ES2237114T3 - Controles de coagulacion para ensayos de tp y ttpa. - Google Patents
Controles de coagulacion para ensayos de tp y ttpa.Info
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Abstract
Composición control de la coagulación para determinar el tiempo de protrombina (TP) o el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA), comprendiendo el control de la coagulación: plasma de mamífero no primate y plasma de primate, siendo la razón de plasma de mamífero no primate con respecto a plasma de primate dentro del intervalo de 1:200 a 1:5; y un anticoagulante.
Description
Controles de coagulación para ensayos de TP Y
TTPA.
La presente invención se refiere generalmente a
ensayos diagnósticos de coagulación y, específicamente, a muestras
control adecuadas para su uso en relación con los mismos. La
invención se refiere particularmente a controles de coagulación
adecuados tanto para ensayos de tiempo de protrombina como de tiempo
de tromboplastina parcial activada.
Los materiales de control de la coagulación se
utilizan en el laboratorio clínico para el control de calidad de los
ensayos de tiempo de protrombina (TP) y tiempo de tromboplastina
parcial activada (TTPA). Los ensayos de TP emplean reactivos de
tromboplastina y se han utilizado ampliamente para evaluar la
coagulación sanguínea asociada con la vía extrínseca. Los ensayos de
TTPA emplean un activador de vía intrínseca, tal como sílice
micronizada, y un componente fosfolípido de un reactivo de
tromboplastina (sin la proteína factor tisular) para evaluar la
coagulación asociada con la vía intrínseca. Tanto los ensayos de TP
como los de TTPA se utilizan clínicamente para detectar en el plasma
de los pacientes déficit de factores de coagulación. Las detecciones
clínicas se emplean, por ejemplo, durante las revisiones de rutina y
antes de la cirugía. Los ensayos de TP y TTPA también se utilizan
para monitorizar el tratamiento con anticoagulantes. Por ejemplo,
los ensayos de TP se emplean habitualmente para monitorizar el
tratamiento anticoagulante oral con cumarina (Warfarin®, Coumadin®),
y los ensayos de TTPA se utilizan normalmente para monitorizar el
tratamiento anticoagulante con heparina.
Los controles de coagulación se utilizan para las
evaluaciones de control de calidad de los sistemas de ensayo de TP y
TTPA. Los controles son esenciales en vista de la variación
potencial en los reactivos empleados en estos ensayos, las
inexactitudes potenciales en los dispositivos utilizados para medir
el tiempo de coagulación y los efectos potenciales de dosis
inexactas de anticoagulante. Los controles de coagulación
comerciales se han diseñado para imitar tres estados fisiológicos:
(a) "Nivel de control I": los controles imitan la coagulación
normal y están pensados para que sean representativos de un
individuo sin deficiencias de coagulación; (2) "Nivel de control
II": los controles están pensados para imitar la coagulación de
un individuo que está sometido a tratamiento anticoagulante suave; y
(3) "Nivel de control III": los controles están pensados para
imitar la coagulación de un individuo que está sometido a
tratamiento anticoagulante relativamente fuerte.
Se conocen en la técnica diversos tipos de
controles de coagulación. Normalmente, los controles de coagulación
se diseñan para que sean adecuados para su uso con (1) ensayos tanto
de TP como de TTPA, (2) ensayo de TP únicamente o (3) ensayo de TTPA
únicamente. Los controles diseñados exclusivamente para su uso en la
evaluación únicamente del ensayo de TTPA se denominan en la técnica
controles de heparina. Aunque son eficaces para los ensayos de TTPA,
tales controles son ineficaces para su uso en la evaluación de los
sistemas de ensayo de TP. La presente invención se refiere a los
controles de coagulación en general que pueden emplearse para
evaluar tanto los sistemas de ensayo de TP como los de TTPA.
Un criterio de rendimiento primario para el
control de la coagulación es su estabilidad a lo largo del tiempo.
Zucker y col., informaron de que los controles de coagulación
preparados mediante el tamponamiento de muestras de plasma con ácido
N-2-hidroxietilpiperazin-N'-2-etanosulfónico
(HEPES) y la liofilización, proporcionaron estabilidad en el control
reconstituido durante ocho horas a 25ºC. Zucker y col.,
Preparation of Quality Control Specimens for Coagulation, Am. J.
Clin. Path. 53:924-927 (1970). Brozovic y sus
colaboradores prepararon controles a partir de muestras de plasma de
pacientes que tomaban tratamiento anticoagulante oral en combinación
con HEPES, citrato de trisodio y aprotinina, y notificaron
estabilidad de 4 horas a 6 horas tras la reconstitución cuando se
almacenaba a 4ºC. Brozovic y col., Stability of
Freeze-Dried Plasma Prepared from Patients on Oral
Anticoagulants, J. Clin. Path., 26:857-863
(1973). La patente de los EE.UU. número 5.721.140 concedida a Speck
y col. describe un control de coagulación que comprende
plasma humano normal, plasma de mamífero no primate con déficit de
factores de coagulación y aprotinina, y notifican que los controles
son estables en ausencia de un tampón durante hasta cinco días.
Otras numerosas patentes y referencias bibliográficas describen
diversos controles de coagulación. Patentes ejemplos incluyen la
patente de los EE.UU. número 3.947.378 concedida a Babson, la
patente de los EE.UU. número 4.007.008 concedida a Becker y
col., la patente de los EE.UU. número 4.056.484 concedida a
Heimburger y col., y la patente de los EE.UU. número
4.127.502 concedida a Li Mutti y col.
Aunque se han notificado en la técnica muchas
variaciones en las composiciones control de coagulación, tales
controles siguen siendo limitados con respecto a la estabilidad,
particularmente una vez reconstituidos a partir de la forma
liofilizada en la que se venden normalmente. Los controles de
coagulación reconstituidos comercialmente disponibles almacenados
durante más de aproximadamente ocho horas no proporcionan tiempos de
coagulación constantes y reproducibles, tal como se determina por
los ensayos de TP y/o TTPA. Además, se han observado precipitados y
fibrina en tales controles reconstituidos. Por tanto, sigue habiendo
una necesidad de controles de coagulación adecuados para su uso en
relación con los ensayos de TP y TTPA que tengan una estabilidad
mejora-
da.
da.
Por tanto, es un objeto de la presente invención
preparar controles de coagulación que tengan una estabilidad
mejorada a lo largo del tiempo, demostrada por tiempos de
coagulación constantes en los ensayos de TP y TTPA y por la ausencia
de formación de material particulado y/o de fibrina. También es un
objeto de la invención poder producir tales controles, a escala
comercial, usando materiales de partida fácilmente disponibles,
equipo de tratamiento convencional y las Buenas Prácticas de
Fabricación (GMP) existentes de la Food and Drug Administration
(FDA) de los EE.UU.
Por tanto, en resumen, la presente invención se
refiere a controles de coagulación adecuados para su uso en
relación con los ensayos de tiempo de protrombina (TP) y tiempo de
tromboplastina parcial activada (TTPA). El control de coagulación
comprende plasma y un anticoagulante que tiene actividad para
potenciar la actividad de la antitrombina III (ATIII) y/o del
cofactor II de la heparina (CIIH) frente a trombina y/o frente a
factores de coagulación sanguínea tales como los factores IXa, Xa
y/o XIa. El plasma incluye preferiblemente plasma de primate y un
plasma de mamífero no primate. El anticoagulante es preferiblemente
un glucosaminoglucano tal como la heparina.
Según la presente invención, se proporciona una
composición control de la coagulación para determinar el tiempo de
protrombina (TP) o el tiempo de tromboplastina parcial activada
(TTPA), comprendiendo el control de coagulación:
plasma de mamífero no primate y plasma de
primate, estando la razón de plasma de mamífero no primate con
respecto al plasma de primate dentro del intervalo de 1:200 a
1:5;
y un anticoagulante.
