ES2242196T3 - Vectores adenovirales que comprenden un "elemento respuesta". - Google Patents

Abstract

SE PROPORCIONAN VEHICULOS DE ADENOVIRUS ESPECIFICOS DE CELULAS HUESPED PARA LA TRANSFECCION DE CELULAS HUESPED DIANA. AL PROPORCIONAR UNA REGULACION DE INICIO DE LA TRANSCRIPCION DEPENDIENTE DE FACTORES DE TRANSCRIPCION QUE SON UNICAMENTE ACTIVOS EN TIPOS CELULARES ESPECIFICOS LIMITADOS, LA REPLICACION VIRAL QUEDARA RESTRINGIDA A LAS CELULAS DIANA. LOS ADENOVIRUS MODIFICADOS PUEDEN SER UTILIZADOS COMO UN VEHICULO PARA LA INTRODUCCION DE UNA NUEVA CAPACITACION GENETICA, EN PARTICULAR ASOCIADA CON CITOTOXICIDAD PARA EL TRATAMIENTO DE NEOPLASIA.

Description

Vectores adenovirales que comprenden un "elemento respuesta" al antígeno específico de la próstata (PSA).

Introducción Campo técnico

El campo de esta invención es la transfección celular.

Antecedentes

La capacidad para cambiar el genotipo y el fenotipo de las células in vitro e in vivo tiene muchas aplicaciones. Para el estudio de los procesos fisiológicos, particularmente con células dedicadas, hay un interés sustancial en poder modificar el fenotipo para afectar a un proceso particular. Incrementando o deprimiendo la cantidad de un miembro de la ruta fisiológica, inhibiendo la actividad de un miembro de la ruta, proporcionando un alelo o un análogo mutado del miembro que existe de forma natural, se puede desvelar la función de los diferentes miembros de la ruta, el orden en el cual participan los miembros, la presencia de rutas alternativas y similares. Pueden utilizarse también las células para producir proteínas.

Los adenovirus no requieren la proliferación celular para una transducción eficaz de las células. Los adenovirus modificados por la introducción de un transgén proporcionan la expresión transitoria de proteínas. Los adenovirus pueden convertirse en incompetentes mediante la inactivación de uno o más genes esenciales y posteriormente ser empaquetados en una línea celular cooperadora para ser utilizados en la transfección. De este modo, los adenovirus proporcionan un vehículo práctico para modificar rasgos celulares o para destruir células, según sea apropiado.

Para muchas aplicaciones médicas, existe un interés en poder modificar específicamente las células diana in vivo o ex vivo. La modificación puede estar asociada con la integración aleatoria de ADN, mediante la cual se introduce una capacidad genética que complementa un defecto genético intracelularmente, proporciona la secreción de un producto a partir de las células modificadas, que es de otro modo producido indetectablemente o no producido por el huésped, proporciona una protección frente a la enfermedad, particularmente frente a una enfermedad vírica, y similares. En muchas situaciones, para que sea eficaz, debe tenerse una eficacia elevada de transfección de las células diana. Esto es particularmente cierto para la modificación in vivo. Además, se desearía tener una alta especificidad por las células diana, en comparación con las demás células que puedan estar presentes ex vivo o in vivo.

La terapia génica implica la transferencia de genes clonados a células diana. Se han desarrollado una gran variedad de vehículos víricos y no víricos para transferir estos genes. De los virus, se han utilizado para transferencia génica retrovirus, virus herpes, virus adenoasociados, virus Sindbis, poxvirus y adenovirus. Estos vehículos tienen todos propiedades diferentes. Por ejemplo, los retrovirus transmiten genes in vitro con una alta eficacia integrando el gen transducido en el cromosoma después de la división de las células infectadas. Los virus adenoasociados pueden integrarse de manera estable, y expresan los genes transducidos, en células en división y en células quiescentes. En contraste, los liposomas y los adenovirus permiten solamente la expresión transitoria del gen, y transducen células diana en división y quiescentes.

De los virus, los adenovirus están entre los producidos y purificados más fácilmente, mientras que los retrovirus son inestables, difíciles de producir e imposibles de purificar. Ambas clases de virus transducen células con una alta eficacia. Los liposomas mantienen la promesa de permitir dosis repetidas de genes ya que, a diferencia de los virus, no son inmunogenéticos. Sin embargo, los liposomas acomplejados con ADN son difíciles de producir en cantidades comerciales y son vehículos ineficaces para la transferencia de genes, transduciendo muy a menudo menos de un uno por ciento de células diana.

Existen dos divisiones principales de los protocolos de terapia génica: in vivo y ex vivo. In vivo se refiere a la administración del agente terapéutico directamente al paciente, normalmente por inhalación o inyección, aunque en algunos casos se ha sugerido la administración oral. La terapia génica ex vivo se refiere al proceso de extraer células de un paciente, por ejemplo en una biopsia, colocar las células en cultivo de tejidos, transferir genes a las células en cultivo de tejidos, caracterizar las células recién manipuladas genéticamente y, finalmente, retornar las células al paciente mediante infusión intravenosa. Terapéuticamente, los retrovirus son utilizados muy a menudo para la transferencia ex vivo, mientras que adenovirus y liposomas son utilizados muy a menudo para la transferencia génica in vivo.

En el tratamiento del cáncer mediante adenovirus defectuosos para la replicación, la respuesta inmune del huésped limita la duración de las dosis repetidas del agente terapéutico a dos niveles. En primer lugar, el propio vehículo de administración adenovírico es inmunogénico. En segundo lugar, genes tardíos del virus son expresados frecuentemente en las células transducidas, induciendo inmunidad celular. Por tanto, la capacidad para administrar repetidamente citoquinas, genes supresores de tumores, ribozimas o genes suicidas está limitada por la naturaleza transitoria de la expresión génica y por la inmunogenicidad del vehículo para la transferencia de los genes y de los productos génicos víricos del vehículo para la transferencia.

El primer caso, la inmunogenicidad del vector, es similar al problema con el que se enfrentan los anticuerpos monoclonales de ratón que forman complejos con toxinas bacterianas que están dirigidos contra antígenos específicos de un tumor. La utilización de estas proteínas como agente terapéutico, popular hace una década, fracasó debido a las elevadas dosis requeridas y finalmente a la inmunogenicidad. Los adenovirus defectuosos para la replicación pueden correr la misma suerte, a no ser que la eficacia pueda ser mejorada para conseguir puntos finales terapéuticos clínicamente útiles antes de que la inmunogenicidad de un vehículo de transferencia limite su utilización
repetida.

En el segundo caso, se han tomado medidas para eliminar la transcripción y la expresión no deseadas de genes tardíos del adenovirus en las células transducidas, con la inmunogenicidad resultante.

Existe por tanto un interés sustancial en poder desarrollar vectores víricos que reduzcan sustancialmente las actuales limitaciones y restricciones sobre la utilización de tales vectores in vivo.

Literatura relevante

Graham y Van der Eb (1973) Virology 52:456-467; Takiff y col. (1981) Lancet ii:832-834; Berkner y Sharp (1983) Nucleic Acid Research 11:6003-6020; Graham (1984) EMBO J. 3:2917-2922; Bett y col. (1993) J. Virology 67:5911-5921 y Bett y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:8802-8806 describen adenovirus que han sido modificados genéticamente con el fin de producir vehículos para la transferencia de genes defectuosos en replicación. En estos vehículos, los productos génicos tempranos del adenovirus E1A y E1B son eliminados y proporcionados in trans por la línea celular de empaquetamiento 293 desarrollada por Frank Graham (Graham y col. (1987) J. Gen. Virol. 36:59-72 y Graham (1977) J. Genetic Virology 68:937-940). El gen que va a ser transducido es insertado comúnmente en el adenovirus en la región de los E1A y E1B eliminados del genoma del virus, Bett y col. (1994), supra. Vectores adenovíricos como vehículos para la transducción eficaz de genes han sido descritos por Stratford-Perricaudet (1990) Human Gene Therapy 1:241-256; Rosenfeld (1991) Science 252:431-434; Wang y col. (1991) Adv. Exp. Med. Biol. 309:61-66; Jaffe y col. (1992) Nat. Gent. 1:372-378; Quantin y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:2581-2584; Rosenfeld y col. (1992) Cell 68:143-155; Stratford-Perricaudet y col. (1992) J. Clin. Invest. 90:626-630; Le Gal Le Salle y col. (1993) Science 259:988-990; Mastrangeli y col. (1993) J. Clin. Invest. 91:225-234; Ragot y col. (1993) Nature 361:647-650; Hayaski y col. (1994) J. Biol. Chem. 269:23872-23875.

Resumen de la invención

Se proporcionan vectores adenovíricos y métodos para su utilización como vehículos para la transducción de tipos celulares restringidos. Específicamente, se proporciona un vector adenovírico competente para la replicación con el fin de introducir efectos citotóxicos en una célula diana que contiene un gen del adenovirus, esencial para la propagación del adenovirus, bajo el control transcripcional de un elemento de respuesta del antígeno prostático específico (PSA), en el que el elemento de respuesta del antígeno prostático específico (PSA) contiene un promotor del antígeno prostático específico (PSA) seleccionado del grupo que consta de los nucleótidos -540 a +8, -532 a + 11 y -230 a +7, con relación al sitio de inicio de la transcripción, del gen del antígeno prostático específico en combinación con un intensificador del antígeno prostático específico (PSA) seleccionado del grupo que consta de los nucleótidos -5322 a -3739, -5322 a -3875 y -5322 a -4023, con relación al sitio de inicio de la transcripción, del gen del antígeno prostático específico, donde dicha célula diana expresa el antígeno prostático específico (PSA). En el caso de vectores adenovíricos competentes para la replicación, uno o más de los promotores de los genes tempranos y/o tardíos esenciales para la propagación es sustituido por un elemento de respuesta del antígeno prostático específico que es transcripcionalmente activo solamente en células prostáticas, en las que puede estar presente también un transgén bajo un promotor específico de la célula.

La invención proporciona también una célula transformada con un vector adenovírico de la invención.

La invención proporciona además un método in vitro para propagar un adenovirus específico para células de mamífero que expresen el antígeno prostático específico, comprendiendo dicho método:

la combinación de un vector adenovírico de la invención con células de mamífero que expresen el antígeno prostático específico,

mediante lo cual se propaga dicho adenovirus.

La invención proporciona además un método in vitro para conferir citotoxicidad selectiva a una célula tumoral que exprese el antígeno prostático específico (PSA), comprendiendo dicho método la introducción de un vector adenovírico de la invención en una célula tumoral que exprese el antígeno prostático específico (PSA), en la que la introducción del vector adenovírico tiene como resultado citotoxicidad.

La invención proporciona también la utilización de un vector de la invención para la fabricación de un medicamento para tratar neoplasias que impliquen células tumorales que expresen el antígeno prostático específico (PSA).

Los vectores adenovíricos de la invención son útiles para el tratamiento de varias indicaciones y para producir huéspedes mamíferos que sean transitoriamente transgénicos, y para permitir la propagación regulada de adenovirus y opcionalmente la expresión de transgenes, en paralelo con la regulación celular de la región de inicio de la transcripción endógena. En el caso de tal adenovirus que es competente transcripcionalmente en las células diana, el adenovirus es utilizado para destruir las células, mientras que produce opcionalmente una o más proteínas de interés.

Descripción de las realizaciones específicas

Se proporcionan vehículos adenovíricos competentes para la replicación. Los virus contienen al menos un gen esencial para la propagación bajo el control transcripcional de un elemento de respuesta del antígeno prostático específico que está regulado específicamente por las células de la próstata. Los genes que son regulados por el elemento de respuesta del antígeno prostático específico pueden ser genes tempranos o tardíos del adenovirus y opcionalmente un transgén. Proporcionando una transcripción regulada restringida a células diana del huésped específicas, pueden proporcionarse adenovirus que pueden ser utilizados como vehículos para introducir una capacidad genética en las células diana del huésped, a diferencia de los demás tipos celulares del huésped. Los transgenes sirven para modificar el genotipo o el fenotipo de la célula diana, además de cualquier modificación del genotipo o el fenotipo resultante de la presencia del adenovirus. Con los adenovirus competentes para la replicación de la invención, se utiliza la proliferación del adenovirus por su efecto citotóxico.

