ES2257823T3 - Genes de expresion optimizada en plantas que codifican toxinas pesticidas. - Google Patents

Genes de expresion optimizada en plantas que codifican toxinas pesticidas.

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ES2257823T3 ES98956551T ES98956551T ES2257823T3 ES 2257823 T3 ES2257823 T3 ES 2257823T3 ES 98956551 T ES98956551 T ES 98956551T ES 98956551 T ES98956551 T ES 98956551T ES 2257823 T3 ES2257823 T3 ES 2257823T3
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Guy A. Cardineau
Steven J. Stelman
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Abstract

Polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre la SEC ID nº 3 y los nucleótidos 1-1815 de la SEC ID nº 1.

Description

Genes de expresión optimizada en plantas que codifican toxinas pesticidas.
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud provisional de patente US nº de serie 60/065.215 (presentada el 12 de noviembre de 1997) y de la solicitud provisional de patente US nº de serie 60/076.445 (presentada el 2 de marzo de 1998).
Antecedentes de la invención
Los insectos y otras plagas suponen costes a los granjeros por valor de miles de millones de dólares cada año en concepto de pérdidas de cultivos y de gastos de control de estas plagas. Entre las pérdidas causadas por las plagas de insectos en las áreas de producción agrícola se incluyen la reducción del rendimiento del cultivo, una menor calidad del cultivo y mayores costes de recolección.
Los pesticidas químicos han proporcionado un procedimiento efectivo de control de las plagas; sin embargo, el público se ha concienciado sobre la cantidad de compuestos químicos residuales que pueden encontrarse en los alimentos, en las aguas subterráneas y en el medio ambiente. Por lo tanto, crecientemente se analizan los pesticidas químicos de síntesis, y ello es necesario, respecto a sus potencialmente tóxicas consecuencias ambientales. Los pesticidas químicos sintéticos pueden envenenar el suelo y los acuíferos subyacentes, contaminar las aguas superficies como resultado de la escorrentía, y destruir formas de vida que no son su diana. Los agentes químicos sintéticos de control presentan la desventaja adicional de comportar peligros de seguridad pública cuando se aplican en áreas en las que podrían entrar en contacto con animales de compañía, animales de granja o niños. También pueden comportar un peligro sanitario para las personas que los aplican, especialmente si no se observan las técnicas correctas de aplicación. Las administraciones de regulación en todo el mundo están limitando y/o prohibiendo la utilización de muchos pesticidas, y particularmente de los pesticidas químicos sintéticos que persisten en el medio ambiente y que se introducen en la cadena alimentaria. Entre los ejemplos de pesticidas químicos sintéticos ampliamente utilizados se incluyen los organoclorados, por ejemplo DDT, mirex, cepona, lindano, aldrín, clordano, aldicarb y dieldrín; los organofosforados, por ejemplo clorpirifos, paratión, malatión y diacinón; y los carbamatos. Las nuevas estrictas limitaciones a la utilización de los pesticidas y la eliminación de algunos pesticidas efectivos del mercado podría limitar las opciones económicas y efectivas para controlar algunas plagas que resultan costosas.
Debido a los problemas asociados a la utilización de los pesticidas químicos sintéticos, existe una clara necesidad de limitar la utilización de estos agentes y una necesidad de identificar agentes de control alternativos. La sustitución de los pesticidas químicos sintéticos, o la combinación de estos agentes con pesticidas biológicos, podría reducir los niveles de los compuestos químicos tóxicos en el medio ambiente.
Un agente pesticida biológico cada vez más popular es el microorganismo del suelo Bacillus thuringiensis (B.t.). El microorganismo del suelo Bacillus thuringiensis (B.t.) es una bacteria gram-positiva formadora de esporas. La mayoría de cepas de B.t. no muestran actividad pesticida. Algunas cepas de B.t. producen y pueden caracterizarse por inclusiones de proteína cristalina parasporal. Estas "endotoxinas \delta", que típicamente presentan actividad pesticida específica, son diferentes de las exotoxinas, que presentan un rango de huéspedes no específico. Estas inclusiones con frecuencia aparecen microscópicamente como cristales de forma diferenciada. Las proteínas pueden resultar altamente tóxicas para las plagas y son específicas en su actividad tóxica.