La invención se refiere además a un control de
coagulación que comprende plasma de primate, plasma de mamífero no
primate y un anticoagulante tal como un glucosaminoglucano que tiene
actividad tal como se describió anteriormente, oscilando la
concentración de anticoagulante desde aproximadamente 0,01 U/ml
hasta aproximadamente 0,15 U/ml, y preferiblemente desde
aproximadamente 0,01 U/ml hasta aproximadamente 0,1 U/ml, donde U
es unidades equivalentes de heparina. El plasma humano puede ser
plasma humano normal o un plasmo humano anómalo, tal como un plasma
activado o un plasma con déficit de factores. El plasma de mamífero
no primate es preferiblemente plasma bovino. El glucosaminoglucano
es preferiblemente heparina, un derivado de heparina o un análogo de
heparina. Un control de coagulación de Nivel I preferido comprende
plasma humano normal, plasma bovino, heparina o un derivado de
heparina y, opcionalmente, plasma activado, y tiene un tiempo de
protrombina que oscila desde aproximadamente 11 segundos hasta
aproximadamente 13 segundos. Un control de coagulación de Nivel II
preferido comprende plasma humano con déficit de factores, plasma
humano normal, plasma bovino y heparina o un derivado de heparina y
tiene un tiempo de protrombina que oscila desde aproximadamente 17
segundos hasta aproximadamente 22 segundos. Un control de
coagulación de Nivel III preferido comprende plasma humano con
déficit de factores, plasma humano normal, plasma bovino y heparina
o un derivado de heparina y tiene un tiempo de protrombina que
oscila desde aproximadamente 25 segundos hasta aproximadamente 33
segundos. Cada uno de los tiempos de protrombina anteriormente
mencionados se determina utilizando un reactivo de tromboplastina
que tiene un valor de Índice de Sensibilidad Internacional (ISI) de
aproximadamente 2.
La invención también se refiere a un control de
coagulación, normalmente en forma liofilizada, que es adecuado para
la reconstitución para el uso en relación con los ensayos de tiempo
de protrombina (TP) y tiempo de tromboplastina parcial activada
(TTPA). El control de coagulación liofilizado comprende plasma de
primate, plasma de mamífero no primate y un anticoagulante, tal
como un glucosaminoglucano que tiene actividad tal como la descrita
anteriormente y está presente en la composición a una concentración
que oscila desde aproximadamente 0,1 U/g hasta aproximadamente 1,8
U/g, en una base en peso seco, donde U son unidades equivalentes de
heparina.
La invención se refiere además a un control de
coagulación que comprende plasma humano y plasma de mamífero no
primate, oscilando la razón de plasma de mamífero no primate con
respecto al plasma humano desde aproximadamente 1:200 hasta
aproximadamente 1:5 y, preferiblemente, desde aproximadamente 1:50
hasta aproximadamente 1:20. Cuando el control de coagulación es una
disolución, la cantidad de plasma de mamífero no primate en la
disolución oscila preferiblemente desde aproximadamente el 0,5%
hasta aproximadamente el 12%, en volumen.
La invención se refiere también a métodos para
preparar tales controles de coagulación. Según un método, se
combinan plasma de primate, plasma de mamífero no primate y un
anticoagulante tal como un glucosaminoglucano y que tiene actividad
tal como se describió anteriormente, para formar una disolución
control que tiene una concentración de anticoagulante que oscila
desde aproximadamente 0,01 U/ml hasta aproximadamente 0,15 U/ml y,
preferiblemente desde aproximadamente 0,01 U/ml hasta
aproximadamente 0,1 U/ml. Preferiblemente, el plasma humano y el
plasma bovino se combinan con un tampón heparinizado directamente
tras la descongelación para formar disolución de plasma
heparinizado que puede combinarse posteriormente para formar
disoluciones control. Según otro método independiente pero
complementario, se prepara una composición control de coagulación
combinando plasma humano y plasma de mamífero no primate para
formar una disolución control que tiene plasma de mamífero no
primate en una cantidad que oscila desde aproximadamente el 0,5%
hasta aproximadamente el 12% en volumen.
Aspectos preferidos de la invención incluyen
adicionalmente aquellos métodos en los que el plasma de mamífero no
primate es un plasma bovino purificado. En estos métodos, se prepara
o se obtiene plasma bovino congelado (por ejemplo, a partir de
fuentes comerciales), se descongela en un entorno (por ejemplo, un
refrigerador) mantenido a una temperatura que oscila desde
aproximadamente 2ºC hasta aproximadamente 8ºC para permitir que las
partículas se formen y salgan de la disolución, y después se trata
para eliminar las partículas del plasma bovino descongelado. La
congelación y la descongelación a temperatura fría se repite
preferiblemente al menos una vez.
La invención se refiere además a métodos para
evaluar un sistema de ensayo de TP o TTPA. Tales métodos de control
de calidad generalmente incluyen combinar un reactivo de TP o un
reactivo de TTPA con controles de coagulación para formar una
disolución de ensayo, detectar la formación de coágulos en la
disolución del ensayo y determinar el tiempo transcurrido desde la
formación de la disolución del ensayo hasta la detección de la
formación del coágulo en la disolución del ensayo. Puede realizarse
entonces una comparación de los tiempos determinados con los tiempos
objetivo para el control particular que se está evaluando. Para la
evaluación de un sistema de ensayo de TP, el control de coagulación
comprende un plasma y un anticoagulante que tiene actividad para
potenciar la actividad de la antitrombina III (ATIII) y/o el
cofactor II de la heparina (CIIH) frente a trombina y/o frente a
factores de coagulación sanguínea tales como los factores IXa, Xa
y/o XIa. El anticoagulante es preferiblemente un glucosaminoglucano
y más preferiblemente heparina, un derivado de heparina o un análogo
de heparina. Para la evaluación de los sistemas de ensayo de TP o
TTPA, el control de coagulación comprende un plasma anómalo y
anticoagulante tales como glucosaminoglucano que tiene actividad tal
como se describió anteriormente. Alternativamente, el control de
coagulación utilizado para el control de calidad de los sistemas de
ensayo de TP o TTPA comprende un plasma de primate, un plasma de
mamífero no primate y un anticoagulante tal como un
glucosaminoglucano que tiene actividad tal como se describió
anteriormente.
Los controles de coagulación y métodos de la
presente invención ofrecen ventajas significativas con respecto a
los materiales y métodos de control de la técnica anterior. Los
controles descritos y reivindicados en el presente documento tienen
estabilidad excepcional en la forma reconstituida, incluso cuando se
preparan en instalaciones de producción comercial a gran escala. Los
controles pueden prepararse a partir de materiales fácilmente
disponibles, utilizando equipo convencional, según las buenas
prácticas de fabricación de la FDA. Como tales, los controles de
coagulación de la invención ofrecen una alternativa comercialmente
atractiva a los controles de coagulación existentes para su uso en
relación con los ensayos de TP y TTPA.
Otras características, objetos y ventajas de la
presente invención serán en parte evidentes para los expertos en la
técnica y en parte se indicarán más adelante en el presente
documento. Todas las referencias citadas en la presente memoria
descriptiva se incorporan como referencia. Además, dado que
bibliografía de patentes y distinta a patentes relacionada con el
contenido descrito y/o reivindicado en el presente documento es
sustancial, muchas referencias relevantes están disponibles para el
experto en la técnica que proporcionarán instrucciones adicionales
con respecto a tal contenido.
La figura 1 es una representación gráfica de los
datos de estabilidad del tiempo de protrombina (TP) para los
controles de coagulación de Nivel I, Nivel II y Nivel III preparados
según los métodos de la presente invención y almacenados, tras su
reconstitución, a 2-8ºC. Los datos se recogieron en
un analizador de coagulación Amelung AMAX CS-190
utilizando un reactivo de TP con un valor ISI de 2,0 (Sigma
ThromboMAX®) basado en ensayos ópticos (figura 1A) y mecánicos
(figura 1B).
La figura 2 es una representación gráfica de los
datos de estabilidad del tiempo de tromboplastina parcial activada
(TTPA) para los controles de coagulación de Nivel I, Nivel II y
Nivel III preparados según los métodos de la presente invención y
almacenados, tras su reconstitución, a 2-8ºC. Los
datos se recogieron en un analizador de coagulación Amelung AMAX
CS-190 utilizando un reactivo de TTPA que es
moderadamente sensible a la heparina y a anticoagulante lúpico
(Sigma TTPA-FSL). Se realizaron determinaciones
ópticas (figura 2A) y mecánicas (figura 2B).
En la presente invención se preparan controles de
coagulación que tienen estabilidad mejorada a lo largo del tiempo
(tal como se demuestra por los tiempos de coagulación constantes en
los ensayos de TP y TTPA y por la ausencia sustancial de material
particulado y/o de fibrina) mediante la adición de un agente que
tiene actividad anticoagulante a uno o más plasmas que se están
utilizando en las composiciones control. Los plasmas son bastante
inestables debido a su gran número de enzimas y su naturaleza
compleja. Como tal, el anticoagulante se añade preferiblemente
pronto en el procedimiento de producción para mitigar cualquier
activación de esas enzimas que se producen intrínsecamente durante
los procedimientos de producción. Tal enfoque es un avance
significativo en la técnica, particularmente para producir controles
de coagulación a escala comercial. Las manipulaciones que conllevan
los procedimientos de producción a gran escala hasta ahora no se
reconocían en la técnica como un factor causante de las
inestabilidades observadas en los controles de coagulación. Además,
hasta ahora la técnica no ha ofrecido una solución a este
problema.
