a representação alfabética de uma molécula de polinucleótido. Esta representação alfabética pode ser introduzida em bases de dados de um computador que tem uma unidade de processamento central e utilizada para aplicações de bioinformática tais como a pesquisa de genómica funcional e homologia.

Um "vector" é capaz de transferir sequências de ácido nucleico para células alvo (por exemplo, vectores virais, vectores não virais, veículos em partículas e lipossomas). Tipicamente, "construção de vector", "vector de expressão" e "vector de transferência do gene" significam qualquer construção de ácido nucleico capaz de direccionar a expressão de um gene de interesse e que pode transferir sequências do gene para células alvo. Assim, o termo inclui veículos de clonagem e expressão, bem como vectores virais. Um "plasmídeo" é um vector na forma de um elemento genético extracromossómico.

Uma sequência de ácidos nucleicos que "codifica" um adjuvante e/ou antigénio seleccionado é uma molécula de ácido nucleico que é transcrita (no caso de ADN) e traduzida (no caso de ARNm) num polipéptido in vivo quando colocado sob o controlo de sequências reguladoras apropriadas. As fronteiras da sequência de codificação são determinadas por um codão de iniciação no terminal 5' (amino) e um codão de terminação da tradução no terminal 3' (carboxilo). Para efeitos da invenção, essas sequências de ácidos nucleicos podem incluir, mas são estão limitadas a, ADNc de ARNm virai, procariota ou eucariota, sequências -19- genómicas de ADN ou ARN virai ou procariota, e até sequências de ADN sintéticas. Uma sequência de terminação da transcrição pode estar localizada 3' em relação à sequência de codificação.

Um "promotor" é uma sequência de nucleótidos que inicia e regula a transcrição de um polinucleótido que codifica um polipéptido. Os promotores podem incluir promotores indutiveis (em que a expressão de uma sequência de polinucleótido ligada operativamente ao promotor é induzida por um analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), promotores repressíveis (em que a expressão de uma sequência de polinucleótido ligada operativamente ao promotor está reprimida por um analito, cofactor, proteína reguladora, etc.), e promotores constitutivos. Pretende-se que o termo "promotor" ou "elemento de controlo" inclua as regiões promotoras de comprimento total e segmentos funcionais (por exemplo, controla a transcrição ou tradução) destas regiões. "Ligado operativamente" refere-se a uma disposição de elementos em que os componentes assim descritos estão configurados para efectuar a sua função usual. Assim, um dado promotor ligado operativamente a uma sequência de ácidos nucleicos é capaz de efectuar a expressão dessa sequência quando as enzimas apropriadas estão presentes. 0 promotor não precisa de estar contíguo à sequência, desde que funcione para dirigir a sua expressão. Por conseguinte, por exemplo, sequências transcritas mas não traduzidas interpostas podem estar presentes entre a sequência promotora e a sequência de ácidos nucleicos e a sequência promotora pode ainda ser considerada "ligada operativamente" à sequência de codificação. "Recombinante" é aqui utilizado para descrever uma molécula de ácido nucleico (polinucleótido) de origem genómica, de ADNc, semissintética, ou sintética, que, em virtude da sua origem ou manipulação, não está associada à -20- totalidade ou a uma porção do polinucleótido ao qual está associada na natureza e/ou está ligada a um polinucleótido diferente daquele ao qual está ligada na natureza. Duas sequências de ácidos nucleicos que estão contidas dentro de uma única molécula de ácido nucleico recombinante são "heterólogas" relativamente uma à outra quando não estão normalmente associadas uma à outra na natureza.

Um "polinucleótido isolado" é uma molécula de ácido nucleico separada e discreta do organismo completo no qual a molécula é encontrada na naturaza; ou uma molécula de ácido nucleico desprovida, na totalidade ou em parte, das sequências normalmente a ela associadas na natureza; ou uma sequência, tal como existe na natureza, mas que tem sequências heterólogas (como definidas a seguir) em associação com ela. A sequência é "derivada de ou obtida a partir de" uma molécula se tiver a mesma ou substancialmente a mesma sequência de pares de bases que uma região da molécula fonte, o seu ADNc, os seus complementos, ou se apresentar identidade de sequência como descrito adiante.

As técnicas para determinar a "identidade de sequências" ou "homologia de sequências" de ácidos nucleicos e aminoácidos também são conhecidas na arte. Tipicamente, essas técnicas incluem a determinação da sequência dos nucleótidos do ARNm para um gene e/ou a determinação da sequência de aminoácidos por ele codificada, e a comparação destas sequências com uma segunda sequência de nucleótidos ou aminoácidos. Em geral, "identidade" refere-se a uma correspondência exacta nucleótido-a-nucleótido ou aminoácido-a-aminoácido de duas sequências de polinucleótidos ou polipéptidos, respectivamente. Duas ou mais sequências (de polinucleótido ou de aminoácidos) podem ser comparadas por determinação da sua "identidade percentual". A identidade percentual de duas sequências, sejam sequências de ácidos nucleicos ou de -21- aminoácidos, é o número de emparelhamentos exactos entre duas sequências alinhadas dividido pelo comprimento das sequências mais curtas e multiplicado por 100. Um alinhamento aproximado para sequências de ácidos nucleicos é proporcionado pelo algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Advances in Applied Mathematics 2: 482-489 (1981). Este algoritmo pode ser aplicado à sequência de aminoácidos por utilização da matriz de avaliação desenvolvida por Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M. 0. Dayhoff ed., 5 suppl. 3: 353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D. C., EUA, e normalizada por Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6): 6745-6763 (1986) . Uma implementação exemplificativa deste algoritmo para determinar a identidade percentual de uma sequência é proporcionada pelo Genetics Computer Group (Madison, WI) na aplicação utilitária "BestFit". Os parâmetros implícitos para este método estão descritos no Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8 (1995) (disponível de Genetics Computer Group, Madison, WI) . Um método preferido para estabelecimento da identidade percentual no contexto da presente invenção é utilizar o pacote MPSRCH de programas com direitos de autor da Universidade de Edimburgo, desenvolvido por John F. Collins e Shane S. Sturrok, e distribuído por IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA) . A partir desta série de pacotes pode ser utilizado o algoritmo de Smith-Waterman em que os parâmetros por defeito são utilizados para a tabela de avaliação (scores) (por exemplo, penalização de abertura de intervalo (gap open penalty) 12, penalização por extensão do intervalo {gap extension penalty)um, e um intervalo {gap) de seis) . A partir dos dados gerados o valor da "Emparelhamento" ("Match") reflecte a "identidade da sequência". Outros programas adequados para calcular a identidade percentual ou semelhança entre sequências são genericamente conhecidos na arte, por exemplo, outro -22- programa de alinhamento é o BLAST, utilizado com parâmetros implícitos. Por exemplo, BLASTN e BLASTP podem ser usados utilizando os seguintes parâmetros implícitos: código genético = padrão; filtro = nenhum; cadeia = ambas; corte = 60; esperado = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 sequências; classificar por = HIGH SCORE; Bases de dados = não redundantes, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + traduções GenBank CDS + Swiss protein + Spupdate + PIR. Pormenores destes programas podem ser encontrados na seguinte morada da Internet: http://www.ncbi.nlm.gov/cgi-bin/BLAST.

Alternativamente, a homologia pode ser determinada por hibridação de polinucleótidos em condições que foram duplexes estáveis entre regiões homólogas, seguida por digestão com nuclease(s) específicas de cadeia simples, e determinação do tamanho dos fragmentos digeridos. Duas sequências de ADN ou de polipéptidos são "substancialmente homólogas" entre si quando as sequências apresentam pelo menos cerca de 80%—85%, de preferência pelo menos cerca de 90%, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 95%-98% de identidade das sequências num comprimento definido das moléculas, determinada utilizando os métodos referidos acima. Tal como aqui utilizado, substancialmente homólogo também se refere a sequências que apresentam identidade completa com a sequência de ADN ou de polipéptido especificada. As sequências de ADN que são substancialmente homólogas podem ser identificadas numa experiência de hibridação de Southern em, por exemplo, condições estritas, como definido para esse sistema específico. Por exemplo, condições de hibridação estritas podem incluir formamida a 50%, 5x solução de Denhardt, 5x SSC, SDS a 0,1% e 100 g/mL de ADN de esperma de salmão desnaturado e as condições de lavagem podem incluir 2x SSC, SDS a 0,1% a 37 °C seguido por lx SSC, SDS a 0,1% a 68 °C. A definição de condições hibridação apropriadas está dentro da experiência na arte. Ver, por exemplo, Sambrook et al.r supra; ADN Cloning, -23- supra; Nucleic Acid Hybridization, supra. 0 termo administração "transdérmica" significa administração intradérmica (por exemplo, na derme ou epiderme), transdérmica (por exemplo, "percutânea") e transmucosa, isto é, administração por passagem de um agente para a ou através da pele ou tecido mucoso. Ver, por exemplo, Transdermal Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft e Guy (eds.), Mareei Dekker, Inc., (1989); Controlled Drug Delivery: Fundamentais and Applications, Robinson e Lee (eds.), Mareei Dekker Inc., (1987); e Transdermal Delivery of Drugs, Vols. 1-3, Kydonieus e Berner (eds.), CRC Press, (1987). Assim, o termo abrange a administração de um agente utilizando um dispositivo de administração de partículas (por exemplo, uma seringa sem agulha) como os descritos na patente U.S. N° 5630796, bem como a administração utilizando dispositivos de administração mediada por partículas como os descritos na patente U.S. N° 5865796.

Por "partícula transportadora que forma um núcleo" significa-se um elemento transportador no qual é revestido um ácido nucleico hóspede (por exemplo, ADN, ARN) para conferir um tamanho de partícula definido bem como uma densidade suficientemente elevada para atingir o momento necessário para penetração na membrana celular, tal que a molécula hóspede possa ser administrada utilizando técnicas mediadas por partículas (ver, por exemplo, patente U.S. N° 5100792) . As partículas transportadoras que formam um núcleo tipicamente incluem materiais tais como tungsténio, ouro, platina, ferrite, poliestireno e látex. Ver por exemplo, Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, (1994) Yang, N. ed., Oxford University Press, New York, NY, páginas 10-11.

Por "dispositivo de administração de partículas" significa-se um instrumento que administra uma composição em partículas transdermicamente sem a ajuda de uma agulha -24- convencional para perfurar a pele. Os dispositivos de administração de partículas para utilização com a presente invenção são discutidos ao longo deste documento.

Tal como aqui utilizado, o termo "tratamento" inclui qualquer dos seguintes: a prevenção de infecção ou reinfecção; a redução ou eliminação de sintomas; e a redução ou eliminação completa de um agente patogénico. 0 tratamento pode ser efectuado profilacticamente (antes da infecção) ou terapeuticamente (depois da infecção).

Os termos "indivíduo" e "sujeito" são aqui utilizados intercambiavelmente para referir qualquer membro do subfilo dos cordados, incluindo, sem limitação, seres humanos e outros primatas, incluindo primatas não humanos tais como chimpanzés e outras espécies de símios e macacos; animais de exploração tais como gado bovino, ovelhas, porcos, cabras e cavalos; animais domésticos tais como cães e gatos; animais de laboratório incluindo roedores como murganhos, ratos e cobaios; aves, incluindo aves domésticas, selvagens e de caça tais como frangos, perús e outros galináceos, patos, gansos e outros semelhantes. Os termos não indicam uma idade específica. Assim, pretende-se que estejam abrangidos tanto indivíduos adultos como recém-nascidos. Os métodos aqui descritos destinam-se a utilização em qualquer das espécies de vertebrados acima referidas, uma vez que os sistemas imunes de todos esses vertebrados funcionam de modo semelhante. Súmula geral

Antes da descrição da presente invenção em pormenor, deve entender-se que esta invenção não está limitada a formulações ou parâmetros de processo específicos dado que podem, é claro, variar. Deve-se também entender que a terminologia aqui utilizada é para efeitos da descrição de formas de realização específicas da -25- invenção, e não pretende ser limitativa. A presente invenção proporciona novas composições contendo sequências de ácidos nucleicos, em que a primeira sequência da composição é uma sequência de codificação de uma subunidade A obtida ou derivada de uma toxina bacteriana de ADP-ribosilação, e a segunda sequência da composição é uma sequência de codificação de uma subunidade B obtida ou derivada de uma toxina bacteriana de ADP-ribosilação. A primeira e segunda sequências são úteis em métodos de imunização em que são administradas a um indivíduo para proporcionar um efeito adjuvante (contra um antigénio de interesse co-administrado) no indivíduo imunizado. As toxinas bacterianas de ADP-ribosilação são uma família de exotoxinas bacterianas aparentadas e incluem a toxina da difteria (DT), toxina pertussis (PT), toxina da cólera (CT) , as toxinas termolábeis de E. coli (LT1 e LT2), endotoxina A de Pseudomonas, exotoxina S de Pseudomonas, exoenzima de B. cereus, toxina de B. sphaericus, toxinas C2 e C3 de C. botulinum, exoenzima de C. limosum, bem como as toxinas de C. perfringens, C. spiriforma e C. difficile, Staphylococcus aureus EDIN, e mutantes da toxina bacteriana de ADP-ribosilação tais como CRM197, um mutante da toxina da difteria não tóxico (ver, por exemplo, Bixler et al. (1989) Adv. Exp. Med. Biol. 251: 175; e Constantino et al. (1992) Vaccine). A maioria das toxinas bacterianas de ADP-ribosilação estão organizadas como um multímero A:B, em que a subunidade A contém a actividade de ADP-ribosiltransferase, e a subunidade B actua como a unidade de ligação. As toxinas bacterianas de ADP-ribosilação preferidas para utilização nas composições da presente invenção incluem a toxina da cólera e as toxinas termolábeis de E. coli. A tóxina da cólera (CT) e as enterotoxinas lábeis (LT) de E. coli são produtos da secreção das suas respectivas estirpes bacterianas enterotóxicas que são imunogénios -26- potentes e apresentam forte toxicidade quando administradas sistematicamente, oralmente ou por via mucosa. Sabe-se que a CT e a LT proporcionam efeitos adjuvantes para o antigénio quando administradas pelas vias intramuscular ou oral. Estes efeitos adjuvantes foram observados a doses abaixo da necessária para toxicidade. As duas toxinas são moléculas extremamente semelhantes, e são pelo menos cerca de 70-80% homólogas ao nivel dos aminoácidos.

As toxinas CT e LT são hexâmeros, constituídas por uma única molécula de uma subunidade A rodeada por um anel em forma de donute composto por 5 moléculas da subunidade B. A subunidade A possui uma actividade de ADP-ribosilase que resulta em modificações da proteína G que levam a regulação positiva da cAMP e proteína quinase A após internalização da subunidade A numa célula de mamífero. A subunidade A pode ser cortada por proteases exógenas dando os fragmentos AI e A2 ligados por uma única ponte dissulfureto. A subunidade A da CT contém um motivo peptídico KDEL no terminal C (RDEL para a subunidade A de LT) que está associado à recuperação de proteínas da rede trans-Golgi para o ER. Isto é provavelmente importante para o transporte do fragmento A ao compartimento celular correcto para toxicidade após a internalização, e retenção da toxina dentro desse compartimento celular. A subunidade AI entra no citoplasma da célula e desencadeia o efluxo de Cl ao catalisar a ADP-ribosilação de uma proteína G, que activa a adenilato ciclase conduzindo a níveis elevados de cAMP. O cAMP elevado faz com que a proteína quinase A fosforile e abra o canal de cloreto regulador da condutância transmembranar da fibrose cística. O papel principal do fragmento A2 é na interacção com a subunidade B. A internalização da toxina é mediada pelas cinco cópias da subunidade B que têm actividade de ligação ao gangliósido GM1, um glicoesfingolípido encontrado ubiquamente na superfície das células de -27- mamífero. A importância relativa das subunidades A e B para a adjuvanticidade é controversa. Há especulação no campo que a actividade tóxica da subunidade A pode modular os efeitos adjuvantes associados à subunidade B. Alguns estudos demonstram que mutações na subunidade A suprimem a actividade adjuvante enquanto que outros mostram que as mutações da subunidade A bloqueiam a actividade de ADP-ribosilase não têm efeito na adjuvanticidade. Outros relatórios mostram níveis variáveis de efeitos adjuvantes para as subunidades B purificadas ou preparações de subunidades B recombinantes. é provável que as subunidades A e B tenham funções separadas que contribuem independentemente para a adjuvanticidade. Estas funções são actividade de ADP-ribosilase e actividade activação de receptores, respectivamente. No que se refere à subunidade da LT em particular, a ligação ao receptor GM1 em células B resulta em activação policlonal, ocorre na ausência de proliferação significativa e envolve a regulação positiva de várias moléculas importantes tais como MHC da classe II, B7, CD40, ICAM-1 e IL2-Ra. Para células T, a adição de holotoxinas de CT ou LT ou subunidades B recombinantes a células T estimuladas com concanavilina A resulta numa redução da incorporação de timidina. Não foram descritos efeitos destas moléculas em macrófagos e células dendríticas. Em culturas de PBMC, EtxB estimula um nível elevado de TNF-α e produção de IL-10 mas não de IL-12. Isto é consistente com as observações de respostas predominantemente semelhantes a Th2 associadas à utilização das formas CT e LT como adjuvantes. É portanto uma característica surpreendente da presente invenção que a administração das presentes composições adjuvantes de polinucleótidos produzam de preferência uma resposta imune semelhante a Thl aumentada contra o antigénio de interesse co-administrado, em vez da -28- resposta semelhante a Th2 que seria esperada a partir da utilização de uma composição adjuvante de exotoxina de ADP-ribosilação.

Sequências de codificação de subunidades de exotoxina de ADP-ribosilação

Numa forma de realização, é proporcionada uma composição que inclui uma ou mais moléculas de ácidos nucleicos recombinantes, contendo as referidas uma ou mais moléculas uma primeira e segunda sequências de ácidos nucleicos em que (a) a primeira sequência de ácidos nucleicos é uma região de codificação de um péptido da subunidade A truncada obtida ou derivada de uma exotoxina de ADP-ribosilação, e (b) uma segunda sequência de ácidos nucleicos é uma região de codificação de um péptido da subunidade B truncada obtida ou derivada de uma exotoxina de ADP-ribosilação. As regiões de codificação proporcionam péptidos de subunidades "truncadas" na medida em que cada uma das referidas regiões de codificação das subunidades foi geneticamente alterada de modo a criar uma delecção 5', com o que o péptido das subunidades codificadas não tem um péptido do sinal bacteriano amino terminal.

Noutra forma de realização, é proporcionada uma composição que inclui uma ou mais moléculas de ácidos nucleicos recombinantes, contendo as referidas uma ou mais moléculas uma primeira e segunda sequências de ácidos nucleicos em que (a) a primeira sequência de ácidos nucleicos é uma região de codificação de um péptido da subunidade A, modificado, maturo, obtida ou derivada de uma exotoxina de ADP-ribosilação, e (b) a segunda sequência de ácidos nucleicos é uma região de codificação de um péptido da subunidade B matura obtida ou derivada de uma exotoxina de ADP-ribosilação. A primeira sequência de ácidos -29- nucleicos contém uma região de codificação que proporciona um péptido da subunidade A "modificado" na medida em que a referida região de codificação foi geneticamente alterada para delecionar um KDEL ou RDEL C-terminal de quatro resíduos de aminoácidos normalmente encontrada no péptido da subunidade codificada.

Ainda noutra forma de realização, é proporcionada uma composição que inclui uma ou mais moléculas de ácidos nucleicos recombinantes, contendo as referidas uma ou mais moléculas uma primeira e segunda sequências de ácidos nucleicos em que (a) a primeira sequência de ácidos nucleicos é uma região de codificação de um péptido da subunidade A truncada e modificada, obtida ou derivada de uma exotoxina de ADP-ribosilação, e (b) a segunda sequência de ácidos nucleicos é uma região de codificação de um péptido da subunidade B truncado, obtida ou derivada de uma exotoxina de ADP-ribosilação.

Em formas de realização especialmente preferidas, as sequências de codificação da subunidade do péptido da exotoxina de ADP-ribosilação são obtidas ou derivadas de uma toxina da cólera (CT) . Noutras formas de realização particularmente preferidas, as sequências de codificação da subunidade do péptido da exotoxina de ADP-ribosilação são obtidas ou derivadas de uma enterotoxina termolábil de E. coli (LT), por exemplo LT1 ou LT2.

Porções dos genomas de várias espécies bacterianas enterotóxicas, particularmente as porções que contêm as sequências de codificação de exotoxinas de ADP-ribosilação, são genericamente conhecidas e as suas sequências estão disponíveis ao público, por exemplo na World Wide Web, e/ou estão depositadas em repositórios tais como a base de dados GenBank. Por exemplo, uma entrada do GenBank para as sequências completas dos genes das subunidades A e B de CT pode ser encontrada no sítio VIBCTXABB (N° de ordem D30053), enquanto que uma entrada do GenBank para as -30- sequências completas dos genes das subunidades A e B de LT pode ser encontrada no sítio AB0116677 (N° de ordem AB011677). As variantes ou fragmentos activos destas sequências da toxina também podem ser utilizadas nas composições e métodos da presente invenção. Para uma discussão geral das exotoxinas de ADP-ribosilação, ver por exemplo, Krueger et al. (1995) Clin. Microbiol. Rev. 8:34— 47. Além disso, em certos aspectos da invenção, uma ou ambas das regiões de codificação do péptido da subunidade da toxina podem ser adicionalmente modificadas geneticamente para destoxificar o ou os péptidos da subunidade por elas codificada. Por exemplo, os mutantes da toxina alterada geneticamente que têm uma actividade de ADP-ribosilação alterada, mutações do sítio de clivagem de tripsina, ou uma actividade de ligação alterada, já são conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Burnette et al. (1994) "Recombinant microbiol ADP-ribosylating toxins of Bordetella pertusis, Vibrio cholerae, and Escherichia coli enterotoxigenic: structure, function and toxoid vaccine development", em Bioprocess Technology, Burnette et al., eds., páginas 185-203; Rappuoli et al. (1995) Int. Archiv. Allergy Immunol. 108:327-333; e Rappuoli et al. (1996) Ad. Exp. Med. Biol. 397:55-60. As sequências que codificam as subunidades da toxina seleccionada são tipicamente inseridas num vector apropriado (por exemplo, uma estrutura base de plasmídeo) utilizando técnicas conhecidas e como se descreve adiante nos Exemplos. A sequência ou sequências que codificam os péptidos da subunidade de exotoxina de ADP-ribosilação podem ser obtidas e/ou preparadas utilizando métodos conhecidos. Por exemplo, podem ser obtidas preparações substancialmente puras utilizando ferramentas de biologia molecular correntes. Isto é, as sequências de polinucleótidos que codificam as subunidades da toxina descritas anteriormente podem ser obtidas utilizando métodos recombinantes, tais -31- como bancos de ADNc de separação por exclusão que exprimem as subunidades de toxina, ou derivando a sequência de codificação das subunidades de toxina a partir de um vector conhecido que as inclui. As sequências de codificação das subunidades de toxina de várias estirpes bacterianas estão depositadas na American Type Culture Collection ATCC, e outras ainda estão disponíveis em organizações nacionais e internacionais de saúde tais como Centers of Disease Control (Atlanta, GA). Ver, por exemplo, Sambrook et al., supra, para uma descrição das técnicas utilizadas para obter e isolar as moléculas de ácidos nucleicos. As sequências de polinucleótidos também podem ser produzidas sinteticamente, em vez de clonadas.

Ainda outro método conveniente para isolar moléculas de ácidos nucleicos específicos é pela reacção em cadeia da polimerase (PCR). Mullis et al. (1987) Methods Enzymol. 155:335-350. Esta técnica utiliza ADN polimerase, usualmente uma ADN polimerase termostável, para replicar uma região de ADN desejada. A região de ADN a ser replicada é identificada por oligonucleótidos de sequência especificada complementar a extremidades opostas e cadeias opostas do ADN desejado para iniciar a reacção de replicação. O produto do primeiro ciclo de replicação é ele próprio um molde para a replicação subsequente, e assim os ciclos sucessivos de replicação repetidos resultam em amplificação geométrica do fragmento de ADN delimitado pelo par de iniciadores utilizado.

Uma vez obtidas as sequências relevantes das subunidades de exotoxina de ADP-ribosilação de interesse, podem ser ligadas umas à outras para dar uma ou mais moléculas de ácidos nucleicos contíguas utilizando técnicas correntes de biologia molecular ou de clonagem. Mas particularmente, depois de ter sido obtida a informação da sequência da combinação de subunidades da toxina seleccionada, as sequências de codificação podem ser -32- combinadas entre si ou com outras sequências para formar uma sequência híbrida, ou tratadas em separado. Em sequências híbridas, as sequências de codificação dos péptidos das subunidades podem ser posicionadas de qualquer maneira uma em relação à outra, e podem ser incluídas numa única molécula de várias formas, por exemplo, como uma cópia única, repetidas aleatoriamente na molécula como cópias múltiplas, ou incluídas na molécula como repetições em série múltiplas ou motivos repetidos ordenados de maneira diferente.

Embora se possa utilizar qualquer de várias técnicas correntes de biologia molecular para construir essas moléculas de ácido nucleico recombinante, um método conveniente abrange a utilização de um ou mais sítios de restrição únicos num vector de vai-vem ou de clonagem (ou inserir um ou mais sítios de restrição únicos numa sequência do vector adequada) e as técnicas de clonagem correntes para dirigir a sequência ou sequências de codificação dos péptidos das subunidades para localizações alvo específicas dentro de um vector.

Alternativamente, podem ser produzidas moléculas híbridas sinteticamente em vez de serem clonadas. A sequência de nucleótidos pode ser concebida com os codãos apropriados para a sequência de aminoácidos específica desejada. Em geral, selecciona-se os codãos preferidos para o hospedeiro pretendido em que vai ser expressa a sequência. A sequência completa pode ser então montada a partir de oligonucleótidos de sobreposição preparados por métodos correntes e montados numa sequência de codificação completa. Ver, por exemplo, Edge (1981) Nature 292:756; Nambair et al. (1984) Science (1984) 223:1299; Jay et al. (1984; J. Biol. Chem. 259:6311.

Uma vez obtidas ou construídas as sequências de codificação dos péptidos da exotoxina de ADP-ribosilação relevantes, as mesmas podem ser inseridas em um ou mais -33- vectores adequados que sequências de controlo ligadas operativamente à sequência ou sequências inseridas, proporcionando assim cassetes de expressão que permitem a expressão dos péptidos das subunidades da toxina in vivo numa espécie de indivíduo alvo.

Os promotores típicos da expressão de células de mamíferos incluem o promotor do gene de expressão precoce de SV4 0, um promotor de CMV tal como o promotor do gene imediato de expressão precoce (immediate early promoter) de CMV, o promotor LTR do vírus do tumor da mama de murganho, o promotor major de expressão tardia de adenovírus (Ad MLP) , e outros sistemas promotores com eficácia adequada. Os promotores não virais, tais como um promotor derivado do gene de metalotioneína de murino, também podem ser utilizados para a expressão de mamíferos. Os promotores indutíveis, repressíveis ou controláveis de outro modo também podem ser utilizados. Tipicamente, as sequências de terminação da transcrição e poliadenilação também vão estar presentes, localizadas 3' em relação a cada codão de terminação da tradução. De preferência, também está presente uma sequência para optimização da iniciação de tradução, localizada 5' em relação a cada sequência de codificação. Os exemplos dos sinais de terminação da transcrição/poliadenilação incluem os derivados de SV40, como descrito em Sambrook et al., supra, bem como uma sequência terminadora da hormona de crescimento de bovino. Os intrões, que contêm sítios doadores e aceitadores de splicing, também podem ser concebidos na cassete de expressão.

Além disso, os elementos intensificadores podem ser incluídos dentro das cassetes de expressão para aumentar os níveis de expressão. Exemplos de intensificadores adequados incluem o intensificador do gene de expressão precoce de SV4 0 (Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4:761), o intensificador/promotor derivado da repetição terminal -34- longa (LTR) do Vírus de Sarcoma de Rous (Gorman et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 79:6777), e os elementos derivados do CMV de ser humano ou de murino (Boshart et al. (1985) Cell 41:521), por exemplo, os elementos incluídos na sequência do intrão A de CMV.

Está incluída uma sequência auxiliar adicional que proporciona a secreção do péptido da subunidade da exotoxina de ADP-ribosilação ligada de uma célula de mamífero. Essas sequências lideres da secreção já são conhecidas pelos especialistas na arte, e incluem, por exemplo, a sequência de sinal lider do activador do plasminogénio do tecido (tpa).

Depois de terem sido produzidas uma ou mais cassetes de expressão adequadas (ou construções de ácidos nucleicos tais como vectores do plasmideo) que contêm as sequências de codificação dos péptidos das subunidades da exotoxina de ADP-ribosilação de interesse, as cassetes de expressão podem ser proporcionadas num vector de transfecção adequado tal como um vector do plasmideo de ADN ou um vector virai para administração subsequente a um indivíduo. A este respeito, as composições de polinucleótidos da invenção podem ser utilizadas como composições adjuvantes por si sós, ou co-administradas com um antigénio de interesse, por exemplo, como parte de uma composição de vacina de componentes múltiplos. Por exemplo, numa composição de vacina de componentes múltiplos, as presentes moléculas de ácidos nucleicos (que contêm as sequências de codificação dos péptidos das subunidades de exotoxina de ADP-ribosilação de interesse) podem ser combinadas com moléculas de ácidos nucleicos adicionais que codificam um ou mais antigénios que se sabe que vão ser importantes para proporcionar protecção contra um agente patogénico, por exemplo, as moléculas que contêm sequências que codificam os antigénios de HA ou NA de influenza, ou as moléculas que contêm sequências que codificam os antigénios -35- de VIH. Alternativamente, a composição de vacina de componentes múltiplos pode conter, além dos polinucleótidos que codificam as subunidades da toxina, o antigénio na forma de virus completo convencional, virus fraccionado, polissacárido, ou preparações de vacina das subunidades purificadas como aqui descrito adiante.

Antigénios

As composições e métodos aqui descritos são úteis como adjuvantes de uma resposta imune contra uma ampla variedade de antigénios co-administrados, por exemplo antigénios obtidos ou derivados de células ou tecidos doentes, ou de agentes patogénicos humanos ou animais. Para efeitos da presente invenção, um adjuvante é utilizado para melhorar a resposta imune a um antigénio especifico, por exemplo quando um adjuvante é co-administrado com uma composição de vacina, a resposta imune é maior do que a resposta imune desencadeada por uma quantidade equivalente da composição de vacina administrada sem o adjuvante, ou o adjuvante é utilizado para direccionar um tipo ou classe particular de resposta imune contra um antigénio co-administrado. A co-administração de uma "quantidade eficaz" das composições adjuvantes da presente invenção vai ser a quantidade que melhora uma resposta imunológica ao antigénio co-administrado de tal modo que, por exemplo, são necessárias doses menores ou inferiores do antigénio para produzir uma resposta imune eficiente.

Tal como aqui utilizado, o termo "co-administrado", tal como quando uma composição adjuvante que codifica as subunidades da exotoxina de ADP-ribosilação de acordo com a presente invenção é "co-administrada" com um antigénio de interesse (por exemplo, uma composição de vacina), significa a administração simultânea ou concorrente da composição adjuvante e do antigénio, por exemplo, quando os -36- dois estão presentes na mesma composição ou são administrados em composições separadas quase ao mesmo tempo mas em sitios diferentes, bem como a administração da composição adjuvante e do antigénio em composições separadas em diferentes momentos, incluindo a administração em sitios diferentes. Por exemplo, a composição adjuvante pode ser administrada antes ou depois da administração do antigénio no mesmo sitio ou num sitio diferente. 0 i entre a administração do adjuvante e do antigénio pode variar desde aproximadamente vários minutos, até várias horas, até vários dias.

Para efeitos da presente invenção, o termo "agente patogénico" é utilizado num sentido lato para se referir a um agente causal especifico de uma doença ou patologia, e inclui qualquer agente que proporcione uma fonte de uma molécula que desencadeia uma resposta imune. Assim, os agentes patogénicos incluem, mas não estão limitados a vírus, bactérias, fungos, protozoários, parasitas, células cancerosas e outras semelhantes. Tipicamente, a resposta imune é produzida por um ou mais antigénios de péptido ou hidrato de carbono produzidos pelo agente patogénico. Os métodos para identificar os antigénios adequados, obter e preparar essas moléculas, e determinar depois as dosagens adequadas, avaliar a imunogenicidade adequada e o tratamento com esses antigénios já são bem conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Plotkin et al. (1994) Vaccines, 2nd Edition, W. B. Saunders, Philadelphia, PA. Exemplos não limitativos de fontes dos antigénios que podem ser utilizados para vacinar indivíduos vertebrados, particularmente mamíferos humanos e não humanos, incluem assim vírus, bactérias, fungos, e outros organismos patogénicos.