Las preparaciones de las esporas y de los cristales de B. thuringiensis subsp. kurstaki se han utilizado durante muchos años como insecticidas comerciales para plagas de lepidópteros. Por ejemplo, B. thuringiensis var. kurstaki HD-1 produce una \delta-endotoxina cristalina que resulta tóxica para las larvas de algunos insectos lepidópteros.
La clonación y expresión en Escherichia coli de un gen de la proteína cristalina de B.t. se describió en la literatura publicada hace más de 15 años (Schnepf, H.E., H.R. Whiteley [1981], Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2893-2897). Las patentes US nº 4.448.885 y nº 4.467.036 dan a conocer la expresión en E. coli de la proteína cristalina de B.t. Los productos basados en ADN recombinante de B.t. han sido producidos y han sido autorizados para su utilización.
La utilización comercial de los pesticidas de B.t. originalmente se restringió a un estrecho abanico de plagas de lepidópteros (orugas). Sin embargo, más recientemente los investigadores han descubierto pesticidas de B.t. con especificidades para un abanico mucho más amplio de plagas. Por ejemplo, se han utilizado comercialmente otras subespecies de B.t., como israelensis y morrisoni (a.k.a. tenebrionis, a.k.a. B.t. M-7), para el control de insectos de los órdenes Diptera y Coleoptera, respectivamente (Gaertner, F.H. [1989], "Cellular Delivery Systems for Insecticidal Proteins: Living and Non-Living Microorganisms", en Controlled Delivery of Crop Protection Agents, R.M. Wilkins, editor, Taylor and Francis, New York y London, 1990, páginas 245-255).
En la actualidad se han identificado nuevas subespecies de B.t., y se han aislado y secuenciado los genes responsables de las proteínas activas de \delta-endotoxina (Höfte, H., H.R. Whiteley [1989], Microbiological Reviews 52(2):242-255). Höfte y Whiteley clasificaron los genes de la proteína cristalina de B.t. en cuatro clases principales. Las clases eran cryI (específico de Lepidoptera), cryII (específico de Lepidoptera y de Diptera), cryIII (específico de Coleoptera) y cryIV (específico de Diptera). Se ha informado del descubrimiento de cepas específicamente tóxicas para otras plagas (Feitelson, J.S., J. Payne, L. Kim [1992], Biol. Technology 10:271-275). Por ejemplo, se han propuesto las denominaciones CryV y CryVI para dos nuevos grupos de toxinas activas en nemátodos.
Muchas moléculas de proteína cristalina de \delta-endotoxina de Bacillus thuringiensis están compuestas de dos segmentos funcionales. Para estas proteínas, la toxina nuclear resistente a proteasa es el primer segmento y corresponde a aproximadamente la primera mitad de la molécula proteica. La estructura tridimensional de un segmento nuclear de una \delta-endotoxina CryIIIA de B.t. es conocida, y se ha propuesto que todas las toxinas relacionadas presentan la misma estructura general (Li, J., J. Carroll, D.J. Ellar [1991], Nature 353:815-821). Con frecuencia se hace referencia a la segunda mitad de la molécula como el "segmento protoxina". El segmento protoxina se cree que participa en la formación del cristal de la toxina (Arvidson, H., P.E. Dunn, S. Strand, A.I. Aronson [1989], Molecular Microbiology 3:1533-1534; Choma, C.T., W.K. Surewicz, P.R. Carey, M. Pozsgay, T. Raynor, H. Kaplan [1990], Eur. J. Biochem. 189:523-527). En el aparato digestivo del insecto las proteasas típicamente procesan la molécula de toxina completa de 130 kDa hasta el segmento nuclear resistente. De esta manera, el segmento protoxina puede aportar a la toxina una especificidad parcial para un insecto al limitar la accesibilidad del núcleo al insecto mediante la reducción del procesamiento de la molécula de la toxina por parte de la proteasa (Haider, M.Z., B.H. Knowles, D.J. Ellar [1986], Eur. J. Biochem. 156:531-540) o mediante la reducción de la solubilidad de la toxina (Aronson, A.I., E.S. Han, W. McGaughey, D. Johnson [1991], Appl. Environ. Microbiol. 57:981-986).
