ES2252928T3

ES2252928T3 - Genes y proteinas ciclina e1.

Info

Publication number: ES2252928T3
Application number: ES99904337T
Authority: ES
Inventors: Steven Roy Coats; Michael Brian Bass; Murray O. Robinson
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1998-06-05
Filing date: 1999-01-28
Publication date: 2006-05-16
Anticipated expiration: 2019-01-28
Also published as: US20030078370A1; WO1999063089A1; US7455963B2; CA2336261A1; DE69928395D1; DK1082423T3; AU752358B2; US6943238B2; US20050282150A1; EP1082423A1; DE69928395T2; US5973119A; ATE310085T1; US6165753A; CA2336261C; EP1082423B1; JP2002517196A; AU2475499A

Abstract

Una molécula de ácido nucleico de ciclina E2 biológicamente activa aislada que codifica un polipéptido seleccionado del grupo formado por: (a) la molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NUM: 1; (b) la molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NUM: 2; (c) la molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NUM: 5; (d) la molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NUM: 7; (e) la molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NUM: 8; (f) una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEC ID NUM: 3, o un fragmento biológicamente activo de dicho polipéptido; (g) una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEC ID NUM: 4, o un fragmento biológicamente activo de dicho polipéptido; (h) una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEC ID NUM: 6, o un fragmento biológicamente activo de dicho polipéptido; (i) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es idéntico al menos en un 70 por cientoal polipéptido codificado por la SEC ID NUM: 1; (j) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es idéntico al menos en un 70 por ciento al polipéptido codificado por la SEC ID NUM: 5; (k) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es idéntico al menos en un 70 por ciento

Description

Genes y proteínas ciclina E1.

Campo de la invención

Esta invención se refiere generalmente a genes novedosos que codifican proteínas que son miembros de la familia de proteínas el ciclo celular conocidas como "ciclinas". Más específicamente, la invención está dirigida a una proteína novedosa denominada ciclina E2, al ADN que codifica la ciclina E2, y a los métodos para elaborar y utilizar los genes y polipéptidos de la ciclina E2.

Antecedentes Técnica relacionada A. Complejos CDK-Ciclina

La división celular es un procedimiento complejo que es regulado por numerosos factores celulares y medioambientales. En estudios recientes se han identificado dos clases de proteínas que parecen jugar papeles clave en el control del ciclo celular. Entre estas clases se incluyen las proteína quinasas dependientes de ciclina ("cdks") y las ciclinas. Las cdks funcionan fosforilando sustratos de proteína seleccionados de la célula; estas proteínas fosforiladas a su vez "señalan" la célula para que entre o continúe el procedimiento de la división celular. Para que las cdks se activen, es decir, fosforilen otras proteínas, deben ser unidas a una proteína ciclina. De ese modo, las ciclinas "regulan" la actividad de las cdks uniéndose a ellas.

Se han identificado numerosas cdks y ciclinas en mamíferos. En la actualidad, se conocen 9 cdks, y son referidas como "cdk1", "cdk2", etcétera. Actualmente se reconocen diez familias de ciclinas, y son referidas como "ciclina A", "ciclina B", y así sucesivamente hasta la "ciclina J". Para una revisión general de las ciclinas ver Coats y col. (en Signal Transduction, Heldin and Purton, eds., Chapman and Hall, publishers (1996); páginas 347-360) y Lees (Curr. Opinions Cell Biol., 7:773-780 [1995]).

Cada familia de ciclinas puede tener más de un miembro. Los mamíferos, por ejemplo, tienen dos tipos de ciclina A; ciclina A1 y ciclina A2, y tres tipos de ciclina D (D1, D2,y D3). Antes de la presente invención, sólo se conocía una ciclina E de mamífero, la ciclina E1, aunque Zariwala y col. (Pathways to Cancer, a Cold Spring Harbor Winter Conference, Harlow y col., eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY pág. 49 [1998]) han identificado supuestamente una proteína ciclina E novedosa. No se encuentran disponibles datos de la secuencia de ADN o de aminoácidos referentes a esta molécula.

Los miembros de la familia de la ciclina se clasifican típicamente basándose en la homología de su secuencia de aminoácidos para los miembros de la familia existentes. Por ejemplo, la ciclina A2 tiene aproximadamente una homología de la secuencia de aminoácidos del 45 por ciento con la ciclina A1, pero solamente una homología de secuencia del 19 por ciento con la ciclina D1 y una homología de secuencia del 21 por ciento con la ciclina E1 (calculada utilizado el programa de soporte lógico de alineamiento Clustal MacVector® de Oxford Molecular Group).

Todas las moléculas de ciclina contienen un dominio de la secuencia de aminoácidos referido como "caja de ciclina". La caja de ciclina tiene aproximadamente 100 aminoácidos de longitud (la longitud total media de un polipéptido de ciclina de 300-500 aminoácidos) y está localizada en la porción media de cada ciclina. Si bien la secuencia de aminoácidos precisa de la caja de ciclina varía de familia a familia, e incluso dentro de los miembros de una familia, existe un motivo altamente conservado en la caja de ciclina que está constantemente presente en todas las cajas de ciclina (ver la base de datos pública Prosite, número de acceso PS00292 que expone una secuencia "consenso" para la caja de ciclina).

Las ciclinas y las cdks se unen entre sí de una manera altamente selectiva; no todas las ciclinas se unen a todas las cdks. Por ejemplo, la ciclina D1 se puede asociar con cdk4, pero no con cdk2. De un modo similar, la ciclina E se puede asociar con cdk2 y cdk3, pero no con cdk4; la ciclina A se puede asociar con cdk2, pero no con cdk5. La formación de complejos ciclina-cdk es transitoria; las dos moléculas pueden estar presentes en la célula al mismo tiempo, pero solo pueden formar un complejo activo si la cdk es fosforilada por una enzima referida como "cak" por quinasa activadora de cdk.

B. Ciclina E1

La ciclina humana E1 fue clonada primero en 1991 y se encontró que se unía a cdk2 y la activaba (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.449.755 expedida el 12 de Septiembre de 1995; WO 93/06123 publicada el 1 de Abril de 1993; Koff y col., Cell, 66:1217-1228 [1991]; ver también la solicitiud de patente PCT WO 98/03649, publicada el 29 de Enero de 1998). Se han identificado homólogos de ciclina E1 en Drosophila (Richardson y col., Development, 119:673-690 [1993]), ratón (Damjanov y col., Biochem. Biophys. Res. Comm., 201:994-1000 [1994], Xenopus (Chevalier y col., J. Cell Sci., 109:1173-1184 [1996]) y Pez Cebra (Yarden y col., Devel. Dynam. 206:1-11 [1996]). Además, se ha informado sobre dos variantes de ciclina E1. La primera de estas es una variante de empalme de la ciclina E1 humana (Mumberg y col., Nuc. Acids Res., 25:2098-2105 1997]) que supuestamente tiene una deleción interna de 45 aminoácidos, y tiene un patrón de expresión que es distinto de la ciclina E1 completa. La otra variante referida carece supuestamente de 15 aminoácidos en el extremo amino (Ohtsubo y col., Mol. Cell. Biol., 15:2612-2624 [1995]).

Recientemente se ha informado sobre un polipéptido de ciclina novedoso, denominado ciclina N, que supuestamente está relacionado con la ciclina E1 (Lauper y col., Abstracts from the 1998 Cold Spring Harbor Laboratory Cell Cycle Meeting, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1998] pág. 115).

C. Ciclinas y Cáncer

Un sello distintivo del cáncer es la división de las células descontrolada, y aparentemente desregulada. El papel de las ciclinas y las cdks en la regulación de la división celular sugiere que estas proteínas pueden estar implicadas en la conversión de las células normales en células cancerosas. Numerosos estudios recientes han sido enfocados a la implicación de la ciclina y la cdk en el cáncer. Por ejemplo, en un reciente artículo para reseñar, Sherr (Science, 274:1672-1677 [1996]) apuntaba que se observa una sobreexpresión de la ciclina D1 en los sarcomas, los tumores colorrectales, y los melanomas, y que la ciclina E está sobreexpresada en los carcinomas de mama, estómago, colon y endometrio.

Sarcevic y col. (J. Biol. Chem., 272:33327-33337 [1997]) describen las especificidades de sustrato de diversos complejos ciclina-cdk en las células de cáncer de mama humano T-47D. Han descubierto, por ejemplo, que ciclina D1-cdk4 fosforilaba una proteína de 38 kDa, mientras ciclina D3-cdk4 fosforilaba una proteína de 105 kDa, una proteína de 102 kDa, y una proteína de 42 kDa. La ciclina E1-cdk2 y la ciclina A-cdk2 fosforilaban numerosas proteínas.

La ciclina E1 ha sido implicada en el cáncer de mama. En pacientes con cáncer de mama jóvenes, la elevada expresión de la ciclina E1 en el tejido tumoral de mama se corresponde supuestamente con una disminución de la supervivencia (Porter y col., Nature Med., 3:222-225 [1997]). Además, la ciclina E1 es aparentemente sobreexpresada en diversas líneas celulares de cáncer de mama (Gray-Bablin y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:15215-15220 [1996]).

Dado que los complejos de ciclina-cdk están implicados en la división celular y son activos en las células cancerosas, la inactivación de estos complejos podría dar como resultado un descenso de la proliferación de las células tumorales. En la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.645.999 expedida el 8 de Julio de 1997 se describen análisis que son supuestamente útiles para identificar compuestos que modulan la actividad de la ciclina E1.

Se han identificado algunas proteínas de origen natural como inhibidores de la actividad ciclina-cdk. Entre estas se incluyen las proteínas p21 y p27 (Patente de los Estados Unidos Núm. 5.688.665 expedida el 18 de Noviembre de 1997; PCT WO96/02140, publicada el 1 de Febrero de 1996; Sherr y col., Genes and Devel., 9:1149-1163 [1995]). La proteína p21 supuestamente se une directamente a cdk1, cdk2, y cdk4, y puede inhibir aparentemente tanto los complejos ciclina D-cdk como los complejos ciclina E-cdk (Sherr y col., supra). La proteína p27 se une supuestamente a los complejos ciclina-cdk (en lugar de a cdks aisladas) y puede inhibir aparentemente la actividad quinasa dependiente de ciclina A, B, D y E (Sherr y col., supra). No obstante, también se ha encontrado que ciclina E1-cdk2 regula supuestamente la p27 (Sheaff y col., Genes and Devel., 11:1464-1478 [1997]).

En vista de los efectos devastadores del cáncer, existe la necesidad en la técnica de identificar moléculas en el organismo humano que puedan tener un importante papel en la etiología de esta enfermedad, y de manipular la expresión de tales moléculas en los pacientes que padecen estas enfermedades y enfermedades afines.

Por consiguiente, un objeto de esta invención es proporcionar moléculas de ácido nucleico y polipéptidos que tengan un papel en la división celular.

Un objeto adicional es proporcionar métodos para alterar el nivel de expresión y/o la actividad de tales polipéptidos en el organismo humano.

Otros objetos relacionados serán fácilmente evidentes a partir de la lectura de esta descripción.

Compendio de la invención

En una realización, la presente invención proporciona una molécula de ácido nucleico de ciclina E2 biológicamente activa aislada que codifica un polipéptido seleccionado del grupo formado por:

a) la molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NUM: 1;

b) la molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NUM: 2;

c) la molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NUM: 5;

d) la molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NUM: 7;

e) la molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NUM: 8;

f) una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEC ID NUM: 3, o un fragmento biológicamente activo de dicho polipéptido;

g) una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEC ID NUM: 4, o un fragmento biológicamente activo de dicho polipéptido;

h) una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEC ID NUM: 6, o un fragmento biológicamente activo de dicho polipéptido;

i) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es idéntico al menos en un 70 por ciento al polipéptido codificado por la SEC ID NUM: 1;

j) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es idéntico al menos en un 70 por ciento al polipéptido codificado por la SEC ID NUM: 5.

k) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es idéntico al menos en un 70 por ciento al polipéptido codificado por la SEC ID NUM: 2.

En otra realización, la presente invención proporciona vectores que comprenden los ácidos nucleicos, y las células huésped que comprenden los vectores.

En otra realización más, la invención proporciona un procedimiento para producir un polipéptido de ciclina E2 que comprende las etapas de expresar un polipéptido codificado por la molécula de ácido nucleico de la ciclina E2 en una célula huésped adecuada y aislar el polipéptido.

En otra realización más, la invención proporciona un polipéptido de ciclina E2 seleccionado del grupo formado por: el polipéptido de la SEC ID NUM: 3, el polipéptido de la SEC ID NUM: 4, el polipéptido de la SEC ID NUM: 6, y un polipéptido que es idéntico al menos en un 70 por ciento a cualquiera de las SEC ID NUMS: 3, 4, o 5, donde el polipéptido de ciclina E2 puede tener o no una metionina amino terminal.

En otra realización, la presente invención proporciona un método in vitro para incrementar la proliferación de una célula, que comprende expresar un ácido nucleico que codifica la ciclina E2 o un fragmento biológicamente activo del mismo, en la célula.

En otra realización más, la presente invención proporciona un método in vitro para incrementar la división celular de una célula, que comprende expresar un gen de ciclina E2, o un fragmento biológicamente activo del mismo, en la célula.

La invención demuestra adicionalmente un método in vitro para disminuir la división celular en una célula, que comprende expresar un mutante de ciclina E2 en una célula, donde el mutante no tiene actividad biológica de ciclina E2.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa la secuencia de ADN completa de la ciclina E2 humana (SEC ID NUM: 1).

La Figura 2 representa la secuencia de ADN completa de la ciclina E2 de ratón (SEC ID NUM: 2).

La Figura 3 representa la supuesta secuencia de aminoácidos completa (SEC ID NUM: 3) de la ciclina E2 humana traducida a partir de la secuencia de ADNc.

La Figura 4 representa la supuesta secuencia de aminoácidos completa (SEC ID NUM: 4) de la ciclina E2 de ratón traducida a partir de la secuencia de ADNc.

La Figura 5 representa la secuencia de ADNc completa de una variante de empalme de la ciclina E2 humana (SEC ID NUM: 5).

La Figura 6 representa la supuesta secuencia de aminoácidos completa (SEC ID NUM: 6) de la variante de empalme de la ciclina E2 humana codificada por el ADN de la SEC ID NUM: 5.

La Figura 7 representa la secuencia de una molécula de ARN (SEC ID NUM: 7) que codifica la ciclina E2 humana completa en la cual los codones han sido optimizados para la expresión en células de E. coli.

La Figura 8 representa la secuencia de una molécula de ARN (SEC ID NUM: 17) que codifica la ciclina E2 de ratón completa en la cual los codones han sido optimizados para la expresión en células de E. coli.

La Figura 9 es una fotografía de un gel de SDS sometido a tinción de Coomasie. "Stds" hace referencia a los patrones de peso molecular previamente teñidos de los pesos moleculares indicados, y "Cyc E2" hace referencia al polipéptido de la ciclina E2 humana.