Os antigénios virais adequados incluem, mas não estão limitados aos obtidos ou derivados da família de vírus da hepatite, incluindo o vírus da hepatite A (VHA), o -37- vírus da hepatite B (VHB), o vírus da hepatite C (VHC), o vírus da hepatite delta (VHD), o vírus da hepatite E (VHE) e o vírus da hepatite G (VHG) . Ver, por exemplo, as publicações internacionais N°s WO 89/04669; WO 90/11089; e WO 90/14436. O genoma do VHC codifica várias proteínas virais, incluindo El e E2. Ver, por exemplo, Houghton et al. (1991) Hepatology 14:381-388. Os fragmentos genómicos contendo sequências que codificam estas proteínas, bem como fragmentos antigénicos delas, vão encontrar utilização nos presentes métodos. Analogamente, a sequência de codificação do antigénio δ de VHD é conhecida (ver, por exemplo, a patente U.S. N° 5378814).

De modo semelhante, uma grande variedade de proteínas da família do vírus do herpes pode ser utilizada como antigénios na presente invenção, incluindo as proteínas derivadas do vírus do herpes simplex (VHS) dos tipos 1 e 2, tais como as glicoproteínas gB, gD e gH de VHS-1 e VHS-2; os antigénios do vírus da varicela zoster (VVZ), o vírus de Epstein-Barr (VEB) e o citomegalovírus (CMV) incluindo gB e gH de CMV; e os antigénios de outros vírus do herpes humano tais como VHH6 e VHH. (Ver, por exemplo, Chee et al. (1990) Cytomegaloviruses (J.K. McDougall, ed., Springer-Verlag, páginas 125-169; McGeoch et al. (1988) J. Gen. Virol. 69:1531-1574; patente U.S. N° 5171568; Baer et al. (1984) Nature 310:207-211; e Davison et al. (1986) J. Gen. Virol. 67:1759-1816).

Os antigénios do vírus de imunodeficiência humana (VHI), tais como as moléculas gpl20 para um grande número de isolados de VIH-1 e incluindo os membros de vários subtipos genéticos de VIH, são conhecidos e estão descritos (ver, por exemplo, Myers et al., Los Alamos Database, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, New México (1992); e Modrow et al. (1987) J. Virol. 61:570-578) e os fragmentos genómicos que contêm o antigénio, derivados ou obtidos a partir de qualquer destes isolados vão ter -38- utilização na presente invenção. Além disso, outras proteínas imunogénicas derivadas ou obtidas a partir de qualquer dos vários isolados de VIH vão encontrar utilização aqui, incluindo os fragmentos contendo uma ou mais das várias proteínas de envelope tais como gpl60 e gp41, os antigénios de gag tais como p24gag e p55gag, bem como as proteínas derivadas das regiões pol, env, tat, vif, rev, nef, vpr, vpu e LTR de VIH.

Os antigénios derivados ou obtidos a partir de outros vírus também têm aqui utilização, tais como sem limitação, antigénios dos membros das famílias Picomaviridae (por exemplo, poliovírus, rinovírus, etc.); Caliciviridae; Togaviridae (por exemplo, vírus da rubéola, vírus do dengue, etc.); Flaviviridae; Coronaviridae; Reoviridae (por exemplo, rotavírus, etc.); Birnaviridae; Rhabdoviridae (por exemplo, o vírus da raiva, etc.); Orthomyxoviridae (por exemplo, os tipos A, B e C do vírus da gripe, etc.); Filoviridae; Paramyxoviridae (por exemplo, vírus da papeira, vírus do sarampo, vírus sincicial respiratório, vírus Parainfluenza, etc.); Bunyaviridae; Arenaviridae; Retroviridae (por exemplo, HTLV-1; HTLV-II; VIH-1 (também conhecido como HTLV-III, LAV, ARV, hTLR, etc.)), incluindo mas sem estar limitado aos antigénios dos isolados de VIHmb, VIHSF2, VIHLAV, VIHLAi, VIMN ; VIH- lcM235r VIH—lus4/ VIH-2, entre outros; o vírus da imunodeficiência do símio (VIS); Papilomavirus, os vírus de encefalite transmitidos por carraças; e outros semelhantes. Ver, por exemplo, Virology, 3rd edition (W. K. Joklik ed. 1988); Fundamental Virology, 2nd edition (B. N. Fields e D. M. Knipe, eds. 1991), para uma descrição destes e de outros vírus.

Em alguns contextos, pode ser preferível que os antigénios virais seleccionados sejam obtidos ou derivados de um agente patogénico virai que tipicamente é introduzido no corpo através de uma superfície mucosa e se sabe que -39- provoca ou está associado a uma doença humana, tais como, mas não limitados a VIH (SIDA), virus da gripe (gripe), vírus do herpes simplex (infecção genital, herpes labial, STDs), rotavírus (diarreia), virus parainfluenza (infecções respiratórias), poliovirus (poliomielite), virus sincicial respiratório (infecções respiratórias), vírus da papeira e do sarampo (papeira, sarampo), vírus da rubéola (rubéola), e rinovírus (resfriado comum).

Os fragmentos genómicos que contêm antigénios bacterianos e parasitas podem ser obtidos ou derivados dos agentes causais conhecidos responsáveis por doenças que incluem, mas não estão limitadas a difteria, tosse convulsa, tétano, tuberculose, pneumonia bacteriana ou fúngica, otite média, gonorreia, cólera, febre tifoide, meningite, mononucleose, peste, shigelose ou salmonelose, doença do legionário, doença de Lyme, lepra, malária, ancilostomíase, ancilostomíase, oncocercose, bilharziose, doença do sono, leishmaniose, giardíase, amebíase, filariose, borreliose e triquinose. Pode ainda obter-se ou derivar-se outros antigénios de vírus não convencionais tais como os agentes causais de kuru, doença de Creutzfeldt-Jakob (CJD), tremor epizoótico, encefalopatia transmissível do vison, doenças debilitantes crónicas, ou de partículas infecciosas proteináceas tais como priões que estão associados à doença das vacas loucas.

Os agentes patogénicos específicos podem incluir M. tuberculosis, Chlamydia, N. gonorrhoeae, Shigella, Salmonella, Vibrio Cholera, Ereponema pallidua, Pseudomofaas, Bordetella pertussis, Brucella, Franciscella tulorensis, Helicobacter pylori, Leptospria interrogans, Legionella pneumophila, Yersinía pestis, Streptococcus (tipos A e B) , Pneumococcus, Meningococcus, Hemophilus influenza (tipo b), Toxoplasma gondic, Complylobacteriosis, Moraxella catarrhalis, Donovanosis, e Actinomycosis; agentes patogénicos fúngicos incluindo candidíase e da -40- aspergilose; agentes patogénicos parasíticos incluindo ténias, planárias, ascarideos, amebiase, giardiase, criptosporidio, bilharziose, Pneumocystis carinii, tricomoníase e triquinose. Assim, a presente invenção também pode ser utilizada para proporcionar uma resposta imune adequada contra numerosas doenças veterinárias, tais como febres aftosas, coronavirus, Pasteurella multocida, Helicobacter, Strongylus vulgaris, Actinobacillus pleuropneumonia, virus da diarreia virai dos bovinos (BVDV), Klebsiella pneumoniae, E. coli, Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis e brochiseptica.

Em algumas formas de realização, o antigénio de interesse pode ser um alergénio. Um "alergénio" é um antigénio que pode iniciar um estado de hipersensibilidade, ou que provoca uma reacção de hipersensibilidade imediata num indivíduo já sensibilizado com o alergénio. Os alergénios são vulgarmente proteínas ou substâncias químicas ligadas a proteínas que têm a propriedade de ser alergénicas; contudo, os alergénios também podem incluir materiais orgânicos ou inorgânicos derivados de uma variedade de fontes artificiais ou naturais tais como materiais vegetais, metais, ingredientes em cosméticos ou detergentes, latexes, ou outros semelhantes. As classes de alergénios adequados para utilização nos métodos da invenção podem incluir, mas não estão limitadas a pólen, escamação de animais, ervas, bolores, poeiras, antibióticos, venenos de insectos que picam, e uma variedade de alergénios ambientais (incluindo substâncias químicas e metais), fármacos e alimentos. Os alergénios das árvores comuns incluem pólen de choupo do Canadá, choupo, freixo, bétula, bôrdo, carvalho, ulmeiro, nogueira americana e cárias; os alergénios de plantas comuns incluem os de centeio, ambrósia, tanchagem menor, azedas e amarantos; os alergénios de contacto de plantas incluem os de sumagre, hera venenosa e urtigas; os alergénios das -41- ervas comuns incluem capim rabo-de-gato, sorgo bravo, grama-das-boticas, festuca e erva-de-febra; os alergénios comuns também pode ser obtidos a partir de bolores ou fungos tais como Alternaria, Fusarium, Hormodendrum, Aspergillus, Micropolyspora, Mucor e actinomicetes termófilos; a penicilina e a tetraciclina são alérgenos antibióticos comuns; os alergénios epidérmicos podem ser obtidos a partir de poeiras domésticas ou orgânicas (tipicamente de origem fúngica), de insectos tais como ácaros (Dermatphagoides pterosinyssis), ou de fontes animais tais como penas, e escamações de gatos e cães; os alergénios comuns dos alimentos incluem leite e queijo (lácteo), ovo, trigo, frutos secos (por exemplo, amendoins), mariscos (por exemplo, crustáceos), ervilhas, feijões e alergénios de glúten; os alergénios ambientais comuns incluem os alergénios de metais (níquel e ouro), produtos químicos (formaldeído, trinitrofenol e aguarrás), látex, borracha, fibras (algodão ou lã), serapilheira, tintas para o cabelo, cosméticos, detergentes e perfumes; os alergénios de fármacos comuns incluem alergénios anestésicos locais e salicilatos; os alergénios antibióticos incluem os alergénios penicilina e sulfonamida; e os alergénios de insectos comuns incluem o veneno de abelha, vespa e formiga, e alergénios do átrio de escaravelhos. Os alergénios especialmente bem caracterizados incluem, mas não estão limitados aos epitopos principais e crípticos do alergénio de Der pi (Hoyne et al. (1994) Immunology 83190-195), fosfolipase A2 de veneno de abelha (PLA) (Akdis et al. (1996) J. Clin. Invest. 98: 16761683), alergénio de pólen de bétula Bet v 1 (Bauer et al. (1997) Clin. Exp. Immunol. 107: 536-541), e o alergénio de erva recombinante multi-epitópico rKBG8.3 (Cao et al. (1997) Immunology 90: 46-51). Estes e outros alergénios adequados estão disponíveis comercialmente e/ou podem ser prontamente preparados como extractos seguindo -42- técnicas conhecidas.

Em certas outras formas de realização, o antigénio de interesse pode ser um antigénio especifico de tumores. Para efeitos da presente invenção, os antigénios específicos de tumores incluem, mas não estão limitados a qualquer dos vários MAGEs (antigénio E associado a melanoma) , incluindo MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3 (péptido HLA-Al), MAGE 4, etc.; qualquer das várias tirosinases (péptido HLA-A2); ras mutante; p53mutante; e antigénio do melanoma p97. Outros antigénios específicos de tumores incluem o péptido Ras e o péptido p53 associado a cancros avançados, os antigénios HPV 16/18 e E6/E7 associados a cancros do colo do útero, antigénio MUC1-KLH associado ao carcinoma da mama, CEA (antigénio carcinoembrionário) associado ao cancro colorrectal, antigénios gp 100 ou MARTI associados a melanoma, e o antigénio PSA associado ao cancro da. A sequência do gene p53 é conhecida (ver por exemplo, Harris et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 4650-4656) e está depositada no GenBank com o N° de ordem M14694. Assim, as composições adjuvantes da presente invenção podem ser utilizadas para realizar métodos imunoterapêuticos para o tratamento de cancros do colo do útero, da mama, colorrectal, da próstata, do pulmão, e melanomas.

Os antigénios para utilização com a presente invenção podem ser obtidos ou produzidos utilizando uma variedade de métodos conhecidos pelos especialistas na matéria. Em particular, os antigénios podem ser isolados directamente de fontes naturais, utilizando técnicas de purificação correntes. Alternativamente, os antigénios podem ser produzidos recombinantemente utilizando técnicas conhecidas. Ver, por exemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II, III, Second Edition (1989); DNA Cloning, Vols. I, II (D. N. Glover ed. 1985). Os antigénios para utilização aqui também podem ser sintetizados, com base em sequências de -43- aminoácidos descritas, através da síntese química de polímeros tal como a síntese de péptidos em fase sólida. Esses métodos são conhecidos pelos especialistas na matéria. Ver, por exemplo, J. N. Stewart e J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chemical Co., Rockford, IL (1984) e G. Barany e R. B. Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, editors E. Gross and J. Meienhofer, Vol. 2, Academic Press, New York, (1980), páginas 3-254, para as técnicas de síntese de péptidos em fase sólida; e M. Bodansky, Principies of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Berlin (1984) e E. Gross e J. Meierhofer, Eds., The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, supra, Vol. 1, para a síntese clássica em solução.

Se desejado, as sequências de polinucleótidos que codificam os antigénios acima descritos podem ser obtidas utilizando métodos recombinantes, como o rastreio de bibliotecas de ADNc e genómicas de células que exprimem o gene, ou derivando o gene de um vector que se sabe que o inclui. Além disso, o gene desejado pode ser isolado directamente das células e tecidos que o contêm, utilizando técnicas correntes, tais como a extracção com fenol e uma PCR de ADNc ou de ADN genómico. Ver, por exemplo, Sambrook et al., supra, para uma descrição das técnicas utilizadas para obter e isolar ADN. As sequências de polinucleótidos também podem ser produzidas sinteticamente, em vez de clonadas.

Nas composições em que o componente antigénio vai ser proporcionado por meio de uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um antigénio de interesse, a sequência de codificação para o antigénio seleccionado pode ser combinada com uma ou ambas as sequências de codificação dos péptidos das subunidades de exotoxina de ADP-ribosilação para proporcionar uma única construção que tem a totalidade das três sequências codificação, combinadas -44- com uma só sequência de codificação de uma subunidade da toxina para proporcionar, por exemplo, uma composição de dois plasmideos, ou proporcionada numa construção separada de uma única construção, ou construções múltiplas que têm as sequências de codificação das subunidades da toxina. Em cada um dos casos acima referidos, o antigénio pode esta ligado operativamente e sob o controlo transcricional dos mesmos ou de diferentes elementos de controlo, por exemplo promotores e intensificadores. Nestas construções em que é utilizado um elemento de controlo único para dirigir a transcrição de duas ou mais sequências de codificação, pode ser utilizada uma sequência de local interno de entrada do ribossoma (IRES) para facilitar a transcrição das sequências múltiplas.

Administração de polinucleótidos

Os polinucleótidos (moléculas de ácidos nucleicos que contêm as sequências de codificação dos péptidos das subunidades da exotoxina de ADP-ribosilação) descritos aqui podem ser administrados por qualquer método adequado. Numa forma de realização preferida, descrita adiante, os polinucleótidos são administrados por revestimento de uma ou mais construções adequadas (por exemplo, uma ou mais construções de plasmideos de ADN) contendo as sequências de codificação dos péptidos das subunidades de exotoxina de ADP-ribosilação de interesse (e, em certas formas de realização, uma sequência de codificação de um antigénio de interesse na mesma construção ou numa construção diferente) em partículas transportadoras que formam um núcleo e depois administra-se as partículas revestidas ao indivíduo ou às células. Contudo, os polinucleótidos da presente invenção também podem ser administrados utilizando um vector virai ou utilizando sistemas não virais, por exemplo, administração de ácido nucleico nú. -45-

Vectores virais Vários sistemas de base virai foram utilizados para administração de genes. Por exemplo, os sistemas retrovirais já são conhecidos e utilizam geralmente linhas de empacotamento que têm um provirus defeituoso integrado (o "auxiliar") que exprime a totalidade dos genes do virus mas não pode empacotar o seu próprio genoma devido a uma delecção do sinal de empacotamento, conhecido como a sequência psi. Por conseguinte, a linha celular produz invólucros virais vazios. As linhas produtoras podem ser derivadas das linhas de empacotamento que, além do auxiliar, contêm um vector virai que inclui sequências necessárias em cis para replicação e empacotamento do vírus, conhecidas como as repetições terminais longas (LTRs). A ou as moléculas) de polinucleótidos de interesse podem ser inseridas no vector e empacotadas nos invólucros virais sintetizados pelo auxiliar retroviral. 0 vírus recombinante pode então ser isolado e administrado a um indivíduo. (Ver, por exemplo, patente U.S. N° 5219740). Os vectores virais representativos incluem mas não estão limitados a vectores tais como os vectores LHI, N2, INSAL, LSHL e LHL2 descritos por exemplo na patente U.S. N° 5219740, bem como os derivados destes vectores, tais como o vector N2 modificado descrito aqui. Os vectores retrovirais podem ser construídos utilizando técnicas bem conhecidas na arte. Ver, por exemplo, a Patente U.S. N° 5219740; Mann et al. (1983) Cell 33:153-159.

Foram desenvolvidos sistemas à base de adenovírus para administração de genes e são adequados para administrar as moléculas de ácidos nucleicos aqui descritas. Os adenovírus humanos são vírus de ADN de cadeia dupla, que entram nas células por endocitose mediada por receptores. Estes vírus são particularmente adequados para -46- transferência genética porque são fáceis de fazer crescer e manipular e apresentam uma ampla gama de hospedeiros in vivo e in vítro. Por exemplo, os adenovirus podem infectar células humanas de origem hematopoiética, linfóide e mielóide. Além disso, os adenovirus infectam células alvo tanto quiescentes como em replicação. Ao contrário dos retrovirus que se integram no genoma do hospedeiro, os adenovirus persistem extracromossomicamente minimizando assim o risco associado à mutagénese de inserção. 0 vírus é produzido facilmente em concentrações elevadas e é estável pelo que pode ser purificado e armazenado. Mesmo em forma competente para replicação, os adenovirus só provocam um baixo nível de morbidez e não estão associados a doenças malignas humanas. Em consequência, foram desenvolvidos vectores de adenovirus que utilizam estas vantagens. Para uma descrição de vectores de adenovirus e das suas utilizações ver, por exemplo, Haj-Ahmad e Graham (1986) J. Virol. 57:267-274; Bett et al. (1993) J. Virol. 67:5911-5921; Mittereder et al. (1994) Human Gene Therapy 5:717-729; Seth et al. (1994) J. Virol. 68:933-940; Barr et al. (1994) Gene Therapy 1:51-58; Berkner, K. L. (1988) BioTechniques 6:616-629; Rich et al. (1993) Human Gene Therapy 4:461-476.

Os vectores virais adeno-associados (AAV) também podem ser utilizados para administrar as moléculas de polinucleótidos aqui descritas. A este respeito, os vectores AAV podem ser derivados de qualquer serotipo de AAV, incluindo sem limitação AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAVX7, etc. Os vectores AAV podem ter um ou mais genes do tipo silvestre de AAV delecionados no todo ou em parte, de preferência os genes rep e/ou cap, mas retêm uma ou mais sequências de repetição de terminal invertido (ITR) de flanqueio funcional. Uma sequência de ITR funcional é em geral considerada necessária para a recuperação, replicação e empacotamento do virião de AAV. Assim, um vector AAV -47- inclui pelo menos as sequências requeridas em cis para replicação e empacotamento (por exemplo, uma ITR funcional) do virus. A ITR não precisa de ser uma sequência de nucleótido do tipo silvestre, e pode ser alterada, por exemplo, por uma inserção, deleção ou substituição de nucleótidos, desde que a sequência proporcione uma recuperação funcional, replicação e empacotamento.

Os vectores de expressão de AAV são construídos utilizando técnicas conhecidas para proporcionar pelo menos como componentes ligados operativamente na direcção da transcrição, elementos de controlo incluindo uma região de início da transcrição, o ADN de interesse e uma região de terminação da transcrição. Os elementos de controlo são seleccionados para serem funcionais numa célula de mamífero. A construção resultante que contém os componentes ligados operativamente está ligada (5' e 3') às sequências ITR do AAV. As construções de AAV adequadas podem ser concebidas utilizando técnicas bem conhecidas na arte. Ver, por exemplo, as patentes U.S. N°s 5173414 e 5139941; publicações internacionais N°s WO 92/01070 (publicada em 23 de Janeiro de 1992) e WO 93/03769 (publicada em 4 de Março de 1993); Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Cárter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Inmunol. 158:97-129; Kotin, R.M. (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Shelling e Smith (1994) Gene Therapy 1:165-169; e Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1867-1875.

Preparações Farmacêuticas Convencionais A formulação de uma preparação que compreenda moléculas de polinucleótidos da presente invenção, com ou sem adição de uma composição de antigénio, pode ser feita -48- utilizando os procedimentos químicos e as metodologias de formulação farmacêutica correntes, todas disponíveis facilmente disponíveis a um técnico com conhecimentos correntes. Por exemplo, as composições que contêm um ou mais vectores adequados podem ser combinadas com um ou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis para proporcionar uma preparação líquida.

As substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, substâncias tamponantes do pH e outras semelhantes, podem estar presentes no excipiente ou no veículo. Estes excipientes, veículos e substâncias auxiliares são geralmente agentes farmacêuticos que não induzem uma resposta imune no indivíduo que recebe a composição, e que podem ser administrados sem toxicidade indevida. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a líquidos tais como água, soro fisiológico, polietileno glicol, ácido hialurónico, glicerol e etanol. Os sais farmaceuticamente aceitáveis também podem estar aí incluídos, por exemplo, sais de ácidos minerais tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos, sulfatos, e outros semelhantes; e sais de ácidos orgânicos tais como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos, e outros semelhantes. É também preferido, embora não necessário, que as preparações contenham um excipiente farmaceuticamente aceitável que sirva como um estabilizador, particularmente para moléculas de péptido, proteína ou outras semelhantes a antigénios se forem para ser incluídas na composição de vacina. Exemplos de veículos adequados que também actuam como estabilizadores de péptidos incluem, sem limitação, qualidades farmacêuticas de dextrose, sacarose, lactose, trealose, manitol, sorbitol, inositol, dextrano, e outros semelhantes. Outros veículos adequados incluem, novamente sem limitação, amido, celulose, fosfatos de sódio ou cálcio, ácido cítrico, ácido tartárico, glicina, polietileno glicóis de peso molecular -49- elevado (PEGs), e combinações suas. Uma discussão completa de excipientes, veículos e substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis está disponível em REMINGTONS'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991), aqui incorporada por citação.

Certos facilitadores da absorção e/ou expressão de ácidos nucleicos ("agentes facilitadores da transfecção") também podem ser incluídos nas composições, por exemplo, facilitadores tais como bupivacaína, cardiotoxina e sacarose, e veículos facilitadores da transfecção tais como preparações lipossomais ou lipídicas que são utilizadas rotineiramente para administrar moléculas de ácidos nucleicos. Os lipossomas aniónicos e neutros estão amplamente disponíveis e são bem conhecidos para administrar moléculas de ácidos nucleicos (ver, por exemplo, Liposomes: A Practical Approach, (1990) RPC New Ed., IRL Press). As preparações lipídicas catiónicas também são veículos bem conhecidos para utilização na administração de moléculas de ácidos nucleicos. As preparações lipídicas adequadas incluem DOTMA (cloreto de (N-[1- (2,3-dioleíloxi)propil]-N,N,N-trimetilamónio) , disponível com o nome comercial Lipofectin™, e DOTAP (1,2-bis(oleíloxi)-3-(trimetilamónio)propano), ver, por exemplo, Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7413— 7416; Malone et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:6077-6081; patentes U.S. N°s 5283185 e 5527928, e publicações internacionais N°s WO 90/11092, WO 91/15501 e WO 95/26356. Estes lípidos catiónicos podem ser utilizados de preferência em associação com um lípido neutro, por exemplo DOPE (dioleíl fosfatidiletanolamina). Ainda outras composições facilitadoras da transfecção, que podem ser adicionadas às preparações lipossomais ou lipídicas acima referidas incluem derivados de espermina (ver, por exemplo, publicação internacional N° WO 93/18759) e compostos de permeabilização da membrana tais como GALA, granlicidina S -50- e sais biliares catiónicos (ver, por exemplo, publicação internacional N° WO 93/19768).

Alternativamente, as moléculas de ácidos nucleicos da presente invenção podem ser encapsuladas, adsorvidas em, ou associadas a veículos em partículas. Os veículos em partículas adequados incluem os derivados de polímeros de poli(metacrilato de metilo), bem como micropartículas de PLG derivadas de poli (lactidos) e poli (lactidos-co-glicolidos). Ver, por exemplo, Jeffery et al. (1993) Pharm. Res. 10:363-368. Podem também ser utilizados outros sistemas e polímeros em partículas, por exemplo, polímeros tais como polilisina, poliarginina, poliornitina, espermina, espermidina, bem como os conjugados destas moléculas.

As composições formuladas vão assim tipicamente incluir uma ou mais moléculas de polinucleótidos (por exemplo, o vector de plasmídeo) que contém as sequências de codificação dos péptidos das subunidades de exotoxina de ADP-ribosilação seleccionados numa quantidade suficiente para adjuvantar uma resposta imunológica contra um antigénio co-administrado. Uma quantidade eficaz apropriada pode ser determinada facilmente por um especialista na matéria. Essa quantidade vai estar numa gama relativamente ampla que pode ser determinada através de ensaios de rotina. Por exemplo, o efeito adjuvante adequado pode ser obtido com tão pouco como 0,1 pg de ADN, enquanto que noutras administrações, pode utilizar-se até 2 mg de ADN. Espera-se em geral que uma dose eficaz dos polinucleótidos que contêm as sequências de codificação dos péptidos das subunidades da exotoxina ribosilante do ADP de interesse, estejam dentro da gama de cerca de 1 pg a 1000 pg, contudo também se pode verificar que vão ser eficazes doses acima e abaixo desta gama. As composições podem conter assim de cerca de 0,1% a cerca de 99,9% das moléculas de polinucleótidos. -51-

Administração_de_Preparações_Farmacêuticas

Convencionais A administração das preparações farmacêuticas descritas anteriormente pode ser efectuada numa dose, de modo continuo ou intermitente do principio ao fim do regime de tratamento. Isto é, uma vez formuladas adequadamente, as composições da presente invenção podem ser administradas a um individuo in vivo utilizando uma variedade de vias e técnicas conhecidas. Por exemplo, as preparações liquidas podem ser proporcionadas como uma solução, suspensão ou emulsão injectável e administradas por injecção parentérica, subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa, utilizando uma seringa e agulha convencional, ou utilizando um sistema de injecção de jacto de liquido. As preparações liquidas também podem ser administradas topicamente na pele ou tecido mucoso, ou proporcionadas como um pulverizado finamente dividido para administração respiratória ou pulmonar. Outros modos de administração incluem administração oral, supositórios, e técnicas de administração transdérmica activas ou passivas.

Alternativamente, as composições podem ser administradas ex vivo, por exemplo já são conhecidas a administração e reimplante das células transformadas num individuo (por exemplo, a transfecção mediada por dextrano, a precipitação com fosfato de cálcio, electroporação, e microinjecção directa em núcleos) . Contudo, a administração mais tipicamente será através de agulha e seringa convencionais para as composições liquidas e para as suspensões liquidas que contêm as composições em partículas. Os métodos de determinação dos meios e doses mais eficazes de administração são bem conhecidos pelos especialistas na matéria e vão variar com o veiculo de administração, a composição da terapêutica, as células -52- alvo, e o indivíduo a ser tratado. Podem ser feitas administrações únicas ou múltiplas com um nível da dose e padrão que são seleccionados pelo médico assistente. Deve entender-se que mais do que uma região de codificação da subunidade e/ou uma região de codificação do antigénio podem ser transportadas por uma única construção do vector de polinucleótido. Alternativamente, vectores separados (por exemplo, vectores virais, plasmídeos, ou qualquer combinação sua), exprimindo cada um deles um ou mais péptidos e/ou antigénios das subunidades da toxina derivada de qualquer agente patogénico, também podem ser administrados a um indivíduo tal como aqui descrito.

Além disso, também se pretende que os polinucleótidos administrados pelos métodos da presente invenção sejam combinados com outras composições e terapêuticas adequadas. Por exemplo, para aumentar mais uma resposta imune num indivíduo, as composições e métodos aqui descritos podem ser combinados com a administração de substâncias auxiliares (por exemplo, outros adjuvantes), tais como agentes farmacológicos, citoquinas, ou outras semelhantes. As substâncias auxiliares podem ser administradas, por exemplo, como proteínas ou outras macromoléculas ao mesmo tempo, antes, ou depois da administração das moléculas de polinucleótidos aqui descritas. As composições de moléculas de ácidos nucleicos também podem ser administradas directamente ao indivíduo ou, alternativamente, administradas ex vivo, a células derivadas do indivíduo, utilizando os métodos conhecidos pelos especialistas na matéria.

Partículas revestidas

Numa forma de realização as construções de polinucleótido que contêm as sequências de codificação dos péptidos das subunidades de exotoxina de ADP-ribosilação -53- seleccionados, e outros componentes auxiliares (tais como as sequências de codificação de um ou mais antigénios) são administrados utilizando partículas transportadoras. Os métodos de administração mediados por partículas para administrar essas preparações de ácidos nucleicos já são conhecidos na arte. Por conseguinte, uma vez preparadas e purificadas adequadamente, as construções do vector do plasmídeo descritas anteriormente podem ser revestidas nas partículas transportadoras (por exemplo, partículas transportadores que formam um núcleo) utilizando uma variedade de técnicas conhecidas na arte. As partículas transportadoras são seleccionadas de materiais que têm uma densidade adequada na gama de tamanhos de partícula utilizados tipicamente para administração intracelular a partir de um dispositivo de administração de partículas apropriado. 0 tamanho óptimo das partículas transportadoras vai depender, é claro, do diêmetro das células alvo.

Para efeitos da presente invenção, pode utilizar-se partículas transportadoras que formam um núcleo compostas por tungsténio, ouro, platina e irídio. São preferidas as partículas de tungsténio e de ouro. As partículas de tungsténio estão disponíveis facilmente em tamanhos médios de 0,5 a 2,0 pm de diâmetro. Embora essas partículas tenham uma densidade óptima para utilização em métodos de administração de partículas, e permitam um revestimento altamente eficiente com o ADN, o tungsténio pode ser potencialmente tóxico para certos tipos de células. Em consequência, as partículas de ouro ou o ouro microcristalino (por exemplo, o pó de ouro A1570, disponível de Engelhard Corp., East Newark, NJ) também encontram utilização com os presentes métodos. As partículas de ouro proporcionam uniformidade de tamanho (disponíveis de Alpha Chemicals em tamanhos de partícula de 1 a 3 pm, ou disponíveis de Degussa, South Plainfield, NJ numa gama de tamanhos de partícula incluindo 0,95 pm) e -54- toxicidade reduzida. São conhecidos e já foram descritos vários métodos para o revestimento ou precipitação do ADN ou ARN em partículas de ouro ou de tungsténio. A maioria desses métodos combina geralmente uma quantidade predeterminada de ouro ou de tungsténio com o ADN do plasmideo, CaCl2 e espermidina. A solução resultante é agitada em vortex continuamente durante o procedimento de revestimento para assegurar a uniformidade da mistura de reacção. Após a precipitação do ácido nucleico, as partículas revestidas podem ser transferidas para membranas adequadas e deixa secar antes da utilização, são revestidas em superfícies de um módulo ou cassete de amostra, ou carregadas numa cassete de administração para utilização num dispositivo de administração de partículas adequado.

Os antigénios peptídicos também podem ser revestidos nas mesmas partículas transportadoras que formam um núcelo ou noutras semelhantes. Por exemplo, os péptidos podem ser ligados a uma partícula transportadora simplesmente misturando os dois componentes numa proporção predeterminada empiricamente, por precipitação com sulfato de amónio ou outros métodos de precipitação com solvente conhecidos pelos especialistas na matéria, ou por acoplamento químico do péptido à partícula transportadora. 0 acoplamento dos resíduos de L-cisteína a ouro foi descrito anteriormente (Brown et al., Chemical Society Reviews 9:271-311 (1980). Outros métodos poderiam incluir, por exemplo, a dissolução do péptido em etanol absoluto, água, ou uma mistura de álcool/agua, adição da solução a uma quantidade de partículas transportadoras, e secando depois a mistura sob uma corrente de ar ou de azoto gasoso enquanto se agita em vortex. Alternativamente, o antigénio pode ser seco sobre as partículas transportadoras por centrifugação em vácuo. Uma vez secas, as partículas revestidas podem ser ressuspensas num solvente adequado -55- (por exemplo, acetato de etilo ou acetona), e trituradas (por exemplo, por sonicação) para proporcionar uma suspensão substancialmente uniforme. As partículas transportadoras revestidas com o antigénio podem então ser combinadas com partículas transportadoras que formam um núcleo que têm a ou as construções dos péptidos das subunidades da exotoxina de ADP-ribosilação e administradas num único passo de injecção de partículas, ou administradas separadamente a partir das composições das subunidades da toxina.

