TW202140794A - 疫苗及其誘導對sars-cov2之免疫反應之用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供重組改良型安卡拉牛痘(modified vaccinia Ankara；rMVA)病毒載體，其包含編碼一或多種SARS-CoV2蛋白、肽或其片段之異源核酸插入物，該等異源核酸插入物可操作地連接至與痘病毒表現系統相容之啟動子，在表現後，其能夠誘導保護性免疫。該等組合物可用於初次接觸抗原免疫疫苗接種策略或初次接觸抗原免疫疫苗/增強疫苗接種策略，以提供對SARS-CoV2及其變體之免疫。

Description

疫苗及其誘導對SARS-COV2之免疫反應之用途
本發明提供用於誘導宿主中對重度急性呼吸道症候群-冠狀病毒2 (SARS-CoV2)之免疫反應之組合物及此類組合物之使用方法與製造方法。特定言之，本文所描述之組合物為重組改良型安卡拉牛痘(modified vaccinia Ankara；MVA)病毒構築體，其編碼一或多種SARS-CoV2抗原。該等組合物可用於初次接觸抗原免疫疫苗接種策略或初次接觸抗原免疫疫苗/增強疫苗接種策略，以提供對廣泛範圍之SARS-CoV2變體之免疫。
冠狀病毒(CoV) (病毒目(Nidovirales )，冠狀病毒科(Coronaviridae) ，冠狀病毒亞科(Coronavirinae) )為具有正義單股RNA基因體之有套膜病毒。相比較而言，CoV具有對於RNA病毒而言係大的基因體，其長度尺寸在26至32千鹼基(kb)範圍內。CoV基因體編碼四種主要結構蛋白：棘(S)蛋白、核鞘(N)蛋白、膜(M)蛋白及套膜(E)蛋白，需要該等所有蛋白質以產生結構上完整的病毒顆粒。參見例如PS Masters, The molecular biology of coronavirus.  Adv. Virus Res. 2014:101:105-12。各種主要CoV結構蛋白在病毒顆粒之結構中起作用且可涉及複製週期之其他態樣。基於基因及抗原標準，CoV已被分成三組：α-CoV、β-CoV及γ-CoV (van Regenmortel等人編. Virus taxonomy: Classification and nomenclature of viruses Seventh report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. San Diego: Academic Press; 2000. 第835-49頁. ISBN 0123702003)。
冠狀病毒主要感染鳥類及哺乳動物，但亦可感染人類(參見例如Bande等人, Progress and challenges toward the development of vaccines against avian infectious bronchitis. J Immunol Res. 2015;2015；van der Hoek L. Human coronaviruses: What do they cause? Antiviral Therapy. 2007;12(4 Pt B):651)。人類冠狀病毒感染之嚴重程度在以下範圍內變化：自類似於感冒之上呼吸道感染至下呼吸道感染(諸如支氣管炎、肺炎)及甚至重度急性呼吸道症候群(severe acute respiratory syndrome；SARS)。
一些CoV最初剛發現係地方性感染，僅限於其天然動物宿主，但已跨過動物-人類物種屏障且進展成在人類中產生人畜共通傳染病(zoonotic disease)。參見例如Lau等人, Severe acute respiratory syndrome coronavirus -like virus in Chinese horseshoe bats.  PNAS 2005; 102(39):14040-5；Rest等人, SARS associated coronavirus has a recombinant polymerase and coronaviruses have a history of host-shifting. Infect Genet Evol. 2003;3(3):219-25。跨物種屏障跳躍已使CoV (諸如SARS CoV及中東呼吸道症候群CoV (MERS))顯現為有毒性的人類病毒。Schoeman及Fielding, Coronavirus envelope protein: current knowledge. Virology 2019;16:69。舉例而言，2003 SARS CoV引起8096例確診病例，其中在全世界報導有774例死亡，死亡率為9.6%。世界衛生組織WHO自2002年11月1日至2003年7月31日發病之可能SARS病例之概述。可獲自：http://www.who.int/csr/sars/country/table2004_04_21/en/index.html。自2012年4月以來，已報導2229例確診的MERS病例，其中792例相關死亡，引起35.5%之死亡率。世界衛生組織WHO 2018年8月WHO MERS-CoV全域概述及風險評定(WHO MERS-CoV Global Summary and Assessment of Risk, August 2018) (WHO/MERS/RA/August18)。可獲自：http://www.who.int/csr/disease/coronavirus_infections/risk-assessment-august-2018.pdf?ua=1。
最近，新冠狀病毒(SARS-CoV2)已爆發，其開始於中國武漢。參見世界衛生組織，關於新冠狀病毒(SARS-CoV2)之爆發之國際健康規定(2005)緊急委員會第二次會議之陳述(Statement on the second meeting of the International Health Regulations (2005) Emergency Committee regarding the outbreak of novel coronavirus (SARS-CoV2), World Health Organization). 2020年1月30日。自2020年1月31日初始存檔，可在https://www.who.int/news-room/detail/30-01-2020-statement-on-the-second-meeting-of-the-international-health-regulations-(2005)-emergency-committee-regarding-the-outbreak-of-novel-coronavirus-(SARS-CoV2)處獲得。許多早期病例與中國武漢市之大型海鮮與動物市場有關，且認為該病毒具有人畜共通起源。Perlman, Another Decade, Another Coronavirus. NEJM (2020年1月24日)；數位物件識別碼：10.1056/NEJMe200112610；C Wu, Joseph等人, Nowcasting and forecasting the potential domestic and international spread of the SARS-CoV2 outbreak originating in Wuhan, China: a modelling study. The Lancet (2020年1月31日)；數位物件識別碼：10.1016/S0140-6736(20)30260-9。此病毒及其他病毒樣本之基因序列之比較顯示與SARS-CoV (79.5%)及蝙蝠冠狀病毒(96%)具有相似性(Zhou等人, A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin, Nature (2020年2月3日;1-4; 數位物件識別碼：10.1038/s41586-020-2012-7)，且SARS-CoV2與β冠狀病毒聚簇，從而與兩種蝙蝠來源的SARS樣病毒株形成薩貝冠狀病毒(Sarbecovirus)亞屬的譜系B中的不同演化支。該病毒之起源尚不清楚。類似於SARS-CoV，近期研究證實，血管收縮素轉化酶2 (Angiotensin Converting Enzyme 2；ACE 2) (一種膜外肽酶)為SARS-CoV2所使用的用於進入人類細胞的受體。
為了試圖控制爆發擴散，全世界已進行檢疫及旅行限制。然而，截至2021年2月，全世界已報導超過1億700萬病例，及超過230萬例死亡，其中該病毒之估計死亡率為約0.7%。
產生針對人類冠狀病毒之治療性疫苗之歷史說明了問題的複雜性及挑戰。仍尚無針對MERS-CoV及SARS-CoV之商業疫苗，儘管事實為該等病毒已分別在2012年及2003年發現。對達成安全性、耐受性之所需結果及必需的免疫原性持續時間之構架及抗原組分之選擇為困難的且可能涉及多次失敗。
正研發多種疫苗以減少或預防SARS-CoV2感染。在2020年12月11日，食品與藥物管理局(FDA)頒予Pfizer-BioNTech COVID-19疫苗(BNT162b2)在年齡為16歲及更大之人員中的緊急使用授權(EUA)以預防COVID-19。在2020年12月18日，美國食品與藥物管理局頒予第二種疫苗之緊急使用授權(EUA)以預防由重度急性呼吸道症候群冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)引起之2019年冠狀病毒疾病(COVID-19)。緊急使用授權允許ModernaTX, Inc. COVID-19疫苗(mRNA-1272)在美國分銷以用於18歲及更大的個體。Pfizer疫苗及Moderna疫苗兩者均為僅編碼SARS-CoV2棘蛋白之mRNA疫苗。
SARS-CoV2，類似於其他SARS相關冠狀病毒，已顯示高的突變率，且此突變率驅使SARS-CoV2進化及基因體變異，從而潛在地使得SARS-CoV2能夠逃逸宿主免疫及由當前疫苗提供之免疫。自初始報導SARS-CoV2基因體序列開始，已鑑別出大量SARS-CoV2變體，其可潛在地影響各種疫苗接種策略之治療功效。舉例而言，最近在結構性棘蛋白中鑑別出之大量突變已引起了疫苗策略可能歸因於突變逃逸而呈現為低效的擔憂。棘蛋白之近期突變已引起了大量關於當前疫苗之效用的擔憂。舉例而言，在小的臨床試驗中，Oxford-AstraZeneca疫苗顯示針對南非變體501Y.V2的效用降低。令人擔心的是，501Y.V2變體中存在之E484K突變可使得當前疫苗的效用降低，從而產生可能的逃逸突變體。
SARS-CoV2之高死亡率以及其容易傳播及傳播速率與突變率，突顯了對研發有效SARS-CoV2疫苗之需求。
因此，本發明之一個目的為提供一種針對SARS-CoV2之治療性疫苗及相關質體與構築體，以及其賦予處於感染風險下之人類免疫原性的用途。
本文提供重組改良型安卡拉牛痘(rMVA)病毒載體，其包含編碼一或多種SARS-CoV2蛋白、肽或其片段之異源核酸插入物，該等異源核酸插入物可操作地連接至與痘病毒表現系統相容之啟動子，在表現後，其能夠誘導保護性免疫。本文所描述之組合物可用於初次接觸抗原免疫疫苗接種策略或初次接觸抗原免疫疫苗/增強疫苗接種策略，以提供對廣泛範圍之SARS-CoV2變體(包括可能的逃逸突變體)之免疫。
在一個態樣中，rMVA病毒載體設計成在接受者宿主細胞中表現呈病毒樣顆粒(VLP) (參見例如圖20)形式之SARS-CoV2抗原(例如棘(S)蛋白、膜(M)蛋白及套膜(E)蛋白)，其中歸因於免疫學上潛在顯性抗原決定基之呈現增強，VLP之表現及形成足夠提供針對突變體譜系之保護性免疫。藉由表現較廣範圍之在表現之後呈現為VLP之SARS-CoV2抗原，可在多種抗原中產生更穩固的體液及細胞反應，從而降低SARS-CoV2變體之突變體免疫逃逸的風險。舉例而言，藉由表現包括S、M及E蛋白之冠狀病毒VLP，可相較於僅針對S蛋白之疫苗產生更穩固的免疫反應，從而降低病毒經由突變進行免疫逃逸之可能，該等突變包括例如S蛋白受體結合域(RBD)內之胺基酸取代，該等胺基酸取代包括例如K417T、K417N、E484K及/或N501Y之彼等。
在一些實施例中，rMVA表現SARS-CoV2抗原，使得產生兩種不同的VLP群體。在一些實施例中，rMVA表現一或多種SARS-CoV2抗原，其與非冠狀病毒病毒醣蛋白呈融合蛋白形式，且獨立地表現病毒基質蛋白，其中SARS-CoV2多肽抗原-醣蛋白融合物及基質蛋白能夠形成VLP。
在一些實施例中，提供一種rMVA病毒載體，其含有編碼SARS-CoV2之膜(M)蛋白、套膜(E)蛋白及棘(S)蛋白之一或多個核酸序列，其中在表現M、E及S蛋白後，形成VLP (參見例如圖20)。在一些實施例中，rMVA含有編碼全長S蛋白、E蛋白及M蛋白之核酸序列，例如如圖1A中所例示。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 1、40及43之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA包含含有SEQ ID NO: 3、42及45之核酸序列。在一些實施例中，rMVA包含含有SEQ ID NO: 46、47或156之核酸序列。在一些實施例中，rMVA含有編碼全長S蛋白之核酸序列，該全長S蛋白進一步包含K417T、E484K及N501Y之取代。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 6、40及43之胺基酸序列。
在一些實施例中，提供一種rMVA病毒載體，其含有編碼SARS-CoV2之膜(M)蛋白、套膜(E)蛋白及棘(S)蛋白之一或多個核酸序列，其中在表現M、E及S蛋白後，形成VLP，且其中S蛋白包含一或多個胺基酸脯胺酸取代，該等取代使呈融合前構形之S蛋白三聚體穩定。在一些實施例中，S蛋白在S胞外域三聚體之啟動子之七肽重複序列1 (HR1)與中央螺旋之間的邊界處或附近含有一或多個脯胺酸取代。在一些實施例中，脯胺酸取代出現在三聚體中之啟動子之胺基酸殘基970至990之間。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且在胺基酸K986及V987處含有兩個脯胺酸取代，例如如圖2A中所例示。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 8、40及43之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA包含含有SEQ ID NO: 10、42及45之核酸序列。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且含有取代K986P、V987P及以下中之一或多者：K417T、E484K及N501Y。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且含有取代K986P、V987P、K417T、E484K及N501Y。在一些實施例中，S蛋白表現為包含SEQ ID NO: 11之胺基酸。在一些實施例中，S蛋白由包含SEQ ID NO: 12之核酸編碼。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 11、40及43之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA包含含有SEQ ID NO: 12、42及45之核酸序列。在一些實施例中，rMVA包含含有SEQ ID NO: 157之核酸序列。在一些實施例中，rMVA包含含有SEQ ID NO: 159之核酸序列。在一些實施例中，rMVA包含含有SEQ ID NO: 50之核酸序列。在一些實施例中，rMVA包含含有SEQ ID NO: 160之核酸序列。
在以上之替代實施例中，rMVA病毒載體含有編碼膜(M)蛋白、套膜(E)蛋白及棘(S)蛋白之線性抗原決定基之一或多個核酸序列，其中在表現M蛋白、E蛋白及S蛋白之線性抗原決定基後，形成VLP。在一特定實施例中，由rMVA編碼之S蛋白之線性抗原決定基為SARS-CoV2 S蛋白之受體結合域(RBD)。在一些實施例中，所編碼之線性S抗原決定基包含S蛋白之胺基酸331至524 (RBD胺基酸331-524)，如圖3A中所例示。在一些實施例中，rMVA表現包含SEQ ID NO: 21之線性抗原決定基。在一些實施例中，所編碼之線性S抗原決定基包含S蛋白之胺基酸327至524 (RBD胺基酸327至524)，如圖3D中所例示。在一些實施例中，rMVA表現包含SEQ ID NO: 20之線性抗原決定基。在一些實施例中，RBD肽包含取代K417T、E484K及N501Y。在一些實施例中，rMVA表現包含SEQ ID NO: 33之線性抗原決定基。在一些實施例中，rMVA表現包含SEQ ID NO: 32之線性抗原決定基。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 20、40及43之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA包含含有SEQ ID NO: 24、42及45之核酸序列。在一些實施例中，rMVA編碼SEQ ID NO: 21、40及43之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA包含含有SEQ ID NO: 25、42及45之核酸序列。在一些實施例中，rMVA編碼SEQ ID NO: 32、40及43之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 33、40及43之胺基酸序列。
在一些實施例中，核酸插入物編碼線性S抗原決定基，該線性S抗原決定基進一步包含來源於S蛋白之訊息肽及跨膜肽，例如如圖3G及圖3H中所例示。S蛋白訊息肽可包含或來源於例如SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸1-13 (MFVFLVLLPLVSS) (SEQ ID NO: 55)。S蛋白跨膜域(其亦可包括胞質尾區)可包含或來源於例如胺基酸1214-1273 (SEQ ID NO: 57)。在一些實施例中，所編碼之S蛋白包含RBD共有序列，如圖5A中所例示。在一些實施例中，RBD共有序列進一步包含例如來源於SEQ ID NO: 55之S蛋白訊息肽及例如來源於SEQ ID NO: 57之S蛋白跨膜肽，例如如圖5B中所例示。在一些實施例中，rMVA表現包含SEQ ID NO: 61之線性抗原決定基。在一些實施例中，rMVA表現包含SEQ ID NO: 62之線性抗原決定基。在一些實施例中，RBD肽包含取代K417T、E484K及N501Y。在一些實施例中，rMVA表現包含SEQ ID NO: 67之線性抗原決定基。在一些實施例中，rMVA表現包含SEQ ID NO: 68之線性抗原決定基。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 61、40及43之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA包含含有SEQ ID NO: 65、42及45之核酸序列。在一些實施例中，rMVA編碼SEQ ID NO: 62、40及43之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA包含含有SEQ ID NO: 66、42及45之核酸序列。在一些實施例中，rMVA編碼SEQ ID NO: 67、40及43之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 68、40及43之胺基酸序列。
在一些實施例中，核酸插入物編碼線性S抗原決定基，該線性S抗原決定基進一步包含訊息肽、E蛋白及M蛋白(參見例如圖3Q、圖3R、圖3S、圖3T)。S蛋白訊息肽可包含或來源於例如SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸1-13 (MFVFLVLLPLVSS) (SEQ ID NO: 55)。在一些實施例中，所編碼之S蛋白包含RBD共有序列。在一些實施例中，RBD共有序列進一步包含例如來源於SEQ ID NO: 55之S蛋白訊息肽。在一些實施例中，rMVA表現包含胺基酸327-524之線性RBD抗原決定基。在一些實施例中，rMVA表現包含SEQ ID NO: 55及20之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA表現包含胺基酸331-524之線性RBD抗原決定基。在一些實施例中，rMVA表現包含SEQ ID NO: 55及21之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA表現包含胺基酸327-598之線性RBD抗原決定基。在一些實施例中，rMVA表現包含SEQ ID NO: 55及161之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA表現包含胺基酸331-598之線性RBD抗原決定基。在一些實施例中，rMVA表現包含SEQ ID NO: 55及162之胺基酸序列。在一些實施例中，RBD肽包含取代K417T、E484K及N501Y。在一些實施例中，rMVA表現包含SEQ ID NO: 55及32之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA表現包含SEQ ID NO: 55及33之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA表現包含SEQ ID NO: 55及163之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA表現包含SEQ ID NO: 55及164之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 55、20、40及43之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA編碼SEQ ID NO: 55、21、40及43之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA編碼SEQ ID NO: 55、32、40及43之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 55、33、40及43之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 55、161、40及43之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 55、162、40及43之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 55、163、40及43之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 164、33、40及43之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 158。
在一些實施例中，rMVA病毒載體含有編碼S蛋白之兩個或更多個線性抗原決定基之核酸序列，其中該兩個或更多個線性抗原決定基由間隔子(例如GPGPG間隔子多肽)隔開，且其中rMVA病毒載體亦含有編碼SARS-CoV2套膜(E)蛋白及膜(M)蛋白之一或多個核酸序列。在一些實施例中，插入至rMVA病毒載體中之序列編碼由間隔子隔開之S蛋白線性抗原決定基，其中該等線性抗原決定基包括不同的S蛋白RBD肽序列，例如(RBD序列1-間隔子-RBD序列2)，其中RBD序列1為第一S蛋白RBD肽，且RBD序列2為第二S蛋白RBD肽。在一些實施例中，插入至MVA病毒載體中之序列編碼串聯重複序列，例如(RBD序列1-間隔子-RBD序列2-間隔子)X ，其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9、10。在一些實施例中，核酸序列編碼串聯重複序列，該串聯重複序列在NH-端側接例如如來源於SEQ ID NO: 55之S肽訊息肽及在羧基端側接例如來源於SEQ ID NO: 57之S蛋白跨膜域。在一些實施例中，RBD肽係選自一或多個來源於SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸331至524或替代地胺基酸327至524之肽。在一些實施例中，由rMVA中之核酸序列編碼之線性抗原決定基係選自SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸504至524及胺基酸473至490。在一些實施例中，由rMVA中之核酸序列編碼之線性抗原決定基為SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸504至524及胺基酸473至490。在一些實施例中，插入至MVA病毒載體中之序列編碼S蛋白RBD肽，該肽含有串聯重複序列((胺基酸504-524)-GPGPG-(胺基酸473-490)-GPGPG)X ，其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9、10，例如如圖4A中所例示。在一些實施例中，x = 3至7。在一些實施例中，x=5。在一些實施例中，插入至MVA病毒載體中之序列編碼S蛋白RBD肽，該肽含有串聯重複序列((胺基酸504-524)-GPGPG-(胺基酸473-490)-GPGPG)X ，其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9、10，且其中串聯重複序列在NH-端側接例如如來源於SEQ ID NO: 55之S蛋白訊息肽及在羧基端側接例如如來源於SEQ ID NO: 57之S蛋白跨膜域，例如如圖4F中所例示。在一些實施例中，x = 3至7。在一些實施例中，x=5。在一些實施例中，胺基酸473-490 RBD肽包含E484K。
在以上之替代實施例中，rMVA病毒載體含有編碼SARS-CoV2膜(M)蛋白、套膜(E)蛋白及缺少S蛋白之羧基端之經修飾之棘(S)蛋白的一或多個核酸序列。經修飾之S蛋白質包含S1 + S2經截短蛋白，其中在表現M蛋白、E蛋白及經截短S蛋白後，形成VLP。在一特定實施例中，由rMVA編碼之經修飾之S蛋白包含SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸(1-1213)，例如如圖6A中所例示。替代地，rMVA病毒載體含有編碼SARS-CoV2膜(M)蛋白、套膜(E)蛋白及具有一或多個脯胺酸取代之S1 + S2經截短蛋白片段之一或多個核酸序列，其中在表現M蛋白、E蛋白及經截短S蛋白後，形成VLP。在一特定實施例中，由rMVA編碼之經修飾之S蛋白包含SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸(1-1213)，其中該S1 + S2經截短片段在胺基酸K986及V987處含有兩個脯胺酸取代(S1 + S2經截短片段+ K986P及V987P)，例如如圖6H中所例示。在一些實施例中，S1 + S2肽進一步包含取代K417T、E484K及N501Y。
在一替代性態樣中，本文提供一種設計成表現呈融合蛋白之一或多種SARS-CoV2 S蛋白抗原肽之rMVA病毒載體，其中該融合蛋白包含套膜醣蛋白訊息肽(GPS)、SARS-CoV2 S蛋白或蛋白片段及套膜醣蛋白之跨膜域(GPTM)，其中套膜醣蛋白不來源於冠狀病毒。構築rMVA病毒載體以進一步表現SARS-CoV2之膜(M)蛋白及套膜(E)蛋白以及來源於與套膜醣蛋白相同病毒之基質蛋白。藉由表現M蛋白及E蛋白兩者、與GP融合之S蛋白片段及基質蛋白，可形成兩個不同VLP：第一個含有SARS-CoV2 M蛋白及E蛋白，且第二個含有S蛋白片段以及GP與基質蛋白。藉由提供兩個VLP，抗原決定基呈現增強可為可能的。適合用於本發明之醣蛋白包括(但不限於)來源於以下之彼等醣蛋白：絲狀病毒科(Filoviridae )，例如馬堡病毒(Marburg virus)、埃博拉病毒(Ebola virus)或蘇丹病毒(Sudan virus)；逆轉錄病毒科(Retroviridae )，例如1型人類免疫缺乏病毒(HIV-1)；沙粒病毒科(Arenaviridaea )，例如拉沙病毒(Lassa virus)；黃病毒科(Flaviviridae )，例如登革熱病毒(Dengue virus)及茲卡病毒(Zika virus)。在特定實施例中，醣蛋白來源於馬堡病毒(MARV)。在特定實施例中，醣蛋白來源於MARV GP蛋白(Genbank登錄號AFV31202.1)。在特定實施例中，MARV GPS域包含醣蛋白之胺基酸1至19 (MWTTCFFISLILIQGIKTL) (SEQ ID NO: 88)，且GPTM域包含醣蛋白之胺基酸序列644-681 (WWTSDWGVLTNLGILLLLSIAVLIALSCICRIFTKYIG) (SEQ ID NO: 90)。在一些實施例中，S蛋白或蛋白片段-GP融合蛋白包含S蛋白受體結合域(RBD)，例如如圖7A中所例示。在一些實施例中，RBD肽來源於S蛋白之胺基酸331至524。在一些實施例中，線性S抗原決定基包含S蛋白之胺基酸331至524，例如如圖7B中所例示。在一些實施例中，RBD肽來源於S蛋白之胺基酸327至524。在一些實施例中，線性S抗原決定基包含S蛋白之胺基酸327至524，例如如圖7G中所例示。在一些實施例中，線性S抗原決定基包含冠狀病毒共有序列。在一些實施例中，RBD肽包含取代K417T、E484K及N501Y。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 95、40及43之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA包含含有SEQ ID NO: 97、42及45之核酸序列。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 96、40及43之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA包含含有SEQ ID NO: 98、42及45之核酸序列。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 99、40及43之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 99、40及43之胺基酸序列。
在一些實施例中，rMVA含有一或多個核酸序列，其編碼：E蛋白；M蛋白；及與病毒醣蛋白(例如MARV GP)融合之S蛋白之兩個或更多個線性抗原決定基，其中該兩個或更多個線性抗原決定基由間隔子(例如GPGPG間隔子多肽)隔開，且其中GPS側接兩個或更多個線性抗原決定基的NH端，且GPTM側接其羧基端；以及來源於與醣蛋白相同病毒的基質蛋白，例如MARV VP40基質蛋白。在一些實施例中，S蛋白之兩個或更多個線性抗原決定基與MARV GP融合，其中線性抗原決定基包括不同的S蛋白RBD肽，例如(RBD序列1-間隔子-RBD序列2)，其中RBD序列1為第一S蛋白RBD肽，且RBD序列2為第二S蛋白RBD肽。在一些實施例中，S蛋白之兩個或更多個線性抗原決定基與MARV GP融合，其中抗原決定基含於串聯重複序列中，例如(RBD序列1-間隔子-RBD序列2-間隔子)X，其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。在一些實施例中，RBD肽係選自一或多個來源於SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸331至524或胺基酸327至524之肽。在一些實施例中，由rMVA編碼之線性抗原決定基係選自SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸504至524及胺基酸473至490。在一些實施例中，由串聯重複序列編碼之線性抗原決定基為SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸504至524及胺基酸473至490。在一些實施例中，串聯重複序列編碼((胺基酸504-524)-GPGPG-(胺基酸473-490)-GPGPG)x，其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。在一些實施例中，x=3至7。在一些實施例中，x=5，例如如圖8A中所例示。當使用串聯重複序列時，MARV GPS肽在NH端側接串聯重複序列，且MARV GPTM肽在羧基端側接串聯重複序列。在一些實施例中，胺基酸473-490 RBD肽包含E484K。
在一些實施例中，rMVA編碼經修飾之S蛋白及來源於與醣蛋白相同病毒之基質蛋白(例如MARV VP40基質蛋白)以及E蛋白及M蛋白，該經修飾之S蛋白包含與病毒醣蛋白(例如MARV GP)融合之S1 + S2經截短蛋白質，其中GPS側接S1 + S2經截短S蛋白的NH端，且GPTM側接其羧基端。在一特定實施例中，由rMVA編碼之經修飾之S S1 + S2經截短蛋白包含SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸1-1213，例如如圖9A中所例示。在一些實施例中，僅由rMVA編碼之S蛋白片段包含含有S1 + S2經截短蛋白之經修飾之S蛋白，該經截短蛋白包含一或多個脯胺酸取代，例如K986P及V987P之脯胺酸取代，例如如圖9B所例示。在一些實施例中，S1 + S2肽進一步包含取代K417T、E484K及N501Y。
在一替代性態樣中，本文提供一種rMVA病毒載體，其設計成表現呈融合蛋白形式之一或多個SARS-CoV2抗原肽，其中融合蛋白包含套膜醣蛋白之訊息肽(GPS)、SARS-CoV2 S蛋白片段及套膜醣蛋白之跨膜域(GPTM)，其中套膜醣蛋白不來源於冠狀病毒，且其中rMVA病毒載體另外表現來源於與醣蛋白相同病毒之基質蛋白。SARS-CoV2肽-GP融合蛋白設計成允許結合基質蛋白形成VLP，其展示SARS-CoV2抗原肽。適合用於本發明之醣蛋白域及基質蛋白包括(但不限於)來源於以下之彼等：絲狀病毒科，例如馬堡病毒、埃博拉病毒或蘇丹病毒；逆轉錄病毒科，例如1型人類免疫缺乏病毒(HIV-1)；沙粒病毒科，例如拉沙病毒；黃病毒科，例如登革熱病毒及茲卡病毒。在特定實施例中，GP蛋白及基質蛋白來源於馬堡病毒(MARV)。在特定實施例中，醣蛋白來源於MARV GP蛋白(Genbank登錄號AFV31202.1)。在特定實施例中，MARV GPS域包含醣蛋白之胺基酸1至19 (MWTTCFFISLILIQGIKTL) (SEQ ID NO: 88)，GPTM域包含醣蛋白之胺基酸序列644-681 (WWTSDWGVLTNLGILLLLSIAVLIALSCIC RIFTKYIG) (SEQ ID NO: 90)。在一些實施例中，醣蛋白-S蛋白融合物及病毒基質蛋白作為插入在不同位置處之核酸含於rMVA中。在一些實施例中，醣蛋白-s蛋白或蛋白質片段融合物及病毒基質蛋白作為插入在相同位置處之雙順反子核酸含於rMVA中。在一些實施例中，與醣蛋白融合之SARS-CoV2蛋白為S蛋白或其片段。在一些實施例中，S蛋白為包含含有S1 + S2經截短蛋白之經修飾之S蛋白的片段。在一些實施例中，由rMVA編碼之經修飾之S蛋白片段包含SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸2至1213，例如如圖10A及圖10C中所例示。在一些實施例中，由rMVA編碼之經修飾之S蛋白片段包含SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸2至1213，該SARS-CoV2 S蛋白含有一或多個例如K986P及V987P之脯胺酸取代，例如如圖10F及圖10D中所例示。在一些實施例中，S1 + S2肽進一步包含取代K417T、E484K及N501Y。在一些實施例中，融合的S蛋白為S蛋白之線性抗原決定基。在一特定實施例中，S蛋白之線性抗原決定基為SARS-CoV2 S蛋白之受體結合域(RBD)，例如如圖11A及圖11H中所例示。在一些實施例中，線性S抗原決定基包含來源於S蛋白之胺基酸331至524之RBD肽。在一些實施例中，線性S抗原決定基包含S蛋白之胺基酸331至524，例如如圖11B及圖11I中所例示。在一些實施例中，線性S抗原決定基包含來源於S蛋白之胺基酸327至524之RBD肽。在一些實施例中，線性S抗原決定基包含S蛋白之胺基酸327至524，例如如圖11E及圖11N中所例示。在一些實施例中，RBD肽進一步包含取代K417T、E484K及N501Y。在一些實施例中，線性S抗原決定基包含冠狀病毒共有序列。在一些實施例中，S蛋白之兩個或更多個線性抗原決定基與MARV GP融合，其中該兩個或更多個線性抗原決定基由間隔子(例如GPGPG間隔子多肽)隔開。在一些實施例中，線性抗原決定基包括不同的S蛋白RBD肽，例如(RBD序列1-間隔子-RBD序列2)，其中RBD序列1為第一S蛋白RBD肽，且RBD序列2為第二S蛋白RBD肽。在一些實施例中，融合的S蛋白包括S蛋白之兩個或更多個線性抗原決定基，其中抗原決定基含於串聯重複序列中，例如(RBD序列1-間隔子-RBD序列2-間隔子)X ，其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。在一些實施例中，RBD肽係選自一或多個來源於SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸331至524之肽。在一些實施例中，由rMVA編碼之線性抗原決定基係選自SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸504至524及胺基酸473至490。在一些實施例中，由串聯重複序列編碼之線性抗原決定基為SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸504至524及胺基酸473至490。在一些實施例中，串聯重複序列編碼((胺基酸504-524)-GPGPG-(胺基酸473-490)-GPGPG)x，其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。在一些實施例中，x=3至7。在一些實施例中，x=5。當以串聯重複序列形式提供S蛋白片段時，GPS側接串聯重複序列之NH端，且GPTM側接串聯重複序列之羧基端，如例如圖12A及圖12B中所例示。在一些實施例中，RBD肽進一步包含取代E484K。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 92及95之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA包含含有SEQ ID NO: 93或94及97之核酸序列。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 92及96之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA包含含有SEQ ID NO: 93或94及98之核酸序列。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 92及99之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 92及100之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 134之胺基酸序列。
在本發明之一替代性態樣中，本文提供一種重組MVA病毒載體，其編碼全長S蛋白，例如如圖13A中所例示。在一些實施例中，S蛋白為經穩定之全長蛋白，其中在S胞外域三聚體之啟動子之七肽重複序列1 (HR1)與中央螺旋之間的邊界處或附近有一或多個脯胺酸取代。在一些實施例中，脯胺酸取代出現在三聚體中之啟動子之殘基970至990之間。在一些實施例中，S蛋白經穩定且表現為全長蛋白且在胺基酸K986及V987處含有兩個脯胺酸取代，例如如圖14A中所例示。在一些實施例中，S蛋白表現為經截短S蛋白，其包含S蛋白之S1 + S2域且缺少S蛋白之羧基端。在一些實施例中，經截短S蛋白包含S蛋白之胺基酸1至1213，如圖15A中例示。在一些實施例中，經截短S蛋白包括胺基酸K986及V987處之兩個脯胺酸取代，如圖15F中所例示。在一些實施例中，S肽進一步包含一或多個選自以下之取代：K417N、K417T、E484K及N501Y。在一些實施例中，S肽進一步包含取代K417T、E484K及N501Y。
在一些態樣中，本文提供一種減少或預防個體(例如人類)感染SARS-CoV2之方法，其包含投與本文所描述之rMVA病毒載體。在一些實施例中，作為初次接觸抗原免疫疫苗向先前尚未感染SARS-CoV2之個體預防性投與rMVA病毒載體。在一些實施例中，作為加強疫苗向先前已感染SARS-CoV2之個體投與rMVA病毒載體。在一些實施例中，作為加強疫苗在先前已投與SARS-CoV2疫苗之個體中投與rMVA病毒載體。在一些實施例中，先前所投與之SARS-CoV2疫苗為本文所描述之rMVA病毒載體。在一些實施例中，先前所投與之疫苗為非MVA病毒載體疫苗。在一些實施例中，疫苗為基於mRNA之疫苗、腺病毒疫苗、非複製性疫苗、DNA疫苗、減毒活疫苗、基於植物之輔助疫苗、基於多抗原決定基肽之疫苗、滅活病毒、肽疫苗。在一些實施例中，先前所投與之疫苗係選自以下中之一或多者：mRNA-1273 (MODERNA COVID-19疫苗；Moderna, Inc.)、AZD-1222 (COVIDSHIELD；AstraZeneca及牛津大學(University of Oxford))、BNT162 (COMIRNATY；Pfizer及BioNTech)、Sputnik V (Gamaleya Research Institute，Acellena Contract Drug Research and Development)、CoronaVac (Sinovac)、NVX-CoV 2372 (NovoVax)、SCB-2019 (Sanofi及GSK)、ZyCoV-D (Zydus Cadila)、BBIBP-CorV (Beijing Institute of Biological Products；China National Pharmaceutical Group (Sinopharm))、EpiVacCorona (Federal Budgetary Research Institution State Research Center of Virology and Biotechnology)、Convidicea (CanSino Biologics)、Covid-19疫苗(Wuhan Institute of Biological Products；China National Pharmaceutical Group (Sinopharm)、JNJ-78436735 (Johnson & Johnson), ZF2001) Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical, Institute of Microbiology of the Chinese Academy of Sciences)、CVnCoV (CureVac；GSK)、INO-4800 (Inovio Pharmaceuticals)、VIR-7831 (Medicago；GSK；Dynavax)、基於Covid-19腺病毒之疫苗(ImmunityBio；NantKwest)、UB-612 (COVAXX)或CoVaxin (Bharat Biotech)。
在一些態樣中，以使用一或多種除本文所描述之rMVA之外之額外接種劑的免疫接種方案，向個體(例如人類)投與本文所描述之rMVA病毒載體。
本文亦提供穿梭載體，其包含待插入至如本文中所描述之MVA中之核酸序列以及包含本文所描述之核酸序列插入物之經分離核酸序列。本文進一步提供細胞，諸如雞胚胎纖維母細胞細胞或DF1細胞，其包含如本文所描述之rMVA。
相關申請案之交叉參考
本申請案主張2020年2月14日申請之美國臨時申請案第62/976,913號、2020年2月16日申請之美國臨時申請案第62/977,402號、2020年3月20日申請之美國臨時申請案第62/992,710號及2020年5月18日申請之美國臨時申請案第63/026,580號之權益及優先權，其中之每一者以全文引用之方式併入本文中。
本文提供疫苗組合物，其包含能夠表現一或多種SARS-CoV2 (2019-新冠狀病毒)抗原、其片段、其變體或其組合之重組MVA病毒載體。疫苗可用於抵抗SARS-CoV2，從而治療、預防及/或抵抗基於SARS-CoV2之病變。疫苗可顯著地誘導投與疫苗一個體之免疫反應，從而抵抗及治療SARS-CoV2感染。
本發明之組合物及方法可以治療有效量使用，以預防未暴露的個人感染或治療暴露於SARS-CoV2之個體的疾病，以便減輕疾病之嚴重程度。
在一些實施例中，組合物及方法可用作增強疫苗，以增加或調節或改變由先前SARS-CoV2疫苗誘導之免疫反應；諸如RNA疫苗或DNA疫苗或病毒載體化之疫苗，諸如腺病毒疫苗載體或基於蛋白質之疫苗或包含SARS-CoV2之殺毒或滅活製劑(具有或不具有佐劑)或減弱SARS-CoV2之疫苗。在一些實施例中，組合物及方法可用作在感染SARS-CoV2及自SARS-CoV2恢復後之增強疫苗。
理想的免疫原性組合物或疫苗具有以下特徵：安全、有效、保護範疇及長壽性。具有少於所有此等特徵之組合物仍可適用於預防SARS-CoV2感染或在發展症狀之前限制已治療之暴露個體的症狀或疾病進展。在一個實施例中，本發明提供一種疫苗，其允許在單一免疫接種之後至少部分(若不完全)的保護。
疫苗可誘導投與疫苗之個體中之體液免疫反應。所誘導的體液免疫反應可對以下中之一或多者具有特異性：rMVA表現的SARS-CoV2抗原抗原決定基或區，其對SARS-CoV2具有特異性；或亦存在於其他冠狀病毒中之保守抗原決定基或區段。所誘導的體液免疫反應可對於一或多種表現的SARS-CoV2抗原具有反應性。
由疫苗誘導之體液免疫反應可包括與未投與疫苗之個體相比，與投與疫苗之個體相關之中和抗體的含量增加。另外，由疫苗誘導之體液反應可包括先前已感染SARS-CoV2之彼等者之中和抗體之含量增加，其中本發明之rMVA充當增強劑。由疫苗誘導之體液反應可包括先前已投與不同SARS-CoV2疫苗之彼等者之中和抗體之含量增加，其中本發明之rMVA充當增強劑。中和抗體可對由rMVA病毒載體表現之SARS-CoV2抗原或其片段具有特異性。中和抗體可對SARS-CoV2抗原具有反應性。中和抗體可提供針對投與疫苗之個體之SARS-CoV2感染及其相關病變之保護及/或針對其之治療。
由疫苗誘導之體液免疫反應可包括與未投與疫苗之個體相比，與投與疫苗之個體相關之IgG抗體的含量增加。此等IgG抗體可對至少一種SARS-CoV2抗原具有特異性。
疫苗可誘導投與疫苗之個體中之細胞免疫反應。所誘導的細胞免疫反應可對SARS-CoV2抗原具有特異性。所誘導的細胞免疫反應可對於SARS-CoV2抗原具有反應性。所誘導的細胞免疫反應可包括引起CD8+ T細胞反應。所引起的CD8+ T細胞反應可以下具有反應性：對SARS-CoV2具有特異性之SARS-CoV2抗原抗原決定基或區；或亦存在於其他冠狀病毒中之保守抗原決定基或區段。
所引起的CD8+ T細胞反應可為多功能的。所誘導的細胞免疫反應可包括引起CD8+ T細胞反應，其中CD8+ T細胞產生干擾素-γ (IFN-γ)、腫瘤壞死因子α (TNF-α)、介白素-2 (IL-2)或IFN-γ與TNF-α之組合。
所誘導的細胞免疫反應可包括與未投與疫苗之個體相比，與投與疫苗之個體相關之CD8+ T細胞反應增加。所誘導的細胞免疫反應可包括產生IFN-γ之CD3+CD8+ T細胞之頻率增加。所誘導的細胞免疫反應可包括產生TNF-α之CD3+CD8+ T細胞之頻率增加。所誘導的細胞免疫反應可包括產生IL-2之CD3+CD8+ T細胞之頻率增加。所誘導的細胞免疫反應可包括產生IFN-γ及TNF-α兩者之CD3+CD8+ T細胞之頻率增加。
由疫苗誘導之細胞免疫反應可包括引起CD4+ T細胞反應。所引起的CD4+ T細胞反應可對SARS-CoV2抗原具有反應性。所引起的CD4+ T細胞反應可為多功能的。所誘導的細胞免疫反應可包括引起CD4+ T細胞反應，其中CD4+ T細胞產生IFN-γ、TNF-α、IL-2或IFN-γ與TNF-α之組合。
所誘導的細胞免疫反應可包括產生IFN-γ之CD3+CD4+ T細胞之頻率增加。所誘導的細胞免疫反應可包括產生TNF-α之CD3+CD4+ T細胞之頻率增加。所誘導的細胞免疫反應可包括產生IL-2之CD3+CD4+ T細胞之頻率增加。所誘導的細胞免疫反應可包括產生IFN-γ及TNF-α兩者之CD3+CD4+ T細胞之頻率增加。
在一些實施例中，上文所描述之此等由疫苗誘導之增加的細胞免疫反應該在先前已感染SARS-CoV2之個體中，其中本發明之rMVA充當增強劑。在一些實施例中，上文所描述之此等由疫苗誘導之增加的細胞免疫反應係在先前已投與不同SARS-CoV2疫苗之個體中，其中本發明之rMVA充當增強劑。
定義 當術語以單數形式提供時，本發明人亦考慮由該術語之複數描述之本發明之態樣。如本說明書中及隨附申請專利範圍中所使用，除非上下文另外清楚地指出，否則單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個參考物，例如「一(個/種)肽」包括複數個/種肽。因此，舉例而言，提及「一方法」包括一或多種方法，及/或本文所描述之類型之步驟及/或在閱讀本發明之後，其對於熟習此項技術者變得顯而易見。
如本文所用，術語「佐劑」意謂添加至本文所描述之疫苗中以增強組合物之免疫原性的任何分子。
術語「抗原」係指能夠誘導免疫反應之物質或分子，諸如蛋白質或其片段。
如本文所用，「編碼序列(Coding sequence)」或「編碼核酸(encoding nucleic acid)」或「編碼…之核酸序列」或其類似者意謂包含編碼蛋白質或其片段之核苷酸序列的核酸(RNA或DNA分子)。編碼序列可進一步包括與調節元件可操作地連接之起始及終止訊息，該等調節元件包括能夠引導在投與核酸之個體或哺乳動物的細胞中表現的啟動子及聚腺苷酸化訊息。
術語「保守胺基酸取代」係指天然胺基酸殘基用非天然殘基取代，使得對於在彼位置處之胺基酸殘基之尺寸、極性、電荷、疏水性或親水性之影響很小或無影響，且不產生實質上改變的免疫原性。舉例而言，此等可為以下群組內之取代：纈胺酸、甘胺酸；甘胺酸、丙胺酸；纈胺酸、異白胺酸、白胺酸；天冬胺酸、麩胺酸；天冬醯胺、麩醯胺酸；絲胺酸、蘇胺酸；離胺酸、精胺酸；及苯丙胺酸、酪胺酸。對於多肽序列之保守胺基酸修飾(及對於編碼核苷酸之對應修飾)可產生功能特徵及化學特徵類似於親本多肽之功能特徵及化學特徵的多肽。
在多肽或蛋白質之情形下，術語「缺失」係指自多肽或蛋白質序列移除一或多個胺基酸殘基之密碼子，其中任一側上之區接合在一起。在核酸之情形下，術語缺失係指自核酸序列移除一或多個鹼基，其中任一側上之區接合在一起。
在蛋白質藥劑之情形下，術語「片段」係指包含肽、多肽或蛋白質之胺基酸序列之至少2個連續胺基酸殘基、至少5個連續胺基酸殘基、至少10個連續胺基酸殘基、至少15個連續胺基酸殘基、至少20個連續胺基酸殘基、至少25個連續胺基酸殘基、至少40個連續胺基酸殘基、至少50個連續胺基酸殘基、至少60個連續胺基酸殘基、至少70個連續胺基酸殘基、至少80個連續胺基酸殘基、至少90個連續胺基酸殘基、至少100個連續胺基酸殘基、至少125個連續胺基酸殘基、至少150個連續胺基酸殘基、至少175個連續胺基酸殘基、至少200個連續胺基酸殘基或至少250個連續胺基酸殘基之胺基酸序列的肽或多肽。在一個實施例中，片段構成參考多肽之整個長度之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在一個實施例中，全長蛋白之片段保留全長蛋白之活性。在另一實施例中，全長蛋白之片段不保留全長蛋白之活性。
在核酸之情形下，術語「片段」係指包含編碼肽、多肽或蛋白質之核酸序列之至少2個連續核苷酸、至少5個連續核苷酸、至少10個連續核苷酸、至少15個連續核苷酸、至少20個連續核苷酸、至少25個連續核苷酸、至少30個連續核苷酸、至少35個連續核苷酸、至少40個連續核苷酸、至少50個連續核苷酸、至少60個連續核苷酸、至少70個連續核苷酸、至少80個連續核苷酸、至少90個連續核苷酸、至少100個連續核苷酸、至少125個連續核苷酸、至少150個連續核苷酸、至少175個連續核苷酸、至少200個連續核苷酸、至少250個連續核苷酸、至少300個連續核苷酸、至少350個連續核苷酸或至少380個連續核苷酸之核酸序列的核酸。在一個實施例中，片段構成參考核酸序列之整個長度之至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。在一較佳實施例中，核酸之片段編碼保留全長蛋白之活性之肽或多肽。在另一實施例中，片段編碼不保留全長蛋白之活性之肽或多肽。
如本文所用，片語「異源序列」係指在自然界中通常不與另一所關注之核酸或蛋白質、多肽或肽序列相關之任何核酸、蛋白質、多肽或肽序列。
如本文所用，片語「異源核酸插入物」係指已插入或待插入至本文所描述之重組載體中之任何核酸序列。異源核酸插入物可僅僅指基因產物編碼序列，或可指包含啟動子、基因產物編碼序列(例如膜(M)蛋白、套膜(E)蛋白、棘(S)蛋白)及與其相連或可操作地連接之任何調節序列的序列。
術語「均聚物鏈段」係指包含至少四個不間雜任何其他核苷酸之相同核苷酸之序列，例如GGGG或TTTTTTT。
術語「誘導免疫反應」意謂在已投與rMVA之個體中引起針對由rMVA表現之一或多種SARS-CoV2蛋白或其片段之體液反應(例如產生抗體)或細胞反應(例如T細胞活化)。
術語「改良型安卡拉牛痘(modified vaccinia Ankara/modified vaccinia Ankara/Modified Vaccinia Ankara)」或「MVA」係指由Anton Mayr博士藉由在雞胚胎纖維母細胞上進行連續傳代而發展的高度減弱的牛痘病毒株；或其變體或衍生物。MVA綜述於Mayr, A.等人 1975 Infection 3:6-14中。
如本文所用，「核酸」或「寡核苷酸」或「多核苷酸」意謂共價連接在一起的至少兩個核苷酸。單股之描述亦界定互補股之序列。因此，核酸亦涵蓋所描繪單股之互補股。核酸之多種變體可用於與給定核酸相同的目的。因此，核酸亦涵蓋實質上相同的核酸及其互補序列。單股提供可在嚴格雜交條件下與目標序列雜交之探針。因此，核酸亦涵蓋在嚴格雜交條件下雜交之探針。
核酸可為單股或雙股，或可含有雙股及單股序列之部分。核酸可為基因體及cDNA之DNA、RNA或雜交體，其中核酸可含有去氧核糖核苷酸與核糖核苷酸之組合及鹼基之組合，該等鹼基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、肌苷、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶及異鳥嘌呤。核酸可藉由化學合成方法或藉由重組方法得到。
如本文所用，「可操作地連接」意謂基因之表現在與其空間連接之啟動子的控制下。啟動子可位於在其控制下之基因之5′ (上游)或3′ (下游)。啟動子與基因之間的距離可與啟動子與其控制之基因(啟動子所源自之基因)之間的距離大致相同。如此項技術中已知，此距離之變化可在不損失啟動子功能之情況下調節。
如本文所用，「肽」、「蛋白質」或「多肽」可意謂連接的胺基酸序列，且可為天然、合成的或天然與合成之修飾或組合。
如本文所用，「啟動子」意謂能夠賦予、活化或增強細胞中之核酸表現的合成或天然衍生型分子。啟動子可包含一或多個特定轉錄調節序列，以進一步增強表現及/或改變其空間表現及/或時間表現。啟動子亦可包含遠端增強子或抑制子元件，該等元件可位於距轉錄之起始位點多達數千鹼基對處。
術語「預防(prevent/preventing/prevention)」係指由投與療法或投與療法組合所致抑制病狀(例如SARS-CoV2感染)發展或發作，或預防個體之病狀之一或多個症狀的復發、發作或發展。
術語「預防有效量」係指組合物(例如重組MVA載體或醫藥組合物)足夠產生預防病狀或其症狀(例如SARS-CoV2感染)或其相關症狀之發展、復發或發作或增強或提高另一療法之預防效果的量。
關於病毒載體而言，術語「重組」意謂已例如使用重組核酸技術進行活體外操縱以表現異源病毒核酸序列之載體(例如病毒基因體)。
術語「調節序列(regulatory sequence/regulatory sequences)」集合地係指啟動子序列、聚腺苷酸化訊息、轉錄終止序列、上游調節域、複製起點、內部核糖體進入位點(「IRES」)、增強子及其類似者，其集合地提供用於編碼序列之轉錄及轉譯。並非全部此等控制序列需要始終存在，只要所選擇基因能夠進行轉錄及轉譯即可。
術語「穿梭載體」係指適用於將遺傳物質自一種宿主系統轉移至另一中之基因載體(例如DNA質體)。穿梭載體可單獨在至少一種宿主(例如大腸桿菌(E. coli))中複製(不存在任何其他載體)。在MVA載體構築之情形下，穿梭載體通常為可在大腸桿菌中操縱且接著引入至用MVA載體感染之培養細胞中，從而引起產生新的重組MVA載體的DNA質體。
術語「緘默突變」意謂不造成由核苷酸序列編碼之蛋白質之一級結構變化的核苷酸序列變化，例如自AAA (編碼離胺酸)變化為AAG (亦編碼離胺酸)。
術語「個體」意謂任何哺乳動物，包括(但不限於)人類、家養動物及農畜、及動物園動物、運動動物或寵物，諸如狗、馬、貓、牛、大鼠、小鼠、天竺鼠及其類似者。可藉由根據診斷測試或個體或健康照護提供者之觀點(例如基因測試、酶或蛋白質標記、標記歷史及其類似者)而進行任何客觀或主觀判定來判定「處於風險下」之彼等個體的判定。
術語「同義密碼子」係指使用具有不同核酸序列之密碼子來編碼相同胺基酸，例如AAA及AAG (該兩者均編碼離胺酸)。密碼子最佳化將蛋白質之密碼子改變為載體或宿主細胞最頻繁使用的同義密碼子。
術語「治療有效量」意謂當向哺乳動物投與用於預防或治療病毒時足夠實現病毒之此類預防或治療之組合物的量(例如重組MVA載體或醫藥組合物)。
術語「治療(treating/treat)」係指由於投與一或多個療法而根除或控制SARS-CoV2感染、減少或改善由該病毒引起之病狀或一或多個症狀之進展、嚴重程度及/或持續時間。
術語「疫苗」意謂用於在向個體投與材料之後激起免疫反應且賦予免疫之材料。此類免疫可包括在疫苗投與後個體暴露於免疫原時出現之細胞或體液免疫反應。
術語「疫苗插入物」係指當插入至重組載體中時與用於表現之啟動子可操作地連接之編碼異源序列的核酸序列。異源序列可編碼本文所描述之醣蛋白或基質蛋白。
術語「病毒樣顆粒」或「VLP」係指類似於病毒但因為其不含有病毒遺傳物質而不具有傳染性之結構。
對於本文中數值範圍之敍述而言，明確地涵蓋具有相同精確度之其間的每一間插數值。舉例而言，對於6-9之範圍，除6與9以外涵蓋數值7與8，且對於6.0-7.0之範圍，明確涵蓋數值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9及7.0。
SARS-CoV2 抗原 本文提供重組改良型安卡拉牛痘(rMVA)病毒載體，其包含編碼一或多種SARS-CoV2蛋白、肽或其片段之異源核酸插入物，該等異源核酸插入物可操作地連接至與痘病毒表現系統相容之啟動子，在表現後，其能夠誘導保護性免疫而不誘導與先前MVA相關冠狀病毒疫苗接種策略相關之免疫病變。
冠狀病毒屬於冠狀病毒科病毒目，且為單股有套膜RNA病毒之大家族。其可分類為四個屬：α冠狀病毒(Alphacoronavirus )、β冠狀病毒(Betacoronavirus )、γ冠狀病毒(Gammacoronavirus )及δ冠狀病毒(Deltacoronavirus ) (Perlman及Netland, Coronaviruses post-SARS: update on replication and pathogenesis. Nature Reviews Microbiology 2009; 7:439-450)。SARS-CoV2屬於β冠狀病毒屬，其亦包括SARS-CoV、MERS-CoV、蝙蝠冠狀病毒HKU4、小鼠肝炎冠狀病毒(MHV)、牛冠狀病毒(BCoV)及人類冠狀病毒OC43。
在所有RNA病毒中，冠狀病毒具有最大的基因體，通常在27至32 kb範圍內。基因體封裝於由核衣殼蛋白(N)形成之螺旋衣殼內部且進一步由套膜包圍。至少三種結構蛋白與病毒套膜相關：膜蛋白質(M)及套膜蛋白(E)涉及病毒組裝，而棘蛋白(S)介導病毒進入宿主細胞。在此等結構蛋白中，棘蛋白形成自病毒表面之大的突起，賦予冠狀病毒具有冠之外觀(因此其名稱；拉丁語冠狀病毒(corona)意謂冠)。除介導病毒進入以外，棘蛋白為病毒宿主範圍及組織向性之關鍵決定因素且為宿主免疫反應之主要誘導因子。
SARS-CoV2之全整基因體業已進行定序，且其已指定為GenBank登錄號MN908947.3。其係由呈29,903個鹼基對之單股RNA序列所組成。迄今為止，已鑑別出10個開放閱讀框(open reading frame；ORF)，包括編碼結構性膜(M)蛋白、套膜(E)蛋白及棘(S)蛋白之基因。
棘 (S) 蛋白 套膜錨定的棘蛋白首先會與宿主受體結合，接著將病毒及宿主膜融合，從而介導冠狀病毒進入宿主細胞(Li F. 2016. Structure, Function, and Evolution of Coronavirus Spike Proteins. Annu Rev Virol 3:237-261)。SARS-CoV棘蛋白之限定受體結合域(receptor-binding domain；RBD)特異性識別其宿主受體血管收縮素轉化酶2 (receptor angiotensin-converting enzyme 2；ACE2) (Li等人, 2003. Angiotensin-converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature 426:450-454)。SARS-CoV2棘蛋白與SARS-CoV棘蛋白之間的總體序列相似性以全蛋白而言約76%至78%，以RBD而言約73%至76%，及以受體結合模體(RBM)而言約 50%至53%，其中兩種S蛋白之間的相似性顯示ACE2為SARS-CoV2之受體的可能性。參見Wan等人, Receptor recognition by novel coronavirus from Wuhan:  An analysis based on decade-long structural studies of SARS, J. Virol. 數位物件識別碼：10.1128/JVI.00127-20。
冠狀病毒棘蛋白含有三個區段：大胞外域、單通道跨膜錨及短的胞內尾。胞外域係由受體結合次單位S1及膜融合次單位S2所組成。電子顯微術研究揭露，棘蛋白為具有三個S1頭部及三聚合S2柄之丁香形三聚體。參見例如Kirchdoerfer等人, Pre-fusion structure of a human coronavirus spike protein. Nature. 2016年3月3日; 531(7592):118-21。在病毒進入期間，S1結合與宿主細胞表面上之受體結合以便使病毒附著，而S2會融合宿主及病毒膜，從而使病毒基因體進入宿主細胞。受體結合及膜融合為冠狀病毒感染週期中初始及關鍵步驟。
SARS-CoV2棘(S)蛋白之胺基酸序列之長度為1273個胺基酸。S蛋白已在Genbank寄存編號QHD43416報導，且在表1中係以SEQ ID NO: 1再現，而其對應核酸序列(SEQ ID NO: 2)已在Genbank寄存編號MN908947.3報導，且位於SARS-CoV2基因體之核酸21563至25384處。在一些實施例中，rMVA包含編碼SEQ ID NO: 1或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%同源之胺基酸序列的核酸序列。在一些實施例中，插入至MVA病毒載體中之全長S蛋白之核酸已如下文所描述進行最佳化，且例如如SEQ ID NO: 3或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%同源之核酸序列中所提供。在某些實施例中，待插入至rMVA中之核酸序列中可包括編碼標籤之額外核酸序列，使得在蛋白質之C端處表現標籤。在一些實施例中，核酸序列(GAGCCAGAGGCT) (SEQ ID NO: 4)編碼具有胺基酸序列EPEA (SEQ ID NO: 5)之高親和力C-標籤。表 1 ： SARS-CoV2 棘蛋白
SEQ ID NO: 1 - SARS-CoV2全長S蛋白 MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