Por tanto, según un aspecto de la invención, se
prepara una composición control de coagulación adecuada para su uso
en relación con los ensayos de TP y/o TTPA, combinando un plasma y
un anticoagulante. Preferiblemente, se combina un plasma de primate
(por ejemplo, plasma humano) y un plasma de mamífero no primate (por
ejemplo, plasma bovino) con un anticoagulante. Los anticoagulantes
preferidos son aquellos que tienen actividad para potenciar la
actividad de la antitrombina III (ATIII) y/o del cofactor II de la
heparina (CIIH) frente a trombina y/o frente a factores de
coagulación sanguínea tales como los factores IXa, Xa y/o XIa. El
anticoagulante es preferiblemente un glucosaminoglucano, tal como
heparina, un derivado de heparina y/o un análogo de heparina que
tiene actividad anticoagulante. Véase el ejemplo 1. Sin vincularse a
la teoría no citada específicamente en las reivindicaciones, los
anticoagulantes glucosaminoglucanos son ventajosos con respecto a
otros restos que afectan a la coagulación tales como los inhibidores
de proteasas, debido a las diferencias en sus mecanismos de
anticoagulación. Mientras que los inhibidores de proteasas, tales
como la aprotinina, funcionan directamente para inhibir factores de
coagulación sanguínea particulares, los anticoagulantes
glucosaminoglucanos, tales como la heparina, los derivados de
heparina y los análogos de heparina, funcionan indirectamente,
mediándose su efecto inhibidor sobre los factores de coagulación
sanguínea a través de intermediarios tales como antitrombina III
(ATIII) y/o el cofactor II de la heparina (CIIH). Como tales, los
anticoagulantes glucosaminoglucanos tienen un efecto más sutil, pero
todavía son eficaces contra un amplio espectro de factores de
coagulación sanguínea. Por tanto, los agentes de anticoagulación
glucosaminoglucanos son particularmente útiles para mejorar la
estabilidad de las composiciones control.
Según otro aspecto de la invención, el plasma
humano se combina con cantidades relativamente pequeñas de plasma de
mamífero no primate, en comparación con las composiciones conocidas.
Específicamente, las composiciones control de la coagulación se
preparan combinando plasma humano y no más de aproximadamente el 12%
en volumen de plasma de mamífero no primate y, preferiblemente,
desde aproximadamente el 0,5% hasta aproximadamente el 12% en
volumen. El empleo de al menos algo de plasma de mamífero no primate
en el control de la coagulación ofrece un enfoque ventajoso para
controlar los tiempos de TP y TTPA, tal como se describe con más
detalle más adelante. Ventajosamente, las composiciones que tienen
aproximadamente el 12% o menos de plasma de mamífero no primate
permanecen estables con respecto a los ensayos de TP y TTPA. Sin
embargo, las composiciones que tienen más del 12% de plasma de
mamífero no primate son inestables con respecto al ensayo de TP.
Tal como se usa en el presente documento, el
término "plasma" generalmente se refiere a una disolución que
comprende proteínas y que tiene actividad procoagulante cuando se
combina con un reactivo de tiempo de protrombina (TP) o con un
reactivo de tromboplastina parcial activada (TTPA). Las proteínas en
el plasma incluyen preferiblemente: factores de coagulación
sanguínea relacionados con la vía extrínseca (por ejemplo, el factor
VII) y/o con la vía intrínseca (por ejemplo, factores XII, XI, IX
y/u VIII); factores de coagulación sanguínea comunes para ambas vías
(por ejemplo, factores X, II y/o V); trombina; y fibrinógeno. El
plasma también incluye preferiblemente otras proteínas plasmáticas,
azúcares y/o sales. El plasma puede ser el plasma total que se
obtiene de los humanos u otros animales. El plasma también puede ser
un derivado de plasma que tiene actividad procoagulante y que se
deriva de uno o más plasmas totales. El derivado de plasma puede
ser, por ejemplo, una fracción plasmática o un plasma que se ha
purificado o, en cualquier caso, se ha tratado para eliminar algunas
proteínas, azúcares, sales y otros componentes del mismo. El plasma
puede ser alternativamente un plasma sustituto formado por
componentes obtenidos de fuentes separadas, incluyendo los
componentes naturales o artificiales, y que tienen actividad
procoagulante. Componentes artificiales ejemplo incluyen proteínas
plasmáticas que se aíslan sustancialmente y/o se purifican a partir
de fuentes naturales y proteínas plasmáticas que se preparan usando
tecnología recombinante. Los plasmas totales, los derivados de
plasma y los sustitutos de plasma están comercialmente disponibles
y/o pueden prepararse usando los métodos conocidos en la actualidad
y/o desarrollados posteriormente en la técnica.
Un plasma preferido en el control de la
coagulación es un plasma de primate, y preferiblemente un plasma
humano. El plasma de primate puede ser un plasma de primate normal o
un plasma de primate anómalo. Los plasmas de primate normales, tales
como los plasmas humanos normales (PHN) son plasmas obtenidos de
individuos u otros primates sin deficiencias en la coagulación. Si
se evalúan utilizando un ensayo de TP con un reactivo de
tromboplastina que tiene un Índice de Sensibilidad Internacional de
aproximadamente 2, los plasmas humanos normales tendrían
preferiblemente un tiempo de coagulación que oscilaría desde
aproximadamente 9 segundos hasta aproximadamente 14 segundos,
preferiblemente desde aproximadamente 11 segundos hasta
aproximadamente 13 segundos y, más preferiblemente, sería de
aproximadamente 12 segundos. Si se evalúan utilizando un ensayo de
TTPA usando un reactivo de TTPA que es moderadamente sensible a la
heparina y al anticoagulante lúpico (por ejemplo, Sigma
TTPA-FSL, Sigma Chemical, St. Louis, MO) y un
analizador de coagulación adecuado (por ejemplo, Amelung AMAX
CS-190), los plasmas humanos normales tendrían
preferiblemente un tiempo de coagulación que oscilaría desde
aproximadamente 22 segundos hasta aproximadamente 32 segundos. Los
plasma de primate normales se tratan normalmente con un
anticoagulante tal como citrato en su extracción y luego se congelan
a una temperatura que oscila desde aproximadamente -50ºC hasta
aproximadamente -100ºC para el almacenamiento. Si se emplean plasmas
de primate normales congelados como materiales de partida, se
descongelan preferiblemente en un entorno (por ejemplo, tal como un
baño de agua) a una temperatura de aproximadamente 37ºC antes de su
uso en relación con la presente invención. Los plasmas de primate
normales son preferiblemente plasmas de primate normales reunidos,
preparados mediante la reunión de al menos aproximadamente 5,
preferiblemente de al menos aproximadamente 10 muestras de plasma
obtenidas de individuos u otros primates sin deficiencias en la
coagulación. Los plasmas de primate normales pueden reunirse antes
de la congelación o, si se congelan antes de la reunión, tras la
descongelación.
En general, un plasma anómalo puede ser cualquier
plasma que sea deficiente con respecto al tiempo de coagulación, en
comparación con un plasma normal. La deficiencia puede ser un
aumento del tiempo de coagulación o una disminución del tiempo de
coagulación, con relación al plasma normal. Un plasma anómalo puede
ser un plasma recogido de individuos, otros primates o mamíferos no
humanos, que tienen deficiencias de coagulación que se producen
naturalmente o que están sometidos a tratamiento anticoagulante. Sin
embargo, el plasma anómalo también puede tener deficiencias en la
coagulación que se inducen artificialmente mediante el tratamiento
del plasma in vitro utilizando métodos conocidos en la
técnica.