Administração de Partículas Revestidas A seguir à sua formação, as partículas transportadoras que formam um núcleo revestidas com as preparações de ácidos nucleicos da presente invenção, sós ou em associação, por exemplo, com preparações de antigénio, são administradas a um indivíduo utilizando técnicas de administração mediadas por partículas. Vários dispositivos de administração de partículas adequados para as técnicas de administração mediadas por partículas são conhecidos na arte, e são todas adequados para utilização na prática da invenção. Os desenhos dos dispositivos correntes utilizam uma descarga explosiva, eléctrica ou gasosa, para impulsionar as partículas transportadoras que formam um núcleo, revestidas, até às células alvo. As partículas revestidas podem elas próprias estar fixadas de forma libertável a uma folha transportadora amovível; ou fixadas de forma removível a uma superfície ao longo da qual passa um caudal de gás, levantando as partículas da superfície e acelerando-as na direcção do alvo. Um exemplo de um dispositivo de descarga gasosa está descrito na patente U.S. N° 5204253. Um dispositivo do tipo explosivo está descrito na patente U.S. N° 4945050. Um exemplo de um aparelho de aceleração de -56- partículas do tipo de descarga eléctrica está descrito na patente U.S. N° 5120657. Outro aparelho de descarga eléctrica adequado para utilização aqui está descrito na patente U.S. N° 5149655. As descrições de todas estas patentes são aqui dadas como integralmente incorporadas por citação.

As partículas revestidas são administradas ao indivíduo que vai ser tratado de uma maneira compatível com a formulação de dosagem, e numa quantidade que será eficaz para produzir o efeito adjuvante/resposta imune desejada. A quantidade de composição que vai ser administrada, que no caso das moléculas de ácidos nucleicos está geralmente na gama de 0,001 a 1000 pg, mais tipicamente 0,01 a 10,0 pg da molécula de ácido nucleico por dose, e no caso das moléculas de péptidos ou proteínas é de 1 pg a 5 mg, mais tipicamente 1 a 50 pg de péptido, depende do indivíduo a ser tratado. A quantidade exacta necessária vai variar dependendo da idade e estado general do indivíduo que é imunizado e da sequência de nucleótidos específica ou péptido seleccionado, bem como de outros factores. Uma quantidade eficaz apropriada pode ser determinada facilmente por um especialista na matéria por leitura da presente especificação.

Composições em Partículas

Alternativamente, os polinucleótidos que transportam as sequências de codificação dos péptidos das subunidades da exotoxina de ADP-ribosilação seleccionados, bem como uma ou mais porções do antigénio seleccionado, podem ser formulados como uma composição em partículas. Mas especificamente, a formulação de partículas que compreendem uma ou mais moléculas de polinucleótido pode ser feita utilizando substâncias químicas e metodologias de formulação farmacêutica correntes, de que todas estão -57- facilmente disponíveis a um técnico com uma experiência razoável. Por exemplo, uma ou mais construções de vectores e/ou componentes de antigénios podem ser combinados com um ou mais excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis para proporcionar uma composição de vacina. As substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emulsionantes, substâncias tamponantes do pH e outras semelhantes, podem estar presentes no excipiente ou no veículo. Estes excipientes, veículos e substâncias auxiliares são geralmente agentes farmacêuticos que não induzem uma resposta imune no indivíduo que recebe a composição, e que podem ser administrados sem toxicidade indevida. Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados a líquidos tais como água, soro fisiológico, polietileno glicol, ácido hialurónico, glicerol e etanol. Os sais farmaceuticamente aceitáveis também podem estar aí incluídos, por exemplo, sais de ácidos minerais tais como cloridratos, bromidratos, fosfatos, sulfatos, e outros semelhantes; e sais de ácidos orgânicos e veículos adequados que também actuam como estabilizadores de péptidos incluem, sem limitação, qualidades farmacêuticas de dextrose, sacarose, lactose, trealose, manitol, sorbitol, inositol, dextrano, e outros semelhantes. Outros veículos adequados incluem, novamente sem limitação, amido, celulose, fosfatos de sódio ou cálcio, ácido cítrico, ácido tartárico, glicina, polietileno glicóis de peso molecular elevado (PEGs), e combinações suas. Uma discussão completa de excipientes, veículos e substâncias auxiliares farmaceuticamente aceitáveis está disponível em REMINGTONS'S PHARMACEUTICAL SCIENCES (Mack Pub. Co., N.J. 1991).

As composições formuladas vão incluir uma quantidade dos polinucleótidos que codificam os péptidos das subunidades da toxina que é suficiente para proporcionar o efeito adjuvante desejado contra um -58- antigénio co-administrado, como se definiu anteriormente. Uma quantidade eficaz apropriada pode ser determinada facilmente por um especialista na matéria. Essa quantidade vai cair numa gama relativamente ampla, geralmente na gama de cerca de 0,001 pg a cerca de 25 mg ou mais da construção de ácido nucleico de interesse, e as quantidades adequadas especificas podem ser determinadas através de ensaios de rotina. As composições podem conter de cerca de 0,1% a cerca de 99,9% da ou das moléculas de ácidos nucleicos. Se um componente de antigénio estiver incluido na composição, ou se os métodos forem utilizados para proporcionar uma composição do antigénio em partículas, o antigénio estará presente numa quantidade adequada tal como descrito anteriormente. As composições são então preparadas como partículas utilizando técnicas correntes, tais como por evaporação simples (secagem ao ar), secagem em vácuo, secagem por atomização, secagem por congelação (liofilização), secagem por atomização com liofilização, revestimento por pulverização, precipitação, formação de partículas em fluidos supercríticos, e outras semelhantes. Se desejado, as partículas resultantes podem ser densificadas utilizando as técnicas descritas na publicação internacional N° WO 97/48485 da mesma requerente.

Os recipientes de dose unitária individual ou multidose, em podem estar empacotadas as partículas antes da utilização, podem compreender o recipiente selado hermeticamente que contém uma quantidade adequada das partículas que compreendem uma construção de ácidos nucleicos adequada e/ou um antigénio seleccionado (por exemplo, para proporcionar uma composição de vacina de componentes múltiplos). As composições em partículas podem ser embaladas como uma formulação estéril, e o recipiente selado hermeticamente pode ser assim concebido para preservar a esterilidade da formulação até à sua utilização nos métodos da invenção. Se desejado, os recipientes podem -59- ser adaptados para uso directo num dispositivo de administração de partículas. Esses recipientes podem tomar a forma de cápsulas, bolsas de folha de alumínio, saquetas, cassetes, e outras semelhantes. Os dispositivos de administração de partículas apropriados (por exemplo, seringas sem agulha) são aqui descritos. 0 recipiente no qual são embaladas as partículas pode ainda ser rotulado para identificar a composição e proporcionar informação relevante sobre a dosagem. Além disso, o recipiente pode ser rotulado com um aviso na forma prescrita por uma agência governamental, por exemplo a Food and Drug Administration, em que o aviso indica a aprovação pela agência ao abrigo da Lei Federal do fabrico, utilização ou venda do adjuvante, antigénio (ou composição de vacina) ali contido para administração humana.

As composições em partículas podem então ser administradas utilizando uma técnica de administração transdérmica. De preferência, as composições em partículas vão ser administradas por meio de um método de injecçâo de pós, por exemplo, administradas a partir de um sistema de seringa sem agulha como os descritos nas publicações internacionais N°s WO 94/24263, WO 96/04947, WO 96/12513, e WO 96/20022 da mesma requerente. A administração de partículas a partir desses sistemas de seringa sem agulha é tipicamente realizado com partículas que têm um tamanho aproximado que varia geralmente de 0,1 a 250 pm, de preferência que variam desde cerca de 10-70 pm. As partículas superiores a cerca de 250 pm também podem ser administradas a partir dos dispositivos, sendo o limite superior o ponto em que o tamanho das partículas poderia provocar danos indesejados nas células da pele. A distância real que as partículas administradas vão penetrar numa superfície alvo depende do tamanho da partícula (por exemplo, o diâmetro nominal da partícula pressupondo que a geometria da partícula é -60- aproximadamente esférica), a densidade da partícula, a velocidade inicial à qual a partícula impacta a superfície, e a densidade e viscosidade cinemática do tecido da pele alvo. A este respeito, as densidades óptimas das partículas para utilização em injecção sem agulha geralmente varia entre cerca de 0,1 e 25 g/cm3, de preferência entre cerca de 0,9 e 1,5 g/cm3, e as velocidades de injecção geralmente variam entre cerca de 100 e 3.000 m/s, ou mais. Com pressão de gás apropriada, as partículas que têm um diâmetro médio de 10-70 μπι podem ser aceleradas através do bico a velocidades que se aproximam das velocidades supersónicas de um fluxo de gás impulsor.

As composições que contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz das moléculas em pó aqui descritas podem ser administradas a qualquer tecido alvo adequado por meio dos dispositivos de administração de partículas descritos anteriormente. Por exemplo, as composições podem ser administradas ao músculo, pele, cérebro, pulmão, fígado, baço, medula óssea, timo, coração, nódulos linfáticos, sangue, cartilagem óssea, pâncreas, bexiga urinária, estômago, intestino, testículos, ovário, útero, recto, sistema nervoso, olho, glândulas e tecidos conjuntivos. Para as moléculas de ácido nucleicos, a administração é de preferência a, e as moléculas são expressas em, células diferenciadas terminalmente; contudo, as moléculas também podem ser administradas a células não diferenciadas, ou parcialmente diferenciadas tais como as células estaminais de sangue e fibroblastos da pele.

Se desejado, estes sistemas de seringa sem agulha podem ser proporcionados em estado pré-carregado que contém uma dosagem adequada das partículas que compreendem as sequências de codificação dos péptidos das subunidades da exotoxina de ADP-ribosilação de interesse. A seringa carregada pode ser embalada num recipiente hermeticamente selado, que pode ser adicionalmente rotulado como descrito -61- anteriormente.

Assim, o método pode ser utilizado para obter partículas de ácido nucleico que têm um tamanho que varia de cerca de 10 a cerca de 250 pm, de preferência de cerca de 10 a cerca de 150 pm, e mais preferencialmente de cerca de 20 a cerca de 60 pm; e uma densidade das partículas que 3 varia de cerca de 0,1 a cerca de 25 g/cm , e uma densidade 3 aparente de cerca de 0,5 a cerca de 3,0 g/cm , ou mais.

Analogamente, pode obter-se partículas de antigénios seleccionados que têm um tamanho que varia de cerca de 0,1 a cerca de 250 pm, de preferência de cerca de 0,1 a cerca de 150 pm, e mais preferencialmente de cerca de 20 a cerca de 60 pm; uma densidade das partículas que varia 3 de cerca de 0,1 a cerca de 25 g/cm , e uma densidade aparente de preferência de cerca de 0,5 a cerca de 3,0 3 g/cm , e mais preferencialmente de cerca de 0,8 a cerca de 1,5 g/cm3.

Melhoramento das Respostas Imunes

Noutra forma de realização da invenção, é proporcionado um método para melhorar uma resposta imune contra um antigénio de interesse. Na essência, o método implica (a) administrar o antigénio de interesse a um indivíduo; (b) proporcionar uma composição adjuvante de acordo com a presente invenção, em que a referida composição contém uma ou mais moléculas de ácidos nucleicos que contêm as sequências de codificação seleccionadas dos péptidos das subunidades da exotoxina de ADP-ribosilação e (c) co-administrar a composição adjuvante ao indivíduo, com o que os péptidos das subunidades da toxina são expressos a partir das respectivas sequências de codificação numa quantidade suficiente para produzir uma resposta imune melhorada contra o antigénio co-administrado. Tal como aqui -62- descrito acima em pormenor, as sequências de codificação são ligadas operativamente às mesmas ou diferentes sequências reguladoras para proporcionar uma ou mais cassetes de expressão. Estas cassetes de expressão são depois proporcionadas num vector adequado, por exemplo uma construção do vector do plasmideo ou um vector virai.

Num aspecto, o método implica a administração da composição de polinucleótidos a um indivíduo utilizando as técnicas correntes de administração de genes que são conhecidas na arte. Ver, por exemplo, as patentes U.S. N°s 5399346, 5580859, 5589466. Tipicamente, a composição de vacina de polinucleótidos é combinada com um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável para proporcionar uma preparação líquida (tal como aqui descrito acima) e depois utilizada como uma solução, suspensão ou emulsão injectável para administração por injecção por via parentérica, subcutânea, intramuscular, intravenosa, utilizando uma agulha e seringa convencional, ou utilizando um sistema de injecção de jacto de líquido. É preferido que a composição seja administrada na pele ou no tecido das mucosas do indivíduo. As preparações líquidas também podem ser administradas topicamente na pele ou no tecido das mucosas, ou proporcionadas como um pulverizado finamente dividido, adequado para administração respiratória ou pulmonar. Outros modos de administração incluem a administração oral, supositórios, e técnicas de administração transdérmica activas ou passivas. As composições de polinucleótidos podem ser administradas alternativamente ex vivo a células provenientes do indivíduo, após o que as células são reimplantadas no indivíduo. Por introdução no indivíduo, a sequência de ácidos nucleicos é expressa para proporcionar os péptidos das subunidades da exotoxina de ADP-ribosilação in situ numa quantidade suficiente para melhorar uma resposta imune contra o antigénio co-administrado no indivíduo vacinado. Esta resposta imune melhorada pode ser -63- caracterizada como uma resposta humoral melhorada (anticorpo), uma resposta celular melhorada (CTL), ou ser caracterizada como melhoradora das respostas tanto humoral como celular contra o antigénio co-administrado.

Em certas formas de realização preferidas, a resposta imune melhorada é caracterizada como uma resposta imune semelhante a Thl (celular) aumentada contra o antigénio co-administrado, em vez de uma resposta semelhante a Th2. A este respeito, a resposta imune semelhante a Thl aumentada pode ser qualificada por um ou mais dos seguintes: concentrações incrementadas de interferão-γ que produz os linfócitos T auxiliares CD4' e/ou CTLs de CD8-; uma actividade aumentada de CTL especifica para o antigénio; de concentrações aumentadas dos anticorpos específicos para o antigénio da subclasse associada tipicamente a imunidade celular (por exemplo, IgG2a) . É preferido que as composições adjuvantes de polinucleótidos da presente invenção sejam administradas em forma de partículas. Por exemplo, as composições podem ser administradas utilizando um dispositivo de administração de partículas tal como aqui descrito anteriormente em pormenor. Em certas formas de realização, as composições de polinucleótidos podem ser revestidas em partículas transportadoras do núcleo utilizando uma variedade de técnicas conhecidas na arte e administradas utilizando um método de administração mediado por partículas. As partículas transportadoras são seleccionadas de materiais que têm uma densidade adequada na gama de tamanhos de partículas utilizados tipicamente para administração intracelular a partir de um dispositivo de administração de partículas. 0 tamanho óptimo das partículas transportadoras vai, é claro, depender do diâmetro das células alvo.

Estes métodos podem alternativamente ser modificados por co-administração de componentes adicionais -64- ou auxiliares ao indivíduo. Por exemplo, pode ser administrada uma composição de vacina secundária, em que a composição secundária pode compreender uma vacina de ácido nucleico, ou uma composição de vacina secundária pode compreender uma vacina convencional tal como um vírus inteiro, vírus fraccionado, ou vacina subunitária. A composição de vacina secundária pode ser combinada com as composições dos péptidos das subunidades de exotoxina de ADP-ribosilação do polinucleótido, ou uma composição de vacina secundária pode ser administrada separadamente no mesmo sítio ou num sítio diferente, quer simultaneamente, sequencialmente, ou separada por um período de tempo significativo tal como num passo de reforço alguns dias depois de ter sido administrada a composição inicial.

Como anteriormente, a composição de vacina secundária e/ou outro componente auxiliar podem ser administrados por injecção utilizando uma seringa convencional, ou utilizando um sistema de administração mediado por partículas também tal como descrito anteriormente. A administração vai ser tipicamente por via subcutânea, epidérmica, intradérmica, intramucosa (por exemplo, nasal, rectal e/ou vaginal), intraperitoneal, intravenosa, oral ou intramuscular. Outros modos de administração incluem a administração tópica, oral e pulmonar, supositórios e aplicações transdérmicas. 0 tratamento da dosagem pode ser um programa de dose única ou um programa de doses múltiplas.

Parte Experimental A seguir estão exemplos de formas de realização específicas para realização da presente invenção. Os exemplos são apresentados apenas para fins ilustrativos, e não têm a intenção de limitar o âmbito da presente invenção por qualquer forma. -65-

Foram feitos esforços para assegurar a exactidão relativamente aos números utilizados (por exemplo, quantidades, temperaturas, etc.), mas deve admitir-se algum erro e desvio experimental

Exemplo 1

Desenvolvimento de Vectores de Expressão que Codificam as Subunidades A e B de CT.

Utilizou-se ADN genómico de Vibrio cholerae como um molde para as reacções em cadeia e polimerase (PCR) para gerar fragmentos de ADN que contêm as sequências de codificação de ambas as subunidades A e B da toxina da cólera (CT) . Para a geração por PCR do fragmento que codifica a subunidade A (CTA), utilizou-se os seguintes iniciadores oligodesoxirribonucleótidos:

Iniciador 1: 5'-GGA GCT AGC AAT GAT GAT AAG TTA TAT CGG-3' (SEQ ID NO: 7); e

Iniciador 2: 5-CCT GGA TCC TCA TAA TTC ATC CTT AAT TCT-3' (SEQ ID NO: 8).

Para facilitar a inserção no vector de expressão, os Iniciadores 1 e 2 contêm sequências adicionais nas suas extremidades 5' (fora da região de homologia para a sequência de codificação de CTA) que incluem sitios de reconhecimento para NheI e BamRI, respectivamente. Os iniciadores 1 e 2 foram concebidos para conduzir à geração por PCR de um fragmento da sequência de codificação da subunidade A começando na posição 164 do nucleótido e terminando na posição 886 do nucleótido (N° de ordem do GenBank #D30053). Esta região abrange a sequência de -66- codificação completa para o péptido da subunidade A matura mas não inclui a sequência que codifica o péptido de sinal bacteriano encontrado no terminal amino do péptido da pré-subunidade A.

Para a geração por PCR do fragmento que codifica a subunidade B (CTB), foram utilizados os seguintes iniciadores oligodesoxirribonucleótidos:

Iniciador 3: 5'-GGA GCT AGC ACA CCT CAA AAT ATT ACT GAT-3' (SEQ ID NO: 9); e

Iniciador 4: 5'-CCT GGA TCC TTA ATT TGC CAT ACT AAT TGC-3' (SEQ ID NO: 10).

Para facilitar a inserção no vector de expressão, os iniciadores 3 e 4 contêm sequências adicionais nas suas extremidades 5' (fora da região de homologia da sequência de codificação de CTB) que incluem sítios de reconhecimento de NheI e BamEI, respectivamente. Os iniciadores 3 e 4 foram concebidos para conduzir à geração por PCR de um fragmento da sequência de codificação da subunidade B começando na posição 946 do nucleótido e terminando na posição 1257 do nucleótido (Número de ordem do GenBank #D30053) . Esta região abrange a sequência de codificação completa do péptido da subunidade B matura mas não inclui a sequência que codifica o péptido de sinal bacteriana encontrado no terminal amino do péptido da pré-subunidade B.

Para além das duas reacções de PCR descritas acima, foi efectuada uma terceira reacção de PCR para gerar uma sequência de codificação de uma forma modificada da subunidade A de CT em que foi eliminado o motivo KDEL de quatro aminoácidos C-terminal. Esta reacção envolveu a -67- utilização do Iniciador 1 (SEQ ID NO:7) e o seguinte iniciador:

Iniciador 5: 5-CCT GGA TCC TCA AAT TCT ATT ATG TGT ATC-3' (SEQ ID NO: 11).

Todas as reacções de PCR foram efectuadas utilizando Pfu Turbo ADN polimerase (obtida de Stratagene, La Jolla, CA) juntamente com o tampão de reacção de PCR fornecido pelo fabricante. As condições de PCR foram as seguintes: 95 °C durante 2 minutos, 30 ciclos de (95 °C durante 1 minuto, 55 °C durante 2 minutos e 15 segundos, 72 °C durante 1 minuto), 72 °C durante 5 minutos, e manutenção a 4 °C.

Depois de completadas as reacções de PCR, os fragmentos sintetizados de novo foram digeridos com enzimas de NheI e BamEI para gerar extremidades coesivas, e os fragmentos individuais foram inseridos no vector de expressão pWRG7054 segmentado com NheI e BamEI resultando nos seguintes clones: pPJV2002, pPJV2003 e pPJV2006 que codificam CTA, CTB, e CTA modificado (menos KDEL), respectivamente. O vector de clonagem original pWRG7054 contém o promotor inicial imediato do citomegalovirus humano com a sequência do intrão A associada. Além disso, a sequência de codificação do péptido de sinal do activador do plasminogénio de tecidos humano está incluída em pWRG7054 para permitir a secreção por células de mamífero de qualquer proteína cuja sequência de codificação é inserida no sítio Nhe 1 na grelha de leitura apropriada. (Ver, por exemplo, Chapman et al. (1991) Nuc. Acids Res. 19:3979-3986, e Burke et al. (1986), J. Biol. Chem. 261:12574-12578).

Os mapas de restrição e as sequências completas dos -68- plasmídeos pPJV2002, pPJV2003 e pPJV2006 estão apresentados nas Figuras 1, 2, e 3, respectivamente.

Exemplo 2

Desenvolvimento de Vectores de Expressão que Codificam as Subunidades A e B de Enterotoxina Termolábil de E. coli. 0 ADN genómico da estirpe E078:H11 de E. coli (American Type Culture Collection #35401) foi utilizado como um molde para as reacções em cadeia de polimerase para produzir fragmentos de ADN que contêm as sequências de codificação de ambas as subunidades A e B da enterotoxina termolábil (LT). Para a produção por PCR do fragmento que codifica a subunidade A, utilizou-se os seguintes dois iniciadores oligodesoxirribonucleótidos:

Iniciador 6: 5' -GGAGCT AGC AAT GGC GAC AAA TTA TAC CGT-3' 15 (SEQ ID NO:12); e

Iniciador 7: 5'-CCT GGA TCC TCA TAA TTC ATC CCG AAT TCT-3' (SEQ ID NO:13).

Para facilitar a inserção no vector de expressão, os iniciadores 6 e 7 contêm sequências adicionais nas suas extremidades 5' (fora da região de homologia para a sequência de codificação de LTA) que incluem sítios de reconhecimento de Nhel e BamRl, respectivamente. Os iniciadores 6 e 7 foram concebidos para conduzir à produção por PCR de um fragmento da sequência de codificação da subunidade A com início na posição 145 do nucleótido e terminando na posição 867 do nucleótido da sequência encontrada na base de dados do GenBank (número de ordem #AB011677). Esta região abrange a sequência de codificação -69- completa do péptido da subunidade A matura mas não inclui a sequência que codifica o péptido do sinal bacteriano encontrado no terminal amino do péptido da pré-subunidade A.

Para a produção por PCR do fragmento que codifica a subunidade B, foram utilizados os seguintes iniciadores oligodesoxirribonucleótidos:

Iniciador 8: 5'-GGA GCT AGO GCT CCC CAG TCT ATT ACA GAA-3' (SEQ ID NO:14); e

Iniciador 9: 5'-0CT GGA TCC CTA GTT TTC CAT ACT GAT TGC-3' (SEQ ID NO:15).

Para facilitar a inserção no vector de expressão, os iniciadores 8 e 9 contêm sequências adicionais nas suas extremidades 5' (fora da região de homologia da sequência de codificação de LTB) que incluem sítios de reconhecimento para NheI e BamEI, respectivamente. Os iniciadores 8 e 9 foram concebidos para levar à produção por PCR de um fragmento da sequência de codificação da subunidade B com início na posição 927 do nucleótido e terminando na posição 1238 do nucleótido da sequência encontrada na base de dados do GenBank (Número de acesso #AB011677). Esta região abrange a sequência de codificação completa do péptido da subunidade B matura mas não inclui a sequência que codifica o péptido do sinal bacteriano encontrado no terminal amino do péptido da pré-subunidade B.

Além das duas reacções de PCR descritas anteriormente, foi realizada uma terceira reacção de PCR para produzir uma sequência de codificação de uma forma modificada da subunidade A de LT em que foi eliminado o motivo RDEL de quatro aminoácidos C-terminal. Esta reacção -70- envolve a utilização do iniciador 6 (SEQ ID NO:12) e o seguinte iniciador:

Iniciador 10: 5'-CCT GGA TCC TCA AAT TCT GTT ATA TAT GTC-3' (SEQ ID NO:16).

Todas as reacções de PCR foram efectuadas utilizando uma ADN polimerase Pfu Turbo (obtida de Stratagene, La Jolla, CA) juntamente com o tampão da reacção de PCR fornecido fabricante. As condições de PCR foram como se segue: 95 °C durante 2 min, 30 ciclos de (95 °C durante 1 min, 55 °C durante 2 min 15 s, 72 °C durante 1 min), 72 °C durante 5 min, e manutenção a 4 °C.

Depois de completadas as reacções de PCR, os fragmentos sintetizados de novo foram digeridos com Nhel e BamHI para gerar extremidades coesivas e os fragmentos individuais foram inseridos no vector de expressão pWRG7054 clivado com Nhel e BamHI resultando nos clones pPJV2004, pPJV2005, e pPJV2007 que codificam LTA, LTB, e LTA modificado (menos RDEL), respectivamente.

Os mapas de restrição e as sequências completas dos plasmideos pPJV2004, pPJV2005, e pPJV2007 estão apresentados nas Figuras 4, 5 e 6, respectivamente.

Exemplo 3

Melhoramento da Resposta do Anticorpo Específica para o Antigénio de uma Vacina de ADN Utilizando Vectores Plasmídicos que Codificam CTA e/ou CTB.

Um vector de vacina de ADN que codifica a proteína M2 do vírus da gripe A foi utilizado para testar os efeitos adjuvantes dos vectores adjuvantes pPJV2002, pPJV2003, e -71- pPJV2006 no contexto da vacinação com ADN mediada por partículas. A vacinação com ADN mediada por partículas foi efectuada por precipitação do vector da vacina de ADN e de M2, com ou sem as diversas combinações dos vectores adjuvantes pPJV2002, pPJV2003, e pPJV2006, sobre partículas microscópicas de ouro e acelerando as partículas de ouro revestidas para a epiderme de murganhos utilizando o dispositivo de administração de partículas PowderJect® XR-1 (PowderJect Vaccines, Inc. Madison, WI).

Mais particularmente, a sequência do segmento #7 de ARN (que codifica a proteína M2) da estirpe A/Kagoshima/10/95 do vírus da GRIPE (H3N2) foi utilizada como um modelo para conceber iniciadores de PCR para facilitar a clonagem da sequência de codificação de M2 matura a partir de A/Sydney/5/97 (H3N2). A sequência de A/Kagoshima foi utilizada para conceber o iniciador uma vez que a sequência do segmento 7 do ARN de A/Sydney não foi ainda determinada. Esperava-se que o elevado grau de conservação entre as sequências de M2 facilitasse a utilização de iniciadores concebidos a partir de uma estirpe virai diferente.

Uma vez que M2 é traduzida de um ARN excisado, considerou-se necessário que as posições 27 a 714 do nucleótido na região de codificação do ARN do segmento 7 fossem excisadas. Em consequência, foi produzido e concebido um conjunto de iniciadores de PCR para gerar a sequência de codificação de M2 completa mas assegurar que o intrão foi eliminado de forma limpa do clone da sequência de codificação de M2 resultante. Os iniciadores de PCR utilizados para gerar o clone da sequência de codificação de M2 de comprimento total foram os seguintes:

Iniciador 11: 5'-CCC AAG CTT CCA CCA TGA GCC TTC TAA CCG -72- AGG TCG AAA CAC CTA TCA GAA ACG AAT GGG AGT GC-3' (SEQ ID NO:17); e

Iniciador 12: 5'-CCC GGA TCC TTA CTC CAG CTC TAT GCT G-3' (SEQ ID NO:18). O iniciador 11 (SEQ ID NO:17) contém sequências adicionais na sua extremidade 5' que incluem um sitio de reconhecimento de HindiII e uma sequência consenso de Kozac para facilitar a iniciação da tradução de ARNm. Além disso, o iniciador 12 (SEQ ID NO: ) contém sequências adicionais na sua extremidade 5' que incluem uma sequência de reconhecimento de Bamhl. 0 ARN virai foi isolado de uma amostra de A/Sydney/5/97 (H3N2) que se fez crescer em ovos de galinha embrionados. 0 processo de isolamento do ARN virai utilizou técnicas correntes conhecidas pelos especialistas na matéria. 0 ARN deste vírus foi utilizado numa reacçâo em cadeia de polimerase/transcriptase inversa (RT-PCR) utilizando um kit de RT-PCR obtido de Stratagene (La Jolla, CA). 0 passo de reacção de RT foi completado por adição de 5,9 pL de água isenta de RNase a um tubo de reacção. A este tubo adicionou-se 1,0 pL de tampão 10X MMLV-RT e 1,0 pL da mistura de dNTP do kit. Além disso, adicionou-se 1 pL de ARN de A/Sydney/5/97 e 0,6 pL (0,6 pg) do iniciador 11 (SEQ ID NO:17). A reacção foi aquecida a 65 °C durante 5 minutos para desnaturar o ARN, após o que se adicionou 0,5 pL da transcriptase inversa do kit. A reacçâo foi incubada a 37 °C durante 15 minutos para complementar o passo de transcrição inversa.

O passo de reacção de PCR foi completado pela adição dos seguintes componentes a um novo tubo de reacção: 40 pL de água; 5 pL de tampão ultra HF 10X do kit, 1,0 pL -73- da mistura de dNTP do kit; 1,0 pL do iniciador 11 (SEQ ID NO:17) (l.Ollg); 1,0 pL do iniciador 12 (SEQ ID NO:18) (1,0 pg) ; 1,0 μL da mistura de reacção da transcriptase inversa referida acima, e 1 pL da Turbo PFU polimerase do kit. A reacção de PCR foi realizada utilizando o seguinte esquema de incubação: 1 minuto a 95 °C, seguido por 30 ciclos de (30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 46 °C, 3 min a 68 °C) , seguido por 10 minutos a 68 °C. Os produtos de PCR foram submetidos a electroforese em gel de agarose a 2% que revela uma única banda de ADN com o tamanho esperado de aproximadamente 300 pb. A banda de aproximadamente 300 pb foi isolada do gel e digerida com HindIII e BamRI para gerar as extremidades coesivas necessárias para a inserção no vector de expressão da vacina de ADN pWRG7077 (Schmaljohn et al. (1997) J. Virol. 71:9563-9569). O ADN de pWRG7077 foi digerido parcialmente com HindIII e completamente com BamRI para facilitar a inserção do suplemento de codificação de M2. O requisito de uma digestão de HindIII parcial do vector foi devido à presença de um segundo sitio HindIII no marcador de resistência a Kanamicina deste plasmideo. O vector da vacina de ADN de M2 resultante foi designado pM2-FL. O vector pM2-FL contém o promotor inicial imediato do citomegalovirus humano (hCMV) e sua sequência do intrão A associado para activar a transcrição a partir da sequência de codificação de M2. Este vector também inclui uma sequência de poliadenilação do gene da hormona de crescimento bovina. O plasmideo de pM2-FL foi então precipitado em partículas de ouro de 2 micrometros como um vector único, ou vector misto mais amostras de vector adjuvante (isto é, o vector plasmídico M2 foi combinado com os vectores adjuvantes pPJV2002, pPJV2003, e/ou pPJV2006). -74-

Especificamente, o ADN do plasmídeo (o vector de M2 único ou vector de M2 mais um ou mais vectores adjuvantes) foi misturado com partículas de ouro de 2 micrometros (Degussa, Lote 65-0) num tubo de centrífuga pequeno contendo 400 pL de espermidina 15 mM. A proporção de ADN para ouro variou de 2,5 pg de ADN por mg de ouro a 4,0 pg de ADN por mg de ouro, e um lote individual continha 26 mg de ouro. O ADN foi precipitado sobre as partículas de ouro por adição de 1/10 do volume de CaCl2 a 10% durante a agitação contínua do tubo sobre num misturador rotativo. Os complexos de ADN-ouro foram lavados três vezes com etanol puro, e depois foram injectadas num tubo TEZFEL® (McMaster-Carr) alojado numa máquina de revestimento de tubos rotativos (PowderJect Vaccines, Inc., Madison WI) que reveste o interior do tubo com o complexo de ouro/ADN. Esta máquina de tubos rotativos está descrita na patente US N° 5733600. Ver também o pedido de patente PCT N° PCT/US95/00780 e as patentes US N°s 5780100; 5865796 e 5584807. Depois de completado o procedimento de revestimento, os tubos foram cortados em "cartuchos" com 0,5 polegadas adequados para carregar num dispositivo de administração de partículas.

As seguintes formulações de ADN-ouro foram produzidas para um ensaio do adjuvante de vacina de ADN em murganhos.