SEQ ID NO: 2 - 全長S蛋白之SARS-CoV2核酸序列 ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGATGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTACCACAGAAATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAACTGAATGCAGCAATCTTTTGTTGCAATATGGCAGTTTTTGTACACAATTAAACCGTGCTTTAACTGGAATAGCTGTTGAACAAGACAAAAACACCCAAGAAGTTTTTGCACAAGTCAAACAAATTTACAAAACACCACCAATTAAAGATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCAGATCCATCAAAACCAAGCAAGAGGTCATTTATTGAAGATCTACTTTTCAACAAAGTGACACTTGCAGATGCTGGCTTCATCAAACAATATGGTGATTGCCTTGGTGATATTGCTGCTAGAGACCTCATTTGTGCACAAAAGTTTAACGGCCTTACTGTTTTGCCACCTTTGCTCACAGATGAAATGATTGCTCAATACACTTCTGCACTGTTAGCGGGTACAATCACTTCTGGTTGGACCTTTGGTGCAGGTGCTGCATTACAAATACCATTTGCTATGCAAATGGCTTATAGGTTTAATGGTATTGGAGTTACACAGAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAATTGATTGCCAACCAATTTAATAGTGCTATTGGCAAAATTCAAGACTCACTTTCTTCCACAGCAAGTGCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGGTCAACCAAAATGCACAAGCTTTAAACACGCTTGTTAAACAACTTAGCTCCAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTTTTAAATGATATCCTTTCACGTCTTGACAAAGTTGAGGCTGAAGTGCAAATTGATAGGTTGATCACAGGCAGACTTCAAAGTTTGCAGACATATGTGACTCAACAATTAATTAGAGCTGCAGAAATCAGAGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCAGAGTGTGTACTTGGACAATCAAAAAGAGTTGATTTTTGTGGAAAGGGCTATCATCTTATGTCCTTCCCTCAGTCAGCACCTCATGGTGTAGTCTTCTTGCATGTGACTTATGTCCCTGCACAAGAAAAGAACTTCACAACTGCTCCTGCCATTTGTCATGATGGAAAAGCACACTTTCCTCGTGAAGGTGTCTTTGTTTCAAATGGCACACACTGGTTTGTAACACAAAGGAATTTTTATGAACCACAAATCATTACTACAGACAACACATTTGTGTCTGGTAACTGTGATGTTGTAATAGGAATTGTCAACAACACAGTTTATGATCCTTTGCAACCTGAATTAGACTCATTCAAGGAGGAGTTAGATAAATATTTTAAGAATCATACATCACCAGATGTTGATTTAGGTGACATCTCTGGCATTAATGCTTCAGTTGTAAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTTGCCAAGAATTTAAATGAATCTCTCATCGATCTCCAAGAACTTGGAAAGTATGAGCAGTATATAAAATGGCCATGGTACATTTGGCTAGGTTTTATAGCTGGCTTGATTGCCATAGTAATGGTGACAATTATGCTTTGCTGTATGACCAGTTGCTGTAGTTGTCTCAAGGGCTGTTGTTCTTGTGGATCCTGCTGCAAATTTGATGAAGACGACTCTGAGCCAGTGCTCAAAGGAGTCAAATTACATTACACA
SEQ ID NO: 3 - 全長S蛋白之SARS-CoV2最佳化核酸序列 ATGTTCGTGTTCCTAGTCCTACTACCGCTAGTCTCTTCTCAGTGTGTAAACCTAACAACGAGAACACAACTACCACCGGCGTACACCAATTCTTTCACAAGAGGAGTATATTACCCGGACAAGGTGTTCAGATCCTCCGTACTACATTCTACACAGGACCTATTCCTACCGTTCTTCTCTAACGTAACATGGTTCCACGCGATCCATGTCTCTGGAACAAACGGAACGAAGAGATTCGATAACCCGGTCTTGCCGTTCAACGATGGTGTATACTTTGCGTCCACCGAGAAGTCCAACATCATCAGAGGATGGATCTTCGGAACCACCTTGGATTCTAAGACCCAGTCCTTGCTAATCGTCAACAACGCGACCAACGTCGTCATCAAAGTCTGCGAATTCCAGTTCTGTAACGACCCGTTCTTGGGAGTCTACTACCACAAGAACAACAAGTCCTGGATGGAATCCGAGTTCAGAGTCTACTCTTCCGCGAACAACTGCACCTTCGAATATGTATCTCAGCCGTTCCTAATGGACCTAGAGGGAAAGCAGGGAAACTTCAAGAACCTAAGAGAGTTCGTATTCAAGAACATCGACGGATACTTCAAGATCTACTCCAAGCACACTCCGATCAACCTAGTTAGAGATCTACCGCAAGGATTCTCTGCGCTAGAACCGTTAGTAGATTTGCCGATCGGAATCAACATCACCAGATTCCAGACACTACTAGCGCTACACAGATCTTACCTAACGCCGGGAGATTCTTCTTCTGGATGGACTGCTGGTGCTGCGGCTTATTATGTAGGATACCTACAGCCGAGAACCTTCCTATTGAAGTACAACGAAAACGGAACCATCACCGATGCCGTAGATTGTGCTCTAGATCCGCTATCCGAAACGAAGTGCACCCTAAAGTCTTTCACCGTCGAGAAGGGAATCTACCAGACCTCCAACTTTAGAGTACAGCCGACCGAATCCATCGTCAGATTTCCGAACATCACGAACCTATGTCCGTTCGGAGAAGTGTTCAACGCGACAAGATTTGCGTCTGTCTATGCGTGGAACAGAAAAAGAATCAGTAACTGCGTCGCGGACTACTCCGTCCTATACAACTCTGCCTCTTTCTCCACGTTCAAATGCTACGGTGTATCTCCGACAAAGCTAAACGATCTATGCTTCACCAACGTCTACGCGGACTCCTTCGTAATCAGAGGAGATGAAGTTAGACAGATTGCGCCGGGACAAACTGGAAAGATCGCGGATTATAACTACAAGCTACCGGACGACTTCACCGGATGTGTAATTGCGTGGAATTCGAACAACCTAGACTCCAAAGTCGGAGGAAACTACAACTACTTGTACAGACTATTCAGAAAGTCCAACCTAAAGCCGTTCGAGAGAGACATCTCCACCGAAATCTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCCCGCTACAGTCTTACGGATTTCAACCGACAAACGGTGTAGGATATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTATGTGGACCGAAAAAGTCTACCAACCTAGTCAAGAACAAATGCGTCAACTTTAACTTCAACGGACTAACCGGAACCGGTGTCCTAACCGAATCTAACAAGAAGTTTCTACCGTTCCAGCAGTTCGGAAGAGATATCGCGGATACAACAGACGCTGTCAGAGATCCGCAAACCTTGGAGATCCTAGATATCACACCGTGTTCTTTCGGTGGTGTCTCTGTAATTACTCCGGGAACGAACACCTCCAATCAAGTAGCGGTACTATACCAGGACGTGAACTGTACAGAAGTACCGGTAGCTATTCACGCGGATCAACTAACACCAACTTGGAGAGTGTACTCCACCGGATCTAACGTATTCCAAACAAGAGCGGGATGTCTAATCGGAGCGGAACACGTAAACAACTCCTACGAATGTGATATCCCGATTGGAGCGGGAATCTGTGCGTCTTACCAAACACAAACAAACTCTCCGAGAAGAGCGAGATCTGTAGCCTCTCAATCTATTATCGCCTACACCATGTCCTTGGGAGCCGAAAATTCTGTCGCGTACTCCAACAATTCTATCGCGATCCCGACAAACTTCACCATCTCTGTAACAACCGAGATCCTACCGGTGTCTATGACCAAGACATCTGTCGATTGCACCATGTACATCTGCGGAGATTCCACCGAGTGCTCCAACCTACTACTACAGTACGGATCTTTCTGTACCCAGCTAAACAGAGCGTTGACTGGAATCGCTGTAGAGCAGGATAAGAACACTCAAGAGGTATTCGCGCAAGTCAAGCAGATCTATAAGACTCCGCCGATCAAGGACTTCGGAGGTTTCAACTTCTCTCAGATCTTGCCGGATCCGTCCAAACCGTCTAAGAGATCTTTCATCGAGGACCTACTATTCAACAAAGTCACCCTAGCTGACGCGGGATTCATCAAACAATACGGAGATTGCTTGGGAGACATTGCGGCGAGAGATCTAATTTGCGCGCAGAAGTTTAACGGATTGACAGTACTACCGCCGCTACTAACCGATGAGATGATTGCGCAGTACACGTCTGCTCTATTGGCGGGAACAATTACAAGTGGATGGACATTTGGAGCCGGTGCCGCTCTACAAATTCCGTTTGCTATGCAAATGGCGTACAGATTCAACGGAATCGGAGTAACCCAGAACGTCTTGTACGAGAACCAGAAGCTAATCGCGAACCAGTTCAATTCCGCGATCGGAAAGATCCAGGACAGTCTATCTTCTACTGCTTCGGCGTTGGGAAAGCTACAGGATGTAGTAAATCAAAACGCGCAGGCGCTAAACACCTTGGTCAAGCAACTATCCTCTAACTTCGGAGCGATCTCGTCCGTCCTAAACGACATCTTATCCAGACTAGATAAGGTCGAAGCGGAGGTCCAGATCGATAGACTAATCACTGGAAGATTGCAGTCCCTACAGACCTACGTAACACAGCAACTAATTAGAGCGGCGGAGATTAGAGCCTCTGCTAATCTAGCTGCGACCAAGATGTCCGAATGTGTCTTGGGACAATCCAAGAGAGTGGACTTCTGCGGAAAGGGATACCACCTAATGTCTTTCCCACAATCTGCGCCGCATGGTGTCGTATTCCTACATGTAACATATGTGCCGGCGCAAGAAAAGAACTTCACAACAGCTCCAGCGATCTGCCATGATGGAAAAGCTCATTTCCCGAGAGAGGGAGTCTTTGTCTCTAACGGAACTCATTGGTTCGTCACCCAGAGAAACTTCTACGAGCCGCAGATCATCACCACCGACAACACATTCGTCTCGGGAAACTGCGACGTGGTCATCGGAATCGTAAACAATACCGTCTACGATCCGTTGCAGCCGGAACTAGACTCCTTCAAAGAAGAGTTGGACAAGTACTTCAAGAACCACACCTCTCCGGATGTGGACTTGGGAGATATCTCTGGAATCAACGCGTCCGTCGTCAACATCCAGAAAGAAATCGATAGATTGAACGAGGTCGCGAAGAACTTGAACGAGTCCCTAATCGACCTACAAGAGCTAGGAAAATACGAGCAGTACATCAAGTGGCCGTGGTACATCTGGCTAGGATTCATTGCTGGACTAATTGCGATCGTCATGGTCACCATCATGCTATGCTGTATGACCTCCTGTTGCTCCTGTCTAAAGGGATGTTGTTCCTGCGGATCCTGTTGCAAGTTCGATGAAGATGATAGTGAACCGGTCCTAAAGGGTGTCAAGCTACACTACACA
在某些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且含有一或多個胺基酸取代。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且含有一或多個選自SEQ ID NO: 1之K417T、E484K或N501Y之取代。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且含有以下取代：SEQ ID NO: 1之K417T、E484K及N501Y。在一些實施例中，取代為K417N。在一些實施例中，S蛋白表現為SEQ ID NO: 6或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%同源之胺基酸序列的全長蛋白。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且缺失SEQ ID NO: 1之一或多個棘蛋白胺基酸H69、V70或Y144或其組合。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且含有一或多個選自以下之取代：SEQ ID NO: 1之D614G、A570D、P681H、T716I、S982A、D1118H、K417N or K417T、D215G、A701V、L18F、R246I、Y453F、I692V、M1229I、N439K、A222V、S477N或A376T，或其組合。在一些實施例中，變體病毒株為在SEQ ID NO: 1之胺基酸242-244處具有棘蛋白缺失之SARS-CoV2病毒。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且含有以下缺失及取代：SEQ ID NO: 1之缺失胺基酸69-70、缺失胺基酸Y144、胺基酸取代N501Y、胺基酸取代A570D、胺基酸取代D614G、胺基酸取代P681H、胺基酸取代T716I、胺基酸取代S982A及胺基酸取代D1118H。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且含有以下缺失及取代：SEQ ID NO: 1之N501Y、K417N或K417T、E484K、D80A、A701V、L18F及胺基酸242-244處之胺基酸缺失。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且含有以下取代中之一或多者：SEQ ID NO: 1之D614G、D936Y、P1263L、L5F、N439K、R21I、D839Y、L54F、A879S、L18F、F1121L、R847K、T478I、A829T、Q675H、S477N、H49Y、T29I、G769V、G1124V、V1176F、K1073N、P479S、S1252P、Y145 deletion、E583D、R214L、A1020V、Q1208H、D215G、H146Y、S98F、T95I、G1219C、A846V、I197V、R102I、V367F、T572I、A1078S、A831V、P1162L、T73I、A845S、G1219V、H245Y、L8V、Q675R、S254F、V483A、Q677H、D138H、D80Y、M1237T、D1146H、E654D、H655Y、S50L、S939F、S943P、G485R、Q613H、T76I、V341I、M153I、S221L、T859I、W258L、L242F、P681L、V289I、A520S、V1104L、V1228L、L176F、M1237I、T307I、T716I、L141、M1229I、A1087S、P26S、P330S、P384L、R765L、S940F、T323I、V826L、E1202Q、L1203F、L611F、V615I、A262S、A522V、A688V、A706V、A892S、E554D、Q836H、T1027I、T22I、A222V、A27S、A626V、C1247F、K1191N、M731I、P26L、S1147L、S1252F、S255F、V1264L、V308L、D80A、I670L、P251L、P631S、*1274Q、A344S、A771S、A879T、D1084Y、D253G、H1101Y、L1200F、Q14H、Q239K、A623V、D215Y、E1150D、G476S、K77M、M177I、P812S、S704L、T51I、T547I、T791I、V1122L、Y145H、D574Y、G142D、G181V、I834T、N370S、P812L、S12F、T791P、V90F、W152L、A292S、A570V、A647S、A845V、D1163Y、G181R、L84I、L938F、P1143L、P809S、R78M、T1160I、V1133F、V213L、V615F、A831V、D839Y、D839N、D839E、S943P、P1263L或V622F，及其組合。表 2 ： SARS-CoV2 棘蛋白突變體
SEQ ID NO: 6 - SARS-CoV2全長S蛋白- K417T、E484K及N501Y MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTG T IADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGV K GFNCYFPLQSYGFQPT Y GVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
在某些態樣中，S蛋白表現為全長蛋白且含有一或多個使呈融合前構形之S蛋白三聚體穩定之胺基酸脯胺酸取代。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且在七肽重複序列1 (HR1)與S胞外域三聚體之啟動子之中央螺旋之間的邊界處或附近含有一或多個脯胺酸取代。在一些實施例中，脯胺酸取代出現在三聚體中之啟動子之胺基酸殘基970至990 (GAISSVLNDILSRLDKVEAE) (SEQ ID NO: 7)之間。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且在SEQ ID NO: 1之胺基酸K986及V987處含有兩個脯胺酸取代，如下表3中之SEQ ID NO: 8 (其中K986P及V987P取代加粗且加底線)中或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%同源之胺基酸序列中所提供。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 9，其提供編碼衍生於原生SARS-CoV2序列之SARS-CoV2之全長S蛋白之核酸序列，其具有編碼P986及P987之核酸取代；或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%同源的核酸序列。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 10，其提供編碼經雙重脯胺酸取代及經穩定之SARS-CoV2 S蛋白之最佳化核酸序列，其中核酸已如下文所描述進行最佳化；或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%同源之核酸序列。在某些實施例中，待插入至rMVA中之核酸序列中可包括編碼標籤之額外核酸序列，使得在蛋白質之C端處表現標籤。在一些實施例中，核酸序列(GAGCCAGAGGCT) (SEQ ID NO: 4)編碼具有胺基酸序列EPEA (SEQ ID NO: 5)之高親和力C-標籤。表 3 ： 例示性經穩定之 SARS-CoV2 全長 S 蛋白
SEQ ID NO: 8 - 具有2個脯胺酸取代之經穩定之SARS-CoV2全長S蛋白 MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLD PP EAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
SEQ ID NO: 9 - 具有2個脯胺酸取代之全長S蛋白之SARS-CoV2核酸序列. ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGATGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTACCACAGAAATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAACTGAATGCAGCAATCTTTTGTTGCAATATGGCAGTTTTTGTACACAATTAAACCGTGCTTTAACTGGAATAGCTGTTGAACAAGACAAAAACACCCAAGAAGTTTTTGCACAAGTCAAACAAATTTACAAAACACCACCAATTAAAGATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCAGATCCATCAAAACCAAGCAAGAGGTCATTTATTGAAGATCTACTTTTCAACAAAGTGACACTTGCAGATGCTGGCTTCATCAAACAATATGGTGATTGCCTTGGTGATATTGCTGCTAGAGACCTCATTTGTGCACAAAAGTTTAACGGCCTTACTGTTTTGCCACCTTTGCTCACAGATGAAATGATTGCTCAATACACTTCTGCACTGTTAGCGGGTACAATCACTTCTGGTTGGACCTTTGGTGCAGGTGCTGCATTACAAATACCATTTGCTATGCAAATGGCTTATAGGTTTAATGGTATTGGAGTTACACAGAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAATTGATTGCCAACCAATTTAATAGTGCTATTGGCAAAATTCAAGACTCACTTTCTTCCACAGCAAGTGCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGGTCAACCAAAATGCACAAGCTTTAAACACGCTTGTTAAACAACTTAGCTCCAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTTTTAAATGATATCCTTTCACGTCTTGACCCACCGGAGGCTGAAGTGCAAATTGATAGGTTGATCACAGGCAGACTTCAAAGTTTGCAGACATATGTGACTCAACAATTAATTAGAGCTGCAGAAATCAGAGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCAGAGTGTGTACTTGGACAATCAAAAAGAGTTGATTTTTGTGGAAAGGGCTATCATCTTATGTCCTTCCCTCAGTCAGCACCTCATGGTGTAGTCTTCTTGCATGTGACTTATGTCCCTGCACAAGAAAAGAACTTCACAACTGCTCCTGCCATTTGTCATGATGGAAAAGCACACTTTCCTCGTGAAGGTGTCTTTGTTTCAAATGGCACACACTGGTTTGTAACACAAAGGAATTTTTATGAACCACAAATCATTACTACAGACAACACATTTGTGTCTGGTAACTGTGATGTTGTAATAGGAATTGTCAACAACACAGTTTATGATCCTTTGCAACCTGAATTAGACTCATTCAAGGAGGAGTTAGATAAATATTTTAAGAATCATACATCACCAGATGTTGATTTAGGTGACATCTCTGGCATTAATGCTTCAGTTGTAAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTTGCCAAGAATTTAAATGAATCTCTCATCGATCTCCAAGAACTTGGAAAGTATGAGCAGTATATAAAATGGCCATGGTACATTTGGCTAGGTTTTATAGCTGGCTTGATTGCCATAGTAATGGTGACAATTATGCTTTGCTGTATGACCAGTTGCTGTAGTTGTCTCAAGGGCTGTTGTTCTTGTGGATCCTGCTGCAAATTTGATGAAGACGACTCTGAGCCAGTGCTCAAAGGAGTCAAATTACATTACACA
SEQ ID NO: 10 - 經最佳化之具有2個脯胺酸取代之全長S蛋白之SARS-CoV2核酸序列. ATGTTCGTGTTCCTAGTCCTACTACCGCTAGTCTCTTCTCAGTGTGTAAACCTAACAACGAGAACACAACTACCACCGGCGTACACCAATTCTTTCACAAGAGGAGTATATTACCCGGACAAGGTGTTCAGATCCTCCGTACTACATTCTACACAGGACCTATTCCTACCGTTCTTCTCTAACGTAACATGGTTCCACGCGATCCATGTCTCTGGAACAAACGGAACGAAGAGATTCGATAACCCGGTCTTGCCGTTCAACGATGGTGTATACTTTGCGTCCACCGAGAAGTCCAACATCATCAGAGGATGGATCTTCGGAACCACCTTGGATTCTAAGACCCAGTCCTTGCTAATCGTCAACAACGCGACCAACGTCGTCATCAAAGTCTGCGAATTCCAGTTCTGTAACGACCCGTTCTTGGGAGTCTACTACCACAAGAACAACAAGTCCTGGATGGAATCCGAGTTCAGAGTCTACTCTTCCGCGAACAACTGCACCTTCGAATATGTATCTCAGCCGTTCCTAATGGACCTAGAGGGAAAGCAGGGAAACTTCAAGAACCTAAGAGAGTTCGTATTCAAGAACATCGACGGATACTTCAAGATCTACTCCAAGCACACTCCGATCAACCTAGTTAGAGATCTACCGCAAGGATTCTCTGCGCTAGAACCGTTAGTAGATTTGCCGATCGGAATCAACATCACCAGATTCCAGACACTACTAGCGCTACACAGATCTTACCTAACGCCGGGAGATTCTTCTTCTGGATGGACTGCTGGTGCTGCGGCTTATTATGTAGGATACCTACAGCCGAGAACCTTCCTATTGAAGTACAACGAAAACGGAACCATCACCGATGCCGTAGATTGTGCTCTAGATCCGCTATCCGAAACGAAGTGCACCCTAAAGTCTTTCACCGTCGAGAAGGGAATCTACCAGACCTCCAACTTTAGAGTACAGCCGACCGAATCCATCGTCAGATTTCCGAACATCACGAACCTATGTCCGTTCGGAGAAGTGTTCAACGCGACAAGATTTGCGTCTGTCTATGCGTGGAACAGAAAAAGAATCAGTAACTGCGTCGCGGACTACTCCGTCCTATACAACTCTGCCTCTTTCTCCACGTTCAAATGCTACGGTGTATCTCCGACAAAGCTAAACGATCTATGCTTCACCAACGTCTACGCGGACTCCTTCGTAATCAGAGGAGATGAAGTTAGACAGATTGCGCCGGGACAAACTGGAAAGATCGCGGATTATAACTACAAGCTACCGGACGACTTCACCGGATGTGTAATTGCGTGGAATTCGAACAACCTAGACTCCAAAGTCGGAGGAAACTACAACTACTTGTACAGACTATTCAGAAAGTCCAACCTAAAGCCGTTCGAGAGAGACATCTCCACCGAAATCTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCCCGCTACAGTCTTACGGATTTCAACCGACAAACGGTGTAGGATATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTATGTGGACCGAAAAAGTCTACCAACCTAGTCAAGAACAAATGCGTCAACTTTAACTTCAACGGACTAACCGGAACCGGTGTCCTAACCGAATCTAACAAGAAGTTTCTACCGTTCCAGCAGTTCGGAAGAGATATCGCGGATACAACAGACGCTGTCAGAGATCCGCAAACCTTGGAGATCCTAGATATCACACCGTGTTCTTTCGGTGGTGTCTCTGTAATTACTCCGGGAACGAACACCTCCAATCAAGTAGCGGTACTATACCAGGACGTGAACTGTACAGAAGTACCGGTAGCTATTCACGCGGATCAACTAACACCAACTTGGAGAGTGTACTCCACCGGATCTAACGTATTCCAAACAAGAGCGGGATGTCTAATCGGAGCGGAACACGTAAACAACTCCTACGAATGTGATATCCCGATTGGAGCGGGAATCTGTGCGTCTTACCAAACACAAACAAACTCTCCGAGAAGAGCGAGATCTGTAGCCTCTCAATCTATTATCGCCTACACCATGTCCTTGGGAGCCGAAAATTCTGTCGCGTACTCCAACAATTCTATCGCGATCCCGACAAACTTCACCATCTCTGTAACAACCGAGATCCTACCGGTGTCTATGACCAAGACATCTGTCGATTGCACCATGTACATCTGCGGAGATTCCACCGAGTGCTCCAACCTACTACTACAGTACGGATCTTTCTGTACCCAGCTAAACAGAGCGTTGACTGGAATCGCTGTAGAGCAGGATAAGAACACTCAAGAGGTATTCGCGCAAGTCAAGCAGATCTATAAGACTCCGCCGATCAAGGACTTCGGAGGTTTCAACTTCTCTCAGATCTTGCCGGATCCGTCCAAACCGTCTAAGAGATCTTTCATCGAGGACCTACTATTCAACAAAGTCACCCTAGCTGACGCGGGATTCATCAAACAATACGGAGATTGCTTGGGAGACATTGCGGCGAGAGATCTAATTTGCGCGCAGAAGTTTAACGGATTGACAGTACTACCGCCGCTACTAACCGATGAGATGATTGCGCAGTACACGTCTGCTCTATTGGCGGGAACAATTACAAGTGGATGGACATTTGGAGCCGGTGCCGCTCTACAAATTCCGTTTGCTATGCAAATGGCGTACAGATTCAACGGAATCGGAGTAACCCAGAACGTCTTGTACGAGAACCAGAAGCTAATCGCGAACCAGTTCAATTCCGCGATCGGAAAGATCCAGGACAGTCTATCTTCTACTGCTTCGGCGTTGGGAAAGCTACAGGATGTAGTAAATCAAAACGCGCAGGCGCTAAACACCTTGGTCAAGCAACTATCCTCTAACTTCGGAGCGATCTCGTCCGTCCTAAACGACATCTTATCCAGACTAGATCCACCGGAAGCGGAGGTCCAGATCGATAGACTAATCACTGGAAGATTGCAGTCCCTACAGACCTACGTAACACAGCAACTAATTAGAGCGGCGGAGATTAGAGCCTCTGCTAATCTAGCTGCGACCAAGATGTCCGAATGTGTCTTGGGACAATCCAAGAGAGTGGACTTCTGCGGAAAGGGATACCACCTAATGTCTTTCCCACAATCTGCGCCGCATGGTGTCGTATTCCTACATGTAACATATGTGCCGGCGCAAGAAAAGAACTTCACAACAGCTCCAGCGATCTGCCATGATGGAAAAGCTCATTTCCCGAGAGAGGGAGTCTTTGTCTCTAACGGAACTCATTGGTTCGTCACCCAGAGAAACTTCTACGAGCCGCAGATCATCACCACCGACAACACATTCGTCTCGGGAAACTGCGACGTGGTCATCGGAATCGTAAACAATACCGTCTACGATCCGTTGCAGCCGGAACTAGACTCCTTCAAAGAAGAGTTGGACAAGTACTTCAAGAACCACACCTCTCCGGATGTGGACTTGGGAGATATCTCTGGAATCAACGCGTCCGTCGTCAACATCCAGAAAGAAATCGATAGATTGAACGAGGTCGCGAAGAACTTGAACGAGTCCCTAATCGACCTACAAGAGCTAGGAAAATACGAGCAGTACATCAAGTGGCCGTGGTACATCTGGCTAGGATTCATTGCTGGACTAATTGCGATCGTCATGGTCACCATCATGCTATGCTGTATGACCTCCTGTTGCTCCTGTCTAAAGGGATGTTGTTCCTGCGGATCCTGTTGCAAGTTCGATGAAGATGATAGTGAACCGGTCCTAAAGGGTGTCAAGCTACACTACACA
在某些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且含有一或多個胺基酸取代。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且含有一或多個選自SEQ ID NO: 8之K417T、E484K或N501Y之取代。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且含有以下取代：SEQ ID NO: 8之K417T、E484K及N501Y。在一些實施例中，S蛋白表現為SEQ ID NO: 11或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%同源之胺基酸序列的全長蛋白。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 12，其提供編碼具有K417T、E484K及N501Y取代之經雙重脯胺酸取代及經穩定之SARS-CoV2 S蛋白之最佳化核酸序列，其中核酸已如下文所描述進行最佳化；或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%同源之核酸序列。在一些實施例中，突變為K417N。
在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且缺失SEQ ID NO: 8之一或多個棘蛋白胺基酸H69、V70或Y144或其組合。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且含有一或多個選自以下之取代：SEQ ID NO: 8之D614G、A570D、P681H、T716I、S982A、D1118H、K417N、K417T、D215G、A701V、L18F、R246I、Y453F、I692V、M1229I、N439K、A222V、S477N或A376T，或其組合。在一些實施例中，棘蛋白包括SEQ ID NO: 8之胺基酸242-244處之缺失。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且含有以下缺失及取代：SEQ ID NO: 8之缺失胺基酸69-70、缺失胺基酸Y144、胺基酸取代N501Y、胺基酸取代A570D、胺基酸取代D614G、胺基酸取代P681H、胺基酸取代T716I、胺基酸取代S982A及胺基酸取代D1118H。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且含有以下缺失及取代：SEQ ID NO: 8之N501Y、K417N或K417T、E484K、D80A、A701V、L18F及胺基酸242-244處之胺基酸缺失。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且含有以下取代中之一或多者：SEQ ID NO: 8之D614G、D936Y、P1263L、L5F、N439K、R21I、D839Y、L54F、A879S、L18F、F1121L、R847K、T478I、A829T、Q675H、S477N、H49Y、T29I、G769V、G1124V、V1176F、K1073N、P479S、S1252P、Y145 deletion、E583D、R214L、A1020V、Q1208H、D215G、H146Y、S98F、T95I、G1219C、A846V、I197V、R102I、V367F、T572I、A1078S、A831V、P1162L、T73I、A845S、G1219V、H245Y、L8V、Q675R、S254F、V483A、Q677H、D138H、D80Y、M1237T、D1146H、E654D、H655Y、S50L、S939F、S943P、G485R、Q613H、T76I、V341I、M153I、S221L、T859I、W258L、L242F、P681L、V289I、A520S、V1104L、V1228L、L176F、M1237I、T307I、T716I、L141、M1229I、A1087S、P26S、P330S、P384L、R765L、S940F、T323I、V826L、E1202Q、L1203F、L611F、V615I、A262S、A522V、A688V、A706V、A892S、E554D、Q836H、T1027I、T22I、A222V、A27S、A626V、C1247F、K1191N、M731I、P26L、S1147L、S1252F、S255F、V1264L、V308L、D80A、I670L、P251L、P631S、*1274Q、A344S、A771S、A879T、D1084Y、D253G、H1101Y、L1200F、Q14H、Q239K、A623V、D215Y、E1150D、G476S、K77M、M177I、P812S、S704L、T51I、T547I、T791I、V1122L、Y145H、D574Y、G142D、G181V、I834T、N370S、P812L、S12F、T791P、V90F、W152L、A292S、A570V、A647S、A845V、D1163Y、G181R、L84I、L938F、P1143L、P809S、R78M、T1160I、V1133F、V213L、V615F、A831V、D839Y、D839N、D839E、S943P、P1263L或V622F，及其組合。
在一些實施例中，編碼經穩定之S蛋白之核酸序列為SEQ ID NO: 12或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%同源之核酸序列。SEQ ID NO: 12提供編碼進一步包含K417T、E484K及N501T胺基酸取代之經雙重脯胺酸取代及經穩定之SARS-CoV2 S蛋白之最佳化核酸序列，其中核酸已如下文所描述進行最佳化。在某些實施例中，待插入至rMVA中之核酸序列中可包括編碼標籤之額外核酸序列，使得在蛋白質之C端處表現標籤。在一些實施例中，核酸序列(GAGCCAGAGGCT) (SEQ ID NO: 4)編碼具有胺基酸序列EPEA (SEQ ID NO: 5)之高親和力C-標籤。表 4 ： 例示性經穩定之 SARS-CoV2 全長 S 蛋白突變體
SEQ ID NO: 11 - 經穩定之SARS-CoV2全長S蛋白- K417T、E484K及N501Y MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTG T IADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGV K GFNCYFPLQSYGFQPT Y GVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLD PP EAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
SEQ ID NO: 12 - 經最佳化之具有2個脯胺酸取代、及K417T、E484K以及N501T胺基酸取代之全長S蛋白之SARS-CoV2核酸序列 ATGTTCGTGTTCCTAGTCCTACTACCGCTAGTCTCTTCTCAGTGTGTAAACCTAACAACGAGAACACAACTACCACCGGCGTACACCAATTCTTTCACAAGAGGAGTATATTACCCGGACAAGGTGTTCAGATCCTCCGTACTACATTCTACACAGGACCTATTCCTACCGTTCTTCTCTAACGTAACATGGTTCCACGCGATCCATGTCTCTGGAACAAACGGAACGAAGAGATTCGATAACCCGGTCTTGCCGTTCAACGATGGTGTATACTTTGCGTCCACCGAGAAGTCCAACATCATCAGAGGATGGATCTTCGGAACCACCTTGGATTCTAAGACCCAGTCCTTGCTAATCGTCAACAACGCGACCAACGTCGTCATCAAAGTCTGCGAATTCCAGTTCTGTAACGACCCGTTCTTGGGAGTCTACTACCACAAGAACAACAAGTCCTGGATGGAATCCGAGTTCAGAGTCTACTCTTCCGCGAACAACTGCACCTTCGAATATGTATCTCAGCCGTTCCTAATGGACCTAGAGGGAAAGCAGGGAAACTTCAAGAACCTAAGAGAGTTCGTATTCAAGAACATCGACGGATACTTCAAGATCTACTCCAAGCACACTCCGATCAACCTAGTTAGAGATCTACCGCAAGGATTCTCTGCGCTAGAACCGTTAGTAGATTTGCCGATCGGAATCAACATCACCAGATTCCAGACACTACTAGCGCTACACAGATCTTACCTAACGCCGGGAGATTCTTCTTCTGGATGGACTGCTGGTGCTGCGGCTTATTATGTAGGATACCTACAGCCGAGAACCTTCCTATTGAAGTACAACGAAAACGGAACCATCACCGATGCCGTAGATTGTGCTCTAGATCCGCTATCCGAAACGAAGTGCACCCTAAAGTCTTTCACCGTCGAGAAGGGAATCTACCAGACCTCCAACTTTAGAGTACAGCCGACCGAATCCATCGTCAGATTTCCGAACATCACGAACCTATGTCCGTTCGGAGAAGTGTTCAACGCGACAAGATTTGCGTCTGTCTATGCGTGGAACAGAAAAAGAATCAGTAACTGCGTCGCGGACTACTCCGTCCTATACAACTCTGCCTCTTTCTCCACGTTCAAATGCTACGGTGTATCTCCGACAAAGCTAAACGATCTATGCTTCACCAACGTCTACGCGGACTCCTTCGTAATCAGAGGAGATGAAGTTAGACAGATTGCGCCGGGACAAACTGGAACGATCGCGGATTATAACTACAAGCTACCGGACGACTTCACCGGATGTGTAATTGCGTGGAATTCGAACAACCTAGACTCCAAAGTCGGAGGAAACTACAACTACTTGTACAGACTATTCAGAAAGTCCAACCTAAAGCCGTTCGAGAGAGACATCTCCACCGAAATCTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCAAGGGATTCAACTGCTACTTCCCGCTACAGTCTTACGGATTTCAACCGACATACGGTGTAGGATATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTATGTGGACCGAAAAAGTCTACCAACCTAGTCAAGAACAAATGCGTCAACTTTAACTTCAACGGACTAACCGGAACCGGTGTCCTAACCGAATCTAACAAGAAGTTTCTACCGTTCCAGCAGTTCGGAAGAGATATCGCGGATACAACAGACGCTGTCAGAGATCCGCAAACCTTGGAGATCCTAGATATCACACCGTGTTCTTTCGGTGGTGTCTCTGTAATTACTCCGGGAACGAACACCTCCAATCAAGTAGCGGTACTATACCAGGACGTGAACTGTACAGAAGTACCGGTAGCTATTCACGCGGATCAACTAACACCAACTTGGAGAGTGTACTCCACCGGATCTAACGTATTCCAAACAAGAGCGGGATGTCTAATCGGAGCGGAACACGTAAACAACTCCTACGAATGTGATATCCCGATTGGAGCGGGAATCTGTGCGTCTTACCAAACACAAACAAACTCTCCGAGAAGAGCGAGATCTGTAGCCTCTCAATCTATTATCGCCTACACCATGTCCTTGGGAGCCGAAAATTCTGTCGCGTACTCCAACAATTCTATCGCGATCCCGACAAACTTCACCATCTCTGTAACAACCGAGATCCTACCGGTGTCTATGACCAAGACATCTGTCGATTGCACCATGTACATCTGCGGAGATTCCACCGAGTGCTCCAACCTACTACTACAGTACGGATCTTTCTGTACCCAGCTAAACAGAGCGTTGACTGGAATCGCTGTAGAGCAGGATAAGAACACTCAAGAGGTATTCGCGCAAGTCAAGCAGATCTATAAGACTCCGCCGATCAAGGACTTCGGAGGTTTCAACTTCTCTCAGATCTTGCCGGATCCGTCCAAACCGTCTAAGAGATCTTTCATCGAGGACCTACTATTCAACAAAGTCACCCTAGCTGACGCGGGATTCATCAAACAATACGGAGATTGCTTGGGAGACATTGCGGCGAGAGATCTAATTTGCGCGCAGAAGTTTAACGGATTGACAGTACTACCGCCGCTACTAACCGATGAGATGATTGCGCAGTACACGTCTGCTCTATTGGCGGGAACAATTACAAGTGGATGGACATTTGGAGCCGGTGCCGCTCTACAAATTCCGTTTGCTATGCAAATGGCGTACAGATTCAACGGAATCGGAGTAACCCAGAACGTCTTGTACGAGAACCAGAAGCTAATCGCGAACCAGTTCAATTCCGCGATCGGAAAGATCCAGGACAGTCTATCTTCTACTGCTTCGGCGTTGGGAAAGCTACAGGATGTAGTAAATCAAAACGCGCAGGCGCTAAACACCTTGGTCAAGCAACTATCCTCTAACTTCGGAGCGATCTCGTCCGTCCTAAACGACATCTTATCCAGACTAGATCCACCGGAAGCGGAGGTCCAGATCGATAGACTAATCACTGGAAGATTGCAGTCCCTACAGACCTACGTAACACAGCAACTAATTAGAGCGGCGGAGATTAGAGCCTCTGCTAATCTAGCTGCGACCAAGATGTCCGAATGTGTCTTGGGACAATCCAAGAGAGTGGACTTCTGCGGAAAGGGATACCACCTAATGTCTTTCCCACAATCTGCGCCGCATGGTGTCGTATTCCTACATGTAACATATGTGCCGGCGCAAGAAAAGAACTTCACAACAGCTCCAGCGATCTGCCATGATGGAAAAGCTCATTTCCCGAGAGAGGGAGTCTTTGTCTCTAACGGAACTCATTGGTTCGTCACCCAGAGAAACTTCTACGAGCCGCAGATCATCACCACCGACAACACATTCGTCTCGGGAAACTGCGACGTGGTCATCGGAATCGTAAACAATACCGTCTACGATCCGTTGCAGCCGGAACTAGACTCCTTCAAAGAAGAGTTGGACAAGTACTTCAAGAACCACACCTCTCCGGATGTGGACTTGGGAGATATCTCTGGAATCAACGCGTCCGTCGTCAACATCCAGAAAGAAATCGATAGATTGAACGAGGTCGCGAAGAACTTGAACGAGTCCCTAATCGACCTACAAGAGCTAGGAAAATACGAGCAGTACATCAAGTGGCCGTGGTACATCTGGCTAGGATTCATTGCTGGACTAATTGCGATCGTCATGGTCACCATCATGCTATGCTGTATGACCTCCTGTTGCTCCTGTCTAAAGGGATGTTGTTCCTGCGGATCCTGTTGCAAGTTCGATGAAGATGATAGTGAACCGGTCCTAAAGGGTGTCAAGCTACACTACACA
在某些態樣中，由rMVA表現中之SARS-CoV2抗原為經修飾之棘(S)蛋白，其中經修飾之S蛋白包含缺少蛋白質之羧基端之S1 + S2經截短蛋白。在一些實施例中，S1 + S2經截短蛋白包含SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸1至1213 (SEQ ID NO: 13)，如表5中所提供；或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%同源之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 15，其提供編碼衍生於原生SARS-CoV2序列之S1 + S2經截短蛋白之核酸序列；或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%同源之核酸序列。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 16，其提供編碼S1 + S2經截短蛋白之最佳化核酸序列；或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%同源之核酸序列。在一些實施例中，S1 + S2經截短蛋白包含SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸1至1213及胺基酸986與987處之兩個脯胺酸取代(SEQ ID NO: 14)，如表5中所提供；或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%同源之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 17，其提供編碼S1 + S2經截短蛋白+K986P及V987P之最佳化核酸序列；或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%同源之核酸序列。在某些實施例中，待插入至rMVA中之核酸序列中可包括編碼標籤之額外核酸序列，使得在蛋白質之C端處表現標籤。在一些實施例中，核酸序列(GAGCCAGAGGCT) (SEQ ID NO: 4)編碼具有胺基酸序列EPEA (SEQ ID NO: 5)之高親和力C-標籤。表 5 ： 經截短 S1 + S2 SARS-CoV2 蛋白
 SEQ ID NO: 13 - SARS-CoV2經截短S1 + S2蛋白(胺基酸1-1213). MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWP
SEQ ID NO: 14 - SARS-CoV2經截短S1 + S2蛋白+ K986P及V987P (胺基酸1-1213). MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLD PP EAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWP
SEQ ID NO: 15 - 經截短S1 + S2蛋白(胺基酸1-1213)之SARS-CoV2核酸序列. ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTCAGTGTGTTAATCTTACAACCAGAACTCAATTACCCCCTGCATACACTAATTCTTTCACACGTGGTGTTTATTACCCTGACAAAGTTTTCAGATCCTCAGTTTTACATTCAACTCAGGACTTGTTCTTACCTTTCTTTTCCAATGTTACTTGGTTCCATGCTATACATGTCTCTGGGACCAATGGTACTAAGAGGTTTGATAACCCTGTCCTACCATTTAATGATGGTGTTTATTTTGCTTCCACTGAGAAGTCTAACATAATAAGAGGCTGGATTTTTGGTACTACTTTAGATTCGAAGACCCAGTCCCTACTTATTGTTAATAACGCTACTAATGTTGTTATTAAAGTCTGTGAATTTCAATTTTGTAATGATCCATTTTTGGGTGTTTATTACCACAAAAACAACAAAAGTTGGATGGAAAGTGAGTTCAGAGTTTATTCTAGTGCGAATAATTGCACTTTTGAATATGTCTCTCAGCCTTTTCTTATGGACCTTGAAGGAAAACAGGGTAATTTCAAAAATCTTAGGGAATTTGTGTTTAAGAATATTGATGGTTATTTTAAAATATATTCTAAGCACACGCCTATTAATTTAGTGCGTGATCTCCCTCAGGGTTTTTCGGCTTTAGAACCATTGGTAGATTTGCCAATAGGTATTAACATCACTAGGTTTCAAACTTTACTTGCTTTACATAGAAGTTATTTGACTCCTGGTGATTCTTCTTCAGGTTGGACAGCTGGTGCTGCAGCTTATTATGTGGGTTATCTTCAACCTAGGACTTTTCTATTAAAATATAATGAAAATGGAACCATTACAGATGCTGTAGACTGTGCACTTGACCCTCTCTCAGAAACAAAGTGTACGTTGAAATCCTTCACTGTAGAAAAAGGAATCTATCAAACTTCTAACTTTAGAGTCCAACCAACAGAATCTATTGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTTCAACTTCAATGGTTTAACAGGCACAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACAAAAAGTTTCTGCCTTTCCAACAATTTGGCAGAGACATTGCTGACACTACTGATGCTGTCCGTGATCCACAGACACTTGAGATTCTTGACATTACACCATGTTCTTTTGGTGGTGTCAGTGTTATAACACCAGGAACAAATACTTCTAACCAGGTTGCTGTTCTTTATCAGGATGTTAACTGCACAGAAGTCCCTGTTGCTATTCATGCAGATCAACTTACTCCTACTTGGCGTGTTTATTCTACAGGTTCTAATGTTTTTCAAACACGTGCAGGCTGTTTAATAGGGGCTGAACATGTCAACAACTCATATGAGTGTGACATACCCATTGGTGCAGGTATATGCGCTAGTTATCAGACTCAGACTAATTCTCCTCGGCGGGCACGTAGTGTAGCTAGTCAATCCATCATTGCCTACACTATGTCACTTGGTGCAGAAAATTCAGTTGCTTACTCTAATAACTCTATTGCCATACCCACAAATTTTACTATTAGTGTTACCACAGAAATTCTACCAGTGTCTATGACCAAGACATCAGTAGATTGTACAATGTACATTTGTGGTGATTCAACTGAATGCAGCAATCTTTTGTTGCAATATGGCAGTTTTTGTACACAATTAAACCGTGCTTTAACTGGAATAGCTGTTGAACAAGACAAAAACACCCAAGAAGTTTTTGCACAAGTCAAACAAATTTACAAAACACCACCAATTAAAGATTTTGGTGGTTTTAATTTTTCACAAATATTACCAGATCCATCAAAACCAAGCAAGAGGTCATTTATTGAAGATCTACTTTTCAACAAAGTGACACTTGCAGATGCTGGCTTCATCAAACAATATGGTGATTGCCTTGGTGATATTGCTGCTAGAGACCTCATTTGTGCACAAAAGTTTAACGGCCTTACTGTTTTGCCACCTTTGCTCACAGATGAAATGATTGCTCAATACACTTCTGCACTGTTAGCGGGTACAATCACTTCTGGTTGGACCTTTGGTGCAGGTGCTGCATTACAAATACCATTTGCTATGCAAATGGCTTATAGGTTTAATGGTATTGGAGTTACACAGAATGTTCTCTATGAGAACCAAAAATTGATTGCCAACCAATTTAATAGTGCTATTGGCAAAATTCAAGACTCACTTTCTTCCACAGCAAGTGCACTTGGAAAACTTCAAGATGTGGTCAACCAAAATGCACAAGCTTTAAACACGCTTGTTAAACAACTTAGCTCCAATTTTGGTGCAATTTCAAGTGTTTTAAATGATATCCTTTCACGTCTTGACAAAGTTGAGGCTGAAGTGCAAATTGATAGGTTGATCACAGGCAGACTTCAAAGTTTGCAGACATATGTGACTCAACAATTAATTAGAGCTGCAGAAATCAGAGCTTCTGCTAATCTTGCTGCTACTAAAATGTCAGAGTGTGTACTTGGACAATCAAAAAGAGTTGATTTTTGTGGAAAGGGCTATCATCTTATGTCCTTCCCTCAGTCAGCACCTCATGGTGTAGTCTTCTTGCATGTGACTTATGTCCCTGCACAAGAAAAGAACTTCACAACTGCTCCTGCCATTTGTCATGATGGAAAAGCACACTTTCCTCGTGAAGGTGTCTTTGTTTCAAATGGCACACACTGGTTTGTAACACAAAGGAATTTTTATGAACCACAAATCATTACTACAGACAACACATTTGTGTCTGGTAACTGTGATGTTGTAATAGGAATTGTCAACAACACAGTTTATGATCCTTTGCAACCTGAATTAGACTCATTCAAGGAGGAGTTAGATAAATATTTTAAGAATCATACATCACCAGATGTTGATTTAGGTGACATCTCTGGCATTAATGCTTCAGTTGTAAACATTCAAAAAGAAATTGACCGCCTCAATGAGGTTGCCAAGAATTTAAATGAATCTCTCATCGATCTCCAAGAACTTGGAAAGTATGAGCAGTATATAAAATGGCCA
SEQ ID NO: 16 - 經截短S1 + S2蛋白(胺基酸1-1213)之SARS-CoV2核酸序列. ATGTTCGTGTTCCTAGTCCTACTACCGCTAGTCTCTTCTCAGTGTGTAAACCTAACAACGAGAACACAACTACCACCGGCGTACACCAATTCTTTCACAAGAGGAGTATATTACCCGGACAAGGTGTTCAGATCCTCCGTACTACATTCTACACAGGACCTATTCCTACCGTTCTTCTCTAACGTAACATGGTTCCACGCGATCCATGTCTCTGGAACAAACGGAACGAAGAGATTCGATAACCCGGTCTTGCCGTTCAACGATGGTGTATACTTTGCGTCCACCGAGAAGTCCAACATCATCAGAGGATGGATCTTCGGAACCACCTTGGATTCTAAGACCCAGTCCTTGCTAATCGTCAACAACGCGACCAACGTCGTCATCAAAGTCTGCGAATTCCAGTTCTGTAACGACCCGTTCTTGGGAGTCTACTACCACAAGAACAACAAGTCCTGGATGGAATCCGAGTTCAGAGTCTACTCTTCCGCGAACAACTGCACCTTCGAATATGTATCTCAGCCGTTCCTAATGGACCTAGAGGGAAAGCAGGGAAACTTCAAGAACCTAAGAGAGTTCGTATTCAAGAACATCGACGGATACTTCAAGATCTACTCCAAGCACACTCCGATCAACCTAGTTAGAGATCTACCGCAAGGATTCTCTGCGCTAGAACCGTTAGTAGATTTGCCGATCGGAATCAACATCACCAGATTCCAGACACTACTAGCGCTACACAGATCTTACCTAACGCCGGGAGATTCTTCTTCTGGATGGACTGCTGGTGCTGCGGCTTATTATGTAGGATACCTACAGCCGAGAACCTTCCTATTGAAGTACAACGAAAACGGAACCATCACCGATGCCGTAGATTGTGCTCTAGATCCGCTATCCGAAACGAAGTGCACCCTAAAGTCTTTCACCGTCGAGAAGGGAATCTACCAGACCTCCAACTTTAGAGTACAGCCGACCGAATCCATCGTCAGATTTCCGAACATCACGAACCTATGTCCGTTCGGAGAAGTGTTCAACGCGACAAGATTTGCGTCTGTCTATGCGTGGAACAGAAAAAGAATCAGTAACTGCGTCGCGGACTACTCCGTCCTATACAACTCTGCCTCTTTCTCCACGTTCAAATGCTACGGTGTATCTCCGACAAAGCTAAACGATCTATGCTTCACCAACGTCTACGCGGACTCCTTCGTAATCAGAGGAGATGAAGTTAGACAGATTGCGCCGGGACAAACTGGAAAGATCGCGGATTATAACTACAAGCTACCGGACGACTTCACCGGATGTGTAATTGCGTGGAATTCGAACAACCTAGACTCCAAAGTCGGAGGAAACTACAACTACTTGTACAGACTATTCAGAAAGTCCAACCTAAAGCCGTTCGAGAGAGACATCTCCACCGAAATCTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCCCGCTACAGTCTTACGGATTTCAACCGACAAACGGTGTAGGATATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTATGTGGACCGAAAAAGTCTACCAACCTAGTCAAGAACAAATGCGTCAACTTTAACTTCAACGGACTAACCGGAACCGGTGTCCTAACCGAATCTAACAAGAAGTTTCTACCGTTCCAGCAGTTCGGAAGAGATATCGCGGATACAACAGACGCTGTCAGAGATCCGCAAACCTTGGAGATCCTAGATATCACACCGTGTTCTTTCGGTGGTGTCTCTGTAATTACTCCGGGAACGAACACCTCCAATCAAGTAGCGGTACTATACCAGGACGTGAACTGTACAGAAGTACCGGTAGCTATTCACGCGGATCAACTAACACCAACTTGGAGAGTGTACTCCACCGGATCTAACGTATTCCAAACAAGAGCGGGATGTCTAATCGGAGCGGAACACGTAAACAACTCCTACGAATGTGATATCCCGATTGGAGCGGGAATCTGTGCGTCTTACCAAACACAAACAAACTCTCCGAGAAGAGCGAGATCTGTAGCCTCTCAATCTATTATCGCCTACACCATGTCCTTGGGAGCCGAAAATTCTGTCGCGTACTCCAACAATTCTATCGCGATCCCGACAAACTTCACCATCTCTGTAACAACCGAGATCCTACCGGTGTCTATGACCAAGACATCTGTCGATTGCACCATGTACATCTGCGGAGATTCCACCGAGTGCTCCAACCTACTACTACAGTACGGATCTTTCTGTACCCAGCTAAACAGAGCGTTGACTGGAATCGCTGTAGAGCAGGATAAGAACACTCAAGAGGTATTCGCGCAAGTCAAGCAGATCTATAAGACTCCGCCGATCAAGGACTTCGGAGGTTTCAACTTCTCTCAGATCTTGCCGGATCCGTCCAAACCGTCTAAGAGATCTTTCATCGAGGACCTACTATTCAACAAAGTCACCCTAGCTGACGCGGGATTCATCAAACAATACGGAGATTGCTTGGGAGACATTGCGGCGAGAGATCTAATTTGCGCGCAGAAGTTTAACGGATTGACAGTACTACCGCCGCTACTAACCGATGAGATGATTGCGCAGTACACGTCTGCTCTATTGGCGGGAACAATTACAAGTGGATGGACATTTGGAGCCGGTGCCGCTCTACAAATTCCGTTTGCTATGCAAATGGCGTACAGATTCAACGGAATCGGAGTAACCCAGAACGTCTTGTACGAGAACCAGAAGCTAATCGCGAACCAGTTCAATTCCGCGATCGGAAAGATCCAGGACAGTCTATCTTCTACTGCTTCGGCGTTGGGAAAGCTACAGGATGTAGTAAATCAAAACGCGCAGGCGCTAAACACCTTGGTCAAGCAACTATCCTCTAACTTCGGAGCGATCTCGTCCGTCCTAAACGACATCTTATCCAGACTAGATAAGGTCGAAGCGGAGGTCCAGATCGATAGACTAATCACTGGAAGATTGCAGTCCCTACAGACCTACGTAACACAGCAACTAATTAGAGCGGCGGAGATTAGAGCCTCTGCTAATCTAGCTGCGACCAAGATGTCCGAATGTGTCTTGGGACAATCCAAGAGAGTGGACTTCTGCGGAAAGGGATACCACCTAATGTCTTTCCCACAATCTGCGCCGCATGGTGTCGTATTCCTACATGTAACATATGTGCCGGCGCAAGAAAAGAACTTCACAACAGCTCCAGCGATCTGCCATGATGGAAAAGCTCATTTCCCGAGAGAGGGAGTCTTTGTCTCTAACGGAACTCATTGGTTCGTCACCCAGAGAAACTTCTACGAGCCGCAGATCATCACCACCGACAACACATTCGTCTCGGGAAACTGCGACGTGGTCATCGGAATCGTAAACAATACCGTCTACGATCCGTTGCAGCCGGAACTAGACTCCTTCAAAGAAGAGTTGGACAAGTACTTCAAGAACCACACCTCTCCGGATGTGGACTTGGGAGATATCTCTGGAATCAACGCGTCCGTCGTCAACATCCAGAAAGAAATCGATAGATTGAACGAGGTCGCGAAGAACTTGAACGAGTCCCTAATCGACCTACAAGAGCTAGGAAAATACGAGCAGTACATCAAGTGGCCG