Ejemplos de plasmas anómalos incluyen pasmas
activados (que tienen normalmente tiempos de coagulación inferiores
a lo normal y empleados en una composición control de la coagulación
para disminuir el tiempo de coagulación en el control) y plasmas con
déficit de factores (que tienen normalmente tiempos de coagulación
superiores a lo normal y que se emplean en una composición control
de la coagulación para aumentar el tiempo de coagulación del
control). Tal como se usa en el presente documento, el término
"plasma activado" se refiere a un plasma anómalo que tiene
niveles aumentados del factor de coagulación Xa con respecto al
plasma normal. Un plasma activado puede ser plasma humano o plasma
no humano, tal como plasma de primate no humano o plasma de mamífero
no primate. Un plasma humano activado es un plasma activado
preferido. El plasma activado puede activarse para la vía extrínseca
(por ejemplo, usando tromboplastina y/u otros agentes de activación
de la vía extrínseca conocidos) y/o para la vía intrínseca (por
ejemplo, mediante la exposición del plasma a agentes de activación
de la vía intrínseca, tal como restos cargados negativamente con un
gran área superficial). Ejemplos de agentes de activación de la vía
intrínseca incluyen sales de ácido orgánico, tales como sales de
ácido elágico y muestras que contienen sílice tales como sílice
micronizada, caolín, Celite y lana de vidrio. El plasma activado es
preferiblemente un plasma activado con lana de vidrio. Tal como se
usa en el presente documento, el término "plasma con déficit de
factores" se refiere a un plasma anómalo que tiene un déficit de
uno o más de los factores de coagulación seleccionados del grupo que
consiste en el factor II, el factor VII, el factor IX y/o el factor
X. Los plasmas con déficit de factores pueden producirse
naturalmente y obtenerse mediante la extracción a partir de
individuos u otros mamíferos o, alternativamente, pueden inducirse
in vitro eliminando los factores de coagulación del plasma
normal mediante métodos conocidos en la técnica. En un enfoque
preferido, los plasmas con déficit de factores se preparan poniendo
en contacto el plasma con absorbentes tales como hidróxido de
aluminio, cloruro de bario, citrato de bario, y/o sulfato de bario,
entre otros. También pueden emplearse otros métodos para preparar
plasmas con déficit de factores. Por ejemplo, un plasma con déficit
de factor VII puede prepararse usando anticuerpos
anti-factor VII y protocolos de purificación de
inmunoafinidad.
El plasma de primate, preferiblemente un plasma
humano, está presente generalmente en una disolución control de la
coagulación en una cantidad que oscila desde aproximadamente el 25%
hasta aproximadamente el 99,55%, más preferiblemente en una cantidad
que oscila desde aproximadamente el 50% hasta aproximadamente el
99,5%, incluso más preferiblemente en una cantidad que oscila desde
aproximadamente el 75% hasta aproximadamente el 99,5% y, más
preferiblemente, en una cantidad que oscila desde aproximadamente el
78% hasta aproximadamente el 99,5% en volumen, en relación con el
volumen de disolución total. La cantidad particular de plasma de
primate (por ejemplo, humano) dependerá, tal como se trata más
adelante, de los tipos y de la calidad de los plasmas de primate
(por ejemplo, plasmas normales y/o anómalos), en presencia de otros
tipos de plasmas (por ejemplo, plasmas de mamíferos no primates), y
del tipo de composición de control que se está preparando (por
ejemplo, Nivel I, II o III).
Otro plasma preferido en el control de la
coagulación es un plasma de mamífero no primate. Los plasmas de
mamífero no primate preferidos para su uso en relación con la
presente invención incluyen plasma bovino, plasma porcino, plasma de
cabra, plasma de oveja, plasma equino y plasma de conejo, entre
otros. El plasma bovino es el plasma de mamífero no primate más
preferido. El plasma de mamífero no primate es preferiblemente un
plasma normal, pero puede ser también un plasma anómalo, tal como un
plasma con déficit de factores y/o un plasma activado. El plasma
bovino normal y los plasmas normales de otros mamíferos no primates
se obtienen normalmente de animales sin deficiencias en la
coagulación y puede añadírseles citrato en su extracción, pueden
reunirse y/o congelarse para el almacenamiento.
Los plasmas de mamíferos no primates se purifican
preferiblemente antes de su uso en relación con la presente
invención. El plasma de mamífero no primate congelado, tal como el
plasma bovino congelado, se prepara o se obtiene, por ejemplo, a
partir de una fuente comercial. El plasma congelado se descongela
luego en un entorno mantenido a una temperatura que oscila desde
aproximadamente 2ºC hasta aproximadamente 8ºC. Ciertos
constituyentes del plasma (por ejemplo, las proteínas plasmáticas)
no son solubles en estas temperaturas frías y, como tal, quedarán
fuera de la disolución, como materiales precipitados y/o
particulados. Los materiales particulados formados en el plasma
descongelado se eliminan después del mismo mediante cualquier medio
adecuado de separación, tal como filtración o centrifugación. Estas
etapas de congelación y descongelación se repiten después
preferiblemente al menos una vez y, preferiblemente, dos o más
veces, volviendo a congelar el plasma parcialmente purificado,
volviendo a descongelar el plasma congelado de nuevo a una
temperatura que oscila desde aproximadamente 2ºC hasta
aproximadamente 8ºC, y después eliminando cualquier partícula
adicional formada en el plasma descongelado de nuevo.
Ventajosamente, el plasma de mamífero no primate purificado
resultante está libre de constituyentes (por ejemplo, proteínas
plasmáticas) que son insolubles a temperaturas inferiores.
Significativamente, la descongelación a las temperaturas frías
citadas permite la eliminación de estos materiales particulados
antes de la liofilización. Si el plasma congelado se descongelaran a
temperaturas superiores, esos materiales particulados habrían
permanecido en disolución y se habrían incluido en la composición
liofilizada. Cuando tal composición liofilizada se reconstituyera
posteriormente, muchos de estos materiales particulados no se
volverían a solubilizar y, por tanto, habrían estado presentes de
manera indeseable como materiales particulados en la composición
control reconstituida.
El plasma de mamífero no primate está presente
generalmente en una disolución control de la coagulación en una
cantidad que oscila desde aproximadamente el 0,5% hasta
aproximadamente el 12%, más preferiblemente, en una cantidad que
oscila desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 10%,
incluso más preferiblemente en una cantidad que oscila desde
aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 8%, todavía más
preferiblemente en una cantidad que oscila desde aproximadamente el
1% hasta aproximadamente el 6%, todavía incluso más preferiblemente
en una cantidad que oscila desde aproximadamente el 2% hasta
aproximadamente el 5%, y lo más preferido en una cantidad que oscila
desde aproximadamente el 2% hasta aproximadamente el 4% en volumen,
en relación con el volumen total de la disolución. El plasma de
mamífero no primate está presente preferiblemente en una cantidad de
aproximadamente el 3% en volumen, en relación con el volumen total
de la disolución. Ventajosamente, el plasma de mamífero no primate,
y particularmente el plasma bovino, puede emplearse dentro de los
intervalos citados para controlar los tiempos TP y TTPA. Por
ejemplo, un aumento en la cantidad de plasma de mamífero no primate
dentro de los intervalos citados aumenta el TP, mientras que
disminuye el TTPA, y potencia la estabilidad del TTPA. Véase el
ejemplo 2. El uso de niveles relativamente bajos de plasma de
mamífero no primate en una composición control puede ser
independiente de, o complementario con, el uso de anticoagulantes
tales como los glucosaminoglucanos.
Los glucosaminoglucanos son heteropolisacáridos
que comprenden unidades repetidas de disacáridos que contienen un
residuo de hexosamina y un residuo de hexosa o ácido hexurónico. El
residuo de hexosamina puede ser una
N-acetilhexosamina. Cualquiera o ambos residuos
pueden estar sulfatados. Los glucosaminoglucanos preferidos incluyen
heparina, derivados de la heparina y/o análogos de la heparina. La
heparina es el glucosaminoglucano más preferido. La heparina puede
ser heparina no fraccionada, una heparina de alto peso molecular o
una heparina de bajo peso molecular, o combinaciones de varias
fracciones de heparina seleccionadas. El derivado de heparina puede
ser cualquier heteropolisacárido preparado a partir de heparina, o
sintetizado químicamente para comprender subunidades de disacárido
de tipo heparina, y que tiene actividad para potenciar la actividad
antitrombina de la antitrombina III (ATIII) y/o del cofactor II de
la heparina (CIIH). Los derivados de la heparina tienen
preferiblemente al menos aproximadamente cinco unidades de sacáridos
de longitud, más preferiblemente al menos aproximadamente ocho
unidades de sacáridos de longitud y lo más preferido, al menos
aproximadamente dieciocho unidades de sacáridos de longitud, y
también preferiblemente incluyen dominios de secuencia clave que
confieren la actividad anticoagulante al derivado de la heparina,
potenciando la interacción de antitrombina III (ATIII) con los
factores de coagulación IXa, Xa y/o XIa, y/o potenciando la
interacción de ATIII y/o el cofactor II de la heparina (CIIH) con
trombina. Véase Rosenberg y col., The
Heparin-Antithrombin System: A Natural Anticoagulant
Mechanism, Capítulo 41, págs. 837-860 del texto
Hemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice,
3ª Ed., ed. por R. Coleman y col., J.B. Lippincott Company,
Filadelfia (1994). Ejemplos de derivados de la heparina incluyen,
por ejemplo, heparina tratada con enzimas, tal como la heparina
tratada con condroitinasa descrita en la solicitud de patente en
tramitación junto con la presente U.S. 5985582 que es eficaz para
potenciar la actividad de la antitrombina III frente a la trombina,
pero que es menos eficaz que la heparina no modificada para
potenciar la actividad del cofactor II de la heparina frente a
trombina. Los análogos de la heparina preferidos incluyen heparán
sulfato, dermatán sulfatos, condroitín sulfatos, queratán sulfatos,
mesoglicano, sulodexida y ácido hialurónico. Los análogos de la
heparina también incluyen otros glucosaminoglucanos que tienen
actividad anticoagulante y, particularmente, que tienen actividad
para potenciar la actividad antitrombina de ATIII y/o CIIH, y/o para
potenciar la interacción entre ATIII y los factores de coagulación
IXa, Xa y/o XIa. La heparina y los análogos de la heparina pueden
obtenerse de muchas fuentes comerciales. Los derivados de la
heparina también pueden obtenerse comercialmente y/o prepararse
según los protocolos conocidos o desarrollados más tarde en la
técnica. Véase Oosta y col., Multiple Functional Domains of the
Heparin Molecule, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 78:829 (1981).