Existen varios tipos diferentes de adenovirus, tales como Ad2, Ad5 y Ad40, que pueden diferir en pequeño grado o en un grado significativo. Particularmente, Ad5 y Ad40 difieren en cuanto a su tropismo por la célula huésped, así como en la naturaleza de la enfermedad inducida por el virus. Para los fines de la presente invención, se pondrá como ejemplo Ad5.

Los genes del adenovirus que son de interés para la presente invención pueden ser divididos en dos grupos, los genes tempranos y los genes tardíos, estando controlada la expresión de estos últimos por el promotor tardío principal. Entre los genes tempranos, están E1A, E1B, E2, E3 y E4. El gen E1A es expresado inmediatamente después de la infección por el virus (0-2 horas) y antes que cualquier otro gen vírico. La proteína E1A actúa como un factor regulador de la transcripción que actúa positivamente en trans, y es requerida para la expresión de los demás genes tempranos del virus y de los genes tardíos principales proximales al promotor. A pesar de la nomenclatura, los genes proximales al promotor dirigidos por el promotor tardío principal se expresan a tiempos tempranos después de la infección por Ad5. En ausencia de un gen E1A funcional, no continúa la infección vírica, ya que no se producen los productos génicos necesarios para la replicación del ADN del virus.

La proteína E1B funciona en trans y es necesaria para el transporte del ARNm tardío desde el núcleo hacia el citoplasma. Defectos en la expresión de E1B tienen como resultado una pobre expresión de las proteínas tardías del virus y la incapacidad para parar la síntesis de proteínas de la célula huésped.

El gen E4 tiene varios productos de transcripción. Los marcos de lectura abiertos (ORF) 3 y ORF 6 de la unidad de transcripción de E4 incrementan la acumulación de ARNms de la unidad de transcripción tardía principal por unión a la proteína de 55 kDa procedente de E1B y a los heterodímeros de E2F-1 y DP-1. En ausencia de proteína funcional procedente de ORF3 y ORF6, se producen placas con una eficacia menor de 10^{-6} de la del virus de tipo salvaje.

Los genes tardíos principales relevantes para la presente invención son genes tales como L1, L2 y L3, que codifican proteínas del virión del virus AD5.

Las regiones del adenovirus que pueden ser eliminadas, normalmente al menos 500 nt, más habitualmente al menos 1 knt aproximadamente, incluyen en el genoma de AD5 los nucleótidos 300 a 3600 en E1, particularmente 342 a 3523; 27000 a 31000, particularmente 28133 a 30818 ó 27865 a 30995 en E3. La deleción será al menos suficiente para la inserción de la construcción deseada y permitirá el empaquetamiento.

Los presentes vectores pueden ser utilizados para una amplia variedad de fines. El fin variará con la célula diana. Las células diana adecuadas expresan el antígeno prostático específico (PSA) y se caracterizan por la activación transcripcional del elemento de respuesta transcripcional del antígeno prostático específico (PSA) en el vehículo adenovírico. La región de inicio de la transcripción será activada normalmente en menos de un 5% aproximadamente, más habitualmente en menos de un 1% aproximadamente y deseablemente en menos de un 0,1% aproximadamente de las células del huésped.

La regulación de la activación transcripcional es el resultado de la interacción entre activadores transcripcionales unidos a elementos reguladores cis, factores unidos a elementos transcripcionales basales y la actividad de los mediadores transcripcionales, o coactivadores. La ausencia o presencia de cualquiera de estos factores puede afectar al nivel de transcripción. Adicionalmente, pueden estar presentes factores en una forma inactiva, cuando los factores son activados mediante modificación química, particularmente como resultado de un mecanismo de señalización celular. En algunos casos, las moléculas de señalización son capaces de actuar directamente para activar la transcripción. Cualquiera de estos mecanismos puede operar limitando los tipos de células en los que es activa la región de inicio de la transcripción del vehículo.

Una persona experta en la técnica comprenderá que pueden estar presentes niveles basales de transcripción muy bajos en los tipos celulares que no son diana. Por el término activación transcripcional, se indica que la transcripción estará incrementada por encima de los niveles basales en la célula diana al menos 100 veces aproximadamente, más habitualmente al menos 1000 veces aproximadamente.

El elemento de respuesta específico de la célula es utilizado con un gen del adenovirus que sea esencial para la propagación, de tal manera que la competencia para la replicación sea alcanzable solamente en la célula diana. El vector puede contener adicionalmente un transgén para cambiar el fenotipo de la célula diana. Por transgén se quiere indicar cualquier gen que no esté presente en el adenovirus de tipo salvaje, frecuentemente el transgén no será tampoco expresado en la célula diana antes de su introducción por el adenovirus.

Según se ejemplifica por el empleo de un elemento de respuesta específico de una célula que comprende una construcción con un promotor y un intensificador específica para células prostáticas, pueden introducirse varias capacidades genéticas en células prostáticas que expresen el antígeno prostático específico. Es de particular interés la oportunidad de introducir efectos citotóxicos que sean controlados por una región de inicio de la transcripción activa específicamente en células prostáticas. Otros tipos celulares que tienen factores de transcripción activos específicos asociados con un estado para el que es deseable una modulación incluyen leucocitos, particularmente linfocitos, células epiteliales, células endoteliales, células hepáticas, células pancreáticas, células neuronales y queratinocitos. Como el adenovirus tiene como resultado la expresión transitoria (de 6 a 8 semanas aproximadamente), puede proporcionarse a las células una capacidad transitoria en los casos en los que el resultado deseado requiera solamente un periodo limitado de respuesta.

Los fines de la introducción de una expresión transitoria incluyen indicaciones que pueden ser tratadas y que implican una proliferación no deseada distinta de la tumoral, tales como las lesiones psoriáticas, restenosis, cicatrización de heridas, reparación tisular, respuesta inmune incrementada, resistencia a la infección, producción de factores, proliferación incrementada, la investigación de rutas metabólicas o de otras rutas fisiológicas, la comparación de la actividad de células en presencia y ausencia del transgén introducido por el adenovirus, mediante la comparación de la actividad de la célula antes, durante y después de la modificación con el adenovirus, etc. Los presentes vectores pueden ser utilizados para liberar una mezcla de células de un grupo particular de células, en los casos en los que el grupo de células son las células diana. Teniendo un adenovirus que sea competente para la propagación selectivamente en las células diana, solamente esas células serán destruidas después de la proliferación del adenovirus. Combinando el adenovirus con la mezcla de células, por ejemplo en cultivo o in vivo, el adenovirus será capaz de proliferar solamente en las células diana. De esta forma células distintas de las células diana no serán afectadas por el adenovirus, mientras que las células diana serán destruidas. La expansión del adenovirus debida a la propagación en las células diana asegurará que la mezcla sea sustancialmente liberada de células diana. Una vez que las células diana han sido destruidas, el adenovirus no será ya capaz de propagarse, pero en cultivo puede ser retenido con el fin de monitorizar continuamente la mezcla para determinar una recurrencia de la célula diana, por ejemplo una célula mutada o una célula neoplásica.

Mediante la identificación de los genes que son expresados específicamente por las células huésped diana, sobre la base de la naturaleza de las células, de su nivel de madurez o de su condición, puede utilizarse el elemento de respuesta específico de las células diana para proporcionar una capacidad genética a tales células, donde la capacidad genética estará ausente en otras células, incluso cuando sean transfectadas con el vehículo adenovirus.

La región que se emplea para proporcionar especificidad celular dependiente de andrógenos, particularmente en células de la próstata, implica una región intensificadora de 1,5 kb aproximadamente y una región promotora de 0,5 kb. La región intensificadora en humanos está localizada entre el nt -5322 y el nt -3739, con relación al sitio de inicio de la transcripción del gen del antígeno prostático específico (PSA). El promotor consta del nt -540 al nt +8. La yuxtaposición de los dos elementos genéticos produce un promotor intensificador específico de la próstata (PSE) mínimo, totalmente funcional. El intensificador contiene tres regiones que se unen a proteínas de unión a ADN específicas de la próstata, una de las cuales contiene un supuesto elemento de respuesta a andrógenos. La región promotora contiene las secuencias típicas TATA y CAAT así como un segundo supuesto elemento de respuesta a andrógenos.

Los vectores son preparados convenientemente empleando dos plásmidos, un plásmido proporciona la región izquierda del adenovirus y el otro plásmido proporciona la región derecha, donde los dos plásmidos comparten al menos 500 nt de la región central para recombinación homóloga. De esta forma, cada plásmido, según se desee, puede ser manipulado independientemente, seguido por cotransfección en un huésped competente, que proporciona genes complementarios cuando sea apropiado, o los factores de transcripción apropiados para el inicio de la transcripción a partir del PSE para la propagación del adenovirus.

Para facilitar el trabajo, están disponibles plásmidos que proporcionan las porciones necesarias del adenovirus. El plásmido pXC.1 (McKinnon (1982) Gene 19:33-42) contiene el extremo izquierdo de tipo salvaje de Ad5. El pBHG10 proporciona el extremo derecho de Ad5, con una deleción en E3. La deleción en E3 proporciona espacio en el virus para insertar el PSE mínimo de 2 kb sin eliminar el intensificador-promotor de tipo salvaje. El gen para E3 está situado en la hebra opuesta de E4 (hebra-r).

Para la manipulación de los genes tempranos, el sitio de inicio de la transcripción de E1A de Ad5 está en el nt 560 y el sitio de inicio ATG de la proteína E1A está en el nt 610 del genoma del virus. Esta región puede ser utilizada para insertar el elemento específico de la célula, por ejemplo PSE. Oportunamente, puede introducirse un sitio de restricción empleando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), en la que el cebador que se emplee puede estar limitado al genoma de Ad5 o puede implicar una porción del plásmido que lleve el ADN genómico de Ad5. Por ejemplo, cuando el esqueleto es pBR322, los cebadores pueden utilizar el sitio de EcoRI en el esqueleto de pBR322 y el sitio de XpaI en el nt 1339 de Ad5. Llevando a cabo la PCR en dos etapas, en las que cebadores solapantes en el centro de la región introducen un cambio de secuencia que tiene como resultado un único sitio de restricción, puede asegurarse la inserción del elemento de respuesta específico de la célula en ese sitio.

Puede utilizarse también una estrategia similar para la inserción del elemento de respuesta específico de la célula con el fin de regular E1B. El promotor de E1B de Ad5 consta de un único sitio de reconocimiento de alta afinidad para Sp1 y una secuencia TATA. Esta región se extiende desde el nt 1636 hasta el nt 1701. Mediante la inserción del elemento de respuesta específico de la célula en esta región, puede asegurarse la transcripción del gen E1B específica de la célula. Empleando la región izquierda modificada con el elemento de respuesta específico de la célula que regula E1A como molde para introducir el elemento de respuesta específico de la célula para regular E1B, el adenovirus resultante dependerá de los factores de transcripción específicos de la célula para la expresión de E1A y E1B.

Para E4 debe utilizarse la porción derecha del genoma del adenovirus. El sitio de inicio de la transcripción de E4 está predominantemente en el nt 35605, la secuencia TATA en el nt 35631 y el primer AUG/CUG de ORF1 está en el nt 35532 (Virtanen y col. (1984) J. Virol. 51:822-831). Utilizando cualquiera de las estrategias anteriores para los demás genes, el elemento de respuesta específico de la célula puede ser introducido en la región entre el sitio de inicio de la transcripción y el codón de inicio. Una vez más, mediante el empleo de un genoma adenovírico previamente manipulado, pueden proporcionarse una pluralidad de genes que son dependientes del factor de transcripción específico de la célula diana, asegurando que el adenovirus será incapaz de replicarse en células que carezcan de estos factores de transcripción.

La utilización de un adenovirus competente, que es competente en células diana particulares, permite la proliferación del adenovirus en las células diana, teniendo como resultado la muerte de las células huésped y la propagación del adenovirus a otras células huésped. Con el fin de asegurar adicionalmente la citotoxicidad, pueden estar presentes uno o más transgenes que tengan efecto citotóxico. De esta forma puede asegurarse con gran confianza que las células diana serán destruidas mientras se proporciona el nivel de expresión apropiado de los agentes citotóxicos.