Formulação #1: vector de ADN de pM2-FL só, 2,5 pg de ADN por mg de ouro, 0,5 mg de ouro por cartucho;

Formulação #2: vector de ADN de pM2-FL precipitado num lote de ouro (2 pg de ADN de pM2-FL por mg de ouro) , vectores de ADN de pPJV2002, e pPJV2003, coprecipitados sobre um segundo lote de ouro (1,75 pg de cada vector adjuvante de ADN por mg de ouro) , os lotes de ouro foram misturados igualmente, 0,5 mg de ouro por cartucho; -75-

Formulação #3: vector de ADN de pM2-FL, vectores de ADN de pPJV2002, e pPJV2003, todos coprecipitados sobre um só lote de ouro (2 pg de ADN de pM2-FL por mg de ouro, e 1 pg de cada um de pPJV2002 e pPJV2003 por mg de ouro), 0,5 mg de ouro por cartucho;

Formulação #4: vector de ADN de pM2-FL, vectores de ADN de pPJV2006, e pPJV2003, todos coprecipitados sobre um só lote de ouro (2 pg de ADN de pM2-FL por mg de ouro, e 1 pg de cada um do ADN de pPJV2006 e pPJV2003 por mg de ouro), 0,5 mg de ouro por cartucho;

Formulação #5: vector de ADN de pM2-FL e pPJV2002 coprecipitados sobre um só lote de ouro (2 pg de ADN de pM2-FL por mg de ouro, e 1 pg de ADN de pPJV2002 por mg de ouro), 0,5 mg de ouro por cartucho.

Formulação #6: vector de ADN de pM2-FL, e pPJV2003 coprecipitados sobre um só lote de ouro (2 pg de ADN de pM2-FL por mg de ouro, e 1 pg de ADN de pPJV2003 por mg de ouro), 0,5 mg de ouro por cartucho.

Estas formulações de vacina de ADN foram então administradas a seis grupos de murganhos como se segue. Cada grupo experimental continha 7 animais e cada animal recebeu duas imunizações com a formulação respectiva com um período de descanso de 4 semanas entre as imunizações. Cada imunização consistiu em duas administrações em série na epiderme abdominal (um cartucho por administração) utilizando o dispositivo de administração de partículas PowderJect® XR-1 (PowderJect Vaccines, Inc. Madison, WI) a uma pressão de hélio de 400 psi. Amostras de soro foram colhidas 4 semanas após a imunização primária (imediatamente antes do reforço) e duas semanas depois da -76- segunda imunização ou imunização de reforço.

As amostra de soro individuais foram ensaiadas quanto às respostas do anticorpo especifico de M2 utilizando um ensaio ELISA em que placas com 96 poços foram pré-revestidas com um péptido sintético M2 que consiste na sequência seguinte: SLLTEVETPIRNEWECR (SEC ID NO:19). As placas de ELISA foram revestidas com o péptido M2 de um dia para o outro a 4 °C utilizando o péptido em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) numa concentração de 1 pg/mL. No dia seguinte, as placas foram bloqueadas com leite em pó magro a 5% em PBS durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram depois lavadas três vezes com tampão de lavagem (soro fisiológico tamponado com Tris 10 mM, Brij-35 a 0,1%). As amostras de soro diluidas foram então adicionadas aos poços e as placas foram incubadas durante 2 horas à temperatura ambiente. As placas foram lavadas três vezes com tampão de lavagem e adicionou-se 100 pL de um anticorpo secundário e as placas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente. O anticorpo secundário consistiu num anticorpo marcado com biotina de cabra anti-IgG de murganho (H+L) (Southern Biotechnology) que foi diluído 1:8000 em BSA a l%/PBS/Tween-20 a 0,1%. As placas foram então lavadas três vezes, e adicionou-se um conjugado de estreptavidina-peroxidase de rábano (Southern Biotechnology) diluído 1:8000 em PBS/Tween-25 a 0,1% e a placa foi incubada durante 1 hora à temperatura ambiente. Após três lavagens adicionais, adicionou-se 100 pL do substrato TMB (Bio Rad, Hercules, CA) e deixou-se que o desenvolvimento de cor decorresse durante 30 minutos à temperatura ambiente. O desenvolvimento de cor foi parado pela adição de H2S04 1 N e as placas foram lidas a 450 nm. As concentrações das diluições no ponto final foram determinadas por identificação da diluição mais elevada do soro que ainda produziu um valor de absorvência que era -77- duas vezes o valor da absorvência de fundo obtido utilizando uma amostra de controlo não imune.

As concentrações do anticorpo do ponto final para os animais individuais em cada grupo e as médias geométricas das concentrações para cada grupo experimental estão apresentadas no Quadro 1 a seguir.

Quadro 1

Formulação # Concentrações individuais Média geométrica da concentração 1 24.300 24.300 72.900 218.700 218.700 218.700 218.700 99.781 2 72.900 72.900 218.700 218.700 218.700 656.100 186.934 3 24.300 72.900 72.900 218.700 656.100 656.100 656.100 186.934 4 24.300 218.700 656.100 350.211 -78- 656.100 656.100 656.100 656.100 656.100 5 72.900 218.700 218.700 218.700 656.100 656.100 262.645 6 24.300 72.900 218.700 218.700 1.968.300 1.968.300 5.904.900 409.722 * (morreu)

Como se pode observar, todos os grupos experimentais imunizados com uma formulação contendo um ou mais dos vectores adjuvantes que codificam CT (Formulações #2-6) apresentaram uma média geométrica da concentração aumentada após a imunização de reforço em relação aos animais de controlo imunizados só com o vector M2 (Formulação #1).

Exemplo 4

Melhoramento das Respostas Celulares Específicas de Antigénios a uma Vacina de ADN que Codifica os Antiqénios de Superfície da Hepatite B (HBsAq) Utilizando os Vectores Plasmídicos Adjuvantes que Codificam os Péptidos das

Subunidades CT-A e CT-B. -79-

Foi construído um plasmídeo do vector dos antigénios de superfície da hepatite B (HBsAg) como se segue. Para produzir a região de codificação de HBsAg, a construção ρΑΜβ (obtida de American Type Culture Collection "ATCC") foi cortada com Ncol e tratada com uma nuclease de feijão mungo para remover o codão de partida do antigénio X. 0 ADN resultante foi então cortado com BarriRI e tratado com T4 ADN polimerase para introduzir extremidades rombas no ADN e criar uma cassete de expressão de HBsAg. A cassete de expressão de HBsAg está presente no fragmento de 1,2 kB. A construção plasmídica pPJV7077 (Schmaljohn et al. (1997) J. Virol. 71:9563-9569) que contém o promotor inicial imediato de CMV humano de comprimento total (estirpe Towne) (com intensificador) foi cortada com HindIII e BglII, e depois tratada com T4 ADN polimerase e fosfatase alcalina de vitelo para criar ADN com extremidades rombas, e z cassete de expressão de HBsAg foi ligada ao plasmídeo para a construção pWRG7128. 0 plasmídeo pWRG7128 foi precipitado em partículas de ouro seguindo o procedimento descrito no Exemplo 3 acima, utilizando novamente 2 pg de ADN por mg de ouro. Os vectores plasmídicos adjuvantes que exprimem os genes das subunidades CTA e CTB (pPJV2002 e pPJV2003, respectivamente) foram misturados um com o outro e precipitados em partículas de ouro estando cada plasmídeo presente a 1 pg de ADN por mg de ouro de tal modo que a quantidade total também era de 2 pg de ADN por mg de ouro. As partículas de ouro revestidas com pWRG7128 e as revestidas com pPJV2002 e pPJV2003 foram misturadas 1:1 e depois carregadas num tubo TEFZEL® tal como acima. Para imunização, comprimentos de 0,5 polegadas de tubo que representam 1 pg de ADN (0,5 pg de plasmídeo pWRG7128 e 0,25 pg de cada um dos plasmídeos pPJV2002 e pPJV2003) -80- foram administrados na epiderme de murganhos Balb/c utilizando o dispositivo de administração de partículas PowderJect® XR-1 utilizando as mesmas condições de administração descritas acima no Exemplo 3. Para os controlos, os murganhos foram imunizados com partículas de ouro revestidas só com pWRG7128 (1 pg de ADN/0,5 mg de ouro por administração). Os murganhos (4 por grupo experimental) foram imunizados e receberam um reforço às 4 semanas, depois foram sacrificados às 2 semanas após o reforço. As respostas imunes foram avaliadas para verificar os níveis de anticorpos séricos por ELISA. Além disso, as respostas imunes celulares foram determinadas utilizando um ensaio ELISPOT para quantificar a secreção de IFN-γ específica de CD8 .

Amostras de soro de murganhos individuais foram ensaiadas quanto aos anticorpos específicos de HBsAg utilizando um ensaio ELISA. Para o ELISA, placas de microtitulação Falcon Pro Bind foram revestidas de um dia para o outro a 4 °C com HBsAg purificado (BioDesign) a 0,1 mg por cavidade em PBS (soro fisiológico tamponado com fosfato, BioWhittaker). As placas foram bloqueadas durante 1 hora à temperatura ambiente (TA) com leite seco a 5%/PBS e depois lavadas 3 vezes com tampão de lavagem (soro fisiológico tamponado com Tris 10 mM, Brij-35 a 0,1%), e as amostras de soro diluídas em tampão de diluição (leite seco a 2%/PBS/Tween 20 a 0,05%) foram adicionadas à placa e incubadas durante 2 horas à TA. As placas foram lavadas 3 vezes e adicionou-se à placa um anticorpo de cabra anti-murganho biotinilado (Southern Biotechnology) diluído 1:8000 em tampão de diluição e incubou-se durante 1 hora à TA. Após a incubação, as placas foram lavadas 3 vezes, após o que se adicionou um conjugado de estreptavidina-peroxidase de rábano (Southern Biotechnology) diluído 1:8000 em PBS e a placa foi incubada durante mais 1 hora à -81- TA. Após três lavagens adicionais, as placas foram lavadas 3 vezes, depois adicionou-se uma solução do substrato TMB (BioRad) e a reacção foi parada com H2S04 1 N após 30 minutos. A densidade óptica foi lida a 450 nm. As concentrações no ponto final foram calculadas por comparação das amostras com um padrão de concentração conhecida.

Para os ensaios imunes celulares, suspensões de células individuais de esplenócitos dos baços dos animais imunizados foram cultivadas in vitro na presença de um péptido correspondente a um epitopo de CD8 conhecido em murganhos Balb/c. O péptido foi dissolvido em DMSO (10 mg/mL) e diluído para 10 pg/mL em cultura. A sequência do péptido era IPQSLDSWWTSL (SEQ ID NO:20).

Para os ensaios ELISPOT para IFN-γ, as placas de filtração por membrana Multiscreen da Millipore foram revestidas com 50 pL de 15 pg/mL de anti-soro anti-IFN-γ (Pharmingen) em tampão de carbonato 0,1 M estéril (pH 9,6) de um dia para o outro a 4 °C. As placas foram lavadas 6 vezes com PBS estéril e depois bloqueadas com o meio de cultura de tecidos que contém soro fetal de bovino (FBS) a 10% durante 1-2 h à TA. 0 meio foi removido e as células de 6 baço distribuídas pelos poços com um total de 1x10 células por poço. Para os poços a que foram adicionadas menos de 6 1x10 células dos animais imunizados, as células de animais nunca antes submetidos à experiência foram utilizadas para 6 levar o total a 1x10 . As células foram incubadas de um dia para o outro numa incubadora de cultura de tecidos na presença do péptido tal como descrito acima. As placas foram então lavadas 2 vezes com PBS e 1 vez com água destilada. Isto foi seguido por 3 lavagens com PBS. Adicionou-se um anticorpo monoclonal anti IFN-γ biotinilado -82- (Pharmingen) à placa (50 pL de uma solução de 1 pg/mL em PBS) e incubado durante 2 horas à TA. As placas foram lavadas 6 vezes com PBS após o que se adicionou 50 pL de um conjugado de estreptavidina-fosfatase alcalina (1:1000 em PBS, Pharmingen) e incubou-se durante 2 horas à TA. As placas foram lavadas 6 vezes com PBS e adicionou-se um substrato corado da fosfatase alcalina (BioRad) e deixou-se que a reacção decorresse até aparecerem manchas escuras. A reacção foi parada por lavagem com água 3 vezes. As placas foram secas ao ar e as manchas contadas ao microscópio.

Para os ensaios de ELISA para IFN-γ, as células foram cultivadas de um dia para o outro em placas de cultura de tecidos com 96 poços de fundo redondo na presença do péptido. As amostras do sobrenadante foram colhidas e utilizadas para a determinação dos níveis de IFN-γ. Placas de fixação elevada (Costar) foram revestidas com 100 pL de 0,5 pg/mL de anticorpo anti-IFN-γ de murganho (Pharmingen) em tampão de bicarbonato pH 9,6. As placas foram bloqueadas durante 1 h à TA com meio de cultura de tecidos contendo FBS a 10% e depois lavadas 3 vezes com um tampão de lavagem de TBS. Amostras do sobrenadante obtidas das células cultivadas foram diluídas em meio de cultura de tecidos e aplicadas na placa e incubadas durante 2 h à TA. As placas foram lavadas 3 vezes com tampão de lavagem e um anticorpo secundário (0,5 pg/mL de anti-IFN-γ de murganho de rato biotinilado em PBS, Pharmingen) foi adicionado às placas e incubadas durante 1 h à TA. As placas foram lavadas 3 vezes, e adicionou-se um conjugado de estreptavidina-peroxidase de rábano (1:2000 em PBS, Southern Biotechnology) durante 1 h à TA. As placas foram lavadas 3 vezes, depois adicionou-se uma solução do substrato TMB (BioRad) e a reacção foi parada com H2SO4 1 N. A densidade óptica foi lida a 450 nm. -83-

Os resultados de ELISA são apresentados a seguir no Quadro 2.

Quadro 2

Formulação Concentrações individuais Concentrações médias pWRG7128 40.000 55.000 84.000 41.000 54.000 pWRG7128, 28.000 23.000 pPJV2002 e 14.000 pPJV2003 27.000 23.000

Como se pode observar, verificou-se que os níveis de anticorpo nos murganhos de controlo imunizados só com pWRG7128 são mais elevados do que nos imunizados com pWRG7128 em associação com os vectores adjuvantes de CT (pPJV2002 e pPJV2003). A concentração média do ponto final para os animais de controlo foi de 55.000, enquanto que a concentração média nos animais imunizados com a formulação adjuvante foi de 23.000. Contudo, o grupo que recebeu a formulação adjuvantada realmente recebeu 1/2 da quantidade de pWRG7128 que os controlos, o que pode explicar a redução das concentrações de anticorpo.

As respostas imunes celulares medidas nos dois grupos de murganhos indicaram um melhoramento significativo das respostas celulares pelos vectores adjuvantes de CT. Mais especificamente, os resultados do ensaio de ELISA para lFN-γ específico para CD8 estão apresentados a seguir no Quadro 3. -84-

Quadro 3 ELISA para IFN-γ Formulação Número de células/poço pWRG7128 1,0 x 10° 0,5 x 10° 0,1 x 10° 0, 77 0,213 0,001 0,828 0,121 0,027 1,35 0,312 0,006 1,25 0,323 0,007 (Média) 1,05 0,242 0,01 pWRG7128, pPJV2002 e pPJV2003 1,96 1,19 0,079 2,30 1,70 0,263 2,20 1,83 0,377 2,44 2,33 0,898 (Média) ττη Γ775 0,404

Neste ensaio de ELISA para IFN-γ, o número de células por poço representa o número de células recuperadas dos animais imunizados aplicadas em placas por poço. 0 número de células por poço é constante (por exemplo, 1 x 106) e é suplementado com células de animais não anteriormente submetidos a experiências. Os valores são as leituras da OD medidas a 450 nm. Os valores da OD mais elevados no ELISA encontrados para as células de murganhos tratadas com a formulação adjuvante de CT são indicativos de uma quantidade maior de IFN-γ segregada por estas células em resposta ao antigénio. As células de animais não anteriormente submetidos a experiências não deram um valor de OD mensurável no ELISA para IFN-γ.

Os resultados do ensaio ELISPOT para IFN-γ especifico para CD8 são apresentados a seguir no Quadro 4.

Quadro 4 -85- ELISPOT para IFN-γ Formulação Número de células positivas/1 x 10° células pWRG728 510 410 530 590 (Média) 5ϊΰ pWRG7128, 1.480 pPJV2002, e 2.300 PPJV2003 2.500 3.500 (Média) 2.445

Neste ensaio de ELISPOT para IFN-γ, os números são a média de poços em duplicado e correspondem ao número de células positivas por 1 x 106 células. As células dos murganhos que não foram anteriormente submetidos a experiências não produziram quaisquer manchas neste ensaio ELISPOT. Além disso, o maior o número de ELISPOTs encontradas nos animais tratados com a formulação adjuvante de CT indica uma resposta superior quando se compara com os animais que receberam só o antigénio (pWRG7128).

Os dados apresentados acima demonstram que as novas composições adjuvantes da presente invenção têm uma aptidão potente para melhorar as respostas imunes celulares a um a um antigénio co-administrado, neste caso um HBsAg expresso a partir de uma vacina de ADN.

Exemplo 5

Melhoramento das Respostas Imunes Humoral e Celular ao Antigénio qp!20 de VIH-1 Utilizando a Administração -86-

Simultânea de um Vector do Antigénio de gp!20 e dos Vectores Adjuvantes de CTA/CTB.

Um vector plasmídico que codifica gpl20 de VIH-1 foi construído como se segue. 0 vector foi construído partindo de um suporte do plasmídeo Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA), o promotor inicial imediato do citomegalovírus humano (hCMV) (Fuller et al. (1994) Aids Res. Hum Retroviruses 10:1433) e o sítio de poliadenilação final do vírus SV40. O promotor hCMV está contido num fragmento AccII de 619 pares de bases (pb) que se estende 522 pb a montante e 96 pares de bases a jusante do sítio de início da transcrição inicial imediata. A sequência de poliadenilação final do vírus SV40 está contida num fragmento de BamHI-BglII de 800 pb derivado de pSV2dhfr (anteriormente disponível de Bethesda Research Laboratories, catálogo #5369 SS) . Inicialmente, foi construído um plasmídeo que codifica gpl60 de VIH-1, designado "pC-Env". Este plasmídeo contém um fragmento Kpnl-Xhol de 2565 pb de LAV-Ibru (N° de ordem do ATCC 53069, N° de ordem do GenBank K02013), que começa na sequência que codifica a posição #4 dos aminoácidos do terminal amino de gpl60 maturo. O fragmento da sequência de codificação env foi colocado imediatamente a jusante, e fundido em grelha com um fragmento sintético de 160 pb que codifica o péptido de sinal da glicoproteína D (gD) do vírus do herpes simplex e nenhuns aminoácidos do terminal amino de gD matura tal como descrito (Fuller et al. (1994) Aids Res. Hum Retroviruses 10:1433). O plasmídeo que codifica gpl20 de VIH-1, aqui designado "pCIA-Env/T", foi depois construído como se segue. O plasmídeo pCIA-Env/T codifica uma forma truncada de gpl60 de VIH-1, e é idêntico à construção pC-Env excepto que as sequências de codificação de env estão truncadas no -87- sítio HindlII na posição 8188 do nucleótido. Isto resulta num produto de tradução de gp 160 truncado com o ponto de truncagem residente nos residuos do aminoácido 128 a jusante do sitio de processamento de gp 120/gp41.

Um segundo vector do plasmídeo que codifica VIH-1 rev, aqui designado "pC-rev", foi construído como se segue. Este vector contém três regiões descontínuas do provírus LAV-Ibru (posições 678-1085, 5821-6379 e 8188-8944 do nucleótido) colocadas directamente entre o promotor de hCMV e a sequência de poliadenilação final do vírus SV40 tal como descrito anteriormente. As três regiões descontínuas contêm o doador de excisão 5' principal, o primeiro exão do gene rev e o segundo exão do gene rev, respectivamente.

Uma terceira construção de vector plasmídico designada 'pWRG7054" foi utilizada como um controlo do vector vazio no estudo. A construção pWRG7054 contém uma região de codificação SIV nef, o promotor de hCMV imediatamente inicial com a região do Intrão A, uma sequência líder de TPA e a sequência de poliadenilação da hormona do crescimento bovina. A construção do plasmídeo pWRG7054 está aqui descrita adiante no Exemplo 6.

As seguintes formulações de ADN-ouro foram produzidas para um ensaio de adjuvante de vacina de ADN em murganhos.

Formulação #1: Controlo do vector vazio (pWRG7054 sem a inserção gpl20), 2,5 pg de ADN por mg de ouro, 0,5 mg de ouro por cartucho;

Formulação #2: Controlo do vector vazio (pWRG7054), o vector de ADN de gpl20 (pCIA-EnvT) , e o vector de ADN de rev (pC-rev) (para permitir a expressão da molécula de -88- gpl20 de VIH-1), todos coprecipitados num único lote de ouro (1,25 pg de cada um de ADN de pWRG7054 e ADN de pCIA-EnvT por mg de ouro, e 0,125 pg de pC-rev por mg de ouro), 0,5 mg de ouro por cartucho;

Formulação #3: Controlo do vector vazio (pWRG7054), os vectores de ADN de CTA (pPJV2002) e de CTB (pPJV2003) todos coprecipitados num único lote de ouro (1,25 pg de ADN de pWRG7054 por mg de ouro e 1 pg de cada um de pPJV2002 e pPJV2003 por mg de ouro), 0,5 mg de ouro por cartucho;

Formulação #4: O vector de ADN de gpl20 (pCIA-EnvT), o vector de ADN de VIH-1 rev (pC-rev), os vectores de CTA (pPJV2002) e de CTB (pPJV2003) todos coprecipitados num único lote de ouro (1,25 pg de ADN de pCIA-EnvT por mg de ouro, 0,125 pg de ADN de pC-rev por mg de ouro, e 1 pg de cada um do ADN de pPJV2002 e de pPJV2003 por mg de ouro), 0,5 mg de ouro por cartucho;

Formulação #5: O vector de ADN de gpl20 (pCIA-EnvT) , o vector de ADN de VIH-1 rev (pC-rev), os vectores de ADN de CTA -KDEL (pPJV2006) e de CTB (pPJV2003) todos coprecipitados num único lote de ouro (1,25 pg de ADN de pCIA-EnvT por mg de ouro, 0,125 pg de ADN de pC-rev por mg de ouro, e 1 pg de cada um do ADN de pPJV2006 e de pPJV2003 por mg de ouro), 0,5 mg de ouro por cartucho.

Os vectores plasmidicos pWRG7054, pCIA-EnvT, pC-rev, pPJV2002, pPJV2003, e pPJV2006 foram precipitados em partículas de ouro seguindo os procedimentos descritos no Exemplo 3 acima, utilizando de novo 2 pg de ADN por mg de ouro. As partículas de ouro revestidas foram carregadas num tubo TEZFEL®, utilizando novamente os procedimentos descritos no Exemplo 3 acima. Para imunização, dois comprimentos de 0,5 polegadas de tubo foram utilizados para -89- administrar uma carga total de 1,0 mg de ouro na epiderme de murganhos Balb/c fêmeas com 5-6 semanas utilizando um dispositivo de administração de partículas funcionando nas mesmas condições de administração que as descritas acima no Exemplo 3 (400 psi de hélio).

Cada um dos cinco grupos experimentais (um por cada formulação de vacina de ADN) consistiu em 4 animais, e cada animal recebeu imunizações primária e de reforço com as suas respectivas formulações, sincronizadas às 0 e 5 semanas. Cada imunização consistiu em duas administrações em série na epiderme abdominal (um cartucho por administração) utilizando um dispositivo de administração de partículas PowderJect® XR-1 (PowderJect Vaccines, Inc. Madison, WI).

As respostas do anticorpo do soro ao antigénio gpl20 de VIH foram testadas utilizando um ensaio de ELISA em espécimes colhidos na semana 5 e na semana 6,5 (após a imunização pri9mária e após o reforço, respectivamente). Para o ELISA, placas EIA de fixação elevada da Costar foram revestidas com 0,3 pg/poço do gpl20 de VIH recombinante (Intracel) em 50 pL de PBS por incubação de um dia para o outro a 4 °C. As placas foram lavadas três vezes e bloqueadas com BSA a 2% durante 2 horas à temperatura ambiente. As diluições em série do soro foram adicionadas às placas revestidas, e incubadas a 37 °C durante uma hora. Após a lavagem, as placas foram incubadas com uma diluição 1:1500 de fosfatase alcalina conjugada com anti-IgG de murganho de cabra (H+L) (BioRad), seguida pelo desenvolvimento de cor com fosfato de p-nitrofenilo (PNPP) (BioRad) e leitura da OD a 405 nm.

Os resultados de ELISA estão apresentados na Figura 7. Como se pode observar, houve um aumento de -90- aproximadamente 20 vezes das respostas imunes específicas para gpl20 nos grupos que receberem vectores adjuvantes (Formulação #4 contendo os vectores pPJV2002 e pPJV2003, ou Formulação #5 contendo os vectores pPJV2006 e pPJV2003) em associação com o vector gpl20 em comparação com o grupo que recebeu o vector gpl20 sem adjuvante (Formulação #2, pClA-EnvT).

Após a recolha de amostras do soro depois do reforço, os animais foram sacrificados e foram recolhidos os baços de cada murganho. Os esplenócitos foram isolados por trituração dos baços, fazendo passar as células através de um tamiz celular de 70 pm, e lisando os eritrócitos com um tampão de lise ACK (BioWhittaker). Os esplenócitos foram lavados três vezes com RPMI-FCS a 5% e ressuspensos numa 7 concentração de 1 x 10 células/mL em RPMI-FCS a 10% suplementado com antibióticos, piruvato de sódio, aminoácidos não essenciais. A quantidade de lFN-γ específica para o antigénio segregada pelos esplenócitos foi determinada utilizando um ELISA in situ. As placas de fixação elevada da Costar foram revestidas com 10 pg/mL de anticorpo monoclonal de captura anti-IFN-gama de murganho (mPAB) (Pharmingen, San Diego, CA) em 50 pL de tampão de bicarbonato 0,1 M (pH 9,6). Depois da incubação de um dia para o outro a 4 °C, os poços foram lavados 5 vezes com PBS-Tween 20 a 0,05% e bloqueados com 200 pL de meio R10 completo à temperatura ambiente durante 2 horas. 1 x 106 esplenócitos foram adicionados a cada poço e foram estimulados só em meio (controlo negativo) , ou em meio com 1 pg/mL de um péptido gpl20 de VIH que tem a seguinte sequência: RIQRGPGRAFVITGK (SEQ ID NO: 21) . Após 24 horas de incubação a 37 °C em CO2 a 5%, as placas foram lavadas 2 vezes com água desionizada (Dl) para -91- lisar as células, depois lavadas 3 vezes com PBS-Tween 20 a 0,05%, e incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com 50 pL por poço de 1 pg/mL de mAb de detecção de IFN-γ anti-murganho biotinilado (Pharmingen). As placas foram então lavadas 5 vezes e incubadas durante 1 hora com 50 pL por poço de uma diluição 1:8000 de solução de estreptavidina-peroxidase de rábano (HRP) (Southern Biotechnology). As placas foram novamente lavadas 5 vezes e o desenvolvimento colorimétrico foi efectuado pela adição do substrato TMB (BioRad, Hercules, CA) durante 30 minutos à temperatura ambiente. A reacção foi parada pela adição de ácido sulfúrico 1 N. A absorvência a 450 nm foi lida com um leitor de placas óptico.

Os resultados deste estudo estão apresentados na Figura 8. Esta Figura mostra o nivel relativo da produção de IFN-γ especifico para o antigénio nos 5 diferentes grupos de teste da vacina que recebem as formulações descritas acima (Formulações # 1-5). O que é importante, os dois grupos de imunização que receberam o vector gpl20 (pCIA-EnvT) em associação com os vectores adjuvantes de CT (isto é, a Formulação #4 que contém os vectores pPJV2002 e pPJV2003, e a Formulação #5 que contém os vectores pP072006 e pPJV2003) apresentaram níveis de produção de IFN-γ significativamente mas elevados de que o grupo de gpl20 sem adjuvante (a Formulação #2 que contém o controlo do vector vazio e pCIA-EnvT) , (P < 0, 000001 e P = 0, 0068, respectivamente) . Estes dados demonstram a aptidão das presentes associações adjuvantes do vector de CT para aumentar acentuadamente a imunidade celular específica para o antigénio para um antigénio de VIH num modelo animal.

Para além de um aumento do nível de produção de IFN-γ, o número de esplenócitos específicos para o péptido gpl20 de VIH que segregam IFN-γ também foi acentuadamente -92- aumentado, como determinado por um método ELISPOT. No ensaio ELISPOT, as placas de nitrocelulose (Millipore) foram revestidas com um anticorpo de captura de IFN-γ, lavadas, e bloqueadas tal como descrito anteriormente para ELISA in situ de IFN-γ das células auxiliares T. Os esplenócitos foram fixados a poços pré-revestidos com um número de células de entrada de 1 x 106 células/poço, e estimuladas em meio só (controlo negativo) ou num meio que contém 1 pg/mL de um péptido que contém o epitopo CTL de gpl20 de VIH imunodominante e que tem a seguinte sequência: RGPGRAFVTI (SEQ ID NO:22). As placas foram incubadas durante 24 horas a 37 °C em CO2 a 5%, lavadas 2 vezes com água Dl, 3 vezes com PBS, e incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com 50 pL por poço de 1 pg/mL de mAb de detecção de IFN-γ anti-murganho biotinilado (Pharmingen). As placas foram então lavadas 5 vezes e incubadas durante 1 hora com 50 pL por poço de uma diluição 1:1000 de solução de estreptavidina-fosfatase alcalina (ALP) (Mabtech). As placas foram lavadas novamente 5 vezes e o desenvolvimento colorimétrico foi efectuado pela adição do substrato da membrana ALP (BioRad, Hercules, CA) até se formarem manchas (2-30 minutos, temperatura ambiente). A reacção foi parada por lavagem com água Dl, e as placas foram secas com ar de um dia para o outro. As manchas foram contadas ao microscópio 40X. Só as manchas grandes com bordos felpudos foram pontuadas como células que formam manchas ("spot forming cells", SFC) .

Os resultados deste ensaio ELISPOT estão apresentados na Figura 9 que mostra os niveis relativos de esplenócitos produtores de IFN-γ nos 5 diferentes grupos de teste da vacina (que receberam as formulações #1-5, respectivamente) . O que é importante, os dois grupos de imunização que receberam o vector gpl20 em associação com -93- os vectores adjuvantes de CT (isto é, a Formulação #4 que contém os vectores pPJV2002 e pPJV2003 e a Formulação #5 que contém os vectores pPJV2006 e pPJV2003) apresentaram números significativamente mais elevados de células produtoras de IFN-γ do que o grupo de gpl20 sem adjuvante (Formulação #2 que contém o controlo do vector vazio e pCIA-EnvT), (P < 0, 000001 e P = 0,0032, respectivamente) . Estes dados demonstram a capacidade das presentes associações de adjuvante de CT de aumentar acentuadamente a imunidade celular especifica para o antigénio contra um antigénio gpl20 de VIH co-administrado num modelo animal. Além disso, a produção aumentada de IFN-γ observada nestes estudos indica que a utilização das associações do vector adjuvante de CT da presente invenção proporciona uma resposta imune robusta semelhante a Thl nos animais imunizados.

Exemplo 6

Melhoramento das Respostas de Anticorpos aos Antigénios de Superfície e do Núcleo de Hepatite B Utilizando a Administração Simultânea de um Vector que Codifica HBcAg e HbsAg com os Vectores Adjuvantes de CTA/CTB.

Um plasmideo do vector que contém as sequências de codificação tanto do antigénio do núcleo da hepatite B (HBcAg) como do antigénio de superfície da hepatite B (HBsAg) foi construído como se segue. As sequências de codificação de HBcAg e HBsAg foram obtidas ambas do clone pAM6 de HBV (N° de ordem ATCC 45020) . Para gerar a região de codificação de HBsAg, uma construção de pAM6 foi cortada com Ncol e tratada com uma nuclease de feijão mungo para remover o codão de partida do antigénio X. O ADN resultante foi cortado então com BamEI e tratado com uma T4 ADN -94- polimerase para cortar o ADN com extremidades rombas e criar uma cassete de expressão de HBsAg. A cassete de expressão de HBsAg está presente no fragmento de 1,2 kB. A construção do plasmideo pPJV7077 (Schmaljohn et al. (1997) J. Virol. 71:9563-9569) que contém o promotor inicial imediato de CMV humano de comprimento total (estirpe Towne) (com intensificador) foi cortado com HindIII e BglII, e depois tratado com uma T4 ADN polimerase e fosfatase alcalina de vitelo para criar o ADN com extremidades rombas, e a cassete de expressão de HBsAg foi ligada ao plasmideo para dar a construção de pWRG7128.

Para gerar a região de codificação de HBcAg, a construção de pAM6 foi cortada para criar uma cassete de expressão de HBcAg, após o que a sequência de HbcAg foi truncada por mutagénese direccionada ao sitio para remover a região rica em arginina C-terminal da partícula do antigénio do núcleo (deleção essa que não interfere com a formação de partículas) . A sequência de HBcAg truncada foi então clonada numa construção de plasmideo contendo o promotor do factor de alongamento humano ("hELF", Mizushima et al. (1990) Nucl. Acids. Res. 18:5322) para proporcionar uma construção do vector HBcAg.