La concentración de anticoagulantes, tales como
los glucosaminoglucanos en una disolución control de la coagulación
oscila preferiblemente desde aproximadamente 0,01 U/ml hasta
aproximadamente 0,15 U/ml, más preferiblemente desde aproximadamente
0,01 U/ml hasta aproximadamente 0,1 U/ml, incluso más
preferiblemente desde aproximadamente 0,03 U/ml hasta
aproximadamente 0,07 U/ml y, lo más preferido de aproximadamente
0,05 U/ml, donde U son unidades equivalentes de heparina, tal como
se define más adelante, y ml son mililitros de la disolución control
de la coagulación. Estas concentraciones se citan como preferidas en
la disolución control tal como se utiliza, independientemente de si
la disolución es una disolución tal como se prepara o una disolución
reconstituida a partir de una composición sólida (por ejemplo,
liofilizada). La concentración correspondiente de glucosaminoglucano
en una composición sólida oscila preferiblemente desde
aproximadamente 0,1 U/g hasta aproximadamente 1,8 U/g, más
preferiblemente desde aproximadamente 0,3 U/g hasta aproximadamente
1,2 U/g, incluso más preferiblemente desde aproximadamente 0,4 U/g
hasta aproximadamente 0,8 U/g, y lo más preferido es de
aproximadamente 0,6 U/g, en una base en peso seco, donde U son
unidades equivalentes de heparina. Sin embargo, pueden emplearse
otras concentraciones en la composición sólida, con ajustes cuando
sea necesario para lograr una disolución control que tiene las
concentraciones preferidas citadas anteriormente de anticoagulantes
en la disolución control. Tal como se observa, las unidades, U, de
glucosaminoglucano se citan en el presente documento como unidades
equivalentes de heparina. Es decir, la unidad, U, representa la
cantidad de un anticoagulante dado (por ejemplo, glucosaminoglucano)
suficiente para tener una actividad anticoagulante, preferiblemente
una actividad anti-factor X, que sea aproximadamente
igual a la actividad del anticoagulante, preferiblemente la
actividad anti-factor X de la heparina no
fraccionada (HNF) normal en los valores numéricos citados. Por
tanto, para la heparina no fraccionada y para las fracciones de
heparina o derivados de la heparina que tienen la misma actividad
específica (en peso o en volumen según sea apropiado) que la
heparina no fraccionada, los valores numéricos citados representan
las unidades reales de la actividad de la heparina, U_{hep},
definiéndose una unidad de actividad de heparina según la Farmacopea
de los Estados Unidos (USP). Véase también Yin y col.,
Heparin-Accelerated Inhibition of Activated Factor X
by Its Plasma Inhibitor, Biochem. Biophys. Acts 201:387 (1970); Yin
y col., Plasma Heparin: A Unique, Practical Submicrogram
Sensitive Assay, J. Lab. Clin. Med., 81:298 (1973). Sin embargo, por
el contrario, para los análogos de la heparina, algunas fracciones
de la heparina, derivados de la heparina u otros anticoagulantes que
tengan una actividad específica diferente (en peso o en volumen,
según sea apropiado) que la de la heparina no fraccionada, las
cantidades de los mismos deben ser suficientes para realizar el
mismo nivel de actividad anticoagulante que realizaría la heparina
no fraccionada, si se utilizara HNF en los valores de concentración
citados. Las actividades anticoagulantes equivalentes se determinan
preferiblemente mediante un ensayo para determinar la actividad que
implica un sustrato que es común tanto a la heparina no fraccionada
como al glucosaminoglucano no HNF. Por ejemplo, si el
glucosaminoglucano es dermatán sulfato, la actividad equivalente a
la heparina puede determinarse utilizando un ensayo que determina la
actividad del glucosaminoglucano para el factor de coagulación
Xa.
La composición control de la coagulación incluye
otros componentes además del plasma de primate, el plasma de
mamífero no primate y el anticoagulante. Por ejemplo, la composición
control también incluye preferiblemente tampones y agentes de carga.
El tampón puede ser cualquier tampón adecuado y preferiblemente
tiene un pK_{a} que oscila desde aproximadamente 6 hasta 8, más
preferiblemente desde aproximadamente 7 hasta 8 y lo más preferido
desde aproximadamente 7,1 hasta aproximadamente 7,6. Los tampones
preferidos incluyen, por ejemplo, ácido
N-2-hidroxietilpiperazin-N-2-etanosulfónico
(HEPES) y ácido
3-(N-morfolino)-propanosulfónico
(MOPS), siendo HEPES el tampón más preferido. Otros tampones ejemplo
incluyen Tris, ácido
N,N-bis-(hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico
(BES), ácido
N-tris-(hidroximetil)-metil-2-aminoetanosulfónico
(TES), ácido
3-[N-tris(hidroximetil)metilamino]-2-hidroxipropanosulfónico
(TAPSO) y ácido
3-[N-tris-(hidroximetil-metilamino]-propanosulfónico
(TAPS), entre otros. La cantidad de tampón incluido puede basarse
generalmente en los tiempos TP y/o TTPA, y preferiblemente oscila
desde aproximadamente 20 mM hasta aproximadamente 200 mM, y lo más
preferido es de aproximadamente 50 mM en la disolución control. Los
agentes de carga que pueden incluirse en la composición control
incluyen glicina, glucitol, manitol, sorbitol, lactosa, dextrosa y
similares. La glicina es el agente de carga preferido. Los agentes
de carga se incluyen preferiblemente en una cantidad que oscile
desde aproximadamente el 0,5% hasta aproximadamente el 5% en peso y
lo más preferido es de aproximadamente el 1% en peso, en relación
con el peso total de la disolución, suponiendo una densidad de la
disolución de aproximadamente 1 g/ml. Es decir, el 1% de agente de
carga en peso equivale a 10 g de agente de carga por litro de
disolución. También pueden emplearse estabilizantes, conservantes y
otros componentes conocidos en la técnica en la composición control
de la coagulación. Los estabilizantes que pueden ser útiles
incluyen, por ejemplo, tampones de Goods, Tris, albúmina sérica
bovina (BSA), sal sódica 1.5 del ácido
piperazina-N,N-bis(2-etanosulfónico)
(PIPES), imidazol, ácido
3-(N-morfolino)-2-hidroxipropanosulfónico
(MOPSO), MOPS, BES, TES, HEPES, TAPSO, TAPS, ácido
3[N-bis(hidroxietil)amino]-2-hidroxipropanosulfónico
(DIPSO), ácido
piperazina-N,N'-bis(2-hidroxipropanosulfónico)
(POPSO), ácido
N-hidroxietil-piperazina-N'-2-hidroxipropanosulfónico
(HEPPSO), tricina y bicina. En la composición también pueden
incluirse conservantes que pueden ser útiles para evitar el
crecimiento de microorganismos, tales como composiciones
antifúngicas, antibacterianas y antilevaduras. Ejemplos de
conservantes incluyen ácidos orgánicos tales como ácido propiónico,
azida sódica, timerosal, HAB (hidroxianisol butilado), HTB
(hidroxitolueno butilado) y formulaciones con múltiples actividades
preformuladas, tal como ProClin®. Las concentraciones de estos
componentes adicionales de la composición pueden determinarse y
optimizarse por una persona experta en la técnica. La contribución
al volumen total de tales componentes adicionales a una disolución
control de la coagulación puede oscilar, en general, desde
aproximadamente el 0%-3%, y preferiblemente desde aproximadamente el
0%-2% en volumen, en relación con el volumen de disolución total.