La capacidad genética que puede ser introducida en el vehículo adenovírico incluye un factor capaz de iniciar la apoptosis, antisentido o ribozimas, que entre otras capacidades puede estar dirigido hacia ARNms que codifiquen proteínas esenciales para la proliferación, tales como proteínas estructurales, factores de transcripción, polimerasas, etc., proteínas patógenas del virus u otras proteínas patógenas, cuando el patógeno prolifera intracelularmente, proteínas citotóxicas, por ejemplo las cadenas a de la difteria, la ricina, la abrina, etc., genes que codifiquen una variante citoplásmica manipulada de una nucleasa (por ejemplo ARNasa A) o de una proteasa (por ejemplo, tripsina, papaína, proteinasa K, carboxipeptidasa, etc.), o que codifiquen el gen Fas, y similares. Otros genes de interés incluyen citoquinas, antígenos, proteínas transmembranales y similares, tales como IL-1, -2, -6, -12, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IFN-\alpha, -\beta, -\gamma, TNF-\alpha, -\beta, TGF-\alpha, -\beta, NGF y similares.

Otras oportunidades para modificación genética específica incluyen células T, tales como linfocitos infiltrantes de tumores (TILs), donde los TILs pueden ser modificados para incrementar la expansión, para incrementar la citotoxicidad, para reducir la respuesta a los inhibidores de la proliferación, para incrementar la expresión de linfoquinas, etc. Puede desearse también incrementar la vulnerabilidad de las células diana proporcionando la expresión de proteínas de membrana superficiales específicas, por ejemplo B7, mutantes del antígeno T de SV40, etc.

Los virus modificados pueden ser utilizados para la administración a la célula diana de una variedad de formas, dependiendo de si las células están en cultivo, ex vivo o in vivo. En el caso de la próstata, las células serán administradas principalmente in vivo. La administración puede ser realizada de una variedad de formas, empleando liposomas, inyección directa, catéteres, inhalación "intravenpis", aplicaciones tópicas, etc. Debido a la alta eficacia de transfección de adenovirus, puede conseguirse un nivel elevado de células modificadas. En el caso de neoplasia, donde se producen toxinas, las toxinas serán liberadas localmente para afectar a las células que puedan no haber sido transfectadas con éxito. De esta manera, pueden eliminarse específicamente las células neoplásicas sin un efecto significativo sobre las células normales. Además, la expresión de proteínas del adenovirus servirá para activar el sistema inmune contra las células diana. Finalmente, la proliferación del adenovirus en una célula huésped dará lugar a la muerte de la célula.

El adenovirus puede ser administrado en un vehículo fisiológicamente aceptable apropiado a una dosis de 10^{4} a 10^{11} aproximadamente. La multiplicidad de infección estará generalmente en el rango de 0,001 a 100 aproximadamente. Los virus pueden ser administrados una o más veces, dependiendo de la respuesta inmune potencial del huésped. Si es necesario, la respuesta inmune puede ser disminuida mediante la utilización de una variedad de inmunosupresores, para permitir una administración repetitiva, sin una respuesta inmune potente.

Los ejemplos siguientes se ofrecen a manera de ilustración y no a manera de limitación.

Parte experimental I. Adenovirus Defectuosos para la Replicación con Inserciones en \DeltaE1 y \DeltaE3

La región intensificadora PSE está localizada entre el nt -5322 y el nt -3739 con relación al sitio de inicio de la transcripción del gen del antígeno prostático específico. El promotor consta del nt -540 al nt +8. La yuxtaposición de estos dos elementos genéticos produce un PSE mínimo totalmente funcional.

El siguiente es un diagrama del PSE.

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Pueden construirse vectores lanzadera para la construcción de los vectores adenovíricos recombinantes que son defectuosos para la replicación mediante la eliminación de la mayor parte o de toda la región E1 del genoma del adenovirus y la inserción de sitios de restricción para la inserción de ADN foráneo. Uno de tales sistemas de vectores ha sido descrito por F. Graham y colaboradores (Graham (1984) EMBO J. 3:2917-2922; Graham (1987) J. Gen. Virol. 68:937-940; Graham y Smiley (1977) ibid 36:59-72 y Graham y Van der Eb (1973) Virology 52:456-467). En este sistema, los plásmidos \DeltaE1sp1A y \DeltaE1sp1B contienen la porción más a la izquierda del genoma de Ad5, excepto las secuencias eliminadas entre los nt 342 y 3523 de Ad5. En el lugar de la deleción hay un sitio de clonaje múltiple que está en orientación opuesta en los dos plásmidos. Una posición alternativa para la inserción de ADN foráneo está en la región de E3 de los plásmidos BHG10 y BGH11 (Bett (1994) PNAS 91:8802-8806) en un sitio de clonaje de PacI que sustituye a las secuencias 28133 a 30818 y 27865 a 30995 de E3 de Ad5, respectivamente. La eliminación de las secuencias de E1 y/o E3 proporciona espacio para la inserción del PSE acoplado a un gen informador o
efector.

A. PSE Dirigiendo la Expresión Génica en \DeltaE1

1. PSE-CAT en \DeltaE1. El PSE que dirige el gen informador CAT fue insertado en la deleción de E1 de \DeltaE1sp1A y \DeltaE1sp1B según sigue. El fragmento XbaI/BamHI de pCAT básico (Promega) que contiene las secuencias codificadoras del gen CAT seguidas por las secuencias señal de poliadenilación de SV40 fue ligado a \DeltaE1sp1A o \DeltaE1sp1B cortados de manera similar para dar CN83 y CN112, respectivamente. El sitio de HindIII entre el PSE y el promotor de PSA de CN65 (Schuur y col. (1996) J. Biol. Chem. 271:7043-7051) fue eliminado por digestión parcial con HindIII, seguido por el relleno de los extremos con Klenow y una nueva ligadura para generar CN84. El producto de PCR de PSE para la inserción en CN83 y CN112 fue preparado por amplificación de CN84 con los cebadores:

18.69.1, 5'-GCGCAAGCTTGGGCTGGG, [SEC ID Nº:01] que contiene un sitio de HindIII, y

18.69.2, 5'-GGAAGATCTAGAAATCTAGCTG, [SEC ID Nº:02] que contiene sitios de BglII y XbaI. Este fragmento de ADN fue cortado con BglII y HindIII, ligado posteriormente a CN83 y CN112 cortados de manera similar para generar los plásmidos CN99 y CN117, respectivamente. En CN99, la unidad de transcripción PSE-CAT está en la orientación de izquierda a derecha con relación a la hebra l de Ad5, mientras que en CN117 la unidad PSE-CAT está en la orientación de derecha a izquierda. Los virus derivados por recombinación homóloga fueron denominados CN710 (plásmidos CN117 y BHG11) y CN714 (plásmidos CN99 y BHG10 {McKinnon y col. (1982) Gene 19:33-42}).

2. PSE-\beta-galactosidasa en \DeltaE1. Se construyeron también plásmidos víricos en los que la unidad de transcripción PSE-\beta-galactosidasa estaba insertada en la deleción de E1 de \DeltaE1sp1A y \DeltaE1sp1B, utilizando una estrategia similar a la utilizada para construir los plásmidos víricos PSE-CAT. El fragmento de XbaI de pCMVbeta (Clontech) que contenía el gen de la \beta-galactosidasa flanqueado por el intrón t pequeño de SV40 en el extremo 5' y las secuencias señal de poliadenilación de SV40 en el extremo 3', fue insertado en los plásmidos \DeltaE1sp1A y sp1B costados con XbaI para construir CN85 y CN86, respectivamente. El PSE fue amplificado a partir de CN84 según se describió para los plásmidos PSE-CAT y ligado en CN85 y CN86 cortados con BglII/HindIII para construir CN93 y CN138, respectivamente. En CN93, la unidad de transcripción PSE-\beta-galactosidasa está en la orientación de izquierda a derecha con relación a la hebra l de Ad5, mientras que en CN138 la unidad PSE-\beta-galactosidasa está en orientación derecha a izquierda. Los virus derivados por recombinación homóloga fueron CN715 (de los plásmidos CN138 y BHG10), CN700 (de los plásmidos CN92 y BHG10), CN701 (de los plásmidos CN93 y BHG10) y CN709 (de los plásmidos CN116 y BHG11).

3. PSE-gen de la toxina A de difteria en \DeltaE1. Las inserciones del gen informador representaban sistemas de ensayo para la inserción de genes terapéuticos en E1 bajo el control del PSE. El plásmido pCAT básico (Promega) fue cortado con BamHI, posteriormente se llevó a cabo una digestión parcial con XhoII con el fin de cortar las secuencias de poliadenilación de SV40 del resto del ADN plasmídico. El fragmento de SV40 de 800 pares de bases fue aislado y clonado en el sitio de BamHI de Bluescript KSII+ con el extremo de XhoII muy próximo al sitio de EcoRI en el poliadaptador de Bluescript. Este clon fue denominado CN10. Las secuencias de la cadena A del gen de la toxina de la difteria fueron insertadas en la región de E1 bajo el control del PSE según sigue. Las secuencias de la cadena A del gen de la toxina diftérica fueron amplificadas por PCR con cebadores que contenían los sitios de restricción y las secuencias para el control de la traducción requeridos:

7.18.1, 5'-GAATTCCTGCAGTCTAGACATATGGGCGCCGAT, [SEC ID Nº:03] que contiene sitios para EcoRI y PstI y un codón de inicio.

7.18.2, 5'-ATTGAATTCCTGCAGTTATGCGGTGACACGATTTCCTG, [SEC ID Nº:04] que contiene sitios para EcoRI, PstI y un codón de parada.

El producto de amplificación de la PCR fue cortado con EcoRI y ligado a CN10 cortado de manera similar para generar CN44 con las secuencias de la DTA en orientación correcta con relación a las secuencias de SV40. Las secuencias de la DTA más las secuencias de SV40 fueron insertadas en \DeltaE1sp1A y \DeltaE1sp1B como fragmentos de XbaI/BamHI para dar CN120 y CN82, respectivamente. El PSE fue amplificado por PCR a partir de CN84 y ligado en CN120 y CN82 según se describió para las construcciones de CAT con el fin de producir CN123 y CN98, respectivamente. En CN123, la unidad de transcripción PSE-DTA está en orientación izquierda a derecha con relación a la hebra l de Ad5, mientras que en CN98 la unidad PSE-DTA está en orientación derecha a izquierda. La recombinación homóloga de CN98 y BHG10 produjo el virus CN721; la recombinación homóloga de CN123 y BHG10 produjo el virus CN722.

B. PSE Dirigiendo la Expresión Génica en \DeltaE3

La inserción de unidades de transcripción dirigidas por PSE en E3 fue analizada clonando la unidad de transcripción PSE-CAT en el sitio de PacI de BHG11. Con el fin de preparar la unidad de transcripción para su inserción en BHG11, el fragmento KpnI/SacI de CN105 fue ligado a pABS.4 cortado de manera similar para construir CN175 que añade un gen de kanamicina para selección y sitios de PacI en cada extremo. El fragmento de PacI de CN175 fue ligado posteriormente a BHG11 cortado con PacI y se identificaron clones con inserciones en ambas orientaciones: CN301 contiene la unidad PSE-CAT en la orientación izquierda a derecha y CN302 contiene la unidad PSE-CAT en orientación derecha a izquierda. CN301 y CN302 fueron luego cortados con SwaI para escindir el fragmento del gen de la kanamicina, posteriormente fueron ligados de nuevo para dar CN303 y CN304.

Construcción de Virus

Una línea de células de riñón embrionario humano, 293, expresa eficazmente los genes E1A y E1B de AD5 y presenta una alta eficacia de transfección con ADN de adenovirus. Las células 293 fueron cotransfectadas con un plásmido con el extremo izquierdo de Ad5 y con un plásmido con el extremo derecho de Ad5. La recombinación homóloga genera adenovirus con los elementos genéticos requeridos para la replicación en células 293 que proporcionan las proteínas E1A y E1B en trans para complementar los defectos de la síntesis de estas proteínas. Para la construcción de mutantes en la región de E4, la cotransfección y la recombinación homóloga se llevaron a cabo en células W162 (Weinberg y Ketner (1983) PNAS 80:5383-5386) que proporcionan proteínas E4 en trans para complementar los defectos de la síntesis de estas proteínas.

Los plásmidos que van a ser combinados son cotransfectados en las células utilizando liposomas catiónicos tales como Lipofectina (DOTMA:DOPE, Life Technologies) combinando los dos plásmidos, mezclando luego las solución de ADN plasmídico (10 mg de cada plásmido en 200 \mul de medio mínimo esencial sin suero u otros aditivos) con un exceso molar de cuatro veces de liposomas en 200 \mul del mismo tampón. Los complejos ADN-lípido son colocados posteriormente en las células e incubados a 37ºC, 5% de CO_{2}, durante 16 horas. Después de la incubación el medio fue cambiado a MEM con un 10% de suero bovino fetal y las células fueron incubadas adicionalmente a 37ºC, 5% de CO_{2}, durante 2 semanas con dos cambios de medio. Al final de este tiempo las células y el medio fueron transferidos a tubos, se congelaron-descongelaron tres veces y el lisado fue utilizado para infectar células 293 (o W162) a la dilución apropiada para detectar virus individuales como placas.