As cassetes de expressão que contêm: (a) o intensificador/promotor de CMV, a região não traduzida 5'-Intrão A, e o péptido de sinal do activador do plasminogénio de tecidos humano (hTPA), ("CMV-IA-TPA"), ou (b) a sequência poliA da hormona do crescimento bovina (bGHpA), foram obtidos cada um da construção do vector

JW4303 (oferta do Dr. Harriet Robinson, Universidade de Massachusetts) e inseridos num suporte plasmídico. A construção resultante foi cortada com NheI, cheia com polimerase e depois cortada com BamEI para gerar um fragmento do vector que contém a origem de replicação -95- pUC19, o gene de resistência à ampicilina e a sequência de bGHpA. 0 suporte plasmidico foi cortado uma segunda vez com Sal I, cheio com polimerase, e cortado com Bamíll para libertar um fragmento do vector que contém o fragmento do vector de CMV-IA-TPA. Os dois fragmentos do vector foram ligados conjuntamente para dar uma construção designada pWRG7054. A construção pWRG7054 foi cortada com NheI, cheia com polimerase, e cortada com BamEI para produzir um fragmento do vector. A construção do vector de HBcAg foi cortada com Ncol, cheia com polimerase, e cortada com BamHI para produzir um fragmento de inserção. Os dois fragmentos foram então ligados conjuntamente para dar uma construção designada pWRG7063. 0 PEL-Bos foi cortado com EcoRI e desfosforilado com fosfatase intestinal de vitelo para produzir um fragmento de vector. 0 plasmideo pWRG7063 foi cortado com HindlII, cheio com polimerase, e cortado com EcoRI para produzir um fragmento de inserção que contém o péptido de sinal de hTPA, a sequência do antigénio de HBcAg e a região bGHpA. Estes dois fragmentos foram ligados conjuntamente para proporcionar uma construção designada pWRG7145. A construção pWRG7128 foi cortada com EcoRI e desfosforilada com fosfatase intestinal de vitelo para produzir um fragmento do vector que contém a região de codificação de HBsAg sob o controlo transcricional do promotor hCMV. A construção pWRG7145 foi cortada com MfeI e EcoRI para produzir um fragmento de inserção constituído pelo promotor/intrão de hELF, a sequência do péptido de sinal de hTPA, a sequência do antigénio de HBcAG e a região bGHpA. Estes fragmentos foram então ligados conjuntamente para proporcionar a construção do plasmideo pP3V7193 que -96- contém as sequências de codificação de HBcAg e HBsAg.

As seguintes formulações de ADN-ouro foram então produzidas para um ensaio de adjuvante de vacina de ADN em porcos.

Formulação #1: Controlo, o vector de HBcAg/HBsAg (pWRG7193) só, 2 pg de ADN por mg de ouro, 0,5 mg de ouro por cartucho; e

Formulação #2: O vector HBcAg/HBsAg (pWRG7193), os vectores de ADN de CTA-KDEL (pPJV2006) e CTB (pPJV2003) todos coprecipitados sobre um único lote de ouro (1,0 pg de ADN de pWRG7193 por mg de ouro, e 0,5 pg de cada um do ADN de pPJV2006 e pPJV2003 por mg de ouro), 0,5 mg de ouro por cartucho. O plasmideo pWRG7193 só ou com os vectores adjuvantes pPJV2006 e pPJV2003 foram precipitados em partículas de ouro seguindo os procedimentos descritos no Exemplo 3 acima, novamente numa concentração final de 2 pg de ADN por mg de ouro. As partículas de ouro revestidas foram carregadas em tubo TEZFEL® utilizando os procedimentos descritos no Exemplo 3 acima. Dois grupos experimentais (de 5 porcos cada um) receberam duas imunizações com a Formulação #1 e a Formulação #2, respectivamente, em que as duas imunizações foram aplicadas com um intervalo de 6 semanas. Cada imunização consistiu em duas injecções em série de 500 psi na área da virilha utilizando um dispositivo de administração de partículas PowderJect® XR-1 em que cada injecção utilizou um só cartucho. Assim, no grupo de controlo (Formulação #1), cada imunização consistiu na administração de um total de 1 mg de ouro e 2 pg do vector pWRG7193 da vacina de ADN. Analogamente, no grupo de teste do adjuvante (Formulação -97- #2), cada imunização consistiu numa administração total de 1 mg de ouro, 2 pg do vector pWRG7193 da vacina de ADN, e 1 pg de cada um dos vectores adjuvantes pPJV2006 e pPJV2003. Foram colhidas amostras de sangue de cada animal no momento da imunização de reforço (semana 6) e 2 semanas após a imunização de reforço (semana 8). A detecção das respostas do anticorpo especificas para o antigénio do núcleo foi efectuada como segue: placas de ELISA foram revestidas com o antigénio do núcleo da hepatite B (Biodesign) a 100 ng/mL em PBS. Depois do revestimento de um dia para o outro a 4 °C, as placas foram bloqueadas com leite em pó desnatado a 5% durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram então lavadas 3 vezes com PBS contendo Tween-20 a 0,05%. Amostras do soro dos porcos foram diluídas em série em leite em pó desnatado a 2%/PBS/Tween 20 a 0,01% e adicionadas às placas de ELISA. Após incubação à temperatura ambiente durante 2 horas, as placas foram lavadas 3 vezes com PBS/Tween-20 a 0,05%. O anticorpo secundário consistiu em anti-IgG de porco de cabra conjugada com peroxidase de rábano (Kirkegaard and Perry) que foi diluída 1:2000 em leite em pó desnatado a 2%/PBS/Tween 20 a 0,01%, e adicionou-se às placas para uma incubação de 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram então lavadas 5 vezes com PBS/Tween-20 a 0,05% e adicionou-se 100 pL do substrato TMB. O desenvolvimento da cor decorreu durante 15 minutos e foi parado pela adição de 100 pL de H2SO4 1 N. As placas foram lidas a 450 nm. As Figuras 10 e 11 mostram os valores da média geométrica da absorvência às 6 e 8 semanas, respectivamente, para cada um dos dois grupos de porcos para 4 diferentes diluições do soro. Estes dados demonstram uma melhoramento acentuado das concentrações do anticorpo para o antigénio do núcleo da hepatite B após a utilização dos vectores adjuvantes de CT PPJV2006 e pPJV2003. -98-

Além das respostas humorais elevadas ao antigénio do núcleo da hepatite B, também foi observada uma elevação mensurável das respostas dos anticorpos específicas para o antigénio de superfície da hepatite B no grupo de teste do adjuvante. Os anticorpos específicos para o antigénio de superfície foram quantificados em amostras de soro dos animais individuais utilizando um kit de doseamento comercial (AUSAB, Abbott Laboratories) . Este kit permite a quantificação das respostas do anticorpo em termos da unidade mili-internacional (mUI/mL) utilizando um painel padrão. As médias geométricas das concentrações do anticorpo do antigénio de superfície no grupo de controlo (Formulação #1) e no grupo de teste do adjuvante (Formulação #2) foram de 282 e 662 mUI/mL, respectivamente, demonstrando a aptidão dos presentes plasmídeos adjuvantes (pPJV2006 e pPJV2003) para aumentar respostas imunes a um antigénio codificado por um vector separado.

Exemplo 7

Melhoramento da Resposta Imune Celular Semelhante Thl a uma Vacina de ADN Utilizando os Vectores Plasmídicos que Codificam as Subunidades de CT ou LT 0 vector da vacina de ADN de pM2-FL que codifica a proteína M2 do vírus da influenza A foi utilizado para testar os efeitos adjuvantes dos vectores adjuvantes pPJV20 02, pPJV2003, pPJV2004, pPJV2005, pPJV2006 e pPJV2007 no contexto da vacinação com ADN mediada por partículas. A vacinação com ADN mediada por partículas foi efectuada precipitando o vector da vacina do ADN de M2, com ou sem várias combinações dos vectores adjuvantes, em partículas microscópicas de ouro e acelerando as partículas de ouro revestidas para a epiderme de murganhos utilizando um -99- dispositivo de administração de partículas PowderJect® XR-1 (PowderJect Vaccines, Inc. Madison, WI) . A construção do vector plasmídico de ADN de pM2-FL é como aqui descrita acima no Exemplo 3.

Tal como anteriormente, o plasmídeo pM2-FL foi precipitado em partículas de ouro de 2 micrometros como vector único, ou vector misto mais amostras do vector adjuvante. Especificamente, o ADN do plasmídeo (o vector pM2-FL individual ou o vector pM2-FL mais um ou mais vectores adjuvantes) foi misturado com partículas de ouro de 2 micrometros (Degussa) num tubo de centrífuga pequeno contendo espermidina. A precipitação foi efectuada seguindo as metodologias do Exemplo 3, e as partículas de ouro revestidas foram então revestidas sobre a superfície interna de um tubo TEZFEL® também como descrito no Exemplo 3. 0 tubo foi então cortado em cartuchos de 0,5 polegadas adequados para carregar no dispositivo de administração de partículas.

As formulações de ADN-ouro seguintes foram produzidas para um ensaio de adjuvante da vacina de ADN em murganhos.

Formulação #1: 0 vector de ADN de pM2-FL combinado com o vector plasmídico vazio pWRG7054 antes da precipitação no mesmo lote de ouro, 2,1 pg do ADN total por mg de ouro (0,1 pg de pM2-FL e 2,0 pg de pWRG7054), 0,5 mg de ouro por cartucho;

Formulação #2: O vector de ADN de pM2-FL combinado com os vectores de ADN de CTA e CTB (pPJV2002 e pPJV2003) antes da precipitação num único lote de ouro, 2,1 pg do ADN total por mg de ouro (1,0 pg de cada vector adjuvante de ADN por mg de ouro, 0,1 pg de pM2-FL) , 0,5 mg de ouro por -100- cartucho;

Formulação #3: O vector de ADN de pM2-FL combinado com os vectores de ADN de CTA -KDEL e CTB (pPJV2006 e pPJV2003) todos coprecipitados num único lote de ouro, 2,1 pg do ADN total por mg de ouro (1,0 pg de cada vector adjuvante de ADN por mg de ouro, 0,1 pg de pM2-FL) , 0,5 mg de ouro por cartucho;

Formulação #4: O vector de ADN de pM2-FL combinado com o vector de ADN de CTA -KDEL (pPJV2006) e suplementado com o vector do plasmídeo vazio de pWRG7054 todos combinados e coprecipitados num único lote de ouro, 2,1 pg do ADN total por mg de ouro (1,0 pg de pPJV2006, 1,0 pg de pWRG7054, 0,1 pg de pM2-FL), 0,5 mg de ouro por cartucho;

Formulação #5: O vector de ADN de pM2-FL combinado com o vector de ADN de CTA (pPJV2002) e suplementado com o vector plasmidico vazio de pWRG7054, todos os ADN foram combinados e coprecipitados num único lote de ouro, 2,1 pg do ADN total por mg de ouro (1,0 pg de pPJV2002, 1,0 pg de pWRG7054, 0,1 pg de pM2-FL), 0,5 mg de ouro por cartucho;

Formulação #6: O vector de ADN de pM2-FL combinado com o vector de ADN de CTB (pPJV2003) e suplementado com o vector plasmidico vazio de pWRG7054, todos os ADN foram combinados e precipitados num único lote de ouro, 2,1 pg do ADN total por mg de ouro (1,0 pg de pPJV2003, 1,0 pg de pWRG7054, 0,1 pg de pM2-FL), 0,5 mg de ouro por cartucho;

Formulação #7: O vector de ADN de pM2-FL combinado com os vectores de ADN de LTA e LTB (pPJV2004 e pPJV2005) antes da precipitação num único lote de ouro, 2,1 pg do ADN total por mg de ouro (1,0 pg de cada vector adjuvante de ADN por mg de ouro, 0,1 pg de pM2-FL), 0,5 mg de ouro por -101- cartucho;

Formulação #8: O vector de ADN de pM2-FL combinado com os vectores de ADN de LTA -RDEL e LTB (pPJV2007 e pPJV2005) todos coprecipitaram num único lote de ouro, 2,1 pg do ADN total por mg de ouro (1,0 pg de cada vector adjuvante de ADN por mg de ouro, 0,1 pg de pM2-FL) , 0,5 mg de ouro por cartucho;

Formulação #9: O vector de ADN de pM2-FL combinado com o vector de ADN de LTA -RDEL (pPJV2007) e suplementado com o vector plasmídico vazio de pWRG7054, todos foram combinados e coprecipitaram num único lote de ouro, 2,1 pg do ADN total por mg de ouro (1,0 pg de pPJV2007, 1,0 pg de pWRG7054, 0,1 pg de pM2-FL), 0,5 mg de ouro por cartucho;

Formulação #10: O vector de ADN de pM2-FL combinado com o vector de ADN de LTA (pPJV2004) e suplementado com o vector plasmidico vazio de pWRG7054, todos os ADN foram combinados e coprecipitados num único lote de ouro, 2,1 pg do ADN total por mg de ouro (1,0 pg de pPJV2004, 1,0 pg de pWRG7054, 0,1 pg de pM2-FL), 0,5 mg de ouro por cartucho;

Formulação #11: O vector de ADN de pM2-FL combinado com o vector de ADN de LTB (pPJV2005) e suplementado com o vector plasmidico vazio de pWRG7054, todos os ADN foram combinados e coprecipitados num único lote de ouro, 2,1 pg do ADN total por mg de ouro (1,0 pg de pPJV2005, 1,0 pg de pWRG7054, 0,1 pg de pM2-FL), 0,5 mg de ouro por cartucho.

Estas formulações de vacina de ADN foram então administradas a onze grupos de murganhos como se segue. Cada grupo experimental continha 8 animais e cada animal recebeu duas imunizações com a sua respectiva formulação com 4 semanas de periodo de descanso entre imunizações. -102-

Cada imunização consistiu em duas administrações em série na epiderme abdominal (um cartucho por administração) utilizando um dispositivo de administração de partículas PowderJect® XR-1 (PowderJect Vaccines, Inc. Madison, WI) a uma pressão de hélio de 400 psi. Foram colhidas amostras de soro duas semanas após a segunda imunização ou imunização de reforço.

As amostras de soro individuais foram doseadas quanto a respostas de anticorpos específicos de M2 para as subclasses de IgGl e de IgG2 utilizando o ensaio de ELISA do Exemplo 3 acima para a determinação da concentração de IgG total, excepto que se utilizou um conjugado de anticorpo secundário específico para IgGl ou IgG2. O anticorpo de conjugado de anti-IgGl de murganho de cabra-biotina foi obtido de Southern Biotechnology Associates, Inc. (catálogo #1070-08, concentração de 0,5 mg/mL) e utilizado numa diluição de 1/8000. O conjugado de anti-IgG2a de murganho de cabra-biotina foi obtido da mesma fonte (catálogo #1080-08, concentração de 0,5 mg/mL) e utilizou-se também numa diluição de 1/8000.

Determinou-se as médias geométricas das concentrações de anticorpo para IgGl e IgG2a específicas para o antigénio de M2 para cada grupo experimental, e foram calculadas as proporções de IgGl para lgG2a. Estes dados estão apresentados a seguir no Quadro 5.

Quadro 5

Formulação# Razão de IgGl para IgG2a 1 160,99 2 3,44 3 13,59 -103- 4 63,20 5 2,63 6 30,97 7 0,02 8 0,50 9 9,00 10 4,53 11 27,00

Como se pode observar com referência ao Quadro 5, a adição de qualquer das subunidades A ou B, ou as várias combinações das subunidades A e B com a formulação da vacina de ADN de M2 conduziram a reduções significativas na razão de IgGl para IgG2 de outro modo desencadeadas com a vacina de ADN de M2 (pM2-FL) na ausência do adjuvante (Formulação #1) . A maior redução da razão resultou da utilização das combinações do vector LTA mais LTB, e de LTA -RDEL mais LTB (Formulações #7 e #8, respectivamente) . Em ambas estas formulações, a utilização dos adjuvantes de polinucleótidos da presente invenção conduziu a uma abundância de concentrações de IgG2a especificas para o antigénio de M2 em relação a IgGl, caracteristica que é distintiva de uma resposta imune semelhante a Thl em murganhos.

Os resultados de grupos experimentais que receberam as Formulações #1, #2 e #7 foram traçado num gráfico como a relação de log IgGl para IgG2a na Figura 12. Como se pode observar nesta Figura, o efeito adjuvante da composição de vacina de ADN de pM2-FL com os vectores adjuvantes de CTA mais CTB (Formulação #2) provocou uma queda com 2 ordens de grandeza na razão de IgGl para IgG2 em relação à composição de vacina de pM2-FL sem adjuvante (Formulação #1) . Além disso, uma queda adicional de 2 ordens de grandeza nesta razão foi observada quando a vacina de ADN de pM2-FL foi -104- adjuvantada com os vectores adjuvantes LTA mais LTB (Formulação #7) .

Exemplo 8

Adição das Sequências que Codificam Péptidos de Sinal a Vectores Adjuvantes que Codificam CT ou LT.

As construções dos vectores que contêm as subunidades da toxina de CTA, CTB, LTA e LTB (pPJV2002, pPJV2003, pPJV2004 e pPJV2005, respectivamente) foram modificadas para remover as sequências de codificação do péptido de sinal de tpa, e foi construído um vector da vacina de ADN duplo que codifica os antigénios tanto do núcleo como de superfície da hepatite B para utilização nas experiências seguintes.

As condições de PCR correntes que foram utilizadas para a construção/modificaçâo dos vectores foram como se segue: lx PCR do tampão do núcleo com MgCl2 1,5 mM (Promega Corp., Madison, Wl); 0,400 μΜ de cada iniciador; 200 μΜ de cada dNTP (USB Inc., Cleveland, OH); 2,5 pg de Taq polimerase (Promega Corp., Madison, WI); 1,0 pg de ADN molde; água até 100 pL; e uma camada de revestimento de óleo mineral (Aldrich Chemical Inc., Milwaukee WI). Um termociclador PTC-200 (MT Research Inc., Waltham, MA) foi programado para fazer funcionar a seguinte rotina: 4 minutos a 95 °C; 30 ciclos de (1 minuto a 95 °C/1 minuto 15 segundos a 55 °C/1 minuto a 72 °C) ; 10 minutos a 72 °C; manutenção a 4 °C. Os produtos de amplificação foram removidos da reacção de PCR utilizando o kit de purificação por PCR QIAquick® (Qiagen Inc., Valência, CA) antes do corte com enzimas de restrição (New England Biolabs, Beverly, MA) . Todos os produtos de PCR foram sequenciados depois da clonagem para assegurar a fidelidade da -105- amplificação.

Mais especificamente, um vector de vacina de ADN duplo que codifica os antigénios tanto do núcleo como de superfície da hepatite B foi construído como se segue. A construção pWRG7128 (Exemplo 4) que contém a sequência de codificação do antigénio de superfície foi modificada utilizando uma série de técnicas correntes de biologia molecular para proporcionar a construção dupla (antigénio de superfície/núcleo). Inicialmente, a construção pWRG7128 foi modificada para remover a região de poliadenilação da hormona do crescimento bovino e substituí-la pela região de poliadenilação de beta-globina de coelho. Um primeiro fragmento de inserção contendo o promotor de CMV com as sequências do exão 1 e do exão 2, e um segundo fragmento de inserção contendo uma segunda região de poliadenilação de beta-globina de coelho foram ligados na construção pWRG7128 modificada, e um adaptador construído por emparelhamento de oligonucleótidos sistémicos foi inserido entre os sítios Sphl e Pstl localizados imediatamente a montante do promotor de CMV inserido. O plasmídeo mpSmpCC (GlaxoSmithKline, UK) foi submetido a PCR com os seguintes iniciadores: 5'—GCC GCT AGC ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GA-3' (SEQ ID NO: 23) e 5'-CCA GGA TCC TTA ACA TTG AGA TTC C-3' (SEQ ID NO:24) para produzir uma sequência de codificação do antigénio do núcleo de hepatite B adw2. Este produto de PCR foi cortado com Nhel e BairiRI para gerar um fragmento de inserção, fragmento esse que foi então modificado para incluir um sítio Bgl2 a jusante e inserido num vector de clonagem. O vector de clonagem foi cortado com Pstl e PcoRl para gerar um fragmento de inserção do antigénio do núcleo; o plasmídeo pWRG7128 modificado foi cortado com Pstl e Mfel para gerar um fragmento do vector, e o fragmento de -106- inserção do antigénio do núcleo foi ligado ao fragmento do vector, resultando na construção do plasmideo do antigénio duplo de superficie/núcleo.

As construções dos vectores que contêm as subunidades de toxina de CTA, CTB, LTA e LTB (pPJV2002, pPJV2003, pPJV2004, e pPJV2005, respectivamente) foram modificadas para remover as sequências de codificação do péptido de sinal tpa por mera excisão das sequências de codificação de tpa utilizando enzimas de restrição para produzir as seguintes construções: CTA sem TPA, CTB sem TPA, LTA sin TPA, e LTB sem TPA, respectivamente. O plasmideo do antigénio duplo do núcleo/superficie foi combinado com o ADN do plasmideo irrelevante (para o controlo sem adjuvante) ou com as construções dos vectores das subunidades da toxina e precipitado em partículas de ouro de 2 micrometros. Especificamente, o ADN plasmídico (vector plasmídico do antigénio duplo do núcleo/superfície) mais dois vectores adjuvantes (para proporcionar uma combinação de CTA/CTB ou LTA/LTB) foi misturado com partículas de ouro de 2 micrometros (Degussa) num tubo pequeno de centrífuga contendo espermidina. A precipitação foi realizada seguindo as metodologias do Exemplo 3, e as partículas revestidas com ouro foram então revestidas na superfície interna de um tubo TEFZEL® tal como também descrito no Exemplo 3. O tubo foi então cortado em cartuchos de 0,5 polegadas adequados para carregar no dispositivo de administração de partículas.

Foram assim produzidas as seguintes formulações de ADN-ouro para um ensaio do adjuvante da vacina de ADN em murganhos:

Formulação #1 ("sem adjuvante") 1 pg do vector -107- plasmídico de ADN do antigénio duplo de superfície/núcleo, 1 pg do vector plasmídico de ADN irrelevante;

Formulação #2: ("CT") 1 pg do vector plasmídico de ADN do antigénio duplo de superfície/núcleo, 0,5 pg do vector plasmídico de ADN de pPJV2002 (CTA) e 0,5 pg do vector plasmídico de ADN de pPJV2003 (CTB);

Formulação #3: ("CT sem TPA") 1 pg do vector plasmídico de ADN do antigénio duplo de superfície/núcleo, 0,5 pg do vector plasmídico de ADN de CTA sem TPA, 0,5 pg do vector plasmídico de ADN de CTB sem TPA;

Formulação #4: ("CTA") 1 pg do vector plasmídico de ADN do antigénio duplo de superfície/núcleo, 1 pg do vector do plasmídeo de ADN de pPJV2002 (CTA);

Formulação #5: ("CTA sem TPA") 1 pg do vector plasmídico de ADN do antigénio duplo de superfície/núcleo, 1 pg do vector plasmídico de ADN de CTA sem TPA;

Formulação E#6: ("CTB") 1 pg do vector plasmídico de ADN do antigénio duplo de superfície/núcleo, 1 pg do vector plasmídico de ADN de pPJV2003 (CTB) ;

Formulação #7: ("CTB sem TPA") 1 pg do vector plasmídico de ADN do antigénio duplo de superfície/núcleo, 1 pg do vector plasmídico de ADN de CTB sem TPA;

Formulação #8: ("LT") 1 pg do vector plasmídico de ADN do antigénio duplo de superfície/núcleo, 0,5 pg do vector plasmídico de ADN de pPJV2004 (LTA) , 0,5 pg do vector plasmídico de ADN de pPJV2005 (LTB);

Formulação #9: ("LT sem TPA") 1 pg do vector -108- plasmídico de ADN do antigénio duplo de superfície/núcleo, 0,5 pg do vector plasmídico de ADN de LTA sem TPA, 0,5 pg do vector plasmídico de ADN de LTB sem TPA;

Formulação #10: ("LTA") 1 pg do vector plasmídico de ADN do antigénio duplo de superfície/núcleo, 1 pg do vector do plasmídeo de ADN de pPJV2004 (LTA);

Formulação #11: ("LTA sem TPA") 1 pg do vector plasmídico de ADN do antigénio duplo de superfície/núcleo, 1 pg do vector plasmídico de ADN de LTA sem TPA;

Formulação #12: ("LTB") 1 pg do vector plasmídico de ADN do antigénio duplo de superfície/núcleo, 1 pg do vector plasmídico de ADN de pPJV2005 (ZTB); e

Formulação #13: ("LTD sem TPA") 1 pg do vector plasmídico de ADN do antigénio duplo de superfície/núcleo, 1 pg do vector plasmídico de ADN de LTD sem TPA.

Num primeiro estudo, várias das formulações de vacina de ADN descritas acima foram administradas a cinco grupos de murganhos utilizando o dispositivo de administração de partículas PowderJect® XR-1 (PowderJect Vaccines, Inc. Madison, WI) . Cada grupo experimental continha 5 animais, e cada animal recebeu duas imunizações com a formulação respectiva com um período de descanso de 4 semanas entre as imunizações. As Formulações que foram testadas foram como se segue: Formulação #1 (sem adjuvante); Formulação #2 (CT); Formulação #3 (CT sem TPA); Formulação #8 (LT) ; e Formulação #9 (LT sem TPA) . Todos os animais foram sacrificados duas semanas depois da segunda imunização, e os baços colhidos para utilização em ensaios ELISPOT de IFN-γ e IL-4. Para os ensaios imunes celulares, as suspensões celulares individuais dos esplenócitos dos -109- baços dos animais imunizados foram cultivados in vitro na presença de um péptido que corresponde a um epitopo de células T conhecido (do antigénio de superfície ou do núcleo) nos murganhos. 0 péptido foi dissolvido em DMSO (10 mg/mL) e diluido para 10 pg/mL em cultura.

Para os ensaios ELISPOT, as placas de filtração de membrana Multiscreen da Millipore foram revestidas com 50 pL do anti-soro apropriado (15 pg/mL de anti-soro anti-IFN-γ ou IL-4, Pharmingen) em tampão de carbonato 0,1 M estéril (pH 9,6) de um dia para o outro a 4 °C. As placas foram lavadas 6 vezes com PBS estéril e depois bloqueadas com meio de cultura de tecidos contendo soro fetal de bovino (FBS) a 10% durante 1-2 horas à TA. O meio foi removido e as células de baço distribuídas pelos poços com 6 um total de 1 x 10 células por poço. Para os poços aos quais se adicionou menos de 1x106 células dos animais imunizados, utilizou-se células de animais não anteriormente submetidos a experiências para levar o total a 1 x 106. As células foram incubadas de um dia para o outro numa incubadora de cultura de tecidos na presença do péptido tal como descrito acima. As placas foram então lavadas 2 vezes com PBS e 1 vez com água destilada. Isto foi seguido por 3 lavagens com PBS. Um anticorpo monoclonal anti-IFN-γ ou anti-IL-4 biotinilado (Pharmingen) foi adicionado à placa (50 pL de uma solução de 1 pg/mL em PBS) e incubada durante 2 horas à TA. As placas foram lavadas 6 vezes com PBS e adicionou-se 50 pL de um conjugado de estreptavidina e fosfatase alcalina (1:1000 em PBS,

Pharmingen) e incubou-se durante 2 horas à TA. As placas foram lavadas 6 vezes com PBS e adicionou-se um substrato corante de fosfatase alcalina (BioRad) e deixou-se que a reacção decorresse até ao aparecimento de manchas escuras. A reacção foi parada por lavagem com água 3 vezes. As -110- placas foram secas ao ar e as manchas contadas ao microscópio. O efeito adjuvante das sequências de codificação das subunidades da toxina segregada ou não segregada foi avaliado por determinação das respostas de ELISPOT para IFN-γ e IL-4 a ambos os antigénios de superfície e do núcleo da hepatite B ("aAg" e "cAg") codificados pela construção do antigénio duplo de superfície/núcleo, e estes resultados foram comparados como descrito nas Figuras 13A-13D. Como se pode observar, os vectores adjuvantes de CT e LT segregados (contendo a sequência de sinal) (Formulações #2 e #8, respectivamente) produziram aumentos significativos (P < 0,05) nas respostas de IFN-γ aos antigénios de superfície e do núcleo, e na resposta de IL-4 ao antigénio de superfície (ver Figuras 13A, 13B e 13C) . Em relação às respostas de IL-4 ao antigénio do núcleo, a falta do efeito do adjuvante pelos vectores de LT (Formulações #8 e #9) é consistente com as observações de que a toxina de LT é mais a de um adjuvante de Thl do que a toxina de CT. O que é mais importante, os vectores de CT e LT que carecem das sequências de sinal (Formulações #3 e #9, respectivamente) apresentaram um efeito adjuvante mais fraco, particularmente como se observa nos dados de ELISPOT de IFN-γ para os antigénios tanto de superfície como do núcleo (ver as Figuras 13A e 13C), em que houve uma queda estatisticamente significativa da actividade adjuvante em virtude da deleção das sequências de sinal.

Finalmente, a diferença claramente observável no efeito adjuvante entre o segregado (Formulações #2 e #8) e o não segregado (Formulações #3 e #9) ajuda a estabelecer que os efeitos adjuvantes observados não são devidos a motivos CpG dentro dos vectores adjuvantes uma vez que os vectores contendo sinal e não contendo sinal não têm -111- qualquer diferença no teor de ADN bacteriano (CpG) mas ainda assim apresentam diferenças siqnificativas quanto à sua capacidade para aumentar as respostas de IFN-γ especificas para o antigénio de superfície.

Num segundo estudo, as formulações de vacina de ADN descritas acima foram administradas a oito grupos de murganhos utilizando o dispositivo de administração de partículas PowderJect® XR-1 (PowderJect Vaccines, Inc. Madison, WI). Cada grupo experimental continha 5 animais, e cada animal recebeu duas imunizações com a formulação respectiva com um período de descanso de 4 semanas entre as imunizações. As Formulações que foram testadas foram como se segue: Formulação #1 (sem adjuvante); Formulação #2 (CT) ; Formulação #4 (CTA) ; Formulação #5 (CTA sem TPA); Formulação #6 (CTB) ; Formulação #7 (CTB sem TPA) ;

Formulação #8 (LT); Formulação #10 (LTA); Formulação #11 (LTA sem TPA) ; Formulação #12 (LTB) ; e Formulação #13 (LTB sem TPA). Todos os animais foram sacrificados duas semanas depois da segunda imunização, e os baços colhidos para utilização nos ensaios ELISPOT de IFN-γ e IL-4 aqui descritos acima.

Como resultado deste segundo estudo (dados não mostrados), observou-se novamente que não havia efeito adjuvante discernível que pudesse ser atribuído ao teor de CpG nos vários plasmídeos adjuvantes. Embora na sua maior parte não se observasse efeito adjuvante estatisticamente relevante com os diversos vectores adjuvantes das subunidades da toxina, os vectores das subunidades de LT (Formulações #10-13) não evidenciaram um efeito adjuvante na resposta de IFN-γ e IL-4 ao antigénio de superfície (sAg) que fosse influenciado pela presença/ausência da sequência de sinal de secreção. -112-

Exemplo 9

Vectores Plasmídicos Adjuvantes que Codificam os Péptidos das Subunidades de CTA/CTB ou LTA/LTB num Estudo de Inoculação Virai

Para avaliar a aptidão dos vectores plasmídicos adjuvantes da presente invenção para proporcionar efeito protector num modelo de inoculação virai com vírus Herpes simplex de tipo 2 (VHS-2) realizou-se o estudo seguinte. Foi construída uma vacina de ADN que codifica um antigénio de VHS-2 e depois foi combinada com várias associações dos presentes vectores plasmídicos adjuvantes para proporcionar composições de vacina. Após a imunização, os animais imunizados foram estimulados com o vírus VHS-2, e determinou-se o efeito protector das diversas composições de vacina.

Em relação à construção do plasmídeo do antigénio de ADN, foram utilizadas as técnicas de PCR correntes para construir o plasmídeo. As condições de PCR correntes que foram utilizadas para a construção do vector foram como se segue: 1 x PCR do tampão do núcleo com MgC12 1,5 mM (Promega Corp., Madison, WI) ; 0,400 μΜ de cada iniciador; 200 μΜ de cada um de dNTP (USB Inc., Cleveland, OH); 2,5 pg de Taq polimerase (Promega Corp., Madison, WI); 1,0 pg de ADN do molde; água até 100 pL; e um óleo mineral (Aldrich Chemical Inc., Milwaukee WI) de revestimento. Um termociclador PTC-200 (MJ Research Inc., Waltham, MA) foi programado para fazer funcionar a seguinte rotina: 4 minutos a 95 °C; 30 ciclos de (1 minuto a 95 °C/1 minuto 15 segundos a 55 °C/1 minuto a 72 °C) ; 10 minutos a 72 °C; manutenção a 4 °C. Os produtos de amplificação foram removidos da reacção de PCR utilizando o kit de purificação por PCR QIAquick® (Qiagen Inc., Valência CA) antes de -113- cortar com as enzimas de restrição (New England Biolabs, Beverly, MA) . Todos os produtos de PCR foram sequenciados após a clonagem para assegurar a fidelidade da amplificação.