Las composiciones control incluyen normalmente aproximadamente el 1%
de tales otros constituyentes, en volumen, en relación con el
volumen de disolución total.
El plasma de primate y el plasma de mamífero no
primate se combinan preferiblemente, en relación el uno con el otro,
en cantidades suficientes para lograr los tiempos de coagulación de
tiempo de protrombina (TP) y/o tiempo de tromboplastina parcial
activada (TTPA) deseados para los controles de Nivel I, Nivel II o
Nivel III, preferiblemente, pero no necesariamente, en una
composición final que incluye un glucosaminoglucano en los
intervalos de concentración citados anteriormente. En general, el
control de coagulación puede tener un TP que oscile desde
aproximadamente 9 segundos hasta aproximadamente 35 segundos, y un
TTPA que oscile desde aproximadamente 20 segundos hasta
aproximadamente 100 segundos. En particular, para una composición de
control de la coagulación de Nivel I, el TP oscila preferiblemente
desde aproximadamente 9 segundos hasta aproximadamente 14 segundos,
más preferiblemente desde aproximadamente 11 segundos hasta
aproximadamente 13 segundos, y lo más preferido es de
aproximadamente 12 segundos. El TTPA para un control de Nivel I
oscila preferiblemente desde aproximadamente 20 segundos hasta
aproximadamente 34 segundos, más preferiblemente desde
aproximadamente 22 segundos hasta aproximadamente 32 segundos, y lo
más preferido es de aproximadamente 30 segundos. Para un control de
coagulación de Nivel II, el TP oscila preferiblemente desde
aproximadamente 15 segundos hasta aproximadamente 25 segundos, más
preferiblemente desde aproximadamente 17 segundos hasta
aproximadamente 22 segundos, y lo más preferido es de
aproximadamente 20 segundos. El TTPA para un control de nivel II
oscila preferiblemente desde aproximadamente 40 segundos hasta
aproximadamente 60 segundos, más preferiblemente desde
aproximadamente 47 segundos hasta aproximadamente 53 segundos, y lo
más preferido es de aproximadamente 50 segundos. Para un control de
coagulación de Nivel III, el TP oscila preferiblemente desde
aproximadamente 25 segundos hasta aproximadamente 33 segundos, más
preferiblemente desde aproximadamente 27 segundos hasta
aproximadamente 31 segundos, y lo más preferido es de
aproximadamente 28 segundos. El TTPA para un control de Nivel III
oscila preferiblemente desde aproximadamente 70 segundos hasta
aproximadamente 100 segundos, más preferiblemente desde
aproximadamente 75 segundos hasta aproximadamente 85 segundos, y lo
más preferido es de aproximadamente 78 segundos. Cada uno de los
tiempos de ensayo de TP mencionados anteriormente se determinan
preferiblemente utilizando un reactivo de tromboplastina que tiene
un Índice de Sensibilidad Internacional (ISI) de aproximadamente 2,
tal como ThromboMAX® (Sigma, St. Louis, MO). Cada uno de los tiempos
de ensayo de TTPA mencionados anteriormente se determinan
preferiblemente utilizando un reactivo de TTPA que es moderadamente
sensible a heparina y a anticoagulante lúpico (Sigma
TTPA-FSL) como el reactivo de TTPA y utilizando un
analizador adecuado (por ejemplo, AMAX CS-190).
El plasma de primate y el plasma de mamífero no
primate se combinan generalmente, en relación el uno con el otro, de
manera que la razón de plasma de mamífero no primate con respecto al
plasma de primate oscila desde aproximadamente 1:200 hasta
aproximadamente 1:5, más preferiblemente oscila desde
aproximadamente 1:200 hasta aproximadamente 1:10 y lo más preferido,
oscila desde aproximadamente 1:50 hasta aproximadamente 1:20, en
volumen (para una disolución control) o en peso (para una
composición control en forma liofilizada). Una disolución control de
la coagulación comprende preferiblemente plasma de primate, tal como
plasma humano, en una cantidad que oscila desde aproximadamente el
78% hasta aproximadamente el 99,5% en volumen, y un plasma de
mamífero no primate, tal como plasma bovino, presente en una
cantidad que oscila desde aproximadamente el 0,5% hasta
aproximadamente el 12% en volumen. Las razones más preferidas y/o
los porcentajes en volumen para los niveles de control particulares
variarán dependiendo del tipo y de la calidad de plasma humano o de
primate (por ejemplo, plasma humano normal frente a plasma humano
anómalo, y tipo de plasma anómalo), y del tipo y de la calidad del
plasma de mamífero no primate (por ejemplo, bovino frente a porcino;
normal frente a anómalo) empleado en la composición de
coagulación.
El anticoagulante se añade preferiblemente a las
disoluciones de plasma como una primera etapa (por ejemplo,
inmediatamente después de la extracción o inmediatamente después de
la descongelación de los plasmas), o al menos como una etapa inicial
en la preparación del control de la coagulación. Sin estar limitado
por la teoría no citada específicamente en las reivindicaciones, la
adición inicial del anticoagulante (por ejemplo, heparina)
potenciará la actividad de anticoagulación de los constituyentes del
plasma, tales como la antitrombina III y el cofactor II de la
heparina y, por tanto, descartará y/o mitigará la activación de los
factores de coagulación. Aunque los enfoques siguientes se describen
con respecto a los plasmas humanos y con respecto a los
glucosaminoglucanos, son igualmente aplicables a la formación de
composiciones control con otros plasmas de primate y con otros
anticoagulantes. En un enfoque preferido, el plasma humano se
combina con el glucosaminoglucano para formar una disolución de
plasma humano, el plasma de mamífero no primate se combina con el
glucosaminoclucano para formar una disolución de plasma de mamífero
no primate, y la disolución de plasma humano y la disolución de
plasma de mamífero no primate se combinan entonces.
En este enfoque preferido, la concentración del
glucosaminoglucano en la disolución de plasma humano y la disolución
de plasma de mamífero no primate es preferiblemente la misma en cada
una de tales disoluciones y preferiblemente igual a la concentración
objetivo para el control de la coagulación; sin embargo, si se
desea, podría ser diferente en cada disolución. Cuando se trata uno
o más de los plasmas, por ejemplo, para purificarse, la heparina
puede añadirse asimismo antes de este tratamiento.
Sin embargo, en general, también podrían
emplearse otros enfoques para combinar el plasma de primate, el
plasma de mamífero no primate y el glucosaminoglucano. En un enfoque
alternativo, por ejemplo, el plasma humano se combina primero con el
plasma de mamífero no primate para formar una mezcla de plasmas, y
el glucosaminoglucano se combina después con la mezcla de plasmas.
En otro enfoque alternativo, el plasma humano se combina con el
glucosaminoglucano para formar una disolución de plasma humano, y la
disolución de plasma humano se combina entonces con el plasma de
mamífero no primate. En un enfoque similar, el plasma de mamífero no
primate se combina con el glucosaminoglucano para formar una
disolución de plasma de mamífero no primate, y la disolución de
plasma de mamífero no primate se combina entonces con el plasma
humano.
En cualquiera de los enfoques mencionados
anteriormente, el glucosaminoglucano, normalmente un sólido en su
forma comercialmente disponible, se solubiliza preferiblemente en un
tampón antes de combinarse con el plasma humano y/o con el plasma de
mamífero no primate. Solubilizar previamente el glucosaminoglucano
en el tampón, en lugar de directamente en el plasma, evita la mezcla
extensa requerida para solubilizar el mismo en el plasma y, por
tanto, ayuda a evitar la activación de las enzimas plasmáticas.
Pueden añadirse agentes de carga (por ejemplo, glicina),
estabilizadores y/o conservantes a las disoluciones de plasma
heparinizado antes o después de que se combinen tales
disoluciones.