Las placas obtenidas fueron purificadas en placa dos veces y los virus fueron caracterizados para determinar la presencia de las secuencias deseadas mediante PCR y ocasionalmente mediante secuenciación del ADN. Para la experimentación posterior los virus fueron preparados a mayor escala mediante centrifugación en gradiente de cloruro de cesio.

La tabla siguiente enumera las combinaciones de los plásmidos con el extremo derecho y el extremo izquierdo de Ad5 utilizados para generar Ad5 recombinante con las características deseadas:

2

II. Adenovirus Atenuados Específicos de la Próstata Competentes para la Replicación A. Ad5 con PSE Dirigiendo la Expresión de E1A

El clonaje y la caracterización de un intensificador específico de la próstata (PSE) mínimo está descrito en Prostate Specific Antigen Expression is Regulated by an Upstream Enhancer (Schuur y col., supra). El plásmido CN71 contiene nuestro PSE mínimo (desde el pb -5322 al pb -3875 con relación al sitio de inicio de la transcripción del gen del PSA) y -532 a +11 del promotor del PSA. CN71 fue cortado con XhoI/HindIII que elimina el promotor de PSA. Un promotor más corto, desde -230 a +7, amplificado por PCR utilizando los cebadores:

18.119, 5'-GGACCTCGAGGTCTCCATGAGCTAC, [SEC ID Nº:05] y

15.59B, 5'-AGCTCGAGCTTCGGGATCCTGAG, [SEC ID Nº:06].

El producto de la PCR fue cortado con XhoI/HindIII y ligado de nuevo en CN71 cortado con XhoI/HindIII, creando CN105.

1. Ad5 Atenuado con PSE Dirigiendo E1A y Conservando el Promotor y el Intensificador Endógenos de E1A de Ad5

El gen E1A es expresado inmediatamente después de la infección vírica (0-2 horas) y antes que cualquier otro gen del virus. La proteína E1A actúa como un factor regulador de la transcripción que actúa en trans, y que actúa positivamente, requerido para la expresión de los demás genes tempranos del virus, E1B, E2, E3, E4 y los genes proximales al promotor de los genes tardíos principales. A pesar de la nomenclatura, los genes proximales al promotor dirigidos por el promotor tardío principal son expresados a tiempos tempranos después de la infección con Ad5 (Flint (1982) Biochem. Biophys. Acta 651:175-208; Flint (1986) Advances Virus Research 31:169-228; Grand (1987) Biochem. J. 241:25-38). En ausencia de un gen E1A funcional la infección vírica no continúa, ya que no se producen los productos génicos necesarios para la replicación del ADN del virus (Nevins (1989) Adv. Virus Res. 31:35-81). El sitio de inicio de la transcripción de E1A de Ad5 está en el nt 560 y el sitio de inicio ATG de la proteína E1A está en el nt 610 del genoma del virus.

El pXC.1 fue adquirido a Microbix Biosystems Inc. (Toronto). El pXC.1 contiene secuencias del Adenovirus 5 desde el pb 22 hasta el 5790. Nosotros hemos introducido un sitio de AgeI 12 pb 5' respecto al codón de inicio de E1A (nucleótido 547 de Ad5) mediante mutagénesis dirigida por oligos y PCR ligada. El plásmido pXC.1 fue amplificado por PCR utilizando los cebadores:

15.133A, 5'-TCGTCTTCAAGAATTCTCA [SEC ID Nº:07], que contiene un sitio de EcoRI, y

15.134B, 5'-TTTCAGTCACCGGTGTCGGA [SEC ID Nº:08],

que contiene una A extra para introducir un sitio de AgeI. Esto creó un segmento desde el sitio de EcoRI en el esqueleto de pBR322 hasta el nt 560 de Ad5. Un segundo segmento de pXC.1 desde el nucleótido 541 del Ad hasta el sitio de XbaI en el nucleótido 1339 del Ad fue amplificado utilizando los cebadores:

15.133B, 5'-GCATTCTCTAGACACAGGTG [SEC ID Nº:09], que contiene un sitio de XbaI y

15.133A, 5'-TCCGACACCGGGTGACCTGAAA [SEC ID Nº:10],

que contiene una T extra para introducir un sitio de AgeI. Una mezcla de estos dos segmentos de ADN amplificados por PCR fue mezclada y amplificada con los cebadores 3 y 4 para crear un segmento de ADN desde el sitio de EcoRI hasta el sitio de XbaI de pXC.1. Este segmento de ADN incluye las 1317 bases más a la izquierda de la secuencia del adenovirus y contiene un sitio de AgeI en el nucleótido 547 del Ad. Este segmento de ADN fue utilizado para sustituir el segmento correspondiente de pXC.1 con el fin de crear CN95. De manera similar, un PSE con extremos de AgeI fue amplificado por PCR a partir de CN105 utilizando los cebadores:

15.176A, 5'-CATTAACCGGTACCTCTAGAAAATCTAGC [SEC ID Nº:11] y

15.176B, 5'-CATTAACCGGTAAGCTTGGGGCTGGGG [SEC ID Nº:12],

y clonado en CN95. El virus creado por recombinación homóloga de CN96 y BHG10 fue denominado CN706.

2. Ad5 Atenuado con PSE Dirigiendo el E1A de Ad5 del que Se Habían Eliminado el Promotor y el Intensificador Endógenos de Ad5

Con el fin de reducir la expresión ubicua del gen E1A, decidimos eliminar las secuencias de ADN reguladoras de la transcripción de E1A endógenas. Las secuencias reguladoras de la transcripción del gen E1A están incluidas intrincadamente en secuencias de ADN esenciales para el empaquetamiento del ADN (ver Graeble y Hearing (1992) y las Referencias citadas en la misma). Graeble y Hearing (1990) han demostrado que un Adenovirus 5 con una deleción desde el pb 194 al pb 316, que elimina todos los elementos reguladores de la transcripción y retiene solamente tres de siete señales de empaquetamiento, reducía el rendimiento solamente 3 veces en comparación con el tipo salvaje. Estas observaciones sugerían que las secuencias reguladoras de la transcripción de E1A son prescindibles y que la pérdida de las tres primeras, de un total de siete, señales de empaquetamiento permitía la producción del virus en cantidades aceptables.

a. En la primera variante, la región del genoma de Ad5 que contiene el intensificador y el promotor de E1A y la secuencia de empaquetamiento de Ad5 fue eliminada y sustituida por un segmento de ADN sintético que contenía una secuencia de empaquetamiento mutada y un segmento amplificado por PCR del PSE procedente de CN127. En esta construcción, el fragmento de EcoRI/XbaI de pXC.1 que contenía las primeras 1339 bases del genoma de Ad5, fue clonado en pUC19 para construir CN172 como sustrato para manipulaciones posteriores. Las secuencias de ADN correspondientes a los nt 123 a 497 de Ad5 fueron eliminadas de CN172 mediante amplificación por PCR utilizando los cebadores:

26.153.1, 5'-CCGCTCGAGATCACACTCCGCCACAC [SEC ID Nº:13], que contiene un sitio de XhoI y

26.153.2, 5'-CCGCTCGAGCACTCTTGAGTGCCA [SEC ID Nº:14], que contiene un sitio de XhoI. El corte del producto de la PCR con XhoI seguido por religadura tuvo como resultado CN178, en el cual un sitio de XhoI sustituía a los nt 123 a 497 de Ad5. El segmento de ADN sintético que contenía las secuencias de empaquetamiento de Ad5 mutadas estaba compuesto por las dos hebras siguientes:

26.160.1, 5'-

3

\vskip1.000000\baselineskip

26.160.2, 5'-

4

Las hebras fueron hibridadas y sometidas a la acción de una quinasa utilizando la polinucleótido quinasa de T4 para formar el ADN_{dh} y permitir la ligadura a los demás segmentos de ADN en la construcción.

El segmento de PSE utilizado para la ligadura fue amplificado por PCR a partir de CN127 utilizando los cebadores:

26.160.3, 5'-GGAAGATCTGAAATCTAGCTGATATAG [SEC ID Nº:17], que contiene un sitio de XhoI y

19.16.5, 5'-TTCTCGAGAAGCTTGGGGCTGGGG [SEC ID Nº:18],

que contiene sitios de XhoI y HindIII. Para la ligadura, el producto de la PCR de PSE y CN178 fueron ambos cortados con XhoI. El CN178 cortado con XhoI, el producto de la PCR de PSE cortado con XhoI y el oligonucleótido de empaquetamiento sometido a la quinasa fueron mezclados en proporciones molares iguales y ligados con ADN ligasa de T4. El recombinante resultante fue denominado CN201. El segmento de EcoRI/XbaI de CN201 que contenía la secuencia de empaquetamiento mutada y el PSE dirigiendo E1A fue cortado de CN201 y utilizado para sustituir el segmento homólogo de pXC.1 para generar CN202.

b. En la segunda variante, se empleó una estrategia diferente. Con el fin de realizar la mutagénesis por deleción con un plásmido relativamente pequeño, un fragmento EcoRI/XhoI de 2297 pb del plásmido CN145, que contiene las secuencias del extremo izquierdo del Adeno incluyendo la región promotora de E1A y el intensificador de PSA, fue subclonado en pBluescript SKII+ cortado de manera similar, produciendo el plásmido CN169.

El plan para la mutagénesis por deleción era eliminar las secuencias de la posición 194-301 del Ad y sustituirlas por un sitio de restricción de SalI, 5'-GTCGAC-3', que servía como marcador de diagnóstico para distinguir los plásmidos mutados de los plásmidos parentales. La deleción eliminaba todo el núcleo central de E1A y elementos reguladores de la transcripción de E2F, así como las señales de empaquetamiento AI y AII, pero conservaba las señales de empaquetamiento AIII, AIV, AV, AVI y AVII. Para este fin, se sintetizaron dos cebadores oligonucleotídicos:

28.134A, 5'-GTCGACGTGAAATCTGAATAATTTTGTGTTACTCATAGC [SEC ID Nº:19]. Este cebador se aparea con las secuencias 302-324 del Ad5.

28.134B, 5'-CACCGGCGCACACCAAAAACGTC [SEC ID Nº:20]. Este cebador se aparea con las secuencias 171-193 de Ad5.

Se utilizó el kit de mutagénesis por PCR de Stratagene en las manipulaciones siguientes. En un tubo de PCR, se añadieron 15 pmoles de cada cebador a 0,5 pmoles de CN169; dNTP 1 mM, 2,5 \mul de PCR 11 10x (Stratagene), dH_{2}O hasta 24 \mul y 0,5 \mul de la Polimerasa Taq y de TaqExtender (Stratagene). La mezcla fue cubierta con 20 \mul de aceite mineral y programada para PCR: 94ºC 4 minutos, 63ºC 1 minuto, 72ºC 4 minutos, en un ciclo, y 94ºC 1 minuto, 63ºC 1 minuto, 72ºC 4 minutos en 10 ciclos. Se añadió 1 \mul del enzima de restricción DpnI (Stratagene) para cortar el ADN parental y se incubó a 37ºC durante 80 minutos seguido por la adición de 1 \mul de Polimerasa Pfu (Stratagene) e incubación a 72ºC durante 50 minutos para rellenar los extremos de ADN salientes generados durante el proceso anterior de PCR por la Polimerasa Taq. La PCR produjo un ADN lineal de 5 kb que fue ligado con ADN ligasa de T4 para su recircularización. Bacterias XL-1 fueron transformadas con la reacción de ligadura y los recombinantes mutados fueron identificados en virtud de la presencia del único sitio de restricción de SalI. Uno de los recombinantes, CN179, fue utilizado para reconstruir el plásmido parental CN145 con la deleción mediante el intercambio del fragmento EcoRI/XhoI de CN145 que contenía las secuencias del Adeno y de PSE con el de CN179, produciendo el plásmido CN185. El plásmido CN185 fue utilizado en cotransfecciones con BHG11 en células 293 humanas para generar Adenovirus recombinantes. Se aislaron nueve placas de virus. Un aislado del virus fue denominado CN724.