Las Figuras 10A-10E son fotografías de transferencias Western (10A-D) y una autorradiografía (10E). Se transfectaron células humanas con diversos constructos de ADN como se indica en la base de los paneles. "pEGFP" hace referencia al vector GFP; "HA·cdk2" hace referencia a cdk2 marcada con hemaglutinina; "p27" hace referencia a un vector que contiene el ADNc de p27 humana; "GFP-E2" hace referencia a un vector que contiene ADN de GFP fusionado al ADNc de la ciclina E2 completo; y "GFP-E2sv" hace referencia a un vector que contiene ADN de GFP fusionado al ADNc de una variante de empalme de la ciclina E2. Para todos los paneles, las células transfectadas fueron lisadas. En 10A-D, los productos de la lisis celular fueron tratados con antisuero anti-GFP después de lo cual se añadieron cuentas de Proteína A-Sepharose para inmunoprecipitar el anticuerpo anti-GFP. El producto inmunoprecipitado se hizo correr sobre un gel, se transfirió a una transferencia Western, y se sondeó con el anticuerpo indicado a la izquierda de cada panel. Para 10E, se añadieron la histona H1 y ATP-P^{32} al extracto celular, se incubaron durante aproximadamente 30 minutos a la temperatura ambiente, y la mezcla se hizo correr sobre SDS-PAGE. El gel se expuso después a la película durante 2 horas. La identidad de cada banda de las transferencias Western y la autorradiografía se indica a la derecha de cada panel.

La Figura 11 representa una "secuencia ambigua" de ciclina E2 humana (SEC ID NUM: 8); esta secuencia identifica aquellos codones que pueden ser cambiados para una expresión óptima del ADN tanto en células huésped eucarióticas como procarióticas. En esta Figura, las letras B, D, H, K, M, R, S, V, W, Y, y N tienen el significado normalizado de la IUPAC para los nucleótidos.

La Figura 12 es un diagrama de barras de una transferencia Northern que cuantifica los niveles de expresión del ARNm de la ciclina E2 humana, la ciclina E1 humana, y la enzima GADPH (como control) de diversos tejidos humanos. Los tejidos humanos están indicados en el eje de las x. El diagrama de barras fue generado mediante un barrido con ordenador de la transferencia Northern tras sondear con cada sonda. Se indican la ciclina E1, la ciclina E2, y GADPH.

La Figura 13 es una transferencia Northern de líneas celulares derivadas de tumor de mama humano sondeadas con sondas de ciclina E1 y ciclina E2. "Normal" hace referencia a células inmortalizadas normales. Se indican líneas celulares derivadas de tumores positivas para el receptor de estrógeno ("ER+") y negativas para el receptor del estrógeno ("ER-"). El nombre de cada línea celular está indicado en la parte superior de la transferencia.

La Figura 14 representa una "secuencia ambigua" de la ciclina E2 de ratón (SEC ID NUM: 18); esta secuencia identifica aquellos codones que pueden ser cambiados para la expresión óptima del ADN tanto en células huésped eucarióticas como procarióticas. Las letras tienen el significado normalizado de la IUPAC para los nucleótidos.

La Figura 15 representa una transferencia Western (15A) y un análisis de quinasa (15B) de una línea celular derivada de osteosarcoma humano denominada Saos-2. En 15A, las células fueron lisadas e inmunoprecipitadas o bien con suero pre-inmune ("PI"; Calle 2) o bien con antisuero anti-ciclina E2 ("E2"; Calle 3). Los productos inmunoprecipitados se hicieron correr sobre SDS-PAGE a partir del cual se generó la transferencia Western. La transferencia fue sondeada con un anticuerpo anti-cdk2. En 15B, se preparó un extracto a partir de la misma línea celular y se trató con anticuerpo anti-ciclina E2 (Calles 2-4) o suero preinmune (Calle 14), después se añadió proteína GST-Rb (Calle 3), o proteína histona H1 (Calle 2) al producto inmunoprecipitado. Al cabo de 30 minutos a 37°C, los productos inmunoprecipitados se hicieron correr sobre SDS-PAGE, y se expusieron a la película durante 2 horas.

Descripción detallada de la invención

Están incluidos en el alcance de esta invención los polipéptidos de ciclina E2 tales como los polipéptidos de las SEC ID NUM: 3 y SEC ID NUM: 4, y los fragmentos polipeptídicos, variantes, y derivados biológicamente activos de los mismos relacionados. Estos polipéptidos de ciclina E2 comparten una homología de sólo aproximadamente el 47 por ciento con los polipéptidos de ciclina E1 a nivel de aminoácidos y de aproximadamente el 55 por ciento a nivel de ADN.

Están incluidas en el alcance de la presente invención las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de ciclina E2, y los métodos para preparar los polipéptidos.

También están incluidos en el alcance de la presente invención los mamíferos no humanos tales como ratones, ratas, conejos, cabras, u ovejas en las cuales el gen ( o genes) que codifica (o codifican) la ciclina E2 natural ha (o han) sido desactivado (o desactivados) ("knocked out") de manera que el nivel de expresión de este gen o genes ha disminuido significativamente o ha sido completamente abolido. Tales mamíferos pueden ser preparados utilizando mecanismos y métodos tales como los descritos en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.557.032. En la presente invención se incluyen adicionalmente mamíferos no humanos tales como ratones, ratas, conejos, cabras, u ovejas en los cuales el gen (o genes) que codifica (o codifican) la ciclina E2 (ya sea la forma natural de la ciclina E2 para el mamífero o un gen (o genes) de ciclina E2 heterólogo (o heterólogos)) está (o están) sobre-expresada por el mamífero, creando de ese modo un mamífero "transgénico". Tales mamíferos transgénicos pueden ser preparados utilizando métodos bien conocidos tales como los descritos en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.489.743 y en la solicitud de patente PCT núm. WO94/28122, publicada el 8 de Diciembre de 1994. En la presente invención se incluyen adicionalmente mamíferos no humanos en los cuales el promotor de la ciclina E2 está activado o inactivado (utilizando métodos de recombinación homóloga como se describe más abajo) para alterar el nivel de expresión de la ciclina E2 natural.

Los polipéptidos de ciclina E2 de la presente invención pueden ser añadidos a las células para intensificar la división celular. Alternativamente, la actividad del polipéptido de ciclina E2 en una célula puede ser inhibida o inactivada con el fin de disminuir o detener la división celular de ciertas células.

El término "proteína de ciclina E2" o "polipéptido de ciclina E2" según se utiliza aquí hace referencia a cualquier proteína o polipéptido que tenga las propiedades descritas aquí para la ciclina E2. La letra pequeña delante del término "ciclina E2", cuando se utiliza, hace referencia a un polipéptido de ciclina E2 de un mamífero concreto, es decir, "h-ciclina E2" hace referencia a ciclina E2 humana, y "m-ciclina E2" hace referencia a ciclina E2 de ratón. El polipéptido de ciclina E2 puede tener o no tener una metionina amino terminal, dependiendo de la manera en la cual se prepare. A modo de ilustración, la proteína ciclina E2 o el polipéptido ciclina E2 hace referencia a (1) un polipéptido biológicamente activo codificado por las moléculas de ácido nucleico de ciclina E2 definidas en cualquiera de los apartados (a) - (f) más abajo, y a los fragmentos peptídicos o polipeptídicos biológicamente activos de las mismas; (2) variantes alélicas de origen natural y variantes sintéticas del gen de ciclina E2 que codifica un polipéptido de ciclina E2 que tiene una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con el polipéptido de ciclina E2 de la SEC ID NUM: 3 o la SEC ID NUM: 4, y/o (3) polipéptidos biológicamente activos, o fragmentos o variantes de los mismos, que hayan sido modificados químicamente.

Según se utiliza aquí, el término "fragmento de ciclina E2" hace referencia a un péptido o polipéptido que es menor que la secuencia de aminoácidos completa de la proteína de ciclina E2 de origen natural pero tiene la actividad biológica de la ciclina E2. Semejante fragmento puede estar truncado en el extremo amino, el extremo carboxi, y/o internamente (por ejemplo mediante empalme natural), y puede ser una variante o un derivado de la ciclina E2. Semejantes fragmentos de ciclina E2 pueden ser preparados con o sin una metionina amino terminal. Además, los fragmentos de ciclina E2 pueden ser fragmentos de origen natural tales como la variante de empalme de la ciclina E2 (SEC ID NUM: 5), otras variantes de empalme, y fragmentos resultantes de la actividad proteasa in vivo.

Según se utiliza aquí, el término "variante de ciclina E2" hace referencia a un polipéptido de ciclina E2 cuya secuencia de aminoácidos contiene una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones en la secuencia de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de la ciclina E2 expuesta en las SEC ID NUMS: 3 y 4. Tales variantes de ciclina E2 pueden ser preparadas a partir de las correspondientes variantes de la molécula de ácido nucleico de ciclina E2, que tienen una secuencia de ADN que varía por consiguiente entre las secuencias de ADN para la ciclina E2 de tipo salvaje en las SEC ID NUMS: 1 y 2. Entre las variantes preferidas del polipéptido de ciclina E2 humana se incluyen sustituciones de alanina en una o más posiciones de aminoácidos 12-23, 32-53, 350-357, y 395-404 que pueden servir para alterar la especificidad de sustrato del polipéptido de ciclina E2. Entre otras variantes preferidas se incluyen las sustituciones de alanina en las posiciones de aminoácidos 392, 396, 397, y/o 401, cuyos mutantes pueden servir para incrementar la estabilidad del polipéptido.

Según se utiliza aquí, el término "derivado de ciclina E2" hace referencia a un polipéptido, proteína o fragmento de ciclina E2 que ha sido modificado químicamente, como por ejemplo, mediante adición de una o más moléculas de polietilenglicol, azúcares, fosfatos, y/o otras moléculas, donde la molécula o moléculas no están ancladas naturalmente al polipéptido de ciclina E2 de tipo salvaje.

Según se utilizan aquí, los términos "polipéptido de ciclina E2 biológicamente activo", "fragmento de ciclina E2 biológicamente activo", "variante de ciclina E2 biológicamente activa", y "derivado de ciclina E2 biológicamente activo" hacen referencia a un polipéptido de ciclina que forma naturalmente un complejo con la quinasa dependiente de ciclina 2 ("cdk2" y es capaz de fosforilar el producto génico del retinoblastoma ("Rb").

Según se utiliza aquí, el término "ciclina E2" cuando se utiliza para describir una molécula de ácido nucleico hace referencia a una molécula o fragmento de ácido nucleico que (a) tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEC ID NUM: 1 o SEC ID NUM: 2; (b) tiene una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es idéntico al menos en un 70 por ciento, pero puede ser idéntico en más del 70 por ciento, es decir, 75, 80, 85, 90, 95 por ciento, o incluso mayor del 95 por ciento al polipéptido codificado por cualquiera de las SEC ID NUM: 1 o 2; (c) es una variante alélica de origen natural de (a) o (b); (d) es una variante de ácido nucleico de (a) - (c) producida como se proporciona aquí; y/o (e) tiene una secuencia que es complementaria a (a) - (d).

El porcentaje de identidad de la secuencia puede ser determinado mediante métodos normalizados que son utilizados comúnmente para comparar la similitud en la posición de los aminoácidos de dos polipéptidos. A modo de ejemplo, utilizando un algoritmo de ordenador tal como BLAST, BLAST2, o FASTA, los dos polipéptidos para los cuales el porcentaje de identidad de la secuencia va a ser determinado están alineados para un emparejamiento óptimo de sus respectivos aminoácidos (el "tramo emparejado", que puede incluir toda la longitud de una o ambas secuencias, o una porción pre-determinada de una o ambas secuencias). Cada programa de ordenador proporciona una penalización de apertura por "defecto" y una penalización de espacio por "defecto", y una matriz de puntuación tal como PAM 250 (para FASTA) y BLOSUM 62 (para los algoritmos de BLAST). Un algoritmo preferido es BLAST2.

Se puede utilizar una matriz de puntuación normalizada (ver Dayhoff y col., en: Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, sup. 3 [1978]) junto con el algoritmo de ordenador. El porcentaje de identidad puede se calculado después determinando el porcentaje de identidad utilizando un algoritmo contenido en un programa tal como FASTA:

300

Los polipéptidos que son idénticos al menos en un 70 por ciento tendrán típicamente una o más sustituciones, deleciones, y/o inserciones de aminoácidos en comparación con la ciclina E2 de tipo salvaje. Normalmente, las sustituciones del resto natural serán o bien alanina, o bien un aminoácido conservativo con el fin de que tenga un efecto pequeño o nulo en la carga neta global, en la polaridad, o en la hidrofobicidad de la proteína. Las sustituciones conservativas se exponen en la siguiente Tabla I.

TABLA I Sustituciones de Aminoácidos Conservativos

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 Alcalinos: \+  \hskip2cm  \+ arginina\cr  \+ \+ lisina\cr 
\+ \+ histidina\cr  Ácidos: \+ \+ ácido glutámico\cr  \+ \+ ácido
aspártico\cr  Polar no cargado: \+ \+ glutamina\cr  \+ \+
asparragina\cr  \+ \+  serina\cr  \+ \+ treonina\cr  \+ \+
tirosina\cr  No Polar: \+ \+ fenilalanina\cr  \+ \+ triptófano\cr 
\+ \+ cisteína\cr  \+ \+ glicina\cr  \+ \+ alanina\cr  \+ \+
valina\cr  \+ \+ prolina\cr  \+ \+ metionina\cr  \+ \+ leucina\cr 
\+ \+
isoleucina\cr}

El término "condiciones muy rigurosas" hace referencia a la hibridación y lavado en condiciones que permiten la unión de una molécula de ácido nucleico utilizada para el rastreo, tal como una sonda de oligonucleótido o una sonda de una molécula de ADNc, a secuencias altamente homólogas. Una solución de lavado muy rigurosa ejemplar es 0,2 X SSC y SDS al 0,1 por ciento utilizados a una temperatura entre 50°C y 65°C.

Cuando se utilizan las sondas oligonucleotídicas para rastrear ADNc o bancos genómicos, se puede utilizar una de las dos siguientes soluciones muy rigurosas. La primera de estas es 6 X SSC con pirofosfato de sodio al 0,05 por ciento a una temperatura de 35-62°C, dependiendo de la longitud de la sonda oligonucleotídica. Por ejemplo, las sondas de 14 pares de bases se lavan a 35-40°C, las sondas de 17 pares de bases a 45-50°C, las sondas de 20 pares de bases se lavan a 52-57°C, y las sondas de 23 pares de bases se lavan a 57-63°C. La temperatura puede ser incrementada 2-3°C cuando la unión no específica de fondo aparece elevada. Una segunda solución muy rigurosa utiliza cloruro de tetrametilamonio (TMAC) para lavar sondas oligonucleotídicas. Una solución de lavado rigurosa es TMAC 3 M, Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, y SDS al 0,2 por ciento. La temperatura de lavado que utiliza esta solución es una función de la longitud de la sonda. Por ejemplo, una sonda de 17 pares de bases se lava a aproximadamente 45-50°C.

Según se utilizan aquí, los términos "cantidad eficaz" y "cantidad terapéuticamente eficaz" hacen referencia a la cantidad de ciclina E2 necesaria para soportar una o más actividades biológicas de la ciclina E2 como las expuestas arriba.

Se puede preparar un polipéptido de ciclina E2 completo o un fragmento del mismo utilizando los métodos de la tecnología del ADN recombinante bien conocidos tales como los expuestos en Sambrook y col., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1989]) y/o Ausubel y col., eds. (Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishers Inc. and Wiley and Sons, NY [1994]). Se puede obtener un gen o un ADNc que codifica la proteína ciclina E2 o un fragmento del misma por ejemplo rastreando un banco genómico o de ADNc, o mediante amplificación. Las sondas o cebadores útiles para rastrear el banco pueden ser generados basándose en la información de la secuencia para otros genes o fragmentos génicos conocidos de la misma familia de genes o de una familia relacionada, tal como, por ejemplo, motivos conservados encontrados en otros genes de ciclina tales como la caja de ciclina. Además, cuando se ha identificado un gen de ciclina de una especie, se puede utilizar todo el gen o una porción del mismo como sonda para identificar los genes homólogos de otras especies. Las sondas o cebadores pueden ser utilizados para rastrear bancos de ADNc de diversas fuentes de tejidos que se cree que expresan el gen de la ciclina E2. Típicamente, se emplearán condiciones muy rigurosas para el rastreo para minimizar el número de falsos positivos del rastreo.