Las composiciones control de la coagulación
preferidas comprenden plasma humano normal, plasma bovino y, o bien
heparina, o un derivado de la heparina. Aunque los controles de
Nivel I, Nivel II y Nivel III preferidos se describen más adelante
con referencia al plasma bovino como el plasma de mamífero no
primate y con referencia a la heparina o a un derivado de la
heparina como el glucosaminoglucano, ha de entenderse que podrían
sustituirse por otros plasmas de mamífero no primate y por otros
glucosaminoglucanos en tal descripción. Tal sustitución está dentro
de la habilidad habitual en la técnica, en vista de la orientación
proporcionada en el presente documento. Además, aunque las
cantidades relativas preferidas de los diversos componentes del
plasma se explican más adelante para las composiciones control de la
coagulación de Nivel I, II y III, los expertos en la técnica también
pueden desarrollar combinaciones óptimas de las diversas
disoluciones de plasma fuera de los intervalos citados, pero que
todavía caen dentro del alcance de la invención.
Un control de la coagulación de Nivel I preferido
comprende plasma humano normal, plasma bovino normal, heparina o un
derivado de la heparina, uno o más tampones y, opcionalmente, un
plasma activado, un agente de carga, un conservante y/o un
estabilizante. Véase el ejemplo 3. Según un método preferido, el
control preferido de Nivel I se prepara solubilizando la heparina o
un derivado de la heparina en un tampón, y luego combinando la
heparina tamponada (o el derivado de la heparina tamponada) con
plasma humano normal para formar una disolución de plasma humano
heparinizado que comprende heparina o un derivado de la heparina a
una concentración que oscila desde aproximadamente 0,01 U/ml hasta
aproximadamente 0,15 U/ml. También puede incluirse un agente de
carga en la disolución de plasma bovino heparinizado. De una manera
similar, la heparina tamponada (o el derivado de la heparina
tamponada) se combina con plasma bovino, se purifica tal como se
describió anteriormente, para formar una disolución de plasma bovino
heparinizado que comprende heparina o un derivado de la heparina a
una concentración que oscila desde aproximadamente 0,01 U/ml hasta
aproximadamente 0,15 U/ml. También puede incluirse un agente de
carga en la disolución de plasma humano heparinizado. Si se desea
utilizar en la composición control, un plasma activado se prepara
preferiblemente a partir de la disolución de plasma humano normal
heparinizado. Por ejemplo, un plasma activado con lana de vidrio
puede prepararse poniendo en contacto la disolución de plasma humano
heparinizado con lana de vidrio durante un periodo de tiempo que
oscila desde aproximadamente 12 horas hasta aproximadamente 30
horas, y preferiblemente durante un periodo de aproximadamente 15
horas hasta 18 horas a una temperatura que oscila desde
aproximadamente 2ºC hasta aproximadamente 8ºC. Puede añadirse un
agente de carga a la disolución de plasma activado heparinizado. La
disolución de plasma activado normal heparinizado, la disolución de
plasma bovino heparinizado y, si se incluye, la disolución de plasma
activado heparinizado, se combinan entonces en las cantidades
relativas apropiadas para formar una composición control de Nivel I
que tiene los valores de TP y TTPA deseados.
Las disoluciones de plasma heparinizado se
combinan preferiblemente en proporciones relativas para formar una
disolución control de Nivel I que comprende plasma humano normal en
una cantidad que oscila desde aproximadamente el 78% hasta
aproximadamente el 99,5%, en volumen, plasma bovino en una cantidad
que oscila desde aproximadamente el 0,5% hasta aproximadamente el
12%, en volumen, plasma activado en una cantidad no superior a
aproximadamente el 7%, en volumen, ascendiendo otros componentes
(por ejemplo, tampones, agentes de carga, etc.) a no más de
aproximadamente el 3% en volumen. Las disoluciones de plasma
heparinizado se combinan más preferiblemente en proporciones
relativas para formar una disolución control de Nivel I que
comprende plasma humano normal en una cantidad que oscila desde
aproximadamente el 86% hasta aproximadamente el 99%, en volumen,
plasma bovino en una cantidad que oscila desde aproximadamente el 1%
hasta aproximadamente el 6%, en volumen, plasma activado en una
cantidad no superior a aproximadamente el 5%, en volumen,
ascendiendo otros componentes (por ejemplo, tampones, agentes de
carga, etc.) a no más de aproximadamente el 2% en volumen. Más
preferiblemente, las disoluciones de plasma heparinizado se combinan
en proporciones relativas para formar una disolución control de
Nivel I que comprende plasma humano normal en una cantidad que
oscila desde aproximadamente el 88% hasta aproximadamente el 95%, en
volumen, plasma bovino en una cantidad que oscila desde
aproximadamente el 2% hasta aproximadamente el 4%, en volumen, y
plasma activado en una cantidad que oscila desde aproximadamente el
3% hasta aproximadamente el 5%, en volumen, ascendiendo otros
componentes (por ejemplo, tampones, agentes de carga, etc.) desde
aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 2% en volumen.
Los controles de la coagulación de Nivel II y
Nivel III preferidos comprenden plasma humano normal, plasma bovino
normal, plasma con déficit de factores, heparina o un derivado de la
heparina, uno o más tampones, un agente de carga y, opcionalmente,
un conservante y/o un estabilizante. Véase el ejemplo 4 (Nivel II) y
el ejemplo 5 (Nivel III). El control de Nivel II y el control de
Nivel III preferidos se preparan formando una disolución de plasma
humano heparinizado a partir de plasma humano normal y formando una
disolución de plasma bovino heparinizado, tal como se describió
anteriormente para el control de Nivel I. Una disolución de plasma
heparinizado con déficit de factores también se prepara,
preferiblemente, a partir de disolución de plasma humano normal
heparinizado absorbiendo el mismo con un absorbente, preferiblemente
con hidróxido de aluminio, según métodos conocidos. La disolución de
plasma humano normal heparinizado, la disolución de plasma bovino
heparinizado y la disolución de plasma heparinizado con déficit de
factores se combinan entonces en las cantidades relativas apropiadas
para formar una composición control de Nivel II o una composición
control de Nivel III que tienen los valores de TP y TTPA respectivos
deseados.
Para formar una composición control de Nivel II
preferida, estas disoluciones de plasma heparinizado se combinan
preferiblemente en proporciones relativas para formar una disolución
control que comprende plasma con déficit de factores en una cantidad
que oscila desde aproximadamente el 75% hasta aproximadamente el
85%, en volumen, plasma bovino en una cantidad que oscila desde
aproximadamente el 0,5% hasta aproximadamente el 12%, en volumen, y
plasma humano normal en una cantidad que oscila desde
aproximadamente el 0,5% hasta aproximadamente el 24,5%, en volumen,
ascendiendo otros componentes (por ejemplo, tampones, agentes de
carga, etc.) hasta no más de aproximadamente el 3% en volumen. Las
disoluciones de plasma heparinizado se combinan más preferiblemente
en proporciones relativas para formar una disolución control de
Nivel II que comprende plasma con déficit de factores en una
cantidad que oscila desde aproximadamente el 77% hasta
aproximadamente el 83%, en volumen, plasma bovino en una cantidad
que oscila desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 6%,
en volumen, y plasma humano normal en una cantidad que oscila desde
aproximadamente el 8% hasta aproximadamente el 22%, en volumen,
ascendiendo otros componentes (por ejemplo, tampones, agentes de
carga, etc.) hasta no más de aproximadamente el 2% en volumen. Más
preferiblemente, las disoluciones de plasma heparinizado se combinan
en proporciones relativas para formar una disolución control de
Nivel II que comprende plasma con déficit de factores en una
cantidad que oscila desde aproximadamente el 78% hasta
aproximadamente el 82%, en volumen, plasma bovino en una cantidad
que oscila desde aproximadamente el 2% hasta aproximadamente el 4%,
en volumen, y plasma humano normal en una cantidad que oscila desde
aproximadamente el 11% hasta aproximadamente el 20%, en volumen,
ascendiendo otros componentes (por ejemplo, tampones, agentes de
carga, etc.) desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 2%
en volumen.