Mais especificamente, um vector plasmidico da vacina de ADN que codifica o antigénio de ICP27 inicial de VHS-2 foi construído como se segue. 0 VHS é um vírus de ADN de cadeia dupla que tem um genoma de aproximadamente 150-160 kpb. O genoma virai está empacotado dentro de uma nucleocápside icosaédrica que está envolta numa membrana. A membrana (ou envelope) inclui pelo menos 10 glicoproteínas codificadas pelo vírus, de que as mais abundantes são gB, gC, gD, e gE. O genoma virai também codifica mais de 70 outras proteínas, incluindo um grupo de aproximadamente cinco antigénios de ICP. Estas proteínas iniciais são sintetizadas cedo no ciclo de replicação virai, em contraste com as glicoproteínas do envelope que só são produzidas no final do ciclo de vida do vírus. Para uma revisão da estrutura molecular e organização do VHS, ver, por exemplo, Roizman e Sears (1996) "Herpes simplex viruses and their replication" em Fields Virology, 3rd ed., Fields et ai., eds., Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA. 0 antigénio ICP27 de VHS-2 pode ser obtido facilmente a partir do genoma de VHS-2, por exemplo da região genómica que se estende aproximadamente do nucleótido 114589 até ao 134980 do genoma de VHS-2, ou um fragmento EcoRI que se estende do nucleótido 110931 até ao 139697 do genoma de VHS-2. A sequência do genoma de VHS-2 está disponível de fontes publicadas, por exemplo a sequência depositada no GenBank com o número de ordem NC_001798.

Para construir o vector ICP27 utilizado no presente estudo, a região de codificação do ICP27 foi submetida a PCR a partir do genoma de VHS-2 utilizando os seguintes -114- iniciadores: 5'-GCC ACT CTC TTC CGA CAC-3' (SEQ ID NO:25) e 5' -CAA GAR CAT CAC ACG GAR C-3' (SEQ ID NO: 26) para obter um fragmento de nucleótido que contém as sequências dos nucleótidos 114523-116179 (GenBank) de VHS-2 que corresponde à região de codificação do ICP27. 0 fragmento de ICP27 foi então clonado na região de clonagem múltipla do vector pTarget (Promega Corp., Madison, WI).

As construções dos vectores plasmidicos adjuvantes que contêm as subunidades de toxina CTA, CTB, LTA e LTB (pPJV2002, pPJV2003, pPJV2004 e pPJV2005, respectivamente) foram combinadas para proporcionar o adjuvante CTA/CTB (pPJV2002 + pPJV2003) e LTA/LTB (pPJV2004 + pPJV2005). 0 plasmideo do antigénio ICP27 foi combinado com os pares de construções dos vectores das subunidades de toxina e precipitados em partículas de ouro de 2 micrometros. Especificamente, o ADN plasmídico (vector plasmídico do antigénio ICP27) mais dois vectores adjuvantes (para proporcionar uma combinação de CTA/CTB ou LTA/LTB) foram misturados com partículas de ouro de 2 micrometros (Degussa) num tubo pequeno de centrífuga contendo espermidina. A precipitação foi realizada seguindo as metodologias do Exemplo 3, e as partículas de ouro revestidas foram então revestidas na superfície interna de um tubo TEFZEL® como descrito também no Exemplo 3. 0 tubo foi então cortado em cartuchos de 0,5 polegadas adequados para carregar no dispositivo de administração de partículas.

Foram assim produzidas as seguintes formulações de ADN-ouro para o estudo de inoculação com VHS-2:

Formulação #1: (sem adjuvante) 2 pg do vector plasmídico de ADN do antigénio ICP27; -115-

Formulação #2: ("CT elevada") 900 ng do vector plasmídico de ADN do antigénio ICP27, 50 ng de pPJV2002 (CTA), 50 ng de pPJV2003 (CTB),

Formulação #3: ("CT baixa") 500 ng do vector plasmídico de ADN do antigénio ICP27, 250 ng de pPJV2002 (CTA), 250 ng de pPJV2003 (CTB),

Formulação #4: ("LT elevada") 900 ng do vector plasmídico de ADN do antigénio ICP27, 50 ng de pPJV2004 25 (LTA), 50 ng de pPJV2005 (LTB), e

Formulação #5: ("LT baixa") 500 ng do vector plasmídico de ADN do antigénio ICP27, 250 ng de pPJV2004 (LTA), 250 ng de pPJV2005 (LTB).

No estudo, as formulações de vacina de ADN descritas anteriormente foram administradas a cinco grupos diferentes de murganhos utilizando o dispositivo de administração de partículas PowderJect® XR-1 (PowderJect Vaccines, Inc. Madison, WI). Cada grupo experimental continha 12 animais, e cada animal recebeu duas imunizações (disparo simples aplicado no abdómen) com a formulação respectiva com um período de descanso de 4 semanas entre as imunizações. Um sexto grupo de murganhos foi constituído como um controlo negativo (animais não anteriormente submetidos a experiências), e não recebeu nenhuma vacina. 4 murganhos de cada grupo foram excluídos 2 semanas após a segunda imunização e utilizados para os ensaios ELISPOT de IFN-γ (dados não apresentados).

Duas semanas depois da segunda imunização, todos os murganhos restantes (8/grupo) foram desafiados com 1 x 106 UFP do vírus VHS-2, estirpe MS, por meio de instilação intranasal. O gráfica de sobrevivência que mostra os -116- resultados do estudo de inoculação está apresentado na Figura 14. Como se pode observar, 100% dos animais não previamente submetidos a experiências sucumbiram dentro de 4 dias após a inoculação. Os animais não previamente submetidos a experiências estão ilustrado no gráfico pela curva (·). Além disso, 100% dos animais que recebem o vector plasmidico do antigénio ICP27 só (Formulação #1) morreram dentro de 7 dias após a inoculação. Os animais que receberam a Formulação #1 estão indicados no gráfico pela curva (T). Em contraste acentuado, os 25% (2/8) dos animais que receberam o plasmideo ICP27 adjuvantado com CT de dose baixa (Formulação #3) foram protegidos da inoculação virai, e 38% (3/8) dos animais que receberam ICP27 adjuvantado com dose elevada de CT (Formulação #2) foram protegidos da inoculação virai. Os animais que receberam a Formulação #3 estão ilustrados no gráfico pela curva (). Os animais que receberam a Formulação #2 estão ilustrados no gráfico pela curva (♦) . Finalmente, tanto a vacina de ICP27 com o adjuvante de LT de dose baixa (Formulação #5) como a vacina de ICP27 com o adjuvante de LT de dose alta (Formulação #4) promoveram a protecção completa (100%) nos animais imunizados. Os animais que receberam a Formulação #5 estão ilustrados no gráfico pela curva (A). Os animais que receberam a Formulação #4 estão ilustrados no gráfico pela curva (O).

Em concordância, foram descritas as novas moléculas adjuvantes de polinucleótidos, as composições que compreendem essas moléculas adjuvantes, e as técnicas de imunização convencionais e com ácidos nucleicos. -117-

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> HAYNES, Joel R. ARRINGTON, Joshua <120> ADJUVANTES À BASE DE ÁCIDOS NUCLEICOS <130> APF41.40 <14 0> <141> 2001-11-26 <160> 22 <170> Patentln Ver.2.1

<210> 1 <211> 5500 <212> AND <213> plasmídeo pPJV2002 < 4 0 0 > 1 -118- gasgsa&ggg ççfcçg&gata egcsrtatfctt tafeaggttaa tgfceatgats afcaatggfcfct SO ettagaegtc aggtggcact ttxcggggaa stgtgcgcgg asceestatt fcgtttatífcfc 13 0 tetaaatÃCâ ttcsaafcafcg tafeccgctes tgagacaata accctgataa atgettcaat IBO sstatfcgaaá aagga&gagt atgagfcattc aacafcttccg tgtegaaett aetccctttt .240 tfcgesgeatt fctgccstççt gfctttfcgctc accGagaaa.c gcfcggtg&aa gt.aaas.gatg 300 etgs.ags.feea gfcttgggtgca cgagtgggtt a«afcísg&aet ggatetcaae ageggfcaaga 300 fccefcfcgagag tfcttcgcecc gaaga&cgtt fctceaafcg&t gagcactttfc aaagtfccfcgc 420 tatgfeggcgc ggtsttatce cgfcafc&gacg ççgggcaags gcaactçggfc çgcegçafcae SSO açt&fcfcçtca gaafcgtscttg gtfegagtaçt gaceagfcca.e agaaaageafc cttacggetg 540 gcatgacagfc aagag&atta tgcagtgçtg ccstaeceat g&gtgaLaac actgcggeea SOO ect&acfetct gacaaegate ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg eaçasçatgg SS0 ggsrafceatgfc sactagcctt gatcgttggg aseeggaget gaatgaagcc staecssaeg 730 acgagsgtg» cãecàcgatg cttgtagcaa t-ggfiaacase j^fegege&aa etafetsactg 780 gegasefcaefc tsactcfcaget tcccggcaac «etfcâatagà etggafeggãg gegg&taaag 840 ttgcaggace «ettetgcgc fccggccctfcc cggctggefcg gtttatfcget gataaetctg 000 gsgseggtg* gcgtgggtcx cgcggtatca ttgsagcact ggggccap*. ggtaagceet 900 eocgtategt agfcfcafcctac acgaegggga. gtcaggeaac fcaègga&gaa egaa&tag&c 1020 agatcgctga gs.fcaggfcgçc fccactgatta agcattggta aetgtEragas eaagtttãct 1080 catatatacc teagattgat ttaaaactec afctfcttaatfc taaaaggafec fcaggtgaaga U40 tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaaegtga gttttegtte cacfcgagíjgfc 1200 cagaeeecgt agaaaagate saaggatctfc ctfcgagafcoc fefefetfcttctg egegfcaatdfc ISSO gctgcttgca a&o&aa&a&a ccacegetac cagsggtggt; ttgtttgccg gatcaagagc 1320 taccaactct fctettsgaag geaaefcgget teageagage gcagetacea aatactgtsc 1380 ttetsgtgta gcôgtagtta ggccaccact te&aga&etc fcgfcageaceg eefeaeataee 144S tcgçtçtgct aatoctgtfc* ccagt$®ctg ctgecagí.gg cgataagfccs fcgfecttacag 1500 ggfcfefgaetc «agacgatag ttaeçggata aggegeagçg gfcegggetsa actggggggfcfc 1500 ogt-gcagaca gcecagcfctg gsgcgasega cctacaccga actgagatae cfcacagcgtg 1620 ageattgàga «agcgccacg cfctcccgaaçr ggagaaaggc ggacagg&at ecgg&éagcg 1600 gcag^ftcgrg aasaggagag cgcatgaggg âgetfeeaagg gggaaaegec tggtafcctfcfc 1740 atagtccfcgt cggefcfcfcesc «accfecfcgac ttgagcgtcg atfctfctgtga fcgcfeçgtcag 1800 βδ»®9«?8*9 sstatggaa* aaegeoagca sçgsggsçtt tfctuK?ggfcte ctggeoteeé 1860 -119- getggcsttt tgetcac&fcg ttettteetg egtfcsfccccc! 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<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: construção sintética < 4 0 0 > 8 cctggatcct cataattcat ccttaattct 30 <210> 9 <211> 30 -130- -130- <212> <213>

ADN

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<212> ADN <213> Sequência artificial -131- < 2 2 Ο > <223>Descrição da Sequência Artificial: construção sintética <400>12 ggagctagca atggcgacaa attataccgt 30 <210> 13 <211> 30

<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223>Descrição da sequência artificial: construção sintética <400>13 cctggatcct cataattcat cccgaattct 30 <210> 14 <211> 30

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<212> ADN <213> Sequência artificial <220> <223>Descrição da sequência artificial: construção sintética 15 < 4 0 0 > -132- cctggatccc tagttttcca tactgattgc 30 <210> 16 <211> 30

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Ser Leu Leu Thr Glu Vai Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Glu Cys 1 Arg 5 10 15 <210> 20 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223>Descrição da sequência artificial: construção sintética <400> 20

Ile Pro Gin Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu 1 5 10 <210> 21 <211> 15 <212> PRT <213> <220> Sequência artificial <223>Descrição da sequência artificial: construção sintética < 4 0 0 > 21

Arg Ile Gin Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Vai Ile Thr Gly Lys -134 - 1 5 10 15 < 210 > 22 <211> 10

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223>Descrição da sequência artificial: construção sintética <400> 22

Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Vai Thr Ile 15 10 -135-

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para a conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento de Patente Europeia. Embora muito cuidado tenha sido tomado na compilação das referências, erros e omissões não podem ser excluídos e o IEP não assume qualquer responsabilidade neste sentido.

Documentos de Patente citados na descrição us 5980898 A [0002] us 0143151 W [0019] us 5630796 A [0039] us 5865796 A [0039] [0142] us 5100792 A [0040] wo 8904669 A [0069] wo 9011089 A [0069] wo 9014436 A [0069] us 5378814 A [0069] us 5171568 A [0070] us 5219740 A [0082] [0082] [0082] us 5173414 A [0085] us 5139941 A [0085] wo 9201070 A [0085] wo 9303769 A [0085] us 5283185 A [0088] us 5527928 A [0088] wo 9011092 A [0088] wo 9115501 A [0088] wo 9526356 A [0088] wo 9318759 A [0088] wo 9319768 A [0088] us 5204253 A [0099] us 4945050 A [0099] -136- us 5120657 A [0099] us 5149655 A [0099] wo 9748485 A [0102] wo 9424263 A [0105] wo 9604947 A [0105] wo 9612513 A [0105] wo 9620022 A [0105] us 5399346 A [0112] us 5580859 A [0112] us 5589466 A [0112] us 5733600 A [0142] us 9500780 W [0142] us 5780100 A [0142] us 5584807 A [0142]

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Lisboa 20/11/2009

Claims (28)

1. -1- REIVINDICAÇÕES 1. Composição adjuvante compreendendo: (i) uma primeira sequência de ácidos nucleicos; (ii) uma segunda sequência de ácidos nucleicos; e (iii) elementos transportadores que formam um núcleo, em que: (a) a referida primeira sequência de ácidos nucleicos é uma região de codificação da subunidade A truncada obtida ou derivada de uma exotoxina bacteriana de ADP-ribosilação; (b) a referida segunda sequência de ácidos nucleicos é uma região de codificação da subunidade B truncada obtida ou derivada de uma exotoxina bacteriana de ADP-ribosilação; (c) as referidas primeira e segunda sequências de ácidos nucleicos estão revestidas nos elementos transportadores que formam um núcleo e estão ligadas operacionalmente, ou está cada uma ligada operacionalmente, a um promotor activo numa célula de mamifero; e (d) cada uma das referidas regiões de codificação de subunidades truncadas tem uma deleção 5', codifica um péptido da subunidade que não tem um péptido de sinal bacteriano amino terminal e está operacionalmente ligada a uma sequência lider para secreção a partir de uma célula de mamífero.
2. 2. Composição de acordo com a reivindicação 1, em que a região de codificação da subunidade A truncada foi ainda geneticamente modificada para eliminar um motivo KDEL ou RDEL C-terminal no péptido da subunidade por ela codificado.
3. 3. Composição adjuvante compreendendo: (i) uma primeira sequência de ácidos nucleicos; (ii) uma segunda sequência de ácidos nucleicos; e (iii) elementos transportadoras que formam um núcleo, em que: (a) a referida primeira sequência de ácidos nucleicos é uma -2- região de codificação da subunidade A modificada obtida ou derivada de uma exotoxina bacteriana de ADP-ribosilação; (b) a referida segunda sequência de ácidos nucleicos é uma região de codificação da subunidade B obtida ou derivada de uma exotoxina bacteriana de ADP-ribosilação; (c) as referidas primeira e segunda sequências de ácidos nucleicos estão revestidas nos elementos transportadores que formam um núcleo e estão ligadas operacionalmente, ou está cada uma ligada operacionalmente, a um promotor activo numa célula de mamífero; e (d) cada uma das referidas região de codificação da subunidade A modificada e região de codificação a subunidade B codifica cada uma um péptido da subunidade maturo, e com a condição adicional de que a região de codificação da subunidade A modificada foi geneticamente modificada para causar a deleção de um motivo KDEL ou RDEL C-terminal no péptido da subunidade por ela codificado e está ligada operacionalmente a uma sequência líder para secreção a partir de uma célula de mamífero.
4. 4. Composição de acordo com a reivindicação 3, em que a região de codificação da subunidade A modificada e a região de codificação da subunidade B foram cada uma delas truncadas por uma deleção 5' com o que cada uma das referidas regiões de codificação das subunidades truncadas codifica um péptido da subunidade que não tem um péptido de sinal bacteriano amino terminal.
5. 5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a exotoxina bacteriana de ADP-ribosilação é uma enterotoxina termolábil (LT) de E. coli.
6. 6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores compreendendo ainda um antigénio de interesse. -3-
7. 7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, compreendendo ainda uma terceira sequência de ácidos nucleicos que codifica um antigénio de interesse.
8. 8. Composição de acordo com a reivindicação 6 ou 7, em que o antigénio é de um agente patogénico bacteriano, um agente patogénico virai, um agente patogénico parasitário, um alergéneo ou um antigénio específico de um tumor.
9. 9. Composição de acordo com a reivindicação 8 em que o antigénio é de um vírus da gripe, vírus do herpes simplex (VHS), vírus da hepatite ou um papilomavírus.
10. 10. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, compreendendo ainda um veículo ou excipiente farmaceuticamente aceitável.
11. 11. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores em que a composição em partículas é adequada para administração transdérmica por meio de um dispositivo de administração de partículas.
12. 12. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a partícula transportadora que forma um núcleo tem um diâmetro médio de 0,1 a 10 ym.
13. 13. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a partícula transportadora que forma um núcleo compreende um metal.
14. 14. Composição de acordo com a reivindicação 13 em que o metal é ouro. -4-
15. 15. Composição adjuvante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para utilização no aumento de uma resposta imune num indivíduo vertebrado contra um antigénio de interesse por administração do antigénio de interesse e da composição ao indivíduo.
16. 16. Composição adjuvante de acordo com a reivindicação 15, em que o antigénio de interesse e a composição são administrados no mesmo sítio no indivíduo.
17. 17. Composição adjuvante de acordo com a reivindicação 15 ou 16, em que o antigénio de interesse e a composição são administrados simultaneamente.
18. 18. Composição adjuvante de acordo com a reivindicação 15, em que a composição compreende ainda o antigénio de interesse.
19. 19. Composição adjuvante de acordo com a reivindicação 15, em que a composição compreende ainda uma terceira sequência de ácidos nucleicos que codifica o antigénio de interesse.
20. 20. Composição adjuvante de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 19, em que o antigénio de interesse é de um agente patogénico bacteriano, um agente patogénico virai, um agente patogénico parasitário, um alergéneo ou um antigénio específico de um tumor.
21. 21. Composição adjuvante de acordo com a reivindicação 20, em que o antigénio é de um vírus da gripe, vírus do herpes simplex (VHS), vírus da hepatite ou um papilomavírus. -5-
22. 22. Composição adjuvante de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 21, em que as partículas transportadoras que formam um núcleo são administradas ao indivíduo utilizando-se uma técnica de administração mediada por partículas.
23. 23. Composição adjuvante de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 22, em que o indivíduo é um ser humano.
24. 24. Produtos contendo uma composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 e um antigénio de interesse como uma preparação combinada para utilização simultânea, separada ou sequencial para aumentar uma resposta imune num indivíduo vertebrado contra o referido antigénio.
25. 25. Dispositivo para administração de partículas para administração transdérmica que está carregado com uma composição em partículas de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
26. 26. Dispositivo de acordo com a reivindicação 25 que é uma seringa sem agulha.
27. 27. Recipiente de dose unitária individual ou multidose fechado hermeticamente, adaptado para utilização num dispositivo de administração de partículas, compreendendo o referido recipiente uma composição adjuvante de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
28. 28. Utilização de uma primeira e segunda sequências de ácidos nucleicos de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 para o fabrico de um medicamento -6- para aumentar uma resposta imune num indivíduo vertebrado contra um antigénio de interesse por administração do antigénio de interesse e do medicamento ao indivíduo. Lisboa 20/11/2009 -1/26- FIGURAS

    Molécula: pPJV2002, 5500 Ph ADN circular Nome Arquivo: pPJV2002.cm5, Descrição: Ligação de frag. de FCR de CTA cortado com Nhe Bam no Vector Bam Nhe 7054 Notas: Características da Molécula: Tipo Início Fim Nome Descrição REGIÃO 2242 3060 CMVpro REGIÃO 3061 3884 intronA GENE 3906 3969 TPAsigCDS' GENE 3975 4697 CTA CDS REGIÃO 4805 5101 bGHpA Enzimas (15 sítios; 1 Sall 2241, MSCI 2256, Spei 2356, SacII 3009 BeíI 3106, PstI 3879, HindiII 3894, Hhel 3969 Ciai 4553/ BamHI 469B, BglII 4305, EcoRI 5100 Figura 1-1 -2/26- 1 61 121íai 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901. 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361 3421 3481 3541 3601 GACGRAAGGG CCTCGTGATA CTXAGACGXC AGGTGGCACT TCTAAATACA TTCAAATATG AATATTGAAA aaggaagagt TTGCGGCATT TTGCCTTCCT CTGAAGAXCA gttgggtgca TCCTTGAGAG TTTTCGCCCC TAXGTGGCGC ggtatxatcc ACTATTCTCA GAATGÀCTTG GCATGACAGT AAGAGAATTA ACITACTTCT GACAACGATC GGGATCATGT AACTCGCCTT ACGAGCGTGA caccacgatg GCGAACTACT TACTCTAGCT TTGCAGGACC ACTTCTGCGC gagccggtga gcgtgggxct CCCGTATCGT AGTTATCTAC AGATCGCTGA GATAGGTGCC CATATATACT TTAGATTGAT TCCTTTTTGA TAATCTCATG CAGACCCCGT AGAAAAGATC GCTGCTTGCA AAÇAAAAAAA TACCAACTCT TTTTCCGAAG TTCTAGTGTA GCCGTAGTTA TCGCTCTGGT AATCCTGTTA GGTTGGACTC AAGACGATAG CGTGCACACA GCCCAGCTTG AGCATTGAGA AAGCGCCACG GCAGGGTCGG AACAGGAGAG ATAGTCCTGT CGGGTTTCGC GGGGGCGGAG cctatggaaa GCTGGCCTTT TGCTCACATG TTACCGCCTT TGAGTGAGCT CAGTGAGCGA GGAAGCGGAA CGATTCATTA ATGCAGCTGG ACGCAATTAA TGTGAGTTAG CGGCTCGTAT GTTGTGXGGA ACCATGATTA CGCCAAGCTA TTOTATCTAT ATCATAAXAT xgacaxtgax tattgactag CCATATATGG AGTTCCGCGT ACGACCCCCG CCCATTGACG CTTTCCATTG ACGXCAATGG AAGTGTATCA TATGCCAAGT TGGCATTATG CCCAGTACAT TTAGTCATCG CTATTACCAT CGGTTTGACT CACGGGGATT TGGCACCAAA ATCAACGGGA ATGGGCGGTA GGCGTGTACG CAGATCGCCX GGAGACGCCA TCCAGCCTCC GCGGCCGGGA GTAAGTACCG CCTATAGACT XXTTTGGCTX GGGGCCTATA CCTATAGGTG TGGGTTATTG ATTACTAATC CATAACATGG TCTGTCCTTC AGAGACTGAC TTTACAAATT CACATATACA GCGTGGGATC TCCACGOGAA CGGCGGAGCT TCCACATCCG CAGCTCCTTG CTCCTAACAG CAGTGTGCCG CACAAGGCCG CGCCTATTTT XATAGGTTAA TTTCGGGGAA ATGTGCGCGG TATCCGCTCA TGAGACAATA ATGAGTATTC AACATTTCCG GTTTTTGCTC ACCCAGAAAC CGAGTGGGTT ACATCGAACT GAAGAACGTT TTCCAATGAT CGTATTGACG CCGGGCAAGA GTTGAGTACT CACCAG1CAC TGCAGTGCTG CCATAACCAT GGAGGACCGA AGGAGCTAAC GATCGTTGGG AACCGGAGCT CCTGTAGCAA TGGCAACAAC TCCCGGCAAC AATTAATAGA TCGGCCCTTC CGGCTGGCTG CGCGGTATCA TTGCAGCACT ACGACGGGGA .GTCftGGCAAC TCACTGATTA AGCATTGGTA TTAAAACTTC ATTTTTAATT ACCAAAATCC CTTAACGTGA AAAGGATCXT CTTGAGATCC CCACCGCTAC CAGCGGTGGT GTAACTGGCT TCAGCAGAGC GGCCACCACT TCAAGAACTC CCAGTGGCTG CTGCCAGTGG TTACCGGATA AGGCGCAGCG GAGCGAACGA CCTACACCGA CTTCCCGAAG GGAGAAAGGC CGCACGAGGG AGCTTCCAGG CACCTCTGAC TTGAGCGTCG AACGCCAGCA ACGCGGCCTT TXCXTTCCXG CGTTATCCCC GATACCGCTC GCCGCAGCCG GAGCGCCCAA TACGCAAACC CACGACAGGT XXCCCGACXG CTCACTCATT AGGCACCCCA ATTGTGAGCG GATAACAATT GTCGACATAA ATCAATATTG GTACATTTAT ATTGGCTCAT XXAXTAATAG TAATCAATTA TACATAACTT ACGGTAAATG TCAATAATGA CGTATGTTCC GTGGAGTATT TACGGTAAAC CCGGCCCCCT ATTGACGTCA GACCTTACGG GACTTTCCTA ggtgaxgcgg ttttggcagt TCCAAGTCTC CACCCCATTG CTTTCCAAAA TGTCGTAATA GTGGGAGGTC TATATAAGCA TCCACGCTGT TTTGACCTCC ACGGTGCATT GGAACGCGGA CTATAGGCAC ACCCCTTTGG CACCCCCGCT CCTTATGCTA ACCATTATTG ACCACTCCCC CTCTTTGCCA CAACTATCTC ACGGACTCTG XAXXTXXACA ACAACGCCGT CCCCCGTGCC XCXCGGGTAC GTGTTCCGGA AGCCCTGGTC CCATGCCTCC TGGAGGCCAG ACTTAGGCAC TGGCGGTAGG GTATGTGTCT TGTCATGAXA ATAATGGTTT AACCCCTAIT TGTTTATTTT ACCCTGATAA ATGCTTCAAT TGTCGCCCTT ATTCCCTTTT GCTGGTGAAA GTAAAAGATG GGATCTCAAC AGCGGTAAGA GAGCACTTTT AAAGTTCTGC GCAACTCGGT CGCCGCATAC AGAAAAGCAT CTTACGGATG GAGTGATAAC ACTGCGGCCA CGCTTTTTTG CACAACATGG GAATGAAGCC ATACCAAACG GTTGCGCAAA CTATTAACTG CTGGATGGAG GCGGATAAAG GTTTATTGCT GATAAATCTG GGGGCCAGAT GGTAAGCCCT XAXGGATGAA CGAAATAGAC ACTGTCAGAC CAAGTTTACT TAAAAGGATC TAGGTGAAGA GTTTTCGTTC CACTGAGCGT TTTTTTTCTG CGCGTAATCT TTGTTTGCCG GATCAAGAGC GCAGATACCA AATACTGTCC TGTAGCACCG CCTACATACC CGATAAGTCG TGTCTTACCG GTCGGGCTGA ACGGGGGGTT KCTGAGATAC CTACAGCGTG GGACAGGTAT CCGGTA&GCG GGGAAACGCC TGGTATCTTT ATTTTTGTGA TGCTCGTCAG TTTACGGTTC CTGGGCTTTT TGATTCTGTG GATAACCGTA AACGACCGAG CGCAGCGAGT GCCTCTCCCC GCGCGTTGGC GAAAGCGGGC AGTGAGCGCA GGCTTTACAC TTTATGCTTC TCACACAGGA AACAGCTATG GCTATTGGCC ATTGCATACG GTCCAATATG ACCGCCATGT CGGGGTCATT AGTTCATAGC GCCCGCCTCG TGACCGCCCA CATAGTAACG CCAATAGGGA TGCCCACTTG GCAGTACATC ATGACGGTAA ATGGCCCGCC CTTGGCAGTA CATCTACGTA ACACCAATGG GCGTGGATAG ACGTCAATGG GAGTTTGTTT ACCCCGCCCC GTTGACGCAA GAGCTCGTTT AGTGAACCGT ATAGAAGACA CCGGGACCGA TTCCCCGTGC CAAGAGXGAC CTCTTATGCA TGCTATACXG XAGGTGAXGG TATAGCXTAG XAXXGGXGAC GATACTTXCC TATTGGCTAT AIGCCAAXAC G3ATGGGGXC CCATXXAXTA CGCAGXXXXr ATXAAACAXA CAXGGGCTCT TCTCCGGTAG AGCGGCTCAX GGTCGCXCGG AGCACAATGC CCACCACCAC GAAAAXGAGC TCGGAGATTG Figura 1-2 -3/26- 3661 3721 3781 3841 3901 3961 4021 4081 4141 4201 4261 4321 4381 4441 4501 4561 4621 4681 4741 4601 4861 4921 4981. 5041 5101 5161 5221 5231 5341 .5401 5461 GGCTCGCACC GTgJSScAGA TGAGTTGTTG TATTCTGATA GAGGGCAGTG TAGTCTGAGC TGACAGACTA ACAGACTGTT CAATCATGGA TGCAATGAAG TCGTTTCGGC TAGCAATGAT TAAAGCAGTC AGGTGGTCTT AAATGAATAT CAACCTTTAT ATGATGGATA TGTTTCCACC TATTGTCTGG TCATTCTACT ACGTTAATGA TGTATTAGGG TAGGTGGGA? TCCATACTCC ATGAACAATT ACATCGTAAT CTCCAGCAGC AGATGGTTAT AAGAGCCGTG GATTCATCAT GTAATACTTG CGATGAAAAA CTAAAGTTAA AAGACAAATA TTAAGGATGA ATTATGAGGA CACGCTCTXG TGAGGGACAG ACCCAGATCT ACGTATGATC TGCCCCTCCC CCGTGCCTTC TAAAATGAGG AAATTGCATC GTGGGGCAGG ACAGCAAGGG GTGGGCTCTA TGGCTTCTGA AATTCACTGG CCGTCGTTTT AATCGCCTTG CAGCACATCC GATCGCCCTT CCCAACAGTT CTCCTTACGC ATCTGTGCGG TCTGATGCCG CATAGTTAAG CGGGCTTGTC TGCTCCCGGC ATGTGTCAGA GGTTTTCACC TGGAAGACTT AAGGCAGCGG AGAGTCAGAG GTAACTCCCG AGTACTCGTT GCTGCCGCGC CCTTTCCATG GGTCTTTTCT AGAGGGCTCT GCTGTGTGCT GATAAGTTAT ATCGGGCAGA ATGCCAAGAG GACAGAGTGA GATCATGCAA GAGGAACTCA TCAATTAGTT TGAGAAGTGC TATTATATAT ATGTTATAGC GCATACAGTC CTCATCCAGA CAAATATATG GATGGTATCG AGGGGCTACA GAGATAGATA GGATTGGCAG GTTTCCCTCC GCACCGCCGG GTTGTGGGAA ACCCAAAGTC TAGGTGTAAA TTTTCAGGCT ATCAATCTGA TCCTCGCAAT CCCTAGGAGG AAATACAATC AGGGGCAGTA AGCCTCGACT GTGCCTTCTA CTTGACCCTG SAAGGTGCCA GCATTGTCTG- AGTAGGTGTC GGAGGATTGG GAAGACAATA GGCGGAAAGA ACCAGCTGGG ACAACGTCGT GACTGGGAAA CCCTTTCGCC AGCTGGCGTA GCGCAGCCTG AATGGCGAAT TATTTCACAC CGCATATGGT CCAGCCCCGA CACCCGCCAA ATCCGCTTAC AGACAAGCTG GTCATCACCG AAACGCGCGA CAGAAGAAG^TGGAGGCAGC TTGCGGTGCT GTTAACGGTG GCGCCACCAG ACATAATAGC GCA5TCACCG TCCAAGCTTG GCTGCTGTGT GGAGCAGTCT TTCTAGACCT CCTGATGAAA GTACTTTGAC CGAGGTACTC GACGGGATTT GTTAGGCACG CCACTTAGTG GGTCAAACTA CACTGCACCC AACATGTTTA TGAACAAGAA GTTTCTGCTT AGTTCATTTT GGGGTGCTTG TTACAGTAAC TTAGATATTG GGAGCATAGA GCTTGGAGGG TGCTCCAAGA TCATCGATGA ATTCCTTGAC GAATACCAAT TATTGATACA CATAATAGAA ATTAGGCAAG GGCTTGAGCT TATGAATACT CCATGGAGAA GTTGCCAGCC ATCTGTTGTT CTCCCACTGT CCTTTCCTAA ATTCTATTCT GGGGGGTGGG GCAGGCATGC TGGGGATGCG GCTCGACAGC TCGACTCTAG ACCCTGGCGT TACCCAACTT AXAGCGAAGA GGCCCGCACC GGCGCCTGAT GCGGTATTTT GCACTCTCAG TACAATCTGC CACCCGCTGA CGCGCCCTGA TGACCGTCTC CGGGAGCTGC Figura 1-3 -4/26-