SEQ ID NO: 17 - 經最佳化之經截短S1 + S2蛋白(胺基酸1-1213) + K986P及V987P之SARS-CoV2核酸序列. ATGTTCGTGTTCCTAGTCCTACTACCGCTAGTCTCTTCTCAGTGTGTAAACCTAACAACGAGAACACAACTACCACCGGCGTACACCAATTCTTTCACAAGAGGAGTATATTACCCGGACAAGGTGTTCAGATCCTCCGTACTACATTCTACACAGGACCTATTCCTACCGTTCTTCTCTAACGTAACATGGTTCCACGCGATCCATGTCTCTGGAACAAACGGAACGAAGAGATTCGATAACCCGGTCTTGCCGTTCAACGATGGTGTATACTTTGCGTCCACCGAGAAGTCCAACATCATCAGAGGATGGATCTTCGGAACCACCTTGGATTCTAAGACCCAGTCCTTGCTAATCGTCAACAACGCGACCAACGTCGTCATCAAAGTCTGCGAATTCCAGTTCTGTAACGACCCGTTCTTGGGAGTCTACTACCACAAGAACAACAAGTCCTGGATGGAATCCGAGTTCAGAGTCTACTCTTCCGCGAACAACTGCACCTTCGAATATGTATCTCAGCCGTTCCTAATGGACCTAGAGGGAAAGCAGGGAAACTTCAAGAACCTAAGAGAGTTCGTATTCAAGAACATCGACGGATACTTCAAGATCTACTCCAAGCACACTCCGATCAACCTAGTTAGAGATCTACCGCAAGGATTCTCTGCGCTAGAACCGTTAGTAGATTTGCCGATCGGAATCAACATCACCAGATTCCAGACACTACTAGCGCTACACAGATCTTACCTAACGCCGGGAGATTCTTCTTCTGGATGGACTGCTGGTGCTGCGGCTTATTATGTAGGATACCTACAGCCGAGAACCTTCCTATTGAAGTACAACGAAAACGGAACCATCACCGATGCCGTAGATTGTGCTCTAGATCCGCTATCCGAAACGAAGTGCACCCTAAAGTCTTTCACCGTCGAGAAGGGAATCTACCAGACCTCCAACTTTAGAGTACAGCCGACCGAATCCATCGTCAGATTTCCGAACATCACGAACCTATGTCCGTTCGGAGAAGTGTTCAACGCGACAAGATTTGCGTCTGTCTATGCGTGGAACAGAAAAAGAATCAGTAACTGCGTCGCGGACTACTCCGTCCTATACAACTCTGCCTCTTTCTCCACGTTCAAATGCTACGGTGTATCTCCGACAAAGCTAAACGATCTATGCTTCACCAACGTCTACGCGGACTCCTTCGTAATCAGAGGAGATGAAGTTAGACAGATTGCGCCGGGACAAACTGGAAAGATCGCGGATTATAACTACAAGCTACCGGACGACTTCACCGGATGTGTAATTGCGTGGAATTCGAACAACCTAGACTCCAAAGTCGGAGGAAACTACAACTACTTGTACAGACTATTCAGAAAGTCCAACCTAAAGCCGTTCGAGAGAGACATCTCCACCGAAATCTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCCCGCTACAGTCTTACGGATTTCAACCGACAAACGGTGTAGGATATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTATGTGGACCGAAAAAGTCTACCAACCTAGTCAAGAACAAATGCGTCAACTTTAACTTCAACGGACTAACCGGAACCGGTGTCCTAACCGAATCTAACAAGAAGTTTCTACCGTTCCAGCAGTTCGGAAGAGATATCGCGGATACAACAGACGCTGTCAGAGATCCGCAAACCTTGGAGATCCTAGATATCACACCGTGTTCTTTCGGTGGTGTCTCTGTAATTACTCCGGGAACGAACACCTCCAATCAAGTAGCGGTACTATACCAGGACGTGAACTGTACAGAAGTACCGGTAGCTATTCACGCGGATCAACTAACACCAACTTGGAGAGTGTACTCCACCGGATCTAACGTATTCCAAACAAGAGCGGGATGTCTAATCGGAGCGGAACACGTAAACAACTCCTACGAATGTGATATCCCGATTGGAGCGGGAATCTGTGCGTCTTACCAAACACAAACAAACTCTCCGAGAAGAGCGAGATCTGTAGCCTCTCAATCTATTATCGCCTACACCATGTCCTTGGGAGCCGAAAATTCTGTCGCGTACTCCAACAATTCTATCGCGATCCCGACAAACTTCACCATCTCTGTAACAACCGAGATCCTACCGGTGTCTATGACCAAGACATCTGTCGATTGCACCATGTACATCTGCGGAGATTCCACCGAGTGCTCCAACCTACTACTACAGTACGGATCTTTCTGTACCCAGCTAAACAGAGCGTTGACTGGAATCGCTGTAGAGCAGGATAAGAACACTCAAGAGGTATTCGCGCAAGTCAAGCAGATCTATAAGACTCCGCCGATCAAGGACTTCGGAGGTTTCAACTTCTCTCAGATCTTGCCGGATCCGTCCAAACCGTCTAAGAGATCTTTCATCGAGGACCTACTATTCAACAAAGTCACCCTAGCTGACGCGGGATTCATCAAACAATACGGAGATTGCTTGGGAGACATTGCGGCGAGAGATCTAATTTGCGCGCAGAAGTTTAACGGATTGACAGTACTACCGCCGCTACTAACCGATGAGATGATTGCGCAGTACACGTCTGCTCTATTGGCGGGAACAATTACAAGTGGATGGACATTTGGAGCCGGTGCCGCTCTACAAATTCCGTTTGCTATGCAAATGGCGTACAGATTCAACGGAATCGGAGTAACCCAGAACGTCTTGTACGAGAACCAGAAGCTAATCGCGAACCAGTTCAATTCCGCGATCGGAAAGATCCAGGACAGTCTATCTTCTACTGCTTCGGCGTTGGGAAAGCTACAGGATGTAGTAAATCAAAACGCGCAGGCGCTAAACACCTTGGTCAAGCAACTATCCTCTAACTTCGGAGCGATCTCGTCCGTCCTAAACGACATCTTATCCAGACTAGAT CCACCG GAAGCGGAGGTCCAGATCGATAGACTAATCACTGGAAGATTGCAGTCCCTACAGACCTACGTAACACAGCAACTAATTAGAGCGGCGGAGATTAGAGCCTCTGCTAATCTAGCTGCGACCAAGATGTCCGAATGTGTCTTGGGACAATCCAAGAGAGTGGACTTCTGCGGAAAGGGATACCACCTAATGTCTTTCCCACAATCTGCGCCGCATGGTGTCGTATTCCTACATGTAACATATGTGCCGGCGCAAGAAAAGAACTTCACAACAGCTCCAGCGATCTGCCATGATGGAAAAGCTCATTTCCCGAGAGAGGGAGTCTTTGTCTCTAACGGAACTCATTGGTTCGTCACCCAGAGAAACTTCTACGAGCCGCAGATCATCACCACCGACAACACATTCGTCTCGGGAAACTGCGACGTGGTCATCGGAATCGTAAACAATACCGTCTACGATCCGTTGCAGCCGGAACTAGACTCCTTCAAAGAAGAGTTGGACAAGTACTTCAAGAACCACACCTCTCCGGATGTGGACTTGGGAGATATCTCTGGAATCAACGCGTCCGTCGTCAACATCCAGAAAGAAATCGATAGATTGAACGAGGTCGCGAAGAACTTGAACGAGTCCCTAATCGACCTACAAGAGCTAGGAAAATACGAGCAGTACATCAAGTGGCCG
在某些態樣中，由rMVA表現之SARS-CoV2抗原為經修飾之棘(S)蛋白，其中經修飾之S蛋白包含缺少蛋白質之羧基端之S1 + S2經截短蛋白，且進一步包含一或多個胺基酸取代或缺失。在一些實施例中，S1 + S2經截短蛋白包含具有K417T、E484K及N501Y取代之SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸1至1213 (SEQ ID NO: 18)，如表6中所提供；或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%同源之胺基酸序列。在一些實施例中，S1 + S2經截短蛋白包含SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸1至1213及胺基酸986與987處之兩個脯胺酸取代以及胺基酸取代K417T、E484K及N501Y (SEQ ID NO: 19)，如表6中所提供；或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%同源之胺基酸序列。
在一些實施例中，由rMVA表現之S蛋白為經修飾之棘(S)蛋白，其中經修飾之S蛋白包含缺少蛋白質之羧基端之S1 + S2經截短蛋白，且進一步包含一或多個選自以下之取代：SEQ ID NO: 13或14或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%同源之胺基酸序列的K417T、E484K或N501Y。在一些實施例中，突變為K417N。
在一些實施例中，由rMVA表現之S蛋白為經修飾之棘(S)蛋白，其中經修飾之S蛋白包含缺少蛋白質之羧基端之S1 + S2經截短蛋白，且進一步包含缺失SEQ ID NO: 13或14或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%同源的胺基酸序列之一或多個棘蛋白胺基酸H69、V70或Y144或其組合。在一些實施例中，由rMVA表現之S蛋白為經修飾之棘(S)蛋白，其中經修飾之S蛋白包含缺少蛋白質之羧基端之S1 + S2經截短蛋白，且進一步包含一或多個選自以下之取代：SEQ ID NO: 13或14的D614G、A570D、P681H、T716I、S982A、D1118H、K417N、K417T、D215G、A701V、L18F、R246I、Y453F、I692V、M1229I、N439K、A222V、S477N或A376T，或其組合。在一些實施例中，由rMVA表現之S蛋白為經修飾之棘(S)蛋白，其中經修飾之S蛋白包含缺少蛋白質之羧基端之S1 + S2經截短蛋白，且進一步包含SEQ ID NO: 13或14之胺基酸242-244處的缺失。在一些實施例中，由rMVA表現之S蛋白為經修飾之棘(S)蛋白，其中經修飾之S蛋白包含缺少蛋白質之羧基端之S1 + S2經截短蛋白，且進一步包含以下缺失及取代：SEQ ID NO: 13或14的缺失胺基酸69-70、缺失胺基酸Y144、胺基酸取代N501Y、胺基酸取代A570D、胺基酸取代D614G、胺基酸取代P681H、胺基酸取代T716I、胺基酸取代S982A及胺基酸取代D1118H。在一些實施例中，由rMVA表現之S蛋白為經修飾之棘(S)蛋白，其中經修飾之S蛋白包含缺少蛋白質之羧基端之S1 + S2經截短蛋白，且進一步包含以下缺失及取代：SEQ ID NO: 13或14的N501Y、K417N或K417T、E484K、D80A、A701V、L18F及胺基酸242-244處的胺基酸缺失。在一些實施例中，由rMVA表現之S蛋白表現為經修飾之棘(S)蛋白，其中經修飾之S蛋白包含缺少蛋白質之羧基端之S1 + S2經截短蛋白，且進一步包含以下取代中之一或多者：SEQ ID NO: 13或14的D614G、D936Y、P1263L、L5F、N439K、R21I、D839Y、L54F、A879S、L18F、F1121L、R847K、T478I、A829T、Q675H、S477N、H49Y、T29I、G769V、G1124V、V1176F、K1073N、P479S、Y145 deletion、E583D、R214L、A1020V、Q1208H、D215G、H146Y、S98F、T95I、G1219C、A846V、I197V、R102I、V367F、T572I、A1078S、A831V、P1162L、T73I、A845S、H245Y、L8V、Q675R、S254F、V483A、Q677H、D138H、D80Y、D1146H、E654D、H655Y、S50L、S939F、S943P、G485R、Q613H、T76I、V341I、M153I、S221L、T859I、W258L、L242F、P681L、V289I、A520S、V1104L、L176F、T307I、T716I、L141、A1087S、P26S、P330S、P384L、R765L、S940F、T323I、V826L、E1202Q、L1203F、L611F、V615I、A262S、A522V、A688V、A706V、A892S、E554D、Q836H、T1027I、T22I、A222V、A27S、A626V、K1191N、M731I、P26L、S1147L、S255F、V308L、D80A、I670L、P251L、P631S、A344S、A771S、A879T、D1084Y、D253G、H1101Y、L1200F、Q14H、Q239K、A623V、D215Y、E1150D、G476S、K77M、M177I、P812S、S704L、T51I、T547I、T791I、V1122L、Y145H、D574Y、G142D、G181V、I834T、N370S、P812L、S12F、T791P、V90F、W152L、A292S、A570V、A647S、A845V、D1163Y、G181R、L84I、L938F、P1143L、P809S、R78M、T1160I、V1133F、V213L、V615F、A831V、D839Y、D839N、D839E、S943P或V622F，及其組合。
在某些實施例中，待插入至rMVA中之核酸序列中可包括編碼標籤之額外核酸序列，使得在蛋白質之C端處表現標籤。在一些實施例中，核酸序列(GAGCCAGAGGCT) (SEQ ID NO: 4)編碼具有胺基酸序列EPEA (SEQ ID NO: 5)之高親和力C-標籤。表 6 ： 具有取代之經截短 S1 + S2 SARS-CoV2 蛋白
SEQ ID NO: 18 - SARS-CoV2經截短S1 + S2蛋白(胺基酸1-1213) + K417T、E484K及N501Y MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTG T IADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGV K GFNCYFPLQSYGFQPT Y GVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKV EAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWP
SEQ ID NO: 19 - SARS-CoV2經截短S1 + S2蛋白+ K986P及V987P (胺基酸1-1213) + K417T、E484K及N501Y. MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTG T IADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGV K GFNCYFPLQSYGFQPT Y GVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLD PP EAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWP
在某些態樣中，SARS-CoV2抗原為S蛋白之線性抗原決定基。在一特定實施例中，S蛋白之線性抗原決定基為SARS-CoV2 S蛋白之受體結合域(RBD)。在一些實施例中，線性S抗原決定基包含下表7中提供之S蛋白之胺基酸327至524 (SEQ ID NO: 20)；或與其80%、85%、90%、95%、95%或99%同源之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 22，其提供編碼衍生於SARS-CoV2之原生序列之S蛋白之胺基酸327至524之線性S抗原決定基的核酸序列；或與其80%、85%、90%、95%、95%或99%同源的核酸序列。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 24，其提供編碼S蛋白之胺基酸327至524之線性S抗原決定基之最佳化核酸序列；一與其80%、85%、90%、95%、95%或99%同源之核酸序列。在一些實施例中，線性S抗原決定基包含下表7中提供之S蛋白之胺基酸331至524 (SEQ ID NO: 21)；或與其80%、85%、90%、95%、95%或99%同源之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 23，其提供編碼衍生於SARS-CoV2之原生序列之S蛋白之胺基酸331至524之線性S抗原決定基的核酸序列；或與其80%、85%、90%、95%、95%或99%同源的核酸序列。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 24，其提供編碼S蛋白之胺基酸331至524之線性S抗原決定基之最佳化核酸序列；一與其80%、85%、90%、95%、95%或99%同源之核酸序列。在一些實施例中，線性S抗原決定基包含SARS-CoV2 S蛋白之RBD區之胺基酸504至524 (SEQ ID NO: 26)；或與其80%、85%、90%、95%、95%或99%同源之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 27，其提供編碼衍生於SARS-CoV2之原生序列之S蛋白之胺基酸504至524之線性S抗原決定基的核酸序列；或與其80%、85%、90%、95%、95%或99%同源的核酸序列。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 28，其提供編碼SARS-CoV2 S蛋白之RBD區之胺基酸504至524之線性S抗原決定基的最佳化核酸序列；或與其80%、85%、90%、95%、95%或99%同源的核酸序列。在一些實施例中，線性S抗原決定基包含SARS-CoV2 S蛋白之RBD區之胺基酸473至490 (SEQ ID NO: 29)；或與其80%、85%、90%、95%、95%或99%同源之胺基酸序列。在一些實施例中，rMVA編碼SEQ ID NO: 30，其提供編碼衍生於SARS-CoV2之原生序列之胺基酸473至490之線性S抗原決定基的核酸序列；或與其80%、85%、90%、95%、95%或99%同源的核酸序列。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 31，其提供編碼SARS-CoV2 S蛋白之RBD區之胺基酸473至490之線性S抗原決定基的最佳化核酸序列；或與其80%、85%、90%、95%、95%或99%同源的核酸序列。
在一些實施例中，S蛋白之線性抗原決定基為受體結合域(RBD)共有序列。
在某些實施例中，待插入至rMVA中之核酸序列中可包括編碼標籤之額外核酸序列，使得在蛋白質之C端處表現標籤。在一些實施例中，核酸序列(GAGCCAGAGGCT) (SEQ ID NO: 4)編碼具有胺基酸序列EPEA (SEQ ID NO: 5)之高親和力C-標籤。
在一些實施例中，S蛋白RBD線性抗原決定基包括在NH端處由核酸序列ATG編碼之胺基酸甲硫胺酸。表 7 ： 例示性 SARS-CoV2 線性 S 蛋白 RBD 抗原決定基
SEQ ID NO: 20 - SARS-CoV2 S蛋白RBD線性抗原決定基(胺基酸327-524) VRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV
SEQ ID NO: 21 - SARS-CoV2 S蛋白RBD線性抗原決定基(胺基酸331-524) NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV
SEQ ID NO: 22 - 編碼S蛋白RBD線性抗原決定基(胺基酸327-524)之SARS-CoV2核酸 GTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAAT
SEQ ID NO: 23 - 編碼S蛋白RBD線性抗原決定基(胺基酸331-524)之SARS-CoV2核酸 AATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAAT
SEQ ID NO: 24 - 經最佳化之編碼S蛋白RBD線性抗原決定基(胺基酸327-524)之SARS-CoV2核酸 GTCAGATTTCCGAACATCACGAACCTATGTCCGTTCGGAGAAGTGTTCAACGCGACAAGATTTGCGTCTGTCTATGCGTGGAACAGAAAAAGAATCAGTAACTGCGTCGCGGACTACTCCGTCCTATACAACTCTGCCTCTTTCTCCACGTTCAAATGCTACGGTGTATCTCCGACAAAGCTAAACGATCTATGCTTCACCAACGTCTACGCGGACTCCTTCGTAATCAGAGGAGATGAAGTTAGACAGATTGCGCCGGGACAAACTGGAAAGATCGCGGATTATAACTACAAGCTACCGGACGACTTCACCGGATGTGTAATTGCGTGGAATTCGAACAACCTAGACTCCAAAGTCGGAGGAAACTACAACTACTTGTACAGACTATTCAGAAAGTCCAACCTAAAGCCGTTCGAGAGAGACATCTCCACCGAAATCTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCCCGCTACAGTCTTACGGATTTCAACCGACAAACGGTGTAGGATATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTA
SEQ ID NO: 25 - 經最佳化之編碼S蛋白RBD線性抗原決定基(胺基酸331-524)之SARS-CoV2核酸 AACATCACGAACCTATGTCCGTTCGGAGAAGTGTTCAACGCGACAAGATTTGCGTCTGTCTATGCGTGGAACAGAAAAAGAATCAGTAACTGCGTCGCGGACTACTCCGTCCTATACAACTCTGCCTCTTTCTCCACGTTCAAATGCTACGGTGTATCTCCGACAAAGCTAAACGATCTATGCTTCACCAACGTCTACGCGGACTCCTTCGTAATCAGAGGAGATGAAGTTAGACAGATTGCGCCGGGACAAACTGGAAAGATCGCGGATTATAACTACAAGCTACCGGACGACTTCACCGGATGTGTAATTGCGTGGAATTCGAACAACCTAGACTCCAAAGTCGGAGGAAACTACAACTACTTGTACAGACTATTCAGAAAGTCCAACCTAAAGCCGTTCGAGAGAGACATCTCCACCGAAATCTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCCCGCTACAGTCTTACGGATTTCAACCGACAAACGGTGTAGGATATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTA
SEQ ID NO: 26 - SARS-CoV2 S蛋白RBD線性抗原決定基(胺基酸504至524) YQPYRVVVLSFELLHAPATV
SEQ ID NO: 27 - 編碼S蛋白RBD線性抗原決定基(胺基酸504至524)之SARS-CoV2核酸 TACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTT
SEQ ID NO: 28 - 經最佳化之編碼S蛋白RBD線性抗原決定基(胺基酸504至524)之SARS-CoV2核酸 TATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTA
SEQ ID NO: 29 - SARS-CoV2 S蛋白RBD線性抗原決定基(胺基酸473至490) YQAGSTPCNGVEGFNCYF
SEQ ID NO: 30 - 編碼S蛋白RBD線性抗原決定基(胺基酸473至490)之SARS-CoV2核酸 TATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTT
SEQ ID NO: 31 - 經最佳化之編碼S蛋白RBD線性抗原決定基(胺基酸473至490)之SARS-CoV2核酸 TATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTC
在一些實施例中，S蛋白之線性抗原決定基為SARS-CoV2 S蛋白之包含一或多個突變或缺失之受體結合域(RBD)。在一些實施例中，線性S抗原決定基包含下表8中提供之S蛋白之胺基酸327至524 (SEQ ID NO: 32)；或與其80%、85%、90%、95%、95%或99%同源之胺基酸序列。在一些實施例中，線性S抗原決定基包含下表8中提供之S蛋白之胺基酸331至524 (SEQ ID NO: 33)；或與其80%、85%、90%、95%、95%或99%同源之胺基酸序列。
在一些實施例中，SARS-CoV2 S蛋白之受體結合域(RBD)包含一或多個選自K417T、K417N、E484K或N501Y取代之突變或取代。
在一些實施例中，由rMVA表現之S蛋白為SARS-CoV2 S蛋白之受體結合域(RBD)，其包含一或多個選自以下之取代：SEQ ID NO: 20或21或與其80%、85%、90%、95%、95%或99%同源的胺基酸序列之K417N、K417T、Y453F、N439K、S477N或A376T，或其組合。在一些實施例中，由rMVA表現之S蛋白為SARS-CoV2 S蛋白之受體結合域(RBD)，其包含以下取代中之一或多者：SEQ ID NO: 20或21或與其80%、85%、90%、95%、95%或99%同源的胺基酸序列之N439K、T478I、S477N、P479S、V367F、V341I、P330S、P384L、A522V及其組合。
在某些實施例中，待插入至rMVA中之核酸序列中可包括編碼標籤之額外核酸序列，使得在蛋白質之C端處表現標籤。在一些實施例中，核酸序列(GAGCCAGAGGCT) (SEQ ID NO: 4)編碼具有胺基酸序列EPEA (SEQ ID NO: 5)之高親和力C-標籤。
在一些實施例中，S蛋白RBD線性抗原決定基包括在NH端處由核酸序列ATG編碼之胺基酸甲硫胺酸。表 8 ： 具有 K417T 、 E484K 及 N501Y 突變之例示性 SARS-CoV2 線性 S 蛋白 RBD 抗原決定基
SEQ ID NO: 32 - 包含K417T、E484K及N501Y之SARS-CoV2 S蛋白RBD線性抗原決定基(胺基酸327-524) VRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTG T IADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGV K GFNCYFPLQSYGFQPT Y GVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV
SEQ ID NO: 33 - 包含K417T、E484K及N501Y之SARS-CoV2 S蛋白RBD線性抗原決定基(胺基酸331-524) NITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTG T IADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGV K GFNCYFPLQSYGFQPT Y GVGYQPYRVVVLSFELLHAPATV
在某些態樣中，S蛋白之兩個或更多個線性抗原決定基由rMVA編碼，其中該兩個或更多個線性抗原決定基由間隔子(例如GPGPG間隔子多肽)隔開。在一些實施例中，插入至rMVA病毒載體中之序列編碼由間隔子隔開之線性抗原決定基，其中線性抗原決定基包括不同的S蛋白RBD肽，例如(RBD序列1-間隔子-RBD序列2)，其中RBD序列1為第一S蛋白RBD肽，且RBD序列2為第二S蛋白RBD肽。在一些實施例中，插入至rMVA病毒載體中之序列編碼串聯重複序列，例如(RBD-間隔子-RBD-間隔子)X 或(RBD序列1-間隔子-RBD序列2-間隔子)X ，其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9、10。在一些實施例中，RBD肽係選自一或多個來源於SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸331至524之肽。在一些實施例中，由rMVA編碼之線性抗原決定基係選自SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸504至524及胺基酸473至490。在一些實施例中，由rMVA編碼之線性抗原決定基為SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸504至524及胺基酸473至490。在一些實施例中，插入至MVA病毒載體中之序列編碼含有串聯重複序列((胺基酸504-524)-間隔子-(胺基酸473-490)-間隔子)x之S蛋白RBD肽，其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9、10。在一些實施例中，x = 3至7。在一些實施例中，x=5。在一些實施例中，插入至MVA病毒載體中之序列編碼含有串聯重複序列((胺基酸504-524)-GPGPG-(胺基酸473-490)-GPGPG)x之S蛋白RBD肽，其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9、10。在一些實施例中，x = 3至7。在一些實施例中，x=5。
在一些實施例中，MVA包含編碼下表9中提供之SEQ ID NO: 34之胺基酸序列之核酸序列，其提供編碼呈串聯重複序列((胺基酸504-524)-GPGPG-(胺基酸473-490)-GPGPG)x之S蛋白RBD肽的例示性胺基酸序列。在一些實施例中，MVA包含SEQ ID NO: 35之核酸序列，其提供編碼衍生於原生SARS-CoV2基因體序列之串聯重複序列((胺基酸504-524)-GPGPG-(胺基酸473-490)-GPGPG)x之核酸序列，該核酸序列編碼胺基酸504-524及胺基酸473-490且包括編碼連接子胺基酸序列GPGPG之核酸序列。在一些實施例中，MVA包含編碼SEQ ID NO: 36之胺基酸序列之核酸序列，該SEQ ID NO: 36提供呈串聯重複序列((胺基酸504-524)-GPGPG-(胺基酸473-490)-GPGPG)x之S蛋白RBD肽的胺基酸序列，其中x = 5，且SEQ ID NO: 37提供編碼其(已經最佳化)的核酸序列。在一些實施例中，MVA包含編碼下表9中提供之SEQ ID NO: 38之胺基酸序列之核酸序列，該SEQ ID NO: 38提供編碼呈串聯重複序列((胺基酸504-524)-GPGPG-(胺基酸473-490)-GPGPG)x之S蛋白RBD肽且進一步包含取代E484K的例示性胺基酸序列。在一些實施例中，MVA包含編碼SEQ ID NO: 39之胺基酸序列之核酸序列，該SEQ ID NO: 39提供呈串聯重複序列((胺基酸504-524)-GPGPG-(胺基酸473-490)-GPGPG)x之S蛋白RBD肽的胺基酸序列，其中x = 5，且進一步包含取代E484K。在一些實施例中，S蛋白RBD串聯重複序列包括在NH端處由核酸序列ATG編碼之胺基酸甲硫胺酸。表 9 ： SARS-CoV2 S 蛋白 RBD 串聯重複序列
SEQ ID NO: 34 - SARS-CoV2 S蛋白RBD串聯重複序列之胺基酸序列. (YQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVEGFNCYFGPGPG)x，其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。
SEQ ID NO: 35 - SARS-CoV2 S蛋白RBD串聯重複序列之核酸序列. (TACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTGGTCCTGGACCCGGTTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTGGTCCTGGACCCGGT)x，其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。
SEQ ID NO: 36 - SARS-CoV2 S蛋白RBD串聯重複序列之胺基酸序列，x = 5. YQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVEGFNCYFGPGPGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVEGFNCYFGPGPGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVEGFNCYFGPGPGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVEGFNCYFGPGPGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVEGFNCYFGPGPG
SEQ ID NO: 37 - SARS-CoV2 S蛋白RBD串聯重複序列之核酸序列，x =5；經最佳化的 TATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTAGGTCCTGGACCCGGTTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCGGTCCTGGACCCGGTTATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTAGGTCCTGGACCCGGTTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCGGTCCTGGACCCGGTTATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTAGGTCCTGGACCCGGTTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCGGTCCTGGACCCGGTTATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTAGGTCCTGGACCCGGTTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCGGTCCTGGACCCGGTTATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTAGGTCCTGGACCCGGTTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCGGTCCTGGACCCGGT
SEQ ID NO: 38 - SARS-CoV2 S蛋白RBD串聯重複序列之胺基酸序列(E484K) (YQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVKGFNCYFGPGPG)x，其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9、10或大於10。
SEQ ID NO: 39 - SARS-CoV2 S蛋白RBD串聯重複序列之胺基酸序列，x = 5 (E484K) YQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVKGFNCYFGPGPGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVKGFNCYFGPGPGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVKGFNCYFGPGPGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVKGFNCYFGPGPGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVKGFNCYFGPGPG
套膜 (E) 蛋白 E蛋白為主要結構蛋白中之最小蛋白。在例如SARS之複製週期期間，E在感染細胞內充分表現，但僅一小部分併入病毒粒子套膜中。Venkatagopalan等人, Coronavirus envelope (E) protein remains at the site of assembly. Virology. 2015;478:75-85。SARS感染中之大多數蛋白質例如定位在胞內遷移之位置處，即ER、高基氏體及ERGIC，其中其參與CoV組裝及出芽。Nieto-Torres等人, Subcellular location and topology of severe acute respiratory syndrome coronavirus envelope protein. Virology. 2011;415(2):69-82。
SARS-CoV2套膜(E)蛋白之胺基酸序列之長度為75個胺基酸。E蛋白已報導在GenBank登錄號QHD43418，且再現於表10 (SEQ ID NO: 40)以及其對應核酸序列(SEQ ID NO: 41)中，該對應核酸序列已報導在Genbank寄存編號MN908947.3，其位於SARS-CoV2基因體之核酸26245至26472處。在一些實施例中，插入至MVA病毒載體中之核酸編碼SEQ ID NO: 40之胺基酸序列或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%異源之胺基酸。在一些實施例中，插入至MVA病毒載體中之核酸為SEQ ID NO: 41或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%異源之核酸。在一些實施例中，插入至MVA病毒載體中之編碼E蛋白之核酸序列已經最佳化，例如如SEQ ID NO: 42或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%異源之核酸中所提供。
在一些實施例中，插入至MVA病毒載體中之核酸編碼：SEQ ID NO: 40之胺基酸序列，其具有一或多個選自以下之取代：S68F、L73F、P71L、S55F、R69I、T9I、V24M、D72H、T30I、S68C、V75L、V58F、V75F或L21F及其組合；或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%異源之胺基酸序列。
在某些實施例中，待插入至rMVA中之核酸序列中可包括編碼標籤之額外核酸序列，使得在蛋白質之C端處表現標籤。在一些實施例中，核酸序列(GAGCCAGAGGCT) (SEQ ID NO: 4)編碼具有胺基酸序列EPEA (SEQ ID NO: 5)之高親和力C-標籤。表 10 ： SARS-CoV2 套膜 (E) 蛋白
SEQ ID NO: 40 - SARS-CoV2 E蛋白胺基酸序列 MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLV
SEQ ID NO: 41 - E蛋白之SARS-CoV2核酸序列 ATGTACTCATTCGTTTCGGAAGAGACAGGTACGTTAATAGTTAATAGCGTACTTCTTTTTCTTGCTTTCGTGGTATTCTTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCGATTGTGTGCGTACTGCTGCAATATTGTTAACGTGAGTCTTGTAAAACCTTCTTTTTACGTTTACTCTCGTGTTAAAAATCTGAATTCTTCTAGAGTTCCTGATCTTCTGGTC
SEQ ID NO: 42 - 經最佳化之E蛋白之SARS-CoV2核酸序列 ATGTACTCCTTCGTGTCCGAAGAAACCGGAACCTTGATCGTCAACTCCGTCCTACTATTCCTAGCGTTCGTCGTGTTCCTACTAGTAACCCTAGCTATCCTAACCGCGCTAAGACTATGTGCGTACTGCTGCAACATCGTCAACGTGTCCCTAGTGAAGCCGTCCTTCTACGTCTACTCCAGAGTCAAGAACCTAAACTCCTCTAGAGTCCCGGACCTACTAGTT
膜 (M) 蛋白 冠狀病毒M蛋白為最豐富的結構蛋白且限定病毒套膜之形狀。Neuman等人, A structural analysis of M protein in coronavirus assembly and morphology. J Struct Biol. 2011;174(1):11-22。其亦被視為CoV組裝之中央處理器(central organizer)，與所有其他主要冠狀病毒結構蛋白相互作用。Masters PS. The molecular biology of coronaviruses. Adv Virus Res. 2006;66:193-292。例如SARS M蛋白之間的同型相互作用為病毒粒子套膜形成之主要驅動力，但獨自不足以形成病毒粒子。Neuman等人, J Struct Biol. 2011;174(1):11-22；de Haan等人, Assembly of the coronavirus envelope: homotypic interactions between the M proteins. J Virol. 2000;74(11):4967-78。例如關於SARS而言，M及E構成病毒套膜，且其相互作用足以產生及釋放VLP。Mortola及Roy.  Efficient assembly and release of SARS coronavirus-like particles by a heterologous expression system. FEBS Lett. 2004;576(1-2):174-8。
SARS-CoV2膜(M)蛋白之胺基酸序列之長度為222個胺基酸。M蛋白已報導在Genbank寄存編號QHD43419，再現為下表11中之SEQ ID NO: 43及其核酸序列，其核酸序列位於SARS-CoV2基因體之核酸26523至27191處，已報導在Genbank寄存編號MN908947.3，且下文再現為SEQ ID NO: 44。
在一些實施例中，插入至MVA病毒載體中之核酸序列編碼SEQ ID NO: 43之胺基酸序列或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%異源之胺基酸。在一些實施例中，插入至MVA病毒載體中之核酸序列為SEQ ID NO: 44或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%異源之核酸。在一些實施例中，插入至MVA病毒載體中之編碼M蛋白之核酸序列已經最佳化，例如如SEQ ID NO: 45或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%異源之核酸中所提供。
在一些實施例中，插入至MVA病毒載體中之核酸序列編碼：SEQ ID NO: 43之胺基酸序列，其進一步包含一或多個選自以下之取代：T175M、D3G、V23L、W31C、A2V、V70F、W75L、M109I、I52T、L46F、V70I、D3Y、K162N、H125Y、K15R、D209Y、R146H、R158C、L87F、A2S、A69S、S214I、T208I、L124F或S4F及其組合；或與其80%、85%、90%、95%、98%或99%異源之胺基酸序列。
在某些實施例中，待插入至rMVA中之核酸序列中可包括編碼標籤之額外核酸序列，使得在蛋白質之C端處表現標籤。在一些實施例中，核酸序列(GAGCCAGAGGCT) (SEQ ID NO: 4)編碼具有胺基酸序列EPEA (SEQ ID NO: 5)之高親和力C-標籤。表 11 ： SARS-CoV2 M 蛋白
SEQ ID NO: 43 - SARS-CoV2 M蛋白胺基酸序列. MADSNGTITVEELKKLLEQWNLVIGFLFLTWICLLQFAYANRNRFLYIIKLIFLWLLWPVTLACFVLAAVYRINWITGGIAIAMACLVGLMWLSYFIASFRLFARTRSMWSFNPETNILLNVPLHGTILTRPLLESELVIGAVILRGHLRIAGHHLGRCDIKDLPKEITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLNTDHSSSSDNIALLVQ
SEQ ID NO: 44 - M蛋白之SARS-CoV2核酸序列. ATGGCAGATTCCAACGGTACTATTACCGTTGAAGAGCTTAAAAAGCTCCTTGAACAATGGAACCTAGTAATAGGTTTCCTATTCCTTACATGGATTTGTCTTCTACAATTTGCCTATGCCAACAGGAATAGGTTTTTGTATATAATTAAGTTAATTTTCCTCTGGCTGTTATGGCCAGTAACTTTAGCTTGTTTTGTGCTTGCTGCTGTTTACAGAATAAATTGGATCACCGGTGGAATTGCTATCGCAATGGCTTGTCTTGTAGGCTTGATGTGGCTCAGCTACTTCATTGCTTCTTTCAGACTGTTTGCGCGTACGCGTTCCATGTGGTCATTCAATCCAGAAACTAACATTCTTCTCAACGTGCCACTCCATGGCACTATTCTGACCAGACCGCTTCTAGAAAGTGAACTCGTAATCGGAGCTGTGATCCTTCGTGGACATCTTCGTATTGCTGGACACCATCTAGGACGCTGTGACATCAAGGACCTGCCTAAAGAAATCACTGTTGCTACATCACGAACGCTTTCTTATTACAAATTGGGAGCTTCGCAGCGTGTAGCAGGTGACTCAGGTTTTGCTGCATACAGTCGCTACAGGATTGGCAACTATAAATTAAACACAGACCATTCCAGTAGCAGTGACAATATTGCTTTGCTTGTACAG
SEQ ID NO: 45 - 經最佳化之M蛋白之SARS-CoV2核酸序列 ATGGCGGATTCTAACGGAACCATCACCGTCGAAGAGTTGAAGAAGCTACTAGAGCAGTGGAACCTAGTCATCGGATTCCTATTCCTAACCTGGATCTGCCTACTACAGTTCGCGTACGCGAACAGGAACAGATTCTTGTACATCATCAAGCTAATCTTCCTATGGCTACTATGGCCGGTCACCTTGGCCTGCTTCGTTCTAGCTGCGGTCTACAGAATCAACTGGATCACAGGTGGAATCGCGATCGCTATGGCTTGTCTAGTAGGACTAATGTGGCTATCCTACTTCATCGCCTCCTTCAGACTATTCGCGAGAACCAGATCTATGTGGTCGTTCAACCCGGAGACGAACATCCTATTGAACGTACCGCTACATGGAACCATCCTAACCAGACCGCTATTGGAATCCGAATTGGTTATCGGAGCGGTCATCCTAAGAGGACATCTAAGAATTGCGGGACACCACCTAGGAAGATGTGACATCAAGGACCTACCGAAGGAGATCACCGTAGCGACCTCTAGAACCCTATCGTACTATAAGTTGGGAGCCTCTCAAAGAGTCGCGGGAGATTCTGGATTTGCGGCGTATTCTAGATACAGAATCGGGAACTACAAGCTAAACACCGACCACTCCTCCAGTTCCGATAATATCGCTCTACTAGTCCAG
改良型安卡拉牛痘 (MVA) 病毒載體 如本文所提供，將編碼一或多種SARS-CoV2抗原或其抗原片段之核酸序列插入至牛痘病毒株改良型安卡拉牛痘(MVA)中，當向個體投與時其能夠在個體之細胞中表現一或多種SARS-CoV2抗原或抗原片段。術語「改良型安卡拉牛痘(modified vaccinia Ankara/modified vaccinia ankara/Modified Vaccinia Ankara)」或「MVA」係指由Anton Mayr博士藉由在雞胚胎纖維母細胞上進行連續傳代而發展的高度減弱的牛痘病毒株；或其變體或衍生物。MVA綜述於(Mayr, A.等人 1975 Infection 3:6-14；瑞士專利第568,392號)中。MVA之全基因體序列可作為Genbank寄存編號U94848獲得。
已藉由在雞胚胎纖維母細胞上進行牛痘病毒安卡拉病毒株(CVA)之長期連續傳代來產生改良型安卡拉牛痘(MVA) (關於綜述參見Mayr, A.等人 1975 Infection 3:6-14；瑞士專利第568,392號)。MVA病毒可作為ATCC第VR-1508號公開獲自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)。MVA藉由其極大的減毒(如藉由毒性減少及在靈長類細胞中複製之能力降低所證實)同時維持良好的免疫原性而著名。已分析MVA病毒以判定相對於親本CVA病毒株之基因體變化。已鑑別出基因體DNA之六個主要缺失(缺失I、II、III、IV、V及Vi)，總計31,000個鹼基對(Meyer, H.等人 1991 J Gen Virol 72: 1031 -1038)。所得MVA病毒之宿主細胞限於禽類細胞。
已發現在感染晚期阻斷人類細胞中之MVA複製，從而預防組裝為成熟傳染性病毒粒子。然而，MVA甚至能夠在非容許細胞中以高含量表現病毒基因及重組異源基因(Sutter, G.及Moss, B. 1992 PNAS USA 89: 10847-10851)。可如下文闡述製備重組MVA。一般而言，可將含有編碼一或多種側接MVA DNA序列(與預先判定的插入位點相鄰(如下文進一步描述))之SARS-CoV2 (異源)多肽之DNA序列之DNA構築體引入至感染MVA的細胞(例如雞胚胎纖維母細胞(CEF)細胞)中，以允許同源重組。一旦已將DNA構築體引入至真核細胞中且外來DNA已與病毒DNA重組，則有可能分離出所需重組MVA。待插入之DNA構築體可為線性或環形的。質體或聚合酶鏈式反應產物為較佳的。此類製備重組MVA載體之方法例如描述於美國專利案第9,453,239號中，其以引用之方式併入本文中。
對於異源DNA序列或基因之表現而言，DNA上必需存在有基因轉錄所需之調節序列，諸如啟動子。因為MVA為細胞質病毒，所以適合的啟動子包括來源於天然存在之痘病毒啟動子之彼等啟動子。視痘病毒基因、啟動子及轉錄因子在痘病毒感染期間之表現時序而定，其分為早期、中間及晚期類別。參見例如Assarsson等人, Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes. PNAS 2008;105(6):2140-2145。Yang Z等人, Genome-wide analysis of the 5ʹ and 3ʹ ends of vaccinia virus early mRNAs delineates regulatory sequences of annotated and anomalous transcripts. J Virol. 2011;85(12):5897-5909。大部分哺乳動物細胞(非容許細胞)中之MVA複製在所有表現階段出現後之後代病毒粒子組裝期間停止。此支援所有啟動子類別(包括晚期啟動子)用於控制轉殖基因表現之效用。Sancho等人, The block in assembly of modified vaccinia virus Ankara in HeLa cells reveals new insights into vaccinia virus morphogenesis. J Virol. 2002;76(16):8318-8334；Geiben-Lynn等人, Kinetics of recombinant adenovirus type 5, vaccinia virus, modified vaccinia ankara virus, and DNA antigen expression in vivo and the induction of memory T-lymphocyte responses. Clin Vaccine Immunol. 2008;15(4):691-696。一些痘病毒啟動子具有早期及晚期元件兩者，從而允許其開放閱讀框(ORF)或重組抗原分別在病毒基因體複製之後在病毒感染早期及晚期表現。Broyles SS, Vaccinia virus transcription. J Gen Virol. 2003;84(Pt 9):2293-2303。在交叉病毒株中可使用痘病毒啟動子。參見Prideaux等人, Comparative analysis of vaccinia virus promoter activity in fowlpox and vaccinia virus recombinants. Virus Res. 1990;16(1):43-57；Tripathy等人, Regulation of foreign gene in fowlpox virus by a vaccinia virus promoter. Avian Dis. 1990;34(1):218-220。此類調節序列為熟習此項技術者已知，且包括例如：p11啟動子，其驅動由F17R ORF編碼之11k蛋白質的表現(Wittek等人, Mapping of a gene coding for a major late structural polypeptide on the vaccinia virus genome. J Virol. 1984;49(2):371-378)；p7.5啟動子(Cochran等人， In vitro mutagenesis of the promoter region for a vaccinia virus gene: evidence for tandem early and late regulatory signals. J Virol. 1985;54(1):30-37)；pI1L啟動子(Schmitt等人， Sequence and transcriptional analysis of the vaccinia virus HindIII I fragment. J Virol. 1988;62(6):1889-1897)；pTK啟動子(Weir及Moss, Determination of the promoter region of an early vaccinia virus gene encoding thymidine kinase. Virology. 1987;158(1):206-210)；pF7L啟動子(Coupar等人， Effect of in vitro mutations in a vaccinia virus early promoter region monitored by herpes simplex virus thymidine kinase expression in recombinant vaccinia virus. J Gen Virol. 1987;68(Pt 9):2299-2309)；pH5啟動子(Perkus等人， Cloning and expression of foreign genes in vaccinia virus, using a host range selection system. J Virol. 1989;63(9):3829-3836)；短的合成啟動子pSyn(Chakrabarti等人， Compact, synthetic, vaccinia virus early/late promoter for protein expression. Biotechniques. 1997;23(6):1094-1097；Hammond等人， A synthetic vaccinia virus promoter with enhanced early and late activity. J Virol Methods. 1997;66(1):135-1380)；pH5啟動子(Wyatt等人， Development of a replication-deficient recombinant vaccinia virus vaccine effective against parainfluenza virus 3 infection in an animal model. Vaccine. 1996;14(15):1451-1458)；pmH5啟動子(Wyatt等人， Development of a replication-deficient recombinant vaccinia virus vaccine effective against parainfluenza virus 3 infection in an animal model. Vaccine. 1996;14(15):1451-1458)；pHyb啟動子(Sancho等人， The block in assembly of modified vaccinia virus Ankara in HeLa cells reveals new insights into vaccinia virus morphogenesis. J Virol. 2002;76(16):8318-8334)；LEO啟動子(Wyatt等人， Correlation of immunogenicities and in vitro expression levels of recombinant modified vaccinia virus Ankara HIV vaccines. Vaccine. 2008;26(4):486-493)；pB8啟動子(Orubu等人， Expression and cellular immunogenicity of a transgenic antigen driven by endogenous poxviral early promoters at their authentic loci in MVA. PLoS One. 2012;7(6):e40167)；pF11啟動子(Orubu等人， Expression and cellular immunogenicity of a transgenic antigen driven by endogenous poxviral early promoters at their authentic loci in MVA. PLoS One. 2012;7(6):e40167)。
在一些實施例中，啟動子為pmH5啟動子。在一些實施例中，啟動子包含SEQ ID NO: 154 (AAAAATTGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAA)。
在一些實施例中，啟動子為p11啟動子。在一些實施例中，啟動子包含SEQ ID NO: 155 (TTTCATTTTGTTTTTTTCTATGCTATAA)。
可藉由轉染將DNA構築體引入至MVA感染的細胞中，例如藉助於磷酸鈣沈澱(Graham等人 1973 Virol 52:456-467；Wigler等人 1979 Cell 16:777-785)、藉助於電穿孔(Neumann等人 1982 EMBO J. 1 :841 -845)、藉由顯微注射(Graessmann等人 1983 Meth Enzymol 101 :482-492)、藉助於脂質體(Straubinger等人 1983 Meth Enzymol 101 :512-527)、藉助於球形質體(Schaffher 1980 PNAS USA 77:2163-2167)或藉由熟習此項技術者已知之其他方法。
本發明MVA載體設計及製造方法適用於製造用於引起針對SARS-CoV2之有效T細胞及抗體免疫反應的有效MVA疫苗載體。在一些實施例中，本文所描述之MVA疫苗載體能夠在單一同源初次接觸抗原免疫增強之後引起有效的免疫反應及抗體產量。
在一些實施例中，本發明提供重組病毒載體(例如MVA載體)，其包含一或多個編碼SARS-CoV2蛋白或其免疫原性片段之核酸序列。可使用熟習此項技術者已知之習知技術構築病毒載體(例如MVA載體)。一或多個異源SARS-CoV2基因插入物編碼具有所需免疫原性之多肽，亦即藉由其投與可在活體內誘導免疫反應、細胞免疫及/或體液免疫之多肽。在編碼具有免疫原性之多肽之基因之引入中，可在編碼具有所需免疫原性之多肽之基因的上游可操作地連接適當啟動子。
一或多個核酸序列可經最佳化以用於MVA載體中。最佳化包括密碼子最佳化，其採用緘默突變以將來自原生序列之所選擇密碼子改變為由宿主-載體系統最佳表現之同義密碼子。其他類型之最佳化包括使用緘默突變以中斷均聚物鏈段或轉錄終止子模體。此等最佳化策略中之每一者可改良基因之穩定性、改良轉錄本之穩定性或改良自序列表現蛋白質之含量。在例示性實施例中，異源DNA插入序列中均聚物鏈段之數目將減少以使構築體穩定。可為類似於牛痘終止訊息之任何東西提供緘默突變。
在例示性實施例中，序列經密碼子最佳化以用於在MVA中表現；具有＞ 5個去氧鳥苷、＞ 5個去氧胞苷、＞ 5個去氧腺苷及＞ 5個去氧胸苷之連串(run)之序列間雜有緘默突變，以最小化歸因於框移突變所致之表現損失。
特定言之，用於插入之核酸可藉由密碼子最佳化初始DNA序列來最佳化。舉例而言，「Invitrogen GeneArt Gene軟體」可用於密碼子最佳化DNA序列。為了充分最佳化基因序列，均聚物序列(富含G/C或T/A之區域)間雜有一或多個緘默突變。在存在於核酸插入序列中之情況下，MVA轉錄終止子(T5NT (UUUUUNU))間雜有一或多個緘默突變。其他最佳化可包括例如添加Kozak序列(GCCACC/ATG)、添加第二終止密碼子及添加牛痘病毒轉錄終止子(具體言之「TTTTTAT」)或其變體及/或組合。
可將編碼一或多個SARS-CoV2蛋白或其片段之DNA插入物插入至MVA基因體中之任何適合的位置處，例如天然缺失位點、經修飾之天然缺失位點、非必需MVA基因(例如MVA胸苷激酶基因座)中、或必需MVA基因之間或非必需MVA基因之間的基因間區中。適合的插入位點已描述於例如以下中：美國專利第6,998,252號、美國專利第9,133,478號、Ober等人, Immunogenicity and safety of defective vaccinia virus lister:  comparison with modified vaccinia virus Ankara.  J. Virol., 2002年8月 (第7713-7723頁)、美國專利第9,133,480號、美國專利第8,288,125號，其中之每一者以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，將SARS-CoV2肽編碼序列插入至以下中：天然缺失位點，例如選自天然缺失位點I、II、III、IV、V或VI之缺失位點；經修飾之天然缺失位點，例如MVA基因A50R與B1R之間(參見例如U.S. 9,133,480)、非必需MVA基因之間、必需MVA基因之間的經截短及經修飾之缺失位點III，例如I8R與G1L或A5R與A6L或其他適合的插入位點；非必需基因座，例如MVA TK基因座；或其組合。
重組改良型安卡拉牛痘 (rMVA) 疫苗構築體 本文提供重組改良型安卡拉牛痘(rMVA)病毒載體，其包含編碼一或多種SARS-CoV2蛋白、肽或其片段之異源核酸插入物，該等異源核酸插入物可操作地連接至與痘病毒表現系統相容之啟動子，在表現後，其能夠誘導保護性免疫而不誘導與先前rMVA相關冠狀病毒疫苗接種策略相關之免疫病變。
SARS-CoV2 S-E-M VLP 在一個態樣中，重組MVA疫苗表現SARS-CoV2之M蛋白及E蛋白、以及SARS-CoV2 S蛋白或其片段或變體，如下文進一步提供。在於宿主細胞中表現後，SARS-CoV2能夠形成非傳染性病毒樣顆粒(VLP)、增強抗原決定基展示及誘導強效的抗病毒免疫反應。