Otro método para preparar un gen que codifica un polipéptido de ciclina E2 o un fragmento del mismo consiste en emplear la síntesis química utilizando métodos bien conocidos para el artesano experto tales como los descritos por ejemplo por Engels y col. (Angew. Chem. Intl. Ed., 28:716-734 [1989]). Entre estos métodos se incluyen, entre otros, los métodos del fosfotriéster, la fosforamidita, y los métodos de H-fosfonato para la síntesis de ácidos nucleicos. Un método preferido para semejante síntesis química es la síntesis soportada en polímero utilizando la química de la fosforamidita normalizada. Típicamente, el ADN que codifica el polipéptido de ciclina E2 tendrá varios cientos de nucleótidos de longitud. Se pueden sintetizar ácidos nucleicos mayores de aproximadamente 100 nucleótidos en forma de diversos fragmentos utilizando estos métodos. Los fragmentos pueden ser ligados después juntos para formar el polipéptido de ciclina E2 completo. Normalmente, el fragmento de ADN que codifica el extremo amino del polipéptido tendrá un ATG, que codifique un resto metionina. Esta metionina puede estar presente o no en la forma madura del polipéptido de ciclina E2, dependiendo de si el polipéptido producido en la célula huésped es secretado de esa célula.

En algunos casos, puede ser deseable preparar variantes de ácido nucleico y/o aminoácidos de la ciclina de origen natural. Las variantes de ácido nucleico (donde uno o más nucleótidos son diseñados para que difieran de la ciclina E2 de tipo salvaje o de origen natural) pueden ser producidas utilizando la mutagénesis dirigida al sitio, la amplificación mediante PCR, u otros métodos apropiados, donde el cebador o los cebadores tienen las mutaciones puntuales deseadas (ver Sambrook y col., supra, y Ausubel y col., supra, para las descripciones de las técnicas de mutagénesis). Asimismo se puede utilizar la síntesis química en la que se emplean los métodos descritos por Engels y col., supra, para preparar tales variantes. También se pueden utilizar otros métodos conocidos para el artesano experto. Las variantes de ácidos nucleicos preferidas son aquellas que contienen sustituciones de nucleótidos que representan la preferencia por el codón en la célula huésped que se va a utilizar para producir la ciclina E2. Otras variantes preferidas son aquellas que codifican cambios de aminoácidos como los descritos antes (v.g., donde la carga o la polaridad de la cadena lateral del aminoácido de origen natural no es alterada sustancialmente por la sustitución por un aminoácido diferente) en comparación con el tipo salvaje, y/o aquellos diseñados para generar uno o varios sitios de glicosilación y/o de fosforilación novedosos en la ciclina E2, o aquellos diseñados para suprimir uno o varios sitios de glicosilación y/o fosforilación en la ciclina E2.

El gen de la ciclina E2, el ADNc, o el fragmento del mismo puede ser insertado en un vector de expresión o amplificación apropiado utilizando mecanismos de ligadura normalizados. El vector es seleccionado típicamente para que sea funcional en la célula huésped concreta empleada (es decir, el vector es compatible con la maquinaria de la célula huésped de manera que se pueda producir la amplificación del gen de la ciclina E2 y/o la expresión del gen). El gen de la ciclina E2, el ADNc o el fragmento del mismo puede ser amplificado/expresado en células huésped procarióticas, de levadura, de insecto (sistemas de baculovirus) y/o eucarióticas. La selección de la célula huésped dependerá en parte de si el polipéptido de ciclina E2 o el fragmento del mismo va a ser glicosilado y/o fosforilado. Si lo es, son preferibles las células huésped de levadura, de insecto, o de mamífero.

Típicamente, los vectores utilizados en cualquiera de las células huésped contendrán una secuencia 5' limítrofe (también referida como "promotor") y también otros elementos reguladores tales como uno o varios intensificadores, un origen de un elemento de replicación, un elemento de terminación de la transcripción, una secuencia intrón completa que contiene un sitio donador y un aceptor de empalme, una secuencia del péptido señal, un elemento del sitio de unión al ribosoma, una secuencia de poliadenilación, una región poliligadora para insertar el ácido nucleico que codifica el polipéptido que va a ser expresado, y un elemento marcador seleccionable. Cada uno de estos elementos se estudia más abajo. Opcionalmente, el vector puede contener una secuencia "etiqueta", es decir, una molécula oligonucleotídica localizada en el extremo 5' o 3' de la secuencia codificadora de la ciclina E2; la molécula oligonucleotídica codifica poliHis (tal como hexaHis), u otra "etiqueta" tal como FLAG, HA (hemaglutinina del virus de la Influenza) o myc para el que existen anticuerpos asequibles comercialmente. Esta etiqueta es típicamente fusionada a la proteína, y puede servir como etiqueta para la purificación por afinidad del polipéptido ciclina E2 de la célula huésped. La purificación por afinidad puede ser completada, por ejemplo, mediante cromatografía en columna utilizando anticuerpos contra la etiqueta como matriz de afinidad. Opcionalmente, la etiqueta puede ser separada con posterioridad del polipéptido ciclina E2 purificado mediante diversos métodos tales como los que utilizan ciertas peptidasas.

La secuencia limítrofe 5' puede ser homóloga (es decir, de la misma especie y/o cepa que la célula huésped), heteróloga (es decir, de una especie diferente de la especie de la célula huésped o de la cepa), híbrida (es decir, una combinación de secuencias limítrofes 5' de una o más fuentes), sintética, o puede ser la secuencia limítrofe 5' de la ciclina E2 natural. Como tal, la fuente de la secuencia limítrofe 5' puede ser cualquier organismo procariótico o eucariótico unicelular, cualquier organismo vertebrado o invertebrado, o cualquier planta, siempre que la secuencia limítrofe 5' sea funcional y pueda ser activada por la maquinaria de la célula huésped.

Las secuencias limítrofes 5' útiles en los vectores de esta invención pueden ser obtenidas mediante cualquiera de los diversos métodos bien conocidos en la técnica. Típicamente, las secuencias limítrofes 5' útiles aquí distintas de la secuencia limítrofe de la ciclina E2 habrán sido identificadas previamente mediante cartografía y/o digestión con endonucleasas de restricción y de este modo pueden ser aisladas de la fuente tisular apropiada utilizando las endonucleasas de restricción apropiadas. En algunos casos, la secuencia de nucleótidos completa de la secuencia limítrofe 5' puede ser conocida. Aquí, la secuencia limítrofe 5' puede ser sintetizada utilizando los métodos descritos antes para la síntesis o la clonación de ácidos nucleicos.

Cuando se conoce toda la secuencia limítrofe 5' o una porción de la misma, ésta puede ser obtenida utilizando la PCR y/o rastreando un banco genómico con oligonucleótidos adecuados y/o fragmentos de la secuencia limítrofe 5' de la misma o de otra especie.

Cuando la secuencia limítrofe 5' no es conocida, se puede aislar un fragmento de ADN que contiene una secuencia limítrofe 5' de un pedazo más grande de ADN que puede contener, por ejemplo, una secuencia codificadora o incluso otro gen o genes. El aislamiento se puede completar mediante digestión con endonucleasas de restricción utilizando una o más enzimas cuidadosamente seleccionadas para aislar el fragmento de ADN apropiado. Tras la digestión, se puede aislar el fragmento deseado mediante purificación en gel de agarosa, columna Qiagen® u otros métodos conocidos por el artesano experto. La selección de las enzimas adecuadas para lograr este propósito será fácilmente evidente para un experto normal en la técnica.

El origen del elemento de replicación es típicamente una parte de los vectores de expresión procarióticos adquiridos comercialmente, y ayuda a la amplificación del vector en una célula huésped. La amplificación del vector hasta un cierto número de copias puede, en algunos casos ser importante para la expresión óptima del polipéptido de ciclina E2. Si el vector de elección no contiene un origen del sitio de replicación, se puede sintetizar uno químicamente basándose en una secuencia conocida, y ligarlo en el vector.

El elemento de terminación de la transcripción se localiza típicamente 3' con respecto al extremo de la secuencia del polipéptido de ciclina E2 y sirve para terminar la transcripción del polipéptido ciclina E2. Normalmente, el elemento de terminación de la transcripción en las células procarióticas es un fragmento rico en G-C seguido de una secuencia poli T. Si bien el elemento es fácilmente clonado a partir de un banco o incluso adquirido comercialmente como parte de un vector, puede ser fácilmente sintetizado utilizando métodos para la síntesis de ácidos nucleicos tales como los descritos antes.

Un elemento génico marcador seleccionable codifica una proteína necesaria para la supervivencia y el crecimiento de una célula huésped en un medio de cultivo selectivo. Los genes marcadores de selección típicos codifican proteínas que (a) confieren resistencia a antibióticos u otras toxinas, v.g., ampicilina, tetraciclina, o kanamicina para las células huésped procarióticas, (b) complementan carencias auxotróficas de la célula; o (c) aportan nutrientes críticos no asequibles de medios complejos. Los marcadores seleccionables preferidos son el gen de resistencia a la kanamicina, el gen de resistencia a la ampicilina, y el gen de resistencia a la tetraciclina.

El elemento de unión al ribosoma, comúnmente denominado secuencia de Shine-Dalgarno (procariotas) o secuencia de Kozak (eucariotas), es necesario normalmente para el inicio de la traducción del ARNm. El elemento está localizado típicamente 3' con respecto al promotor y 5' con respecto a la secuencia codificadora del polipéptido de ciclina E2 que se va a sintetizar. La secuencia de Shine-Dalgarno varía pero es típicamente una polipurina (es decir, tiene un elevado contenido en A-G). Se han identificado muchas secuencias de Shine-Dalgarno, cada una de las cuales puede ser fácilmente sintetizada utilizando los métodos mostrados antes y empleada en un vector procariótico.

En aquellos casos en los que es deseable que el polipéptido de ciclina E2 sea secretado desde la célula huésped, se puede utilizar una secuencia señal para dirigir el polipéptido de ciclina E2 fuera de la célula huésped en la que es sintetizado, y la porción carboxi terminal de la proteína puede ser suprimida con el fin de evitar el anclaje a la membrana. Típicamente, la secuencia señal se sitúa en la región codificadora de la secuencia de ácido nucleico de la ciclina E2, o directamente en el extremo 5' de la región codificadora de la ciclina E2. Se han identificado muchas secuencias señal, y cualquiera de ellas que sea funcional en la célula huésped seleccionada puede ser utilizada junto con el gen de la ciclina E2. Por lo tanto, la secuencia señal puede ser homóloga o heteróloga con respecto al gen de la ciclina E2, y puede ser homóloga o heteróloga con respecto al gen de la ciclina E2. Adicionalmente, la secuencia señal puede ser sintetizada químicamente utilizando los métodos expuestos más arriba.

En la mayoría de los casos, la secreción del polipéptido de la célula huésped por medio de la presencia de un péptido señal producirá la eliminación de la metionina amino terminal del polipéptido.

En muchos casos, la transcripción del gen de la ciclina E2 es incrementada por la presencia de uno o más intrones en el vector; esto es particularmente cierto cuando la ciclina E2 es producida en células huésped eucarióticas, especialmente células huésped de mamífero. Los intrones utilizados pueden existir de forma natural en el gen de la ciclina E2, especialmente cuando el gen de la ciclina E2 utilizado es una secuencia genómica completa o un fragmento de la misma. Cuando el intrón no existe de forma natural en el gen de la ciclina E2 (como la mayoría de los ADNc), el intrón o los intrones pueden ser obtenidos de otra fuente. La posición del intrón con respecto a la secuencia limítrofe 5' y el gen de la ciclina E2 es generalmente importante, ya que el intrón debe ser transcrito para que sea eficaz. Como tal, cuando el gen de ciclina E2 insertado en el vector de expresión es una molécula de ADNc, la posición preferida para el intrón es 3' con respecto al sitio de inicio de la transcripción, y 5' con respecto a la secuencia de terminación de la transcripción poliA. Preferiblemente para el ADNc de la ciclina E2, el intrón estará localizado en un lado u otro (es decir, 5' o 3') del ADNc de manera que no interrumpa esta secuencia codificadora. Se puede utilizar cualquier intrón de cualquier fuente, incluyendo cualquier organismo viral, procariótico y eucariótico (planta o animal) para poner en práctica esta invención, siempre que sea compatible con la célula o las células huésped en las cuales es insertado. También están incluidos aquí los intrones sintéticos. Opcionalmente, se puede utilizar más de un intrón en el vector.

Cuando uno o más elementos expuestos antes no están ya presentes en el vector que se va a utilizar, se pueden obtener individualmente y ligar en el vector. Los métodos utilizados para obtener cada uno de los elementos son bien conocidos por el artesano experto y son comparables a los métodos expuestos antes (es decir, síntesis del ADN, rastreo del banco, y similares).

Los vectores finales utilizados para poner en práctica esta invención se construyen típicamente a partir de vectores de partida tales como un vector asequible comercialmente. Tales vectores pueden contener o no algunos de los elementos que van a ser incluidos en el vector completado. Si ninguno de los elementos deseados está presente en el vector de partida, cada elemento puede ser ligado individualmente en el vector cortando el vector con la endonucleasa o las endonucleasas de restricción apropiadas de manera que los extremos del elemento que se va a ligar y los extremos del vector sean compatibles para la ligadura. En algunos casos, puede ser necesario "volver romos" los extremos que se van a ligar entre sí con el fin de obtener una ligadura satisfactoria. Los extremos romos se consiguen rellenando primero los "extremos cohesivos" utilizando la ADN polimerasa de Klenow o la ADN polimerasa de T4 en presencia de los cuatro nucleótidos. Este procedimiento es bien conocido en la técnica y se describe por ejemplo en Sambrook y col., supra.

Alternativamente, se pueden ligar primero entre sí dos o más de los elementos que van a ser insertados en el vector (si van a estar situados adyacentes entre sí) y después ligarlos en el vector.

Otro método para construir el vector consiste en llevar a cabo todas las ligaduras de los elementos variantes simultáneamente en una mezcla de reacción. Aquí, se generarán muchos vectores sin sentido o no funcionales debido a la ligadura o la inserción inapropiada de los elementos, no obstante el vector funcional puede ser identificado y seleccionado mediante digestión con endonucleasas de restricción.

Los vectores preferidos para poner en práctica esta invención son aquellos que son compatibles con células huésped bacterianas, de insectos, y de mamífero. Entre tales vectores se incluyen, entre otros, pCRII, pCR3, y pcDNA3 (Invitrogen Company, San Diego, CA), pBSII (Stratagene Company, LaJolla, CA), pET15b (Novagen, Madison, WI), pGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), pEGFP·N2 (Clontech, Palo Alto, CA), pETL (BlueBacII; Invitrogen), y pFastBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, NY).

Una vez que el vector ha sido construido y una molécula de ácido nucleico que codifica la ciclina E2 completa o truncada ha sido insertada en el sitio apropiado del vector, el vector completado puede ser insertado en una célula huésped adecuada para la amplificación y/o la expresión del polipéptido de ciclina E2.