    Molécula: pPJV2003, 5589 bps ADN circular Nome Arquivo: pPJV2003.cm5, Descrição : Ligação de f rag. de CTB cortado com Nhe Bam no Vectoi Nhe Bam 7054 Notas: Caracteristicas da Molécula : Tipo Inicio Fim Nome Descrição REGIÃO 2242 3060 CMVpro REGIÃO 3061 3884 intronA GENE 3906 3969 TPAsigCDS' GENE 3975 4286 CTA CDS REGIÃO 4394 4690 bGHpA Enzimas (16 sítios; 1 Pcil 1876, Sall 2241, MscI 2266, Spel 2356 SacII 3009, Nsil 3106, PstI 3879, HindIII 3894 Hhel 3969, BaraHI 4287, BglII 4394, Xbal 4685 Figura 2-1 -5/26- i 61 121 181 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2151 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2S81 2641 2701 2761 2321 2 881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361 3421 3481 3541 3601 GACGAAAGGG CCTCGTGATA CTTAGACGTC AGGTGGCACT TCTAAATACA TTCAAATATG AATATTGAAA AAGGAAGAGT TTGCGGCATT TTGCCTTCCT CTGAAGATCA GTTGGGTGCA TCCTTGAGAG TTTTCGCCCC TATGTGGCGC GGTATTATCC ACTATTCTCA GAATGACTTG GCATGACAGT AAGAGAATTA ACTTACTTCT GACAACGATC GGGATCATGT AACTCGCCTT ACGAGCGTGA CACCACGATG GCGAACTACT TACTCTAGCT TTGCAGGACC ACTTCTGCGC GAGCCGGTGA GCGTGGGTCT CCCGTATCGT AGTTATCTAC AGATCGCTGA GATAGGTGCC CATATATACT TTAGATTGAT TCCTTTTTGA TAATCTCATG CAGACCCCGT.AGAAAAGATC GCTGCTTGCA AACAAAAAAA TACCAACTCT TTTTCCGAAG TTCTAGTGTA GCCGTAGTTA TCGCTCTGCT AATCCTGTTA GGTTGGACTC AAGACGATAG CGTGCACACA GCCCAGCTTG AGCATTGAGA AAGCGCCACG GCAGGGTCGG AACAGGAGAG ATAGTCCTGT CGGGTTTCGC GGGGGCGGAG CCTATGGAAA GCTGGCCTTT TGCT.CACATG TTACCGCCTT TGAGTGAGCT CAGTGAGCGA GGAAGCGGAA CGATTCATTA ATGCAGCTGG ACGCAATTAA TGTGAGTTAG CSGCTCGTAT GTTGTGTGGA ACCATGATTA CGCCAAGCTA TTGTATCTAT ATCATAATAT TGACATTGAT TATTGACTAG CCATATATGG AGTTCCGCGT ACGACCCCCG CCCATTGACG CTTTCCATTG ACGTCAATGG AAGTGTATCA TATGCCAAGT TGGCATTATG CCCAGTACAT TTAGTCATCG CTATTACCAT CGGTTTGACT CACGGGGATT TGGCACCAAA ATCAACGGGA ATGGGCGGTA GGCGTGTACG CAGATCGCCT GGAGACGCCA TCCAGCCTCC GCGGCCGGGA GTAAGTACCG CÇTATAGACT TTTTTGGCTT GGGGCCTATA CCTATAGGTG TGGGTTATTG ATTACTAATC CATAACATGG TCTGTCCTTC AGAGACTGAC TTTACAAATT CACATATACA GCGTGGGATC TCCACGCGAA CGGCGGAGCT TCCACATCCG CAGCTCCTTG CTCCTAACAG CAGTGTGCCG CACAAGGCCG CGCCTATTTT TATAGGTTAA TTTCGGGGAA ATGTGCGCGG TATCCGCTCA TGAGACAATA ATGAGTATTC AACAXTTCCG GTTXTTGCTC ACCCAGAAAC CGAGTGGGXT ACATCGAACT GAAGAACGTT TTCCAATGAT CGTAXTGACG CCGGGCAAGA GTTGAGTACT CACCAGTCAC TGCAGTGCTG CCATAACCAT GGAGGACCGA AGGAGCTAAC GATCGTTGGG AACCGGAGCT CCTGTAGCAA TGGCAACAAC TCCCGGCAAC AATTAATAGA XCGGCCCIXC CGGCTGGCTG CGCGGTATCA TTGCAGCACT ACGACGGGGA GTCAGGCAAC XCACXGAXXA AGCATTGGTA TTAAAACXTC ATTTTTAATT • ACCAAAATCC CTTAACGTGA AAAGGATCTT CTTGAGAICC CCACCGCTAC CAGCGGTGGT GTAACTGGCT TCAGCAGAGC GGCCACCACT TCAAGAACTC CCAGTGGCTG CTGCCAGTGG TTACCGGATA AGGCGCAGCG GAGCGAACGA CCIACACCGA CTTCCCGAAG GGAGAAAGGC CGCACGAGGG AGCTTCCAGG CACCTCTGAC XTGAGCGXCG AACGCCAGCA ACBCGGCCTX TTCTTTGCTG CGTTATCCCC GATACCGCTC GCCGCAGCCG GAGCGCCCAA TACGCAAACC CACGACAGGT TTCCCGACTG CTCACTCATT AGGCACCCCA ATTGTGAGCG GATAACAATT GTCGACAXAA AXCAATATTG GTACATTTAT ATTGGCTCAT TTATTAATAG TAA.TCAATTA TACATAACTX ACGGXAAATG TCAATAAXGA CGTATGTTCC GTGGAGTAXT TACGGTAAAC CCGGCCCCCT ATTGACGTCA GÁCCTXACGG GACTXXCCTA GGTGAXGCGG TTTTGGCAGT TCCAAGTCTC CACCCCATXG CTXTÇCAAAA TGTCGTAATA GXGGGAGGXC TATATAAGCA TCCACGCTGT XTTGACCXCC ACGGTGCATT QGAACGCGGA CXATAGGCAC ACCCCTTTGG CACCCCCGCT CCTTATGCTA ACCATTATTG ACCACTCCCC CTCTTTGÇCA CAACXATCXC ACGGACXCTG IATTTTTACA ACAACGCCGT CCCCCGTGCC XCICGGGTAC GTGXTCCGGA AGCCCTGGTC CCATGCCTCC TGGAGGCCAG ACXXAGGCAC XGGCGGXAGG GTATGTGTCT TGTCAXGATA ataatggttt AACCCCTATT TGTTTATTTT ACCCTGATAA ATGCXXCAAX TGTCGCCCTT ATTCCCTTXT GCTGGTGAAA GXAAAAGAXG GGATCTCAAC AGCGGXAAGA GAGCACTTTT AAAGXTCTGC GCAACTCGGT CGCCGCATAC AGAAAAGCAX CXTACGGAXG GAGTGATAAC ACTGCGGCCA CGCTTTTTTG CACAACAXGG GAATGAAGCC ATACCAAACG GTTGCGCAAA CIATTAACTG CIGGATGGAG GCGGATAAAG GXTXATXGCT GAXAAATCTG GGGGCCAGAX GGTAAGCCCX TATGGATGAA CGAAATAGAC ACTGTCAGAC CAAGXXTACX XAAAAGGATC TAGGTGAAGA GTTTTCGTTC CACTGAGCGX XTTTTTTCTG CGCGTAATCT TTGTXTGCCG GATCAAGAGC GCAGAXACCA AAXACIGTCC TGTAGCACCG CCTACATACC CGAXAAGTCG XGTCXXACCG · gtcgggctga acggggggtx· ACXGAGAXAC CTACAGCGTG GGACAGGXAT CCGGXAAGCG GGGAAACGCC TGGTATCTTT AXTXTTGTGA TGCTCGTCAG TTTACGGTTC CTGGCCTTTT TGATTCTGTG GATAACCGTA AACGACCGAG CGCAGCGAGT GCCTCTCCCC GCGCGTTGGC GAAAGCGGGC AGTGAGCGCA GGCTTTACAC TTTATGCTTC TCACACAGGA AACAGCTAXG GCXATXGGCC AXTGCATACG GTCCAATATG ACCGCCATGT CGGGGTCATT AGTTCATAGC GCCCGCCTCG TGACCGCCCA CATAGTAACG CCAATAGGGA TGCCCACTTG GCAGTACATC AXGACGGTAA ATGGCCCGCC CTTGGCAGXA CATCTACGTA ACACCAAXGG GCGTGGATAG ACGTCAATGG GAGTTTGTTT ACCCCGCCCC GTTGACGCAA GAGCTCGTTT AGTGAACCGT ATAGAAGACA CCGGGACCGA TTCCCCGTGC CAAGAGTGAC CTCTTATGCA TGCTATACTG TAGGTGATGG TATAGCTTAG TATTGGTGAC GATACTTTCC TATTGGCTAT ATGCCAATAC GGATGGGGTC·CCATTTATTA CGCAGTTTTT ATXAAACATA CATGGGCTCT TCTCCGGTAG AGCGGCTCAT GGTCGCTCGG AGCACAATGC CCACCACCAC GAAAATGAGC TCGGAGATTG Figura 2-2 -6/26-3661 GGCTCGCACC GK^BcAGA TGGAAGACTT AAGGCAGCGÍf 3721 TGAGTTGTTG TATTCTGATA AGAGTCAGAG GTAACTCCCG TTGCGGTGCT GTTAACGGTG 3781 GAGGGCASTG TAGTCTGAGC AGTACTCGTT GCTGCCGCGC GCGCCACCAG ACATAATAGC 3841 TGACAGACTA ACAGACTGTT CCTTTCCATG GGTCTTTTCT GCAGTCACCG TCCAAGCTTG 3901 CAATCATGGA TGCAATGAAG AGAGGGCTCT GCTGTGTGCT GCTGCTGTGT GGAGCAGTCT 3961 TCGTTTCGGC TAGCACACCT CAAAATATTA CTGATTTGTG TGCAQAATAC CACAACACAC 4021 AAATATATAC GCTAAATGAT AAGATATTTT CGTATACAGA ATCTCTAGCT GGAAAAAGAG 4081 AGATGGCTAT CATTACTTTT AAGAATGGTG CAATTTTTCA AGTAGAAGTA CCAGGTAGTC 4141 AACATATAGA ttcacaaaaa AAAGCGATTG AAAGGATGAA ggataccctg AGGATTGCAT 4201 ATCTTACTGA agctaaagtc gaaaagttat GTGTATGGAA taataaaacg cctcatgcga 4261 TTGCCGCAAT TAGTATGGCA AATTAAGGAT CCTCGCAATC CCTAGGAGGA TTAGGCAAGG 4321 GCTTGAGCTC ACGCTCTTGT GAGGGACAGA AATACAATCA GGGGCAGTAT ATGAATACTC 4381 CATGGAGAAA CCCAGATCTA CGTATGATCA GCCTCGACTG TGCCTTCTAG TTGCCAGCCA 4441 TCTGTTGTTT GCCCCTCCCC CGTGCCTTCC TTGACCCTGG AAGGTGCCAC TCCCACTGTC 4501 CTTTCCTAAT AAAATGAGGA AATTGCATCG CATTGTCTGA GTAGGTGTCA TTCTATTCTG 4561 GGGGGTGGGG TGGGGCAGGA CAGCAAGGGG GAGGATTGGG AAGACAATAG CAGGCATGCT 4621 GGGGATGCGG TGGGCTCTAT GGCTTCTGAG GCGGAAAGAA CCAGCTGGGG CTCGACAGCT 4681. OGACTCEAGA ATTCACTGGC CGTCGTTTTA CAACGTCGTG ACTGGGAAAA CCCTGGCGTT 4741 ACCCAACTTA ATCGCCTTGC AGCACATCCC CCTTTCGCCA GCTGGCGTAA TAGCGAAGAG. 4801 GCCCGCACCG ATCGCGCTTC CCAACAGTTG CGCAGCCTGA ATGGCGAATG GCGCCTGATG 4861 CGGTATTTTC TCCTTACGCA TCTGTGCGGX ATTTCACACC GCATATGGTG CACTCTCAGT 4921 ACAATCTGCT CTGATGCCGC ATAGTTAAGC CAGCCCCGAC ACCCGCCAAC ACCCGCTGAC 4981 GCGCCCTGAC GGGCTTGTCT GCTCCCGGCA TCCGCTTACA GACAAGCTGT GACCGTCTCC 5041 GGGAGCTGCA TGTGTCAGAG GTTTTCACCG TCATCACCGA AACGCGCGA Figura 2-3 -7/26-

    Molécula: pPJV2006, 5488 bps ADN circular Nome Arquivo: pPJV2006.cm5, Descrição: Ligação de frag. de CTA-KDEL PCR cortado com Nhe Bam no Vector Nhe Bam 7054 Notas: Caracteristicas da Molécula: Tipo Inicio Fim Nome Descrição REGIÃO 2242 3060 CMVpro REGIÃO 3061 3884 intronA GENE 3906 3969 TPAsigCDS' GENE 3975 4285 CTA CDS REGIÃO 4394 5089 bGHpA Enzimas (15 sitios) Sall 2241, MSCl 2266, Spel 2356, Sacll 3009 Msil 3106, psti 3879, Hindin 3394, Nhel 3 969 Ciai 4553, BamHI 4686, BglXI 4793, EcoRX 50Θ8 Figura 3-1 1 61 121 18:1 • 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1081 1141 1201 1261 1321 1381 1441 1501 1561 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361 3421 3481 3541 3601 -8/26- GACGAAAGGG CCTCGTGATA CGCCTATTTT TATAGGTTAA TGTCATGATA ATAATGGTTT CTTAGACGTC AGGTGGCACT ITTCGGGGAA ATGTGCGCGG AACCCCTATT TGTTTAXTTT TCTAAATACA TTCAAATATG TATCCGCTCA TGAGACAATA ACCCTGATAA ATGCTTCAAT AATATTGAAA AAGGAAGAGT. ATGAGTATTC AACATTTCCG TGTCGCCCTT ATTCCCTTTT TTGCGGCATT TTGCCTTCCT GTTTTTGCTC ACCCAGAAAC GCTGGTGAAA GTAAAAGATG CTGAAGATCA GTTGGGTGCA CGAGTGGGTT ACATCGAACT GGATCTCAAC AGCGGTAAGA XCCXTGAGAG TTTTCGCCCC GAAGAACGTT TTCCAATGAT GAGCACTTTT AAAGTTCTGC TATGTGGCGC GGTATTATCC CGTATTGACG CCGGGCAAGA GCAACTCGGT CGCCGCATAC ACTATTCXCA GAAXGACTTG GTTGAGXACT CACCAGTCAC AGAAAAGCAT CTTACGGATG GCATGACAGT AAGAGAATTA XGCAGTGCTG CCAXAACCAX GAGTGATAAC ACTGCGGCCA ACTTACXTCT GACAACGAXC GGAGGACCGA AGGAGCXAAC CGCTmTTG CACAACATGG GGGATCATGT AACXCGCCTT GATCGXTGGG AACCGGAGCX GAAXGAAGCC AXACCAAACG ACGAGCGTGA CACCACGAIG CCXGXAGCAA TGGCAACAAC GXXGCGCAAA CTATTAACTG GCGAACTACT TACXCTAGCI XCCCGGCAAC AATTAAXAGA CTGGATGGAG GCGGATAAAG TTGCAGGACC ACTXCTGCGC TCGGCCCTTC CGGCXGGCXG GTTTATTGCT GATAAAICTG GAGCCGGTGA GCGTGGGXCX CGCGGTATCA TTGCAGCACT GGGGCCAGAT GGTAAGCCCX CCCGTATCGT AGTTATCTAC ACGACGGGGA GTCAGGCAAC TATGGATGAA CGAAATAGAC AGATCGCTGA GATAGGTGCC TCACTGATTA AGCAXTGGXA ACTGTCAGAC. CAAGTTTACT CATATAXACT TTAGAXTGAX TIAAAACTXC ATTTTXAATT TAAAAGGAXC IAGGXGAAGA TCCTTTXXGA TAAXGXCAXG ACCAAAATCC CTTAACGTGA' GTTTTCGTTC CACTGAGCGT CAGACCCCGT AGAAAAGATC AAAGGATCTT CTTGAGATCC TXTTTTTCTG CGCGTAATCT GCXGCTTGCA AACAAAAAAA CCACCGCTAC CAGCGGTGGT TTGXTTGCCG GAXCAAGAGC TACCAACTCT TTTTCCGAAG GTAACTGGCT TCAGCAGAGC GCAGATACCA AATACTGTCC TTCTAGXGXA GCCGTAGTTA GGCCACCACT TCAAGAACTC TGTAGCACCG CCTACATACC TCGCTCTGCT AATCCTGTTA CCAGTGGCTG CTGCCAGTGG CGAXAAGTCG TGTCTTACCG GGTTC-GACTC AAGACGAXAG 'TXACCGGATA AGGCGCAGCG GTCGGGCTGA ACGGGGGGTT CGTGCACACA GCCCAGCTTG GAGCGAACGA CCTACACCGA ACTGAGATAC CTACAGCGXG AGCATTGAGA AAGCGCCACG CTTCCCGAAG GGAGAAAGGC GGACAGGTAT CCGGTAAGCG GCAGGGTCGG AACAGGAGAG CGCACGAGGG AGCTTCGAGG GGGAAACGCC TGGTATCTTT AXAGTCCXGT .CGGGTTTCGC CACCTCTGAC TTGAGCGTCG ATTTTTGTGA TGCTCGTCAG GGGGGCGGAG CCXAXGGAAA AACGCCAGCA ACGCGGCCTT TTTACGGTTC CTGGCCTTTT GCTGGCCTTX TGCTCACATG XXCXXTCCTG CGTTATCCCC TGATTCTGXG GAXAACCGTA TTACCGCCTI TGAGTGAGCT GAXACCGCXC' GCCGCAGCCG AACGACCGAG CGCAGCGAGT CAGTGAGCGA GGAAGCGGAA GAGCGCCCAA TACGCAAACC GCCTCTCCCC GCGCGXTGGC CGATTCATXA ATGCAGCTGG CACGACAGGT TXCCCGACTG GAAAGCGGGC AGTGAGCGCA ACGCAATTAA TGTGAGTTAG CTCACXCAXT AGGCACCCCA GGCTTTACAC TTTATGCTTC CGGCTCGTAT gxtgtgtgga atxgxgagcg gataacaatx tcacacagga AACAGCXAXG ACCATGATXA CGCCAAGCXA GTCGACATAA ATCAATATTG GCTATTGGCC ATTGCATACG TTGTAXCTAX ATCATAAIAT GTACATTTAT ATTGGCTCAT GTCCAATATG ACCGCCATGX TGACAXXGAT XAXXGACXAG TTATXAATAG TAAXCAATTA CGGGGTCATT AGTXCATAGC CCATATATGG AGXTCCGCGT XACAXAACTT ACGGTAAATG GCCCGCCTCG TGACCGCCCA ACGACCCCCG CCCATTGACG TCAAXAATGA CGTATGTTCC CAXAGTAACG CCAATAGGGA CXTTCCATTG ACGTCAAfGG GTGGAGTATT TACGGTAAAC TGCCCACTTG GCAGTACATC AAGTGTATCA TATGCCAAGT CCGGCCCCCT ATTGACGXCA ATGACGGTAA ATGGCCCGCC TGGCATTATG CCCAGTACAT GACCTTACGG GACTTTCCTA CTTGGCAGTA CATCTACGTA TTAGTCAXCG CTATTACCAT GGTGATGCGG TTTTGGCAGT ACACCAATGG GCGTGGAXAG CGGTTTGACT CACGGGGATT TCCAAGTCTC CACCCCATTG ACGTCAATGG GAGTTTGTTT TGGCACCAAA ATCAACGGGA CTTTCCAAAA TGTCGTAATA ACCCCGCCCC GTTGACGCAA ATGGGCGGTA GGCGXGTACG. GTGGGAGGTC TATATAAGCA GAGCXCGTTT AGTGAACCGT CAGATCGCCT GGAGACGCCA TCCACGCTGT TTTGACCTCC ATAGAAGACA CCGGGACCGA TCCAGCCTCC GCGGCCGGGA ACGGTGCATT GGAACGCGGA TTCCCCGTGC CAAGAGTGAC GTAAGTACCG CCTATAQACT CTATAGGCAC ACCCCTTXGG CTCTTATGCA TGCTATACTG TTTTTGGCTT GGGGCCTATA CACCCCCGCT CCTTAXGCTA TAGGTGAXGG TATAGCTTAG CCTATAGGTG TGGGTTATTG ACCATTATTG ACCACXCCCC TATTGGTGAC GATACXTTCC ATTACTAATC CATAACATGG CTCTTTGCCA CAACTATCTC TATTGGCTAT ATGCCAAXAC TCTGTCCTTC AGAGACTGAC ACGGACICTG TATTTTTACA GGATGGGGTC CCATTTATTA TTXACAAATT CACATATACA ACAACGCCGX CCCCCGTGCC CGCAGTTTTT ATXAAACATA GCGTGGGATC ICCACGCGAA TCTCGGGTAC GTGTTCCGGA CAXGGGCXCT TCTCCGGXAG CGGCGGAGCT TCCACAXCCG AGCCCTGGTC CCATGCCTCC AGCGGCTCAT GGICGCTCGG CAGCTCCTTG CTCCTAACAG TGGAGGCCAG ACTTAGGCAC AGCACAATGC CCACCACCAC CAGTGTGCCG CACAAGGCCG TGGCGGTAGG GTATGTGTCT GAAAATGAGC TCGGAGAXTG Figura 3-2 -9/26- 3661 3721 3731 3841 3901 3951 4021 4081 4141 4201 4251 4321 4381 4441 4501 4561 4521 4681 4741 4801 4861 4921 4981 5041 5101 5161 5221 5281 5341 5401 5461 GGCTCGCACC GTGl koA TGGAAGACTT TGAGTTGTTG TATTCTGATA AGAGTCAGAG GAGGGCAGTG TAGTCTGAGC AGTACTCGTT TGACAGACTA ACAGACTGTT CCTTTCCATG CAATCATGGA TGCAATGAAG AGAGGGCTCT TGGTTTCGGC TAGCAATGAT GATAAGTTAT TAAAGCAGTC AGGTGGTCTT ATGCCAAGAG AAATGAATAT CAACCTTTAT GATCATGCAA ATGATGGATA TGTTTCCACC TCAATTAGTT TATTGTCTGG TCATTCTACT TATTATATAT ACGTTAATGA TGTATTAGGG GCATACAGTC TAGGTGGGAT TCCATACTCC CAAATATATG ATGAACAATT ACATCGTAAI AGGGGCTACA CTCCAGCAGC AGATGGTTAT GGATTGGCAG AAGAGCCGTG GATTCATCAT GCACCGCCGG GTAATACTTG CGATGAAAAA ACCCAAAGTC CTAAAGTTAA AAGACAAATA TTTTCAGGCT TTTGAGGATC CTCGCAATCC CTAGGAGGAT AGGGACAGAA ATACAATCAG GGGCAGTATA GTATGATCAG CCTCGACTGT GCCTTCTAGT GTGCCTTCCT TGACCCTGGA AGGTGCCACT ATTGCATCGC ATTGTCTGAG TAGGTGTCAT AGCAAGGGGG AGGATTGGGA AGACAATAGC GCTTCTGAGG CGGAAAGAAC CAGCXGGGGC GTCGTTTTAC AACGTCGTGA CTGGGAAAAC GCACATCCCC CTTTCGCCAG CTGGCGTAAT CAACAGTTGC GCAGCCTGAA TGGCGAATGG CTGTGCGGTA TTTCACACCG CATATGGTGC TAGTTAAGCC agcgccgaca cccgccaaca CTCCCGGCAT CCGCTTACAG ACAAGCTGTG TTTTCACCGT CATCACCGAA ACGCGCGA AAGGCAGCGG3C9®?®.' _&| GpAGGSAGCq, λ GTAACTCCCG TTCCGGTGCX -'MÍkCGGTG"* GCTGCCGCGC GCGCCACCAG ACAXAATAGC GGTCTTTTCT GCAGTCACCG TCCAAGCTTG GCTGTGTGCT GCTGCTGTGT GGAGCAGTCT ATCGGGCAGA TTCTAGACCT CCTGATGAAA GACAGAGTGA GTACTTTGAC CGAGGTACTC GAGGAACTCA GACGGGATTX GTTAGGCACG TGAGAAGTCC CCACTTAGTG GGTCAAACTA ATGTTATAGC CACTGCACCC AACATGTTTA CTCATCCAGA TGAACAAGAA GTTTCTGCTT GATGGTATCG AGTTCATTTT GGGGTGCTTG GAGATAGATA TTACAGTAAC TTAGATATTG GTTTCCCTCC GGAGCATAGA GCTTGGAGGG GTTGTGGGAA TGCTCCAAGA TCATCGATGA TAGGTGTAAA ATTCCTTGAC GAATACCAAT ATCAATCTGA TATTGATACA CATAATAGAA TAGGCAAGGG CTTGAGCTCA CGCTCTTGTG TGAATACTCC ATGGAGAAAC CCAGATCTAC TGCCAGCCAT CTGTTGTTTG CCCCTCCCCC CCCACTGTCC TTTCCTAATA AAATGAGGAA TCTATTCTGG GGGGTGGGGT GGGGCAGQAC AGGCATGCTG GGGATGCGGT GGGCTCTATG TCGACAGCTC GACTCXAGAA TTCACTGGCC CCTGGCGTTA CCCAACTTAA TCGCCTTGCA agcgaagagg cccgcaccga tcgcccttcc CGCCTGATGC GGTATTTTCT CCTTACGCAT ACTCTCAGTA CAATCTGCTC TGATGCCGCA CCCGCTGACG CGCCCTGACG GGCTTGTCXG ACCGTCTCCG GGAGCTGCAT GTGTCAGAGG Figura 3-3 -10/26- 5261,Nari,

    Molécula: pPJV2004, 5500 bps ADN circular Nome Arquivo: pPJV2004.cm5, Descrição: Ligação da Inserção de LTA Nhe-Bam no Vector Nhe Bam 7054 Notas: Características da Molécula: Tipo Início Fim Nome Descrição REGIÃO 2242 3060 CMVpro REGIÃO 3061 3884 intronA GENE 3906 3969 TPAsigCDS' GENE 3975 4697 CTA CDS REGIÃO 4805 5101 bGHpA Enzimas (13 sítios) Pcil 1876, Sa.ll 2241, MscI 2266, Spel 2356 Sacll 3009, Nsil 3106, PBtl 3 879, Nhel 3969 BaniHI 4698, Bglll 4805, Ehel 5261, Kasl 5261. Figura 4-1 -11/26- 1 61 121 Ιβί 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 1031 1141 1201 1251 1321 1331 1441 '1501 1551 1621 1681 1741 1801 1861 1921 1981 2041 2101 2161 2221 2281 2341 2401 2461 2521 2581 2641 2701 2761 2821 2881 2941 3001 3061 3121 3181 3241 3301 3361 3421 3481 3541 3601 GACGAAAGGG CCTCGTGATA CGCCTATTTT CTTAGACGTC AGGTGGCACT TTTCGGGGAA TCTAAATACA TTCAAATATG TATCCGCTCA AATATTGAAA AAGGAAGAGT ATGAGTAXTC TTGCGGCATT TTGCCTTCCT GTTTTTGCTC CTGAAGATCA GTTGGGTGCA CGAGTGGGTT TCCTTGAGAG TTTTCGCCCC GAAGAACGTT TATGTGGCGC GGTATTATCC CGTATTGACG ACTATTCTCA GAATGACTTG GTTGAGTACT GCATGACAGT AAGAGAATTA TGCAGTGCTG ACTTACTTCX GACAACGATC GGAGGACCGA GGGATCATGT AACTCGCCTT GATCGTTGGG ACGAGCGTGA CACCACCATG CCTGTAGCAA GCGAACTACT TACTCTAGCT TCCCGGCAAC TTGCAGGACC ACTTCTGCGC TCGGCCCTTC GAGCCGGTGA GCGTGGGTCT CGCGGTATCA. CCCGTATCGT AGTTATCTAC ACGACGGGGA AGATCSCTGA GATAGGTGCC XCACTGATTA CATATATACT TTAGATTGAT TTAAAACTTC TCCTTTTTGA TAATCTCATG ACCAAAATCC . CAGACCCCGT AGAAAAGATC ÁAAGGATCTT GCTGCTTGCA AACAAAAAAA CCACCGCTAC TACCAACTCT TTTTCCGAAG GTAACTGGCT TTCTAGTGTA GCCGTAGTTA GGCCACCACT TCGCTCTGCT AATCCTGTTA CCAGTGGCTG GGTTGGACTC AAGACGATAG TTACCGGATA CGTGCACACA GCCCAGCTTG GAGCGAACGA AGCATTGAGA AAGCGCCACG CTTCCCGAAG GCAGGGTCGG AAGAGGAGAG CGCACGAGGG ATAGTCCTGT CGGGTTTCGC CACCTCTGAC GGGGGCGGAG CCTATGGAAA AACGCCAGCA GCTGGCCTTT TGCTCACAXG TTCXTTCCTG TTACCGCCTT TGAGTGAGCT GATACCGCIC CAGTGAGCGA GGAAGCGGAA GAGCGCCCAA CGATTCAXTA ATGCAGCTGG CACGACAGGT ACGCAATTAA TGTGAGTTAG CTCACTCATT CGGCTCGTAT GTXGTGTGGA ATTGTGAGCG ACCATGATTA CGCCAAGCTA GTCGACATAA TTGTATCTAT ATCAXAATAT GTACAXTTAT TGACATTGAT TATTGACTAG TTATTAATAG CCATATATGG AGTTCCGCGT TACATAACTT ACGACCCCCG CCCATTGACG TCAATAATGA CTTTCCATTG ACGTCAATGG GTGGAGTATT AAGTGTATCA TATGCCAAGT COGGCCCCCT TGGCATTATG CCCAGTACAT GACCTTACGG TTAGTCATCG CTATTACCAT GGTGATGCGG CGGTTTGACT CACGGGGATT TCCAAGTCTC TGGCACCAAA ATCAACGGGA CTTTCCAAAA ATGGGCGGTA GGCGTGTACG GTGGGAGGTC CAGATCGCCT GGAGACGCCA XCCACGCTGT TCCAGCCTCC GCGGCCGGGA ACGGTGCATT GTAAGTACCG CCTATAGACT CTATAGGCAC TTTTTGGCTT GGGGCCTATA CACCCCCGCT CCTATAGGTG TGGGTTATTG ACCATTATTG , ATTACTAATC CATAACATGG CTCTTTGCCA TCTGTCCTTC AGAGACXGAC ACGGACTCTG TTTACAAATT CACATATACA ACAACGGCGT GCGTGGGATC TCCACGCGAA TCTCGGGTAC CGGCGGAGCT TCCACATCCG AGCCCTGGTC CAGCTCCTTG CTCCTAACAG TGGAGGCCAG CAGTGTGCCG CACAAGGCCG TGGCGGTAGG TATAGGTTAA TGTCATGATA ATAATGGTTT ATGTGCGCGG AACCCCTATT TGTTTATTTT TGAGACAATA ACCCTGATAA ATGCTTCAAT AACATTTCCG TGTCGCCCTT ATTCCCTTTT ACCCAGAAAC GCTGGTGAAA GTAAAAGATG ACATCGAACT GGAXCtCAAC AGCGGTAAGA TTCCAATGAT GAGCACTTTT AAAGTTCTGC CCGGGCAAGA GCAACTCGGT CGCCGCATAC CACCAGTCAC AGAAAAGCAT CTTACGGATG CCATAACCAT GAGTGATAAC ACTGCGGCCA AGGAGCTAAC GGCTTTTTTG CACAACATGG AACCGGAGCT GAATGAAGCC ATACCAAACG TGGCAACAAC GTTGCGCAAA CTATTAACTG AATTAATAGA CTGGAXGGAG GCGGATAAAG CGGCTGGCTG GTTTATTGCT GATAAATCTG TTGCAGCACX GGGGCCAGAT GGTAAGCCCT GTCAGGCAAC TATGGATGAA CGAAATAGAC AGCATTGGTA ACTGTCAGAC CAAGTTTACT ATTTTTAATT TAAAAGGAXC TAGGTGAAGA GTTAACGTGA GTTTTCGTTC CACTGAGCGT CTTGAGATCC TXXXXXXCIG CGCGTAATCT CAGCGGTGGT TTGTTTGCCG GATCAAGAGC TCAGCAGAGC GCAGAIACCA AATACTGXCC TCAAGAACTC TGTAGCACCG CCTACATACC CXGCCAGTGG CGATAAGTCG TGTCTTACCG AGGCGCAGCG GTCGGGCTGA ACGGGGGGXT CCTACACCGA ACTGAGATAC CTACAGCGTG GGAGAAAGGC GGACAGGXAX CCGGTAAGCG AGCTXCCAGG GGGAAACGCC TGGTATCTTT XT3AGCGTCG ATTTTTGXGA TGCTOGTCAG ACGCGGCCTT TTTACGGXTC CTGGCCTXTT CGTTATCCCC TGATTCXGTG GATAACCGTA GCCGCAGCCG AACGACCGAG CGCAGCGAGT TACGCAAACC GCCXCTCCCC GCGCGTTGGC TTCCCGACTG GAAAGCGGGC AGTGAGCGCA AGGCACCCCA GGCTXTACAC TTTATGCTTC GAXAACAAXX TCACACAGGA AACAGCTATG ATCAAXATTG GCTATTGGCC ATTGCATACG ATXGGCTCAT GTCCAATATG ACCGCCATGT TAATCAAXTA CGGGGTCATT AGTTCATAGC ACGGTAAATG GCCCGCCTCG XGACCGCCCA CGTATGTTCC CATAGTAACG CCAATAGGGA TACGGTAAAC TGCCCACTTG GCAGTACATC ATTGACGTCA AXGACGGXAA AXGGCCCGCC GACTTTCCTA CTTGGCAGTA CATCTACGTA TTTTGGCAGT ACACCAATGG GCGTGGATAG CACCCCATTG ACGTCAATGG GAGTTTGTTT TGTCGTAATA ACCCCGCCCC GTTGACGCAA TATATAAGCA GAGCTCGTTT AGTGAACCGT TTTGACCTCC ATAGAAGACA CCGGGACCGA GGAACGCGGA TTCCCCGTGC CAAGAGTGAC ACCCCTTTGG CXCTTATGCA TGCTATACTG CCTTATGCTA TAGGTGATGG TATAGCTTAG ACCACTCCCC TATTGGTGAC GATACTTTCC CAACXATCTC TATTGGCTAT ATGCCAATAC TATTTTTACA GGATGGGGTC CCATTTATTA CCCCCGTGCC CGCAGTTTTT ATTAAA.CATA GTGTTCCGGA CATGGGCTCT TCTCCGGTAG CCATGCCTCC AGCGGCTCAI GGTCGCTCGG ACTTAGGCAC AGCACAATGC CCACCACCAC GTATGTGTCT GAAAATGAGC TCGGAGATTG Figura 4-2 -12/26- GGCTCGOACC GTGSCÇCAGA TGGAAGACTT TGAGTTGTTG TATTCTGATA AGAGTCAGAG GAGGGCAGTG TAGTCTGÁGC AGTACTCGTT TGACAGACTA ACAGACTGTT CCTTTCCATG CAAtCATGGA TGCAATGAAG AGAGGGCTCT TCGTTTCGGC TAGCAATGGC GACAAATTAT TAAAACGTTC CGGAGGTCTT ATGCCCAGAG AAATGAATAT TAATCTTTAT GATCACGCGA ATGACGGATA TGTTTCCACT TCTCTTAGTT TATTATCAGG ATATTCCACT TACIATATAT ATGTTAATGA TGTATTAGGC GTATACAGCC TAGGTGGAAT ACCATATTCT CAGATATATG ATGAACGATT ACATCGTAAC AGGGAATATA CTCCGGCAGA GGATGGTTAC AGATTAGCAG aagaaccctg gattcatcat gcaccacaag GTGATACTTG TAATGAGGAG ACCCAGAATC CAAAAGTTAA GAGGCAGATA TTTTCAGACT TTCGGGATGA ATTATGAGGA TCCTCGCAAT CACGCTCTTG TGAGGGACAG AAATACAATC ACCCAGATCT ACGTATGATC AGCCTCGACT TGCCGGTCCC CCGTGCCTTC CTTGACCCTG TAAAATGAGG AAATTGCATC GCATTGTCTG GTGGGGCAGG ACAGCAAGGG GGAGGATTGG GTGGGCTCTA TGGCTTCTGA GGCGGAAAGA AATTCACTGG CCGTCGTTTT ACAACGTCGT AATCGCCTTG CAGCACATCC CCCTTTCGCC GATCGCCCTT CCCAACAGTT GCGCAGCCTG CTCCTTACGC ATCTGTGCGG TATTTCACAC TCTGATGCCG CATAGTTAAG CCAGCCCCGA CGGGCTTGTC TGCTCCCGGC ATCCGCTTAC ATGTGTCAGA GGTTTTCACC GTCATCACCG AAGGCAGCGd dteAlÂGAÂtf^^G^bécwíC"' GTAACTCCCG TTGCGGTGCT GTTAACGGTG GCTGCCGCGC GCGCCACCAG ACATAAXAGC GGTGTTTTCT GCAGTCACCG TCCAAGCTTG GCTGTGTGCT GCTGCTGTGT GGAGCAGTCT ACCGTGCTGA CTCTAGACCC CCAGATGAAA GGCATAATGA GTACTTCGAT AGAGGAACTG GAGGAACACA AACCGGCTTT GTCAGATATG TGAGAAGTGC TCACTTAGCA GGACAGTCTA ATGTTATAGC GACAGCACCA AATATGTTTA CTCACCCATA TGAACAGGAG GTTTCTGCGT GATGGTATCG TGTTAATTTT GGTGTGATTG GAGACCGGTA TTACAGAAAT CTGAATATAG GTTTCCCACC GGATCACCAA GCTTGGAGAG .GTTGTGGAAA TTCATCAAGA ACAATTACAG TGAGCACAAT ATATCTCAGG AAATATCAAT ATCAGTCAGA GGTTGACATA TATAACAGAA CCCTAGGAGG ATTAGGCAAG GGCTTGAGCT AGGGGCAGTA TATGAATACT CCATGGAGAA GTGCCTTCTA GTTGCCAGCC ATCTGTTGTT GAAGGTGCCA CTCCCACTGT CCTTTCCTAA AGTAGGTGTC ATTCTATTCT GGGGGGTGGG GAAGACAATA GCAGGCATGC TGGGGATGCG. ACCAGCTGGG GCTCGACAGC TCGACTCTAG GACTQGGAAA ACCCTGGCGT TACCCAACTT. AGCTGGCGTA ATAGCGAAGA GGCCCGCACC MTGGCGAAT GGCGCCTGAT GCGGTATTTT CGCATATGGT GCACTCTCAG TACAATCTGC CACCCGCCAA CACCCGCTGA CGCGCCCTGA AGACAAGCTG TGACCGTCTC CGGGAGCTGC AAACGCGCGA Figura 4-3 -13/26-