3. Ad5 Atenuado con PSE Dirigiendo la Expresión de E1B

La proteína E1B funciona en trans y es necesaria para el transporte del ARNm tardío desde el núcleo hasta el citoplasma. Defectos en la expresión de E1B tienen también como resultado una pobre expresión de las proteínas tardías del virus y la incapacidad para cortar la síntesis de proteínas de la célula huésped. El promotor de E1B ha sido implicado como el elemento que define la diferencia en el rango de huéspedes entre Ad40 y Ad5: Ad40 es clínicamente un enterovirus, mientras que Ad5 produce conjuntivitis aguda (Bailey, Mackay y col. (1993) Virology 193:631; Bailey y col. (1994) ibid 202:695-706). El promotor de E1B de Ad5 consta de un único sitio de reconocimiento de alta afinidad de Sp1 y una secuencia TATA.

Para insertar un PSE que dirija la expresión de E1B en Ad5, se creó un sitio de EagI corriente arriba del sitio de inicio de E1B mediante la inserción de un residuo de G en el nt 1682 de Ad5 por mutagénesis dirigida por oligonucleótidos igual que anteriormente. Para simplificar la inserción del PSE en el sitio de EagI, el sitio de EagI endógeno de CN95 fue eliminado por digestión con EagI, tratamiento con nucleasa de alubia y religadura para construir CN114. Se utilizaron los cebadores:

15.133A, 5'-TCGTCTTCAAGAATTCTCA [SEC ID Nº:21], que contiene un sitio de EcoRI y

9.4, 5'-GCCCACGGCCGCATTATATAC [SEC ID Nº:22],

que contiene una C extra, para amplificar el segmento entre el sitio de EcoRI y el nt 1682 de Ad5.

Se utilizaron los cebadores:

9.3, 5'-GTATATAATGCGGCCGTGGGC [SEC ID Nº:23], que contiene una G extra y

24.020, 5'-CCAGAAAATCCAGCAGGTACC [SEC ID Nº:24],

que contiene un sitio de KpnI, para amplificar el segmento entre 1682 y el sitio de KpnI en el nt 2048 de Ad5. La coamplificación de los dos segmentos con los cebadores 9 y 12 produce un fragmento con un sitio de EagI en el nt 1682 del Ad5 que fue utilizado para sustituir el sitio de EcoRI/KpnI correspondiente en pXC.1 para construir CN124. PSE amplificado a partir de CN105 con los cebadores:

26.1.1, 5'-TAACGGCCGTCTAGAAATCTAGCTGA [SEC ID Nº:25] y

26.1.2, 5'-TAACGGCCGAAGCTTGGGCTGGG [SEC ID Nº:26],

con extremos de EagI, fue ligado en el sitio de EagI de CN124 para construir CN125. El virus resultante de la recombinación homóloga de CN125 y BHG10 fue denominado CN711.

4. Ad5 Atenuado con PSE Dirigiendo la Expresión de E1A y E1B

Se construyó un plásmido con el extremo izquierdo de Ad5 que tenía el PSE dirigiendo la expresión de E1A y E1B mediante amplificación por PCR de CN95 con los cebadores 9-12 según se describió para la construcción de CN124. El segmento de ADN resultante contiene el sitio de AgeI derivado de CN95 y el sitio de EagI derivado de la mutagénesis por PCR. Este segmento de ADN fue clonado de nuevo en CN114 (el plásmido del que se había eliminado el sitio de EagI procedente de pXC.1) para construir el plásmido CN144. CN144 contiene un único sitio de AgeI en el nt 547 de Ad5 y un único sitio de EagI en el nt 1682 de Ad5. Los segmentos del PSE fueron amplificados por PCR con extremos de AgeI procedentes de CN105 o con extremos de EagI, también por PCR a partir de CN105, según se describió anteriormente y ligados en los sitios apropiados de CN144 para construir CN145. CN145 es un plásmido en el que el PSE dirige la expresión de E1A y E1B mientras que conserva los promotores e intensificadores endógenos de Ad5 de ambos genes. Se eligieron los clones con el PSE en orientación de izquierda a derecha. Los promotores/intensificadores de E1A y E1B de Ad5 endógenos fueron movidos corriente arriba por la inserción de ambos segmentos de PSE. El virus resultante derivado por recombinación homóloga de CN145 y BHG10 fue denominado CN716.

5. Ad5 Atenuado con PSE Dirigiendo la Expresión de E4

E4 está situado en el extremo derecho del genoma de Ad5 y es leído de derecha a izquierda a partir de la hebra l (Flint, supra). E4 puede ser eliminado del genoma del Ad5 y suministrado en trans por las células W162, un derivado de las células VERO (Weinberg y Ketner, supra). Los productos de transcripción de E4 son complejos. Los marcos de lectura abiertos (ORF) 3 y ORF 6 de la unidad de transcripción de E4 incrementan la acumulación de ARNms de la unidad de transcripción tardía principal mediante la unión a la proteína de 55 kDa de E1B (Dix y Leppard (1993) J. Virol. 67:3226-3231) y a heterodímeros de E2F-1 y DP-1 (Helin y Harlow (1994) J. Virol. 68:5027-5035). Mutaciones tales que hagan que ni ORF3 ni ORF6 codifiquen proteínas funcionales, producen placas con una eficacia menor de 10^{-6} de la del virus de tipo salvaje (Bridge y Ketner (1989) J. Virol. 67:5911-5921).

Con el fin de facilitar la inserción del PSE que dirige la expresión de E4, el fragmento de EcoRI de 10 kb de BHG10 que contiene las 8 kb 3' de Ad5 más una porción del esqueleto de pBR322 fue clonado en el sitio de EcoRI de Bluescript KSII+ para construir CN108. Un sitio de DraIII en el nt 33906 del Ad fue eliminado por digestión parcial de CN108, se rellenaron los extremos con Klenow y se volvió a ligar para construir CN113. Un sitio de XhoI fue introducido en el nt 35577 del Ad mediante mutagénesis dirigida por oligonucleótidos y PCR ligada según se describió anteriormente, utilizando los cebadores:

10.1, 5'-TAACTCACGTTGTGCATTGT [SEC ID Nº:27], que contiene un sitio de DraIII,

10.4, 5'-GGTGCCGTGCTCGAGTGGTGT [SEC ID Nº:28], que contiene una C extra,

10.3, 5'-ACACCACTCGAGCACGGCACC [SEC ID Nº:29], que contiene una G extra,

19.158, 5'-GCTACTATTCGACAGTTTGTACTG [SEC ID Nº:30], que contiene un sitio de ClaI.

El producto de la PCR que contenía un sitio de XhoI así como extremos de DraIII y ClaI, fue utilizado para sustituir al fragmento DraIII/ClaI correspondiente de CN113 para construir CN122.

El plásmido CN70 contiene el PSE mínimo (desde el pb -5322 al pb -4023 con relación al sitio de inicio de la transcripción del gen de PSA) y de -532 a +11 del promotor del PSA. CN70 fue cortado con XhoI/HindIII que elimina el promotor del PSA. Un promotor más corto, desde -230 a +7, amplificado por PCR utilizando los cebadores:

18.119, 5'-GGACCTCGAGGTCTCCATGAGCTAC [SEC ID Nº:31], y

15.59B, 5'-AGCTCGAGCTTCGGGATCCTGAG [SEC ID Nº:32],

fue ligado en su lugar para construir CN104. CN127 fue construido a partir de CN104 según sigue: CN104 fue cortado con XhoI, se rellenaron los extremos con Klenow y se volvieron a ligar para eliminar el sitio de XhoI. El PSE de CN127 fue amplificado por PCR utilizando los cebadores:

19.16.1, 5'-GGGTCGACGTACCTCTAGAAATCTAGC [SEC ID Nº:33] y

19.16.5, 5'-TTGTCGACAAGCTTGGGGCTGGGG [SEC ID Nº:34],

para crear extremos de SalI. Este segmento de ADN fue ligado posteriormente a CN122 cortado con XhoI para insertar el PSE en la orientación correcta corriente arriba de E4. El plásmido resultante fue denominado CN135. El gen de resistencia a kanamicina procedente de pABS4 (Microbix) fue insertado en CN135 en el sitio de PacI para construir CN146; el fragmento de EcoRI de CN146 (que contenía secuencias del adenovirus con el PSE y el gen de resistencia a kanamicina insertados) fue ligado posteriormente al fragmento grande de EcoRI de BHG10, sustituyendo a las secuencias homólogas del Ad de tipo salvaje en BHG10. Los recombinantes fueron identificados por resistencia a ampicilina y a kanamicina, posteriormente el gen de la kanamicina fue cortado mediante digestión con PacI y religadura para dar CN190, que es BHG10 con el PSE insertado corriente arriba de la región codificadora de E4.

6. Ad5 Atenuado con PSE Dirigiendo el E1A de Ad5 que Contiene Citosina Desaminasa en \DeltaE3

Un vector adenovírico específico de la próstata que contuviera el gen de la citosina desaminasa ("cd") incorporado en su genoma, podría suministrar este gen a un tejido diana (esto es, a tumores prostáticos). Por consiguiente, células cancerosas infectadas metabolizarían 5-FC y liberarían el agente quimioterapéutico 5-FU al tejido circundante suprimiendo la división celular, y presentarían el denominado "efecto testigo" (Hirshowitz y col. (1995) Human Gene Ther. 6:1055-1063; Griffith y Jarvis (1993) J. Biol. Chem. 268:20085-20090). En contraste, las células no proximales, no infectadas, no serían afectadas. Esto sugiere dos utilizaciones del gen cd en un vector adenovírico atenuado. En primer lugar, cd puede servir como agente terapéutico adicional para proporcionar la capacidad destructora testigo y acelerar la reducción del tumor local sin toxicidad sistémica (Moolten y Wells (1990) J. Nat'l. Cancer Inst. 82:297-300). En segundo lugar, el gen puede servir como mecanismo de memoria para parar una infección galopante impidiendo la síntesis de ADN y ARN vírico en las células locales infectadas y no infectadas.

El enzima citosina desaminasa, que desamina la citosina para dar uracilo, se encuentra en muchas bacterias y hongos. Estos microorganismos pueden convertir la 5-fluorocitosina (5-FC), un profármaco inocuo, en 5-fluorouracilo (5-FU) un compuesto muy tóxico que inhibe la síntesis de ADN y ARN (Calibrisi y Chabner, Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics (Eds. A.G. Gilman, T. Rall, A.S. Nies y P. Taylor, Pergamon, NY) (1990) 8ª ed., pp. 1209-1263); Damon y col. (1989). Como las células de mamífero no expresan cantidades significativas del gen cd, no son sensibles a 5-FU. Células de mamífero modificadas mediante transferencia génica para que expresen el gen pueden sin embargo metabolizar 5-FC. En esta solicitud, cd actúa como un "gen suicida", confiriendo selectivamente sensibilidad a aquellas células que contienen el gen.

Construcción del Vector Adenovírico. El plásmido pCMV-cd, que contiene la región codificadora de cd corriente abajo del promotor de CMV, fue obtenido de David Crooks (Stanford). Un sitio de la endonucleasa de restricción SpeI localizado en una región de clonaje múltiple entre el promotor y el ATG de cd, fue eliminado mediante digestión del plásmido con enzimas que reconocen secuencias que flanquean el sitio de SpeI, BamHI y EcoRI, rellenando los extremos con Klenow y volviendo a ligar (CN130). Con este sitio eliminado, el casete CMV-cd fue clonado mediante la digestión de CN130 con SpeI y la ligadura del fragmento apropiado en el sitio de XbaI de pABS4 (Microbix, Toronto), un plásmido lanzadera que contiene el gen de resistencia a kanamicina (CN131). Mediante la digestión de CN131 con PacI, se aisló un fragmento que contenía el gen kanR y el gen cd y se ligó en BHG11 (Microbix) cortado de manera similar, que contenía un único sitio de PacI introducido por manipulación en la región E3 de Ad5 (CN141). El gen kanR fue eliminado por digestión de CN141 con SwaI y volviendo a ligar el vector (CN148).

Se construyeron dos virus Ad5 recombinantes que contenían el gen cd en la región E3. El primero contiene solamente el casete CMV-cd en la región de E3 (CN719). El segundo tiene el casete CMV-cd en E3 y el elemento mínimo intensificador específico de la próstata (PSE) que modula la expresión de las proteínas E1A (CN720). Los virus fueron generados mediante recombinación homóloga en células 293 en un pase bajo, una línea celular de riñón humano que expresa las proteínas E1A y E1B de Ad, realizada cotransfectando las mismas con pXC.1/CN148 y CN145(PSE-E1A)/CN148.