Las células huésped pueden ser células huésped procarióticas (tales como E. coli) o células huésped eucarióticas (tales como una célula de levadura, una célula de insecto, o una célula de vertebrado). La célula huésped, cuando es cultivada en condiciones apropiadas, puede sintetizar el polipéptido de ciclina E2 que puede ser recogido con posterioridad del medio de cultivo (si la célula huésped la secreta al medio) o directamente desde la célula huésped que la produce (si éste no es secretado). Tras la recolección, se puede purificar el polipéptido de ciclina E2 utilizando métodos tales como la cromatografía de tamiz molecular, la cromatografía de afinidad, y similares.

La selección de la célula huésped para la producción del polipéptido de ciclina E2 dependerá en parte de si el polipéptido de ciclina E2 va a ser glicosilado o fosforilado (en cuyo caso se prefieren las células huésped eucarióticas), y de la manera en la cual la célula huésped es capaz de "plegar" la proteína en su estructura terciaria natural (v.g., orientación apropiada de puentes disulfuro, etc.) de manera que la proteína biológicamente activa sea preparada por la célula. No obstante, cuando la célula huésped no sintetiza el polipéptido de ciclina E2 que tiene actividad biológica, el polipéptido de ciclina E2 puede ser "plegado" tras la síntesis utilizando condiciones químicas apropiadas como las que se mencionan más abajo.

Las células o líneas celulares adecuadas pueden ser células de mamíferos, tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células 3T3. La selección de células huésped de mamífero adecuadas y los métodos de transformación, cultivo, amplificación, rastreo y producción y purificación del producto son conocidos en la técnica. Otras líneas de células de mamíferos adecuadas son las líneas celulares COS-1 y COS-7 de mono, y la línea celular CV-1. Entre las células huésped de mamífero ejemplares se incluyen líneas celulares de primate y líneas celulares de roedor, incluyendo líneas celulares transformadas. También son adecuadas las células diploides normales, las cepas celulares derivadas del cultivo in vitro de tejidos primarios, así como los explantes primarios. Las células candidato pueden ser genotípicamente deficientes en el gen de selección, o pueden contener un gen de selección que actúa dominantemente. Entre otras líneas celulares de mamífero adecuadas se incluyen pero no están limitadas a, células de neuroblastoma N2A de ratón, células HeLa, L-929 de ratón, líneas 3T3 derivadas de ratones Swiss, Balb-c o NIH, líneas celulares de hámster BHK o Hak.

De un modo similar son útiles como células huésped útiles adecuadas para la presente invención las células bacterianas. Por ejemplo, las diversas cepas de E. coli (v.g., HB101, DH5\alpha, DH10, y MC1061) son bien conocidas como células huésped en el campo de la biotecnología. También se pueden emplear las diversas cepas de B. Subtilis, Pseudomonas sp., otros Bacillus sp., Streptomyces sp., y similares en este método.

Asimismo se encuentran disponibles como células huésped para la expresión de los polipéptidos de la presente invención muchas cepas de células de levadura conocidas por los expertos en la técnica.

Además, cuando se desea, se pueden utilizar sistemas celulares de insectos en los métodos de la presente invención. Tales sistemas son descritos por ejemplo por Kitts y col., (Biotechniques, 14:810-817 [1993]), Lucklow (Curr. Opin. Biotechnol., 4:564-572 [1993]) y Lucklow y col. (J. Virol., 67:4566-4579 [1993]). Las células de insecto preferidas son Sf-9 e Hi5 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

La inserción (también referida como "transformación" o "transfección") del vector en la célula huésped seleccionada se puede completar utilizando métodos tales como el método del cloruro de calcio, la electroporación, la microinyección, la lipofección o el método de DEAE-dextrano. El método seleccionado será, en parte, función del tipo de célula huésped que se vaya a utilizar. Estos métodos y otros métodos adecuados son bien conocidos por el artesano experto, y se muestran, por ejemplo, en Sambrook y col., supra.

Las células huésped que contienen el vector (es decir, transformadas o transfectadas) pueden ser cultivadas utilizando medios estándar bien conocidos por el artesano experto. Los medios contendrán normalmente todos los nutrientes necesarios para el crecimiento y la supervivencia de las células. Los medios adecuados para cultivar células de E. coli son por ejemplo, Caldo Luria (LB) y/o Caldo Terrific (TB). Los medios adecuados para cultivar células eucarióticas son RPMI 1640, MEM, DMEM, todos los cuales pueden estar suplementados con suero y/o factores de crecimiento según requiera la línea celular concreta que esté siendo cultivada. Un medio adecuado para los cultivos de insectos es el medio de Grace suplementado con Yeastolato, producto hidrolizado de lactoalbúmina, y/o suero de ternera fetal según se necesite.

Típicamente, solamente se añade un antibiótico u otro compuesto útil para el crecimiento selectivo de las células transformadas como suplemento para el medio. El compuesto que se va a utilizar estará dictado por el elemento marcador seleccionable presente en el plásmido con el cual se había transformado la célula huésped. Por ejemplo, cuando el elemento marcador seleccionable es la resistencia a la kanamicina, el compuesto añadido al medio de cultivo será la kanamicina.

La cantidad de polipéptido de ciclina E2 producido en la célula huésped puede ser evaluada utilizando métodos normalizados conocidos en la técnica. Entre tales métodos se incluyen, sin limitación, el análisis de transferencia Western, la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, la electroforesis en gel no desnaturalizante, la separación HPLC, la inmunoprecipitación, y/o los análisis de actividad tales como los análisis de desplazamiento en gel de unión al ADN.

Si el polipéptido de ciclina E2 ha sido diseñado para que sea secretado desde las células huésped, se puede encontrar la mayor parte del polipéptido en el medio de cultivo celular. Los polipéptidos preparados de esta manera típicamente no poseen una metionina amino terminal, ya que esta es eliminada durante la secreción desde la célula. Si no obstante, el polipéptido de ciclina E2 no es secretado desde las células huésped, éste estará presente en el citoplasma y/o el núcleo (para las células huésped eucarióticas) o en el periplasma (para las células huésped bacterianas gram negativas) y puede tener una metionina amino terminal.

Para el polipéptido de ciclina E2 situado en el citoplasma y/o el núcleo de la célula huésped, las células huésped son típicamente desorganizadas primero mecánicamente o con detergente para liberar los contenidos intra-celulares en una solución tamponada. El polipéptido de ciclina E2 puede ser aislado después de esta solución.

La purificación del polipéptido de ciclina E2 de la solución se puede lograr utilizando una variedad de técnicas. Si el polipéptido ha sido sintetizado de manera que contenga una etiqueta tal como Hexahistidina (ciclina E2/hexaHis) u otro pequeño péptido tal como FLAG (Eastman Kodak Co., New Haven, CT) o myc (Invitrogen, Carlsbad, CA) en cualquiera de sus extremos carboxilo o amino, éste puede ser purificado esencialmente en un procedimiento de una etapa haciendo pasar la solución a través de una columna de afinidad donde la matriz de la columna tiene una elevada afinidad por la etiqueta o por el polipéptido directamente (es decir, un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente la ciclina E2). Por ejemplo, la polihistidina se une con gran afinidad y especificidad al níquel, de ese modo se puede utilizar una columna de afinidad de níquel (tal como las columnas de níquel de Qiagen®) para la purificación de ciclina E2/poliHis. (Ver por ejemplo, Ausubel y col., eds., Current Protocols in Molecular Biology, Sección 10.11.8, John Wiley & Sons, Nueva York [1993]).

Cuando el polipéptido de ciclina E2 es preparado sin una etiqueta anclada, y no se encuentran disponibles anticuerpos, se pueden utilizar otros procedimientos conocidos para la purificación. Entre tales procedimientos se incluyen, sin limitación, la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía de tamiz molecular, la HPLC, la electroforesis en gel natural combinada con la elución en gel, y el isoelectroenfoque preparativo (máquina/técnica "Isoprime", Hoefer Scientific). En algunos casos, se pueden combinar dos o más de estas técnicas para lograr una aumento de la pureza.

Si se prevé que el polipéptido de ciclina E2 se encontrará principalmente intracelularmente, el material intracelular (incluyendo los cuerpos de inclusión para las bacterias gram negativas) puede ser extraído de la célula huésped utilizando cualquier mecanismo normalizado conocidos para el artesano experto. Por ejemplo, las células huésped pueden ser sometidas a lisis para liberar el contenido del periplasma/citoplasma mediante una prensa French, homogeneización, y/o sonicación seguido de centrifugación.

Si el polipéptido de ciclina E2 ha formado cuerpos de inclusión en el periplasma, los cuerpos de inclusión pueden unirse a menudo con las membranas celulares internas y/o externas y de ese modo se encontrarán principalmente en el material de sedimento tras la centrifugación. El material de sedimento puede ser tratado después con un agente caotrópico tal como guanidina o urea para liberar, romper y solubilizar los cuerpos de inclusión. El polipéptido de ciclina E2 en su forma ahora soluble puede ser analizado después utilizando la electroforesis en gel, la inmunoprecipitación o similar. Si se desea aislar el polipéptido de ciclina E2, el aislamiento se puede completar utilizando métodos normalizados tales como los expuestos más abajo y en Marston y col. (Meth. Enz., 182:264-275 [1990]).

Si no se forman cuerpos de inclusión del polipéptido de ciclina E2 en un grado significativo en el periplasma de la célula huésped, el polipéptido de ciclina E2 se encontrará principalmente en el sobrenadante tras la centrifugación del producto homogeneizado celular, y el polipéptido de ciclina E2 puede ser aislado del sobrenadante utilizando métodos tales como los expuestos más abajo.

En aquellas situaciones en las que es preferible aislar parcial o completamente el polipéptido de ciclina E2, la purificación se puede lograr utilizando métodos normalizados bien conocidos por el artesano experto. Entre tales métodos se incluyen, sin limitación, la separación mediante electroforesis seguida de electroelución, los diversos tipos de cromatografía (inmunoafinidad, tamiz molecular, y/o intercambio iónico), y/o la cromatografía de líquidos a presión elevada. En algunos casos, puede ser preferible utilizar más de uno de estos métodos para completar la purificación.

Además de preparar y purificar el polipéptido de ciclina E2 utilizando mecanismos de ADN recombinante, los polipéptidos de ciclina E2, los fragmentos, y/o los derivados de los mismos pueden ser preparados mediante métodos de síntesis química (tales como la síntesis peptídica en fase sólida) utilizando mecanismos conocidos en la técnica tales como los expuestos por Merrifield y col., (J. Am. Chem. Soc., 85:2149 [1963]), Houghten y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:5132 [1985]), y Stewart y Young (Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, IL [1984]). Tales polipéptidos pueden ser sintetizados con o sin metionina en el extremo amino. Los polipéptidos de ciclina E2 sintetizados químicamente o los fragmentos pueden ser oxidados utilizando los métodos expuestos en estas referencias para formar puentes disulfuro. Se espera que los polipéptidos de ciclina E2 o los fragmentos tengan una actividad biológica comparable a la de los polipéptidos de ciclina E2 producidos recombinantemente o purificados a partir de fuentes naturales, y de este modo pueden ser utilizados indistintamente con polipéptidos de ciclina E2 recombinantes o naturales.

Las composiciones de ciclina E2 modificada químicamente en las cuales el polipéptido de ciclina E2 está conectado a un polímero están incluidas en el alcance de la presente invención. El polímero seleccionado es típicamente soluble en agua de manera que la proteína a la cual está anclado no precipite en un entorno acuoso, tal como el entorno fisiológico. El polímero seleccionado es modificado normalmente para que tenga un único grupo reactivo, tal como un éster activo para la acilación o un aldehído para la alquilación, de manera que se pueda controlar el grado de polimerización proporcionado en los presentes métodos. El polímero puede tener cualquier peso molecular, y puede ser ramificado o no ramificado. Está incluida en el alcance de los polímeros de ciclina E2 una mezcla de polímeros. Preferiblemente, para el uso terapéutico de la preparación del producto final, el polímero será farmacéuticamente aceptable.

El polímero soluble en agua o una mezcla de los mismos se pueden ser seleccionar del grupo formado, por ejemplo, por polietilenglicol (PEG), monometoxi-polietilenglicol, dextrano, celulosa, u otros polímeros basados en carbohidratos, poli-(N-vinil pirrolidona)-polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, copolímeros de poli(óxido de propileno)/óxido de etileno, polioles polioxietilados (v.g., glicerol) y poli(alcohol vinílico).

Para las reacciones de acilación, los polímeros seleccionados deberán tener un único grupo éster reactivo. Para la alquilación reductiva, los polímeros seleccionados deberán tener un único grupo aldehído reactivo. Un aldehído reactivo preferido es polietilenglicol-propionaldehído, que es soluble en agua, o mono-alcoxi C1-C10 o derivados ariloxi del mismo (ver la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.252.714).

La pegilación de la ciclina E2 se puede llevar a cabo mediante cualquiera de las reacciones de pegilación conocidas en la técnica, como se describe por ejemplo en las siguientes referencias: Focus on Growth Factors 3:4-10 (1992); EP 0 154 316; y EP 0 401 384. Preferiblemente, la pegilación se lleva a cabo por medio de una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de polietilenglicol reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo) como se describe más abajo.

Un polímero soluble en agua particularmente preferido para su uso aquí es el polietilenglicol, abreviado como PEG. Según se utiliza aquí, se pretende que polietilenglicol abarque cualquiera de las formas de PEG que han sido utilizadas para tranformar otras proteínas, tales como mono-alcoxi-(C1-C10) o ariloxi-polietilenglicol.

En general, la transformación química puede ser realizada en cualquiera de las condiciones adecuadas utilizadas para hacer reaccionar una sustancia biológicamente activa con una molécula de polímero activada. Los métodos para preparar ciclina E2 pegilada comprenderán generalmente las etapas de (a) hacer reaccionar un polipéptido de ciclina E2 con polietilenglicol (tal como un derivado éster o aldehído reactivo de PEG) en condiciones en las que la ciclina E2 se ancla a uno o más grupos PEG, y (b) obtener el producto o los productos de reacción. En general, las condiciones de reacción óptimas para las reacciones de acilación serán determinadas basándose en parámetros conocidos y en el resultado deseado. Por ejemplo, a mayor proporción de PEG:proteína, mayor porcentaje de producto poli-pegilado.

Generalmente, las condiciones que pueden ser aliviadas o moduladas por la administración de los presentes polímeros/polipéptidos de ciclina E2 se incluyen aquellos descritos aquí para las moléculas de ciclina E2. No obstante, las moléculas de polímero/ciclina E2 descritas aquí pueden tener actividades adicionales, una actividad biológica intensificada o reducida, u otras características, tales como una vida media incrementada o disminuida, en comparación con las moléculas no transformadas.

Los polipéptidos de ciclina E2, fragmentos de los mismos, variantes, y derivados, pueden ser empleados solos, juntos, o combinados con otras composiciones farmacéuticas. Los polipéptidos de ciclina E2, fragmentos, variantes, y derivados pueden ser utilizados combinados con citocinas, factores de crecimiento, antibióticos, anti-inflamatorios, y/o agentes quimioterapéuticos según sea apropiado para la indicación que esté siendo tratada.