在一些實施例中，提供一種rMVA病毒載體，其編碼SARS-CoV2之棘(S)蛋白(或其片段)、套膜(E)蛋白及膜(M)蛋白，其中在表現S蛋白、E蛋白及M蛋白後，形成VLP。在一些實施例中，核酸經排列以使得S、E及M編碼序列為線性相鄰的。在圖1A中提供適合於在表現後形成VLP之編碼S蛋白、E蛋白及M蛋白之單一MVA插入物的線性表示。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白，例如如SEQ ID NO: 1中所提供；E蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 40中所提供；且M蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 43中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種質體或MVA病毒載體，其包含編碼SEQ ID NO: 1、40及43之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白，例如如SEQ ID NO: 6中所提供；E蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 40中所提供；且M蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 43中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種質體或MVA病毒載體，其包含編碼SEQ ID NO: 6、40及43之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種核酸序列，其包含SEQ ID NO: 2、41及44；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種編碼全長S蛋白、E蛋白及M蛋白之核酸，其中核酸已經最佳化以用於在MVA病毒載體中表現，例如如SEQ ID NO: 3、42及45中所提供。在一些實施例中，核酸序列編碼額外胺基酸序列，諸如標籤，例如C端標籤，諸如適合於在分析中偵測所表現之蛋白質之EPEA。核酸序列可進一步包含適合的啟動子序列，諸如(但不限於)衍生於pmH5、p11、pSyn、pHyb或此項技術中已知之任何其他適合的啟動子序列之彼等啟動子序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適合的轉譯起始序列，諸如Kozak共有序列。另外，核酸序列可在各蛋白質或標籤之最後一個胺基酸序列後在核酸序列之3'端處包括適當的終止密碼子，例如TAA、TAG或TGA或其組合或多個。此外，核酸序列可在各所編碼蛋白質之最後一個終止密碼子之3'包括牛痘病毒終止序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適用於產生穿梭載體之限制酶位點，以易於插入抗原序列。包含全長S蛋白、E蛋白及M蛋白之相鄰編碼序列之例示性核酸序列如提供於下文SEQ ID NO: 46、47或156中。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 46 (圖1B-1C-1D)之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 47 (圖1E-1F-1G)之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 156 (圖1H-1I-1J)之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。
替代地，提供一種rMVA病毒載體，其編碼SARS-CoV2之棘(S)蛋白、套膜(E)蛋白及膜(M)蛋白，其中S蛋白已用一或多個使呈融合前構形之S蛋白三聚體穩定之胺基酸脯胺酸取代進行穩定，且其中在表現後，該等蛋白質形成VLP。在一些實施例中，核酸經排列以使得經穩定之S、E及M編碼序列為線性相鄰的。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且在七肽重複序列1 (HR1)與S胞外域三聚體之啟動子之中央螺旋之間的邊界處或附近含有一或多個脯胺酸取代。在一些實施例中，脯胺酸取代出現在三聚體中之啟動子之胺基酸殘基970至990之間。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且含有胺基酸K986及V987處之兩個脯胺酸取代。在圖2A中提供適合於在表現後形成VLP之編碼經穩定之S蛋白、E蛋白及M蛋白之單一MVA插入物的線性表示。在一些實施例中，S蛋白表現為包含S蛋白之胺基酸986及987處之兩個脯胺酸取代的全長蛋白，例如如SEQ ID NO: 8中所提供；E蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 40中所提供；且M蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 43中所提供，或與其至少75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，本文提供一種質體或MVA病毒載體，其含有編碼SEQ ID NO: 8、40及43之核酸序列或與其至少75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，S蛋白表現為包含S蛋白之胺基酸986及987處之兩個脯胺酸取代的全長蛋白，例如如SEQ ID NO: 11中所提供；E蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 40中所提供；且M蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 43中所提供，或與其至少75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，本文提供一種質體或MVA病毒載體，其含有編碼SEQ ID NO: 11、40及43之核酸序列或與其至少75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種核酸序列，其包含SEQ ID NO: 9、41及44；或與其至少75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種編碼全長經脯胺酸取代之S蛋白、E蛋白及M蛋白之核酸，其中該核酸已經最佳化以用於在MVA病毒載體中表現，例如如SEQ ID NO: 10、42及45中所提供，或與其至少75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，本文提供一種編碼全長經脯胺酸取代之S蛋白、E蛋白及M蛋白之核酸，其中該核酸已經最佳化以用於在MVA病毒載體中表現，例如如SEQ ID NO: 12、42及45中所提供，或與其至少75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，核酸序列編碼額外胺基酸序列，諸如標籤，例如C端標籤，諸如EPEA。核酸序列可進一步包含適合的啟動子序列，諸如(但不限於)衍生於pmH5、p11、pSyn、pHyb或任何其他適合的啟動子序列之彼等啟動子序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適合的轉譯起始序列，諸如Kozak共有序列。另外，核酸序列可在蛋白質或標籤之最後一個胺基酸序列後在核酸序列之3'端處包括適當的終止密碼子，例如TAA、TAG或TGA或其組合或多個。此外，核酸序列可在各所編碼蛋白質之最後一個終止密碼子之3'包括牛痘病毒終止序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適用於產生穿梭載體之限制酶位點，以易於插入抗原序列。用於插入之編碼全長經穩定之S蛋白、E蛋白及M蛋白之例示性核酸序列在下文提供為SEQ ID NO: 48、49、50或156。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 48 (圖2B-2C-2D)之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 49 (圖2E-2F-2G)之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 50 (圖2H-2I-2J)之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 157 (圖2K-2L-2M)之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 159 (圖2N-2O-2P)之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 160 (圖2Q-2R-2S)之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。
替代地，提供一種rMVA病毒載體，其編碼SARS-CoV2之部分棘(S)蛋白、套膜(E)蛋白及膜(M)蛋白，其中該部分S蛋白為SARS-CoV2 S蛋白之受體結合域(RBD)。在一些實施例中，線性S抗原決定基包含S蛋白之胺基酸327至524，且視情況進一步在NH端處包含初始甲硫胺酸胺基酸殘基。在一些實施例中，RBD序列為冠狀病毒共有序列。在一些實施例中，核酸經排列以使得S RBD、E及M編碼序列為線性相鄰的。在圖3D中提供適合於在表現後形成VLP之編碼部分S蛋白編碼胺基酸327至524、E蛋白及M蛋白之單一MVA插入物的線性表示。在一些實施例中，部分S蛋白表現為，如SEQ ID NO: 20中所提供；E蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 40中所提供；且M蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 43中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，本文提供一種質體或MVA病毒載體，其含有編碼SEQ ID NO: 22、40及43之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種核酸序列，其包含SEQ ID NO: 24、41及44；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種編碼部分S蛋白、E蛋白及M蛋白之核酸，其中該核酸已經最佳化以用於在MVA病毒載體中表現，例如如SEQ ID NO: 24、42及45中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，部分S蛋白表現為，如SEQ ID NO: 32中所提供；E蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 40中所提供；且M蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 43中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。
在一些實施例中，核酸序列編碼額外胺基酸序列，諸如標籤，例如C端標籤，諸如適合在分析偵測期間使用之EPEA。核酸序列可進一步包含適合的啟動子序列，諸如衍生於pmH5、p11、pSyn、pHyb或任何其他適合的啟動子序列之彼等啟動子序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適合的轉譯起始序列，諸如Kozak共有序列。另外，核酸序列可在蛋白質或標籤之最後一個胺基酸序列後在核酸序列之3'端處包括適當的終止密碼子，例如TAA、TAG或TGA或其組合或多個。此外，核酸序列可在各所編碼蛋白質之最後一個終止密碼子之3'包括牛痘病毒終止序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適用於產生穿梭載體之限制酶位點，以易於插入抗原序列。用於插入之編碼S蛋白RBD區、E蛋白及M蛋白之例示性核酸序列提供為SEQ ID NO: 51或52。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 51 (圖3E)之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 52 (圖3F)之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。
替代地，在一些實施例中，線性S抗原決定基包含S蛋白之胺基酸331至524，且視情況在RBD之NH端處進一步包含甲硫胺酸。在一些實施例中，核酸經排列以使得S RBD (胺基酸331-524)、E及M編碼序列為線性相鄰的。在圖3A中提供適合於在表現後形成VLP之編碼部分S蛋白編碼胺基酸331至524、E蛋白及M蛋白之單一MVA插入物的線性表示。在一些實施例中，部分S蛋白表現為，如SEQ ID NO: 21中所提供；E蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 40中所提供；且M蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 43中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，本文提供一種質體或MVA病毒載體，其含有編碼SEQ ID NO: 23、40及43之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種核酸序列，其包含SEQ ID NO: 25、41及44；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種編碼部分S蛋白、E蛋白及M蛋白之核酸，其中該核酸已經最佳化以用於在MVA病毒載體中表現，例如如SEQ ID NO: 25、42及45中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，部分S蛋白表現為，如SEQ ID NO: 33中所提供；E蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 40中所提供；且M蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 43中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。
在一些實施例中，核酸序列編碼額外胺基酸序列，諸如標籤，例如C端標籤，諸如適合在分析偵測期間使用之EPEA。核酸序列可進一步包含適合的啟動子序列，諸如(但不限於)衍生於pmH5、p11、pSyn、pHyb或任何其他適合的啟動子序列之彼等啟動子序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適合的轉譯起始序列，諸如Kozak共有序列。另外，核酸序列可在蛋白質或標籤之最後一個胺基酸序列後在核酸序列之3'端處包括適當的終止密碼子，例如TAA、TAG或TGA或其組合或多個。此外，核酸序列可在各所編碼蛋白質之最後一個終止密碼子之3'包括牛痘病毒終止序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適用於產生穿梭載體之限制酶位點，以易於插入抗原序列。用於插入之編碼S蛋白RBD (胺基酸331-524)區、E蛋白及M蛋白之例示性核酸序列提供為SEQ ID NO: 53或54。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 53 (圖3B)之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 54 (圖3C)之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。
在一些實施例中，提供一種rMVA病毒載體，其編碼SARS-CoV2之部分棘(S)蛋白、套膜(E)蛋白及膜(M)蛋白，其中該部分S蛋白為SARS-CoV2 S蛋白之受體結合域(RBD)，且其中RBD結合蛋白在其NH端上側接衍生於S蛋白之胺基酸1-13的S蛋白訊息肽，且在其羧基端上側接衍生於胺基酸1214至1273的S蛋白跨膜域或其片段。側接S蛋白訊息肽(SP)在下表12中提供為SEQ ID NO: 55，且其核酸序列提供為SEQ ID NO: 56。SP之最佳化核酸序列提供於SEQ ID NO: 59中。S蛋白跨膜域(STM)在下表8中提供為SEQ ID NO: 57，且其核酸序列提供為SEQ ID NO: 58，且最佳化核酸序列提供為SEQ ID NO: 60。在一些實施例中，線性S抗原決定基包含S蛋白之胺基酸327至524，側接SP及STM。SP-RBD (胺基酸327-524)-STM肽提供於SEQ ID NO: 61中。在一些實施例中，線性S抗原決定基包含S蛋白之胺基酸331至524，側接SP及STM。SP-RBD (胺基酸331-524)-STM肽提供於SEQ ID NO: 62中。在一些實施例中，核酸經排列以使得S SP-RBD-TM、E及M編碼序列為線性相鄰的。在圖3G中提供適合於在表現後形成VLP之編碼部分S蛋白編碼胺基酸1-13 (SP)、331至524 (RBD)及1214-1273 (STM)、E蛋白及M蛋白之單一MVA插入物的線性表示。在圖3H中提供適合於在表現後形成VLP之編碼部分S蛋白編碼胺基酸1-13 (SP)、327至524 (RBD)及1214-1273 (STM)、E蛋白及M蛋白之單一MVA插入物的線性表示。在一些實施例中，部分S蛋白SP-RBD (胺基酸327-524)-STM表現為，如SEQ ID NO: 61中所提供；E蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 40中所提供；且M蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 43中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，部分S蛋白SP-RBD (胺基酸331-524)-STM表現為，如SEQ ID NO: 62中所提供；E蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 40中所提供；且M蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 43中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，本文提供一種質體或MVA病毒載體，其含有編碼SEQ ID NO: 61或62、40及43之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種質體或MVA病毒載體，其含有編碼SEQ ID NO: 67或68、40及43之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種核酸序列，其包含SEQ ID NO: 63或64、41及44；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種編碼部分S蛋白、E蛋白及M蛋白之核酸，其中該核酸已經最佳化以用於在MVA病毒載體中表現，例如如SEQ ID NO: 65或66、42及45中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，核酸序列編碼額外胺基酸序列，諸如標籤，例如C端標籤，諸如適合在分析偵測期間使用之EPEA。核酸序列可進一步包含適合的啟動子序列，諸如(但不限於)衍生於pmH5、p11、pSyn、pHyb或任何其他適合的啟動子序列之彼等啟動子序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適合的轉譯起始序列，諸如Kozak共有序列。另外，核酸序列可在蛋白質或標籤之最後一個胺基酸序列後在核酸序列之3'端處包括適當的終止密碼子，例如TAA、TAG或TGA或其組合或多個。此外，核酸序列可在各所編碼蛋白質之最後一個終止密碼子之3'包括牛痘病毒終止序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適用於產生穿梭載體之限制酶位點，以易於插入抗原序列。用於插入之編碼S蛋白SP-RBD (胺基酸327-524)-STM區、E蛋白及M蛋白之例示性核酸序列提供為SEQ ID NO: 69或70。用於插入之編碼S蛋白SP-RBD (胺基酸331-524)-STM區、E蛋白及M蛋白之例示性核酸序列提供為SEQ ID NO: 71或72。在一些實施例中，rMVA包含選自SEQ ID NO: 69 (圖3I-3J)、70 (圖3K-3L)、71 (圖3M-3N)或72 (圖3O-3P)之核酸序列；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。
在一替代實施例中，核酸插入物編碼進一步包含訊息肽之線性S抗原決定基、E蛋白及M蛋白(參見例如圖3Q、圖3R、圖3S、圖3T)。S蛋白訊息肽可包含或來源於例如SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸1-13 (MFVFLVLLPLVSS) (SEQ ID NO: 55)。在一些實施例中，所編碼之S蛋白包含RBD共有序列。在一些實施例中，RBD共有序列進一步包含例如來源於SEQ ID NO: 55之S蛋白訊息肽。在一些實施例中，rMVA表現包含胺基酸327-524之線性RBD抗原決定基。在一些實施例中，rMVA表現包含SEQ ID NO: 55及20之胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，rMVA表現包含胺基酸331-524之線性RBD抗原決定基。在一些實施例中，rMVA表現包含SEQ ID NO: 55及21之胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，rMVA表現包含胺基酸327-598之線性RBD抗原決定基。在一些實施例中，rMVA表現包含SEQ ID NO: 55及161之胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，rMVA表現包含胺基酸331-598之線性RBD抗原決定基。在一些實施例中，rMVA表現包含SEQ ID NO: 55及162之胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，RBD肽包含取代K417T、E484K及N501Y。在一些實施例中，rMVA表現包含SEQ ID NO: 55及32之胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，rMVA表現包含SEQ ID NO: 55及33之胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，rMVA表現包含SEQ ID NO: 55及163之胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，rMVA表現包含SEQ ID NO: 55及164之胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 55、20、40及43之胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，rMVA編碼SEQ ID NO: 55、21、40及43之胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，rMVA編碼SEQ ID NO: 55、32、40及43之胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 55、33、40及43之胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 55、161、40及43之胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 55、162、40及43之胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 55、163、40及43之胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，rMVA編碼包含SEQ ID NO: 164、33、40及43之胺基酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，核酸序列編碼額外胺基酸序列，諸如標籤，例如C端標籤，諸如適合在分析偵測期間使用之EPEA。核酸序列可進一步包含適合的啟動子序列，諸如(但不限於)衍生於pmH5、p11、pSyn、pHyb或任何其他適合的啟動子序列之彼等啟動子序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適合的轉譯起始序列，諸如Kozak共有序列。另外，核酸序列可在蛋白質或標籤之最後一個胺基酸序列後在核酸序列之3'端處包括適當的終止密碼子，例如TAA、TAG或TGA或其組合或多個。此外，核酸序列可在各所編碼蛋白質之最後一個終止密碼子之3'包括牛痘病毒終止序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適用於產生穿梭載體之限制酶位點，以易於插入抗原序列。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 158 (圖3U-3V)或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。表 12 ： SP 肽、 TM 肽、 SP-RBD-STM 肽序列
SEQ ID NO: 55 - S蛋白訊息肽胺基酸1至13 MFVFLVLLPLVSS
SEQ ID NO: 56 - S蛋白訊息肽核酸序列 ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGT
SEQ ID NO: 57 - S蛋白跨膜域胺基酸1214至1273 WYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
SEQ ID NO: 58 - S蛋白跨膜域核酸序列 TGGTACATTTGGCTAGGTTTTATAGCTGGCTTGATTGCCATAGTAATGGTGACAATTATGCTTTGCTGTATGACCAGTTGCTGTAGTTGTCTCAAGGGCTGTTGTTCTTGTGGATCCTGCTGCAAATTTGATGAAGACGACTCTGAGCCAGTGCTCAAAGGAGTCAAATTACATTACACA
SEQ ID NO: 59 - 經最佳化之S蛋白訊息肽核酸序列 ATGTTCGTGTTCCTAGTCCTACTACCGCTAGTCTCTTCT
SEQ ID NO: 60 - 經最佳化之S蛋白跨膜域核酸序列 TGGTACATCTGGCTAGGATTCATTGCTGGACTAATTGCGATCGTCATGGTCACCATCATGCTATGCTGTATGACCTCCTGTTGCTCCTGTCTAAAGGGATGTTGTTCCTGCGGATCCTGTTGCAAGTTCGATGAAGATGATAGTGAACCGGTCCTAAAGGGTGTCAAGCTACACTACACA
Seq. ID No. 61 - SP-RBD (胺基酸327-524)-STM肽胺基酸序列 MFVFLVLLPLVSSVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
Seq. ID No. 62 - SP-RBD (胺基酸331-524)-STM肽胺基酸序列 MFVFLVLLPLVSSNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
SEQ ID NO: 63 - SP-RBD (胺基酸327-524)-STM肽核酸序列 ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTGTTAGATTTCCTAATATTACAGTTAGATTTCCTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTGGTACATTTGGCTAGGTTTTATAGCTGGCTTGATTGCCATAGTAATGGTGACAATTATGCTTTGCTGTATGACCAGTTGCTGTAGTTGTCTCAAGGGCTGTTGTTCTTGTGGATCCTGCTGCAAATTTGATGAAGACGACTCTGAGCCAGTGCTCAAAGGAGTCAAATTACATTACACA
SEQ ID NO: 64- SP-RBD (胺基酸331-524)-STM肽核酸序列 ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGTAATATTACAAACTTGTGCCCTTTTGGTGAAGTTTTTAACGCCACCAGATTTGCATCTGTTTATGCTTGGAACAGGAAGAGAATCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGTCCTATATAATTCCGCATCATTTTCCACTTTTAAGTGTTATGGAGTGTCTCCTACTAAATTAAATGATCTCTGCTTTACTAATGTCTATGCAGATTCATTTGTAATTAGAGGTGATGAAGTCAGACAAATCGCTCCAGGGCAAACTGGAAAGATTGCTGATTATAATTATAAATTACCAGATGATTTTACAGGCTGCGTTATAGCTTGGAATTCTAACAATCTTGATTCTAAGGTTGGTGGTAATTATAATTACCTGTATAGATTGTTTAGGAAGTCTAATCTCAAACCTTTTGAGAGAGATATTTCAACTGAAATCTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTCCTTTACAATCATATGGTTTCCAACCCACTAATGGTGTTGGTTACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTTGTGGACCTAAAAAGTCTACTAATTTGGTTAAAAACAAATGTGTCAATTGGTACATTTGGCTAGGTTTTATAGCTGGCTTGATTGCCATAGTAATGGTGACAATTATGCTTTGCTGTATGACCAGTTGCTGTAGTTGTCTCAAGGGCTGTTGTTCTTGTGGATCCTGCTGCAAATTTGATGAAGACGACTCTGAGCCAGTGCTCAAAGGAGTCAAATTACATTACACA
SEQ ID NO: 65 - 經最佳化之SP-RBD (胺基酸327-524)-STM肽核酸序列 ATGTTCGTGTTCCTAGTCCTACTACCGCTAGTCTCTTCTGTCAGATTTCCGAACATCACGAACCTATGTCCGTTCGGAGAAGTGTTCAACGCGACAAGATTTGCGTCTGTCTATGCGTGGAACAGAAAAAGAATCAGTAACTGCGTCGCGGACTACTCCGTCCTATACAACTCTGCCTCTTTCTCCACGTTCAAATGCTACGGTGTATCTCCGACAAAGCTAAACGATCTATGCTTCACCAACGTCTACGCGGACTCCTTCGTAATCAGAGGAGATGAAGTTAGACAGATTGCGCCGGGACAAACTGGAAAGATCGCGGATTATAACTACAAGCTACCGGACGACTTCACCGGATGTGTAATTGCGTGGAATTCGAACAACCTAGACTCCAAAGTCGGAGGAAACTACAACTACTTGTACAGACTATTCAGAAAGTCCAACCTAAAGCCGTTCGAGAGAGACATCTCCACCGAAATCTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCCCGCTACAGTCTTACGGATTTCAACCGACAAACGGTGTAGGATATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTATGGTACATCTGGCTAGGATTCATTGCTGGACTAATTGCGATCGTCATGGTCACCATCATGCTATGCTGTATGACCTCCTGTTGCTCCTGTCTAAAGGGATGTTGTTCCTGCGGATCCTGTTGCAAGTTCGATGAAGATGATAGTGAACCGGTCCTAAAGGGTGTCAAGCTACACTACACA
SEQ ID NO: 66 - 經最佳化之SP-RBD (胺基酸331-524)-STM肽核酸序列 ATGTTCGTGTTCCTAGTCCTACTACCGCTAGTCTCTTCTAACATCACGAACCTATGTCCGTTCGGAGAAGTGTTCAACGCGACAAGATTTGCGTCTGTCTATGCGTGGAACAGAAAAAGAATCAGTAACTGCGTCGCGGACTACTCCGTCCTATACAACTCTGCCTCTTTCTCCACGTTCAAATGCTACGGTGTATCTCCGACAAAGCTAAACGATCTATGCTTCACCAACGTCTACGCGGACTCCTTCGTAATCAGAGGAGATGAAGTTAGACAGATTGCGCCGGGACAAACTGGAAAGATCGCGGATTATAACTACAAGCTACCGGACGACTTCACCGGATGTGTAATTGCGTGGAATTCGAACAACCTAGACTCCAAAGTCGGAGGAAACTACAACTACTTGTACAGACTATTCAGAAAGTCCAACCTAAAGCCGTTCGAGAGAGACATCTCCACCGAAATCTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCCCGCTACAGTCTTACGGATTTCAACCGACAAACGGTGTAGGATATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTATGGTACATCTGGCTAGGATTCATTGCTGGACTAATTGCGATCGTCATGGTCACCATCATGCTATGCTGTATGACCTCCTGTTGCTCCTGTCTAAAGGGATGTTGTTCCTGCGGATCCTGTTGCAAGTTCGATGAAGATGATAGTGAACCGGTCCTAAAGGGTGTCAAGCTACACTACACA
Seq. ID No. 67 - SP-RBD (胺基酸327-524)-STM肽胺基酸序列(K417T、E484K、N501Y) MFVFLVLLPLVSSVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
Seq. ID No. 68 - SP-RBD (胺基酸331-524)-STM肽胺基酸序列(K417T、E484K、N501Y) MFVFLVLLPLVSSNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
SEQ ID NO: 161 - SP-RBD (胺基酸327-598)肽胺基酸序列 MFVFLVLLPLVSSVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVS
SEQ ID NO: 162 - SP-RBD (胺基酸331-598)肽胺基酸序列 MFVFLVLLPLVSSNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVS
SEQ ID NO: 163 - SP-RBD (胺基酸327-598)肽胺基酸序列(K417T、E484K、N501Y) MFVFLVLLPLVSSVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVS
SEQ ID NO: 164 - SP-RBD (胺基酸331-598)肽胺基酸序列(K417T、E484K、N501Y) MFVFLVLLPLVSSNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYTCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVS
替代地，提供一種rMVA病毒載體，其編碼串聯重複序列、SARS-CoV2之套膜(E)蛋白及膜(M)蛋白，其中該串聯重複序列衍生於S蛋白RBD域之線性抗原決定基。在一些實施例中，串聯重複序列例如為(RBD-間隔子-RBD-間隔子)X 或(RBD序列1-間隔子-RBD序列2-間隔子)X ，其中RBD為任何S蛋白RBD肽，RBD序列1為第一S蛋白RBD肽，且RBD序列2為第二S蛋白RBD肽，且其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施例中，串聯重複序列視情況在NH端處包含甲硫胺酸胺基酸。在一些實施例中，RBD肽係選自一或多個衍生於SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸331至524或SARS-CoV2 S蛋白之327-524之肽。在一些實施例中，由rMVA編碼之線性抗原決定基係選自SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸504至524及胺基酸473至490。在一些實施例中，由rMVA編碼之線性抗原決定基為SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸504至524及胺基酸473至490。在一些實施例中，插入至MVA病毒載體中之序列編碼含有串聯重複序列((胺基酸504-524)-間隔子-(胺基酸473-490)-間隔子)x之S蛋白RBD肽，其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施例中，x = 3至7。在一些實施例中，x=5。
在一些實施例中，核酸經排列以使得串聯重複序列、E及M編碼序列為線性相鄰的。在圖4A中提供適合於在表現後形成VLP之編碼串聯重複序列、E蛋白及M蛋白之單一MVA插入物的線性表示。在一些實施例中，串聯重複序列表現為，如SEQ ID NO: 34中所提供，其視情況在NH端處進一步包含甲硫胺酸，其中x為2至10；E蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 40中所提供；且M蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 43中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，本文提供一種質體或MVA病毒載體，其含有編碼SEQ ID NO: 34 (其中x為2至10或大於10)、SEQ ID NO: 40及SEQ ID NO: 43的核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，本文提供一種質體或MVA病毒載體，其含有編碼SEQ ID NO: 38 (其中x為2至10或大於10)、SEQ ID NO: 40及SEQ ID NO: 43的核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，本文提供一種質體或MVA病毒載體，其含有編碼SEQ ID NO: 39 (其中x為2至10或大於10)、SEQ ID NO: 40及SEQ ID NO: 43的核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，本文提供一種核酸序列，其包含SEQ ID NO: 35 (其中x為2至10或大於10)、SEQ ID NO: 41及SEQ ID NO: 44；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種核酸序列，其包含SEQ ID NO: 36、SEQ ID NO: 41及SEQ ID NO: 44；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種編碼串聯重複序列、E蛋白及M蛋白之核酸，其中該核酸已經最佳化以用於在MVA病毒載體中表現，例如如SEQ ID NO: 37、42及45中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，核酸序列編碼額外胺基酸序列，諸如標籤，例如C端標籤，諸如適合在分析偵測期間使用之EPEA。核酸序列可進一步包含適合的啟動子序列，諸如(但不限於)衍生於pmH5、p11、pSyn、pHyb或任何其他適合的啟動子序列之彼等啟動子序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適合的轉譯起始序列，諸如Kozak共有序列。另外，核酸序列可在蛋白質或標籤之最後一個胺基酸序列後在核酸序列之3'端處包括適當的終止密碼子，例如TAA、TAG或TGA或其組合或多個。此外，核酸序列可在各所編碼蛋白質之最後一個終止密碼子之3'包括牛痘病毒終止序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適用於產生穿梭載體之限制酶位點，以易於插入抗原序列。用於插入之編碼串聯重複序列、E蛋白及M蛋白之例示性核酸序列提供為SEQ ID NO: 73或74。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 73 (圖4B-4C)之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。在一些實施例中，rMVA包含SEQ ID NO: 74 (圖4D-4E)之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。
替代地，提供一種rMVA病毒載體，其編碼串聯重複序列、SARS-CoV2之套膜(E)蛋白及膜(M)蛋白，其中該串聯重複序列衍生於S蛋白RBD域之線性抗原決定基，且在其NH端上側接SP肽(例如SEQ ID NO: 55)，且在其羧基端上側接STM (例如SEQ ID NO: 57)。在一些實施例中，串聯重複序列例如為(RBD-間隔子-RBD-間隔子)X 或(RBD序列1-間隔子-RBD序列2-間隔子)X ，其中RBD為任何S蛋白RBD肽，RBD序列1為第一S蛋白RBD肽，且RBD序列2為第二S蛋白RBD肽，且其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施例中，RBD肽係選自一或多個衍生於SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸331至524或SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸327至524之肽。在一些實施例中，由rMVA編碼之線性抗原決定基係選自SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸504至524及胺基酸473至490。在一些實施例中，由rMVA編碼之線性抗原決定基為SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸504至524及胺基酸473至490。在一些實施例中，插入至MVA病毒載體中之序列編碼含有串聯重複序列((胺基酸504-524)-間隔子-(胺基酸473-490)-間隔子)x之S蛋白RBD肽，其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施例中，x = 3至7。在一些實施例中，x=5。
在一些實施例中，核酸經排列以使得SP-串聯重複序列-TM、E及M編碼序列為線性相鄰的。在圖4F中提供適合於在表現後形成VLP之編碼SP-串聯重複序列-TM、E蛋白及M蛋白之單一MVA插入物的線性表示。在一些實施例中，SP-串聯重複序列-TM表現為，如SEQ ID NO: 75中所提供，其中x為2至10；E蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 40中所提供；且M蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 43中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，本文提供一種質體或MVA病毒載體，其含有編碼SEQ ID NO: 77、SEQ ID NO: 40及SEQ ID NO: 43的核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，本文提供一種核酸序列，其包含SEQ ID NO: 76 (其中x為2至10)、SEQ ID NO: 41及SEQ ID NO: 44；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種核酸序列，其包含SEQ ID NO: 78、SEQ ID NO: 41及SEQ ID NO: 44；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種編碼SP-串聯重複序列-TM、E蛋白及M蛋白之核酸，其中該核酸已經最佳化以用於在MVA病毒載體中表現，例如如SEQ ID NO: 76或78、42及45中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。
在一些實施例中，SP-串聯重複序列-TM表現為，如SEQ ID NO: 79中所提供，其中x為2至10；E蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 40中所提供；且M蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 43中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，本文提供一種質體或MVA病毒載體，其含有編碼SEQ ID NO: 80、SEQ ID NO: 40及SEQ ID NO: 43的核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。
在一些實施例中，核酸序列編碼額外胺基酸序列，諸如標籤，例如C端標籤，諸如適合在分析偵測期間使用之EPEA。核酸序列可進一步包含適合的啟動子序列，諸如(但不限於)衍生於pmH5、p11、pSyn、pHyb或任何其他適合的啟動子序列之彼等啟動子序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適合的轉譯起始序列，諸如Kozak共有序列。另外，核酸序列可在蛋白質或標籤之最後一個胺基酸序列後在核酸序列之3'端處包括適當的終止密碼子，例如TAA、TAG或TGA或其組合或多個。此外，核酸序列可在各所編碼蛋白質之最後一個終止密碼子之3'包括牛痘病毒終止序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適用於產生穿梭載體之限制酶位點，以易於插入抗原序列。用於插入之編碼串聯重複序列、E蛋白及M蛋白之例示性核酸序列提供為SEQ ID NO: 81或82。在一些實施例中，rMVA包含選自SEQ ID NO: 81 (圖4G-4H)之核酸序列；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。在一些實施例中，rMVA包含選自SEQ ID NO: 82 (圖4I-4J)之核酸序列；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。表 13 ： SP-RBD 串聯重複序列 -TM
SEQ ID NO: 75 - SARS-CoV2 S蛋白SP-RBD串聯重複序列-TM序列之胺基酸序列. MFVFLVLLPLVSS(YQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVEGFNCYFGPGPG)xWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT，其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9或10。
SEQ ID NO: 76 - SARS-CoV2 S蛋白SP-RBD串聯重複序列-TM序列之核酸序列. ATGTTTGTTTTTCTTGTTTTATTGCCACTAGTCTCTAGT(TACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTGGTCCTGGACCCGGTTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTGGTCCTGGACCCGGT)xTGGTACATTTGGCTAGGTTTTATAGCTGGCTTGATTGCCATAGTAATGGTGACAATTATGCTTTGCTGTATGACCAGTTGCTGTAGTTGTCTCAAGGGCTGTTGTTCTTGTGGATCCTGCTGCAAATTTGATGAAGACGACTCTGAGCCAGTGCTCAAAGGAGTCAAATTACATTACACA    其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9或10。
SEQ ID NO: 77 - SARS-CoV2 S蛋白SP-RBD串聯重複序列，x = 5-TM之胺基酸序列 MFVFLVLLPLVSSYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVEGFNCYFGPGPGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVEGFNCYFGPGPGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVEGFNCYFGPGPGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVEGFNCYFGPGPGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVEGFNCYFGPGPGWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
SEQ ID NO: 78 - SARS-CoV2 S蛋白RBD串聯重複序列之核酸序列，x =5；經最佳化的 ATGTTCGTGTTCCTAGTCCTACTACCGCTAGTCTCTTCTTATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTAGGTCCTGGACCCGGTTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCGGTCCTGGACCCGGTTATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTAGGTCCTGGACCCGGTTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCGGTCCTGGACCCGGTTATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTAGGTCCTGGACCCGGTTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCGGTCCTGGACCCGGTTATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTAGGTCCTGGACCCGGTTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCGGTCCTGGACCCGGTTATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTAGGTCCTGGACCCGGTTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCGGTCCTGGACCCGGTTGGTACATCTGGCTAGGATTCATTGCTGGACTAATTGCGATCGTCATGGTCACCATCATGCTATGCTGTATGACCTCCTGTTGCTCCTGTCTAAAGGGATGTTGTTCCTGCGGATCCTGTTGCAAGTTCGATGAAGATGATAGTGAACCGGTCCTAAAGGGTGTCAAGCTACACTACACA
SEQ ID NO: 79 - SARS-CoV2 S蛋白SP-RBD串聯重複序列-TM序列之胺基酸序列(E484K) MFVFLVLLPLVSS(YQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVKGFNCYFGPGPG)xWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT，其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9或10。
SEQ ID NO: 80 - SARS-CoV2 S蛋白SP-RBD串聯重複序列，x = 5-TM之胺基酸序列(E484K) MFVFLVLLPLVSSYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVEGFNCYFGPGPGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVKGFNCYFGPGPGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVEGFNCYFGPGPGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVEGFNCYFGPGPGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVEGFNCYFGPGPGWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT
替代地，提供一種rMVA病毒載體，其編碼SARS-CoV2之經修飾、經截短形式之棘(S)蛋白、套膜(E)蛋白及膜(M)蛋白，其中該經截短S蛋白包含S1 + S2區且缺乏羧基端，且其中在表現後，該等蛋白質形成VLP。在一些實施例中，核酸經排列以使得經截短S、E及M編碼序列為線性相鄰的。在一些實施例中，經截短S蛋白包含胺基酸1至1213 (SEQ ID NO: 13)。在圖6A中提供適合於在表現後形成VLP之編碼經截短S蛋白、E蛋白及M蛋白之單一MVA插入物的線性表示。在一些實施例中，經截短S蛋白含有胺基酸986及987處之兩個脯胺酸取代，例如如圖6H中所例示。在一些實施例中，經截短S蛋白表現為，如SEQ ID NO: 13或14或18或19中所提供；E蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 40中所提供；且M蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 43中所提供，或與其至少75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，本文提供一種質體或MVA病毒載體，其含有編碼SEQ ID NO: 13或14或18或19、40及43之核酸序列或與其至少75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種核酸序列，其包含SEQ ID NO: 15或17、41及44；或與其至少75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種編碼經截短S蛋白、E蛋白及M蛋白之核酸，其中該核酸已經最佳化以用於在MVA病毒載體中表現，例如如SEQ ID NO: 16或17、42及45中所提供，或與其至少75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，核酸序列編碼額外胺基酸序列，諸如標籤，例如C端標籤，諸如EPEA。核酸序列可進一步包含適合的啟動子序列，諸如(但不限於)衍生於pmH5、p11、pSyn、pHyb或任何其他適合的啟動子序列之彼等啟動子序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適合的轉譯起始序列，諸如Kozak共有序列。另外，核酸序列可在蛋白質或標籤之最後一個胺基酸序列後在核酸序列之3'端處包括適當的終止密碼子，例如TAA、TAG或TGA或其組合或多個。此外，核酸序列可在各所編碼蛋白質之最後一個終止密碼子之3'包括牛痘病毒終止序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適用於產生穿梭載體之限制酶位點，以易於插入抗原序列。用於插入之編碼經截短S蛋白、E蛋白及M蛋白之例示性核酸序列在下文提供為SEQ ID NO: 83或84。用於插入之編碼經截短S蛋白+K986P及V987P、E蛋白及M蛋白之例示性核酸序列在下文提供為SEQ ID NO: 85或86。在一些實施例中，rMVA包含選自SEQ ID NO: 83 (圖6B-6C-6D)、84 (圖6E-6F-6G)、85 (圖6I-6J-6K)或86 (圖6L-6M-6N)之核酸序列；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。
S 片段 -GP 融合物 VLP 在一替代態樣中，本文提供一種rMVA病毒載體，其設計成表現呈框內融合蛋白形式之一或多種SARS-CoV2 S蛋白抗原肽，其中該融合蛋白包含套膜醣蛋白之訊息序列(GPS)、SARS-CoV2 S蛋白或蛋白片段、套膜醣蛋白之跨膜域(GPTM)及(視情況)套膜醣蛋白之胞質域(GPCD)，其中套膜醣蛋白不來源於冠狀病毒。rMVA病毒載體進一步設計成表現來自套膜醣蛋白所來源的相同病毒的基質蛋白。藉由提供與GP蛋白呈融合物形式之SARS-CoV2 S蛋白片段，S蛋白片段-GP融合物可與rMVA表現的基質蛋白形成VLP。在一些實施例中，rMVA病毒載體進一步表現SARS-CoV2之膜(M)蛋白及套膜(E)蛋白，當表現時，該等蛋白能夠形成個別的VLP。因此，自單一rMVA病毒載體，能夠產生兩種展示SARS-CoV2之抗原性抗原決定基之VLP。
適合用於本發明之醣蛋白及基質蛋白包括(但不限於)來源於以下之彼等：絲狀病毒科，例如馬堡病毒、埃博拉病毒或蘇丹病毒；逆轉錄病毒科，例如1型人類免疫缺乏病毒(HIV-1)；沙粒病毒科，例如拉沙病毒；黃病毒科，例如登革熱病毒及茲卡病毒。
在特定實施例中，醣蛋白及基質蛋白來源於馬堡病毒(MARV)。在特定實施例中，醣蛋白來源於MARV GP蛋白(Genbank登錄號AFV31202.1)。MARV GP蛋白之胺基酸序列提供為下表14中之SEQ ID NO: 87。在特定實施例中，MARV GPS域包含醣蛋白之胺基酸1至19 (MWTTCFFISLILIQGIKTL) (SEQ ID NO: 88，其可例如由MVA最佳化核酸序列SEQ ID NO: 89編碼)；GPTM域包含醣蛋白之胺基酸序列644-673 (WWTSDWGVLTNLGILLLLSIAVLIALSCICRIFTKYIG) (SEQ ID NO: 90，其可例如由MVA最佳化核酸序列SEQ ID NO: 91編碼)。
MARV VP40胺基酸序列可在GenBank登錄號JX458834獲得，且在下表14中提供為SEQ ID NO: 92，其可例如由MVA最佳化核酸序列SEQ ID NO: 93編碼。在一些實施例中，插入至rMVA中之核酸為Seq.ID. No. 94或與其70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高同源之核酸序列。表 14 ： 用於 S 蛋白融合物構築體中之 MARV 醣蛋白域
SEQ ID NO: 87 - GP MARV胺基酸序列 MWTTCFFISLILIQGIKTLPILEIASNDQPQNVDSVCSGTLQKTEDVHLMGFTLSGQKVADSPLEASKRWAFRTGVPPKNVEYTEGEEAKTCYNISVTDPSGKSLLLDPPTNVRDYPKCKTIHHIQGQNPHAQGIALHLWGAFFLYDRIASTTMYRGKVFTEGNIAAMIVNKTVHKMIFSRQGQGYRHMNLTSTNKYWTSSNGTQTNDTGCFGTLQEYNSTKNQTCAPSKTPPPPPTAHPEIKPTSTPTDATRLNTTNPNSDDEDLTTSGSGSGEQEPYTTSDAVTKQGLSSTMPPTLSPQPGTPQQGGNNTNHSQDAATELDNTNTTAQPPMPSHNTTTISTNNTSKHNLSTLSEPPQNTTNPNTQSMATENEKTSAPPKTTLPPTESPTTEKSTNNTKSPTTMEPNTTNGHFTSPSSTPNSTTQHLIYFRRKRSILWREGDMFPFLDGLINAPIDFDPVPNTKTIFDESSSSGASAEEDQHASSNISLTLSYLPHTSENTAYSGENENDCDAELRIWSVQEDDLAAGLSWIPFFGPGIEGLYTAGLIKNQNNLVCRLRRLANQTAKSLELLLRVTTEERTFSLINRHAIDFLLTRWGGTCKVLGPDCCIGIEDLSRNISEQIDQIKKDEQKEGTGWGLGGKWWTSDWGVLTNLGILLLLSIAVLIALSCICRIFTKYIG
SEQ ID NO: 88 - GP MARV之訊息肽胺基酸序列 MWTTCFFISLILIQGIKTL
SEQ ID NO: 89 - 經最佳化之GP MARV之訊息肽核酸序列 ATGTGGACGACCTGCTTCTTCATCTCCCTAATCCTAATCCAGGGAATCAAGACCCTA
SEQ ID NO: 90 - GP MARV之跨膜域胺基酸序列 WWTSDWGVLTNLGILLLLSIAVLIALSCICRIFTKYIG
SEQ ID NO: 91 - 經最佳化之GP MARV之跨膜域核酸序列 TGGTGGACATCTGACTGGGGAGTCCTAACGAACCTAGGAATCCTACTACTATTGTCGATCGCGGTCCTAATCGCGCTATCCTGTATCTGTAGAATCTTCACCAAGTACATCGGA
SEQ ID NO: 92 - MARVVP 40胺基酸序列 MASSSNYNTYMQYLNPPPYADHGANQLIPADQLSNQHGITPNYVGDLNLDDQFKGNVCHAFTLEAIIDISAYNERTVKGVPAWLPLGIMSNFEYPLAHTVAALLTGSYTITQFTHNGQKFVRVNRLGTGIPAHPLRMLREGNQAFIQNMVIPRNFSTNQFTYNLTNLVLSVQKLPDDAWRPSKDKLIGNTMHPAISIHPNLPPIVLPTVKKQAYRQHKNPNNGPLLAISGILHQLRVEKVPEKTSLFRISLPADMFSVKEGMMKKRGESSPVVYFQAPENFPLNGFNNRQVVLAYANPTLSAI
SEQ ID NO: 93 - 經最佳化之MARVVP 40核酸序列 ATGGCGTCTAGTTCTAATTATAATACTTATATGCAATATCTAAATCCACCACCATATGCGGATCATGGTGCTAATCAACTAATTCCAGCGGATCAACTATCTAATCAACATGGAATTACACCAAATTATGTTGGAGATCTAAATCTAGATGATCAGTTTAAAGGAAATGTTTGTCATGCGTTTACACTAGAAGCGATTATTGATATTTCTGCGTATAATGAAAGAACAGTAAAAGGTGTACCAGCTTGGCTACCACTAGGAATTATGTCTAATTTTGAATATCCACTAGCGCATACAGTAGCGGCGCTATTGACAGGATCTTATACAATTACACAGTTTACACATAATGGACAAAAGTTTGTTAGAGTAAATAGACTAGGAACTGGAATACCAGCGCATCCACTAAGAATGCTAAGAGAAGGAAATCAAGCTTTTATTCAAAATATGGTTATTCCAAGAAATTTCTCTACAAATCAGTTTACTTATAATCTAACTAATCTAGTACTATCTGTACAAAAGCTACCAGATGATGCTTGGAGACCATCTAAAGATAAACTAATTGGAAATACAATGCATCCAGCGATTTCTATTCATCCAAATCTACCACCAATAGTACTACCAACTGTAAAGAAACAAGCGTATAGACAACATAAGAATCCAAATAATGGACCACTATTGGCGATTTCTGGAATTCTACATCAACTAAGAGTAGAAAAGGTACCAGAAAAGACATCTTTGTTTAGAATTTCTCTACCAGCGGATATGTTTTCTGTAAAAGAAGGAATGATGAAGAAAAGAGGAGAATCTTCTCCAGTAGTATATTTTCAAGCGCCAGAAAATTTTCCATTGAATGGTTTTAATAATAGACAAGTAGTACTAGCGTATGCGAATCCAACACTATCTGCGATATAATAA