    Molécula: pPJV2005, 5089 bps ADN circular Nome Arquivo: pPJV2005.cm5, Descrição: : Ligação de frag. de LTB NheBam no Vector Nhe Bam 7054 Notas: Caracteristicas da Molécula: Tipo Inicio Fim Nome Descrição REGIÃO 2242 3060 CMVpro REGIÃO 3061 3884 intronA GENE 3906 3969 TPAsigCDS 1 GENE 3975 4286 CTA CDS REGIÃO 4394 4690 bGHpA Enzimas (19 sítios) 1 Pcil 1876, Sall 2241, MSCl 2266, Spel 2356 SacII 3009, Nsil. 3106, PstI 3B79, HindIII 3894 Hhel 3969', Clat 4061, Smal 4130, Muni 4256 Figura 5-1 -14/26- 1 · GACGAAAGGG CCTCGTGATA CGCCTATTTT TATAGGTTAA TGTCATGATA ATAATGGTTX 61 CTTAGACGTC AGGTGGCACT TTTCGGGGAA ATGTGCGCGG AACCCCTATT TGTTTATTTT 121 TCTAAATACA TTCAAATATG TATCCGCTCA TGAGACAATA ACCCTGATAA ATGCTTCAAT 181 AATATTGAAA AAGGAAGAGT ATGAGTATTC AACATTTCCG TGTCGCCCTT ATTCCCTTTT 241 TTGCGGCATT TTGCCTTCCT GTXTXTGCTC ACCCAGAAAC GCTGGTGAAA GTAAAAGATG 301 CTGAAGATCA GTTGGGTGCA CGAGTGGGTT ACATCGAACT GGATCTCAAC AGCGGTAAGA 361 TCCTTGAGAG TTTTCGCCCC GAAGAACGTT TTCCAATGAT GAGCACTTTT AAAGTTCTGC 421 TATGTGGCGC GGTATTATCC CGTATTGACG CCGGGCAAGA GCAACTCGGT CGCCGCATAC 481 ACTATTCTCA GAATGACTTG GTTGAGTACT CACCAGTCAC AGAAAAGCAT CTTACGGATG 541 GCATGACAGT AAGAGAATTA TGCAGTGCTG CCATAACCAT GAGTGATAAC ACTGCGGCCA 601 ACTTACTTCT GACAACGATC GGAGGACCGA AGGAGCTAAC CGCTTTTTTG CACAACATGG 661 GGGATCATGT AACTCGCCTT GATCGTTGGG AACCGGAGCT GAATGAAGCC ATACCAAACG 721 ACGAGCGTGA CACCACGATG CCTGTAGCAA TGGCAACAAC GTTGCGCAAA CTATTAACTG 781 GCGAACTACT TACTCTAGCT TCCCGGCAAC AATTAATAGA CTGGATGGAG GCGGATAAAG 841 TTGCAGGACC ACXTCTGCGC XCGGCCCTXC CGGCTGGCXG GXXXATTGCT GATAAATCTG 901 GAGCCGGTGA GCGTGGGTCX CGCGGTATCA TXGCAGCACT GGGGCCAGAX GGTAAGCCCX 961 CCCGXATCGX AGXTATCTAC ACGACGGGGA GTCAGGCAAC TATGGATGAA CGAAÁTAGAC 1021 AGATCGCTGA GATAGGTGCC TCACTGATXA AGCATTGGTA ACTGTCAGAC CAAGTTTACT 1081 CATAXATACT TXAGATTGAT TTAAAACTTC ATTXTXAAXX TAAAAGGAIC TAGGTGAAGA 1141 TCCXXXTTGA TAAXCTCAXG ACCAAAATCC CTTAACGTGA GTTTTCGXXC- CACXGAGCGT 1201 CAGACCCCGX AGAAAAGATC AAAGGATCXT CTTGAGATCC TTTTTTXCXG CGCGTAAXCT 1261 GCTGCTT3CA AACAAAAAAA CCACCGCXAC CAGCGGXGGX XTGTTTGCCG GATCAAGAGC 1321 TACCAACTCX TTXTCCGAAG GTAACXGGCT TCAGCAGAGC GCAGATACCA AATACXGXCC 1381 TTCTAGTGTA gccgxagtta ggccaccact tcaagaacxc tgtagcaccg ccxacaxacc 1441 TCGCTCTGCT AAXCCTGTTA CCAGTGGCXG CTGCCAGTGG CGATAAGXCG TGXCXXACCG 1501 GGTTGGACTC aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg GXCGGGCXGA ACGGGGGGTT 1561 CGTGCACACA GCCCAGCTTG GAGCGAACGA CCTACACCGA ACTGAGAXAC CXACAGCGTG 1521 AGCAXTGAGA AAGCGCCACG CTTCCCGAAS GGAGAAAGGC GgACAGGTAT CCGGXAAGCG 168.1 GCAGGGTCGG AACAGGAGAG CGCACGAGGG AGCTXCCAGG GGGAAACGCC TGGXAXCXTT 1741 ATAGTCCTGT CGGGTTTCGC CACCXCTGAC XTGAGCGTCG ATTTXTGXGA TGCTCGTCAG 1801 GGGGGCGGAG CCTATGGAAA AACGCCAGCA ACGCGGCCTT TTXACGGXXC CXGGCCTTTT 1361 GCTGGCCTTT TGCTCACATG TTCTTTCCTG CGTTATCCCC XGATTCTGXG GATAACCGTA 1921 XTACCGCCTT TGAGTGAGCX GATACCGCXC GCCGCAGCCG AACGACCGAG CGCAGCGAGT 1981 CAGTGAGCGA GGAAGCGGAA GAGCGCCCAA XACGCAAACC GCCXCTCCCC GCGCGXTGGC .2041 CGATXCATXA ATGCAGCTGG CACGACAGGT XTCCCGACTG GAAAGCGGGC AGTGAGCGCA 2101 ACGCAATTAA TGTGAGTTAG CTCACTCAXT AGGCACCCCA GGCTTTACAC TTTATGCTTC 2161 CGGCTCGTAX GTXGTGTGGA ATXGTGAGCG GATAACAAXT XCACACAGGA AACAGCXATG 2221 ACCATGATTA CGCCAAGCTA C-TCGACATAA ATCAAXATTG GCTATXGGCC ATTGCAXACG 2281 XTGTAXCTAT ATCAXAATAT GTACATTTAT ATTGGCTCAT GTCCAATAXG ACCGCCAXGT 2341 XGACATTGAT XAXTGACTAG TTATTAATAG TAATCAATTA CGGGGTCATT AGTXCATAGC 2401 CCATATATGG AGTTCCGCGT TACATAACTT ACGGTAAAXG GCCCGCCXCG TGACCGCCCA 2461 ACGACCCCCG CCCATTGACG TCAATAATGA CGTAXGTTCC CATAGTAACG CCAATAGGGA 2521 CTTTCCATXG ACGTCAATGG GXGGAGTATT TACGGTAAAC TGCCCACTTG GCAGTACATC 2581 AAGTGTATCA TATGCCAAGT CCGGCCCCCT AXTGACGTCA ATGACGGTAA ATGGCCCGCC 2641 XGGCAXXATG CCCAGTACAT GACCTTACGG GACTXTCCTA CTXGGCAGTA CATCTACGTA 2701 TTAGTCATCG CTATTACCAX GGTGATGCGG TTTTGGCAGT ACACCAATGG GCGTGGATAG 2761 CGGTTTGACT CACGGGGATT TCCAAGXCTC CACCCCATTG ACGTCAATGG GAGTTTGTTT 2821 TGGCACCAÃA ATCAACGGGA CTTTCCAAAA TGTCGTAATA ACCCCGCCCC GTTGACGCAA 2881 ATGGGCGGTA GGCGTGTACG GTGGGAGGTC TATATAAGCA GAGCTCGTTX AGTGAACCGT 2941 CAGATCGCCT GGAGACGCCA TCCACGCTGT TTTGACCTCC ATAGAAGACA CCGGGACCGA 3001 · TCCAGCCICC GCGGCCGGGA ACGGTGCATT GGAACGCGGA TTCCCCGTGC CAAGAGTGAC 3061 GTAAGTACCG CCTATAGACT CTATAGGCAC ACCCCTTTGG CTCTTATGCA TGCTAXACTG 3121 TTTTTGGCTT GGGGCCTATA CACCCCCGCT CCTTATGCTA TAGGTGATGG TATAGCTTAG 3181 . CCTATAGGTG TGGGTTATTG ACCATTATXG ACCACTCCCC TATTGGTGAC GATACTTTCC , 3241 ATTACTAATC CATAACATGG CTCTTTGCCA CAACTATCTC TATTGGCTAT ATGCCAATAC 3301 TCTGTCCTTC AGAGACTGAC ACGGACTCTG TATTTTTACA GGATGGGGTC CCATTTATTA 3361 TTTACAAATT CACATATACA ACAACGCCGX CCCCCGTGCC CGCAGTTTTT ATTAAACATA 3421 GCGTGGGATC TCCACGCGAA TCTCGGGTAC GTGTTCCGGA CATGGGCTCT TCTCCGGTAG 3481 CGGCGGAGCT TCCACATCCG AGCCCTGGTC CCATGCCTCC AGCGGCTCAT GGTCGCTCGG 3541 CAGCTCCTTG CTCCTAACAG TGGAGGCCAG ACTTAGGCAC AGCACAATGC CCACCACCAC 3601 CAGTGTGCCG CACAAGGCCG TGGCGGTAGG GTATGTGTCT GAAAATGAGC TCGGAGATTG Figura 5-2 -15/26 GGCTCGCACC GTGlRCAGA TGGAAGACTT TGAGTTGTTG TATTCTGATA AGAGTCAGAG GAGGGCAGTG TAGTCTGAGC AGTACTCGTT TGACAGACTA ACAGACTGTT CCTTTCCATG CAATCATGGA TGCAATGAAG AGAGGGCTCT TCGTTTCGGC TAGCGCTCCC CAGTCTATTA AAATATATAC GATAAATGAC AAGATACTAT AAATGGTTAT CATTACATTT AAGAGCGGCG AACATATAGA CTCCCAAAAA AAAGCCATTG ATCTGACCGA GACCAAAATT GATAAATTAT TTGCGGCAAT CAGTATGGAA AACTAGGGAT GCTTGAGCTC ACGCTCTTGT GAGGGACAGA CATGGAGAAA CCCAGATCTA CGTATGATCA TCTGTTGTTT GCCCCTCCCC CGTGCCTTCC CTTTCCTAAT AAAATGAGGA AATTGCATCG GGGGGTGGGG TGGGGCAGGA CAGCAAGGGG GGGGATGCGG TGGGCTCTAT GGCTTCTGAG CGACTCTAGA ATTCACTGGC CGTCGTTTTA ACCCAACTTA ATCGCCTTGC AGCACATCCC GCCCGCACCG ATCGCCCTTC CCAACAGTTG CGGTATTTTC TCCTTACGCA TCTGTGCGGT ACAATCTGCT CTGATGCCGC ATAGTTAAGC GCGCCCTGAC GGGCTTGTCT GCTCCCGGCA GGGAGCTGCÃ TGTGTCAGAG GTTTTCACCG AAGGCAGCQG1· CAGAiAGASGSeÇGCAGGCSGC GTAACTCCCG TTGCGGTGCT GTTAACGGTG GCTGCCGCGC GCGCCACCAG ACATAATAGC GGTCTTTTCT GCAGTCACCG TCCAAGCTTG GCTGTGTGCT GCTGCTGTGT GGAGCAGTCT CAGAACTATG TTCGGAATAT CGCAACACAC CATATACGGA ATCGATGGCA GGCAAAAGAG CAACATTTCA GGTCGAAGTC CCGGGCAGTC AAAGGATGAA GGACACATTA AGAATCACAT GTGTATGGAA TAATAAAACC CCCAATTCAA CCTCGCAAXC CCTAGGAGGA TTAGGCAAGG AATACAATCA GGGGCAGTAT ATGAATACTC GCCTCGACTG TGCCTTCTAG TTGCCAGCCA TTGACCCTOG AAGGTGCCAC TCCCACTGTC CATTGTCTGA GTAGGTGTCA TTCTATTCTG gaggattggg aagacaatag caggcatgct GCGGAAAGAA CCAGCTGGGG CTCGACAGCT CAACGTCGTG ACTGGGAAAA CCCTGGGGTT CCTTTCGCCA GCTGGCGTAA TAGCGAAGAG CGCAGCCTGA ATGGCGAATG GCGCCTGATG ATTTCACACC GCATATGGTG CACTCTCAGT CAGCCCCGAC ACCCGCCAAC ACCCGCTGAC TCCGCTTACA GACAAGCTGT GACCGTCTCC TCATCACCGA AACGCGCGA Figura 5-3 -16/26- 5249,Nar1. 5249,Kasi:

    Molécula: pPJV2007, 5488 bps ADN circular Nome Arquivo: pPJV2007.cm5, Descrição: Ligação da Inserção de LTA-RDEL Nhe-Bam no Vector Nhe Bam 7054 Notas: Características da Molécula: Tipo Início Fim Nome Descrição REGIÃO 2242 3060 CMVpro REGIÃO 3061 3884 intronA GENE 3906 3969 TPAsigCDS' GENE 3975 4285 CTA CDS REGIÃO 4793 5089 bGHpA Enzimas (14 sítios) Pcil 1376, Sall 2241, MscI 2266, Spel 2356 Sàcil 3009, Hsil 3106, PstI 3379, Nkel 3969 BatnHI 4686, BglII 4793, EcoRI 5083, Eiiel 5249 Figura 6-1 -17/26- 1 GACGAAAGGG CCTCGTGATA CGCCTATTTT TiVTAGGTTAA TGTCATGATA ATAATGGTTT 61 CTTAGACGTC AGGTGGCACT TTTCGGGGAA ATGTGCGCGG AACCCCTATT TGTTTATTTT 121 TCTAAATACA TTCAAATATG TATCCGCTCA TGAGACAATA ACCCTGATAA ATGCTTCAAT 181 AATATTGAAA AAGGAAGAGT ATGAGTATTC AACATTTCCG TGTCGCCCTT ATTCCCTTTT 241 TTGCGGCATT TTGCCTTCCT GTTTTTGCTC ACCCAGAAAC GCTGGTGAAA GTAAAAGATG 301 CTGAAGATCA GTTGGGTGCA CGAGTGGGTT ACATCGAACT GGATCTCAAC AGCGGTAAGA 361 TCCTTGAGAG TTTTCGCCCC GAAGAACGTT TTCCAATGAT GAGCACTTTT AAAGTTCTGC 421 TATGTGGCGC GGTATTATCC CGTATTGACG CCGGGCAAGA GCAACTCGGT CGCCGCATAC 481 ACTATTCTCA GAATGACTTG GTTGAGTACT CACCAGTCAC AGAAAAGCAT CTTACGGATG 541 GCATGACAGT AAGAGAATTA TGCAGTGCTG CCATAACCAT GAGTGATAAC ACTGCGGCCA 601 ACTTACTTCT GACAACGATC GGAGGACCGA AGGAGCTAAC CGCTTTTTTG CACAACAIGG 661 GGGATCATGT AACTCGCCTT GATCGTTGGG AACCGGAGCT GAATGAAGCC ATACCAAACG 721 ACGAGCGTGA CACCACGATG CCTGTAGCAA TGGCAACAAC GTTGCGCAAA CTATTAACTG 781 GCGAACTACT TACTCTAGCT TCCCGGCAAC AATTAATAGA CTGGATGGAG GCGGATAAAG 841 TTGCAGGACC ACTTCTGCGC TCGGCCCTTC CGGCTGGCTG GTTTATTGCT GATAAATCTG 901 GAGCCGGTGA GCGTGGGTCT CGCGGTATCA TTGCAGCACT GGGGCCAGAT GGTA&GCCCT 961 CCCGTATCGT AGTTATCTAC ACGACGGGGA GTCAGGCAAC TATGGATGAA CGAAATAGAC 1021 AGATCGCTGA GATAGGTGCC TCACTGATTA AGCATTGGTA ACTGTCAGAC CAAGTTTACT 1081 CATATAXACT TTAGATTGAT TTAAAACTTC ATTTTTAATT TAAAAGGATC TAGGTGAAGA 1141 TCCTTTTTGA TAATCTCATG ACCAAAATCC CTTAACGTGA GTTTTCGTTC CACTGAGCGT 1201 CAGACCCCGT AGAAAAGATC AAAGGÀTCTT CTTGAGATCC' TTTTTTTCTG CGCOTAATCT 1261 GCTGCTTGCA AACAAAAAAA CCACCGCTAC CAGCGGTGGT TTGTTTGCCG GATCAAGAGC 1321 TACCAACTCT TTTTCCGAAG GXAACXGGCT TCAGCAGAGC GCAGATACCA AATACXGTCC 1381 TXCXAGTGTA GCCGTAGXXA GGCCACCACT TCAAGAACTC TGTAGCACCG CCTACAXACC 1441 TCGCTCTGCT aatcctgxta CCAGXGGCXG CTGCCAGTGG cgataagtcg tgtcxtaccg 1501 GGTTGGACTC AAGACGATAG XTACCGGATA AGGCGCAGCG GTCGGGCTGA ACGGGGGGTT 1561 CGXGCACACA GCCCAGCXXG GAGCGAACGA CCTACACCGA ACTGAGATAC CTACAGCGIG 1621 AGCATTGAGA AAGCGCCACG CTTCCCGAAG GGAGAAAGGC GGACAGGTAT CCGGTAAGCG 1681 GCAGGGTCGG AACAGGAGAG CGCACGAGGG AGCXXCCAGG GGGAAACGCC TGGTAXCTTT 1741 ATAGTCCTGT CGGGTTTCGC CACCXCTGAC XTGAGCGTCG ATTTTTGTGA TGCTCGTCAG 1801 GGGGGCGGAG CCTATGGAAA AACGCCAGCA ACGCGGCCTT TTTACGGTTC CTGGCCTTTX 1861 GCTGGCCTTT TGCTCACATG TTCTTTCCTG CGTTATCCCC TGATTCTGTG GATAACCGTA 1921 TTACCGCCTT TGAGXGAGCT GATACCGCXC GCCGCAGCCG AACGACCGAG CGCAGCGAGT 1981 CAGXGAGCGA GGAAGCGGAA GAGCGCCCAA TACGCAAACC GCCXCTCCCC GCGCGXXGGC 2041 CGATTCATTA ATGCAGCTGG CACGACAGGT XXCCCGACTG GAAAGCGGGC AGTGAGCGCA •2101 ACGCAATTAA TGTGAGTTAG CTCACXCAXX AGGCACCCCA GGCXXTACAC TXTATGCXTC 2161 CGGCTCGTAT GTTGTGTGGA ATTGTGAGCG GATAACAATT TCACACAGGA AACAGCTATG 2221 ACCAXGATTA CGCCAAGCTA GTCGACATAA AXCAAIATTG GCTATTGGCC ATTGCATACG 2281 TTGXATCTAT ATCATAATAX GTACATTTAT ATTGGCTCAT GTCCAATATG ACCGCCATGT 2341 TGACATTGAT TATTGACTAG TTATTAATAG TAATCAATTA CGGGGTCAXT AGTTCATAGC 2401 CCATATATGG AGTTCCGCGT TACATAAGTT ACGGTAAATG GCCCGCCTCG TGACCGCCCA 2461 ACGACCCCCG CCCATTGACG TCAATAAXGA CGXATGTXCC CATAGTAACG CCAATAGGGA 2521 CTTTCCATTG ACGTCAATGG GTGGAGXATT TACGGTAAAC XGCCCACTTG GCAGTACATC 2581 AAGTGTATCA TAXGCCAAGT CCGGCCCCCT ATTGACGXCA ATGACGGTAA ATGGCCCGCC 2641 XGGCATTAXG CCCAGTACAT GACCTTACGG GACTTTCCTA CTTGGCAGTA CATCTACGTA 2701 TTAGTCATCG CTAXTACCAT GGTGATGCGG TTTTGGCAGT ACACCAATGG GCGTGGATAG 2761 CGGTTTGACT CACGGGGATT XCCAAGTCTC CACCCCATTG ACGTCAATGG GAGTTTGTTT 2821 TGGCACCAAA ATCAACGGGA CTTTCCAAAA TGTCGTAATA ACCCCGCCCC GTTGACGCAA 2881 ATGGGCGGTA GGCGTGTACG GTGGGAGGTC TATATAAGCA GAGCTCGXTT AGTGAACCGT 2941 CAGATCGCCT GGAGACGCCA TCCACGCTGT TTTGACCTCC ATAGAAGACA CCGGGACCGA 3001 TCCAGCCTCC GCGGCCGGGA ACGGTGCATT GGAACGCGGA TTCCCCGTGC CAAGAGTGAC 3061 GTAAGTACCG CCTATAGACT CTATAGGCAC ACCCCTTTGG CTCTTATGCA TGCTATACTG 3121 TTTTTGGCTT GGGGCCTATA CACCCCCGCT CCTTATGCTA TAGGTGATGO TATAGCTTAG 3181 CCTATAGGTG TGGGTTATTG ACCATTATXG ACCACTCCCC TATTGGTGAC GATACTTTCC 3241 ATTACTAATC CATAACATGG CTCTTTGCCA CAACXATCTC TATTGGCTAT ATGCCAATAC 3301 TCTGTCCTTC AGAGACTGAC ACGGACTCTG TATTTTTACA GGAIGGGGTC CCATTTATTA 3361 TTTACAAATT CACATATACA ACAACGCCGT CCCCCGTGCC CGCAGTTTTT ATTAAACATA 3421 GCGTGGGATC TCCACGCGAA TCTCGGGTAC GTGTTCCGGA CATGGGCTCT TCTCCGGTAG 3481 CGGCGGAGCT TCCACATCCG AGCCCTGGTC CCATGCCTCC AGCGGCTCAT GGTCGCTCGG 3541 CAGCTCCTTG CTCCTAACAG TGGAGGCCAG ACTTAGGCAC AGCACAATGC CCACCACCAC 3601 CAGTGTGCCG cacaaggccg tggcggtagg gtatgtgtct gaaaatgagc tcggagattg Figura 6-2 -18/26- 3661 3721 3781 3841 3901 3961 4021 4081 4141 4201 4261 . 4321 4381 4441 4501 4561 4621 4681 4741 4801 4861 4921 4981 5041 5101 5161 5221 5281 5341 5401 5461 GGCTCGCACC GTgSK&AGA TGAGTTGTTG TATTCTGATA GAGGGCAGTG TAGTCTGAGC TGACAGACTA ACAGACTGTT CAATCATGGA TGCARTCJAAG TCGTTTCGGC TAGCAATGGC TAAAACGTTC CGGAGGTCTT AAAIGAAXAT TAAlCXTTAT ATGACGGATA TGTTTCCACT TATTATCAGG ATATTCCACT ATGTTAATGA TGTATTAGGC TAGGTGGAAT ACCATATTCT ATGAACGATT ACATCGTAAC CTCCGGCAGA GGATGGTTAC AAGAACCCTG GATTCATCAT GTGATACTTG TAÁTGAGGAG CAAAAGTTAA GAGGCAGAlA TTTGAGGATC CTCGCAATCC AGGGACAGAA ATACAATCAG GTATGATCAG CCTCGACTGT GTGCCTTCCT TGACCCTGGA ATTGCATCGC ATTGTCTGAG AGCAAGGGGG AGGATTGGGA GCTTCTGAGG CGGAAAGAAC GTCGTTTTAC AACGTCGTGA GCACATCCCC CTTTCGCCAG. CAACAGTTGC. GCAGCCTGAA CTGTGCGGTA TTTCACACCG TAGTTAAGCC AGCCCCGACA CTCCCGGCAT CCGCTTACAG TTTTCACGGT CATCACCGAA TGGAAGACTT AAGGCAGCGG AGAGTCAGAG GTAACTCCCG AGTACTCGTT GCTGCCGCGC CCTTTCCATG GGTCTTTTCT AGAGGGCTCT GCTGTGTGCT GACAAATTAT ACCGTGCTGA ATGCCCAGAT GGCATAATGA GATCACGCGA GAGGAACACA TCTCTTAGTT TGAGAAGTGC TACTATATAT ATGTTATAGC GTATACAGCC CTCACCCATA CAGATATATS GATGGTATCG AGGGAATATA GAGACCGGTA AGATTAGCAG GTTTCCCACC GCACCACAAG GTTGTGGAAA ACCCAGAATC TGAGCACAAT TTTTCAGACT ATCAGTCAGA CTAGGAGGAT TAGGCAAGGG GGGCAGTATA TGAATACXCC GCCTTGTAGT TGCCAGCCAT AGGTGCCACT CCCACTGTCC TAGGTGTCAT TCTATTCTGG AGACAATAGC AGGCATGCTG CAGCTGGGGC TCGACAGCTC CTGGGAAAAC CCTGGCGTTA CTGGCGTÁAT AGCGAAGAGG TGGCGAATGG CGCCTGATGC CATATGGTGC ACTCTCAGTA CCCGCCAACA CCCGCTGACG ACAAGCTGTG ACCGTCTCCG ACGCGCGA CAGAAtiAAtSflePGCAGGCAG C~" TTGCGGTGCT GTTAACGGTG GCGCCACCAG ACATAATAGC GCAGTCACCG TCCAAGCTTG GCTGCTGTGT GGAGCAGTCT ÇTCTAGACCC CCAGATGAAA GTACTTCGAT AGAGGAACTC AACCGGCTrr GTCAGATATG TCACTTAGCA GGACAGTCTA GACAGCACCA AATATGTTTA TGAACAGGAG GTTTCTGCGT TGTTAATTTT GGTGTGATTG TTACAGAAAT CTGAATATAG GGATCACCAA GCTTGGAGAG TTCATCAAGA ACAATTACAG ATATCTCAGG AAATATCAAT GGTTGACATA TATAACAGAA CTTGAGCTCA CGCTCTTGTG ATGGAGAAAC CCAGATCTAC CTGTTGTTTC CCCCTCCCCC TTTCCTAATA AAATGAGGAA GGGGTGGGGT GGGGCAGGAC GGGATGCGGT GGGCTCTATG GACTCTAGAA TXCACTGGCC CCCAACTTAA TCGCCTTGCA CCCGCACCGA TCGCCCTTCC GGTATTTTCT CCTTACGCAT CAATCTGCTC TGATGCCGCA CGCCCTGACG GGCTTGTCTG' GGAGCTGCAT GTGTCAGAGG Figura 6-3 -19/26- Concentração Reciproca Logarítmica

    SniPl/fec 9fil20+pST^+píPl2o*CTAl2o+CTAiVe C en^PVec Srr>PVQc Cr4/B CTa-«0£Ub Figura 7 -20/26-

    Figura 8 Células Formadoras de Manchas/Milhão

    -21/26- 500 400 300 200 100 Figura 9 -22/26- Absorvência

    Figura 10 -23/26- Absorvência

    Figura 11 -24/26- Ο σ>οο <β Ο Ui ο !<β Ν ιβ &

    Figura 12 -25/26- 6000 5000 4000- 3000 - 2000 - 1000

    * ' <5> 'ti X 1 Figuras 13A - 13D -26/26- Protecção Contra Estimulação com HSV-2 em Murganhos

    Figura 14