Las moléculas de ciclina E2, ya se administren solas o en una terapia combinada, pueden ser útiles al promover la división celular de poblaciones de células concretas tales como glóbulos blancos, glóbulos rojos, neuronas, condrocitos, y similares. En los pacientes con SIDA y en los pacientes con cáncer que han sufrido quimioterapia y/o transplantes de médula ósea, el recuento de leucocitos es típicamente bajo; la administración de ciclina E2 a las células pluripotenciales del paciente y/o otros glóbulos blancos, ya sea mediante terapia génica o mediante tratamiento directo de las células con ciclina E2 de una manera ex vivo, podría servir para incrementar el recuento de glóbulos blancos. De un modo similar, en los hemofílicos y en los pacientes de diálisis renal, por ejemplo, el tratamiento de la población de eritroblastos progenitores del paciente con ciclina E2 vía terapia génica o tratamiento ex vivo, podría aumentar el recuento de glóbulos rojos. Otra indicación en la cual podría ser útil la administración de ciclina E2 es el incremento de condrocitos en pacientes que padecen degeneración del cartílago debida a lesión de las articulaciones, artritis, o similar. Aquí, la ciclina E2 podría ser administrada a los condrocitos vía terapia génica o mediante tratamiento ex vivo de condrocitos cultivados. Otra indicación más para la terapia con ciclina E2 sería el aumento de la población de neuronas en pacientes que padecen la enfermedad de Alzheimer, u otros trastornos neurológicos que resultan de la apoptosis de diversas neuronas. Finalmente, la terapia con ciclina E2 podría estar indicada en la apoplejía o la isquemia en la cual se produce lesión del tejido a partir de la pérdida de flujo sanguíneo. Aquí, la administración de ciclina E2 a las células circundantes al área de necrosis podría servir para regenerar el tejido necrótico.

Las moléculas de ácido nucleico de ciclina E2, los fragmentos, y/o los derivados que no codifican por sí mismos los polipéptidos que son activos en los análisis de actividad pueden ser útiles como sondas de hibridación en análisis de diagnóstico para someter a ensayo, ya sea cualitativamente o cuantitativamente, la presencia de ADN de ciclina E2 o del ARN correspondiente en tejidos de mamíferos o muestras de fluido corporal.

Los fragmentos de polipéptido de ciclina E2, las variantes, y/o los derivados que no son activos por sí mismos en los análisis de actividad pueden ser útiles para preparar anticuerpos que reconozcan los polipéptidos de ciclina E2.

Los polipéptidos de ciclina E2, loa fragmentos, las variantes, y/o los derivados pueden ser utilizados para preparar anticuerpos utilizando métodos normalizados. Así, los anticuerpos que reaccionan con los polipéptidos de ciclina E2, así como los fragmentos reactivos de tales anticuerpos, también se contemplan dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos pueden ser policlonales, monoclonales, recombinantes, quiméricos, de cadena sencilla y/o biespecíficos. Típicamente, el anticuerpo o fragmento del mismo será o bien de origen humano, o bien "humanizado", es decir, preparado con el fin de prevenir o minimizar una reacción inmune frente al anticuerpo cuando sea administrado al paciente. El fragmento de anticuerpo puede ser cualquier fragmento que sea reactivo con los polipéptidos de ciclina E2 de la presente invención, tal como Fab, Fab', etc. Asimismo esta invención proporciona hibridomas generados presentando la ciclina E2 o un fragmento del mismo como antígeno a un animal seleccionado, seguido de células en fusión (v.g. células de bazo) del mamífero con ciertas células cancerosas para crear las líneas celulares inmortalizadas mediante mecanismos conocidos. Los métodos empleados para generar tales líneas celulares y anticuerpos dirigidos contra todo el polipéptido de ciclina E2 humano o porciones del mismo de la presente invención también están abarcados por esta invención.

Los anticuerpos pueden ser utilizados terapéuticamente, de manera que inhiban la unión de la ciclina E2 a cdk2. Los anticuerpos pueden ser utilizados adicionalmente para fines de diagnóstico in vivo e in vitro, por ejemplo en forma marcada para detectar la presencia de la ciclina E2 en un fluido corporal o muestra celular.

Los anticuerpos preferidos son anticuerpos humanos, ya sean policlonales o monoclonales.

Composiciones Terapéuticas y Administración

Las composiciones terapéuticas de ciclina E2 están dentro del alcance de la presente invención. Tales composiciones pueden comprender una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido de ciclina, fragmentos, variantes, o derivados mezclados con un portador farmacéuticamente aceptable. El material portador puede ser agua para inyectables, preferiblemente suplementada con otros materiales comunes en las soluciones para la administración a mamíferos. Típicamente, se administrará el compuesto terapéutico de ciclina E2 en forma de una composición que comprenda el polipéptido de ciclina E2 purificado, fragmento, variante, o derivado junto con uno o más portadores, excipientes, o diluyentes fisiológicamente aceptables. Son portadores ejemplares apropiados la solución salina tamponada neutra o la solución salina mezclada con seralbúmina. Preferiblemente, el producto es formulado en forma de producto liofilizado utilizando excipientes apropiados (v.g, sacarosa). Se pueden incluir otros portadores, diluyentes, y excipientes normalizados, si se desea. Otras composiciones ejemplares comprenden tampón Tris con un pH de 7,0-8,5, o tampón acetato con un pH de aproximadamente 4,0-5,5, que puede incluir adicionalmente sorbitol o un sustituto adecuado del mismo.

Las composiciones de ciclina E2 pueden ser administradas parenteralmente. Alternativamente, las composiciones pueden ser administradas intravenosamente o subcutáneamente. Cuando se administran sistémicamente, las composiciones terapéuticas para su uso en esta invención pueden estar en forma de una solución acuosa parenteralmente aceptable, libre de pirógeno. La preparación de semejantes soluciones de proteína farmacéuticamente aceptables, por lo que respecta al pH, el carácter isotónico, la estabilidad y similares, está dentro del conocimiento práctico de la técnica.

Las formulaciones terapéuticas de composiciones de ciclina E2 útiles para poner en práctica la presente invención pueden ser pueden ser preparadas para el almacenamiento mezclando la composición seleccionada que tiene el grado de pureza deseado con portadores, excipientes, o estabilizadores opcionales fisiológicamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Edición, A.R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company [1990]) en forma de una torta liofilizada o de una solución acuosa. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables son no tóxicos para los receptores y son preferiblemente inertes a las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, u otros ácidos orgánicos; antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular; proteínas tales como seralbúmina, gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparragina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos incluyendo glucosa, manosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcares tales como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o tensioactivos no iónicos tales como Tween, pluronics o polietilenglicol (PEG).

La cantidad eficaz de la composición o las composiciones de ciclina E2 que se va a emplear terapéuticamente dependerá, por ejemplo, de los objetivos terapéuticos tales como la indicación para la cual se está utilizando la ciclina E2, la ruta de administración, y el estado del paciente. Por consiguiente, será necesario para el terapeuta titular la dosificación y modificar la ruta de administración según se requiera para obtener el efecto terapéutico óptimo. Una dosis diaria típica puede oscilar de aproximadamente 0,1 \mug/kg hasta 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados antes. Típicamente, un clínico administrará la composición de ciclina E2 hasta alcanzar una dosificación que logre el efecto deseado. La composición de ciclina E2 puede ser administrada por lo tanto en forma de una única dosis, o en forma de dos o más dosis (que pueden contener o no la misma cantidad de ciclina E2) a lo largo del tiempo, o en forma de una infusión continua por medio de un dispositivo de implante o un catéter.

A medida que se realizan estudios adicionales, surge información referente a los niveles de dosificación apropiados para el tratamiento de diversas condiciones en diversos pacientes, y el trabajador experto normal, considerando el contexto terapéutico, el tipo de trastorno en tratamiento, la edad y la salud general del receptor, será capaz de lograr la dosificación apropiada.

La composición de ciclina E2 que se va a utilizar para la administración in vivo debe ser estéril. Esto se logra fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles. Cuando la composición de ciclina E2 es liofilizada, la esterilización utilizando estos métodos puede ser llevada a cabo o bien antes, o bien después, de la liofilización y la reconstitución. La composición para la administración parenteral será almacenada normalmente en forma liofilizada o en solución.

Las composiciones terapéuticas se colocan generalmente en un recipiente que tenga un puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa que tenga un tapón horadable por una aguja para inyección hipodérmica.

La ruta de administración de la composición es conforme a los métodos conocidos, v.g., oral, inyectable o infusión mediante las rutas intravenosa, intraperitoneal, intracerebral (intraparenquimal), intracerebroventricular, intramuscular, intraocular, intraarterial, o intralesional, o mediante sistemas de liberación sostenida o dispositivos de implante que pueden implicar opcionalmente el uso de un catéter. Cuando se desea, las composiciones pueden ser administradas continuamente mediante infusión, inyección de bolo o mediante u dispositivo de implante.

Alternativamente o adicionalmente, la ciclina E2 puede ser administrada localmente por medio de la implantación en el área afectada de una membrana, esponja, u otro material apropiado sobre el cual haya sido absorbido el polipéptido de ciclina E2.

Cuando se utiliza un dispositivo de implante, el dispositivo puede ser implantado en un tejido u órgano adecuado, y la liberación de la ciclina E2 puede ser directamente a través de bolo, o por medio de la administración continua, o por medio de un catéter utilizando la infusión continua.

El polipéptido de ciclina E2 puede ser administrado en una formulación o preparación de liberación sostenida. Entre los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida se incluyen matrices poliméricas semipermeables en forma de artículos conformados, v.g., películas, o microcápsulas. Entre las matrices de liberación sostenida se incluyen poliésteres, hidrogeles, polilactidas (Estados Unidos 3.773.919, EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de gamma etilo (Sidman y col, Biopolymers, 22:547-556 [1983]), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer y col., J. Biomed. Mater. Res., 15:167-277 [1981] y Langer, Chem. Tech., 12:98-105 [1982]), etilenvinilacetato (Langer y col., supra) o ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (EP 133.988). Entre las composiciones de liberación sostenida también se pueden incluir liposomas, que pueden ser preparados por cualquiera de los numerosos métodos conocidos en la técnica (v.g., Epstein y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 [1985]; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949).

En algunos casos, puede ser deseable utilizar composiciones de ciclina E2 de una manera ex vivo. Aquí, las células, tejidos, u órganos que han sido separados del paciente son expuestos a las composiciones de ciclina E2 después de lo cual las células, tejidos y/o órganos son implantados de nuevo más tarde en el paciente.

En otros casos, la ciclina E2 puede ser liberada a través del implante en pacientes de ciertas células que han sido diseñadas genéticamente, utilizando métodos tales como los descritos aquí, para expresar y secretar polipéptidos de ciclina E2, fragmentos, variantes, o derivados. Tales células pueden ser células animales o humanas, y pueden derivar de tejidos del propio paciente o de otra fuente, ya sea humana o no humana. Opcionalmente, las células pueden ser inmortalizadas. No obstante, con el fin de reducir la posibilidad de una respuesta inmunológica, se prefiere que las células sean encapsuladas para evitar la infiltración de los tejidos circundantes. Los materiales de encapsulación son típicamente envueltas poliméricas, semi-permeables, biocompatibles o membranas que permitan la liberación del producto o los productos proteicos pero evitan la destrucción de las células por el sistema inmune del paciente o por otros factores perjudiciales de los tejidos circundantes.

Los métodos utilizados para la encapsulación de células en membranas son familiares para el artesano experto, y la preparación de las células encapsuladas y su implante en pacientes pueden ser completadas sin la experimentación indebida. Ver, v.g., las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.892.538; 5.011.472; y 5.106.627. En la PCT WO 91/10425 (Aebischer y col.) se describe un sistema para encapsular células vivas. Las técnicas para formular otros diversos medios de liberación sostenida o controlada, tales como portadores de liposomas, partículas o cuentas bio-erosionables, también son conocidas por los expertos en la técnica, también son conocidas en la técnica, y se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.653.975 (Baetge y col., CytoTherapeutics, Inc.). Las células, con o sin encapsulación, pueden ser implantadas en tejidos u órganos corporales adecuados del paciente.

Como se comenta más abajo, puede ser deseable tratar poblaciones de células aisladas tales como células pluripotenciales, linfocitos, glóbulos rojos, condrocitos, neuronas, y similares con ciclina E2. Esto puede ser logrado exponiendo las células aisladas a la proteína ciclina E2, donde la ciclina E2 está en una forma que resulta permeable a la membrana celular. Alternativamente, la terapia génica puede ser empleada como se describe más abajo.

Una manera en la cual puede ser aplicada la terapia génica consiste en el uso del gen de ciclina E2 (ya sea ADN genómico, ADNc, y/o ADN sintético que codifica la ciclina E2, o un fragmento, variante, o derivado del mismo) que puede estar conectado operablemente a un promotor constitutivo o inducible para formar un "constructo de ADN para terapia génica". El promotor puede ser homólogo o heterólogo con respecto al gen de ciclina E2 endógeno, siempre que sea activo en el tipo de célula o tejido en el cual se vaya a insertar el constructo. Entre otros componentes del constructo de ADN para la terapia génica se pueden incluir opcionalmente, según se requiera, moléculas de ADN diseñadas para la integración en un sitio específico (v.g., secuencias limítrofes endógenas útiles para la recombinación homóloga), intensificadores o silenciadores del promotor específico de tejidos, moléculas de ADN capaces de proporcionar una ventaja selectiva sobre la célula parental, moléculas de ADN útiles como marcas para identificar células transformadas, sistemas de selección negativa, agentes de unión específica a la célula (como, por ejemplo, para el redireccionamiento celular), factores de internalización específicos de la célula, y factores de transcripción para intensificar la expresión por el vector así como factores para permitir la elaboración del vector.

Este constructo de ADN para la terapia génica puede ser introducido después en las células del paciente (ya sea ex vivo o in vivo). Un medio para introducir el constructo de ADN para la terapia génica es a través de vectores virales. Entre los vectores virales adecuados utilizados típicamente en la terapia génica para la liberación de los constructos de ADN para la terapia génica se incluyen, sin limitación, vectores de adenovirus, virus adeno-asociados, virus herpes-simplex, lentivirus, papilomavirus, y retrovirus. Algunos de estos vectores, tales como los vectores retrovirales, liberarán el constructo de ADN para la terapia génica en el cromosoma bacteriano de las células del paciente, y el constructo de ADN para la terapia génica puede integrarse en el ADN cromosómico; otros vectores funcionarán como episomas y el constructo de ADN para la terapia génica permanecerá en el citoplasma. El uso de vectores para la terapia génica se describe, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5.672.344 (30 de Septiembre de 1997; Kelly y col., University of Michigan), 5.399.346 (21 de Marzo 1995; Anderson y col., U.S. Dept. Health and Human Services), 5.631.236 (20 de Mayo de 1997; Woo y col., Baylor College of Medicine), y 5.635.399 (3 de Junio de 1997; Kriegler y col., Chiron Corp.).

Entre los medios alternativos para liberar los constructos de ADN para la terapia génica en las células de un paciente sin el uso de vectores virales se incluyen, sin limitación, la transferencia mediada por liposomas, la inyección directa de ADN desnudo, la transferencia mediada por un receptor (complejo ligando-ADN), la electroporación, la precipitación con fosfato de calcio, y el bombardeo con micropartículas (v.g., "pistola génica"). Ver las Patentes de los Estados Unidos Núms. 4.970.154 (13 de Noviembre de 1990; Chang, Baylor College of Medicine), WO 96/40958 (19 de Diciembre de 1996; Smith y col., Baylor College of Medicine) 5.679.559 (21 de Octubre de 1997; Kim y col., University of Utah) 5.676.954 (14 de Octubre de 1997; Brigham, Vanderbilt University), y 5.593.875 (14 de Enero de 1997; Wurm y col., Genentech).