Caracterización In Vitro. En este primer ensayo funcional, se estudió CN720, un adenovirus atenuado específico de la próstata que contiene el gen cd en la región E3, con el fin de analizar su capacidad para conferir sensibilidad a 5-FC a las células infectadas y a las células vecinas. Se analizó también Ad5 de tipo salvaje (CN702). Células CV1, una línea celular de riñón de mono semipermisiva, sembradas en cuatro placas de microvaloración de 96 pocillos en DMEM con un 5% de FBS, fueron infectadas en una serie de diluciones 1:2 a partir de los pocillos 1-11 con CN702 o CN720. La multiplicidad de infección del pocillo uno era aproximadamente veinticinco para CN702 y dos para CN720. La fila 12 de cada placa se dejó como control no infectado. Un día después de la infección se cambió el medio. Dos placas de células, una infectada con CN720 y otra infectada con CN702, fueron tratadas con 5-FC 5 mM. El medio de las dos placas restantes fue cambiado por DMEM completo solamente. Estas células infectadas, no tratadas, ilustran la capacidad lítica del virus y fueron utilizadas para diferenciar entre las dos causas de muerte celular en este experimento, la lisis de las células por el virus y la toxicidad de 5-FU. Las células fueron fijadas con metanol 50%-acetona 50% y teñidas con colorante Giemsa 6 días después de la administración del profármaco. Las placas fueron analizadas midiendo la absorbancia a 530 nm en un lector de placas de microvaloración SpectraMAX 340 (Molecular Devices). La supervivencia celular fue calculada relacionando la absorbancia de las células en los pocillos no infectados con la absorbancia en los pocillos infectados. Los resultados fueron representados gráficamente como supervivencia celular frente a la dilución del virus.

De este experimento pueden extraerse varias conclusiones. La más importante, la gráfica sugiere que los adenovirus recombinantes están expresando el gen cd. Aunque la capacidad de ambos virus para destruir las células parece incrementarse en presencia de 5-FC, debido quizá a la toxicidad generalizada a altas concentraciones del profármaco, el cambio de la destrucción celular es drástico con CN720. La gráfica de CN720 muestra una clara diferencia de la supervivencia celular entre las células tratadas con 5-FC y las células no tratadas, indicativa de un efecto testigo de 5-FU. Este resultado ilustra el potencial para aprovechar la función de cd con el fin de incrementar el potencial destructor de Ad5 o de utilizar una infección galopante mediante la generación de un depósito intracelular de fármaco tóxico en las células no infectadas que impide la replicación del ADN, un mecanismo de memoria.

Como un modelo in vitro, seis placas de 96 pocillos fueron sembradas con una línea celular de epitelio intestinal humano, DLD-1, que es permisiva para el Ad humano, en DMEM, FBS 10%. Fueron infectadas según se describió anteriormente con el virus Ad5-cd (CN719). El profármaco (1 mM) fue añadido a una placa a cada punto de tiempo, 0 horas, 24 horas y 48 horas después de la infección. Las tres placas restantes no se trataron y sirvieron como controles infectados. Un grupo de dos placas, una con profármaco y otra sin él, fue recogido los días 7, 8 y 9 después de la infección.

Estos resultados corroboran los datos previos y los extienden. Se observa una muerte celular incrementada en todos los puntos de tiempo en las células infectadas tratadas con el profármaco, con relación a las células infectadas pero no tratadas. Estos datos revelan también que el efecto testigo es más pronunciado a medida que la infección está más avanzada. Cuando se añade 5-FC a las 24 horas y a las 48 horas después de la infección, la muerte celular es mayor que cuando el profármaco se añade inmediatamente después de la infección inicial. Estos datos demuestran que un adenovirus específico de un tejido que alberga el gen cd tiene una capacidad de destrucción superior que el adenovirus de tipo salvaje.

7. Ad5 Atenuado con PSE Dirigiendo E1A y el Antígeno T de SV40 en \DeltaE3 para Incrementar el Rango de Huéspedes con el Fin de Incluir Células de Mono y Humanas

El adenovirus humano no se replica eficazmente en células de mono. Asociada con niveles disminuidos de ARNm fibroso en el citoplasma, la infección abortiva está causada por defectos en la expresión de los genes tardíos regulada por las proteínas E4 (Ross y Ziff (1992) J. Virology 66:3110-3117). Híbridos adenovirus-SV40 - - que se ha demostrado que contienen una pequeña porción del genoma de SV40 que codifica el antígeno T grande integrada en la región E3 del genoma del adenovirus 2, superan este defecto y lisan células de mono (Lewis y Rowe (1970) ibid 5:413-420; Lewis y col. (1973) ibid 11:655-664). Se cree que el antígeno T grande (Tag) confiere a estos híbridos esta capacidad de rango de huéspedes (Tijan y col. (1979) PNAS 75:1279-1283). Se han aislado varios híbridos Ad2-SV40 de cultivos infectados con SV40 y Ad2, conteniendo cada uno una cantidad conservada de la región codificadora carboxiterminal de Tag y longitudes variables de la región codificadora aminoterminal.

Nosotros hemos adoptado este paradigma para desarrollar mutantes de Ad5 específicos de un tejido, con un rango de huéspedes, para su utilización en estudios con monos. Se llevaron a cabo dos estrategias. La primera utilizó como modelo el mutante con rango de huéspedes Ad2 + ND1, que alberga la secuencia codificadora de Tag de SV40 desde la unidad del mapa 0,28 a la 0,11 (Zain y Roberts (1978) J. Mol. Biol. 120:13). Un fragmento de restricción PstI/BamHI de 666 pares de bases en el plásmido pDIS (obtenido de Edgar Schrieber), un plásmido que contiene la secuencia codificadora completa de Tag, el promotor temprano endógeno de SV40 y un intensificador de SV40 invertido, contiene la secuencia 3' apropiada y fue clonado mediante el plásmido lanzadera pABS4 (Microbix) en el único sitio de restricción de PacI en la región E3 de BHG11 (Microbix). Corriente arriba de la secuencia codificadora se clonó una hebra de oligo (+):

26.99.1, 5'-GTTTGTGTATTTTAGATCAAAGATGCTGCA [SEC ID Nº:35], y una hebra (-):

26.99.2, 5'-GCATCTTTGATCTAAAATACACAAAC [SEC ID Nº:36],

que contiene una secuencia aceptora de ayuste, secuencias de reconocimiento de ribosomas y un ATG para llevar a cabo la expresión del péptido apropiado (CN170). La expresión de esta construcción depende de un transcrito que se origina a partir del promotor tardío principal.

La segunda estrategia implicaba la creación de una deleción interna en la secuencia de Tag en el plásmido pDIS, entre el sitio de EcoNI en la región aminoterminal y el sitio de PstI en la secuencia codificadora carboxiterminal, mediante la utilización de una hebra de oligo (+) adaptadora:

27.183.1, 5'-TAAAGGAGGAGATCTGCCTAAAACACTGCA [SEC ID Nº:37], y una hebra (-):

27.183.2, 5'-GTGTTTTAGGCAGATCTCCTCCTTT [SEC ID Nº:38].

La unidad de transcripción completa, incluyendo el intensificador, el promotor y la secuencia codificadora, fue cortada por digestión con HpaII/BamHI y clonada mediante un plásmido lanzadera en el único sitio de PacI de BHG11 (CN183). Este método genera una unidad de transcripción discreta en la secuencia de Ad5 cuya expresión no depende del promotor tardío principal.

Se produjeron dos virus Ad5-SV40 con un rango de huéspedes. Ambos contienen los extremos carboxi de Tag pero carecen del promotor. Uno es un virus atenuado específico de un tejido, con el intensificador específico de la próstata (PSE) modulando la expresión de las proteínas E1A (CN725). El otro es Ad5 de tipo salvaje con una inserción de Tag (CN726). Ambos fueron generados por recombinación homóloga mediante cotransfección de células 293, una línea de células de riñón humano que expresa las proteínas E1A y E1B de Ad, con CN145 (PSE-E1A) o con pXC.1 (extremo izquierdo del Ad5 de tipo salvaje) y CN170.

Caracterización de los Mutantes con un Rango de Huéspedes. Ad5 de tipo salvaje (CN702) y CN726 fueron sembrados en células 293 y en células CV1, una línea de células de riñón del mono verde africano. Las placas fueron contadas en ambas monocapas de células y se determinó una relación entre las placas en las dos líneas celulares. La relación para CN726 y CN702 fue de 0,01 y 0,0007, respectivamente. La capacidad de replicación del adenovirus en células de mono permite la evaluación preclínica de adenovirus atenuados recombinantes en monos, produciendo una valiosa información para la dosificación y formulación de estos virus como agentes terapéuticos en humanos.

8. Construcción de ADN Recombinante para Introducir Mutaciones en E2, la Proteína de Unión a ADN (DBP), para la Generación de Ad5 Recombinante con un Rango de Huéspedes Extendido que Permite la Replicación en Células Humanas y de Mono

El adenovirus de tipo 5 de tipo salvaje es competente para la replicación solamente en células humanas. Para la evaluación preclínica de adenovirus atenuados terapéuticos sería deseable analizar la eficacia y la toxicidad en animales grandes semejantes a humanos tales como monos. Se ha descrito un mutante con un rango de huéspedes, hr404, que confiere un fenotipo de replicación de Ad5 humano en células de mono (Klessig y Grodzicker (1979) Cell 17:957-966). Se demostró que la naturaleza de la mutación de hr404 era una única mutación puntual C \rightarrow T en la posición 32657 del adeno en el gen de la DBP, que tenía como resultado un cambio del aminoácido Histidina por el aminoácido Tirosina en el codón 130 (H130Y) en la proteína de unión a ADN de 72K (Kruijer y col. (1981) Nucleic Acids Res. 9:4439-4457).

Nosotros construimos una molécula de ADN recombinante con el fragmento EcoRI-BamHI de 5,8 kb del plásmido BHG10 (Bett y col., supra) que contenía las secuencias del extremo derecho del Adenovirus de tipo 5 e introdujimos mediante mutagénesis dirigida a un sitio la mutación H130Y en el gen de la DBP. Este plásmido permitiría la construcción de adenovirus recombinantes que serían capaces de replicarse en células humanas y de mono.

El fragmento EcoRI/BamHI de 5769 pb de BHG10 (Bett y col., supra) fue clonado en pBluescript KSII+ cortado de manera similar, teniendo como resultado el plásmido CN184. Con el fin de eliminar sitios de restricción que estorbaban, se eliminó un fragmento de XhoI de 2568 pb produciendo el plásmido CN186. El cebador superior de la PCR para la mutagénesis es:

28.180U, 5'-GCAACCCACCGGTGCTAATCAAGTATGGCAAAGGAGTAAGCGC-3' [SEC ID Nº39].

El residuo de T mutado que produce la mutación H130Y está mostrado en negrita y subrayado. En cursiva está mostrado el único sitio de SgrAI de pCN186. El cebador inferior de la PCR es:

28.180L, 5'-TGGCCTTGCTAGACTGCTCCTTCAGC-3' [SEC ID Nº:40].

La amplificación por PCR se realizó con 100 pmoles de cada uno de estos cebadores, 200 ng de CN186 como molde, dNTP 1 mM, tampón Pfu 1x (Stratagene), dH_{2}O hasta 100 \mul y 5 U de polimerasa Pfu clonada (Stratagene) a 94ºC 1 minuto, 60ºC 1 minuto, 72ºC 2 minutos durante 30 ciclos. La PCR produjo el fragmento de ADN de 588 pb esperado. El fragmento de ADN fue purificado con una columna Wizard DNA Clean-Up Column (Promega) y digerido con los enzimas de restricción SgrAI y AflII. El fragmento de 473 pb de interés que contenía la mutación H130Y fue purificado en gel y aislado. Para la reinserción en el gen de la DBP, el fragmento de ADN mutado fue ligado con el fragmento de AscI-SgrAI de 1639 pb procedente de CN184 y el fragmento de AflII-AscI de 6609 pb procedente de CN184, teniendo como resultado el plásmido CN188.

Se construyeron genomas adenovíricos recombinantes mediante la ligadura in vitro del fragmento EcoRI-BamHI de 5,8 kb de CN188 con un fragmento de ADN central de EcoRI-Bst1107 de 21562 pb de BHG10 y el plásmido CN144 cortado con Bst1107. El virus resultante fue denominado CN723.