SEQ ID NO: 94 - 馬堡VP40經最佳化之mH5牛痘啟動子 AAAAATTGAAAATAAATACAAAGGTTCTTGAGGGTTGTGTTAAATTGAAAGCGAGAAATAATCATAAATGGCGTCTAGTTCTAATTATAATACTTATATGCAATATCTAAATCCACCACCATATGCGGATCATGGTGCTAATCAACTAATTCCAGCGGATCAACTATCTAATCAACATGGAATTACACCAAATTATGTTGGAGATCTAAATCTAGATGATCAGTTTAAAGGAAATGTTTGTCATGCGTTTACACTAGAAGCGATTATTGATATTTCTGCGTATAATGAAAGAACAGTAAAAGGTGTACCAGCTTGGCTACCACTAGGAATTATGTCTAATTTTGAATATCCACTAGCGCATACAGTAGCGGCGCTATTGACAGGATCTTATACAATTACACAGTTTACACATAATGGACAAAAGTTTGTTAGAGTAAATAGACTAGGAACTGGAATACCAGCGCATCCACTAAGAATGCTAAGAGAAGGAAATCAAGCTTTTATTCAAAATATGGTTATTCCAAGAAATTTCTCTACAAATCAGTTTACTTATAATCTAACTAATCTAGTACTATCTGTACAAAAGCTACCAGATGATGCTTGGAGACCATCTAAAGATAAACTAATTGGAAATACAATGCATCCAGCGATTTCTATTCATCCAAATCTACCACCAATAGTACTACCAACTGTAAAGAAACAAGCGTATAGACAACATAAGAATCCAAATAATGGACCACTATTGGCGATTTCTGGAATTCTACATCAACTAAGAGTAGAAAAGGTACCAGAAAAGACATCTTTGTTTAGAATTTCTCTACCAGCGGATATGTTTTCTGTAAAAGAAGGAATGATGAAGAAAAGAGGAGAATCTTCTCCAGTAGTATATTTTCAAGCGCCAGAAAATTTTCCATTGAATGGTTTTAATAATAGACAAGTAGTACTAGCGTATGCGAATCCAACACTATCTGCGATATAATAATAATAATTTTTAT
在一個替代例中，提供一種rMVA病毒載體，其編碼與GP蛋白融合之S蛋白或蛋白片段、來自SARS-CoV2之E蛋白、來自SARS-CoV2之M蛋白及基質蛋白。在一些實施例中，將S蛋白或蛋白片段-GP融合物、E蛋白及M蛋白編碼核酸序列插入於rMVA中之單個插入位點中，且將MARV VP40編碼核酸序列插入在分開的插入位點處。在一些實施例中，將S蛋白或蛋白片段-GP融合物、E蛋白及M蛋白以及MARV VP40編碼核酸序列插入於rMVA中之單個插入位點中。
在一些實施例中，S蛋白片段-GP融合蛋白包含S蛋白受體結合域(RBD)。在一些實施例中，RBD肽來源於S蛋白之胺基酸327至524。在一些實施例中，RBD肽來源於S蛋白之胺基酸331至524。在一些實施例中，RBD為冠狀病毒共有序列。RBD肽在其NH端側上側接來源於MARV醣蛋白之胺基酸1至19 (SEQ ID NO: 88)之訊息肽，且在其羧基端側上側接MARV醣蛋白之跨膜域(SEQ ID NO: 90)。所表現之GPS-RBD (胺基酸327-524)-GPTM肽提供於下表15中之SEQ ID NO: 95中，其可例如由例如SEQ ID NO: 97中提供之MVA最佳化核酸序列編碼。所表現之GPS-RBD (胺基酸331-524)-GPTM肽提供於下表15中之SEQ ID NO: 96中，其可例如由例如SEQ ID NO: 98中提供之MVA最佳化核酸序列編碼。在一些實施例中，核酸經排列以使得GPS-RBD-GPTM、E及M編碼序列為線性相鄰的。在圖7A中提供包含MARV VP 40插入物及適合於在表現後形成VLP之編碼GPS-RBD-TM、E蛋白及M蛋白之個別的單一MVA插入物的rMVA的線性表示。在圖7B中提供包含MARV VP 40插入物及適合於在表現後形成VLP之編碼GPS-RBD (胺基酸331-524)-TM、E蛋白及M蛋白之個別的單一MVA插入物的rMVA的線性表示。在圖7G中提供包含MARV VP 40插入物及適合於在表現後形成VLP之編碼GPS-RBD (胺基酸327-524)-TM、E蛋白及M蛋白之個別的單一MVA插入物的rMVA的線性表示。在一些實施例中，GPS-RBD-GPTM表現為，如SEQ ID NO: 95 (RBD胺基酸327-524)或SEQ ID NO: 96 (RBD胺基酸331-524)或SEQ ID NO: 99 (RBD胺基酸327-524，E484K)或SEQ ID NO: 100 (RBD胺基酸331-524；E484K)中所提供；E蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 40中所提供；M蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 43中所提供；且MARV VP蛋白表現為，如SEQ ID NO: 92中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，本文提供一種質體或MVA病毒載體，其含有編碼SEQ ID NO: 95或96或99或100、40、43及92之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種核酸序列，其包含SEQ ID NO: 97或98、41及44；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種編碼GPS-RBD-GPTM、E蛋白及M蛋白之核酸，其中該核酸已經最佳化以用於在MVA病毒載體中表現，例如如SEQ ID NO: 97或98、42及45中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，核酸序列編碼額外胺基酸序列，諸如標籤，例如C端標籤，諸如適合在分析偵測期間使用之EPEA。核酸序列可進一步包含適合的啟動子序列，諸如衍生於pmH5、p11、pSyn、pHyb或任何其他適合的啟動子序列之彼等啟動子序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適合的轉譯起始序列，諸如Kozak共有序列。另外，核酸序列可在蛋白質或標籤之最後一個胺基酸序列後在核酸序列之3'端處包括適當的終止密碼子，例如TAA、TAG或TGA或其組合或多個。此外，核酸序列可在各所編碼蛋白質之最後一個終止密碼子之3'包括牛痘病毒終止序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適用於產生穿梭載體之限制酶位點，以易於插入抗原序列。用於插入之編碼GPS-RBD-GPTM、E蛋白及M蛋白之例示性核酸序列提供為SEQ ID NO: 101、102、103及104。在一些實施例中，rMVA包含選自SEQ ID NO: 101 (圖7H-7I)、102 (圖7J-7K)、103 (圖7C-7D)或104 (圖7E-7F)之核酸序列；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。在一些實施例中，rMVA進一步包含SEQ ID NO: 93或94之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。表 15 ： GPS-RBD-GPTM 融合物
SEQ ID NO: 95 - GPS-RBD (胺基酸327-524)-GPTM融合肽胺基酸序列 MWTTCFFISLILIQGIKTLVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVWWTSDWGVLTNLGILLLLSIAVLIALSCICRIFTKYIG
SEQ ID NO: 96 - GPS-RBD (胺基酸331-524)-GPTM融合肽胺基酸序列 MWTTCFFISLILIQGIKTLNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVWWTSDWGVLTNLGILLLLSIAVLIALSCICRIFTKYIG
SEQ ID NO: 97 - 經最佳化之GPS-RBD (胺基酸327-524)-GPTM融合肽核酸序列 ATGTGGACGACCTGCTTCTTCATCTCCCTAATCCTAATCCAGGGAATCAAGACCCTAGTCAGATTTCCGAACATCACGAACCTATGTCCGTTCGGAGAAGTGTTCAACGCGACAAGATTTGCGTCTGTCTATGCGTGGAACAGAAAAAGAATCAGTAACTGCGTCGCGGACTACTCCGTCCTATACAACTCTGCCTCTTTCTCCACGTTCAAATGCTACGGTGTATCTCCGACAAAGCTAAACGATCTATGCTTCACCAACGTCTACGCGGACTCCTTCGTAATCAGAGGAGATGAAGTTAGACAGATTGCGCCGGGACAAACTGGAAAGATCGCGGATTATAACTACAAGCTACCGGACGACTTCACCGGATGTGTAATTGCGTGGAATTCGAACAACCTAGACTCCAAAGTCGGAGGAAACTACAACTACTTGTACAGACTATTCAGAAAGTCCAACCTAAAGCCGTTCGAGAGAGACATCTCCACCGAAATCTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCCCGCTACAGTCTTACGGATTTCAACCGACAAACGGTGTAGGATATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTATGGTGGACATCTGACTGGGGAGTCCTAACGAACCTAGGAATCCTACTACTATTGTCGATCGCGGTCCTAATCGCGCTATCCTGTATCTGTAGAATCTTCACCAAGTACATCGGA
SEQ ID NO: 98 - 經最佳化之GPS-RBD (胺基酸331-524)-GPTM融合肽核酸序列 ATGTGGACGACCTGCTTCTTCATCTCCCTAATCCTAATCCAGGGAATCAAGACCCTAAACATCACGAACCTATGTCCGTTCGGAGAAGTGTTCAACGCGACAAGATTTGCGTCTGTCTATGCGTGGAACAGAAAAAGAATCAGTAACTGCGTCGCGGACTACTCCGTCCTATACAACTCTGCCTCTTTCTCCACGTTCAAATGCTACGGTGTATCTCCGACAAAGCTAAACGATCTATGCTTCACCAACGTCTACGCGGACTCCTTCGTAATCAGAGGAGATGAAGTTAGACAGATTGCGCCGGGACAAACTGGAAAGATCGCGGATTATAACTACAAGCTACCGGACGACTTCACCGGATGTGTAATTGCGTGGAATTCGAACAACCTAGACTCCAAAGTCGGAGGAAACTACAACTACTTGTACAGACTATTCAGAAAGTCCAACCTAAAGCCGTTCGAGAGAGACATCTCCACCGAAATCTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCCCGCTACAGTCTTACGGATTTCAACCGACAAACGGTGTAGGATATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTATGGTGGACATCTGACTGGGGAGTCCTAACGAACCTAGGAATCCTACTACTATTGTCGATCGCGGTCCTAATCGCGCTATCCTGTATCTGTAGAATCTTCACCAAGTACATCGGA
SEQ ID NO: 99 - GPS-RBD (胺基酸327-524)-GPTM融合肽胺基酸序列(K417T；E484K；N501Y) MWTTCFFISLILIQGIKTLVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVWWTSDWGVLTNLGILLLLSIAVLIALSCICRIFTKYIG
SEQ ID NO: 100 - GPS-RBD (胺基酸331-524)-GPTM融合肽胺基酸序列(K417T；E484K；N501Y) MWTTCFFISLILIQGIKTLNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVWWTSDWGVLTNLGILLLLSIAVLIALSCICRIFTKYIG
在一個替代例中，提供一種rMVA病毒載體，其編碼與GP蛋白融合之S蛋白肽、來自SARS-CoV2之E蛋白、來自SARS-CoV2之M蛋白及基質蛋白，其中S蛋白片段-GP融合蛋白包含S蛋白串聯重複序列。S蛋白串聯重複序列在其NH端側上側接來源於MARV醣蛋白之胺基酸1至19 (SEQ ID NO: 88)之訊息肽，且在其羧基端側上側接MARV醣蛋白之跨膜域(SEQ ID NO: 90)。在一些實施例中，串聯重複序列例如為(RBD-間隔子-RBD-間隔子)X 或(RBD序列1-間隔子-RBD序列2-間隔子)X ，其中RBD為任何S蛋白RBD肽，RBD序列1為第一S蛋白RBD肽，且RBD序列2為第二S蛋白RBD肽，且其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施例中，RBD肽係選自一或多個來源於SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸331至524之肽。在一些實施例中，由rMVA編碼之線性抗原決定基係選自SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸504至524及胺基酸473至490。在一些實施例中，由rMVA編碼之線性抗原決定基為SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸504至524及胺基酸473至490。在一些實施例中，串聯重複序列為((胺基酸504-524)-間隔子-(胺基酸473-490)-間隔子)x，其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施例中，x = 3至7。在一些實施例中，x=5。包含GPS-串聯重複序列-GPTM之例示性胺基酸序列在表16中提供為SEQ ID NO: 105，其可由MVA最佳化核酸序列SEQ ID NO: 106編碼。包含GPS-串聯重複序列-GPTM (其中對於串聯重複序列，x=5)之例示性胺基酸序列在表16中提供為SEQ ID NO: 107，其可由MVA最佳化核酸序列SEQ ID NO: 108編碼。
在一些實施例中，核酸經排列以使得GPS-串聯重複序列-GPTM肽、E及M編碼序列為線性相鄰的。在圖8A中提供包含MARV VP 40插入物及適合於在表現後形成VLP之編碼GPS-串聯重複序列-GPTM肽、E蛋白及M蛋白之個別的單一MVA插入物的rMVA的線性表示。在一些實施例中，GPS-串聯重複序列-GPTM肽表現為，如SEQ ID NO: 105或107或109或110中所提供；E蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 40中所提供；M蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 43中所提供；且MARV VP蛋白表現為，如SEQ ID NO: 92中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，本文提供一種質體或MVA病毒載體，其含有編碼SEQ ID NO: 105或107或109或110、40、及43以及92之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種核酸序列，其包含SEQ ID NO: 106或108、41及44；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種編碼GPS-串聯重複序列-GPTM肽、E蛋白及M蛋白之核酸，其中該核酸已經最佳化以用於在MVA病毒載體中表現，例如如SEQ ID NO: 106或108、42及45中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，核酸序列編碼額外胺基酸序列，諸如標籤，例如C端標籤，諸如適合在分析偵測期間使用之EPEA。核酸序列可進一步包含適合的啟動子序列，諸如(但不限於)衍生於pmH5、p11、pSyn、pHyb或任何其他適合的啟動子序列之彼等啟動子序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適合的轉譯起始序列，諸如Kozak共有序列。另外，核酸序列可在蛋白質或標籤之最後一個胺基酸序列後在核酸序列之3'端處包括適當的終止密碼子，例如TAA、TAG或TGA或其組合或多個。此外，核酸序列可在各所編碼蛋白質之最後一個終止密碼子之3'包括牛痘病毒終止序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適用於產生穿梭載體之限制酶位點，以易於插入抗原序列。用於插入之編碼GPS-串聯重複序列-GPTM肽、E蛋白及M蛋白之例示性核酸序列提供為SEQ ID NO: 111及112。在一些實施例中，rMVA包含選自SEQ ID NO: 111 (圖8B-8C)或112 (圖8D-8E)之核酸序列；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。在一些實施例中，rMVA進一步包含SEQ ID NO: 93或94之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。表 16 ： GPS-RBD 串聯重複序列 -GPTM
SEQ ID NO: 105 - GPS-RBD串聯重複序列-GPTM胺基酸序列 MWTTCFFISLILIQGIKTL(YQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVEGFNCYFGPGPG)xWWTSDWGVLTNLGILLLLSIAVLIALSCICRIFTKYIG 其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9或10。
SEQ ID NO: 106 - 經最佳化之GPS-RBD串聯重複序列-GPTM核酸序列 ATGTGGACGACCTGCTTCTTCATCTCCCTAATCCTAATCCAGGGAATCAAGACCCTA(TACCAACCATACAGAGTAGTAGTACTTTCTTTTGAACTTCTACATGCACCAGCAACTGTTGGTCCTGGACCCGGTTATCAGGCCGGTAGCACACCTTGTAATGGTGTTGAAGGTTTTAATTGTTACTTTGGTCCTGGACCCGGT)xTGGTGGACATCTGACTGGGGAGTCCTAACGAACCTAGGAATCCTACTACTATTGTCGATCGCGGTCCTAATCGCGCTATCCTGTATCTGTAGAATCTTCACCAAGTACATCGGA 其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9或10。
SEQ ID NO: 107 - GPS-RBD串聯重複序列-GPTM胺基酸序列，其中x = 5 MWTTCFFISLILIQGIKTLYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVEGFNCYFGPGPGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVEGFNCYFGPGPGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVEGFNCYFGPGPGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVEGFNCYFGPGPGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVEGFNCYFGPGPGWWTSDWGVLTNLGILLLLSIAVLIALSCICRIFTKYIG
SEQ ID NO: 108 - 經最佳化之GPS-RBD串聯重複序列-GPTM核酸序列，其中x = 5 ATGTGGACGACCTGCTTCTTCATCTCCCTAATCCTAATCCAGGGAATCAAGACCCTATATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTAGGTCCTGGACCCGGTTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCGGTCCTGGACCCGGTTATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTAGGTCCTGGACCCGGTTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCGGTCCTGGACCCGGTTATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTAGGTCCTGGACCCGGTTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCGGTCCTGGACCCGGTTATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTAGGTCCTGGACCCGGTTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCGGTCCTGGACCCGGTTATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTAGGTCCTGGACCCGGTTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCGGTCCTGGACCCGGTTGGTGGACATCTGACTGGGGAGTCCTAACGAACCTAGGAATCCTACTACTATTGTCGATCGCGGTCCTAATCGCGCTATCCTGTATCTGTAGAATCTTCACCAAGTACATCGGA
SEQ ID NO: 109 - GPS-RBD串聯重複序列-GPTM胺基酸序列(E484K) MWTTCFFISLILIQGIKTL(YQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVKGFNCYFGPGPG)xWWTSDWGVLTNLGILLLLSIAVLIALSCICRIFTKYIG 其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9或10。
SEQ ID NO: 110 - GPS-RBD串聯重複序列-GPTM胺基酸序列，其中x = 5 (E484K) MWTTCFFISLILIQGIKTLYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVKGFNCYFGPGPGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVKGFNCYFGPGPGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVKGFNCYFGPGPGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVKGFNCYFGPGPGYQPYRVVVLSFELLHAPATVGPGPGYQAGSTPCNGVKGFNCYFGPGPGWWTSDWGVLTNLGILLLLSIAVLIALSCICRIFTKYIG
在一個替代例中，提供一種rMVA病毒載體，其編碼與GP蛋白融合之經修飾之S蛋白肽、來自SARS-CoV2之E蛋白、來自SARS-CoV2之M蛋白及基質蛋白，其中經修飾之S蛋白包含缺少蛋白質之羧基端之S1 + S2經截短蛋白。在一些實施例中，S1 + S2經截短蛋白包含S蛋白之胺基酸2至1213。在一些實施例中，S1 + S2經截短蛋白包含S蛋白之胺基酸2至1213；及胺基酸986及/或987處之脯胺酸取代(S1 + S2經截短蛋白+ K986P及V987P)。在一些實施例中，將經截短S蛋白-GP融合物、E蛋白及M蛋白編碼核酸序列插入於rMVA中之單個插入位點中，且將MARV VP40編碼核酸序列插入在分開的插入位點處。
在一些實施例中，經截短S蛋白-GP融合蛋白包含S蛋白之胺基酸2至1213。經截短S蛋白在其NH端側上側接來源於MARV醣蛋白之胺基酸1至19 (SEQ ID NO: 88)之訊息肽，且在其羧基端側上側接MARV醣蛋白之跨膜域(SEQ ID NO: 90)。所表現之GPS-經截短S蛋白-GPTM肽提供於下表17中之SEQ ID NO: 113中，其可例如由例如SEQ ID NO: 115中提供之MVA最佳化核酸序列編碼。所表現之GPS-經截短S蛋白+ K986P及V987P-GPTM肽提供於下表17中之SEQ ID NO: 114中，其可例如由例如SEQ ID NO: 116中提供之MVA最佳化核酸序列編碼。所表現之GPS-經截短S蛋白-GPTM肽提供於下表17中之SEQ ID NO: 117中，其進一步包括取代K417T、E484K及N501Y。所表現之GPS-經截短S蛋白+ K986P、V987P、K417T、E484K及N501Y-GPTM肽提供於下表17中之SEQ ID NO: 118中。在一些實施例中，核酸經排列以使得GPS-經截短S-GPTM、E及M編碼序列為線性相鄰的。在圖9A中提供包含MARV VP 40插入物及適合於在表現後形成VLP之編碼GPS-經截短S-TM、E蛋白及M蛋白之個別的單一MVA插入物的rMVA的線性表示。在一些實施例中，核酸經排列以使得GPS-經截短S + K986P及V987P-GPTM、E及M編碼序列為線性相鄰的。在圖9H中提供包含MARV VP 40插入物及適合於在表現後形成VLP之編碼GPS-經截短S + K986P及V987P-TM、E蛋白及M蛋白之個別的單一MVA插入物的rMVA的線性表示。在一些實施例中，GPS-經截短S-GPTM表現為，如SEQ ID NO: 113或SEQ ID NO: 114或SEQ ID NO: 117或SEQ ID NO: 118中所提供；E蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 40中所提供；M蛋白表現為全長蛋白，如SEQ ID NO: 43中所提供；且MARV VP蛋白表現為，如SEQ ID NO: 92中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，本文提供一種質體或MVA病毒載體，其含有編碼SEQ ID NO: 113或114或117或118、40、及43以及92之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種核酸序列，其包含SEQ ID NO: 115或116、41及44；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種編碼GPS-經截短S-GPTM、E蛋白及M蛋白之核酸，其中該核酸已經最佳化以用於在MVA病毒載體中表現，例如如SEQ ID NO: 115或116、42及45中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，核酸序列編碼額外胺基酸序列，諸如標籤，例如C端標籤，諸如適合在分析偵測期間使用之EPEA。核酸序列可進一步包含適合的啟動子序列，諸如衍生於pmH5、p11、pSyn、pHyb或任何其他適合的啟動子序列之彼等啟動子序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適合的轉譯起始序列，諸如Kozak共有序列。另外，核酸序列可在蛋白質或標籤之最後一個胺基酸序列後在核酸序列之3'端處包括適當的終止密碼子，例如TAA、TAG或TGA或其組合或多個。此外，核酸序列可在各所編碼蛋白質之最後一個終止密碼子之3'包括牛痘病毒終止序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適用於產生穿梭載體之限制酶位點，以易於插入抗原序列。用於插入之編碼GPS-經截短S-GPTM或GPS-經截短S + K986P及V987P、E蛋白及M蛋白之例示性核酸序列提供為SEQ ID NO: 119、120、121或122。在一些實施例中，rMVA包含選自SEQ ID NO: 119 (圖9B-9C-9D)、120 (圖9E-9F-9G)、121 (圖9I-9J-9K)或122 (圖9L-9M-9N)之核酸序列；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。在一些實施例中，rMVA進一步包含SEQ ID NO: 93或94之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。表 17 ： GPS- 經截短 S-GPTM
SEQ ID NO: 113 - GPS-經截短S-GPTM胺基酸序列 MWTTCFFISLILIQGIKTLFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWWTSDWGVLTNLGILLLLSIAVLIALSCICRIFTKYIG
EQ ID NO: 114 - GPS-經截短S + K986P及V987P-GPTM胺基酸序列 MWTTCFFISLILIQGIKTLFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLD PP EAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWWTSDWGVLTNLGILLLLSIAVLIALSCICRIFTKYIG
SEQ ID NO: 115 - 經最佳化之GPS-經截短S-GPTM核酸序列 ATGTGGACGACCTGCTTCTTCATCTCCCTAATCCTAATCCAGGGAATCAAGACCCTATTCGTGTTCCTAGTCCTACTACCGCTAGTCTCTTCTCAGTGTGTAAACCTAACAACGAGAACACAACTACCACCGGCGTACACCAATTCTTTCACAAGAGGAGTATATTACCCGGACAAGGTGTTCAGATCCTCCGTACTACATTCTACACAGGACCTATTCCTACCGTTCTTCTCTAACGTAACATGGTTCCACGCGATCCATGTCTCTGGAACAAACGGAACGAAGAGATTCGATAACCCGGTCTTGCCGTTCAACGATGGTGTATACTTTGCGTCCACCGAGAAGTCCAACATCATCAGAGGATGGATCTTCGGAACCACCTTGGATTCTAAGACCCAGTCCTTGCTAATCGTCAACAACGCGACCAACGTCGTCATCAAAGTCTGCGAATTCCAGTTCTGTAACGACCCGTTCTTGGGAGTCTACTACCACAAGAACAACAAGTCCTGGATGGAATCCGAGTTCAGAGTCTACTCTTCCGCGAACAACTGCACCTTCGAATATGTATCTCAGCCGTTCCTAATGGACCTAGAGGGAAAGCAGGGAAACTTCAAGAACCTAAGAGAGTTCGTATTCAAGAACATCGACGGATACTTCAAGATCTACTCCAAGCACACTCCGATCAACCTAGTTAGAGATCTACCGCAAGGATTCTCTGCGCTAGAACCGTTAGTAGATTTGCCGATCGGAATCAACATCACCAGATTCCAGACACTACTAGCGCTACACAGATCTTACCTAACGCCGGGAGATTCTTCTTCTGGATGGACTGCTGGTGCTGCGGCTTATTATGTAGGATACCTACAGCCGAGAACCTTCCTATTGAAGTACAACGAAAACGGAACCATCACCGATGCCGTAGATTGTGCTCTAGATCCGCTATCCGAAACGAAGTGCACCCTAAAGTCTTTCACCGTCGAGAAGGGAATCTACCAGACCTCCAACTTTAGAGTACAGCCGACCGAATCCATCGTCAGATTTCCGAACATCACGAACCTATGTCCGTTCGGAGAAGTGTTCAACGCGACAAGATTTGCGTCTGTCTATGCGTGGAACAGAAAAAGAATCAGTAACTGCGTCGCGGACTACTCCGTCCTATACAACTCTGCCTCTTTCTCCACGTTCAAATGCTACGGTGTATCTCCGACAAAGCTAAACGATCTATGCTTCACCAACGTCTACGCGGACTCCTTCGTAATCAGAGGAGATGAAGTTAGACAGATTGCGCCGGGACAAACTGGAAAGATCGCGGATTATAACTACAAGCTACCGGACGACTTCACCGGATGTGTAATTGCGTGGAATTCGAACAACCTAGACTCCAAAGTCGGAGGAAACTACAACTACTTGTACAGACTATTCAGAAAGTCCAACCTAAAGCCGTTCGAGAGAGACATCTCCACCGAAATCTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCCCGCTACAGTCTTACGGATTTCAACCGACAAACGGTGTAGGATATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTATGTGGACCGAAAAAGTCTACCAACCTAGTCAAGAACAAATGCGTCAACTTTAACTTCAACGGACTAACCGGAACCGGTGTCCTAACCGAATCTAACAAGAAGTTTCTACCGTTCCAGCAGTTCGGAAGAGATATCGCGGATACAACAGACGCTGTCAGAGATCCGCAAACCTTGGAGATCCTAGATATCACACCGTGTTCTTTCGGTGGTGTCTCTGTAATTACTCCGGGAACGAACACCTCCAATCAAGTAGCGGTACTATACCAGGACGTGAACTGTACAGAAGTACCGGTAGCTATTCACGCGGATCAACTAACACCAACTTGGAGAGTGTACTCCACCGGATCTAACGTATTCCAAACAAGAGCGGGATGTCTAATCGGAGCGGAACACGTAAACAACTCCTACGAATGTGATATCCCGATTGGAGCGGGAATCTGTGCGTCTTACCAAACACAAACAAACTCTCCGAGAAGAGCGAGATCTGTAGCCTCTCAATCTATTATCGCCTACACCATGTCCTTGGGAGCCGAAAATTCTGTCGCGTACTCCAACAATTCTATCGCGATCCCGACAAACTTCACCATCTCTGTAACAACCGAGATCCTACCGGTGTCTATGACCAAGACATCTGTCGATTGCACCATGTACATCTGCGGAGATTCCACCGAGTGCTCCAACCTACTACTACAGTACGGATCTTTCTGTACCCAGCTAAACAGAGCGTTGACTGGAATCGCTGTAGAGCAGGATAAGAACACTCAAGAGGTATTCGCGCAAGTCAAGCAGATCTATAAGACTCCGCCGATCAAGGACTTCGGAGGTTTCAACTTCTCTCAGATCTTGCCGGATCCGTCCAAACCGTCTAAGAGATCTTTCATCGAGGACCTACTATTCAACAAAGTCACCCTAGCTGACGCGGGATTCATCAAACAATACGGAGATTGCTTGGGAGACATTGCGGCGAGAGATCTAATTTGCGCGCAGAAGTTTAACGGATTGACAGTACTACCGCCGCTACTAACCGATGAGATGATTGCGCAGTACACGTCTGCTCTATTGGCGGGAACAATTACAAGTGGATGGACATTTGGAGCCGGTGCCGCTCTACAAATTCCGTTTGCTATGCAAATGGCGTACAGATTCAACGGAATCGGAGTAACCCAGAACGTCTTGTACGAGAACCAGAAGCTAATCGCGAACCAGTTCAATTCCGCGATCGGAAAGATCCAGGACAGTCTATCTTCTACTGCTTCGGCGTTGGGAAAGCTACAGGATGTAGTAAATCAAAACGCGCAGGCGCTAAACACCTTGGTCAAGCAACTATCCTCTAACTTCGGAGCGATCTCGTCCGTCCTAAACGACATCTTATCCAGACTAGATAAGGTCGAAGCGGAGGTCCAGATCGATAGACTAATCACTGGAAGATTGCAGTCCCTACAGACCTACGTAACACAGCAACTAATTAGAGCGGCGGAGATTAGAGCCTCTGCTAATCTAGCTGCGACCAAGATGTCCGAATGTGTCTTGGGACAATCCAAGAGAGTGGACTTCTGCGGAAAGGGATACCACCTAATGTCTTTCCCACAATCTGCGCCGCATGGTGTCGTATTCCTACATGTAACATATGTGCCGGCGCAAGAAAAGAACTTCACAACAGCTCCAGCGATCTGCCATGATGGAAAAGCTCATTTCCCGAGAGAGGGAGTCTTTGTCTCTAACGGAACTCATTGGTTCGTCACCCAGAGAAACTTCTACGAGCCGCAGATCATCACCACCGACAACACATTCGTCTCGGGAAACTGCGACGTGGTCATCGGAATCGTAAACAATACCGTCTACGATCCGTTGCAGCCGGAACTAGACTCCTTCAAAGAAGAGTTGGACAAGTACTTCAAGAACCACACCTCTCCGGATGTGGACTTGGGAGATATCTCTGGAATCAACGCGTCCGTCGTCAACATCCAGAAAGAAATCGATAGATTGAACGAGGTCGCGAAGAACTTGAACGAGTCCCTAATCGACCTACAAGAGCTAGGAAAATACGAGCAGTACATCAAGTGGCCGTGGTGGACATCTGACTGGGGAGTCCTAACGAACCTAGGAATCCTACTACTATTGTCGATCGCGGTCCTAATCGCGCTATCCTGTATCTGTAGAATCTTCACCAAGTACATCGGA
SEQ ID NO: 116 - 經最佳化之GPS-經截短S-GPTM核酸序列 ATGTGGACGACCTGCTTCTTCATCTCCCTAATCCTAATCCAGGGAATCAAGACCCTATTCGTGTTCCTAGTCCTACTACCGCTAGTCTCTTCTCAGTGTGTAAACCTAACAACGAGAACACAACTACCACCGGCGTACACCAATTCTTTCACAAGAGGAGTATATTACCCGGACAAGGTGTTCAGATCCTCCGTACTACATTCTACACAGGACCTATTCCTACCGTTCTTCTCTAACGTAACATGGTTCCACGCGATCCATGTCTCTGGAACAAACGGAACGAAGAGATTCGATAACCCGGTCTTGCCGTTCAACGATGGTGTATACTTTGCGTCCACCGAGAAGTCCAACATCATCAGAGGATGGATCTTCGGAACCACCTTGGATTCTAAGACCCAGTCCTTGCTAATCGTCAACAACGCGACCAACGTCGTCATCAAAGTCTGCGAATTCCAGTTCTGTAACGACCCGTTCTTGGGAGTCTACTACCACAAGAACAACAAGTCCTGGATGGAATCCGAGTTCAGAGTCTACTCTTCCGCGAACAACTGCACCTTCGAATATGTATCTCAGCCGTTCCTAATGGACCTAGAGGGAAAGCAGGGAAACTTCAAGAACCTAAGAGAGTTCGTATTCAAGAACATCGACGGATACTTCAAGATCTACTCCAAGCACACTCCGATCAACCTAGTTAGAGATCTACCGCAAGGATTCTCTGCGCTAGAACCGTTAGTAGATTTGCCGATCGGAATCAACATCACCAGATTCCAGACACTACTAGCGCTACACAGATCTTACCTAACGCCGGGAGATTCTTCTTCTGGATGGACTGCTGGTGCTGCGGCTTATTATGTAGGATACCTACAGCCGAGAACCTTCCTATTGAAGTACAACGAAAACGGAACCATCACCGATGCCGTAGATTGTGCTCTAGATCCGCTATCCGAAACGAAGTGCACCCTAAAGTCTTTCACCGTCGAGAAGGGAATCTACCAGACCTCCAACTTTAGAGTACAGCCGACCGAATCCATCGTCAGATTTCCGAACATCACGAACCTATGTCCGTTCGGAGAAGTGTTCAACGCGACAAGATTTGCGTCTGTCTATGCGTGGAACAGAAAAAGAATCAGTAACTGCGTCGCGGACTACTCCGTCCTATACAACTCTGCCTCTTTCTCCACGTTCAAATGCTACGGTGTATCTCCGACAAAGCTAAACGATCTATGCTTCACCAACGTCTACGCGGACTCCTTCGTAATCAGAGGAGATGAAGTTAGACAGATTGCGCCGGGACAAACTGGAAAGATCGCGGATTATAACTACAAGCTACCGGACGACTTCACCGGATGTGTAATTGCGTGGAATTCGAACAACCTAGACTCCAAAGTCGGAGGAAACTACAACTACTTGTACAGACTATTCAGAAAGTCCAACCTAAAGCCGTTCGAGAGAGACATCTCCACCGAAATCTATCAGGCTGGATCTACACCGTGTAATGGTGTCGAAGGATTCAACTGCTACTTCCCGCTACAGTCTTACGGATTTCAACCGACAAACGGTGTAGGATATCAGCCGTACAGAGTCGTCGTACTATCCTTCGAACTACTACATGCTCCGGCGACAGTATGTGGACCGAAAAAGTCTACCAACCTAGTCAAGAACAAATGCGTCAACTTTAACTTCAACGGACTAACCGGAACCGGTGTCCTAACCGAATCTAACAAGAAGTTTCTACCGTTCCAGCAGTTCGGAAGAGATATCGCGGATACAACAGACGCTGTCAGAGATCCGCAAACCTTGGAGATCCTAGATATCACACCGTGTTCTTTCGGTGGTGTCTCTGTAATTACTCCGGGAACGAACACCTCCAATCAAGTAGCGGTACTATACCAGGACGTGAACTGTACAGAAGTACCGGTAGCTATTCACGCGGATCAACTAACACCAACTTGGAGAGTGTACTCCACCGGATCTAACGTATTCCAAACAAGAGCGGGATGTCTAATCGGAGCGGAACACGTAAACAACTCCTACGAATGTGATATCCCGATTGGAGCGGGAATCTGTGCGTCTTACCAAACACAAACAAACTCTCCGAGAAGAGCGAGATCTGTAGCCTCTCAATCTATTATCGCCTACACCATGTCCTTGGGAGCCGAAAATTCTGTCGCGTACTCCAACAATTCTATCGCGATCCCGACAAACTTCACCATCTCTGTAACAACCGAGATCCTACCGGTGTCTATGACCAAGACATCTGTCGATTGCACCATGTACATCTGCGGAGATTCCACCGAGTGCTCCAACCTACTACTACAGTACGGATCTTTCTGTACCCAGCTAAACAGAGCGTTGACTGGAATCGCTGTAGAGCAGGATAAGAACACTCAAGAGGTATTCGCGCAAGTCAAGCAGATCTATAAGACTCCGCCGATCAAGGACTTCGGAGGTTTCAACTTCTCTCAGATCTTGCCGGATCCGTCCAAACCGTCTAAGAGATCTTTCATCGAGGACCTACTATTCAACAAAGTCACCCTAGCTGACGCGGGATTCATCAAACAATACGGAGATTGCTTGGGAGACATTGCGGCGAGAGATCTAATTTGCGCGCAGAAGTTTAACGGATTGACAGTACTACCGCCGCTACTAACCGATGAGATGATTGCGCAGTACACGTCTGCTCTATTGGCGGGAACAATTACAAGTGGATGGACATTTGGAGCCGGTGCCGCTCTACAAATTCCGTTTGCTATGCAAATGGCGTACAGATTCAACGGAATCGGAGTAACCCAGAACGTCTTGTACGAGAACCAGAAGCTAATCGCGAACCAGTTCAATTCCGCGATCGGAAAGATCCAGGACAGTCTATCTTCTACTGCTTCGGCGTTGGGAAAGCTACAGGATGTAGTAAATCAAAACGCGCAGGCGCTAAACACCTTGGTCAAGCAACTATCCTCTAACTTCGGAGCGATCTCGTCCGTCCTAAACGACATCTTATCCAGACTAGAT CCACCG GAAGCGGAGGTCCAGATCGATAGACTAATCACTGGAAGATTGCAGTCCCTACAGACCTACGTAACACAGCAACTAATTAGAGCGGCGGAGATTAGAGCCTCTGCTAATCTAGCTGCGACCAAGATGTCCGAATGTGTCTTGGGACAATCCAAGAGAGTGGACTTCTGCGGAAAGGGATACCACCTAATGTCTTTCCCACAATCTGCGCCGCATGGTGTCGTATTCCTACATGTAACATATGTGCCGGCGCAAGAAAAGAACTTCACAACAGCTCCAGCGATCTGCCATGATGGAAAAGCTCATTTCCCGAGAGAGGGAGTCTTTGTCTCTAACGGAACTCATTGGTTCGTCACCCAGAGAAACTTCTACGAGCCGCAGATCATCACCACCGACAACACATTCGTCTCGGGAAACTGCGACGTGGTCATCGGAATCGTAAACAATACCGTCTACGATCCGTTGCAGCCGGAACTAGACTCCTTCAAAGAAGAGTTGGACAAGTACTTCAAGAACCACACCTCTCCGGATGTGGACTTGGGAGATATCTCTGGAATCAACGCGTCCGTCGTCAACATCCAGAAAGAAATCGATAGATTGAACGAGGTCGCGAAGAACTTGAACGAGTCCCTAATCGACCTACAAGAGCTAGGAAAATACGAGCAGTACATCAAGTGGCCGTGGTGGACATCTGACTGGGGAGTCCTAACGAACCTAGGAATCCTACTACTATTGTCGATCGCGGTCCTAATCGCGCTATCCTGTATCTGTAGAATCTTCACCAAGTACATCGGA
SEQ ID NO: 117 - GPS-經截短S-GPTM胺基酸序列(K417T；E484K；N501Y) MWTTCFFISLILIQGIKTLFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWWTSDWGVLTNLGILLLLSIAVLIALSCICRIFTKYIG
SEQ ID NO: 118 - GPS-經截短S + K986P及V987P-GPTM胺基酸序列(K417T；E484K；N501Y) MWTTCFFISLILIQGIKTLFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGTIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVKGFNCYFPLQSYGFQPTYGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRARSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLD PP EAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWWTSDWGVLTNLGILLLLSIAVLIALSCICRIFTKYIG
在一替代態樣中，本文提供一種rMVA病毒載體，其設計成表現呈框內融合蛋白形式之一或多種SARS-CoV2 S蛋白抗原肽，其中該融合蛋白包含套膜醣蛋白之訊息序列(GPS)、SARS-CoV2 S蛋白片段、套膜醣蛋白之跨膜域(GPTM)及套膜醣蛋白之胞質域(GPCD)，其中套膜醣蛋白不來源於冠狀病毒。rMVA病毒載體進一步設計成表現來自套膜醣蛋白所來源的相同病毒的基質蛋白。藉由提供與GP蛋白呈融合物形式之SARS-CoV2 S蛋白片段，S蛋白片段-GP融合物可與rMVA表現的基質蛋白形成VLP。
適合用於本發明之醣蛋白及基質蛋白包括(但不限於)來源於以下之彼等：絲狀病毒科，例如馬堡病毒、埃博拉病毒或蘇丹病毒；逆轉錄病毒科，例如1型人類免疫缺乏病毒(HIV-1)；沙粒病毒科，例如拉沙病毒；黃病毒科，例如登革熱病毒及茲卡病毒。
在特定實施例中，醣蛋白及基質蛋白來源於馬堡病毒(MARV)。在特定實施例中，醣蛋白來源於MARV GP蛋白(Genbank登錄號AFV31202.1)。MARV GP蛋白之胺基酸序列提供為表14中之SEQ ID NO: 87。在特定實施例中，MARV GPS域包含醣蛋白之胺基酸1至19 (MWTTCFFISLILIQGIKTL) (SEQ ID NO: 88，其可例如由MVA最佳化核酸序列SEQ ID NO: 89編碼)；GPTM域包含醣蛋白之胺基酸序列644-673 (WWTSDWGVLTNLGILLLLSIAVLIALSCICRIFTKYIG) (SEQ ID NO: 90，其可例如由MVA最佳化核酸序列SEQ ID NO: 91編碼)。
MARV VP40胺基酸序列可在Genbank登錄號JX458834獲得，且在表14中提供為SEQ ID NO: 92，其可例如由MVA最佳化核酸序列SEQ ID NO: 93編碼。在一些實施例中，可含有與GPS-S蛋白或蛋白片段-GPTM核酸序列一起呈雙順反子序列之編碼病毒基質蛋白之核酸序列，或在插入在MVA基因體內之個別位置處之個別核酸序列上含有編碼病毒基質蛋白之核酸序列。
在一個替代例中，提供一種rMVA病毒載體，其編碼與GP蛋白融合之經修飾之S蛋白肽，其中經修飾之S蛋白包含缺少蛋白質之羧基端的S1 + S2經截短蛋白，且亦編碼基質蛋白，例如MARV VP40蛋白。在一些實施例中，S1 + S2經截短蛋白包含S蛋白之胺基酸2至1213。在一些實施例中，S1 + S2經截短蛋白包含S蛋白之胺基酸2至1213及一或多個脯胺酸取代，例如K986P及/或V987P。在一些實施例中，將經截短S蛋白-GP融合物及MARV VP40編碼核酸序列插入在分開的插入位點處。在一些實施例中，將經截短S蛋白-GP融合物及MARV VP40編碼核酸序列作為雙順反子序列插入MVA基因體中。
在一些實施例中，經截短S蛋白-GP融合蛋白包含S蛋白之胺基酸2-1213。經截短S蛋白在其NH端側上側接來源於MARV醣蛋白之胺基酸1至19 (SEQ ID NO: 88)之訊息肽，且在其羧基端側上側接MARV醣蛋白之跨膜域(SEQ ID NO: 90)。所表現之GPS-經截短S蛋白-GPTM肽提供於表17中之SEQ ID NO: 113或114中，其可例如由例如SEQ ID NO: 115或116中提供之MVA最佳化核酸序列編碼。替代地，所表現之GPS-經截短S蛋白-GPTM肽提供於表17中之SEQ ID NO: 117或118中。在圖10A中提供rMVA之線性表示，其包含MARV VP 40插入物及編碼GPS-經截短S-TM之個別的單一MVA插入物。在圖10F中提供rMVA之線性表示，其包含MARV VP 40插入物及編碼GPS-經截短S +K986P及V987P-TM之個別的單一MVA插入物。在一些實施例中，GPS-經截短S-GPTM表現為，如SEQ ID NO: 113或114或117或118中所提供；且MARV VP蛋白表現為，如SEQ ID NO: 92中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種質體或MVA病毒載體，其含有編碼SEQ ID NO: 113或114或117或118及92之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種核酸序列，其包含SEQ ID NO: 70A或70B；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種編碼GPS-經截短S-GPTM之核酸，其中該核酸已經最佳化以用於在MVA病毒載體中表現，例如如SEQ ID NO: 115或116中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，核酸序列編碼額外胺基酸序列，諸如標籤，例如C端標籤，諸如適合在分析偵測期間使用之EPEA。核酸序列可進一步包含適合的啟動子序列，諸如(但不限於)衍生於pmH5、p11、pSyn、pHyb或任何其他適合的啟動子序列之彼等啟動子序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適合的轉譯起始序列，諸如Kozak共有序列。另外，核酸序列可在蛋白質或標籤之最後一個胺基酸序列後在核酸序列之3'端處包括適當的終止密碼子，例如TAA、TAG或TGA或其組合或多個。此外，核酸序列可在各所編碼蛋白質之最後一個終止密碼子之3'包括牛痘病毒終止序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適用於產生穿梭載體之限制酶位點，以易於插入抗原序列。用於插入之編碼GPS-經截短S-GPTM之例示性核酸序列提供為SEQ ID NO: 123、124、125或126。在一些實施例中，rMVA包含選自SEQ ID NO: 123 (圖10B-10C)、124 (圖10D-10E)、125 (圖10G-10H)或126 (圖10I-10J)之核酸序列；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。在一些實施例中，rMVA進一步包含SEQ ID NO: 93或94之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。
在一些實施例中，將經截短S蛋白-GP融合物及MARV VP40編碼核酸序列作為雙順反子序列插入MVA基因體中。在圖10K中提供rMVA之線性表示，其包含呈雙順反子核酸之MARV VP 40插入物及GPS-經截短S-TM。在圖10R中提供rMVA之線性表示，其包含呈雙順反子核酸之MARV VP 40插入物及GPS-經截短S +K986P及V987P-TM。用於插入之編碼GPS-經截短S或經截短S + K986P及V987P-GPTM/VP40之例示性核酸序列提供為SEQ ID NO: 127、128、129或130。在一些實施例中，rMVA包含選自SEQ ID NO: 127 (圖10L-10M-10N)、128 (圖10O-10P-10Q)、129 (圖10S-10T-10U)或130 (圖10V-10W-10X)之核酸序列；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。
在一個替代例中，提供一種rMVA病毒載體，其編碼與GP蛋白融合之S蛋白受體結合域(RBD)肽，且亦編碼基質蛋白，例如MARV VP40蛋白。在一些實施例中，將RBD-GP融合物編碼核酸序列及MARV VP40編碼核酸序列插入在分開的插入位點處，如圖11A中所例示。在一些實施例中，將RBD GP融合物作為雙順反子序列插入MVA基因體中，如圖11H中所例示。
在一些實施例中，RBD肽來源於S蛋白之胺基酸327至524。在一些實施例中，RBD肽來源於S蛋白之胺基酸331至524。在一些實施例中，RBD為冠狀病毒共有序列。RBD肽在其NH端側上側接來源於MARV醣蛋白之胺基酸1至19 (SEQ ID NO: 88)之訊息肽，且在其羧基端側上側接MARV醣蛋白之跨膜域(SEQ ID NO: 90)。所表現之GPS-RBD (胺基酸327-524)-GPTM肽提供於表15中之SEQ ID NO: 95中，其可例如由例如SEQ ID NO: 97中提供之MVA最佳化核酸序列編碼。所表現之GPS-RBD (胺基酸331-524)-GPTM肽提供於表15中之SEQ ID NO: 96中，其可例如由例如SEQ ID NO: 98中提供之MVA最佳化核酸序列編碼。替代地，所表現之GPS-RBD (胺基酸327-524)-GPTM肽提供於SEQ ID NO: 99中。替代地，所表現之GPS-RBD (胺基酸327-524)-GPTM肽提供於SEQ ID NO: 100中。在圖11a中提供包含MARV VP 40插入物及適合於在表現後形成VLP之個別GPS-RBD-TM插入物的rMVA的線性表示。在圖11b中提供包含MARV VP 40插入物及適合於在表現後形成VLP之個別GPS-RBD (胺基酸331-524)-TM插入物的rMVA的線性表示。在圖11E中提供包含MARV VP 40插入物及適合於在表現後形成VLP之個別GPS-RBD (胺基酸327-524)-TM插入物的rMVA的線性表示。在一些實施例中，GPS-RBD-GPTM表現為，如SEQ ID NO: 95或99 (RBD (胺基酸327-524))或96或100 (RBD (胺基酸331-524))中所提供；且MARV VP蛋白表現為，如SEQ ID NO: 92中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種質體或MVA病毒載體，其含有編碼SEQ ID NO: 95或96或99或100及92之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種核酸序列，其包含SEQ ID NO: 97或98；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種編碼GPS-RBD-GPTM之核酸，其中該核酸已經最佳化以用於在MVA病毒載體中表現，例如如SEQ ID NO: 97或98中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，核酸序列編碼額外胺基酸序列，諸如標籤，例如C端標籤，諸如適合在分析偵測期間使用之EPEA。核酸序列可進一步包含適合的啟動子序列，諸如(但不限於)衍生於pmH5、p11、pSyn、pHyb或任何其他適合的啟動子序列之彼等啟動子序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適合的轉譯起始序列，諸如Kozak共有序列。另外，核酸序列可在蛋白質或標籤之最後一個胺基酸序列後在核酸序列之3'端處包括適當的終止密碼子，例如TAA、TAG或TGA或其組合或多個。此外，核酸序列可在各所編碼蛋白質之最後一個終止密碼子之3'包括牛痘病毒終止序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適用於產生穿梭載體之限制酶位點，以易於插入抗原序列。用於插入之編碼GPS-RBD-GPTM之例示性核酸序列提供為SEQ ID NO: 131、132、133或134。在一些實施例中，rMVA包含選自SEQ ID NO: 131 (圖11F)、132 (圖11G)、133 (圖11C)或134 (圖11D)之核酸序列；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。在一些實施例中，rMVA進一步包含SEQ ID NO: 93或94之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。
在一些實施例中，將RBD-GP融合物及MARV VP40編碼核酸序列作為雙順反子序列插入MVA基因體中。在圖11I中提供rMVA之線性表示，其包含呈雙順反子核酸之MARV VP 40插入物及GPS-RBD (胺基酸331-325)-TM。在圖11N中提供rMVA之線性表示，其包含呈雙順反子核酸之MARV VP 40插入物及GPS-RBD (胺基酸327-325)-TM。用於插入之編碼GPS-RBD-GPTM-VP40之例示性核酸序列提供為SEQ ID NOS: 135 (圖11O-11P)及136 (圖11Q-11R) (RBD (胺基酸327-524))或137 (圖11J-11K)及138 (圖11L-11M) (RBD (胺基酸331-524))。在一些實施例中，rMVA包含選自SEQ ID NO: 135、136、137或138之核酸序列；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。
在一個替代例中，提供一種rMVA病毒載體，其編碼與GP蛋白融合之S蛋白肽，且亦編碼病毒基質蛋白，例如MARV VP40蛋白。在一些實施例中，S蛋白串聯重複序列在其NH端側上側接來源於MARV醣蛋白之胺基酸1至19 (SEQ ID NO: 88)之訊息肽，且在其羧基端側上側接MARV醣蛋白之跨膜域(SEQ ID NO: 90)。在一些實施例中，串聯重複序列例如為(RBD-間隔子-RBD-間隔子)X 或(RBD序列1-間隔子-RBD序列2-間隔子)X ，其中RBD為任何S蛋白RBD肽，RBD序列1為第一S蛋白RBD肽，且RBD序列2為第二S蛋白RBD肽，且其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施例中，RBD肽係選自一或多個來源於SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸331至524或327至524之肽。在一些實施例中，由rMVA編碼之線性抗原決定基係選自SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸504至524及胺基酸473至490。在一些實施例中，由rMVA編碼之線性抗原決定基為SARS-CoV2 S蛋白之胺基酸504至524及胺基酸473至490。在一些實施例中，串聯重複序列為((胺基酸504-524)-間隔子-(胺基酸473-490)-間隔子)x，其中x = 2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些實施例中，x = 3至7。在一些實施例中，x=5。包含GPS-串聯重複序列-GPTM之例示性胺基酸序列在表16中提供為SEQ ID NO: 105，其可由MVA最佳化核酸序列SEQ ID NO: 106編碼。替代地，包含GPS-串聯重複序列-GPTM之例示性胺基酸序列在表16中提供為SEQ ID NO: 109。包含GPS-串聯重複序列-GPTM (其中對於串聯重複序列，x=5)之例示性胺基酸序列在表16中提供為SEQ ID NO: 107，其可由MVA最佳化核酸序列SEQ ID NO: 108編碼。包含GPS-串聯重複序列-GPTM (其中對於串聯重複序列而言，x=5)之替代性例示性胺基酸序列在表16中提供為SEQ ID NO: 110。
在圖12A中提供包含MARV VP 40插入物及適合於在表現後形成VLP之編碼GPS-串聯重複序列-GPTM肽之個別的單一MVA插入物的rMVA的線性表示。在一些實施例中，GPS-串聯重複序列-GPTM肽表現為，如SEQ ID NO: 64或66中所提供；且MARV VP蛋白表現為，如SEQ ID NO: 59中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種質體或MVA病毒載體，其含有編碼SEQ ID NO: 105或106或109或110及92之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種核酸序列，其包含SEQ ID NO: 106或108；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種編碼GPS-串聯重複序列-GPTM肽之核酸，其中該核酸已經最佳化以用於在MVA病毒載體中表現，例如如SEQ ID NO: 106或108或109或110中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，核酸序列編碼額外胺基酸序列，諸如標籤，例如C端標籤，諸如適合在分析偵測期間使用之EPEA。核酸序列可進一步包含適合的啟動子序列，諸如(但不限於)衍生於pmH5、p11、pSyn、pHyb或任何其他適合的啟動子序列之彼等啟動子序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適合的轉譯起始序列，諸如Kozak共有序列。另外，核酸序列可在蛋白質或標籤之最後一個胺基酸序列後在核酸序列之3'端處包括適當的終止密碼子，例如TAA、TAG或TGA或其組合或多個。此外，核酸序列可在各所編碼蛋白質之最後一個終止密碼子之3'包括牛痘病毒終止序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適用於產生穿梭載體之限制酶位點，以易於插入抗原序列。用於插入之編碼GPS-串聯重複序列-GPTM肽之例示性核酸序列提供為SEQ ID NO: 139及140。在一些實施例中，rMVA包含選自SEQ ID NO: 139 (圖12B)或140 (圖12C)之核酸序列；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。在一些實施例中，rMVA進一步包含SEQ ID NO: 93或94之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。