Otro método para incrementar la expresión de la ciclina E2 endógena en una célula por medio de la terapia génica consiste en insertar uno o más elementos intensificadores en los promotores de la ciclina E2, donde el elemento o los elementos intensificadores pueden servir para incrementar la actividad transcripcional del gen de la ciclina E2. El elemento o los elementos intensificadores utilizados serán seleccionados basándose en el tejido en el que se desee activar la ciclina E2; se seleccionarán elementos intensificadores conocidos por conferir la activación del promotor en un tejido dado. Por ejemplo, si se va a "conectar" la ciclina E2 en células T, se puede utilizar el elemento intensificador del promotor lck. Aquí, la porción funcional del elemento transcripcional puede ser insertada en un fragmento de ADN que contenga el promotor de la ciclina E2 (y opcionalmente, también la secuencia limítrofe 5' y/o 3', vectora) utilizando mecanismos de clonación normalizados. Este constructo, conocido como "constructo de recombinación homólogo" puede ser introducido después en las células deseadas ya sea ex vivo o in vivo.

La terapia génica puede ser utilizada par disminuir la expresión de la ciclina E2 modificando la secuencia de nucleótidos del promotor de la ciclina E2 endógena. Semejante modificación se logra típicamente por medio de los métodos de recombinación homólogos. Por ejemplo, se puede diseñar una molécula de ADN que contenga todo o una porción de la secuencia del promotor de la ciclina E2 para eliminar y/o remplazar piezas del promotor que regulan la transcripción. Aquí, la caja TATA y/o el sitio de unción de una proteína activadora de la transcripción del promotor de ciclina E2 puede ser suprimida utilizando mecanismos de la biología molecular normalizados; semejante deleción puede inhibir la actividad promotora reprimiendo de ese modo la transcripción del correspondiente gen de la ciclina E2. La deleción de la caja TATA o del sitio de unión al activador de la transcripción en el promotor puede ser completada generando un constructo de ADN que comprenda toda o una porción relevante del promotor de la ciclina E2 (de la misma especie o de una especie relacionada que el gen de la ciclina E2 que se va a regular) en la cual uno o más de los nucleótidos de la caja TATA y/o el sitio de unión al activador transcripcional son mutados por medio de una sustitución, deleción y/o inserción de uno o más nucleótidos de manera que la caja TATA y/o el sitio de unión al activador tengan una actividad disminuida o se vuelvan completamente inactivos. Este constructo, que también contendrá típicamente al menos aproximadamente 500 bases de ADN que corresponden a las regiones limítrofes 5' y 3' naturales (endógenas) del segmento promotor que ha sido modificado, pueden ser introducidas en las células apropiadas (ya sea ex vivo o in vivo) directamente o por medio de un vector viral tal como los descritos antes. Típicamente, la integración del constructo en el ADN genómico de las células será por medio de la recombinación homóloga, donde las secuencias de ADN limítrofes 5' y 3' del constructo del promotor pueden servir para ayudar a integrar la región promotora modificada por medio de la hibridación al ADN cromosómico endógeno.

También se pueden emplear otros métodos de terapia génica en los que es deseable inhibir la actividad de la ciclina E2. Por ejemplo, se pueden introducir en la célula moléculas de ADN o ARN antisentido, que tienen una secuencia que es complementaria al menos a una porción de la ciclina E2. Típicamente, la molécula antisentido será complementaria al sitio de inicio (extremo 5') del gen de la ciclina E2. Cuando la molécula antisentido hibrida después con el ARNm de ciclina E2, se evita la traducción del ARNm de la ciclina E2.

Alternativamente, se puede emplear la terapia génica para crear un inhibidor dominante negativo de la ciclina E2. En esta situación, el ADN que codifica un polipéptido de ciclina E2 completo o truncado mutante puede ser preparado e introducido en las células de un paciente utilizando métodos virales o no virales como se ha descrito antes. El mutante de ciclina E2 es diseñado típicamente para (1) competir con la ciclina E2 endógena en su papel biológico; y (2) contener una o más inserciones, deleciones, y/o mutaciones en comparación con la ciclina E2 de tipo salvaje de manera que todavía se una a cdk2, pero no permita la formación de un complejo ciclina E2/cdk activo (ver, por ejemplo Diehl y col., Mol. Cell. Biol., 17:7362-7374 [1997]). Esta proteína de ciclina E2 mutante, cuando es sobreexpresada en las células en las cuales es introducida, puede competir con la proteína de ciclina E2 endógena, dando como resultado la formación de complejos de ciclina E2/cdk2 mutantes que son inactivos.

Biología de la Ciclina E2

Si bien no se desea estar ligado a ninguna teoría, se cree que, in vivo, la ciclina E2 forma un complejo con la quinasa 2 dependiente de ciclina ("cdk2") para formar una "holoenzima"; esta holoenzima puede ser fosforilada después en la posición 160 (treonina) de la cdk2 por medio de un complejo de enzima separada denominado "quinasa activadora de ciclina" o "cak". Tras la fosforilación de la porción cdk2 del complejo holoenzimático ciclina E2/cdk, este complejo puede fosforilar después sus sustratos, que son retinoblastoma e histona H1 por medio de la actividad quinasa de la porción cdk2 de la holoenzima.

Análisis para Rastrear Inhibidores de Ciclina E2

Las moléculas orgánicas (biológicas o sintéticas) o inorgánicas que inhiben la ciclina E2 pueden ser identificadas utilizando uno o más de los análisis de rastreo descritos más abajo. Tales moléculas podían ser administradas o bien ex vivo, o bien in vivo mediante inyección local o iv, o mediante liberación oral, mediante un dispositivo de implante, o similar.

Para facilitar la lectura, se utiliza la siguiente definición para describir los análisis:

"Molécula o moléculas de ensayo" hace referencia a la molécula o a las moléculas que están en evaluación como inhibidor de la ciclina E2, o bien en virtud de su potencial capacidad de bloquear (1) la interacción de la quinasa dependiente de ciclina E2 ("cdk2"); una molécula con la cual se asocia naturalmente en la célula; ver los presentes Ejemplos) o (2) la interacción de la ciclina E2/cdk2 con la quinasa activadora de ciclina "cak"; una molécula que "activa" el complejo ciclina E2/cdk2 mediante la fosforilación de cdk en la posición 160, pero solamente cuando la cdk2 forma complejo con la ciclina E2.

A. Análisis In Vitro Utilizando Proteínas Purificadas

Un tipo de análisis in vitro para evaluar la eficacia de una molécula de ensayo inhibidora de ciclina E2 requiere ciclina E2 purificada y cdk. El polipéptido de ciclina E2 y el polipéptido de cdk pueden ser producidos recombinantemente utilizando los métodos descritos antes. El gen que codifica cdk es conocido (Ninomiya-Tsuji y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9006-9010 [1991]; Tasi y col., Nature, 353:174-177 [1991]). Los polipéptidos de ciclina E2 y cdk2 recombinantes pueden ser moléculas completas o variantes o derivados de las mismas biológicamente activos. Entre las células huésped para la producción recombinante de cada polipéptido se incluyen, sin limitación, bacterias tales como E. coli, levadura, células de insecto (utilizando, por ejemplo, el sistema de baculovirus), células de mamífero, u otras células eucarióticas. Los dos polipéptidos pueden ser producidos simultáneamente en la misma célula huésped, donde la célula huésped es transfectada simultáneamente con el ADN que codifica cada polipéptido, o en células huésped separadas de la misma o diferente especie.

Cada polipéptido puede ser purificado a partir de la célula huésped (o el medio de cultivo si es secretada); típicamente, esto se puede lograr expresando cada polipéptido con una secuencia "etiqueta" tal como hemaglutinina ("HA"), His (polihistidina tal como hexahistidina), myc o FLAG, y purificando el polipéptido con la etiqueta por medio de cromatografía de afinidad utilizando, por ejemplo, una columna de níquel para la polihistidina, o un anticuerpo mono- o poli-clonal para myc o FLAG.

Como se ha mencionado antes, la porción cdk de la holoenzima ciclina E2/cdk2 debe estar fosforilada en el aminoácido 160 con el fin de que la holoenzima tenga actividad quinasa; la fosforilación del aminoácido 160 de cdk puede ocurrir solamente cuando cdk está asociada con la ciclina E2, formando de ese modo la holoenzima. El complejo ciclina E2/cdk se puede formar espontáneamente si se expresan simultáneamente los dos polipéptidos en células eucarióticas o procarióticas. Adicionalmente, cuando son expresados simultáneamente en una célula huésped eucariótica, la maquinaria de la célula huésped puede fosforilar el aminoácido 160 de cdk, siempre que la célula huésped tenga quinasa activadora de ciclina endógena ("cak"), que es responsable de semejante fosforilación. El complejo holoenzimático fosforilado (el "complejo holoenzimático activado") puede ser purificado después, típicamente utilizando la cromatografía de afinidad.

Un método preferido para producir el complejo holoenzimático activado es el sistema de baculovirus tal como pFastBac DUAL® (Gibco/BRL Life Technologies, Grand Island, NY). En este sistema, los genes tanto de cdk como de ciclina E2 pueden ser expresados en el mismo vector, y el vector también contiene una etiqueta poliHis para facilitar la purificación.

Si los dos polipéptidos son producidos en células huésped separadas de la misma o diferente especie, pueden ser purificados cada uno (preferiblemente por medio de la cromatografía de afinidad) y después combinados en solución forman el complejo holoenzimático. Luego se pueden añadir ATP y cak (quinasa activadora dependiente de ciclina) al complejo holoenzimático; después se puede fosforilar el aminoácido treonina 160 de cdk por medio de cak, generando de ese modo un complejo holoenzimático activo. Una vez que el complejo holoenzimático activo ha sido preparado y aislado, se pueden realizar diversos análisis in vitro para los inhibidores de ciclina E2.

En uno de tales análisis, se pone en solución el complejo holoenzimático activado. Se pueden añadir a la solución ATP marcado en gamma (tal como ATP-P32), sustrato para la holoenzima (tal como histona H1 y péptido de retinoblastoma), y la molécula o moléculas a someter a ensayo o bien simultáneamente o bien sucesivamente. Tras un período de incubación, se puede aislar el sustrato y analizar la cantidad de marca que contiene.

En un análisis preferido, denominado "análisis de proximidad por centelleo", o "SPA" (Cook, Drug Discovery Today, 1:287-294 [1996]), se ancla sustrato biotinilado (histona H1 o péptido de retinoblastoma, por ejemplo) a cuentas no porosas recubiertas con estreptavidina y cargadas con fluido de centelleo. Las cuentas pueden ser incubadas con un complejo holoenzimático activado, ATP marcado en gamma, y la molécula o las moléculas de ensayo utilizando placas de microtitulación (tales como placas de 96 pocillos o placas de 384 pocillos). Cuando se transfiere un grupo fosfato radiomarcado al sustrato por medio de la actividad quinasa del complejo holoenzimático activado, el fotón liberado por el grupo fosfato radiactivo es registrado por el contador de centelleo. Aquellos pocillos que contienen moléculas de ensayo que son eficaces al inhibir la ciclina E2 de manera que la actividad quinasa del complejo holoenzimático sea desorganizada tendrán menos recuento radiactivo detectado que los pocillos de control.

También se pueden llevar a cabo otros análisis in vitro para evaluar moléculas de ensayo. En uno de tales análisis, se puede anclar el sustrato a pocillos de una placa de microtitulación, y se pueden añadir sucesivamente o simultáneamente un complejo holoenzimático activo, ATP marcado en gamma (u otro agente de detección adecuado), y la molécula o moléculas de ensayo. Después de una incubación corta (del orden de segundos a minutos), se puede separar la solución de cada pocillo y las placas se pueden lavar y luego medir la cantidad de fosfato marcado en gamma añadido al sustrato por medio de la actividad del complejo holoenzimático.

Otras variaciones de estos análisis serán evidentes para el artesano experto. Por ejemplo, el sustrato puede ser anclado a cuentas como alternativa al anclaje al fondo de cada pocillo; las cuentas pueden ser separadas después de la solución tras la incubación con la molécula de ensayo, el ATP marcado, y el complejo holoenzimático activado, y midiendo la cantidad de marca incorporada al sustrato.

Típicamente, en cada tipo de análisis, la molécula de ensayo será evaluada a lo largo de una amplio intervalo de concentraciones, y se pueden utilizar una serie de controles adecuados para la precisión en la evaluación de los resultados. En algunos casos, puede ser útil evaluar dos o más moléculas de ensayo juntas para analizar la posibilidad de efectos "sinérgicos".

B. Análisis In Vitro Utilizando Células Cultivadas

Se pueden utilizar líneas celulares eucarióticas cultivadas que están dividiéndose activamente para analizar la eficacia de una molécula de ensayo al inhibir la ciclina E2. Las líneas celulares preferidas son por ejemplo las células Saos-2 de mamífero (American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA, USA; número de acceso HTB-85) y las células 293T de riñón embriónico humano (American Type Culture Collection, número de acceso CRL-1573), que expresan niveles detectables de ciclina E2, cdk, y cak. No obstante, las células que se están dividiendo activamente en las cuales los genes que codifican la ciclina E2 y/o la cdk son transfectados y expresados a un nivel detectable, pero expresan la cak endógena (o en las cuales los genes de cak también son transfectados y expresados) también son adecuadas para su uso en estos análisis.

Los cultivos de células pueden ser expuestos a la molécula o las moléculas de ensayo durante una cantidad de tiempo predeterminada (normalmente hasta aproximadamente 24 horas). Las células se pueden lavar para separar la molécula de ensayo restante, y después se puede medir su capacidad de división. Las células que se dividen activamente pueden ser identificadas en varios días. Una manera preferida consiste en incubarlas durante un tiempo corto en un compuesto tal como bromo-desoxiuridina (BRDU), un análogo nucleotídico que es incorporado al ADN a medida que éste replica; el BRDU puede ser detectado utilizando un anticuerpo marcado fluorescente. Alternativamente, o adicionalmente, las células en división pueden ser detectadas utilizando el Alamar Blue Assay® (Biosource Intl., Camarillo, CA). Las moléculas de ensayo eficaces serán aquellas que disminuyan la cantidad de división celular en comparación con los análisis de control.

Si bien no se pretende estar ligado a un mecanismo de acción concreto, se cree que la inhibición de la ciclina E2 puede conducir a la muerte celular, o apoptosis. Por lo tanto, también se puede evaluar la supervivencia de las células que han sido expuestas a una o más moléculas de ensayo mediante el uso de azul tripán, u otro colorante o molécula fluorescente que sea excluida o absorbida selectivamente por las células vivas.

Otros análisis basados en células para la detección de la eficacia de las moléculas de ensayo serán fácilmente evidentes para el artesano experto.

Los análisis se pueden llevar a cabo utilizando placas de microtitulación de 96 pocillos u otras placas adecuadas que permitan llevar a cabo diversos análisis simultáneamente. Típicamente, en cada tipo de análisis de cultivo celular, la molécula de ensayo será evaluada a lo largo de un intervalo de concentraciones, y se puede utilizar una serie de "pocillos de control" que carecen o bien de las moléculas de ensayo, o bien de las células cultivadas para la precisión en la evaluación de los resultados. En algunos casos, puede ser útil evaluar dos o más moléculas de ensayo juntas para evaluar la posibilidad de efectos "sinérgicos".

C. Análisis In Vivo

Una vez que se han identificado las moléculas, se puede evaluar la eficacia de éstas en modelos de tumores de roedor (ver por Ejemplo, O'Reilly y col., Cell, 88:277-285 [1997]). La molécula de ensayo puede ser administrada antes del comienzo del tumor en el roedor; después de semejante administración, se puede controlar la aparición de los tumores y compararla con un roedor de control que no reciba la molécula de ensayo. Alternativamente, la molécula de ensayo puede ser administrada después del comienzo del tumor, y se puede controlar el tamaño del tumor.