La nomenclatura y esquema de clasificación de 1989 de Höfte y Whiteley se basaba tanto en la secuencia deducida de aminoácidos como en el rango de huésped de la toxina. Este sistema estaba adaptado para cubrir 14 tipos diferentes de genes de toxina que se dividieron en cinco clases principales. En la actualidad, el número de genes de proteína cristalina de Bacillus thuringiensis secuenciados es superior a 50. Se ha propuesto un esquema de nomenclatura revisado que se basa únicamente en la identidad de los aminoácidos (Crickmore et al. [1996], Society for Invertebrate Pathology, 29th Annual Meeting, IIIrd International Colloquium on Bacillus thuringiensis, Universidad de Córdoba, Córdoba, España, 1-6 de septiembre de 1996, resumen). La "llamada" mnemónica se ha conservado para todos los genes de toxina excepto para cytA y cytB, que siguen siendo una clase separada. Se han cambiado los numerales romanos por numerales arábigos en el primer escalafón, y se han eliminado los paréntesis en el tercer escalafón. Muchos de los nombres originales se han conservado, aunque algunos se han reclasificado.
Con la utilización de las técnicas de ingeniería genética, se están desarrollando nuevas técnicas para la administración de toxinas de B.t. en las áreas agrícolas, incluyendo la utilización de plantas modificadas genéticamente con genes de toxina de B.t. de resistencia a insectos y la utilización de células microbianas estabilizadas como vehículos de administración de toxinas de B.t. (Gaertner, F.H., L. Kim [1988], TIBTECH 6:S4-S7). De esta manera, los genes aislados de endotoxina de B.t. cada vez son más valiosos comercialmente.
Se han conseguido diversas mejoras mediante la modificación de toxinas de B.t. y/o de sus genes. Por ejemplo, las patentes US nº 5.380.831 y nº 5.567.862 se refieren a la producción de genes de proteína cristalina sintética insecticida que presentan una expresión mejorada en plantas.
Entre los obstáculos a la utilización agrícola exitosa de las toxinas de B.t. se incluyen el desarrollo de resistencia a las toxinas de B.t. por los insectos. Además, determinados insectos pueden ser refractarios a los efectos de B.t. Entre estos insectos se incluyen el gorgojo del algodón y el gusano de la hoja del algodonero, así como insectos adultos de la mayoría de especies que con anterioridad no han demostrado sensibilidad evidente a las \delta-endotoxinas de
B.t.
Así, las estrategias de control de la resistencia en la tecnología de plantas de B.t. están resultando cada vez de mayor atractivo. El descubrimiento de aislados de B.t. y de nuevos usos de los aislados conocidos de B.t. sigue siendo una técnica empírica e impredecible. Sigue existiendo una gran necesidad de nuevos genes de toxina que puedan expresarse con éxito a niveles adecuados en plantas de una manera que resulte en el control efectivo de insectos y de otras plagas.
Sumario de la invención
Un polinucleótido según la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre la SEC ID nº 3 y los nucleótidos nº 1 a nº 1.815 de la SEC ID nº 1. Éstas son secuencias polinucleótidas optimizadas para plantas que codifican toxinas pesticidas (de longitud completa y truncadas). Las secuencias polinucleótidas truncadas pueden utilizarse para producir toxinas truncadas o para la producción de genes y proteínas de fusión (o quiméricas).
Las secuencias polinucleótidas de la presente invención presentan determinadas modificaciones, en comparación con las secuencias de tipo salvaje, que las hacen particularmente adecuadas para la expresión optimizada en plantas. Mediante la utilización de técnicas conocidas por los expertos en la materia, pueden utilizarse las secuencias polinucleótidas indicadas en la presente memoria para transformar plantas con el fin de proporcionar a las plantas resistencia a plagas.
Descripción de la invención
La SEC ID nº 1 es una secuencia polinucleótida para un gen híbrido de longitud completa optimizado para plantas cryIF/cryIA(b), denominado 1F1AB-PO.
La SEC ID nº 2 es una secuencia de aminoácidos para una toxina quimérica de longitud completa optimizada para plantas CryIF/CryIA(b). El gen 1F1AB-PO codifica esta toxina.