在一些實施例中，將GPS-串聯重複序列-GPTM及MARV VP40編碼核酸序列作為雙順反子序列插入MVA基因體中。在圖12D中提供rMVA之線性表示，其包含呈雙順反子核酸之MARV VP 40插入物及GPS-串聯重複序列-GPTM。用於插入之編碼GPS-串聯重複序列-GPTM-VP40之例示性核酸序列提供為SEQ ID NO: 141及142。在一些實施例中，rMVA包含選自SEQ ID NO: 141 (圖12E-12F)或142 (圖12G-12H)之核酸序列；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。
在一些實施例中，提供一種rMVA病毒載體，其僅編碼棘(S)蛋白(或其片段)。在圖13A中提供編碼S蛋白之單一MVA插入物之線性表示。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白，例如如SEQ ID NO: 1或6中所提供，或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種質體或MVA病毒載體，其包含編碼SEQ ID NO: 1之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種質體或MVA病毒載體，其包含編碼SEQ ID NO: 6之核酸序列或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種編碼全長S蛋白之核酸，其中該核酸已經最佳化以用於在MVA病毒載體中表現，例如如SEQ ID NO: 3中所提供。在一些實施例中，核酸序列編碼額外胺基酸序列，諸如標籤，例如C端標籤，諸如適合於在分析中偵測所表現之蛋白質之EPEA。核酸序列可進一步包含適合的啟動子序列，諸如(但不限於)衍生於pmH5、p11、pSyn、pHyb或此項技術中已知之任何其他適合的啟動子序列之彼等啟動子序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適合的轉譯起始序列，諸如Kozak共有序列。另外，核酸序列可在各蛋白質或標籤之最後一個胺基酸序列後在核酸序列之3'端處包括適當的終止密碼子，例如TAA、TAG或TGA或其組合或多個。此外，核酸序列可在各所編碼蛋白質之最後一個終止密碼子之3'包括牛痘病毒終止序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適用於產生穿梭載體之限制酶位點，以易於插入抗原序列。包含全長S蛋白之相鄰編碼序列之例示性核酸序列在下文中提供為SEQ ID NO: 143 (圖13B-13C)及144 (圖13D-13E)。在一些實施例中，rMVA包含選自SEQ ID NO: 143或144之核酸序列；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。
替代地，提供一種rMVA病毒載體，其編碼棘(S)蛋白，其中S蛋白已用一或多個使呈融合前構形之S蛋白三聚體穩定之胺基酸脯胺酸取代進行穩定。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且在七肽重複序列1 (HR1)與S胞外域三聚體之啟動子之中央螺旋之間的邊界處或附近含有一或多個脯胺酸取代。在一些實施例中，脯胺酸取代出現在三聚體中之啟動子之胺基酸殘基970至990之間。在一些實施例中，S蛋白表現為全長蛋白且含有胺基酸K986及V987處之兩個脯胺酸取代。在圖14A中提供編碼經穩定之S蛋白之單一MVA插入物之線性表示。在一些實施例中，S蛋白表現為包含S蛋白之胺基酸986及987處之兩個脯胺酸取代之全長蛋白，例如如SEQ ID NO: 8或11中所提供，或與其至少75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種質體或MVA病毒載體，其含有編碼SEQ ID NO: 8或11之核酸序列或與其至少75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種核酸序列，其包含SEQ ID NO: 9；或與其至少75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種編碼全長經脯胺酸取代之S蛋白之核酸，其中該核酸已經最佳化以用於在MVA病毒載體中表現，例如如SEQ ID NO: 10或12中所提供，或與其至少75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，核酸序列編碼額外胺基酸序列，諸如標籤，例如C端標籤，諸如EPEA。核酸序列可進一步包含適合的啟動子序列，諸如(但不限於)衍生於pmH5、p11、pSyn、pHyb或任何其他適合的啟動子序列之彼等啟動子序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適合的轉譯起始序列，諸如Kozak共有序列。另外，核酸序列可在蛋白質或標籤之最後一個胺基酸序列後在核酸序列之3'端處包括適當的終止密碼子，例如TAA、TAG或TGA或其組合或多個。此外，核酸序列可在各所編碼蛋白質之最後一個終止密碼子之3'包括牛痘病毒終止序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適用於產生穿梭載體之限制酶位點，以易於插入抗原序列。用於插入之編碼全長經穩定之S蛋白之例示性核酸序列在下文中提供為SEQ ID NO: 145及146。在一些實施例中，rMVA包含選自SEQ ID NO: 145 (圖14B-14C)或146 (圖14D-14E)之核酸序列；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。
替代地，提供一種rMVA病毒載體，其編碼經修飾、經截短形式之棘(S)蛋白，其中經截短S蛋白包含S1 + S2區且缺乏羧基端。在一些實施例中，經截短S蛋白包含胺基酸1至1213 (SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 18)。在一些實施例中，經截短S蛋白含有胺基酸986及987處之兩個脯胺酸取代(SEQ ID NO: 14或SEQ ID NO: 19)。在圖15A中提供編碼經截短S蛋白之單一MVA插入物之線性表示。在圖15F中提供編碼經截短S蛋白+ K986P及V987P之單一MVA插入物之線性表示。在一些實施例中，經截短S蛋白表現為，如SEQ ID NO: 13、14、18或19中所提供，或與其至少75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種質體或MVA病毒載體，其含有編碼SEQ ID NO: 13、14、18或19之核酸序列或與其至少75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種核酸序列，其包含SEQ ID NO: 15；或與其至少75%、80%、85%、90%或95%同源之序列。在一些實施例中，本文提供一種編碼經截短S蛋白之核酸，其中該核酸已經最佳化以用於在MVA病毒載體中表現，例如如SEQ ID NO: 16或17中所提供，或與其至少75%、80%、85%、90%或95%同源的序列。在一些實施例中，核酸序列編碼額外胺基酸序列，諸如標籤，例如C端標籤，諸如EPEA。核酸序列可進一步包含適合的啟動子序列，諸如(但不限於)衍生於pmH5、p11、pSyn、pHyb或任何其他適合的啟動子序列之彼等啟動子序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適合的轉譯起始序列，諸如Kozak共有序列。另外，核酸序列可在蛋白質或標籤之最後一個胺基酸序列後在核酸序列之3'端處包括適當的終止密碼子，例如TAA、TAG或TGA或其組合或多個。此外，核酸序列可在各所編碼蛋白質之最後一個終止密碼子之3'包括牛痘病毒終止序列。另外，用於插入之核酸序列可進一步包括適用於產生穿梭載體之限制酶位點，以易於插入抗原序列。用於插入之編碼經截短S蛋白之例示性核酸序列在下文提供為SEQ ID NO: 147 (圖15B-15C)、148 (圖15D-15E)、149 (圖15G-15H)或150 (圖15I-15J)。在一些實施例中，rMVA包含選自SEQ ID NO: 147、148、149或150之核酸序列；或與其至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%同源之序列。
醫藥組合物 本發明之重組病毒載體容易地調配為用於獸醫或人類用途之醫藥組合物，單獨或呈組合形式。醫藥組合物可包含醫藥學上可接受之稀釋劑、賦形劑、載劑或佐劑。
在一個實施例中，本發明為一種有效抵抗及/或治療SARS-CoV2感染之疫苗，其包含表現至少一種SARS-CoV2抗原性多肽或其免疫原性片段之重組MVA載體。疫苗組合物可包含一或多種額外治療劑。
醫藥組合物可包含1、2、3、4或大於4種不同的重組MVA載體。
如本文所用，片語「醫藥學上可接受之載劑」涵蓋標準醫藥載劑中之任一者，諸如適合於非經腸投與(諸如藉由肌肉內、關節內(關節中)、靜脈內、皮內、腹膜內及皮下途徑)之彼等醫藥載劑。此類調配物之實例包括含有抗氧化劑、緩衝劑、抑菌劑及使調配物與預期接受者血液等張之溶質的水性及非水性等張無菌注射溶液；及可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑及防腐劑之水性及非水性無菌懸浮液。一種例示性醫藥學上可接受之載劑為生理鹽水。
其他生理學上可接受之稀釋劑、賦形劑、載劑或佐劑及其調配物為熟習此項技術者已知。
在一些實施例中，佐劑用作免疫反應增強劑。在各種實施例中，免疫反應增強劑係選自由以下組成之群：基於明礬之佐劑、基於油之佐劑、Specol、RIBI、TiterMax、Montanide ISA50或Montanide ISA 720、GM-CSF、基於非離子性嵌段共聚物之佐劑、基於溴化二甲基二(十八基)銨(DDA)之佐劑AS-1、AS-2、基於Ribi佐劑系統之佐劑、QS21、Quil A、SAF (呈其微流化形式之Syntex佐劑(SAF-m))、溴化二甲基-二(十八基)銨(DDA)、基於人類補體之佐劑m、微卡(vaccae)、ISCOMS、MF-59、SBAS-2、SBAS-4、Enhanzyn®、RC-529、AGPs、MPL-SE、QS7、七葉素(Escin)；毛地黃皂苷(Digitonin)；滿天星(Gypsophila)；及藜麥皂苷。
用於本文所描述之方法中之組合物可藉由例如選自以下之途徑投與：非經腸、肌肉內、動脈內、血管內、靜脈內、腹膜內、皮下、經皮、透皮、經眼、吸入、頰內、舌下、經舌(perilingual)、經鼻、局部投與及經口投與。較佳的投與方法可視各種因素(例如所投與之組合物的組分及所治療之病狀之嚴重程度)而變化。適合於經口投與之調配物可由液體溶液(諸如將有效量之組合物溶解於稀釋劑(例如水、鹽水或PEG-400)中)、膠囊、藥囊或錠劑組成，各自含有預定量之疫苗。醫藥組合物亦可為供吸入至例如支氣管道的氣霧劑調配物。氣霧劑調配物可與加壓的醫藥學上可接受之推進劑(例如二氯二氟甲烷、丙烷或氮氣)混合。
出於本發明之目的，適合於遞送治療或生物活性劑之醫藥組合物可包括例如錠劑、膠囊錠、膠囊、丸劑、散劑、顆粒劑、懸浮液、乳液、溶液、凝膠、水凝膠、口服凝膠、糊劑、滴眼劑、軟膏、乳膏、硬膏劑、頓服藥(drench)、遞送裝置、栓劑、灌腸劑、可注射劑、植入物、噴霧劑或氣霧劑。此等調配物中之任一種可藉由此項技術中熟知且公認之方法製備。參見例如Remington: The Science and Practice of Pharmacy (第21版), A. R. Gennaro, Lippincott Williams及Wilkins編, 2005；及Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, J. Swarbrick編, Informa Healthcare, 2006，其中之每一者在此以引用之方式併入。
若本發明之組合物與免疫刺激劑或佐劑一起共投與，則組合物(例如疫苗)之免疫原性可顯著地改良。熟習此項技術者熟知之適合佐劑包括例如磷酸鋁、氫氧化鋁、QS21、Quil A (及其衍生物及組分)、磷酸鈣、氫氧化鈣、氫氧化鋅、糖脂類似物、胺基酸之十八烷基酯、胞壁醯二肽、聚磷氮烯、脂蛋白、ISCOM-基質、DC-Chol、DDA、細胞介素及其他佐劑以及其衍生物。
適合於經口投與之調配物可由以下組成：(a)液體溶液，諸如將有效量之疫苗溶解於稀釋劑中，該等稀釋劑諸如水、鹽水或PEG 400；(b)膠囊、藥囊或錠劑，各自含有預定量之疫苗，如液體、固體、粒劑或明膠；(c)於適當液體中之懸浮液；(d)適合的乳液；及(e)多醣聚合物，諸如幾丁質。疫苗(單獨或與其他適合的組分組合)亦可製成經由吸入至例如支氣管通道而投與的氣霧劑調配物。可將氣霧劑調配物置放於諸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣及其類似物之可接受之加壓推進劑中。
適合用於直腸投與之調配物包括例如栓劑，其由疫苗與栓劑基質組成。適合的栓劑基質包括天然或合成三酸甘油酯或石蠟烴。另外，亦有可能使用明膠經直腸膠囊，其由疫苗與基質之組合組成，該基質包括例如液體三酸甘油酯、聚乙二醇及石蠟烴。本發明之疫苗亦可與細胞介素一起共投與以進一步增強免疫原性。細胞介素可藉由熟習此項技術者已知之方法投與，例如作為呈質體形式之核酸分子或作為蛋白質或融合蛋白。
本發明亦提供套組，其包含本發明之疫苗。舉例而言，包含疫苗及使用說明書之套組在本發明之範疇內。
使用方法 本發明之組合物可用作疫苗以用於誘導對SARS-CoV2之免疫反應。
在例示性實施例中，本發明提供一種預防有需要之個體(例如未暴露的個體)感染SARS-CoV2之方法，該方法包含向個體投與預防有效量之本發明之組合物。該方法之結果為個體部分或完全地對病毒免疫。
在例示性實施例中，本發明提供一種治療有需要之個體(例如暴露的個體，諸如最近已暴露但尚無症狀之個體或最近已暴露且僅有輕度症狀之個體)之SARS-CoV2感染之方法，該方法包含向個體投與治療有效量的本發明之組合物。治療結果為個體具有改善的治療概況。
待根據本文所描述之方法治療之個體(例如感染SARS-CoV2之個體)可為開業醫師已診斷為患有此類病狀之個體。診斷可藉由任何適合的手段執行。預防感染之發展的個體可以已接受或可以尚未接受此類診斷。熟習此項技術者應理解，歸因於存在一或多個風險因素(例如暴露於SARS-CoV2等)，所以待根據本發明治療之個體可使用標準測試鑑別或在未檢查之情況下可鑑別為處於高風險下的個體。
預防治療可例如向尚未暴露於或感染SARS-CoV2但易於暴露於或感染SARS-CoV2或以其他方式處於暴露於或感染SARS-CoV2之風險下的個體投與。
可例如向已暴露於或感染SARS-CoV2、尚未患病或顯示症狀或感染、罹患病症之個體投與治療性治療，以便改善或穩定個體(例如已感染SARS-CoV2之患者)之病狀。結果為改善治療概況。在一些情況下，與同等的未經治療對照相比，治療可改善其病症或症狀例如5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或100%，如藉由任何標準技術所量測。在一些情況下，治療可引起病毒複製抑制、病毒效價或病毒負荷降低、病毒根除或清除。在其他實施例中，治療可引起改善一或多個感染症狀，包括上文鑑別之任何症狀。根據此實施例，可藉由偵測症狀之改善或不存在症狀而評定治療確認。
在其他實施例中，治療可引起減小或消除個體將感染傳染至另一未感染個體之能力。一般使用與用於測定病症改善之相同方法來評定根據此實施例治療之確認，但預防傳染所必需之病毒效價或病毒負荷減少可不同於改善病症所必需之病毒效價或病毒負荷減少。
在一個實施例中，本發明為一種藉由向個體投與編碼至少一個來自SARS-CoV2之基因之重組病毒載體而誘導個體(例如人類)之免疫反應的方法。免疫反應可為細胞免疫反應或體液免疫反應或其組合。
在一特定實施例中，本發明為一種藉由向個體投與編碼至少一個來自SARS-CoV2之基因之重組病毒載體而誘導個體(例如人類)之免疫反應的方法。免疫反應可為細胞免疫反應或體液免疫反應或其組合。
在一個實施例中，免疫反應為廣泛中和抗體反應。
在一特定實施例中，本發明為一種藉由向個體投與編碼至少一個來自SARS-CoV2之基因之重組病毒載體而誘導個體(例如人類)之免疫反應的方法。在某些實施例中，重組病毒載體編碼至少兩個來自SARS-CoV2之基因。免疫反應可為細胞免疫反應或體液免疫反應或其組合。
在另一實施例中，本發明提供一種藉由向個體投與編碼至少一個來自SARS-CoV2之基因之重組病毒載體而治療個體(例如人類)之SARS-CoV2感染的方法。所治療之個體可能尚未感染SARS-CoV2但處於發展其之風險下。
可例如藉由注射(例如肌肉內、動脈內、血管內、靜脈內、腹膜內或皮下)投與組合物。
應瞭解，可同時或依序(例如增強)採用大於一種投與本發明之疫苗之途徑。另外，本發明之疫苗可與傳統免疫接種方法組合使用，該等傳統免疫接種方法諸如採用蛋白質抗原、牛痘病毒及滅活病毒作為疫苗。因此，在一個實施例中，向個體投與本發明之疫苗(個體用本發明之疫苗「初次接觸抗原免疫」)，且接著投與不同疫苗(個體用不同疫苗「增強」)。在另一實施例中，首先向個體投與不同疫苗，隨後投與本發明之疫苗。在又另一實施例中，共投與不同疫苗及本發明之疫苗。在一些實施例中，不同疫苗為mRNA-1273 (Moderna、Inc.)、AZD-1222 (AstraZeneca及牛津大學)、BNT162 (Pfizer及BioNTech)、CoronaVac (Sinovac)、NVX-CoV 2372 (NovoVax)、SCB-2019 (Sanofi及GSK)、ZyCoV-D (Zydus Cadila)或CoVaxin(Bharat Biotech)。
儘管不受特定機制束縛，但咸信，在用如本文中所描述之醫藥組合物接種後，宿主之免疫系統藉由產生對SARS-CoV2蛋白具有特異性之抗體(分泌性抗體及血清抗體)，及藉由產生對SARS-CoV2具有特異性之細胞介導的免疫反應，而對疫苗起反應。由於疫苗接種，宿主變得至少部分地或完全對SARS-CoV2感染免疫，或對發展由SARS-CoV2感染引起之中度或重度疾病具有抗性。
在一個態樣中，提供用於減輕、降低一或多個與SARS-CoV2感染相關之症狀(例如發熱、重度頭痛、肌肉痛、不適、極端無力、結膜炎、常見皮疹、吞咽困難、噁心、嘔吐、出血性腹瀉隨後彌漫性出血、譫妄、休克、黃疸、血小板減少症、淋巴球減少症、嗜中性球增多症、各種器官(例如腎及肝臟)中病灶性壞死及急性呼吸窘迫)之嚴重程度或減少其發生之方法，其包含投與有效量之醫藥組合物，該醫藥組合物包含含有SARS-CoV2蛋白或其片段之重組MVA病毒載體。
在一個實施例中，重複投與至少兩次、至少3次、至少4次、至少5次、至少6次、至少7次、至少8次或大於8次。
在一個實施例中，重複投與兩次。
在一個實施例中，提供約2-8、約4-8或約6-8次投與。
在一個實施例中，在投與之間提供約1-4週、2-4週、3-4週、1週、2週、3週、4週或大於4週間隔。
在一個具體實施例中，在2次投與之間使用4週間隔。
本發明包括預防及治療SARS-CoV2感染之方法，其包括抗藥性及多重抗藥性形式之病毒及病毒感染之相關疾病病況、病狀或併發症，包括肺炎，諸如2019年新冠狀病毒感染肺炎(NCIP)、急性肺損傷(ALI)及急性呼吸窘迫症候群(ARDS)。額外非限制性併發症包括低氧血症型呼吸衰竭、急性呼吸衰竭(ARF)、急性肝損傷、急性心臟損傷、急性腎損傷、敗血性休克、彌散性血管內凝血、血結塊、多系統發炎性症候群、慢性疲勞、橫紋肌溶解症及細胞介素風暴。
在另一替代實施例中，提供一種預防傳染之方法，其包括向人類投與有效量之一或多種本文所描述之rMVA病毒載體，以誘導足夠預防SARS-CoV2傳染之免疫反應。
本發明係針對一種治療SARS-CoV2感染之方法，其包括抗藥性及多重抗藥性形式之病毒及病毒感染之相關疾病病況、病狀或併發症，包括肺炎，諸如2019年新冠狀病毒感染肺炎(NCIP)、急性肺損傷(ALI)及急性呼吸窘迫症候群(ARDS)。額外非限制性併發症包括低氧血症型呼吸衰竭、急性呼吸衰竭(ARF)、急性肝損傷、急性心臟損傷、急性腎損傷、敗血性休克、彌散性血管內凝血、血結塊、多系統發炎性症候群、慢性疲勞、橫紋肌溶解症及細胞介素風暴。
在一個實施例中，投與本文所描述之rMVA引起進展性呼吸道功能不全之發生率(PRI)降低，如藉由使用6層多階層級別之下文所描述之呼吸支援方法，維持令人滿意的充氧(SpO2 ＞ 93%)所需之呼吸支援方法級別增加大於或等於1層或甚至2層或更多所量測，其中個體患有後天性SARS-CoV2感染但先前已投與或將投與本文所描述之rMVA病毒載體。
增加呼吸支援級別之量表包括： 級別1：在室內空氣(SpO2 ＞ 93%)中正常充氧，不需要補充O2 級別2：室內空氣(SpO2 ＞ 93)中之持續性低血氧症，需要藉由鼻導管或面罩補充低含量O2 (至多2 L/min)以維持SpO2 ＞ 93 級別3：需要藉由鼻導管或面罩(至多2 L/min)被動補充更高含量之O2 以維持SpO2 ＞ 93 級別4：需要藉由正壓裝置，例如持續氣道正壓(CPAP)或雙位準氣道正壓(BiPAP)或其他非侵入性正壓呼吸支援方法充氧，以維持令人滿意的充氧及/或通氣 級別5：需要侵入性呼吸支援(插管式機械通氣或ECMO) 級別6：死亡
在一個實施例中，與未免疫的個體相比，PRI降低為自級別5增加至級別3、自級別5增加至級別2或自級別5增加至級別1。在一個實施例中，與未免疫的個體相比，PRI降低為自級別4增加至級別2或自級別4增加至級別1。在一個實施例中，與未免疫的個體相比，PRI降低為自級別3增加至級別1。
在一個實施例中，投與本文所描述之rMVA病毒載體減少臨床恢復(NIAID臨床狀態量表之狀態6、7或8，使用經調試之國家過敏及傳染性疾病研究所(NIAID)臨床狀態順序量表)之中位數時間至少3、4、5或更多天。在一個實施例中，投與本文所描述之rMVA病毒載體引起改善，如藉由發展SARS-CoV2感染之個體之經調試之臨床狀態順序量表所量測。
自最嚴重疾病至逐漸較不嚴重疾病，經調適之總體臨床狀態順序量表之階段定義如下： 1.死亡 2.住院，使用侵入性機械通氣或ECMO 3.住院，使用非侵入性通氣或高流量氧氣裝置 4.住院，需要補充氧氣 5.住院，不需要補充氧氣-需要持續的醫療照護(COVID-19相關或其他) 6.住院，不需要補充氧氣；不再需要COVID-19之密切醫療照護 7.未住院，但活動受限，需要COVID-19表現之密切門診照護 8.未住院，活動不受限制，無需持續的密切醫療照護
在一個實施例中，相較於未免疫的個體，投與本文所描述之rMVA病毒載體減少臨床恢復(NIAID臨床狀態量表之狀態6、7或8，使用經調試之國家過敏及傳染性疾病研究所(NIAID)臨床狀態順序量表)之中位數時間至少5天、至少6天、至少7天、至少8天、至少9天或至少10天。
在一個實施例中，相較於未免疫的個體，投與本文所描述之rMVA病毒載體減少感染SARS-CoV-2病毒之患者之住院持續時間。
在一個實施例中，相較於未免疫的個體，投與本文所描述之rMVA病毒載體減少感染SARS-CoV-2病毒之患者之鼻及/或咽喉中持續不可偵測的SARS-CoV-2病毒的時間。
在一個實施例中，相較於未免疫的個體，投與本文所描述之rMVA病毒載體減少呼吸衰竭或死亡。
劑量 疫苗以與劑型相容之方式，且以諸如將為治療有效的、免疫原性及保護性的量投與。待投與之量視所治療之個體而定，包括例如個體免疫系統合成抗體及必要時產生細胞介導之免疫反應的能力。投與所需之活性成分之精確量視醫師之判斷而定，且可基於逐個患者而進行監測。然而，適合的劑量範圍可容易地由熟習此項技術者判定，且一般在約5.0 × 106 TCID50 至約5.0 × 109 TCID50 範圍內。劑量亦可視(但不限於)以下而定：投與途徑、患者之健康狀況及體重以及調配物之性質。
本發明之醫藥組合物以諸如將為治療有效的、免疫原性及/或能夠預防埃博拉病毒病原性物種之量來投與。所投與之劑量視待治療之個體(例如投與方式，及所治療之個體之年齡、體重、免疫系統能力及一般健康狀況)而定。組合物以提供引起免疫反應而無不當不良生理學效果之足夠表現量之量投與。較佳地，本發明之組合物為異源病毒載體，其包括一或多種SARS-CoV2之多肽或編碼一或多個SARS-CoV2基因之核酸分子，且以例如1.0 × 104 與9.9 × 1012 TCID50 之間的病毒載體之劑量投與，該劑量較佳在1.0  × 105 TCID50 與1.0 × 1011 TCID50 pfu之間，更佳地在1.0 × 106 與1.0 × 1010 TCID50 pfu之間，或最佳地在5.0 × 106 與5.0 × 109 TCID50 之間。組合物可包括例如至少5.0 × 106 TCID50 之病毒載體(例如1.0 × 108 TCID50 之病毒載體)。醫師或研究人員可決定適當量及給藥方案。
該方法之組合物可包括例如1.0 × 104 與9.9 × 1012 TCID50 之間的病毒載體，較佳在1.0 × 105 TCID50 與1.0 × 1011 TCID50 pfu之間，更佳地在1.0 × 106 與1.0 × 1010 TCID50 pfu之間，或最佳地在5.0 × 106 與5.0 × 109 TCID50 之間。組合物可包括例如至少5.0 × 106 TCID50 之病毒載體(例如1.0 × 108 TCID50 之病毒載體)。方法可包括例如向個體投與組合物兩次或更多次。
本發明亦提供一種在個體(例如人類)中誘導對SARS-CoV2之免疫反應之方法，其包括向個體投與有效量之編碼至少一個來自SARS-CoV2之基因的重組病毒載體。所治療之個體可以未感染沙粒狀病毒但處於發展其之風險下。替代地，個體可以已感染SARS-CoV2。可例如藉由注射(例如肌肉內、動脈內、血管內、靜脈內、腹膜內或皮下)投與組合物。
術語「有效量」意謂以臨床上相關方式投與組合物以改善、抑制或減輕個體之病狀或病症之症狀(例如改善、抑制或減輕沙粒狀病毒感染，或提供對SARS-CoV2感染之有效免疫反應)之量。個體中之任何改善被認為足夠達成治療。較佳地，足夠治療之量為預防SARS-CoV2發病或其一或多個症狀之量；或為降低SARS-CoV2感染之一或多個症狀之嚴重程度、或個體罹患該一或多個症狀之時長的量(例如相對於未用本發明之組合物治療之對照個體，降低至少10%、20%或30%，更佳地至少50%、60%或70%，且最佳地至少80%、90%、95%、99%或更多)。用於實踐本文所描述之方法(例如治療SARS-CoV2感染)之醫藥組合物之足夠量視以下而變化：投與方式，及所治療之個體之年齡、體重與一般健康狀況。最終，開方醫師或研究人員將決定適當量及劑量。
在一些情況下，可能需要將本發明之免疫原性SARS-CoV2組合物與誘導對其他藥劑(特定言之其他病毒)之保護性反應之免疫原性組合物組合。舉例而言，本發明之疫苗組合物可與其他基因免疫接種疫苗同時、分開或依序投與，該等其他基因免疫接種疫苗諸如針對以下之彼等疫苗：流感(Ulmer, J. B.等人, Science 259: 1745-1749 (1993)；Raz, E.等人, PNAS (USA) 91 :9519-9523 (1994))、瘧疾(Doolan, D. L.等人, J. Exp. Med. 183:1739-1746 (1996)；Sedegah, M.等人, PNAS (USA) 91 :9866-9870 (1994))及肺結核(Tascon, R. C.等人, Nat. Med. 2:888-892 (1996))。
投與 如本文所用，術語「投與」係指向個體給予一定劑量之本發明之醫藥組合物之方法。用於本文所描述之方法中之組合物可藉由例如選自以下之途徑投與：非經腸、經皮、透皮、經眼、吸入、頰內、舌下、經舌、經鼻、經直腸、局部投與及經口投與。非經腸投與包括靜脈內、腹膜內、皮下、動脈內、血管內及肌肉內投與。較佳的投與方法可視各種因素(例如所投與之組合物的組分及所治療之病狀之嚴重程度)而變化。
可藉由熟習此項技術者已知之任一種途徑來投與本發明之醫藥組合物(例如疫苗)。可例如藉由肌肉內注射進行投與。用於本文所描述之方法中之組合物亦可藉由例如選自以下之途徑投與：非經腸、經皮、透皮、經眼、吸入、頰內、舌下、經舌、經鼻、經直腸、局部投與及經口投與。非經腸投與包括靜脈內、腹膜內、皮下及肌肉內投與。較佳的投與方法可視各種因素而變化，該等因素例如所投與之組合物的組分及所治療之病狀之嚴重程度。
另外，可向個體給予單次或多次投與本發明之組合物。舉例而言，尤其易於感染SARS-CoV2之個體可能需要多次治療來建立及/或維持針對病毒的保護。由本文所描述之醫藥組合物提供的誘導之免疫水準可藉由例如量測中和分泌抗體及血清抗體之量來監測。接著，可視需要調整或重複劑量以維持所需水準之針對病毒感染的保護。
組合 本文所描述之rMVA疫苗可與當前針對罹患SARS-CoV2之患者之照護標準一起投與，或可與健康照護提供者視為對患者為有益的任何其他化合物或療法組合或交替投與，如下文更詳細地描述。組合及/或交替療法可為預防性、治療性、輔助性或姑息性的。
該方法亦包含向有需要之宿主(通常人類)投與有效量之本文所描述之rMVA，視情況與至少一種額外生物活性劑(例如額外抗病毒劑)組合，視情況進一步與醫藥學上可接受之載劑添加劑及/或賦形劑組合。
在一些實施例中，本文所描述之rMVA可與額外SARS-CoV2疫苗接種組合或交替投與。在一些實施例中，額外疫苗接種可選自：基於mRNA之疫苗、腺病毒疫苗、非複製性疫苗、DNA疫苗、減毒活疫苗、基於植物之輔助疫苗、基於多抗原決定基肽之疫苗、滅活病毒及肽疫苗，或其組合。適合於與本文所描述之rMVA病毒載體及方法一起使用之額外疫苗包括(但不限於)：mRNA-1273 (MODERNA COVID-19疫苗；Moderna, Inc.)、AZD-1222 (COVIDSHIELD；AstraZeneca及牛津大學)、BNT162 (COMIRNATY；Pfizer及BioNTech)、Sputnik V (Gamaleya Research Institute，Acellena Contract Drug Research and Development)、CoronaVac (Sinovac)、NVX-CoV 2372 (NovoVax)、SCB-2019 (Sanofi及GSK)、ZyCoV-D (Zydus Cadila)、BBIBP-CorV (Beijing Institute of Biological Products；China National Pharmaceutical Group (Sinopharm))、EpiVacCorona (Federal Budgetary Research Institution State Research Center of Virology and Biotechnology)、Convidicea (CanSino Biologics)、Covid-19疫苗(Wuhan Institute of Biological Products；China National Pharmaceutical Group (Sinopharm)、JNJ-78436735 (Johnson & Johnson), ZF2001) Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical, Institute of Microbiology of the Chinese Academy of Sciences)、CVnCoV (CureVac；GSK)、INO-4800 (Inovio Pharmaceuticals)、VIR-7831 (Medicago；GSK；Dynavax)、基於Covid-19腺病毒之疫苗(ImmunityBio；NantKwest)、UB-612 (COVAXX)或CoVaxin (Bharat Biotech)，或其組合。
本文所描述之rMVA病毒載體可在當前COVID患者之照護標準上投與，或可與健康照護提供者視為有益於患者之任何其他化合物或療法組合或交替投與。組合及/或交替療法可為治療性、輔助性或姑息性的。
在一些實施例中，rMVA病毒載體與抗感染劑一起投與，例如NS5B抑制劑(包括(但不限於)瑞美德韋(remdesivir))、蛋白酶抑制劑(諸如先前批准用於HIV之洛匹那韋(lopinavir)或利托那韋(ritonavir))。在一些實施例中，抗感染劑係選自：法匹拉韋(favipiravir)、芬戈莫德(fingolimod) (吉倫亞(Gilenya))、甲基普賴蘇濃(methylprednisolone)、貝伐單抗(bevacizumab) (安維汀(Avastin))、安特美(Actemra) (托西利單抗(tocilizumab))、優米弗韋(umifenovir)、氯沙坦及REGN3048與REGN3051之單株抗體組合、利巴韋林(ribavirin)、AT-527(Atea Pharmaceuticals，在美國專利第10,519,186號中描述，其以引用之方式併入本文中)或AT-511 (Atea Pharmaceuticals，在美國專利第10,519,186號中描述，其以引用之方式併入本文中)。此等藥物或疫苗中之任一者可與本文提供之rMVA組合或交替使用，以治療或預防易受SARS-CoV2此類病毒感染。
實施例 本文至少提供以下實施例： 1.      一種重組改良型安卡拉牛痘(rMVA)病毒載體，其包含編碼來源於重度急性呼吸道症候群-冠狀病毒2 (SARS-CoV2)之棘(S)蛋白、肽片段或其變體、膜(M)蛋白及套膜(E)蛋白之異源核酸序列，該異源核酸序列可操作地連接至與痘病毒表現系統相容之啟動子，其中在於宿主細胞中表現後，該S蛋白、肽片段或其變體、該M蛋白及該E蛋白能夠一起形成病毒樣顆粒。 2.      如實施例1之rMVA，其中該異源核酸序列編碼全長S蛋白。 3.      如實施例1或2之rMVA，其中該全長S蛋白包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 4.      如實施例3之rMVA，其中該全長S蛋白包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列。 5.      如實施例1至2之rMVA，其中編碼該S蛋白之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 3或與其至少95%同源之序列。 6.      如實施例5之rMVA，其中編碼該全長S蛋白之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 3。 7.      如實施例1或2之rMVA，其中該全長S蛋白包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 8.      如實施例7之rMVA，其中該全長S蛋白包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列。 9.      如實施例1至8之rMVA，其中該E蛋白包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 10.    如實施例9之rMVA，其中該E蛋白包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列。 11.    如實施例1至10之rMVA，其中編碼該E蛋白之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 42或與其至少95%同源之序列。 12.    如實施例11之rMVA，其中編碼該E蛋白之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 42。 13.    如實施例1至12之rMVA，其中該M蛋白包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 14.    如實施例13之rMVA，其中該M蛋白包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列。 15.    如實施例1至14之rMVA，其中編碼該M蛋白之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 45或與其至少95%同源之序列的S蛋白。 16.    如實施例15之rMVA，其中編碼該M蛋白之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 45。 17.    如實施例1之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 1、40及43之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 18.    如實施例17之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 1、40及43之胺基酸序列。 19.    如實施例1之rMVA，其中該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 3、42及45或與其至少95%同源之序列。 20.    如實施例19之rMVA，其中該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 3、42及45。 21.    如實施例1之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 6、40及43之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 22.    如實施例21之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 6、40及43之胺基酸序列。 23.    如實施例1至22之rMVA，其中該S蛋白包含一或多個選自以下之胺基酸取代：K986P、V987P、K417T、K417N、E484K或N501Y。 24.    如實施例23之rMVA，其中該S蛋白包含胺基酸取代K417T、E484K及N501Y。 25.    如實施例1至24之rMVA，其中編碼該S蛋白、該E蛋白及該M蛋白之該異源核酸序列可操作地連接至一或多個選自以下與痘病毒表現系統相容之啟動子：p11啟動子、pmH5啟動子、pH5啟動子、p7.5啟動子、pSyn及pHyb。 26.    如實施例25之rMVA，其中該啟動子為p7.5啟動子。 27.    如實施例25之rMVA，其中該啟動子為pmH5啟動子。 28.    如實施例25之rMVA，其中該啟動子為p11啟動子。 29.    如實施例27之rMVA，其中該啟動子為SEQ ID NO: 154。 30.    如實施例28之rMVA，其中該啟動子為SEQ ID NO: 155。 31.    如實施例1之rMVA，其中該rMVA異源核酸序列包含選自SEQ ID NO: 46、47、156之核酸序列。 32.    一種重組改良型安卡拉牛痘(rMVA)病毒載體，其包含編碼來源於重度急性呼吸道症候群-冠狀病毒2 (SARS-CoV2)之經穩定之棘(S)蛋白、肽片段或其變體、膜(M)蛋白及套膜(E)蛋白之異源核酸序列，該異源核酸序列可操作地連接至與痘病毒表現系統相容之啟動子，其中在於宿主細胞中表現後，該經穩定之S蛋白、肽片段或其變體、該M蛋白及該E蛋白能夠一起形成病毒樣顆粒。 33.    如實施例32之rMVA，其中該異源核酸序列編碼全長經穩定之S蛋白。 34.    如實施例32或33之rMVA，其中該全長經穩定之S蛋白包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 35.    如實施例34之rMVA，其中該全長經穩定之S蛋白包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列。 36.    如實施例32至33之rMVA，其中編碼該經穩定之S蛋白之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 10或與其至少95%同源之序列。 37.    如實施例36之rMVA，其中編碼該全長經穩定之S蛋白之異源核酸序列包含SEQ ID NO: 10。 38.    如實施例32或33之rMVA，其中該全長經穩定之S蛋白包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 39.    如實施例38之rMVA，其中該全長經穩定之S蛋白包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列。 40.    如實施例32至39之rMVA，其中該E蛋白包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 41.    如實施例40之rMVA，其中該E蛋白包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列。 42.    如實施例32至41之rMVA，其中編碼該E蛋白之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 42或與其至少95%同源之序列。 43.    如實施例42之rMVA，其中編碼該E蛋白之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 42。 44.    如實施例32至43之rMVA，其中該M蛋白包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 45.    如實施例4之rMVA，其中該M蛋白包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列。 46.    如實施例32至45之rMVA，其中編碼該M蛋白之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 45或與其至少95%同源之序列的S蛋白。 47.    如實施例46之rMVA，其中編碼該M蛋白之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 45。 48.    如實施例32之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 8、40及43之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 49.    如實施例48之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 8、40及43之胺基酸序列。 50.    如實施例32之rMVA，其中該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 10、42及45或與其至少95%同源之序列。 51.    如實施例50之rMVA，其中該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 10、42及45。 52.    如實施例32之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 11、40及43之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 53.    如實施例52之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 11、40及43之胺基酸序列。 54.    如實施例32之rMVA，其中該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 12、42及45或與其至少95%同源之序列。 55.    如實施例54之rMVA，其中該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 12、42及45。 56.    如實施例32至55之rMVA，其中編碼該S蛋白、該E蛋白及該M蛋白之該異源核酸序列可操作地連接至一或多個選自以下與痘病毒表現系統相容之啟動子：p11啟動子、pmH5啟動子、pH5啟動子、p7.5啟動子、pSyn及pHyb。 57.    如實施例56之rMVA，其中該啟動子為p7.5啟動子。 58.    如實施例56之rMVA，其中該啟動子為pmH5啟動子。 59.    如實施例56之rMVA，其中該啟動子為p11啟動子。 60.    如實施例58之rMVA，其中該啟動子為SEQ ID NO: 154。 61.    如實施例59之rMVA，其中該啟動子為SEQ ID NO: 155。 62.    如實施例32之rMVA，其中該rMVA異源核酸序列係選自包含SEQ ID NO: 48、49、50、157、159、160之核酸序列或與其至少95%同源之核酸序列。 63.    一種重組改良型安卡拉牛痘(rMVA)病毒載體，其包含編碼來源於重度急性呼吸道症候群-冠狀病毒2 (SARS-CoV2)之棘(S)蛋白受體結合域(RBD)之線性抗原決定基、膜(M)蛋白及套膜(E)蛋白之異源核酸序列，該異源核酸序列可操作地連接至與痘病毒表現系統相容之啟動子，其中在於宿主細胞中表現後，該線性抗原決定基、該M蛋白及該E蛋白能夠一起形成病毒樣顆粒。 64.    如實施例63之rMVA，其中該異源核酸序列編碼該S蛋白RBD域之胺基酸331-524。 65.    如實施例63或64之rMVA，其中該S蛋白RBD包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 66.    如實施例65之rMVA，其中該S蛋白RBD包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列。 67.    如實施例63至66之rMVA，其中編碼該S蛋白RBD之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 24或與其至少95%同源之序列。 68.    如實施例67之rMVA，其中編碼該S蛋白RBD之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 24。 69.    如實施例63之rMVA，其中該異源核酸序列編碼該S蛋白RBD域之胺基酸327-524。 70.    如實施例63或69之rMVA，其中該S蛋白RBD包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 71.    如實施例70之rMVA，其中該S蛋白RBD包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列。 72.    如實施例63或69至71之rMVA，其中編碼該S蛋白RBD之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 25或與其至少95%同源之序列。 73.    如實施例72之rMVA，其中編碼該S蛋白RBD之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 25。 74.    如實施例63之rMVA，其中該RBD域包含一或多個選自以下之取代：K417N、K417T、E484K或N501Y。 75.    如實施例74之rMVA，其中該RBD域包含取代K417T、E484K及N501Y。 76.    如實施例63之rMVA，其中該S蛋白RBD包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 77.    如實施例77之rMVA，其中該S蛋白RBD包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列。 78.    如實施例63之rMVA，其中該S蛋白RBD包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 79.    如實施例78之rMVA，其中該S蛋白RBD包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列。 80.    如實施例63至79之rMVA，其中該E蛋白包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 81.    如實施例80之rMVA，其中該E蛋白包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列。 82.    如實施例63至81之rMVA，其中編碼該E蛋白之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 42或與其至少95%同源之序列的S蛋白。 83.    如實施例82之rMVA，其中編碼該E蛋白之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 42。 84.    如實施例62至83之rMVA，其中該M蛋白包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 85.    如實施例84之rMVA，其中該M蛋白包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列。 86.    如實施例63至85之rMVA，其中編碼該M蛋白之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 45或與其至少95%同源之序列。 87.    如實施例86之rMVA，其中編碼該M蛋白之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 45。 88.    如實施例63之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 20、40及43之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 89.    如實施例88之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 20、40及43之胺基酸序列。 90.    如實施例63之rMVA，其中該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 24、42及45或與其至少95%同源之序列。 91.    如實施例90之rMVA，其中該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 24、42及45。 92.    如實施例63之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 21、40及43之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 93.    如實施例92之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 21、40及43之胺基酸序列。 94.    如實施例63之rMVA，其中該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 25、42及45或與其至少95%同源之序列。 95.    如實施例63之rMVA，其中該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 25、42及45。 96.    如實施例63至95之rMVA，其中該S RBD域進一步包含來源於該S蛋白之訊息肽及跨膜肽。 97.    如實施例96之rMVA，其中該S訊息肽包含SEQ ID NO: 55。 98.    如實施例96或97之rMVA，其中該S跨膜肽包含SEQ ID NO: 57。 99.    如實施例63至98之rMVA，其中編碼該S蛋白、該E蛋白及該M蛋白之該異源核酸序列可操作地連接至一或多個選自以下與痘病毒表現系統相容之啟動子：p11啟動子、pmH5啟動子、pH5啟動子、p7.5啟動子、pSyn及pHyb。 100.  如實施例99之rMVA，其中該啟動子為p7.5啟動子。 101.  如實施例99之rMVA，其中該啟動子為pmH5啟動子。 102.  如實施例99之rMVA，其中該啟動子為p11啟動子。 103.  如實施例101之rMVA，其中該啟動子包含SEQ ID NO: 154。 104.  如實施例102之rMVA，其中該啟動子包含SEQ ID NO: 155。 105.  如實施例63之rMVA，其中該rMVA異源核酸序列係選自包含SEQ ID NO: 51、52、53或54之序列或與其至少95%同源之核酸序列。 106.  一種重組改良型安卡拉牛痘(rMVA)病毒載體，其包含編碼來源於重度急性呼吸道症候群-冠狀病毒2 (SARS-CoV2)之棘(S)蛋白受體結合域(RBD)之線性抗原決定基、膜(M)蛋白及套膜(E)蛋白之異源核酸序列，該異源核酸序列可操作地連接至與痘病毒表現系統相容之啟動子，其中該線性S抗原決定基RBD域進一步包含來源於該S蛋白之訊息肽及跨膜肽，其中在於宿主細胞中表現後，該線性S抗原決定基RBD域、該M蛋白及該E蛋白能夠一起形成病毒樣顆粒。 107.  如實施例106之rMVA，其中該S訊息肽包含SEQ ID NO: 55。 108.  如實施例106或107之rMVA，其中該S跨膜肽包含SEQ ID NO: 57。 109.  如實施例106至108之rMVA，其中該異源核酸序列編碼該S蛋白RBD域之胺基酸327-524。 110.  如實施例106至109之rMVA，其中該S蛋白RBD包含SEQ ID NO: 61之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 111.  如實施例110之rMVA，其中該S蛋白RBD包含SEQ ID NO: 61之胺基酸序列。 112.  如實施例106至110之rMVA，其中該S蛋白RBD由包含SEQ ID NO: 65之核酸或與其至少95%同源之序列編碼。 113.  如實施例112之rMVA，其中該S蛋白RBD由包含SEQ ID NO: 65之核酸編碼。 114.  如實施例106至108之rMVA，其中該異源核酸序列編碼該S蛋白RBD域之胺基酸327-524。 115.  如實施例106至108及114之rMVA，其中該S蛋白RBD包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 116.  如實施例115之rMVA，其中該S蛋白RBD包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列。 117.  如實施例114至117之rMVA，其中編碼該S蛋白RBD之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 66或與其至少95%同源之序列。 118.  如實施例117之rMVA，其中編碼該S蛋白RBD之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 66。 119.  如實施例106之rMVA，其中該RBD域包含一或多個選自以下之取代：K417N、K417T、E484K或N501Y。 120.  如實施例119之rMVA，其中該RBD域包含取代K417T、E484K及N501Y。 121.  如實施例106之rMVA，其中該S蛋白RBD包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 122.  如實施例106之rMVA，其中該S蛋白RBD包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列。 123.  如實施例106之rMVA，其中該S蛋白RBD包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 124.  如實施例123之rMVA，其中該S蛋白RBD包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列。 125.  如實施例106至124之rMVA，其中該E蛋白包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 126.  如實施例125之rMVA，其中該E蛋白包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列。 127.  如實施例106至126之rMVA，其中編碼該E蛋白之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 42或與其至少95%同源之序列的S蛋白。 128.  如實施例127之rMVA，其中編碼該E蛋白之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 42。 129.  如實施例106至128之rMVA，其中該M蛋白包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 130.  如實施例129之rMVA，其中該M蛋白包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列。 131.  如實施例106至130之rMVA，其中編碼該M蛋白之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 45或與其至少95%同源之序列的S蛋白。 132.  如實施例131之rMVA，其中編碼該M蛋白之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 45。 133.  如實施例106之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 61、40及43之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 134.  如實施例133之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 61、40及43之胺基酸序列。 135.  如實施例106之rMVA，其中該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 65、42及45或與其至少95%同源之序列。 136.  如實施例135之rMVA，其中該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 65、42及45。 137.  如實施例106之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 62、40及43之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 138.  如實施例137之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 62、40及43之胺基酸序列。 139.  如實施例106之rMVA，其中該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 66、42及45或與其至少95%同源之序列。 140.  如實施例139之rMVA，其中該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 66、42及45。 141.  如實施例106之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 67、40及43之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 142.  如實施例141之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 67、40及43之胺基酸序列。 143.  如實施例106之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 68、40及43之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 144.  如實施例144之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 68、40及43之胺基酸序列。 145.  如實施例106至144之rMVA，其中編碼該S蛋白、該E蛋白及該M蛋白之該異源核酸序列可操作地連接至一或多個選自以下與痘病毒表現系統相容之啟動子：p11啟動子、pmH5啟動子、pH5啟動子、p7.5啟動子、pSyn及pHyb。 146.  如實施例145之rMVA，其中該啟動子為p7.5啟動子。 147.  如實施例145之rMVA，其中該啟動子為pmH5啟動子。 148.  如實施例145之rMVA，其中該啟動子為p11啟動子。 149.  如實施例147之rMVA，其中該啟動子包含SEQ ID NO: 154。 150.  如實施例148之rMVA，其中該啟動子包含SEQ ID NO: 155。 151.  如實施例106之rMBA，其中該rMVA異源核酸序列係選自包含SEQ ID NO: 69、70、71或72之序列或與其至少95%同源之核酸序列。 152.  一種重組改良型安卡拉牛痘(rMVA)病毒載體，其包含一或多個編碼以下之異源核酸序列：i)來源於SARS-CoV2之RBD域之棘(S)蛋白受體結合域(RBD)融合肽之線性抗原決定基，其中該融合肽包含a)馬堡病毒的套膜醣蛋白訊息肽，b)該RBD域的該線性抗原決定基，及c)套膜醣蛋白跨膜域；及ii)馬堡病毒基質蛋白，該一或多個異源核酸序列可操作地連接至與痘病毒表現系統相容的啟動子，其中在於宿主細胞中表現後，該RBD融合肽及該基質蛋白能夠一起形成病毒樣顆粒。 153.  如實施例152之rMVA，其中醣蛋白訊息肽包含SEQ ID NO: 88之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 154.  如實施例152或153之rMVA，其中該醣蛋白跨膜域包含SEQ ID NO: 90或與其至少95%同源之序列。 155.  如實施例152至154之rMVA，其中該基質蛋白為VP40蛋白。 156.  如實施例155之rMVA，其中該VP40蛋白包含SEQ ID NO: 92之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 157.  如實施例156之rMVA，其中該VP40蛋白由包含SEQ ID NO: 93或與其至少95%同源之序列的核酸編碼。 158.  如實施例152至157之rMVA，其中該異源核酸序列編碼該S蛋白RBD域之胺基酸327-524。 159.  如實施例158之rMVA，其中該RBD融合肽由包含SEQ ID NO: 97之核酸編碼。 160.  如實施例152至157之rMVA，其中該異源核酸序列編碼該S蛋白RBD域之胺基酸331-524。 161.  如實施例160之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 96之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 162.  如實施例161之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 96之胺基酸序列。 163.  如實施例160至162之rMVA，其中編碼該RBD融合肽之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 98或與其至少95%同源之序列。 164.  如實施例163之rMVA，其中編碼該RBD融合肽之該異源核酸序列包含SEQ ID NO: 98。 165.  如實施例152至157之rMVA，其中該RBD域包含一或多個選自以下之取代：K417N、K417T、E484K或N501Y。 166.  如實施例165之rMVA，其中該RBD域包含取代K417T、E484K及N501Y。 167.  如實施例152至157之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 168.  如實施例167之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列。 169.  如實施例152至157之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 170.  如實施例169之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列。 171.  如實施例152至173之rMVA，其中編碼該S蛋白、該E蛋白及該M蛋白之該異源核酸序列可操作地連接至一或多個選自以下與痘病毒表現系統相容之啟動子：p11啟動子、pmH5啟動子、pH5啟動子、p7.5啟動子、pSyn及pHyb。 172.  如實施例171之rMVA，其中該啟動子為p7.5啟動子。 173.  如實施例171之rMVA，其中該啟動子為pmH5啟動子。 174.  如實施例171之rMVA，其中該啟動子為p11啟動子。 175.  如實施例173之rMVA，其中該啟動子包含SEQ ID NO: 154。 176.  如實施例174之rMVA，其中該啟動子包含SEQ ID NO: 155。 177.  如實施例152至176之rMVA，其中該rMVA異源核酸序列係選自包含SEQ ID NO: 131、132、133、134、135、136、137或138之序列或與其至少95%同源之核酸序列。 178.  一種重組改良型安卡拉牛痘(rMVA)病毒載體，其包含一或多個編碼以下之異源核酸序列：i)來源於SARS-CoV2之RBD域之棘(S)蛋白受體結合域(RBD)融合肽之線性抗原決定基，其中該融合肽包含a)該S蛋白的訊息肽及b)該RBD域的該線性抗原決定基，及c)套膜醣蛋白跨膜域；ii)SARS-CoV2之M蛋白；及iii)SARS-CoV2之E蛋白，該一或多個異源核酸序列可操作地連接至與痘病毒表現系統相容的啟動子，其中在於宿主細胞中表現後，該RBD融合肽、該E蛋白及該M蛋白能夠一起形成病毒樣顆粒。 179.  如實施例178之rMVA，其中訊息肽包含SEQ ID NO: 55之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 180.  如實施例178至179之rMVA，其中該異源核酸序列編碼該S蛋白RBD域之胺基酸327-524。 181.  如實施例180之rMVA，其中該RBD融合肽包含含有SEQ ID NO: 55及20之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 182.  如實施例178至179之rMVA，其中該異源核酸序列編碼該S蛋白RBD域之胺基酸331-524。 183.  如實施例182之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 55及21之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 184.  如實施例161之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 55及21之胺基酸序列。 185.  如實施例178至179之rMVA，其中該異源核酸序列編碼該S蛋白RBD域之胺基酸327-598。 186.  如實施例185之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 55及161之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 187.  如實施例186之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 55及161之胺基酸序列。 188.  如實施例178至179之rMVA，其中該異源核酸序列編碼該S蛋白RBD域之胺基酸331-598。 189.  如實施例185之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 55及162之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 190.  如實施例189之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 55及162之胺基酸序列。 191.  如實施例178至190之rMVA，其中該RBD域包含一或多個選自以下之取代：K417N、K417T、E484K或N501Y。 192.  如實施例191之rMVA，其中該RBD域包含取代K417T、E484K及N501Y。 193.  如實施例192之rMVA，其中該異源核酸序列編碼該S蛋白RBD域之胺基酸327-524。 194.  如實施例193之rMVA，其中該RBD融合肽包含含有SEQ ID NO: 55及32之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 195.  如實施例191之rMVA，其中該異源核酸序列編碼該S蛋白RBD域之胺基酸331-524。 196.  如實施例195之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 55及33之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 197.  如實施例196之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 55及33之胺基酸序列。 198.  如實施例191之rMVA，其中該異源核酸序列編碼該S蛋白RBD域之胺基酸327-598。 199.  如實施例198之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 55及163之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 200.  如實施例199之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 55及163之胺基酸序列。 201.  如實施例191之rMVA，其中該異源核酸序列編碼該S蛋白RBD域之胺基酸331-598。 202.  如實施例201之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 55及164之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。 203.  如實施例202之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 55及164之胺基酸序列。 204.  如實施例179至203之rMVA，其中編碼該S蛋白、該E蛋白及該M蛋白之該異源核酸序列可操作地連接至一或多個選自以下與痘病毒表現系統相容之啟動子：p11啟動子、pmH5啟動子、pH5啟動子、p7.5啟動子、pSyn及pHyb。 205.  如實施例204之rMVA，其中該啟動子為p7.5啟動子。 206.  如實施例204之rMVA，其中該啟動子為pmH5啟動子。 207.  如實施例204之rMVA，其中該啟動子為p11啟動子。 208.  如實施例206之rMVA，其中該啟動子包含SEQ ID NO: 154。 209.  如實施例207之rMVA，其中該啟動子包含SEQ ID NO: 155。 210.  如實施例179至209之rMVA，其中該rMVA異源核酸序列包含SEQ ID NO: 158或與其至少95%同源之核酸序列。 211.  一種減少或預防人類感染SARS-CoV2之方法，其包含投與有效量之如實施例1至181中任一項之rMVA病毒載體。 212.  如實施例211之方法，其中該rMVA係作為預防性初始疫苗接種投與。 213.  如實施例211之方法，其中該rMVA係作為增強疫苗接種投與。 214.  如實施例213之方法，其中先前已對該人類投與SARS-CoV2疫苗。 215.  如實施例214之方法，其中該前述疫苗係選自：基於mRNA之疫苗、腺病毒疫苗、非複製性疫苗、DNA疫苗、減毒活疫苗、基於植物之輔助疫苗、基於多抗原決定基肽之疫苗、滅活病毒、肽疫苗或其組合。 216.  如實施例214之方法，其中該前述疫苗係選自：mRNA-1273 (MODERNA COVID-19疫苗；Moderna, Inc.)、AZD-1222 (COVIDSHIELD；AstraZeneca及牛津大學)、BNT162 (COMIRNATY；Pfizer及BioNTech)、Sputnik V (Gamaleya Research Institute，Acellena Contract Drug Research and Development)、CoronaVac (Sinovac)、NVX-CoV 2372 (NovoVax)、SCB-2019 (Sanofi及GSK)、ZyCoV-D (Zydus Cadila)、BBIBP-CorV (Beijing Institute of Biological Products；China National Pharmaceutical Group (Sinopharm))、EpiVacCorona (Federal Budgetary Research Institution State Research Center of Virology and Biotechnology)、Convidicea (CanSino Biologics)、Covid-19疫苗(Wuhan Institute of Biological Products；China National Pharmaceutical Group (Sinopharm)、JNJ-78436735 (Johnson & Johnson), ZF2001) Anhui Zhifei Longcom Biopharmaceutical, Institute of Microbiology of the Chinese Academy of Sciences)、CVnCoV (CureVac；GSK)、INO-4800 (Inovio Pharmaceuticals)、VIR-7831 (Medicago；GSK；Dynavax)、基於Covid-19腺病毒之疫苗(ImmunityBio；NantKwest)、UB-612 (COVAXX)或CoVaxin (Bharat Biotech)。 217.  如實施例213之方法，其中該人類先前已感染SARS-CoV2。 218.  如實施例211之方法，其中該rMVA係作為初次接觸抗原免疫疫苗及增強疫苗兩者投與。 219.  如實施例213至216之方法，其中該rMVA係作為增強疫苗投與2次或更多次。 219.  如實施例216之方法，其中該rMVA增強劑係在初次接觸抗原免疫疫苗接種4週或更久後投與。