Los siguientes ejemplos están destinados a fines meramente ilustrativos, y no se deben considerar limitantes del alcance de la invención en modo alguno.

Ejemplos 1. Identificación de la Ciclina E2 Humana

Se investigó una base de datos de EST interna ("etiquetas de secuencia expresada" en sus siglas en inglés) de Amgen, Inc., conteniendo los ADNc de más de 200 bancos diferentes utilizando una secuencia peptídica diseñada para identificar los dominios de tipo caja de ciclina.

Una EST de múrido denominada BmmE7-133-G12 fue obtenida de esta búsqueda, y fue utilizada para buscar la base de datos pública Genbank que contiene secuencias de ADN humano. Se obtuvo una secuencia con el número de acceso R84331. Esta secuencia fue utilizada para diseñar cebadores de PCR para llevar a cabo un reconocimiento de transcritos.

El reconocimiento de transcritos se llevó a cabo mediante PCR utilizando diversos bancos de ADNc de Marathon® (Clontech, Palo Alto, CA) con los siguientes cebadores:

1

Las condiciones para la PCR eran: 2,5 \mul de ADNc, 20 pmoles de cada cebador, 0,5 \mul de 50 x dNTP, 0,5 \mul de enzima AmpliTaq® (Perkin Elmer), 2,5 \mul de 10x tampón de PCR en un volumen final de 25 \mul. Los parámetros del ciclo fueron 94°C durante 2 minutos, seguido de 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos, 72°C durante 45 segundos, seguido de 72°C durante 7 minutos después del último ciclo. Los ADNc de hígado fetal, de pulmón fetal y de timo eran positivos para los transcritos de ciclina.

Se utilizó la PCR de Fetal Liver Marathon cDNA Library® (Clontech, Palo Alto, CA) para obtener la región codificadora completa del gen de ciclina E2. Los cebadores sentido y antisentido para esta reacción eran, respectivamente:

2

Las condiciones para la PCR eran: 2,5 \mul de ADNc, 5 pmoles de cada cebador, 0,5 \mul de 50 x dNTP, 0,5 \mul de polimerasa KlenTaq® (Clontech, Palo Alto, CA), 2,5 \mul de 10X tampón de PCR en un volumen final de 25 \mul. Los parámetros del ciclo fueron 94°C durante 1 minuto seguido de 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, seguido de 68°C durante 3 minutos. Los productos de la PCR se hicieron correr después sobre un gel de agarosa al 1 por ciento. Se cortó del gel un producto de PCR de aproximadamente 2,58 kilopares de bases (kb), y las rebanadas del gel fueron solubilizadas en yoduro de sodio e incubadas a aproximadamente 48°C durante aproximadamente 1 horas. Después se extrajo el ADN y se purificó utilizando el estuche GeneClean® (Bio 101, Vista, CA) siguiendo el protocolo del fabricante, y se ligó en el vector pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Este vector que contenía el inserto fue transformado después en células de E. coli Inv-Alfa-f' (Invitrogen, Carlsbad, CA) para la amplificación. El plásmido fue purificado a partir de las células utilizando el método de lisis alcalina normalizado con el estuche Qiagen Maxi® (Qiagen, Santa Clarita, CA), y el inserto fue secuenciado. La secuenciación indicaba que el inserto contenía el ADN de la ciclina E2 humana completo.

Para confirmar que la secuencia obtenida era correcta, se realizó la PCR utilizando una polimerasa de alta fidelidad como sigue. Se utilizaron como molde Fetal Lung and Thymus Marathon Libraries® (Clontech), y los cebadores para esta reacción eran:

3

Las condiciones para la PCR eran las siguientes: 2,5 \mul de ADNc, 5 pmoles de cada cebador, 0,5 \mul de 50 x dNTP, 0,5 \mul de polimerasa PFU (Stratagene, La Jolla, CA), 2,5 \mul de 10X tampón de PCR a un volumen final de 25 \mul. Los parámetros del ciclo fueron 94°C durante 2 minutos, seguido de 35 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 60°C durante 30 segundos, y 72°C durante 3 minutos. La banda de ADN de aproximadamente 1,3 kb resultante fue resuelta en un gel de agarosa y purificada como se ha descrito antes. El producto de ADN purificado fue subclonado en pCR2.1 como se ha descrito antes.

La digestión de 2 clones independientes con la enzima de restricción EcoRI reveló un fragmento de aproximadamente 1,3 kb, y un fragmento de aproximadamente 1,2 kb. El análisis de la secuencia de los dos fragmentos reveló un clon de ciclina E2 completo (el fragmento de 1,3 kb), y un clon de ciclina E2 mutante (el fragmento de 1,2 kb) con una deleción en marco de aproximadamente 135 pb en la caja de ciclina de carecía de las bases 496-631 del clon completo.

La secuencia del ADNc de la ciclina E2 humana completa se expone en la Figura 1 (SEC ID NUM: 1), y la secuencia de aminoácidos supuesta, traducida a partir de este ADNc, se muestran en la Figura 3 (SEC ID NUM: 3). La secuencia de ADNc de la variante de empalme se expone en la Figura 5 (SEC ID NUM: 5), y la secuencia de aminoácidos de esta variante de empalme se muestran en la Figura 6 (SEC ID NUM: 6).

El análisis de este gen, y la comparación con los genes de las bases de datos expuestas antes indicaba que se trataba en efecto de un gen novedoso, con aproximadamente una identidad total del 49 por ciento a nivel tanto de la secuencia de ADN como de aminoácidos con respecto a la ciclina E1 humana, y una identidad de aproximadamente el 70 por ciento con el dominio de la caja de ciclina de la ciclina E1 humana a nivel de aminoácidos. Debido a la homología con la ciclina E1, se determinó que este gen era un miembro de la familia de la ciclina. Por lo tanto, se denominó "ciclina E2".

El clon de ciclina E2 mutante, que es una variante de empalme en marco, carece de los aminoácidos 166-212 (bases 496-631), que están localizados en la caja de ciclina. Como se describe más abajo con detalle, esta isoforma no se une a cdk2.

Un búsqueda de esta secuencia de ADNc de ciclina E2 humana con las bases de datos disponibles públicamente, externas tales como Genbank reveló una EST en la base de datos que tiene homología con el extremo 5' de la ciclina E2 humana (número de acceso Genbank R84331). No obstante, la secuencia de Genbank tiene numerosas bases incorrectas cuando se compara con el mismo tramo de nucleótidos de la presente invención.

2. Clonación de Ciclina E2 De múrido

La EST de múrido BmmE7-133-G12 descrita antes fue utilizada para diseñar los siguientes cebadores de PCR:

100

Se utilizó un ADNc de Marathon Library® (Clontech, Palo Alto, CA) de cerebro de ratón como molde para la PCR. Las condiciones para la PCR fueron las siguientes: 5 \mul de ADNc, 20 pmoles de cada cebador, 0,5 \mul de 50 x dNTP, 0,5 \mul de AmpliTaq® (Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ), y 5 \mul de 10X tampón de PCR en un volumen final de 50 \mul. Los parámetros de la reacción fueron: 94°C durante 2 minutos, seguido de 35 ciclos de 94°C durante 20 segundos, 60°C durante 30 segundos, 72°C durante 50 segundos, y un mantenimiento a 72°C durante 7 minutos tras el último ciclo. El producto de la PCR era un fragmento de aproximadamente 723 pb, y contenía los restos 308 a 1031. Este fragmento fue clonado en pCR2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) y fue transformado en células de E. coli como se ha descrito antes. Después de cultivar las células para amplificar el plásmido, el plásmido fue purificado a partir de las células como se ha descrito antes, y el inserto de aproximadamente 723 pb fue digerido con EcoRI lo que generó un fragmento de aproximadamente 153 pb (restos 879 a 1031) y un fragmento de aproximadamente 570 pb (restos 308 a 878). El fragmento de 570 pb fue purificado en gel utilizando los procedimientos descritos antes, y fue utilizado como sonda de ADN para rastrear un banco XR de testículos de ratón Uni-Zap® (Stratagene, La Jolla, CA, catálogo núm. 937308). El banco fue cultivado en placa a aproximadamente 1 x 10(6) PFU (unidades formadoras de placa), y se prepararon elevadores de placa por duplicado utilizando membranas de nailon (BioRad, Hercules, CA). La sonda de 570 pb de Ciclina E2 de ratón fue radiomarcada utilizando el estuche Rediprimer® (Amersham Life Science, Arlington Heights, IL) siguiendo el protocolo del fabricante. La actividad específica de la sonda era de aproximadamente 1 x 10(9) cpm/microgramo. La hibridación de los filtros se realizó durante la noche a aproximadamente 42°C en solución de hibridación normalizada conteniendo 2,5 x solución de Denhardt, formamida al 50%, SDS al 0,1 por ciento, 5 x SSC, y 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmón. Tras la hibridación, los filtros fueron lavados dos veces en 2 x SSC a la temperatura ambiente durante aproximadamente 15 minutos, seguido de tres lavados en 2 x SSC a aproximadamente 50°C durante aproximadamente 30 minutos, y después una vez en 0,2 x SSC más SDS al 0,5 por ciento a aproximadamente 42°C durante 30 minutos. Los filtros fueron expuestos a la película a aproximadamente -70°C durante aproximadamente 3 días utilizando tamices intensificadores.

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Se identificaron seis positivos a partir de este rastreo por hibridación. El inserto de cada clon fue subclonado en el vector pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA) utilizando mecanismos normalizados y cada inserto fue secuenciado.

La secuencia del ADN de la ciclina E2 de múrido se muestra en la Figura 2 (SEC ID NUM: 2). La supuesta secuencia de aminoácidos, traducida a partir del ADNc, se muestra en la Figura 4 (SEC ID NUM: 4). La ciclina E2 de múrido tenía una identidad de aproximadamente el 89 por ciento con la ciclina E2 humana a nivel de ADN, y una identidad de aproximadamente el 92 por ciento con la ciclina E2 humana a nivel de aminoácidos.

3. Preparación de Proteína Ciclina E2 Humana

Se preparó el polipéptido de ciclina E2 humana completo en forma de proteína de fusión con glutation-s-transferasa utilizando el sistema pGEX® (Pharmacia, Piscataway, NJ) y siguiendo el protocolo del fabricante. El ADNc de ciclina E2 fue insertado en el vector pGEX-4T-2 en el extremo 3' del ADN que codifica la GST. El vector fue transformado en células de la cepa BL-21 de E. coli (Invitrogen, San Diego, CA) que eran competentes para la transformación mezclando el ADN plasmídico con las células. Tras cultivar las células durante la noche, las células fueron diluidas 1:100 en medio y cultivadas durante aproximadamente 4 horas a 37°C, después de lo cual se añadió IPTG a una concentración final de 0,1 mM. Al cabo de aproximadamente 4 horas de cultivo, se preparó el extracto de proteína a partir de las células utilizando el protocolo GST Gene Fusion System® (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) siguiendo el protocolo del fabricante, y este extracto se añadió después a una suspensión de cuentas de Glutation-Agarosa 4B Sepharose (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). La solución del extracto que contenía las cuentas fue centrifugada después, y las cuentas fueron recogidas y lavadas. Estas cuentas fueron mezcladas después con una suspensión de cuentas de agarosa a las cuales se había unido trombina proteasa (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Después de mezclar e incubar los dos grupos de cuentas durante aproximadamente 1 hora a la temperatura ambiente, la solución se centrifugó para sedimentar las cuentas. Las muestras del sobrenadante se hicieron correr sobre SDS-PAGE para evaluar la pureza. En la Figura 9 se muestra una foto de un gel teñido con Coomassie. Como se puede observar, solamente estaba presente una única banda de aproximadamente 46 kDa; esta banda corresponde al peso molecular esperado para la ciclina E2, indicando que el procedimiento daba como resultado la generación del polipéptido de ciclina E2 purificado. Para confirmar que esta banda era en efecto de ciclina E2, se preparó una transferencia Western y se sondeó con antisuero anti-ciclina E2 (utilizando el antisuero originado contra el péptido de ciclina E2 de la SEC ID NUM: 17).

4. Producción del Anticuerpo de Ciclina E2 Humana

Se preparó antisuero policlonal de conejo originado contra dos péptidos de ciclina E2 como sigue: Se prepararon péptidos correspondientes a las dos siguientes secuencias de aminoacidos utilizando procedimientos de síntesis de péptidos normalizados.

101

Se mezclaron aproximadamente 5 mg de cada péptido con coadyuvante completo de Freund en un volumen total de aproximadamente 1 ml, y se inyectaron subcutáneamente en conejos. Al cabo de aproximadamente 4 semanas, se inyectó de nuevo a los conejos la misma solución. Al cabo de 2 semanas, se tomaron muestras de sangre de los conejos y se sometió a ensayo la presencia de anticuerpos para los péptidos en el suero mediante transferencia Western. Se administró una tercera inyección tras la toma de muestras de sangre de ensayo, y aproximadamente dos semanas más tarde, se realizó una segunda toma de muestras de sangre de ensayo. Aproximadamente dos semanas más tarde, se administró una cuarta inyección, y aproximadamente dos semanas después de eso, se realizó la recogida de sangre final.

La sangre obtenida de la toma de muestras de sangre final se dejó coagular incubándola a aproximadamente 4°C mediante centrifugación y recogiendo el sobrenadante. Este suero fue utilizado para las transferencias Western y las inmunoprecipitaciones descritas aquí.

5. Expresión de Ciclina E2 Humana en Células de Mamífero

Se insertó el ADNc de ciclina E2 completa humana en el plásmido pEGFP-n1 (Invitrogen, San Diego, CA) que contiene la región codificadora de la proteína fluorescente verde (GFP''). El ADNc de la ciclina E2 fue insertado 3' con respecto al ADN de GFP para generar el vector pGFP-E2.

Después se transfectaron aproximadamente 5 microgramos del plásmido en aproximadamente 2 x 10(6) células de riñón embriónico humano 293T utilizando el procedimiento de transfección con fosfato de calcio normalizado.

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Simultáneamente, las células fueron transfectadas con un vector, denominado HA-cdk2, que contenía el gen que codifica la cdk2 humana (Turner y col., Genes and Devel., 8:1434-1447 [1994]).

Tras la transfección, las células fueron incubadas a aproximadamente 37°C durante aproximadamente 24 horas, después de lo cual las células fueron cosechadas en aproximadamente 200 microlitros de un tampón denominado "tampón TG" conteniendo Triton X-100 al 1 por ciento, glicerol al 10 por ciento, SDS al 0,1 por ciento, desoxicolato al 0,5 por ciento, Hepes 20 mM pH 7,4, NaCl 100 mM, y leupeptina, aprotinina, PMSF, vanadato de sodio, y fluoruro de sodio aproximadamente 1 mM cada uno. Los desechos celulares fueron eliminados por centrifugación a aproximadamente 10.000 x g, después de lo cual el sobrenadante fue recogido y el sedimento descartado.

Se añadió al extracto aproximadamente 1 microlitro de antisuero policlonal anti-GFP (Invitrogen, San Diego, CA) y el extracto fue incubado a aproximadamente 4°C durante aproximadamente 1 hora. Tras la incubación, se añadieron aproximadamente 50 microlitros de cuentas de agarosa Proteína A/Proteína G (Pierce Biochemicals, Rockford, IL), y la mezcla se incubó aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 4°C. Tras esta incubación, las cuentas fueron sedimentadas y lavadas cinco veces con tampón TG menos SDS y desoxicolato. Después de lavar, las cuentas fueron resuspendidas en tampón de muestra SDS-PAGE, calentadas a aproximadamente 95°C durante aproximadamente 3 minutos, centrifugadas, y el sobrenadante fue recogido y cargado en gel de SDS-PAGE al 12 por ciento.