La SEC ID nº 3 es una secuencia polinucleótida denominada PT-1AB-PO que se encuentra optimizada para la expresión en plantas. Este gen, que codifica una parte protoxina de Cry1Ab, puede utilizarse conjuntamente con genes truncados (genes que codifican toxinas nucleares truncadas) con el fin de preparar toxinas de longitud completa. A menos que se indique lo contrario, los genes quiméricos ejemplificados en la presente memoria se muestran con esta secuencia polinucleótida (PT-1AB-PO).
La SEC ID nº 4 es una secuencia de aminoácidos de una parte protoxina codificada por el gen denominado PT-1AB-PO.
Un gen cryIF truncado preferente de la presente invención corresponde a los nucleótidos nº 1 a nº 1.815 del gen quimérico de SEC ID nº 1. Puede añadirse un codón de parada, tal como TAA o TAG, a esta secuencia en las posiciones nº 1.816 a nº 1.818, por ejemplo, en el caso de que se desee utilizar una toxina truncada, sin una parte protoxina. Pueden modificarse de manera similar otras secuencias polinucleótidas y genes de la invención, como conocerá un experto en la materia.
Resultará evidente para un experto en la materia que, dadas la secuencias indicadas en la presente memoria, los genes de la invención pueden obtenerse mediante varios medios. En las formas de realización preferentes, los genes pueden construirse sintéticamente utilizando un sintetizador de genes. Los genes específicos ejemplificados en la presente memoria también pueden obtenerse modificando, de acuerdo a las enseñanzas de la invención, determinados genes de tipo salvaje (por ejemplo mediante técnicas de mutación puntual) a partir de determinados aislados depositados en una colección de cultivos, tal como se discute posteriormente. Por ejemplo, puede obtenerse un gen cryIF de tipo salvaje a partir del aislado de B.t. PS81I (ver las patentes US nº 5.126.133 y nº 5.188.960). De manera similar, las partes de cryIA(b) de los genes híbridos de la invención pueden producirse sintéticamente o pueden derivarse modificando genes de tipo salvaje. Las toxinas y genes CryIA(b) se han descrito en, por ejemplo, Höfte et al. (1986), Eur. J. Biochem. 161:273; Geiser et al. (1986), Gene 48:109; y Haider et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16:10927. Los clones y aislados adicionales de tipo salvaje se han discutido en más detalle anteriormente, en la sección titulada "Antecedentes de la invención" y se proporcionan en el listado, posteriormente.
Genes y toxinas: los polinucleótidos de la invención pueden utilizarse para formar "genes" completos para codificar proteínas o péptidos en una célula huésped deseada. Por ejemplo, como conocerá fácilmente un experto, los polinucleótidos de la invención se muestran sin codones de parada. Además, los polinucleótidos de la invención pueden colocarse apropiadamente bajo el control de un promotor en un huésped de interés, tal como se conoce fácilmente en la técnica.
Como reconocerá fácilmente el experto, el ADN puede existir en una forma de doble cadena. En esta disposición, una cadena es complementaria a la otra cadena y viceversa. La "cadena codificante" con frecuencia se utiliza en la técnica para referirse a la cadena que presenta una serie de codones (un codón es un grupo de tres nucleótidos que puede ser leído tres-a-la-vez para dar lugar a un aminoácido particular) que puede leerse como un marco de lectura abierto (ORF) para formar una proteína o péptido de interés. Con el fin de expresar una proteína in vivo, típicamente se traduce una cadena de ADN en una cadena complementaria de ARN que se utiliza como molde para la proteína. Al replicarse el ADN en una planta (por ejemplo), se producen cadenas complementarias adicionales de ADN. De esta manera, la invención incluye la utilización de los polinucleótidos ejemplificados que se muestran en el listado adjunto de secuencias o de sus cadenas complementarias. Se incluyen en la invención el ARN y el APN (ácidos péptido-nucleicos) que son funcionalmente equivalentes al ADN ejemplificado.