所主張發明藉助於以下非限制性實例進一步描述。鑒於以上揭示內容且在實驗例證之後，包括藉助於說明而非限制的，且參考附圖，本發明之其他態樣及實施例對於一般熟習此項技術者將顯而易見。
實例
實例 1 ： S 蛋白 -E-M rMVA 病毒載體 GEO-CM01 之構築 使用來自COVID-19武漢海鮮市場肺炎病毒(GenBank登錄號MT039888.1)之S蛋白、M蛋白及E蛋白構築重組MVA疫苗候選者(GEO-CM01)。將SEQ ID NO: 156插入至親本減弱的病毒株改良型安卡拉牛痘MVA 1974/NIH純系1 (ATCC #PTA-5095)中，該病毒株由國家過敏及傳染性疾病研究所(NIAID), 病毒疾病實驗室(Laboratory of Viral Diseases；LVD)之Bernard Moss博士，使用pAD-1/S-ME穿梭載體(圖24)研發，以插入在兩個牛痘基因A5R與A6L之間。pAD-1/S-ME穿梭載體衍生於pAD-1/pUC57穿梭載體(圖26)。針對MVA對所插入序列進行密碼子最佳化。引入緘默突變以中斷均聚物序列(＞4G/C及＞4A/T)，其減少可能引起讀框轉移之RNA聚合酶誤差。針對牛痘特異性終止子編輯序列，以移除可引起過早終止之模體。使用經修飾之H5早期/晚期啟動子來驅動S及M插入物之轉錄，而使用p11啟動子來驅動E插入物之轉錄。藉由同源重組及在雞胚胎纖維母細胞中連續斑塊純化來製備rMVA。簡言之，將pAD-1/S-ME轉染至感染親本MVA之原代雞胚胎纖維母細胞(CEF)細胞中。自上清液及溶解物獲取重組病毒，接著使用報導基因篩選使其經受多輪斑塊純化。
為了驗證SEQ ID NO: 156插入至親本病毒株中，對表現S蛋白之核酸序列進行PCR擴增。使用50 ng來自用於產生GEO-CM01 (陽性對照)、GEO-CM01、MVA親本株(陰性對照)之穿梭質體pAD-1/S-ME之DNA，在具有10 mM引子之25 μl反應中擴增抗原插入物，該等引子為：正向引子p55 (5'-AGATCGGAGATGACTGCGATG-3') (SEQ ID NO: 151)及反向引子p54 (5'-CGATGGTAGGTCAGATTGTCC-3') (SEQ ID NO: 152)。藉由將10 μl PCR反應物負載至用溴化乙錠染色之1%瓊脂糖凝膠上來觀測反應物。如圖17及圖18中所示，GEO-CM01 rMVA之PCR產生適當的訊息(5384個鹼基對)。
為了驗證SME VLP之表現，CEF細胞用GEO-CM01感染，且48小時後藉由免疫細胞化學進行分析。簡言之，細胞用1:1甲醇:丙酮固定，用一級小鼠抗SARS-CoV-2棘蛋白抗體(GeneTex #GTX632604)及二級抗小鼠HRP染色，且用AEC過氧化酶受質(其介導斑塊之比色讀數)顯影。鑑別出陽性染色斑塊(參見圖16)。
為了進一步確認GEO-CM01中之抗原表現，進行GEO-CM01抗原表現之西方墨點分析。以低感染倍率(m.o.i.) (0.5)，用GEO-CM01或MVA親本株感染DF1細胞。在感染兩天之後，收穫細胞溶解物及上清液，且使等體積經受SDS-PAGE，轉移至PVDF膜，且用抗SARS-CoV-2棘蛋白/RBD (兔)抗體(Sino Biologicals，#40592-T62)及二級抗兔IgG探測(圖19)。在Odyssey紅外掃描儀上觀測膜。如圖19中所示，GEO-CM01感染之DF1細胞溶解物及上清液顯示表現棘蛋白。
獲取已感染GEO-CM01之DF1細胞中形成病毒樣顆粒之電子顯微(EM)影像(圖20)。
實例 2 - 使用 GEO-CM01 之 動物保護挑戰 使用倉鼠模型測定GEO-CM01之初始臨床前功效。嚴格根據Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the National Research Council中所描述之建議進行研究。盡一切努力較少動物之痛苦，且所有涉及可能疼痛之程序均用適當麻醉劑或鎮痛劑進行。基於病毒及免疫結果之統計分析，科學地調整所使用倉鼠之數目。
在免疫接種及血液收集之前，七週齡金色敍利亞雌性倉鼠(Envigo)用5%異氟醚麻醉，且在SARS-CoV-2刺激之前用氯胺酮/甲苯噻嗪麻醉。以每動物108 TCID50 之劑量，經由肌肉內途徑(遞送100 µl，按每後腿50 µl)，以29天間隔，用MVA-SME疫苗(GEO-CM01)疫苗接種倉鼠一次或兩次(每組N=10隻)，而對照組接受鹽水。在第一次免疫接種四天前及在免疫接種後27天(第27及56天)進行腔靜脈血液收集。在第59天，將疫苗接種的動物及對照動物鼻內暴露於目標劑量105 PFU之第5代分離株SARS-CoV-2 USA-WA1/2020。每日監測動物之體重減輕及疾病徵象。在刺激3天後，使各組中五隻動物藉由過度劑量之可注射麻醉劑(氯胺酮/甲苯噻嗪)進行安樂死，以用於病毒負荷測定。剩餘動物在感染14天後藉由過度劑量之氯胺酮/甲苯噻嗪進行安樂死。
測試自動物收集之血清之針對SARS-CoV-2之中和能力。簡言之，對血清樣本進行熱滅活(在56℃，30分鐘)。以2倍連續方式將10倍稀釋血清進一步稀釋，且將60 µl各血清稀釋液與60 µl SARS-CoV-2-mNG (200 PFU)混合。serum/病毒混合物在37℃培育1小時。接著，將100 µl血清/病毒混合物轉移至黑色平底96孔盤中之Vero E6細胞單層，且在37℃培育2天。用Cytation雜交多模讀取器(Biotek Instruments)在488 nm下量測病毒螢光。GEO-CM01誘導中和之能力之結果顯示於圖21及圖22中。結果顯示SARS-CoV-2斑形成減少50%時之稀釋度(圖21)。接受初次接觸抗原免疫/增強劑量之GEO-CM01之一半動物產生中和SARS-CoV-2之抗體，指示在金色倉鼠模型中，GEO-CM01引起針對SARS-CoV-2之中和抗體之能力。
藉由ELISA分析來自GEO-CM01免疫動物之血清之對以下具有特異性之抗體的含量：重組棘蛋白-膜(S-M)融合物、棘蛋白(S)及受體結合域(RBD)蛋白(圖22)。在單次劑量免疫接種(第27天)之後，觀測到可偵測含量之針對S-M、S及RBD之抗體。在初次接觸抗原免疫-增強疫苗接種之後觀測到針對此等蛋白之結合抗體之含量進一步增加，指示在金色倉鼠模型中，GEO-CM01誘導針對棘蛋白(包括RBD)及膜蛋白之穩固抗體。
動物以單劑量或初次接觸抗原免疫-增強方案進行疫苗接種，用SARS-CoV-2刺激，接著監測發病。在刺激之後每日記錄體重及健康評分(圖23)。單次劑量免疫接種少量地保護動物免於臨床疾病及體重減輕，而初次接觸抗原免疫-增強免疫接種提供針對臨床疾病的完全保護且在SARS-CoV-2刺激之後顯著地降低體重減輕，指示在金色倉鼠模型中，疫苗接種GEO-CM01顯著地降低發病，在SARS-CoV-2刺激之後保護動物免於患病。
實例 3 - 經穩定之 S 蛋白 -E-M rMVA 病毒載體 GEO-CM02 之構築 使用來自COVID-19武漢海鮮市場肺炎病毒(GenBank登錄號MT039888.1)之經穩定之S蛋白及M蛋白以及E蛋白構築重組MVA疫苗候選者(GEO-CM02)。將SEQ ID NO: 157插入至親本減弱的病毒株改良型安卡拉牛痘MVA 1974/NIH純系1 (ATCC #PTA-5095)中，該病毒株由國家過敏及傳染性疾病研究所(NIAID), 病毒疾病實驗室(LVD)之Bernard Moss博士，使用pAD-1/sS-ME穿梭載體(圖25)研發，以插入在兩個牛痘基因A5R與A6L之間。pAD-1/sS-ME穿梭載體衍生於pAD-1/pUC57穿梭載體(圖26)。針對MVA對所插入序列進行密碼子最佳化。引入緘默突變以中斷均聚物序列(＞4G/C及＞4A/T)，其減少可能引起讀框轉移之RNA聚合酶誤差。針對牛痘特異性終止子編輯序列，以移除可引起過早終止之模體。使用經修飾之H5早期/晚期啟動子來驅動S及M插入物之轉錄，而使用p11啟動子來驅動E插入物之轉錄。藉由同源重組及在雞胚胎纖維母細胞中連續斑塊純化來製備rMVA。簡言之，將pAD-1/sS-ME轉染至感染親本MVA之原代雞胚胎纖維母細胞(CEF)細胞中。自上清液及溶解物獲取重組病毒，接著使用報導基因篩選使其經受多輪斑塊純化。
為了驗證SEQ ID NO: 157插入至親本病毒株中，對表現經穩定之S蛋白之核酸序列進行PCR擴增。使用50 ng來自用於產生GEO-CM02 (陽性對照)、GEO-CM02、MVA親本株(陰性對照)之穿梭質體pAD-1/sS-ME之DNA，在具有10 mM引子之25 μl反應中擴增抗原插入物，該等引子為：正向引子p55 (5'-AGATCGGAGATGACTGCGATG-3') (SEQ ID NO: 151)及反向引子p54 (5'-CGATGGTAGGTCAGATTGTCC-3') (SEQ ID NO: 152)。藉由將10 μl PCR反應物負載至用溴化乙錠染色之1%瓊脂糖凝膠上來觀測反應物。如圖18及圖31中所示，GEO-CM02 rMVA之PCR產生適當的訊息(5384個鹼基對)。
為了進一步確認GEO-CM02中之抗原表現，進行GEO-CM02抗原表現之西方墨點分析。以低感染倍率(0.5)，用GEO-CM02或MVA親本株感染DF1細胞。在感染兩天之後，收穫細胞溶解物及上清液，且使等體積經受SDS-PAGE，轉移至PVDF膜，且用抗SARS-CoV-2棘蛋白/RBD (兔)抗體(Sino Biologicals，#40592-T62)及二級抗兔IgG探測(圖20)。
實例 4 - 使用 GEO-CM02 之 動物保護挑戰 使用倉鼠模型測定GEO-CM02之初始臨床前功效。
在第0天及第29天(初次接觸抗原免疫/增強群組)或僅在第29天(初次接觸抗原免疫群組)，使用108 PFU GEO-CM02對倉鼠進行初始肌肉內免疫。將在第59天對倉鼠鼻內投與SARS-CoV-2。一組倉鼠將在刺激後第3天(第62天)處死，且一群組將在刺激後第14天(第73天)處死。
將藉由ELISA分析SARS-CoV2抗體，且將測定抗體之中和能力。將收穫肺以用於病理組織學及病毒負荷之檢查。
實例 5 - SP-RBD-E/M rMVA 病毒載體之構築 使用來自COVID-19武漢海鮮市場肺炎病毒(GenBank登錄號MT039888.1)之S蛋白之RBD (胺基酸327-527)序列及M蛋白以及E蛋白構築重組MVA疫苗候選者(GEO-CM03)。RBD序列在其N端上側接S蛋白之訊息肽，且在其羧基端上側接S蛋白之跨膜區，因此允許在表現後形成在VLP表面上展示RBD之VLP。將SEQ ID NO: 158插入至親本減弱的病毒株改良型安卡拉牛痘MVA 1974/NIH純系1 (ATCC #PTA-5095)中，該病毒株由國家過敏及傳染性疾病研究所(NIAID), 病毒疾病實驗室(LVD)之Bernard Moss博士，使用pAD-1/SP-RBD-TM/E/M穿梭載體研發，以插入在兩個牛痘基因A5R與A6L之間。pAD-1/SP-RBD/E/M穿梭載體衍生於pAD-1/pUC57穿梭載體(圖26)。針對MVA對所插入序列進行密碼子最佳化。引入緘默突變以中斷均聚物序列(＞4G/C及＞4A/T)，其減少可能引起讀框轉移之RNA聚合酶誤差。針對牛痘特異性終止子編輯序列，以移除可引起過早終止之模體。使用經修飾之H5早期/晚期啟動子來驅動SP-RBD融合物插入物及M插入物之轉錄，而使用p11啟動子來驅動E插入物之轉錄。藉由同源重組及在雞胚胎纖維母細胞中連續斑塊純化來製備rMVA。簡言之，將pAD-1/SP-RBD-E/M轉染至感染親本MVA之原代雞胚胎纖維母細胞(CEF)細胞中。自上清液及溶解物獲取重組病毒，接著使用報導基因篩選使其經受多輪斑塊純化。
為了驗證SEQ ID NO: 158插入至親本病毒株中，對表現RBD插入物之核酸序列進行PCR擴增。使用50 ng來自用於產生GEO-CM03 (陽性對照)、GEO-CM03、MVA親本株(陰性對照)之穿梭質體之DNA，在具有10 mM引子之25 μl反應中擴增抗原插入物，該等引子為：正向引子p55 (5'-AGATCGGAGATGACTGCGATG-3') (SEQ ID NO: 151)及反向引子p54 (5'-CGATGGTAGGTCAGATTGTCC-3') (SEQ ID NO: 152)。藉由將10 μl PCR反應物負載至用溴化乙錠染色之1%瓊脂糖凝膠上來觀測反應物。如圖18及圖31中所示，GEO-CM03 rMVA之PCR產生適當的訊息(2422個鹼基對)。
為了進一步確認GEO-CM03中之抗原表現，進行GEO-CM03抗原表現之西方墨點分析。以低感染倍率(0.5)，用GEO-CM03或MVA親本株感染DF1細胞。在感染兩天之後，收穫細胞溶解物及上清液，且使等體積經受SDS-PAGE，轉移至PVDF膜，且用抗SARS-CoV-2棘蛋白/RBD (兔)抗體(Sino Biologicals，#40592-T62)及二級抗兔IgG探測(圖20)。
實例 6 - 使用 GEO-CM03 之 動物保護挑戰 使用倉鼠模型測定GEO-CM03之初始臨床前功效。
在第0天及第29天(初次接觸抗原免疫/增強群組)或僅在第29天(初次接觸抗原免疫群組)，使用108 PFU GEO-CM02對倉鼠進行初始肌肉內免疫。將在第59天對倉鼠鼻內投與SARS-CoV-2。一組倉鼠將在刺激後第3天(第62天)處死，且一群組將在刺激後第14天(第73天)處死。
將藉由ELISA分析SARS-CoV2抗體，且將測定抗體之中和能力。將收穫肺以用於病理組織學及病毒負荷之檢查。
實例 7 - MarvGP-RBD 及 MARV VP40 rMVA 病毒載體之構築 使用來自COVID-19武漢海鮮市場肺炎病毒(登錄號MT039888.1)及馬堡病毒(MARV)分離株MARV/H.sapiens-tc/COD/2000/24 DRC (登錄號JX458834)之序列，構築重組MVA疫苗候選者(GEO-CM03b)。將SEQ ID NO: 134插入至親本減弱的病毒株改良型安卡拉牛痘MVA 1974/NIH純系1 (ATCC #PTA-5095)中，該病毒株由國家過敏及傳染性疾病研究所(NIAID), 病毒疾病實驗室(LVD)之Bernard Moss博士研發。
將COVID-19棘蛋白基因受體結合域融合在馬堡病毒醣蛋白之訊息序列的胺基端處與馬堡病毒醣蛋白之跨膜域及胞質尾區的羧基端處之間(SignalMARV-RBDCOVID-TMMARV)。將SignalMARV-RBDCOVID-TMMARV次選殖至pLW76穿梭載體中，以用於插入在兩個必需牛痘基因A5R與A6L之間。將MARV基質蛋白(SEQ ID NO: 92) VP40次選殖至pAD2/67穿梭載體中，以用於插入在兩個必需牛痘基因A50R與B1R之間。針對MVA對所插入序列進行密碼子最佳化(SEQ ID NO: 94)。引入緘默突變以中斷均聚物序列(＞4G/C及＞4A/T)，其減少可能引起讀框轉移之RNA聚合酶誤差。針對牛痘特異性終止子編輯序列，以移除可引起過早終止之模體。使用經修飾之H5早期/晚期啟動子來驅動基因插入物之轉錄。藉由同源重組及連續斑塊純化來製備重組體。簡言之，將重組質體轉染至已感染親本MVA之原代雞胚胎纖維母細胞中。自上清液及溶解物獲取重組病毒，接著使用報導基因篩選使其經受多輪斑塊純化。
為了驗證SEQ ID NO: 134插入至親本病毒株中，對表現RBD插入物之核酸序列進行PCR擴增。使用50 ng來自用於產生GEO-CM03b (陽性對照)、GEO-CM03b、MVA親本株(陰性對照)之穿梭質體MTRDB之DNA，在具有10 mM引子之25 μl反應中擴增抗原插入物，該等引子為：正向引子p55 (5'-AGATCGGAGATGACTGCGATG-3') (SEQ ID NO: 151)及反向引子p54 (5'-CGATGGTAGGTCAGATTGTCC-3') (SEQ ID NO: 152)或正向引子p53 (5'-CAGAAGTTAATAAGCGTATAGCCATC-3') (SEQ ID NO: 153)及反向引子p54。藉由將10 μl PCR反應物負載至用溴化乙錠染色之1%瓊脂糖凝膠上來觀測反應物。如圖29中所示，GEO-CM03b rMVA之PCR產生適當的訊息(p54/p55：1288個鹼基對；p54/p53：1558個鹼基對，參見中間兩個箭頭)。
圖1A提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含在例如MVA基因A5R與A6L之間含有編碼全長S蛋白、E蛋白及M蛋白之核酸的插入物。如所例示的，在左至右取向上，mH5啟動子(pmH5)與編碼全長SARS-CoV2 S蛋白之核酸可操作地連接。插入物可在S蛋白序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在S蛋白之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，與S蛋白相鄰的為編碼全長E蛋白之核酸序列，該核酸序列例如與p11啟動子可操作地連接。類似於S蛋白，E蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前，包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤的核酸序列。如所例示的，插入物進一步包括編碼全長M蛋白之核酸序列。如所例示的，M蛋白編碼序列定向於右至左取向上，其中E蛋白編碼序列之3'端與M蛋白編碼序列之3'端相鄰。如所例示的，M蛋白編碼序列與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。M蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖1B-1C-1D為SEQ ID NO: 46之例示性rMVA核酸插入物，其編碼全長SARS-CoV2 S蛋白、M蛋白及E蛋白。在序列內亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖1E-1F-1G為SEQ ID NO: 47之例示性rMVA核酸插入物，其編碼全長SARS-CoV2 S蛋白、M蛋白及E蛋白。在序列內亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列、SmaI限制位點及c-標籤序列。
圖1H-1I-1J為SEQ ID NO: 156之例示性rMVA核酸插入物，其編碼全長SARS-CoV2 S蛋白、M蛋白及E蛋白。在序列內亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列、SmaI限制位點及c-標籤序列。
圖2A提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體在例如MVA基因A5R與A6L之間包含編碼經穩定之S蛋白、E蛋白及M蛋白的核酸插入物。如所例示的，在左至右取向上，mH5啟動子(pmH5)與編碼全長經穩定之SARS-CoV2 S蛋白之核酸可操作地連接。插入物可在經穩定之S蛋白序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在經穩定之S蛋白之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，與經穩定之S蛋白相鄰的為編碼全長E蛋白之核酸序列，該核酸序列例如與p11啟動子可操作地連接。類似於經穩定之S蛋白，E蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前，包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。如所例示的，插入物進一步包括編碼全長M蛋白之核酸序列。如所例示的，M蛋白編碼序列定向於右至左取向上，其中E蛋白編碼序列之3'端與M蛋白編碼序列之3'端相鄰。如所例示的，M蛋白編碼序列與pmH5啟動子可操作地連接。M蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖2B-2C-2D為SEQ ID NO: 48之例示性rMVA核酸插入物，其編碼全長經穩定之SARS-CoV2 S蛋白、M蛋白及E蛋白，該等蛋白包含胺基酸取代K986P及V987P。在序列內亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖2E-2F-2G為SEQ ID NO: 49之例示性rMVA核酸插入物，其編碼全長經穩定之SARS-CoV2 S蛋白、M蛋白及E蛋白，該等蛋白包含胺基酸取代K986P及V987P。在序列內亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、SmaI限制位點、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖2H-2I-2J為SEQ ID NO: 50之例示性rMVA核酸插入物，其編碼全長經穩定之SARS-CoV2 S蛋白、M蛋白及E蛋白，該等蛋白包含胺基酸取代K986P、V987P、K417T、E484K及N501Y。在序列內亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、SmaI限制位點、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖2K-2L-2M為SEQ ID NO: 157之例示性rMVA核酸插入物，其編碼全長經穩定之SARS-CoV2 S蛋白、M蛋白及E蛋白，該等蛋白包含胺基酸取代K986P及V987P。在序列內亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、SmaI限制位點、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖2N-2O-2P為SEQ ID NO: 159之例示性rMVA核酸插入物，其編碼全長經穩定之SARS-CoV2 S蛋白、M蛋白及E蛋白，該等蛋白包含胺基酸取代K986P、V987P、K417T、E484K及N501Y。在序列內亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、SmaI限制位點、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖2Q-2R-2S為SEQ ID NO: 160之例示性rMVA核酸插入物，其編碼全長經穩定之SARS-CoV2 S蛋白、M蛋白及E蛋白，該等蛋白包含胺基酸取代K986P、V987P、K417T、E484K及N501Y。在序列內亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、SmaI限制位點、起始密碼子及Kozak調節序列。
圖3A提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含插入在例如MVA基因A5R與A6L之間的編碼S蛋白之RBD (胺基酸331-524)區、E蛋白及M蛋白之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，mH5啟動子(pmH5)與編碼S蛋白之胺基酸331至524之核酸可操作地連接。插入物可在插入在S RBD (胺基酸331-524)蛋白質序列之5'之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在S RBD (胺基酸331-524)蛋白之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，與S RBD (胺基酸331-524)蛋白相鄰的為編碼全長E蛋白之核酸序列，該核酸序列例如與p11啟動子可操作地連接。類似於S RBD (胺基酸331-524)蛋白，E蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前，包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤的核酸序列。如所例示的，插入物進一步包括編碼全長M蛋白之核酸序列。如所例示的，M蛋白編碼序列定向於右至左取向上，其中E蛋白編碼序列之3'端與M蛋白編碼序列之3'端相鄰。如所例示的，M蛋白編碼序列與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。M蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖3B為SEQ ID NO: 53之例示性rMVA核酸插入物，其編碼S蛋白之RBD (胺基酸331-524)區、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖3C為SEQ ID NO: 54之例示性rMVA核酸插入物，其編碼S蛋白之RBD (胺基酸331-524)區、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、SmaI限制位點、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖3D提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含插入在例如MVA A5R與A6L之間的編碼S蛋白之RBD (胺基酸327-524)區、E蛋白及M蛋白之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，mH5啟動子(pmH5)與編碼S蛋白之胺基酸327至524之核酸可操作地連接。插入物可在插入在S RBD (胺基酸327-524)蛋白質序列之5'之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在S RBD (胺基酸327-524)蛋白之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，與S RBD (胺基酸327-524)蛋白相鄰的為編碼全長E蛋白之核酸序列，該核酸序列例如與p11啟動子可操作地連接。類似於S RBD (胺基酸327-524)蛋白，E蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前，包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤的核酸序列。如所例示的，插入物進一步包括編碼全長M蛋白之核酸序列。如所例示的，M蛋白編碼序列定向於右至左取向上，其中E蛋白編碼序列之3'端與M蛋白編碼序列之3'端相鄰。如所例示的，M蛋白編碼序列與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。M蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖3E為SEQ ID NO: 51之例示性rMVA核酸插入物，其編碼S蛋白之RBD (胺基酸327-524)區、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖3F為SEQ ID NO: 52之例示性rMVA核酸插入物，其編碼S蛋白之RBD (胺基酸327-524)區、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、SmaI限制位點、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖3G提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含插入在例如MVA A5R與A6L之間的編碼S蛋白訊息肽(SP)-S蛋白RBD (胺基酸331-524)-S蛋白跨膜域(STM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白之核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來源於S蛋白之胺基酸1-13的S蛋白訊息肽(SP)、S蛋白RBD (胺基酸331-524)肽及來源於S蛋白之胺基酸1214-1273的跨膜域(STM)。起始密碼子提供在SP-S RBD (胺基酸331-524)-STM融合物編碼核酸之5'。插入物可在訊息肽編碼序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前在SP-S RBD (胺基酸331-524)-STM融合物之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，與SP-S RBD (胺基酸331-524)-STM融合物編碼序列相鄰的為編碼全長E蛋白之核酸序列，該核酸序列例如與p11啟動子可操作地連接。E蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。如所例示的，插入物進一步包括編碼全長M蛋白之核酸序列。如所例示的，M蛋白編碼序列定向於右至左取向上，其中E蛋白編碼序列之3'端與M蛋白編碼序列之3'端相鄰。如所例示的，M蛋白編碼序列與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。M蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖3H提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含插入在例如MVA基因A5R與A6L之間的編碼S蛋白訊息肽(SP)-S蛋白RBD (胺基酸327-524)-S蛋白跨膜域(STM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白之核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來源於S蛋白之胺基酸1-13的S蛋白訊息肽(SP)、S蛋白RBD (胺基酸327-524)肽及來源於S蛋白之胺基酸1214-1273的跨膜域(STM)。起始密碼子提供在SP-S RBD (胺基酸327-524)-STM融合物編碼核酸之5'。插入物可在訊息肽編碼序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在SP-S RBD (胺基酸327-524)-STM融合物之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，與SP-S RBD (胺基酸327-524)-STM融合物編碼序列相鄰的為編碼全長E蛋白之核酸序列，該核酸序列例如與p11啟動子可操作地連接。E蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。如所例示的，插入物進一步包括編碼全長M蛋白之核酸序列。如所例示的，M蛋白編碼序列定向於右至左取向上，其中E蛋白編碼序列之3'端與M蛋白編碼序列之3'端相鄰。如所例示的，M蛋白編碼序列與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。M蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖3I-3J為SEQ ID NO: 69之例示性rMVA核酸插入物，其編碼S蛋白訊息肽(SP)-S蛋白RBD (胺基酸327-524)-S蛋白跨膜域(STM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖3K-3L為SEQ ID NO: 70之例示性rMVA核酸插入物，其編碼S蛋白訊息肽(SP)-S蛋白RBD (胺基酸327-524)-S蛋白跨膜域(STM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、SmaI限制位點、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖3M-3N為SEQ ID NO: 71之例示性rMVA核酸插入物，其編碼S蛋白訊息肽(SP)-S蛋白RBD (胺基酸331-524)-S蛋白跨膜域(STM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖3O-3P為SEQ ID NO: 72之例示性rMVA核酸插入物，其編碼S蛋白訊息肽(SP)-S蛋白RBD (胺基酸331-524)-S蛋白跨膜域(STM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、SmaI限制位點、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖3Q提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含插入在例如MVA基因A5R與A6L之間的編碼S蛋白訊息肽(SP)-S蛋白RBD (胺基酸327-524)融合蛋白、E蛋白及M蛋白之核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來源於S蛋白之胺基酸1-13的S蛋白訊息肽(SP)及S蛋白RBD (胺基酸327-524)肽。起始密碼子提供在SP-S RBD (胺基酸327-524)融合物編碼核酸之5'。插入物可在訊息肽編碼序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在SP-S RBD (胺基酸327-524)之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，與SP-S RBD (胺基酸327-524)融合物編碼序列相鄰的為編碼全長E蛋白之核酸序列，該核酸序列例如與p11啟動子可操作地連接。E蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。如所例示的，插入物進一步包括編碼全長M蛋白之核酸序列。如所例示的，M蛋白編碼序列定向於右至左取向上，其中E蛋白編碼序列之3'端與M蛋白編碼序列之3'端相鄰。如所例示的，M蛋白編碼序列與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。M蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖3R提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含插入在例如MVA基因A5R與A6L之間的編碼S蛋白訊息肽(SP)-S蛋白RBD (胺基酸331-524)融合蛋白、E蛋白及M蛋白之核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來源於S蛋白之胺基酸1-13的S蛋白訊息肽(SP)及S蛋白RBD (胺基酸331-524)肽。起始密碼子提供在SP-S RBD (胺基酸331-524)融合物編碼核酸之5'。插入物可在訊息肽編碼序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在SP-S RBD (胺基酸331-524)之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，與SP-S RBD (胺基酸331-524)融合物編碼序列相鄰的為編碼全長E蛋白之核酸序列，該核酸序列例如與p11啟動子可操作地連接。E蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。如所例示的，插入物進一步包括編碼全長M蛋白之核酸序列。如所例示的，M蛋白編碼序列定向於右至左取向上，其中E蛋白編碼序列之3'端與M蛋白編碼序列之3'端相鄰。如所例示的，M蛋白編碼序列與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。M蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖3S提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含插入在例如MVA基因A5R與A6L之間的編碼S蛋白訊息肽(SP)-S蛋白RBD (胺基酸327-598)融合蛋白、E蛋白及M蛋白之核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來源於S蛋白之胺基酸1-13的S蛋白訊息肽(SP)及S蛋白RBD (胺基酸327-598)肽。起始密碼子提供在SP-S RBD (胺基酸327-598)融合物編碼核酸之5'。插入物可在訊息肽編碼序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在SP-S RBD (胺基酸327-598)之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，與SP-S RBD (胺基酸327-598)融合物編碼序列相鄰的為編碼全長E蛋白之核酸序列，該核酸序列例如與p11啟動子可操作地連接。E蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。如所例示的，插入物進一步包括編碼全長M蛋白之核酸序列。如所例示的，M蛋白編碼序列定向於右至左取向上，其中E蛋白編碼序列之3'端與M蛋白編碼序列之3'端相鄰。如所例示的，M蛋白編碼序列與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。M蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖3T提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含插入在例如MVA基因A5R與A6L之間的編碼S蛋白訊息肽(SP)-S蛋白RBD (胺基酸331-598)融合蛋白、E蛋白及M蛋白之核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來源於S蛋白之胺基酸1-13的S蛋白訊息肽(SP)及S蛋白RBD (胺基酸331-598)肽。起始密碼子提供在SP-S RBD (胺基酸331-598)融合物編碼核酸之5'。插入物可在訊息肽編碼序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在SP-S RBD (胺基酸331-598)之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，與SP-S RBD (胺基酸331-598)融合物編碼序列相鄰的為編碼全長E蛋白之核酸序列，該核酸序列例如與p11啟動子可操作地連接。E蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。如所例示的，插入物進一步包括編碼全長M蛋白之核酸序列。如所例示的，M蛋白編碼序列定向於右至左取向上，其中E蛋白編碼序列之3'端與M蛋白編碼序列之3'端相鄰。如所例示的，M蛋白編碼序列與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。M蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖3U-3V為SEQ ID NO: 158之例示性rMVA核酸插入物，其編碼S蛋白訊息肽(SP)-S蛋白RBD (胺基酸331-524)-S蛋白跨膜域(STM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖4A提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含插入在例如MVA基因A5R與A6L之間的編碼S蛋白RBD源性胺基酸之串聯重複序列、E蛋白及M蛋白之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，mH5啟動子(pmH5)與編碼S RBD串聯重複序列((胺基酸504-524)-GPGPG-(胺基酸473-490)-GPGPG)5 之核酸可操作地連接。起始密碼子提供在S RBD串聯重複序列之5'。插入物可在S RBD串聯重複序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在S RBD串聯重複蛋白之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，與S RBD串聯重複蛋白相鄰的為編碼全長E蛋白之核酸序列，該核酸序列例如與p11啟動子可操作地連接。類似於S RBD串聯重複序列，E蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前，包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤的核酸序列。如所例示的，插入物進一步包括編碼全長M蛋白之核酸序列。如所例示的，M蛋白編碼序列定向於右至左取向上，其中E蛋白編碼序列之3'端與M蛋白編碼序列之3'端相鄰。如所例示的，M蛋白編碼序列與pmH5啟動子可操作地連接。M蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖4B-4C為SEQ ID NO: 73之例示性rMVA核酸插入物，其編碼S蛋白RBD源性胺基酸之串聯重複序列、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列、連接子序列及c-標籤序列。
圖4D-4E為SEQ ID NO: 74之例示性rMVA核酸插入物，其編碼S蛋白RBD源性胺基酸之串聯重複序列、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、SmaI限制位點、起始密碼子、Kozak調節序列、連接子序列及c-標籤序列。
圖4F提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含插入在例如MVA基因A5R與A6L之間的編碼S蛋白胺基酸1-13之訊息肽(SP)-S蛋白RBD串聯重複序列-S蛋白跨膜域(STM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白之核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來源於S蛋白之胺基酸1-13的訊息肽(SP)、S蛋白RBD串聯重複序列肽及來源於S蛋白之胺基酸1214-1273的跨膜域(STM)。起始密碼子提供在SP-S RBD串聯重複序列-STM融合物編碼核酸之5'。插入物可在訊息肽編碼序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在SP-S RBD串聯重複序列-STM融合物之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，與SP-S RBD串聯重複序列-STM融合物編碼序列相鄰的為編碼全長E蛋白之核酸序列，該核酸序列例如與p11啟動子可操作地連接。E蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。如所例示的，插入物進一步包括編碼全長M蛋白之核酸序列。如所例示的，M蛋白編碼序列定向於右至左取向上，其中E蛋白編碼序列之3'端與M蛋白編碼序列之3'端相鄰。如所例示的，M蛋白編碼序列與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。M蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖4G-4H為SEQ ID NO: 81之例示性rMVA核酸插入物，其編碼S蛋白胺基酸1-13之訊息肽(SP)-S蛋白RBD串聯重複序列-S蛋白跨膜域(STM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖4I-4J為SEQ ID NO: 82之例示性rMVA核酸插入物，其編碼S蛋白胺基酸1-13之訊息肽(SP)-S蛋白RBD串聯重複序列-S蛋白跨膜域(STM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、SmaI限制位點、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖5A提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含插入在例如MVA基因A5R與A6L之間的編碼S蛋白RBD共有序列、E蛋白及M蛋白之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，mH5啟動子(pmH5)與編碼S RBD共有蛋白質之核酸可操作地連接。起始密碼子提供在S RBD共有物編碼核酸之5'。插入物可在S RBD共有蛋白質編碼序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在S RBD共有蛋白之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，與S RBD共有蛋白編碼序列相鄰的為編碼全長E蛋白之核酸序列，該核酸序列例如與p11啟動子可操作地連接。類似於S RBD共有蛋白，E蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前，包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤的核酸序列。如所例示的，插入物進一步包括編碼全長M蛋白之核酸序列。如所例示的，M蛋白編碼序列定向於右至左取向上，其中E蛋白編碼序列之3'端與M蛋白編碼序列之3'端相鄰。如所例示的，M蛋白編碼序列與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。M蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖5B提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含插入在例如MVA基因A5R與A6L之間的編碼S蛋白胺基酸1-13之訊息肽(SP)-S蛋白RBD共有物-S蛋白跨膜域(STM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白之核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來源於S蛋白之胺基酸1-13的訊息肽(SP)、S蛋白RBD共有肽及來源於S蛋白之胺基酸1214-1273的跨膜域(STM)。起始密碼子提供在SP-S RBD共有物-STM融合物編碼核酸之5'。插入物可在訊息肽編碼序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在SP-S RBD共有物-STM融合物之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，與SP-S RBD共有物-STM融合物編碼序列相鄰的為編碼全長E蛋白之核酸序列，該核酸序列例如與p11啟動子可操作地連接。E蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。如所例示的，插入物進一步包括編碼全長M蛋白之核酸序列。如所例示的，M蛋白編碼序列定向於右至左取向上，其中E蛋白編碼序列之3'端與M蛋白編碼序列之3'端相鄰。如所例示的，M蛋白編碼序列與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。M蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖6A提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含插入在例如MVA基因A5R與A6L之間的編碼來源於S蛋白之經截短胺基酸1-1213(S1 + S2經截短蛋白)、E蛋白及M蛋白之核酸。如所例示的，在左至右取向上，mH5啟動子(pmH5)與編碼來源於S蛋白之經截短胺基酸1-1213 (S1+S2經截短蛋白)之核酸可操作地連接。插入物可在S (S1 + S2經截短)蛋白序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在S蛋白(S1+S2經截短蛋白)之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，自左至右取向，與S蛋白(S1+S2經截短蛋白)相鄰的為編碼全長E蛋白之核酸序列，該核酸序列例如與p11啟動子可操作地連接。類似於S蛋白(S1+S2經截短蛋白)，E蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前，包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤的核酸序列。如所例示的，插入物進一步包括編碼全長M蛋白之核酸序列。如所例示的，M蛋白編碼序列定向於右至左取向上，其中E蛋白編碼序列之3'端與M蛋白編碼序列之3'端相鄰。如所例示的，M蛋白編碼序列與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。M蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖6B-6C-6D為SEQ ID NO: 83之例示性rMVA核酸插入物，其編碼來源於S蛋白之經截短胺基酸1-1213 (S1 + S2經截短蛋白)、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖6E-6F-6G為SEQ ID NO: 84之例示性rMVA核酸插入物，其編碼來源於S蛋白(S1 + S2經截短蛋白)之經截短胺基酸1-1213、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、SmaI限制位點、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖6H提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含插入在例如MVA基因A5R與A6L之間的編碼來源於S蛋白之經截短胺基酸1-1213 (S1 + S2經截短蛋白) (在胺基酸981及982處具有兩個脯胺酸取代)、E蛋白及M蛋白之核酸。如所例示的，在左至右取向上，mH5啟動子(pmH5)與編碼來源於S蛋白之經截短胺基酸1-1213 (S1+S2經截短蛋白+ K986P及V987P)之核酸可操作地連接。插入物可在S (S1 + S2經截短蛋白+ K986P及V987P)蛋白序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在S蛋白(S1+S2經截短蛋白+ K986P及V987P)之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，自左至右取向，與S蛋白(S1+S2經截短蛋白+ K986P及V987P)相鄰的為編碼全長E蛋白之核酸序列，該核酸序列例如與p11啟動子可操作地連接。類似於S蛋白(S1+S2經截短蛋白+ K986P及V987P)，E蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前，包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤的核酸序列。如所例示的，插入物進一步包括編碼全長M蛋白之核酸序列。如所例示的，M蛋白編碼序列定向於右至左取向上，其中E蛋白編碼序列之3'端與M蛋白編碼序列之3'端相鄰。如所例示的，M蛋白編碼序列與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。M蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖6I-6J-6K為SEQ ID NO: 85之例示性rMVA核酸插入物，其編碼在胺基酸981及982處具有兩個脯胺酸取代之來源於S蛋白之經截短胺基酸1-1213 (S1 + S2經截短蛋白)、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖6L-6M-6N為SEQ ID NO: 86之例示性rMVA核酸插入物，其編碼在胺基酸981及982處具有兩個脯胺酸取代之來源於S蛋白之經截短胺基酸1-1213 (S1 + S2經截短蛋白)、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、SmaI限制位點、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖7A提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，其包含插入在MVA基因A5R與A6L之間的編碼訊息醣蛋白(訊息GP)-S蛋白RBD共有物-醣蛋白跨膜域序列(GP TM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白之核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來自非冠狀病毒訊息醣蛋白之訊息肽(訊息GP)、S蛋白RBD共有肽及醣蛋白之跨膜域(GP TM)。起始密碼子提供在訊息GP-S RBD共有物-GP TM融合物編碼核酸之5'。插入物可在訊息肽編碼序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在訊息GP-S RBD共有物-GP TM融合物之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，與訊息GP-S RBD共有物-GP TM融合物編碼序列相鄰的為編碼全長E蛋白之核酸序列，該核酸序列例如與p11啟動子可操作地連接。E蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。如所例示的，插入物進一步包括編碼全長M蛋白之核酸序列。如所例示的，M蛋白編碼序列定向於右至左取向上，其中E蛋白編碼序列之3'端與M蛋白編碼序列之3'端相鄰。如所例示的，M蛋白編碼序列與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。M蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。如所例示的，將編碼非冠狀病毒基質蛋白(例如馬堡病毒基質蛋白VP40)之核酸序列插入在例如MVA基因A50R與B1R之間。編碼基質蛋白之核酸序列例如與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。類似於融合蛋白，基質蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖7B提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，其包含插入在MVA基因A5R與A6L之間的編碼訊息醣蛋白(訊息GP)-S蛋白RBD (胺基酸331-524)共有物-醣蛋白跨膜域序列(GP TM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白之核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來自非冠狀病毒訊息醣蛋白之訊息肽(訊息GP)、S蛋白RBD (胺基酸331-524)共有肽及醣蛋白之跨膜域(GP TM)。起始密碼子提供在訊息GP-S RBD (胺基酸331-524)共有物-GP TM融合物編碼核酸之5'。插入物可在訊息肽編碼序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在訊息GP-S RBD (胺基酸331-524)共有物-GP TM融合物之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，與訊息GP-S RBD (胺基酸331-524)共有物-GP TM融合物編碼序列相鄰的為編碼全長E蛋白之核酸序列，該核酸序列例如與p11啟動子可操作地連接。E蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。如所例示的，插入物進一步包括編碼全長M蛋白之核酸序列。如所例示的，M蛋白編碼序列定向於右至左取向上，其中E蛋白編碼序列之3'端與M蛋白編碼序列之3'端相鄰。如所例示的，M蛋白編碼序列與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。M蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。如所例示的，將編碼非冠狀病毒基質蛋白(例如馬堡病毒基質蛋白VP40)之核酸序列插入在例如MVA基因A50R與B1R之間。編碼基質蛋白之核酸序列例如與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。類似於融合蛋白，基質蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖7C-7D為SEQ ID NO: 103之例示性rMVA核酸插入物，其編碼訊息醣蛋白(訊息GP)-S蛋白RBD (胺基酸331-524)共有物-醣蛋白跨膜域序列(GP TM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖7E-7F為SEQ ID NO: 104之例示性rMVA核酸插入物，其編碼訊息醣蛋白(訊息GP)-S蛋白RBD (胺基酸331-524)共有物-醣蛋白跨膜域序列(GP TM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、SmaI限制位點、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖7G提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，其包含插入在例如MVA基因A5R與A6L之間的編碼訊息醣蛋白(訊息GP)-S蛋白RBD (胺基酸327-524)共有物-醣蛋白跨膜域序列(GP TM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白之核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來自非冠狀病毒訊息醣蛋白之訊息肽(訊息GP)、S蛋白RBD (胺基酸327-524)共有肽及醣蛋白之跨膜域(GP TM)。起始密碼子提供在訊息GP-S RBD (胺基酸327-524)共有物-GP TM融合物編碼核酸之5'。插入物可在訊息肽編碼序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在訊息GP-S RBD (胺基酸327-524)共有物-GP TM融合物之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，與訊息GP-S RBD (胺基酸327-524)共有物-GP TM融合物編碼序列相鄰的為編碼全長E蛋白之核酸序列，該核酸序列例如與p11啟動子可操作地連接。E蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。如所例示的，插入物進一步包括編碼全長M蛋白之核酸序列。如所例示的，M蛋白編碼序列定向於右至左取向上，其中E蛋白編碼序列之3'端與M蛋白編碼序列之3'端相鄰。如所例示的，M蛋白編碼序列與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。M蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。如所例示的，將編碼非冠狀病毒基質蛋白(例如馬堡病毒基質蛋白VP40)之核酸序列插入在例如MVA基因A50R與B1R之間。編碼基質蛋白之核酸序列例如與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。類似於融合蛋白，基質蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖7H-7I為SEQ ID NO: 101之例示性rMVA核酸插入物，其編碼訊息醣蛋白(訊息GP)-S蛋白RBD (胺基酸327-524)共有物-醣蛋白跨膜域序列(GP TM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖7J-7K為SEQ ID NO: 102之例示性rMVA核酸插入物，其編碼訊息醣蛋白(訊息GP)-S蛋白RBD (胺基酸327-524)共有物-醣蛋白跨膜域序列(GP TM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、SmaI限制位點、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖8A提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含插入在例如MVA基因A5R與A6L之間的編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白RBD源性胺基酸之串聯重複序列-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白之核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來自非冠狀病毒醣蛋白的訊息肽(訊息GP MARV)、S RBD串聯重複序列((胺基酸504-524)-GPGPG-(胺基酸473-490)-GPGPG)5 及醣蛋白之跨膜域(GP TM)。起始密碼子提供在訊息GP MARV-S RBD串聯重複序列-GP TM融合物編碼序列之5'。插入物可在訊息GP MARV-S RBD串聯重複序列-GP TM融合物序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在融合蛋白之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，與融合蛋白相鄰的為編碼全長E蛋白之核酸序列，該核酸序列例如與p11啟動子可操作地連接。類似於融合蛋白，E蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。如所例示的，插入物進一步包括編碼全長M蛋白之核酸序列。如所例示的，M蛋白編碼序列定向於右至左取向上，其中E蛋白編碼序列之3'端與M蛋白編碼序列之3'端相鄰。如所例示的，M蛋白編碼序列與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。M蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。如所例示的，將編碼非冠狀病毒基質蛋白(例如馬堡病毒基質蛋白VP40)之核酸序列插入在例如MVA基因A50R與B1R之間。編碼基質蛋白之核酸序列例如與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。類似於融合蛋白，基質蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖8B-8C為SEQ ID NO: 111之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白RBD源性胺基酸之串聯重複序列-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列、連接子序列及c-標籤序列。