La capacidad de replicación del adenovirus en células de mono permite la evaluación preclínica de adenovirus atenuados recombinantes en monos, proporcionando una valiosa información para la dosificación y la formulación de estos virus como agentes terapéuticos en humanos. Además, con la utilización de la mutación hr404 en CN723, puede utilizarse el mismo virus empleado en los estudios con monos como virus para ensayos clínicos en humanos.

9. Deleción de ORF 1, 2, 3 y Parte de ORF 4 de la Región E4 de Adenovirus de Tipo 5

La región E4 codifica dos polipéptidos que son responsables de la estimulación de la replicación del ADN genómico del virus y de la estimulación de la expresión de los genes tardíos. Los productos proteicos de los marcos de lectura abiertos (ORFs) 3 y 6 pueden ambos realizar estas funciones, sin embargo la proteína de ORF 6 requiere la interacción con la proteína E1B de 55K para presentar actividad, mientras que la proteína de ORF3 no. Con el fin de restringir adicionalmente la replicación vírica a las células epiteliales de la próstata, pueden eliminarse los ORFs 1-3 de E4, haciendo que la replicación del ADN vírico y la síntesis de los genes tardíos sean dependientes de la proteína del ORF 6 de E4. Combinando tal mutante con secuencias en las que la región E1B está regulada por el PSE, puede obtenerse un virus en el que la función de E1B y la función de E4 sean dependientes del PSE que dirige E1B.

Un virus de este tipo fue construido combinando secuencias del plásmido dl1006 que contiene una deleción en E4 de los ORFs 1-3 (Bridge y Ketner (1989) J. Virol. 63:631-638) con BHG10, seguido por cotransfección con CN144 para construir un virus recombinante. El plásmido pdl1006 es cortado con AvrII y AgeI para aislar las secuencias que contenían la región de E4 mutada. Este segmento de ADN es utilizado para sustituir el segmento homólogo de CN108 cortado con los mismos enzimas.

CN108 contiene el fragmento de EcoRI de 6 kb procedente de BHG10 clonado en BSKSII+. Debido a la deleción de E3 en BHG10, el sitio de AvrII en el nt 28752 del Ad5 ha sido eliminado. AvrII cortaba todavía CN108 en el nt 35463 de Ad5; AgeI cortaba CN108 en el nt 31102 de Ad5. El fragmento de AvrII/AgeI de 4,4 kb procedente de CN108 fue sustituido por el fragmento de AvrII/AgeI de 3,8 kb procedente de dl1006, produciendo CN203 que contenía la deleción de E4. El fragmento de EcoRI procedente de CN203 fue clonado en BHG10 para construir CN204. La recombinación homóloga de CN204 y CN144 produjo el virus CN726.

Un virus similar de este tipo fue construido de la manera siguiente. Según se describió previamente, AvrII cortaba CN108 en el nt 35463 de Ad5. SapI cortaba CN108 dos veces, con uno de los sitios en el nt 34319 de Ad5. Un corte completo con AvrII y un corte parcial con SapI de CN108 y religadura eliminaron 1144 pb de E4, produciendo CN205. El fragmento de EcoRI/BamHI de 5,3 kb procedente de CN205 fue clonado en CN188 cortado de manera similar, produciendo CN206. El fragmento de BamHI de 14 kb de CN206, que contenía la deleción de E4 y la mutación hr404, fue clonado en BHG10 cortado con BamHI, produciendo CN207. La recombinación homóloga de CN144 y CN207 en células 293, produjo CN727.

10. PSE Controlando la Región E2 de Ad5

La región E2 del Adenovirus 5 codifica proteínas relacionadas con la replicación del genoma adenovírico, incluyendo la proteína de unión a ADN de 72 kDa, la proteína terminal precursora de 80 kDa y la ADN polimerasa vírica. El objetivo es controlar la expresión de los genes E2 por el intensificador/promotor del PSA específico de la próstata en un adenovirus recombinante.

La región E2 de Ad5 es transcrita en orientación hacia la derecha a partir de dos promotores, denominados E2 temprano y E2 tardío, que están situados en el mapa en las unidades de mapa 76,0 y 72,0, respectivamente. Mientras que el promotor E2 tardío es activo transitoriamente durante las etapas tardías de la infección y es independiente de la proteína transactivadora E1A, el protomor E2 temprano es crucial durante las fases tempranas de la replicación vírica.

El promotor de E2 temprano, situado en el mapa de Ad5 desde el nt 27053 al 27121, consta de un sitio de inicio de la transcripción principal y otro secundario, siendo este último responsable del 5% aproximadamente de los transcritos de E2, dos secuencias TATA no canónicas, dos sitios de unión del factor de transcripción E2F y un sitio de unión del factor de transcripción ATF (para una revisión detallada de la arquitectura de los promotores de E2 ver Swaminathan y Thimmapaya (1995) Current Topics in Microbiology and Immunology 199 parte 3:177-194).

El promotor tardío de E2 solapa con las secuencias codificadoras del gen L4 codificado por la hebra contraria y no es por tanto susceptible de manipulación genética. Sin embargo, el promotor temprano de E2 solapa solamente con unos pocos pares de bases de secuencias que codifican una proteína de 33 k en la hebra contraria. Es de destacar que el sitio de restricción de SpeI (posición 27082 de Ad5) es parte del codón de parada para la proteína de 33 kDa mencionada anteriormente y separa convenientemente el sitio de inicio de la transcripción del E2 temprano principal y el sitio de la proteína de unión a TATA de los sitios de unión de los factores de transcripción corriente arriba E2F y ATF. Por tanto, una inserción del intensificador/promotor del PSA en el sitio de SpeI alteraría el promotor temprano de E2 endógeno del Ad5 y permitiría la expresión de transcritos de E2 restringida a la próstata.

Construcción de Ad5 recombinante con el intensificador/promotor del PSA en la región del promotor temprano de E2. El fragmento BamHI/EcoRI de Ad5 (posiciones 21562-27331) que incluye la región de E2 fue subclonado previamente en pBluescript KSII+, dando como resultado el plásmido CN184. Una variante de este plásmido, CN188, que llevaba una mutación en el gen de la DBP (H130Y) que permitía aplicaciones en un rango de huéspedes extendido, ha sido construida y descrita anteriormente.

El plásmido CN188 fue utilizado para la inserción del intensificador/promotor de PSA en la región de E2. El plásmido fue linealizado con SpeI y los extremos salientes 5' fueron desfosforilados con fosfatasa alcalina de intestino de ternera y posteriormente se rellenaron los extremos con polimerasa Klenow y dNTP. El intensificador/promotor PSE de extremos romos fue ligado al vector CN188 de extremos romos, linealizado con SpeI. Se identificaron ADNs recombinantes con el intensificador/promotor PSE en la orientación apropiada para dirigir el inicio de la transcripción en la región de E2. El plásmido CN196 contiene el intensificador/promotor PSE en el esqueleto de CN188. El fragmento de EcoRI de 5,3 kb del plásmido CN205, que contiene una deleción de los ORF 1, 2, 3 y 4 del gen E4, fue insertado en la orientación apropiada en CN196 cortado con EcoRI, dando lugar al plásmido CN197.

Se obtuvo un genoma vírico recombinante con el intensificador/promotor PSE controlando la expresión de los genes tempranos E1A, E1B y E2 y la mutación de hr404 H130Y en el gen de la DBP y la deleción de los marcos de lectura abiertos 1, 2, 3 y 4 del gen E4, mediante la ligadura in vitro del fragmento BamHI-Bst11071 de 9152 pb de CN144 con el fragmento Bst11071-BamHI de 15802 pb de BHG10 y el fragmento de BamHI de 12425 pb de CN197.

Preparación de Virus

Se prepararon virus según se describió previamente (arriba). La Tabla siguiente enumera las combinaciones de los plásmidos con el extremo derecho y el extremo izquierdo de Ad5 utilizados para generar Ad5 recombinante con las características deseadas:

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Resultados Construcción y estructura genómica del virus

En la ronda inicial de construcción se produjeron tres adenovirus específicos de la próstata, competentes para la replicación. CN706 que contiene el PSE dirigiendo la expresión del gen E1A, CN711 que contiene el PSE dirigiendo la expresión del gen E1B y CN716 que contiene el PSE dirigiendo la expresión del E1A y el PSE dirigiendo la expresión de E1B. Los virus fueron generados por recombinación homóloga en células 293 y clonados dos veces mediante purificación de placas. La estructura del ADN genómico fue analizada por PCR y por la secuenciación de las uniones entre las secuencias insertadas y las secuencias genómicas del Ad. Todos los virus contenían las estructuras deseadas (datos no mostrados).

Crecimiento de los Virus In Vitro

El crecimiento de los virus in vitro fue caracterizado mediante dos ensayos: un ensayo del tamaño del estallido para medir la cantidad de partículas infecciosas producidas en un ciclo de infección y ensayos de placas para determinar el crecimiento de los virus en varios tipos de células.

Para los ensayos del tamaño del estallido, células LNCaP (una línea celular de CaP que produce PSA) o células HBL100 (una línea de células epiteliales de mama no malignas) fueron infectadas con virus a una multiplicidad de infección (MOI) de 1 (5 x 10^{5} UFP por muestra). Se recogieron muestras a varios puntos de tiempo y se midió la cantidad de virus infecciosos presentes mediante ensayos de placas en células 293. La Tabla 2 muestra que CN706 producía 6,3 x 10^{6} UFP a partir de una cantidad inicial de 5 x 10^{5} UFP en células LNCaP después de 48 horas. En las células HBL100 el incremento a partir de la misma cantidad inicial de virus fue hasta 2,0 x 10^{6} UFP. CN706 producía por tanto 13 UFP por partícula infecciosa inicial en células LNCaP, lo cual era una cantidad 3 veces mayor que la producida en células HBL100 durante el mismo periodo de tiempo.

Los ensayos del tamaño del estallido en CN711 revelaron también un crecimiento preferencial en células LNCaP frente a las células HBL100 (Tabla 2). En las células LNCaP, 5 x 10^{5} UFP de virus iniciales producían 4 x 10^{7} UFP a las 48 horas, mientras que en las células HBL100 se obtuvieron 8 x 10^{6} UFP a las 48 horas. Esto representaba un incremento de virus de 40 veces en las células LNCaP o un rendimiento 5 veces mayor que en las células
HBL100.

Esta diferencia en la producción de virus para CN716 mostraba una disparidad más amplia entre las dos líneas celulares. En las células LNCaP, se obtuvieron 1,7 x 10^{7} UFP después de 48 horas, mientras que en las células HBL100 se obtuvieron 8 x 10^{5} UFP en el mismo punto de tiempo. Por tanto, en las células LNCaP se produjeron 34 partículas infecciosas por cada partícula inicial a las 48 horas, mientras que para HBL100 se produjeron 1,6 partículas infecciosas.

Estos resultados indican que la expresión de los genes tempranos E1A y E1B puede ser controlada por el PSE insertado. Con el fin de caracterizar adicionalmente esta regulación, se analizó la producción de virus CN706 mediante el ensayo del estallido en células LNCaP en presencia o ausencia del análogo de testosterona R1881. Como el PSE es muy activo en presencia de andrógenos pero esencialmente inactivo en ausencia de andrógenos, la producción de proteínas tempranas controlada por el PSE, y por tanto la producción de virus, sería sensible a los niveles de andrógeno. Según se muestra en la Tabla 3, en ausencia de R1881 se obtuvieron 3 x 10^{6} UFP a las 48 horas en un incremento de tres veces sobre el virus inicial. En presencia de R1881 1 nM o 10 nM, se obtuvieron de dos a tres veces más UFP a las 48 horas. En contraste, con adenovirus de tipo salvaje ensayado en paralelo, no había diferencia evidente en las UFP obtenidas en presencia o ausencia de R1881.

TABLA 2 Ensayos de Estallido

		LNCaP	HBL100
	CN706	6,3 x 10^{6}	2,0 x 10^{6}
	CN711	4 x 10^{7}	8 x 10^{6}
	CN716	1,7 x 10^{7}	8 x 10^{5}

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TABLA 3 Inducción por R1881

		R1881 0 nM	R1881 1 nM	R1881 10 nM
	CN706	3 x 10^{6}	8 x 10^{6}	5 x 10^{6}

Con el fin de determinar adicionalmente la selectividad de crecimiento de CN706, CN711 y CN716, los virus fueron analizados en ensayos de placas en los que una única partícula infecciosa del virus produce una placa visible mediante múltiples ciclos de infección y replicación. Los resultados de un ensayo representativo están mostrados en la Tabla 4.