Huéspedes recombinantes: los genes codificantes de toxina de la invención pueden introducirse en una amplia diversidad de huéspedes microbianos o vegetales. En algunas formas de realización de la invención, pueden utilizarse huéspedes microbianos transformados en las etapas preliminares para preparar precursores, por ejemplo, que finalmente se utilizarán para transformar, en formas de realización preferentes, células vegetales y plantas de manera que expresen las toxinas codificadas por los genes de la invención. Los microorganismos transformados y utilizados de esta manera se encuentran dentro del alcance de la invención. Los microorganismos recombinantes pueden ser, por ejemplo, B.t., E. coli o Pseudomonas. Los expertos en la materia pueden llevar a cabo transformaciones siguiendo técnicas estándares. Los materiales necesarios para estas transformaciones se dan a conocer en la presente memoria o de otra manera se encuentran fácilmente disponibles para el experto en la materia.
De esta manera, en las formas de realización preferentes, la expresión del gen de la toxina resulta, de manera directa o indirecta, en la producción y mantenimiento intracelulares del pesticida. Cuando la plaga ingiere la planta transformada, las plagas ingerirán la toxina. El resultado es el control de la plaga.
\newpage
El gen de la toxina de B.t. puede introducirse a través de un vector adecuado en un huésped, preferentemente un huésped vegetal. Existen muchos cultivos de interés, tales como maíz, trigo, arroz, algodón, soja y girasol. Los genes de la invención son particularmente adecuados para proporcionar un mantenimiento y expresión estables en la planta transformada del gen que expresa el polipéptido pesticida y, deseablemente, proporciona una protección mejorada del pesticida frente a la degradación e inactivación ambientales.
Evidentemente se requiere una región promotora capaz de expresar el gen en la planta. De esta manera, para la expresión in planta, el ADN de la invención se encuentra bajo el control de un región promotora apropiada. Las técnicas para obtener la expresión in planta mediante la utilización de estos constructos son conocidas en la técnica.
Los genes que codifican las toxinas pesticidas, tal como se dan a conocer en la presente memoria, pueden insertarse en células vegetales utilizando una diversidad de técnicas que son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, un gran número de vectores de clonación que comprenden un sistema de replicación en E. coli y un marcador que permite la selección de las células transformadas se encuentra disponible para la preparación e inserción de genes foráneos en plantas superiores. Los vectores comprenden, por ejemplo, pBR322, la serie pUC, la serie M13mp, pACYC184, etc. De acuerdo con lo anterior, la secuencia que codifica la toxina de B.t. puede insertarse en el vector en un sitio de restricción adecuado. El plásmido resultante se utiliza para la transformación de E. coli. Las células de E. coli se cultivan en un medio nutritivo adecuado, después se recolectan y se lisan. El plásmido se recupera. Generalmente como procedimientos de análisis se llevan a cabo análisis de secuencia, análisis de restricción, electroforesis y otros procedimientos biológicos, bioquímicos y moleculares. Tras cada manipulación, la secuencia de ADN utilizada puede cortarse y unirse a la siguiente secuencia de ADN. Cada secuencia de plásmido puede clonarse en el mismo plásmido o en diferentes plásmidos.
Dependiendo del procedimiento de inserción de los genes deseados en la planta, pueden resultar necesarias otras secuencias de ADN. Si, por ejemplo, se utiliza el plásmido Ti o Ri para la transformación de la célula vegetal, resultará necesario unir por lo menos el margen derecho, aunque con frecuencia resultará necesario unir el margen derecho y el margen izquierdo del plásmido Ti o Ri de ADN-T como región flanqueante de los genes a insertar. La utilización de ADN-T para la transformación de las células vegetales se ha investigado intensivamente y se ha descrito suficientemente en la patente EP nº 120.516; Hoekema (1985), en: The Binary Plant Vector System, Offset-durkkerij Kanters B.V., Ablasserdam; capítulo 5; Fraley et al., Crit. Rev. Plant Sci. 4:1-46; y An et al. (1985), EMBO J. 4:277-287.
Una vez se ha integrado el ADN insertado en el genoma, es relativamente estable y, como regla general, no sale nuevamente del genoma. Normalmente contiene un marcador de selección que proporciona a las células vegetales transformadas resistencia frente a un biocida o a un antibiótico, tal como canamicina, G 418, bleomicina, higromicina o cloranfenicol, inter alia. El marcador individualmente utilizado de acuerdo con ello debe permitir la selección de las células transformadas frente a las células que no contienen el ADN insertado.