圖8D-8E為SEQ ID NO: 112之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白RBD源性胺基酸之串聯重複序列-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、SmaI限制位點、起始密碼子、Kozak調節序列、連接子序列及c-標籤序列。
圖9A提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含插入在例如MVA基因A5R與A6L之間的編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-來源於S蛋白經截短胺基酸2-1213 (S1 + S2經截短蛋白)-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白的核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來自非冠狀病毒醣蛋白的訊息肽(訊息GP MARV)、S蛋白(S1 + S2經截短蛋白)及醣蛋白的跨膜域(GP TM)。起始密碼子提供在訊息GP MARV-經截短S蛋白(S1 + S2經截短蛋白)-GP TM融合物編碼序列之5'。插入物可在訊息GP MARV-S蛋白(S1 + S2經截短蛋白)-GP TM融合物序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在融合蛋白之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，與融合蛋白相鄰的為編碼全長E蛋白之核酸序列，該核酸序列例如與p11啟動子可操作地連接。類似於融合蛋白，E蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。如所例示的，插入物進一步包括編碼全長M蛋白之核酸序列。如所例示的，M蛋白編碼序列定向於右至左取向上，其中E蛋白編碼序列之3'端與M蛋白編碼序列之3'端相鄰。如所例示的，M蛋白編碼序列與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。M蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。如所例示的，將編碼非冠狀病毒基質蛋白(例如馬堡病毒基質蛋白VP40)之核酸序列插入在例如MVA基因A50R與B1R之間。編碼基質蛋白之核酸序列例如與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。類似於融合蛋白，基質蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖9B-9C-9D為SEQ ID NO: 119之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-來源於S蛋白之經截短胺基酸2-1213 (S1 + S2經截短蛋白)-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖9E-9F-9G為SEQ ID NO: 120之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-來源於S蛋白之經截短胺基酸2-1213 (S1 + S2經截短蛋白)-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、SmaI限制位點、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖9H提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含插入在例如MVA基因A5R與A6L之間的編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-來源於S蛋白之經截短胺基酸2-1213 (S1+S2經截短蛋白+ K986P及V987P)-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白的核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來自非冠狀病毒醣蛋白的訊息肽(訊息GP MARV)、S蛋白(S1+S2經截短蛋白+ K986P及V987P)及醣蛋白的跨膜域(GP TM)。起始密碼子提供在訊息GP MARV-經截短S蛋白(S1+S2經截短蛋白+ K986P及V987P)-GP TM融合物編碼序列之5'。插入物可在訊息GP MARV-S蛋白(S1+S2經截短蛋白+ K986P及V987P)-GP TM融合物序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在融合蛋白之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，與融合蛋白相鄰的為編碼全長E蛋白之核酸序列，該核酸序列例如與p11啟動子可操作地連接。類似於融合蛋白，E蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。如所例示的，插入物進一步包括編碼全長M蛋白之核酸序列。如所例示的，M蛋白編碼序列定向於右至左取向上，其中E蛋白編碼序列之3'端與M蛋白編碼序列之3'端相鄰。如所例示的，M蛋白編碼序列與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。M蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。如所例示的，將編碼非冠狀病毒基質蛋白(例如馬堡病毒基質蛋白VP40)之核酸序列插入在例如MVA基因A50R與B1R之間。編碼基質蛋白之核酸序列例如與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。類似於融合蛋白，基質蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖9I-9J-9K為SEQ ID NO: 121之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-來源於S蛋白之經截短胺基酸2-1213 (S1+S2經截短蛋白+ K986P及V987P)-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖9L-9M-9N為SEQ ID NO: 122之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-來源於S蛋白之經截短胺基酸2-1213 (S1+S2經截短蛋白+ K986P及V987P)-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白、E蛋白及M蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、SmaI限制位點、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖10A提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含：插入在MVA基因A5R與A6L之間的編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白S1 + S2經截短蛋白-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白的核酸序列；及插入在MVA基因A50R與B1R之間的編碼非冠狀病毒基質蛋白的核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來自非冠狀病毒醣蛋白之訊息肽(訊息GP MARV)、來源於S蛋白之經截短胺基酸2-1213 (S1 + S2經截短蛋白)及醣蛋白之跨膜域(GP TM)。起始密碼子提供在訊息GP MARV-S蛋白(S1 + S2經截短蛋白)-GP TM融合物編碼核酸(在左至右取向上)之5'。插入物可在訊息GP MARV-S蛋白(S1 + S2經截短蛋白)-GP TM融合物序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在融合蛋白之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，將編碼非冠狀病毒基質蛋白(例如馬堡病毒基質蛋白VP40)之核酸序列插入在MVA基因A50R與B1R之間。編碼基質蛋白之核酸序列例如與pmH5啟動子可操作地連接。類似於融合蛋白，基質蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖10B-10C為SEQ ID NO: 123之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白S1 + S2經截短蛋白-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖10D-10E為SEQ ID NO: 124之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白S1 + S2經截短蛋白-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、SmaI限制位點、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖10F提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含：插入在MVA基因A5R與A6L之間的編碼醣蛋白(訊息GP MARV)- S蛋白S1+S2經截短蛋白+ K986P及V987P-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白的核酸序列；及插入在MVA基因A50R與B1R之間的編碼非冠狀病毒基質蛋白的核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來自非冠狀病毒醣蛋白之訊息肽(訊息GP MARV)、來源於S蛋白之經截短胺基酸2-1213 (S1 + S2經截短蛋白)加胺基酸981及982處之兩個脯胺酸取代及醣蛋白之跨膜域(GP TM)。起始密碼子提供在訊息GP MARV-S蛋白(S1 + S2經截短蛋白)-GP TM融合物編碼核酸(在左至右取向上)之5'。插入物可在訊息GP MARV-S蛋白(S1+S2經截短蛋白+ K986P及V987P)-GP TM融合物序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在融合蛋白之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，將編碼非冠狀病毒基質蛋白(例如馬堡病毒基質蛋白VP40)之核酸序列插入在例如MVA基因A50R與B1R之間。編碼基質蛋白之核酸序列例如與pmH5啟動子可操作地連接。類似於融合蛋白，基質蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖10G-10H為SEQ ID NO: 125之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)- S蛋白S1+S2經截短蛋白+ K986P及V987P-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖10I-10J為SEQ ID NO: 126之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白S1+S2經截短蛋白+K986P及V987P-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、SmaI限制位點、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖10K提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含插入在例如MVA基因A5R與A6L之間的編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白S1 + S2經截短蛋白-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白的核酸序列及編碼非冠狀病毒基質蛋白的核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來自非冠狀病毒醣蛋白之訊息肽(訊息GP MARV)、來源於S蛋白之經截短胺基酸2-1213 (S1 + S2經截短蛋白)及醣蛋白之跨膜域(GP TM)。起始密碼子提供在訊息GP MARV-S蛋白(S1 + S2經截短蛋白)-GP TM融合物編碼核酸(在左至右取向上)之5'。插入物可在訊息GP MARV-S蛋白(S1 + S2經截短蛋白)-GP TM融合物序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在融合蛋白之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，亦作為例如雙順反子序列插入編碼非冠狀病毒基質蛋白(例如馬堡病毒基質蛋白VP40)之核酸序列。編碼基質蛋白之核酸序列例如與pmH5啟動子可操作地連接，且定向於3'至5'取向上。類似於融合蛋白，基質蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖10L-10M-10N為SEQ ID NO: 127之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白S1 + S2經截短蛋白-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白及MARC VP40蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖10O-10P-10Q為SEQ ID NO: 128之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白S1 + S2經截短蛋白-醣蛋白該跨膜域(GP TM)融合蛋白及MARC VP40蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、SmaI限制位點、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖10R提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含插入在例如MVA基因A5R與A6L之間的編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白S1 + S2經截短蛋白加胺基酸981及982處之兩個脯胺酸取代-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白的核酸序列及編碼非冠狀病毒基質蛋白的核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來自非冠狀病毒醣蛋白之訊息肽(訊息GP MARV)、來源於S蛋白之經截短胺基酸2-1213 (S1+S2經截短蛋白+ K986P及V987P)及醣蛋白之跨膜域(GP TM)。起始密碼子提供在訊息GP MARV-S蛋白(S1+S2經截短蛋白+ K986P及V987P)-GP TM融合物編碼核酸(在左至右取向上)之5'。插入物可在訊息GP MARV-S蛋白(S1+S2經截短蛋白+ K986P及V987P)-GP TM融合物序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在融合蛋白之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，亦作為例如雙順反子序列插入編碼非冠狀病毒基質蛋白(例如馬堡病毒基質蛋白VP40)之核酸序列。編碼基質蛋白之核酸序列例如與pmH5啟動子可操作地連接，且定向於3'至5'取向上。類似於融合蛋白，基質蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖10S-10T-10U為SEQ ID NO: 129之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白S1 + S2經截短蛋白加胺基酸981及982處之兩個脯胺酸取代-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白及MARC VP40蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖10V-10W-10X為SEQ ID NO: 130之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白S1 + S2經截短蛋白加胺基酸981及982處之兩個脯胺酸取代-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白及MARC VP40蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、SmaI限制位點、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖11A提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含：插入在MVA基因A5R與A6L之間的編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白RBD-醣蛋白之跨膜域(GPTM)融合蛋白的核酸序列；及插入在MVA基因A50R與B1R之間的編碼非冠狀病毒基質蛋白的核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來自非冠狀病毒醣蛋白之訊息肽(訊息GP MARV)、S蛋白RBD區及醣蛋白之跨膜域(GP TM)。起始密碼子提供在醣蛋白-S RBD融合物編碼核酸(在左至右取向上)之5'。插入物可在訊息GP MARV-S RBD-GP TM融合物序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在融合蛋白之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，將編碼非冠狀病毒基質蛋白(例如馬堡病毒基質蛋白VP40)之核酸序列插入在MVA基因A50R與B1R之間。編碼基質蛋白之核酸序列例如與pmH5啟動子可操作地連接。類似於融合蛋白，基質蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖11B提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含：插入在MVA基因A5R與A6L之間的編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白RBD (胺基酸331-524)-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白的核酸序列；及插入在MVA基因A50R與B1R之間的編碼非冠狀病毒基質蛋白的核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來自非冠狀病毒醣蛋白之訊息肽(訊息GP MARV)、S蛋白RBD (胺基酸331-524)區及醣蛋白之跨膜域(GP TM)。起始密碼子提供在醣蛋白-S RBD (胺基酸331-524)融合物編碼核酸(在左至右取向上)之5'。插入物可在訊息GP MARV-S RBD (胺基酸331-524)-GP TM融合物序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在融合蛋白之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，將編碼非冠狀病毒基質蛋白(例如馬堡病毒基質蛋白VP40)之核酸序列插入在MVA基因A50R與B1R之間。編碼基質蛋白之核酸序列例如與pmH5啟動子可操作地連接。類似於融合蛋白，基質蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖11C為SEQ ID NO: 133之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白RBD (胺基酸331-524)-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖11D為SEQ ID NO: 134之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白RBD (胺基酸331-524)-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列、SmaI限制位點及c-標籤序列。
圖11E提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含：插入在MVA基因A5R與A6L之間的編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白RBD (胺基酸327-524)-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白的核酸序列；及插入在MVA基因A50R與B1R之間的編碼非冠狀病毒基質蛋白的核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來自非冠狀病毒醣蛋白之訊息肽(訊息GP MARV)、S蛋白RBD (胺基酸327-524)區及醣蛋白之跨膜域(GP TM)。起始密碼子提供在醣蛋白-S RBD (胺基酸327-524)融合物編碼核酸(在左至右取向上)之5'。插入物可在訊息GP MARV-S RBD (胺基酸327-524)-GP TM融合物序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在融合蛋白之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，將編碼非冠狀病毒基質蛋白(例如馬堡病毒基質蛋白VP40)之核酸序列插入在MVA基因A50R與B1R之間。編碼基質蛋白之核酸序列例如與pmH5啟動子可操作地連接。類似於融合蛋白，基質蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖11F為SEQ ID NO: 131之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白RBD (胺基酸327-524)-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖11G為SEQ ID NO: 132之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白RBD (胺基酸327-524)-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列、SmaI限制位點及c-標籤序列。
圖11H提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含例如插入在MVA基因A5R與A6L之間的編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白RBD-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白的雙順反子核酸序列及編碼非冠狀病毒基質蛋白的核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來自非冠狀病毒醣蛋白之訊息肽(訊息GP MARV)、S蛋白RBD區及醣蛋白之跨膜域(GP TM)。起始密碼子提供在醣蛋白-S RBD融合物編碼核酸(在左至右取向上)之5'。插入物可在訊息GP MARV-S RBD-GP TM融合物序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在融合蛋白之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。另外，雙順反子核酸序列亦編碼非冠狀病毒基質蛋白，例如馬堡病毒基質蛋白VP40。編碼基質蛋白之核酸序列例如與pmH5啟動子可操作地連接。類似於融合蛋白，基質蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖11I提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含例如插入在MVA基因A5R與A6L之間的編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白RBD (胺基酸331-524)-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白的雙順反子核酸序列及編碼非冠狀病毒基質蛋白的核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來自非冠狀病毒醣蛋白之訊息肽(訊息GP MARV)、S蛋白RBD (胺基酸331-524)區及醣蛋白之跨膜域(GP TM)。起始密碼子提供在醣蛋白-S RBD融合物編碼核酸(在左至右取向上)之5'。插入物可在訊息GP MARV-S RBD (胺基酸331-524)-GP TM融合物序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在融合蛋白之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。另外，雙順反子核酸序列亦編碼非冠狀病毒基質蛋白，例如馬堡病毒基質蛋白VP40。編碼基質蛋白之核酸序列例如與pmH5啟動子可操作地連接。類似於融合蛋白，基質蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖11J-11K為SEQ ID NO: 137之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白RBD (胺基酸331-524)-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白及MARV VP40蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖11L-11M為SEQ ID NO: 138之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白RBD (胺基酸331-524)-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白及MARV VP40蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列、SmaI限制位點及c-標籤序列。
圖11N提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含例如插入在MVA基因A5R與A6L之間的編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白RBD (胺基酸327-524)-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白的雙順反子核酸序列及編碼非冠狀病毒基質蛋白的核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來自非冠狀病毒醣蛋白之訊息肽(訊息GP MARV)、S蛋白RBD (胺基酸327-524)區及醣蛋白之跨膜域(GP TM)。起始密碼子提供在醣蛋白-S RBD融合物編碼核酸(在左至右取向上)之5'。插入物可在訊息GP MARV-S RBD (胺基酸327-524)-GP TM融合物序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在融合蛋白之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。另外，雙順反子核酸序列亦編碼非冠狀病毒基質蛋白，例如馬堡病毒基質蛋白VP40。編碼基質蛋白之核酸序列例如與pmH5啟動子可操作地連接。類似於融合蛋白，基質蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖11O-11P為SEQ ID NO: 135之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白RBD (胺基酸327-524)-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白及MARV VP40蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖11Q-11R為SEQ ID NO: 136之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白RBD (胺基酸327-524)-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白及MARV VP40蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列、SmaI限制位點及c-標籤序列。
圖12A提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含：插入在MVA基因A5R與A6L之間的編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白RBD源性胺基酸之串聯重複序列-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白的核酸序列；及插入在MVA基因A50R與B1R之間的編碼非冠狀病毒基質蛋白的核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來自非冠狀病毒醣蛋白的訊息肽(訊息GP MARV)、S RBD串聯重複序列((胺基酸504-524)-GPGPG-(胺基酸473-490)-GPGPG)5 及醣蛋白之跨膜域(GP TM)。起始密碼子提供在訊息GP MARV-S RBD串聯重複序列-GP TM融合物編碼序列之5'。插入物可在訊息GP MARV-S RBD串聯重複序列-GP TM融合物序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在融合蛋白之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。如所例示的，將編碼非冠狀病毒基質蛋白(例如馬堡病毒基質蛋白VP40)之核酸序列插入在MVA基因A50R與B1R之間。編碼基質蛋白之核酸序列例如與mH5啟動子(pmH5)可操作地連接。類似於融合蛋白，基質蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖12B為SEQ ID NO: 139之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白RBD源性胺基酸之串聯重複序列-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖12C為SEQ ID NO: 140之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白RBD源性胺基酸之串聯重複序列-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列、SmaI限制位點及c-標籤序列。
圖12D提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含例如插入在MVA基因A5R與A6L之間的編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白RBD串聯重複序列((胺基酸504-524)-GPGPG-(胺基酸473-490)-GPGPG)5 )-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白的雙順反子核酸序列及編碼非冠狀病毒基質蛋白的核酸序列。如所例示的，mH5啟動子(pmH5)與編碼融合蛋白之核酸可操作地連接，其中在左至右取向上，融合蛋白包括來自非冠狀病毒醣蛋白之訊息肽(訊息GP MARV)、S蛋白RBD串聯重複序列((胺基酸504-524)-GPGPG-(胺基酸473-490)-GPGPG)5 )區及醣蛋白之跨膜域(GP TM)。起始密碼子提供在醣蛋白-S RBD融合物編碼核酸(在左至右取向上)之5'。插入物可在訊息GP MARV-S蛋白RBD串聯重複序列((胺基酸504-524)-GPGPG-(胺基酸473-490)-GPGPG)5 )-GP TM融合物序列之起始密碼子之前，包括轉譯起始序列，例如Kozak序列。另外，可在終止密碼子之前，在融合蛋白之3'端處包括編碼標籤(例如C-親和標籤)之核酸序列。另外，雙順反子核酸序列亦編碼非冠狀病毒基質蛋白，例如馬堡病毒基質蛋白VP40。編碼基質蛋白之核酸序列例如與pmH5啟動子可操作地連接。類似於融合蛋白，基質蛋白核酸序列亦可在終止密碼子之前包括適當的轉譯起始序列(諸如Kozak序列)以及在編碼序列之3'端處編碼標籤之核酸序列。
圖12E-12F為SEQ ID NO: 141之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白RBD串聯重複序列((胺基酸504-524)-GPGPG-(胺基酸473-490)-GPGPG)5)-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白及MARV VP40蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖12G-12H為SEQ ID NO: 142之例示性rMVA核酸插入物，其編碼醣蛋白(訊息GP MARV)-S蛋白RBD串聯重複序列((胺基酸504-524)-GPGPG-(胺基酸473-490)-GPGPG)5)-醣蛋白之跨膜域(GP TM)融合蛋白及MARV VP40蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列、SmaI限制位點及c-標籤序列。
圖13A提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含插入在MVA基因A5R與A6L之間的編碼全長S蛋白之核酸。如所例示的，在左至右取向上，mH5啟動子(pmH5)與編碼全長SARS-CoV2 S蛋白之核酸可操作地連接。插入物可在S蛋白序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列(例如Kozak序列)，以及在終止密碼子之前在編碼序列之3'端處包括編碼標籤之核酸序列。
圖13B-13C為SEQ ID NO: 143之例示性rMVA核酸插入物，其編碼全長S蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖13D-13E為SEQ ID NO: 144之例示性rMVA核酸插入物，其編碼全長S蛋白。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列、SmaI限制位點及c-標籤序列。
圖14A提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含插入在MVA基因A5R與A6L之間的編碼經穩定之S蛋白之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，mH5啟動子(pmH5)與編碼全長經穩定之SARS-CoV2 S蛋白之核酸可操作地連接。插入物可在經穩定之S蛋白序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列(例如Kozak序列)，以及在終止密碼子之前在編碼序列之3'端處包括編碼標籤之核酸序列。
圖14B-14C為SEQ ID NO: 145之例示性rMVA核酸插入物，其編碼全長經穩定之S蛋白加胺基酸981及982處之兩個脯胺酸取代。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖14D-14E為SEQ ID NO: 146之例示性rMVA核酸插入物，其編碼全長經穩定之S蛋白加胺基酸981及982處之兩個脯胺酸取代。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列、SmaI限制位點及c-標籤序列。
圖15A提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，該病毒載體包含插入在例如MVA基因A5R與A6L之間的編碼胺基酸1-1213經截短S蛋白(S1+S2經截短蛋白)之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，mH5啟動子(pmH5)與編碼全長SARS-CoV2 S (S1+S2經截短蛋白)蛋白之核酸可操作地連接。插入物可在S (S1+S2經截短蛋白)蛋白序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列(例如Kozak序列)，以及在終止密碼子之前在編碼序列之3'端處包括編碼標籤之核酸序列。
圖15B-15C為SEQ ID NO: 147之例示性rMVA核酸插入物，其編碼胺基酸1-1213經截短S蛋白(S1+S2經截短蛋白)。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖15D-15E為SEQ ID NO: 148之例示性rMVA核酸插入物，其編碼胺基酸1-1213經截短S蛋白(S1+S2經截短蛋白)。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列、SmaI限制位點及c-標籤序列。
圖15F提供例示性重組MVA病毒載體之例示性線性示意圖，其包含插入在例如MVA基因A5R與A6L之間的編碼胺基酸1-1213經截短S蛋白(S1+S2經截短蛋白+ K986P及V987P)之核酸序列。如所例示的，在左至右取向上，mH5啟動子(pmH5)與編碼全長SARS-CoV2 S (S1+S2經截短蛋白+ K986P及V987P)蛋白之核酸可操作地連接。插入物可在S (S1+S2經截短蛋白+ K986P及V987P)蛋白序列之起始密碼子之前包括轉譯起始序列(例如Kozak序列)，以及在終止密碼子之前在編碼序列之3'端處包括編碼標籤之核酸序列。
圖15G-15H為SEQ ID NO: 149之例示性rMVA核酸插入物，其編碼胺基酸1-1213經截短S蛋白(S1+S2經截短蛋白)加K986P及V987P之兩個取代。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列及c-標籤序列。
圖15I-15J為SEQ ID NO: 150之例示性rMVA核酸插入物，其編碼胺基酸1-1213經截短S蛋白(S1+S2經截短蛋白)加K986P及V987P之兩個取代。在序列中亦例示且標識出牛痘mH5啟動子、牛痘P11啟動子、起始密碼子、Kozak調節序列、SmaI限制位點及c-標籤序列。
圖16為CEF細胞之免疫細胞化學分析之圖像，該等CEF細胞用表現S、M及E VLP之重組MVA構築體GEO-CM01感染，暴露於一級小鼠抗SARS-CoV-2棘蛋白抗體及二級抗小鼠HRP抗體且用AEC過氧化酶受質顯影。箭頭指示S蛋白表現染色呈陽性之斑塊。
圖17為顯示S蛋白抗原插入物之擴增的PCR凝膠。GEO-CM01表示表現S、M及E VLP之重組MVA構築體GEO-CM01；使用50 ng來自用於產生GEO-CM01 (陽性對照)之穿梭質體之DNA來產生陽性對照；及陰性對照表示MVA親本株。
圖18為顯示S蛋白抗原插入物之擴增的PCR凝膠。CM01病毒DNA表示表現S、M及E VLP的重組MVA構築體GEO-CM01；CM01質體表示使用50 ng來自用於產生GEO-CM01之穿梭質體之DNA產生的陽性對照；CM02病毒DNA表示表現經穩定之S、M及E VLP的重組MVA構築體GEO-CM02；CM02質體表示使用50 ng來自用於產生GEO-CM02之穿梭質體之DNA產生的陽性對照；CM03病毒DNA表示表現S蛋白之RBD、M及E VLP的重組MVA構築體GEO-CM03；CM03質體表示使用50 ng來自用於產生GEO-CM03之穿梭質體之DNA產生的陽性對照；及空MVA DNA表示作為陰性對照的MVA親本株。
圖19為用以下感染之DF1細胞之細胞溶解物與上清液中之S蛋白抗原表現之西方墨點(Western blot)：重組MVA構築體GEO-CM01 (Covid M01)、GEO-CM02 (Covid M02)及GEO-CM03 (Covid M03)，從而指示病毒樣顆粒之形成。
圖20為GEO-CM01感染的DF1細胞中形成病毒樣顆粒之電子顯微影像。
圖21為SARS-CoV2中和分析之示意圖。針對其中和活SARS-CoV-2之能力，測試來自免疫接種動物之血清。將血清之連續稀釋液與SARS-CoV-2一起培育，且接著藉由斑塊檢定來測定中和程度(level of neutralization)。
圖22為在免疫接種黃金倉鼠之後，對針對重組棘蛋白-膜融合物、棘蛋白及S蛋白之受體結合域(RBD)之抗體偵測具有特異性之ELISA的示意圖。
圖23為在黃金倉鼠中之初次接觸疫苗免疫/增強(GEO-CM01)與對照試驗中SARS-CoV2刺激後體重與健康評分隨著時間推移的示意圖。P=0.0003，Friendman氏試驗，隨後Dunn氏多重比較檢定。
圖24為pAD-1/S-ME之穿梭載體圖譜。
圖25為pAD-1/sS-ME之穿梭載體圖譜。
圖26為pAD-1/pUC57之穿梭載體圖譜。
圖27為顯示S蛋白抗原插入物之擴增的PCR凝膠。GEO-CM02表示表現經穩定之S、M及E VLP之重組MVA構築體GEO-CM02；使用50 ng來自用於產生GEO-CM02 (陽性對照)之穿梭質體之DNA來產生陽性對照；及陰性對照表示MVA親本株。
圖28為顯示RBD抗原插入物之擴增之PCR凝膠。GEO-CM03表示表現經穩定之RBD、M及E VLP之重組MVA構築體GEO-CM03；使用50 ng來自用於產生GEO-CM03 (陽性對照)之穿梭質體之DNA來產生陽性對照；及陰性對照表示MVA親本株。來自GEO-CM01之擴增產物用作比較物。
圖29為顯示RBD抗原插入物之擴增之PCR凝膠。GEO-CM03b表示表現RBD之重組MVA構築體GEO-CM03b；使用50 ng來自用於產生GEO-CM03b之穿梭質體之DNA產生陽性對照(P=陽性對照)；及陰性對照表示MVA親本株(M)。M=MVA親本；P=pGeo-MTRBD 質體DNA；Cl.1 = MVA-RBDVP40純系#4/01；Cl.2 = MVA-RBDVP40純系#4/02。預期的PCR片段如下：p53/p54：MVA親本(M) = 647 bp；MVA-RBDVP40/GFP - 2544 bp (上部箭頭)；MVA-RBDVP40 - 1558 bp (中上箭頭)；pGEO-MTRBD - 2544 bp。P55/p54 = MVA親本(M) = 377 bp (下部箭頭)；MVA-RBDVP40/GFP - 1288 bp (中下箭頭)；MVA-RBDVP40 - 1288 bp (中下箭頭)；pGEO-MTRBD - 1288 bp (中下箭頭)。
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Claims (66)

  1. 一種重組改良型安卡拉牛痘(modified vaccinia Ankara；rMVA)病毒載體，其包含編碼來源於重度急性呼吸道症候群-冠狀病毒2 (severe acute respiratory syndrome-coronavirus 2；SARS-CoV2)之棘(S)蛋白、肽片段或其變體、膜(M)蛋白及套膜(E)蛋白之異源核酸序列，該異源核酸序列可操作地連接至與痘病毒表現系統相容之啟動子，其中在宿主細胞中表現後，該S蛋白、肽片段或其變體、該M蛋白及該E蛋白能夠一起形成病毒樣顆粒。
  2. 如請求項1之rMVA，其中該S蛋白包含SEQ ID NO: 1之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  3. 如請求項1之rMVA，其中該S蛋白包含SEQ ID NO: 6之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  4. 如請求項1至3之rMVA，其中該E蛋白包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  5. 如請求項1至4之rMVA，其中該M蛋白包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  6. 如請求項1至5之rMVA，其中該S蛋白包含一或多個選自以下之胺基酸取代：K986P、V987P、K417T、K417N、E484K或N501Y。
  7. 如請求項1之rMVA，其中該rMVA異源核酸序列包含選自SEQ ID NO: 46、47、156之核酸序列。
  8. 一種重組改良型安卡拉牛痘(rMVA)病毒載體，其包含編碼來源於重度急性呼吸道症候群-冠狀病毒2 (SARS-CoV2)之經穩定之棘(S)蛋白、肽片段或其變體、膜(M)蛋白及套膜(E)蛋白之異源核酸序列，該異源核酸序列可操作地連接至與痘病毒表現系統相容之啟動子，其中在宿主細胞中表現後，該經穩定之S蛋白、肽片段或其變體、該M蛋白及該E蛋白能夠一起形成病毒樣顆粒。
  9. 如請求項8之rMVA，其中該經穩定之S蛋白包含SEQ ID NO: 8之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  10. 如請求項8至9之rMVA，其中該經穩定之S蛋白包含SEQ ID NO: 11之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  11. 如請求項8至10之rMVA，其中該E蛋白包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  12. 如請求項8至11之rMVA，其中該M蛋白包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  13. 如請求項8之rMVA，其中該rMVA異源核酸序列係選自包含SEQ ID NO: 48、49、50、157、159、160之核酸序列或與其至少95%同源之核酸序列。
  14. 一種重組改良型安卡拉牛痘(rMVA)病毒載體，其包含編碼來源於重度急性呼吸道症候群-冠狀病毒2 (SARS-CoV2)之棘(S)蛋白受體結合域(RBD)之線性抗原決定基、膜(M)蛋白及套膜(E)蛋白之異源核酸序列，該異源核酸序列可操作地連接至與痘病毒表現系統相容之啟動子，其中在宿主細胞中表現後，該線性抗原決定基、該M蛋白及該E蛋白能夠一起形成病毒樣顆粒。
  15. 如請求項14之rMVA，其中該S蛋白RBD包含SEQ ID NO: 21之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  16. 如請求項14之rMVA，其中該S蛋白RBD包含SEQ ID NO: 20之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  17. 如請求項14至16之rMVA，其中該RBD域包含一或多個選自以下之取代：K417N、K417T、E484K或N501Y。
  18. 如請求項17之rMVA，其中該S蛋白RBD包含SEQ ID NO: 33之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  19. 如請求項17之rMVA，其中該S蛋白RBD包含SEQ ID NO: 32之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  20. 如請求項17至19之rMVA，其中該E蛋白包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  21. 如請求項17至20之rMVA，其中該M蛋白包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  22. 如請求項14之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 20、40及43之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  23. 如請求項14之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 21、40及43之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  24. 如請求項14至23之rMVA，其中該S RBD域進一步包含來源於該S蛋白之訊息肽及跨膜肽。
  25. 如請求項24之rMVA，其中該S訊息肽包含SEQ ID NO: 55。
  26. 如請求項24至25之rMVA，其中該S跨膜肽包含SEQ ID NO: 57。
  27. 如請求項14之rMVA，其中該rMVA異源核酸序列係選自包含SEQ ID NO: 51、52、53或54之序列或與其至少95%同源之核酸序列。
  28. 一種重組改良型安卡拉牛痘(rMVA)病毒載體，其包含編碼來源於重度急性呼吸道症候群-冠狀病毒2 (SARS-CoV2)之棘(S)蛋白受體結合域(RBD)之線性抗原決定基、膜(M)蛋白及套膜(E)蛋白之異源核酸序列，該異源核酸序列可操作地連接至與痘病毒表現系統相容之啟動子，其中該線性S抗原決定基RBD域進一步包含來源於該S蛋白之訊息肽及跨膜肽，其中在宿主細胞中表現後，該線性S抗原決定基RBD域、該M蛋白及該E蛋白能夠一起形成病毒樣顆粒。
  29. 如請求項28之rMVA，其中該S訊息肽包含SEQ ID NO: 55。
  30. 如請求項28或29之rMVA，其中該S跨膜肽包含SEQ ID NO: 57。
  31. 如請求項28至30之rMVA，其中該S蛋白RBD包含SEQ ID NO: 61之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  32. 如請求項29至30之rMVA，其中該S蛋白RBD包含SEQ ID NO: 62之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  33. 如請求項28至32之rMVA，其中該RBD域包含一或多個選自以下之取代：K417N、K417T、E484K或N501Y。
  34. 如請求項33之rMVA，其中該S蛋白RBD包含SEQ ID NO: 67之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  35. 如請求項33之rMVA，其中該S蛋白RBD包含SEQ ID NO: 68之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  36. 如請求項33至35之rMVA，其中該E蛋白包含SEQ ID NO: 40之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  37. 如請求項33至36之rMVA，其中該M蛋白包含SEQ ID NO: 43之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  38. 如請求項28之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 61、40及43之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  39. 如請求項28之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 62、40及43之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  40. 如請求項28之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 67、40及43之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  41. 如請求項28之rMVA，其中該異源核酸序列編碼包含SEQ ID NO: 68、40及43之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  42. 如請求項28之rMBA，其中該rMVA異源核酸序列係選自包含SEQ ID NO: 69、70、71或72之序列或與其至少95%同源之核酸序列。
  43. 一種重組改良型安卡拉牛痘(rMVA)病毒載體，其包含一或多個編碼以下之異源核酸序列：i)來源於SARS-CoV2之RBD域之棘(S)蛋白受體結合域(RBD)融合肽之線性抗原決定基，其中該融合肽包含a)馬堡病毒(Marburgvirus)的套膜醣蛋白訊息肽，b)該RBD域的該線性抗原決定基，及c)套膜醣蛋白跨膜域；及ii)馬堡病毒基質蛋白，該一或多個異源核酸序列可操作地連接至與痘病毒表現系統相容的啟動子，其中在宿主細胞中表現後，該RBD融合肽及該基質蛋白能夠一起形成病毒樣顆粒。
  44. 如請求項43之rMVA，其中醣蛋白訊息肽包含SEQ ID NO: 88之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  45. 如請求項43至44之rMVA，其中該醣蛋白跨膜域包含SEQ ID NO: 90或與其至少95%同源之序列。
  46. 如請求項43至45之rMVA，其中該基質蛋白為VP40蛋白。
  47. 如請求項46之rMVA，其中該VP40蛋白包含SEQ ID NO: 92之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  48. 如請求項43至47之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 95之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  49. 如請求項43至47之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 96之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  50. 如請求項43至49之rMVA，其中該RBD域包含一或多個選自以下之取代：K417N、K417T、E484K或N501Y。
  51. 如請求項50之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 99之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  52. 如請求項50之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 100之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  53. 如請求項43之rMVA，其中該rMVA異源核酸序列係選自包含SEQ ID NO: 131、132、133、134、135、136、137或138之序列或與其至少95%同源之核酸序列。
  54. 一種重組改良型安卡拉牛痘(rMVA)病毒載體，其包含一或多個編碼以下之異源核酸序列：i)來源於SARS-CoV2之RBD域之棘(S)蛋白受體結合域(RBD)融合肽之線性抗原決定基，其中該融合肽包含a)該S蛋白的訊息肽及b)該RBD域的該線性抗原決定基，及c)套膜醣蛋白跨膜域；ii)SARS-CoV2之M蛋白；及iii)SARS-CoV2之E蛋白，該一或多個異源核酸序列可操作地連接至與痘病毒表現系統相容的啟動子，其中在宿主細胞中表現後，該RBD融合肽、該E蛋白及該M蛋白能夠一起形成病毒樣顆粒。
  55. 如請求項54之rMVA，其中訊息肽包含SEQ ID NO: 55之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  56. 如請求項54之rMVA，其中該RBD融合肽包含含有SEQ ID NO: 55及20之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  57. 如請求項54之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 55及21之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  58. 如請求項54之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 55及161之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  59. 如請求項54之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 55及162之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  60. 如請求項54至59之rMVA，其中該RBD域包含一或多個選自以下之取代：K417N、K417T、E484K或N501Y。
  61. 如請求項60之rMVA，其中該RBD融合肽包含含有SEQ ID NO: 55及32之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  62. 如請求項60之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 55及33之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  63. 如請求項60之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 55及163之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  64. 如請求項60之rMVA，其中該RBD融合肽包含SEQ ID NO: 55及164之胺基酸序列或與其至少95%同源之序列。
  65. 如請求項60之rMVA，其中該rMVA異源核酸序列包含SEQ ID NO: 158或與其至少95%同源之核酸序列。
  66. 一種減少或預防人類感染SARS-CoV2之方法，其包含投與有效量之如請求項1至65中任一項之rMVA病毒載體。
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