TABLA 4 Ensayo de placas

6

Soluciones madre de los virus fueron diluidas a UFP/ml iguales y posteriormente se utilizaron para infectar monocapas de células durante 1 hora. El inóculo fue luego retirado y las células fueron cubiertas con agar semisólido que contenía medio e incubadas a 37ºC durante una semana. Las placas de la monocapa fueron posteriormente contadas y se calcularon los títulos de virus infeccioso en las diferentes células. Los datos fueron normalizados respecto al título de CN702 en células 293.

El virus de tipo salvaje CN702 mostró títulos aproximadamente iguales en cada una de las cinco líneas celulares. En contraste, cada uno de los virus modificados con PSE presentaba un patrón de crecimiento variable en los diferentes tipos celulares. CN706 crecía hasta un título 10 veces menor en células LNCaP que en células 293, sin embargo, su título en células HBL100 era 260 veces menor que en células 293. En la línea celular TSU de CaP que no secreta PSA, el título de CN706 era aproximadamente el mismo que en las células LNCaP que secretan PSA. De manera similar, el título en la línea celular de pulmón A549 era también próximo al título en células LNCaP. El virus CN711 no mostraba una diferencia significativa en título en las líneas celulares analizadas.

Los datos del virus CN716 revelaban una notable selectividad de crecimiento en la línea celular LNCaP. Este virus crecía bien en las células LNCaP, alcanzando un título incluso mayor que en las células 293. El crecimiento del virus en las demás líneas celulares era significativamente menor, 18 veces menor en la siguiente línea con el título más elevado, A549. La mayor diferencia fue en las células HBL100, en las que el título fue 225 veces menor con relación al título en las células LNCaP. Los datos del ensayo del tamaño del estallido y del ensayo de placas demostraban que el adenovirus humano puede ser modificado utilizando el PSE con el fin de desarrollar virus con propiedades de crecimiento selectivo en células de CaP secretoras de PSA.

Tratamiento de xenoinjertos de tumores LNCaP

El objetivo final del desarrollo de virus específicos de la próstata es el tratamiento de pacientes con enfermedad prostática. La viabilidad de este objetivo fue analizada utilizando xenoinjertos de tumores LNCaP crecidos subcutáneamente en ratones Balb/c nu/nu. Los virus de ensayo fueron inoculados en los ratones mediante inyección intratumoral directa de 10^{8} UFP de virus aproximadamente en 0,1 ml de PBS + glicerol 10%, o bien intravenosamente a través de la vena de la cola. Se midieron los tamaños de los tumores y, en algunos experimentos, se tomaron muestras de sangre semanalmente.

Se comparó el efecto de la inyección intratumoral de CN706 sobre el tamaño del tumor y sobre los niveles séricos de PSA con el efecto de un tratamiento ficticio. Los tamaños de los tumores tratados con CN706 continuaron aumentando durante dos semanas, posteriormente disminuyeron progresivamente durante la duración del experimento. Al final del experimento todos los tumores tratados con CN706 (10 en total) habían disminuido de tamaño y cinco ratones fueron sanados de su tumor. En contraste, los tumores tratados con tampón continuaron creciendo durante la duración del experimento, alcanzando un tamaño de aproximadamente dos veces su tamaño original hacia los 42 días.

Resultados publicados previamente habían demostrado que los niveles séricos de PSA se correlacionan con el tamaño del tumor en el modelo de xenoinjertos de tumores LNCaP. La medida de los niveles de PSA en los ratones con tumores tratados con CN706, indicaba un aumento de los niveles de PSA una semana después del tratamiento, seguido por una disminución constante de los niveles de PSA hasta 35 días. Los niveles séricos de PSA aumentaron durante el curso del experimento, siendo la media superior a 250 ng/ml a los 35 días.

Aunque es probable que un agente terapéutico basado en los virus descritos en la presente sería administrado intralesionalmente, sería también deseable determinar si el virus podría afectar al crecimiento del tumor después de administración intravenosa. Si fuera así, sería entonces concebible que el virus pudiera ser utilizado para tratar depósitos tumorales metastásicos inaccesibles a la inyección directa. Grupos de cinco ratones portadores de tumores LNCaP fueron inoculados con 10^{8} UFP de CN706 mediante inyección en la vena de la cola, o con 10^{8} UFP de un adenovirus defectuoso en replicación (CMV-LacZ) para controlar los efectos tóxicos no específicos del virus, o con el tampón utilizado para portar el virus. Los tumores de los ratones tratados con tampón o con CMV-LacZ continuaron creciendo durante la duración del experimento, alcanzando finalmente de media cinco veces aproximadamente su tamaño original. Los tumores de los ratones tratados con CN706 crecieron ligeramente entre el momento de la inoculación y la primera medida a los 7 días; posteriormente el tamaño medio del tumor disminuyó hasta aproximadamente el 75% del volumen original del tumor hacia el día 42.

El tratamiento de los tumores LNCaP en ratones desnudos con CN711 tuvo como resultado un desenlace similar al del tratamiento con CN706. En los animales tratados con CN711 (5 en total) los tumores continuaron creciendo entre el día de la inoculación y el día 8. Posteriormente el tamaño medio de los tumores disminuyó, alcanzando un 65% hacia el día 49. El tamaño medio de los tumores de los ratones tratados con tampón (4 en total) aumentó durante la duración del experimento, alcanzando un 300% del volumen original del tumor hacia el día 49.

Se utilizó el mismo protocolo experimental para analizar el virus CN716 en tumores LNCaP. Los ratones fueron inoculados con PBS + glicerol 10%, CN716 o CN702. Los tumores de los ratones tratados con tampón crecieron rápidamente y los ratones fueron sacrificados debido al gran tamaño de los tumores después de tres semanas. Los tumores tratados con CN702 continuaron creciendo durante dos semanas, posteriormente disminuyeron su tamaño hasta el 80% de su volumen original hacia el día 42. Los tumores tratados con CN716 permanecieron en su tamaño original durante una semana, posteriormente disminuyeron en tamaño hasta el 40% de su volumen original hacia el día 42. Al final del experimento, 2 de los 4 ratones tratados estaban curados de sus tumores.

Es evidente, a partir de los resultados anteriores, que los adenovirus pueden ser proporcionados como vehículos específicos para células huésped particulares, en las que los virus pueden ser defectuosos para la replicación o competentes para la replicación. Los virus pueden ser vehículos para la introducción de una amplia variedad de genes en las células huésped diana. Particularmente, empleando el elemento específico de la próstata, los genes tempranos esenciales para la replicación pueden ser modificados para que estén bajo el control de elementos de respuesta de las células prostáticas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTES: CALYDON, Inc.

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DELA INVENCIÓN: VECTORES VÍRICOS ESPECÍFICOS PARA UN TEJIDO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 40

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: FLEHR, HOHBACH, TEST, ALBRITTON Y HERBERT

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 4 Embarcadero Center, Suite 3400

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: San Francisco

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: California

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

ZIP: 94111-4187

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US96/

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE REGISTRO:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN SOBRE EL REPRESENTANTE/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: ROWLAND, Bertram I.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 20.015

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DEREFERENCIA/EXPEDIENTE: FP-62215-1-PC/BIR

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 415-494-8700

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 415-494-8771

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TELEX: 910 277299

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGCAAGCTT GGGCTGGG

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAGATCTA GAAATCTAGC TG

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAATTCCTGC AGTCTAGACA TATGGGCGCC GAT

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTGAATTCC TGCAGTTATG CGGTGACACG ATTTCCTG

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGACCTCGAG GTCTCCATGA GCTAC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTCGAGCT TCGGGATCCT GAG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGTCTTCAA GAATTCTCA

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTCAGTCAC CGGTGTCGGA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCATTCTCTA GACACAGGTG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCGACACCG GGTGACCTGA AA

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 29 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATTAACCGG TACCTCTAGA AAATCTAGC

\hfill

29

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATTAACCGG TAAGCTTGGG GCTGGGG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGCTCGAGA TCACACTCCG CCACAC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCGCTCGAGC ACTCTTGAGT GCCA

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 156 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :15:

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 156 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :16:

\vskip1.000000\baselineskip

8

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGAAGATCTG AAATCTAGCT GATATAG

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTCTCGAGAA GCTTGGGGCT GGGG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCGACGTGA AATCTGAATA ATTTTGTGTT ACTCATAGC

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CACCGGCGCA CACCAAAAAC GTC

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGTCTTCAA GAATTCTCA

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCCCACGGCC GCATTATATA C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTATATAATG CGGCCGTGGG C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :24:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCAGAAAATC CAGCAGGTAC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :25:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAACGGCCGT CTAGAAATCT AGCTGA

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :26:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAACGGCCGA AGCTTGGGCT GGG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :27:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAACTCACGT TGTGCATTGT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :28:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGTGCCGTGC TCGAGTGGTG T

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 21 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :29:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ACACCACTCG AGCACGGCAC C

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :30:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCTACTATTC GACAGTTTGT ACTG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :31:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGACCTCGAG GTCTCCATGA GCTAC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 23 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :32:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGCTCGAGCT TCGGGATCCT GAG

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :33:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGTCGACGT ACCTCTAGAA ATCTAGC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :34:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGTCGACAA GCTTGGGGCT GGGG

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :35:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTTTGTGTAT TTTAGATCAA AGATGCTGCA

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :36:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCATCTTTGA TCTAAAATAC ACAAAC

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 30 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :37:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAAAGGAGGA GATCTGCCTA AAACACTGCA

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :38:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTGTTTTAGG CAGATCTCCT CCTTT

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº :39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 43 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :39:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCAACCCACC GGTGCTAATC AAGTATGGCA AAGGAGTAAG CGC

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:40:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE HEBRA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESCRIPCIÓN: /desc = "Cebador"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº :40:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGGCCTTGCT AGACTGCTCC TTCAGC

\hfill

26

Claims (12)

1. Un vector adenovírico competente para la replicación para introducir efectos citotóxicos en una célula diana, que comprende un gen del adenovirus esencial para la propagación adenovírica bajo el control transcripcional de un elemento de respuesta del antígeno prostático específico (PSA), en el que dicho elemento de respuesta del antígeno prostático específico (PSA) contiene un promotor del antígeno prostático específico seleccionado del grupo que consta de los nucleótidos -540 a +8, -532 a +11 y -230 a +7 con relación al sitio de inicio de la transcripción del gen del antígeno prostático específico, en combinación con un intensificador del antígeno prostático específico (PSA) seleccionado del grupo que consta de los nucleótidos -5322 a -3739, -5322 a -3875 y -5322 a -4023, con relación al sitio de inicio de la transcripción del gen del antígeno prostático específico, en el que dicha célula diana expresa el antígeno prostático específico (PSA).

2. Un vector adenovírico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho promotor del PSA comprende los nucleótidos -532 a +11.

3. Un vector adenovírico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho promotor del PSA comprende los nucleótidos -540 a +8.

4. Un vector adenovírico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho intensificador del PSA comprende los nucleótidos -5322 a -3739.

5. Un vector adenovírico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho gen del adenovirus es un gen temprano.

6. Un vector adenovírico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que contiene además un transgén bajo el control transcripcional de un elemento de respuesta específico de las células diana.

7. Un vector adenovírico de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el transgén es citotóxico.

8. Un vector adenovírico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde dicho vector adenovírico tiene una deleción en al menos una región entre los nucleótidos 300 a 3600 y 27000 a 31000 del adenovirus.

9. Una célula transformada con un vector adenovírico de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Un método in vitro para propagar un adenovirus específico para células de mamífero que expresen el antígeno prostático específico, comprendiendo dicho método:

la combinación de un vector adenovírico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 con células de mamífero que expresen el antígeno prostático específico, mediante lo cual se propaga dicho adenovirus.

11. Un método in vitro para conferir citotoxicidad selectiva a una célula tumoral que exprese el antígeno prostático específico (PSA), comprendiendo dicho método la introducción del vector adenovírico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en una célula tumoral que exprese el antígeno prostático específico (PSA), en la que la introducción del vector adenovírico tiene como resultado citotoxicidad.

12. La utilización de un vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de neoplasias en las que estén implicadas células tumorales que expresen el antígeno prostático específico (PSA).