El gel fue transferido a una membrana PVDF (NEN Life Sciences, Burton, MA) utilizando los procedimientos de transferencia Western normalizados, y la membrana fue cortada en tiras para sondear con diferentes anticuerpos incluyendo anti-GFP (Invitrogen, San Diego, SA), anti-HA (Boehringer-Mannheim, Indianápolis, IN), y anti-p27 (Santa Cruz Biologicals, Santa Cruz, CA).

Por separado, se siguió el mismo procedimiento para la variante de empalme de la ciclina E2 humana, y se realizaron los mismos procedimientos descritos inmediatamente antes para las células transfectadas con ciclina E2 de tipo salvaje para estas células con el fin de determinar si la cdk se une a la variante de empalme.

En otro grupo separado de experimentos, se transfectó simultáneamente un constructo de ADN que contenía un ADNc que codificaba p27 humana (Polyak y col., Cell, 78:59-66 [1994]) a células que también habían sido transfectadas con ciclina E2 completa y cdk2. Los procedimientos seguidos para esta transfección eran los mismos mostrados antes.

Los resultados del análisis de transferencia Western se muestran en la Figura 10 A-D. Como se muestra en 10A, la proteína GFP fusionada o bien a la ciclina E2 completa o bien a la ciclina E2 variante de empalme "SV" es inmunoprecipitada utilizando anti-suero anti-GFP. La cadena pesada de la IgG también es detectada en la transferencia Western como se indica. La Figura 10B demuestra que la GFP sola también es inmunoprecipitada por el antisuero anti-GFP. La Figura 10C muestra que cdk2 se asocia (y de ese modo inmunoprecipita simultáneamente) con la ciclina E2 de tipo salvaje pero no con la variante de empalme de la ciclina E2, y por lo tanto, la porción intermedia del dominio de la caja de ciclina, que ha desaparecido en la variante de empalme, es probablemente la responsable de la unión de cdk2 a ciclina E2. La Figura 10D muestra que en una transfección de tres vías de las células con cdk2, ciclina E2 (completa) y constructos de ADN de p27, p27 inmunoprecipita simultáneamente con las otras dos proteínas, indicando que p27 forma un complejo con cdk2 y ciclina E2. La Figura 10E muestra que un complejo que contiene ciclina E2 completa y cdk2 puede fosforilar la histona H1, y que la presencia de p27 disminuye la cantidad de fosforilación. Además, el complejo variante de empalme de ciclina E2-cdk2 no puede fosforilar la histona H1. Los experimentos para este análisis de quinasa fueron llevados a cabo como se describe inmediatamente más abajo.

6. Actividad Biológica de Ciclina E2

La actividad biológica de la ciclina E2/cdk2 fue evaluada utilizando un análisis de quinasa. Los extractos fueron preparados tratando aproximadamente 2 x 10 (6) células Saos-2 (American Type Culture Collection, 10801 University Blvd., Manassas, VA, USA) con aproximadamente 200 microlitros de tampón TG (ver arriba), y centrifugando el extracto para sedimentar los desechos celulares. Se añadieron aproximadamente 3 microlitros de anticuerpo (o bien anti-ciclina E2 originado contra el péptido de la SEC ID NUM: 17, anti-GP, o bien suero preinmune "PI") a aproximadamente 500 microlitros de proteína de extracto celular, y la mezcla fue incubada aproximadamente 1 hora a aproximadamente 4°C. Después se añadieron aproximadamente 50 microlitros de cuentas de Sepharose Proteína A/G, y esta mezcla se incubó aproximadamente 30 minutos a aproximadamente 4°C. Las cuentas fueron lavadas después aproximadamente 4 veces con tampón TG (aproximadamente 500 microlitros por lavado) después de lo cual se añadió tampón quinasa conteniendo Tris 50 mM pH 7,5, MgCl_{2} 10 mM, DTT 1 mM, ATP 25 mM, y 40 micro-CI de gamma-32P-ATP al extracto. Luego se añadieron diversos sustratos de quinasa potenciales, incluyendo histona H1, GST-retinoblastoma (pRb; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), o GST-p53 (Santa Cruz Biotechnology). La mezcla fue incubada después a aproximadamente 37°C durante aproximadamente 30 minutos, después de lo cual se añadió tampón de muestra SDS-PAGE 2x normalizado. Las muestras fueron calentadas a aproximadamente 95°C durante aproximadamente 3 minutos, se hicieron correr sobre SDS-PAGE, y se expusieron a la película durante 2 horas. Los resultados se pueden observar en la Figura 15, Panel B. Como resulta evidente, el complejo de ciclina E2-cdk2 puede fosforilar el GST-Rb y la histona H1, pero no GST-p53.

7. Expresión Específica de Tejidos de Ciclina E2

Se utilizó el análisis de transferencia Northern para identificar aquellos tejidos en los cuales es expresada la ciclina E2. Se adquirió una transferencia Northern conteniendo aproximadamente 2 microgramos de ARN poli A+ de diversos tejidos (Clontech, Palo Alto, CA) y se sondeó o bien con un fragmento de ADNc de ciclina E2 humana de aproximadamente 320 pb que abarcaba una región 5' con respecto a la caja de ciclina, un fragmento de ciclina E1 de 310 pares de bases que abarcaba los aminoácidos 272-377 de la ciclina E1 humana, o bien una sonda de GADPH (gliceraldehído-fosfo-deshidrogenasa) humana de aproximadamente 550 pb que codificaba una porción del gen GADPH humano. Las sondas fueron marcadas utilizando el estuche RediPrimer® (Amersham, Arlington Heights, IL), y la actividad final de las sondas marcadas era de aproximadamente 1 x 10(9) cpm por microgramo. Las transferencias fueron prehibridadas durante la noche a aproximadamente 42°C en una solución de hibridación que contenía 2 x Denhardt, SDS al 0,5 por ciento, formamida al 50 por ciento, 0,1 mg por picogramo de ADN de esperma de salmón, y 5 x SSC. La actividad específica de la sonda en esta solución era de aproximadamente 2 x 10(6) cpm. Tras la hibridación, las transferencias fueron lavadas tres veces en 2 x SSC conteniendo SDS al 0,1 por ciento a la temperatura ambiente, dos veces en 2 x SSC conteniendo SDS al 0,1 por ciento a 50°C y una vez en 0,1 x SSC conteniendo SDS al 0,5 por ciento a 50°C. Las películas fueron expuestas a aproximadamente -70°C durante dos días. Los autorradiogramas resultantes fueron escaneados en un ordenador, y los datos fueron convertidos en un diagrama de barras para cuantificar las cantidades relativas de ARN detectado por cada sonda.

Los resultados se muestran en la Figura 12, y los tejidos humanos analizados se indican en el eje de las x. Como se puede observar, el tejido de testículos tenía el máximo nivel de ARN tanto de ciclina E2 como de ciclina E1. El ARN de ciclina E1 estaba presente en los linfocitos de sangre periférica ("PBL"), pero el ARN de ciclina E2 no. El ARN de ciclina E2 estaba presente en bazo y timo, pero el ARN de ciclina E1 no.

Para evaluar los niveles de ARN de ciclina E2 en tejidos tumorales, se evaluaron diversas líneas celulares de cáncer de mama, junto con líneas celulares de tejido de mama inmortalizado normal. Las líneas celulares son asequibles de la American Type Culture Collection.

Las células NMEC, 184A1 y MCF10 fueron cultivadas en medio DME/F12 modificado (Gibco/BRL, Grand Island, NY) suplementado con Hepes 10 mM, glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, etanolamina 0,5 mM, 5 microgramos/ml de transferrina, 1 mg/ml de seralbúmina bovina, 5,0 ng/ml de selenita de sodio, 20 ng/ml de triyodotironina, 10 ng/ml de EGF, 5 microgramos/ml de insulina, y 0,5 microgramos/ml de hidrocortisona. Asimismo se añadió extracto de pituitaria bovina (30 microgramos/ml) al medio para las líneas celulares NMEC. Las líneas celulares de cáncer de mama ER+ y ER- (positiva y negativa para el receptor de estrógeno) fueron cultivadas en medio esencial mínimo mejorado de Richter (Gibco/BRL, Grand Island, NY) suplementado con Hepes 10 mM, glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 0,1 mM, suero bovino fetal al 10 por ciento, y 1 microgramo/ml de insulina. Todas las células fueron rastreadas rutinariamente en cuanto a la contaminación de micoplasma, y fueron mantenidas a 37°C en una atmósfera de aproximadamente el 6,5 por ciento de dióxido de carbono.

El ARN total fue preparado a partir de cada línea celular sometiendo a lisis las monocapas celulares en isotiocianato de guanidinio y centrifugando sobre un colchón de cloruro de cesio como describen Gudas y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:4705-4709 [1988]). Se sometieron a electroforesis aproximadamente 20 microgramos de ARN sobre geles de formaldehído desnaturalizante, se transfirieron a membranas Magna NT (Micron Separations Inc., Westboro, MA), y se entrecruzaron con radiación UV. Las sondas para el análisis de transferencia Northern incluían el ADNc de ciclina E1 completo, y un fragmento de ciclina E2 de aproximadamente 330 pb (como se ha descrito antes). Las sondas fueron marcadas con 32P-dCTP a una actividad específica de aproximadamente 1 x 10(9) cpm/microgramo de ADN utilizando un estuche de marcaje cebado al azar (Boehringer-Mannheim, Indianápolis, IN). La transferencia fue hibridada en una solución que contenía formamida al 50 por ciento, SDS al 0,2 por ciento, 6 x SSPE, 2 x Denhardt y 100 ng/ml de ADN de esperma de salmón. La hibridación fue conducida a aproximadamente 41°C durante aproximadamente 24 horas, después de lo cual la transferencia fue lavada una vez en 2 x SSC conteniendo SDS al 0,5 por ciento a la temperatura ambiente; una vez en 0,5 x SSC conteniendo SDS al 0,5 por ciento a la temperatura ambiente; una vez en 0,2 x SSC conteniendo SDS al 0,5 por ciento a la temperatura ambiente; y tres veces en 0,5 x SSC conteniendo SDS al 0,5 por ciento a aproximadamente 59°C.

Los resultados del análisis Northern se muestran en la Fig. 13. Como se puede observar, el ARN de ciclina E2 está presente en algunas líneas celulares ER+ y ER-, pero apenas es detectable en células normales. El ARN de ciclina E1 está presente en menos líneas celulares de cáncer de mama en comparación con la ciclina E2.

<110> AMGEN INC.

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<120> Genes y Proteínas de la Ciclina E Novedosos

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<130> A-524

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<140> 09/092,770

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<141> 1998-06-05

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<160> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 1215

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<212> ADN

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<213> Humano

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<400>

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<400> 1

4

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<210> 2

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<211> 1212

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<212> ADN

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<213> Ratón

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<400> 2

5

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<210> 3

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 404

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 3

6

7

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 403

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ratón

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

8

9

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1080

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 359

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humana

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1214

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400>

12

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1215

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Humano

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

13

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gaagagaatg tcaagacgaa gaagcc

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 10

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcttaaatca ggcaaaggtg aaggat

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccatcctaat acgactcact atagggc

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagttctacc caatcttggt gaat

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atttaagctg ggcatgttca cagga

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> constructo sintético

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtcttcagct tcactggact cacatc

\hfill

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Gln Leu Ser Pro Val Cys Asn Gly Gly Ile Met Thr Pro}

\sac{Pro Lys Ser Thr Glu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> humana

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Lys Gln Gln Pro Gln Pro Ser Gln Thr Glu Ser Pro Gln}

\sac{Glu Ala Gln Ile Ile Gln Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1212

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ARN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

15

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1212

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Ratón

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

16

Claims

1. Una molécula de ácido nucleico de ciclina E2 biológicamente activa aislada que codifica un polipéptido seleccionado del grupo formado por:

(a) la molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NUM: 1;

(b) la molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NUM: 2;

(c) la molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NUM: 5;

(d) la molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NUM: 7;

(e) la molécula de ácido nucleico que comprende la SEC ID NUM: 8;

(f) una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEC ID NUM: 3, o un fragmento biológicamente activo de dicho polipéptido;

(g) una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEC ID NUM: 4, o un fragmento biológicamente activo de dicho polipéptido;

(h) una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido de la SEC ID NUM: 6, o un fragmento biológicamente activo de dicho polipéptido;

(i) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es idéntico al menos en un 70 por ciento al polipéptido codificado por la SEC ID NUM: 1;

(j) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es idéntico al menos en un 70 por ciento al polipéptido codificado por la SEC ID NUM: 5;

(k) una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que es idéntico al menos en un 70 por ciento al polipéptido codificado por la SEC ID NUM: 2.

2. Una molécula de ácido nucleico aislada que es el complemento de la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

3. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende la SEC ID NUM: 1, la SEC ID NUM: 2, la SEC ID NUM: 5, la SEC ID NUM: 7, o la SEC ID NUM: 8.

4. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica el polinucleótido de la SEC ID NUM: 3, la SEC ID NUM: 4, o la SEC ID NUM: 6.

5. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

6. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 2.

7. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 3.

8. Un vector que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 4.

9. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 5.

10. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 6.

11. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 7.

12. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 8.

13. Un procedimiento para producir un polipéptido de ciclina E2 que comprende las etapas de:

(a) expresar un polipéptido codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 1 en un huésped adecuado; y

(b) aislar el polipéptido.

14. El procedimiento de la reivindicación 13, donde el polipéptido es la SEC ID NUM: 3, la SEC ID NUM: 4, o la SEC ID NUM: 6.

15. Un polipéptido de ciclina E2 seleccionado del grupo formado por:

(a) el polipéptido de la SEC ID NUM: 3;

(b) el polipéptido de la SEC ID NUM: 4;

(c) el polipéptido de la SEC ID NUM: 6; y

(d) el polipéptido que es idéntico al menos en un 70 por ciento a cualquiera de los polipéptidos (a) a (c).

16. El polipéptido de ciclina E2 de la reivindicación 15 que no posee una metionina amino terminal.

17. Un método in vitro para incrementar la proliferación de una célula, que comprende expresar un ácido nucleico que codifica la ciclina E2 de la reivindicación 1 o un fragmento biológicamente activo de la misma en la célula.

18. Un método in vitro para incrementar la división celular de la célula, que comprende expresar un gen de la ciclina E2 de la reivindicación 1, o un fragmento biológicamente activo de la misma en la célula.

19. Un método in vitro para disminuir la división celular en la célula, que comprende expresar un mutante de ciclina E2 del gen de la ciclina E2 de la reivindicación 1 en la célula, donde el mutante no tiene actividad biológica de ciclina E2.

20. El uso de un ácido nucleico aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, un vector según cualquiera de las reivindicaciones 5-8, una célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 9-12 o un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 15-16 para preparar un medicamento para incrementar la proliferación celular y/o incrementar la división celular.

21. El uso de un mutante de ciclina E2 del gen de ciclina E2 de la reivindicación 1, que no tiene actividad biológica de la ciclina E2 o de un ácido nucleico que lo codifica para preparar un medicamento para disminuir la división celular, donde dicho mutante es adecuado para su expresión en una célula.

22. Una composición farmacéutica que comprende un ácido nucleico aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, un vector según cualquiera de las reivindicaciones 5-8, una célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 9-12 o un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 15-16.