Se dispone de un gran número de técnicas para insertar ADN en una célula huésped vegetal. Entre estas técnicas se incluyen la transformación con ADN-T utilizando Agrobacterium tumefaciens o Agrobacterium rhizogenes como agente de transformación, la fusión, la inyección, biolística (bombardeo con micropartículas) o la electroporación, así como otros posibles procedimientos. Si se utilizan agrobacterias para la transformación, el ADN a insertar debe clonarse en plásmidos especiales, es decir, en un vector intermediario o en un vector binario. Los vectores intermediarios pueden integrarse en el plásmido Ti o Ri mediante recombinación homóloga gracias a secuencias que son homólogas a las secuencias presentes en el ADN-T. El plásmido Ti o Ri también comprende la región vir, necesaria para la transferencia del ADN-T. Los vectores intermediarios no pueden replicarse dentro de las agrobacterias. El vector intermediario puede transferirse a Agrobacterium tumefaciens por medio de un plásmido ayudante (conjugación). Los vectores binarios pueden replicarse tanto en E. coli como en agrobacterias. Comprenden un gen de marcador de selección y un línker o polilínker enmarcados por las regiones limítrofes derecha e izquierda de ADN-T. Pueden transformarse directamente en agrobacterias (Holsters et al. [1978], Mol. Gen. Genet. 163:181-187). El Agrobacterium utilizado como célula huésped debe comprender un plásmido que porte una región vir. La región vir resulta necesaria para la transferencia del ADN-T a la célula vegetal. Puede contener ADN-T adicional. La bacteria transformada de esta manera se utiliza para la transformación de las células vegetales. Los explantes de planta pueden cultivarse ventajosamente con Agrobacterium tumefaciens o de Agrobacterium rhizogenes para transferir el ADN a la célula vegetal. A continuación pueden regenerarse plantas completas a partir del material vegetal infectado (por ejemplo trozos de hoja, segmentos de tallo, raíces, aunque también protoplastos o células cultivadas en suspensión) en un medio adecuado, que puede contener antibióticos o biocidas para la selección. Las plantas obtenidas de esta manera seguidamente pueden someterse a ensayo para la presencia del ADN insertado. No se requieren plásmidos especiales en el caso de la inyección y la electroporación. Resulta posible utilizar plásmidos ordinarios tales como, por ejemplo, derivados de pUC.
Las células transformadas crecen dentro de las plantas de la manera habitual. Pueden formar células germinales y transmitir la característica o características transformadas en las plantas de la progenie. Estas plantas pueden cultivarse de la manera conocida y cruzarse con plantas que presentan los mismos factores hereditarios transformados u otros factores hereditarios. Los individuos híbridos resultantes presentan las propiedades fenotípicas correspondientes.
<110> Cardineau, Guy A.
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Stelman, Steven J. 
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Narva, Kenneth E. 
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<120> Genes optimizados para plantas que codifican toxinas pesticidas
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<130> MA-714XC2
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<140>
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<141>
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<150> 60/065.215
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<151> 1997-11-12
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<150> 60/076.445
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<151> 1998-03-02
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<160> 27
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<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> gen sintético de toxina de B.t.
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<400> 1
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1
2 
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<210> 2
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<211> 1148
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> toxina codificada por el gen sintético de B.t.
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<400> 2
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3
4
5
6
7 
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<210> 3
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<211> 1.641
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> gen sintético de protoxina de B.t.
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<400> 3
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8 
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<210> 4
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<211> 547
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Toxina codificada por el gen sintético de B.t.
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<400> 4
9
10

Claims (5)

1. Polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de entre la SEC ID nº 3 y los nucleótidos 1-1815 de la SEC ID nº 1.
2. Polinucleótido según la reivindicación 1, que comprende la SEC ID nº 3.
3. Polinucleótido según la reivindicación 1, que comprende la SEC ID nº 1.
4. Célula huésped transformada que comprende una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
5. Procedimiento para controlar una plaga, que comprende poner en contacto la plaga con una toxina producida por un huésped transformado que comprende una secuencia de nucleótidos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.
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