Una composición control de Nivel III preferida se
forma combinando estas disoluciones de plasma heparinizado en
proporciones relativas para formar una disolución control que
comprende plasma con déficit de factores en una cantidad que oscila
desde aproximadamente el 85% hasta aproximadamente el 95%, en
volumen, plasma bovino en una cantidad que oscila desde
aproximadamente el 0,5% hasta aproximadamente el 12%, en volumen, y
plasma humano normal en una cantidad que oscila desde
aproximadamente el 0,5% hasta aproximadamente el 14,5%, en volumen,
ascendiendo otros componentes (por ejemplo, tampones, agentes de
carga, etc.) hasta no más de aproximadamente el 3% en volumen. Las
disoluciones de plasma heparinizado se combinan más preferiblemente
en proporciones relativas para formar una disolución control de
Nivel III que comprende plasma con déficit de factores en una
cantidad que oscila desde aproximadamente el 87% hasta
aproximadamente el 93%, en volumen, plasma bovino en una cantidad
que oscila desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 6%,
en volumen, y plasma humano normal en una cantidad que oscila desde
aproximadamente el 0,5% hasta aproximadamente el 12%, en volumen,
ascendiendo otros componentes (por ejemplo, tampones, agentes de
carga, etc.) hasta no más de aproximadamente el 2% en volumen. Más
preferiblemente, las disoluciones de plasma heparinizado se combinan
en proporciones relativas para formar una disolución control de
Nivel II que comprende plasma con déficit de factores en una
cantidad que oscila desde aproximadamente el 88% hasta
aproximadamente el 92%, en volumen, plasma bovino en una cantidad
que oscila desde aproximadamente el 2% hasta aproximadamente el 4%,
en volumen, y plasma humano normal en una cantidad que oscila desde
aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 10%, en volumen,
ascendiendo otros componentes (por ejemplo, tampones, agentes de
carga, etc.) desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 2%
en volumen.
Las disoluciones control de la coagulación
preparadas tal como se describió anteriormente pueden liofilizarse
según métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, las
composiciones pueden liofilizarse congelando a una temperatura y a
vacío durante un periodo de tiempo suficiente para formar la
composición control liofilizada. La temperatura, vacío y periodo de
tiempo no son limitadamente críticos, sino que la liofilización
puede llevarse a cabo generalmente tal como sigue. Las composiciones
se congelan hasta una temperatura de congelación que oscila
normalmente desde aproximadamente -60ºC hasta aproximadamente -20ºC
sin vacío durante un periodo de tiempo que oscila desde
aproximadamente 2 horas hasta aproximadamente 24 horas. Después de
aplica un vacío, que oscila preferiblemente desde aproximadamente 10
militorr hasta aproximadamente 200 militorr de presión absoluta. La
temperatura del anaquel se eleva algo entonces, normalmente hasta
una temperatura que oscila desde aproximadamente 0ºC hasta
aproximadamente 25ºC, durante un periodo de tiempo suficiente para
liofilizar la composición. La liofilización se realiza, más
preferiblemente, congelando la composición en una cámara hasta una
temperatura de aproximadamente -40ºC sin vacío durante un periodo de
tiempo de aproximadamente 4 horas, después haciendo un vacío en la
cámara inferior a aproximadamente 200 militor y posteriormente
elevando la temperatura preferiblemente hasta aproximadamente 25ºC
durante un periodo suficiente para que el producto alcance
aproximadamente 25ºC durante aproximadamente 4 horas. En una
realización preferida, se suministran aproximadamente de 1 ml a
aproximadamente 5 ml, y preferiblemente de aproximadamente 1 ml a
aproximadamente 3 ml de una disolución control a un vial y se
liofilizan mediante congelación durante aproximadamente 4 horas a
-40ºC sin vacío. Posteriormente se aplica un vacío inferior a
aproximadamente 200 militorr y la temperatura del anaquel se eleva
hasta aproximadamente 25ºC durante un periodo de tiempo suficiente
para liofilizar la disolución. La composición liofilizada se sella
preferiblemente a vacío. La composición liofilizada puede
almacenarse, antes de la reconstitución, durante aproximadamente 2
años a temperaturas de desde aproximadamente 2ºC hasta
aproximadamente 8ºC.
La composición control liofilizada puede
reconstituirse utilizando agua, un tampón apropiado u otra
disolución de reconstitución. Preferiblemente, el volumen de
disolución de reconstitución es suficiente para formar disoluciones
control de la coagulación que comprenden los diversos plasmas en los
volúmenes relativos mencionados anteriormente. Si se desea utilizar
un volumen de reconstitución mayor o menor, las cantidades de los
diversos plasmas presentes en las disoluciones control tal como se
han preparado, antes de la liofilización, deben ajustarse en
consecuencia para formar disoluciones control de la coagulación
reconstituidas tras la liofilización que comprenden los diversos
plasmas en los volúmenes relativos mencionados anteriormente.
Las composiciones control de la coagulación
reconstituidas de la presente invención tienen estabilidad aumentada
con respecto a los ensayos de TP y TTPA. Tal como se demuestra en el
ejemplo 6, por ejemplo, los controles de Nivel I, Nivel II y Nivel
III preparados tal como se describe y se reivindica en el presente
documento tienen una estabilidad excelente de hasta 48 horas tras su
reconstitución (aproximadamente 6 veces más larga que los controles
comercialmente disponibles en la actualidad).
Los controles de la coagulación descritos
anteriormente pueden usarse para evaluar los sistemas de ensayo de
TP y/o TTPA para propósitos de control de calidad. Tales métodos de
control de calidad generalmente incluyen combinar un reactivo de TP
o un reactivo de TTPA con uno de los controles de la coagulación
descritos anteriormente para formar una disolución del ensayo,
detectando la formación de coágulos en la disolución del ensayo y
determinando el tiempo transcurrido desde la formación de la
disolución del ensayo hasta la detección de la formación del coágulo
en la disolución del ensayo. Para la evaluación de un sistema de
ensayo de TP, el control de la coagulación puede comprender un
anticoagulante y cualquier plasma adecuado. Para la evaluación de
los sistemas de ensayo de TP o TTPA, el control de la coagulación
comprende, según un enfoque, un anticoagulante y un plasma anómalo.
En otro enfoque para el control de calidad de los sistemas de ensayo
de TP o TTPA, el control de la coagulación comprende plasma de
primate, plasma de mamífero no primate y un anticoagulante.
Los reactivos de tiempo de protrombina (TP), tal
como se usan en el presente documento, se refieren a una disolución
que comprende factor tisular e iones catiónicos, preferiblemente
iones de calcio (Ca^{++}). El factor tisular es una glucoproteína
integral de membrana que es biológicamente activa para iniciar la
coagulación sanguínea por la vía extrínseca. El factor tisular
comprende un componente proteico, la proteína factor tisular y un
componente lipídico. El componente lipídico del factor tisular
comprende principalmente fosfolípidos. El factor tisular puede ser
factor tisular que se produce naturalmente, tal como el incluido en
extractos de tejidos de mamíferos o, alternativamente, puede
prepararse sintéticamente, por ejemplo, combinando la proteína
factor tisular aislada o producida recombinantemente y fosfolípidos
en razones apropiadas. Véase la patente de los EE.UU. número
5.017.556 y las referencias citadas en ese documento.
Los reactivos de tiempo de tromboplastina parcial
activada (TTPA), tal como se usan en el presente documento, se
refieren a una disolución que comprende el componente lipídico del
factor tisular, sin proteína factor tisular y un agente de
activación de la vía intrínseca. Los agentes que activan la vía
intrínseca normalmente son restos cargados negativamente con una
gran área superficial y pueden incluir, por ejemplo, sales de ácidos
orgánicos, tal como las sales de ácido elágico, y especies que
contienen sílice, tal como sílice micronizada, caolín, Celite y lana
de vidrio.
La formación del coágulo puede detectarse y el
tiempo requerido para tal formación de coágulo puede determinarse
utilizando protocolos manuales y/o automatizados. Métodos ejemplo
para la determinación de la formación del coágulo incluyen
observaciones visuales con un técnica de "basculación de tubo",
métodos electroquímicos (por ejemplo, fibrómetro), métodos ópticos
(por ejemplo, basados en la absorbancia o tasa de cambio de la
absorbancia), entre otros. Ejemplos de analizadores automatizados
incluyen AMAX CS-190 (Sigma Chemical, St. Louis,
MO).
Puede realizarse una comparación de los tiempos
determinados con intervalos objetivo para el control particular que
se está evaluando. Cuando el control de coagulación se combina con
un reactivo de TP, el tiempo determinado puede compararse con los
tiempos objetivo de TP para los controles de Nivel I, Nivel II y
Nivel III, tal como se explicó anteriormente. Cuando el control de
coagulación se combina con un reactivo de TTPA, el tiempo
determinado puede compararse con los tiempos objetivo de TTPA para
los controles de Nivel I, Nivel II y Nivel III, tal como se explicó
anteriormente. Los tiempos determinados que están fuera de los
tiempos objetivo son indicativos de una preocupación acerca del
control de calidad para el sistema del ensayo. Tales preocupaciones
se refieren normalmente al reactivo de TP/TTPA o al dispositivo y/o
los protocolos empleados para determinar el tiempo de
coagulación.
Los ejemplos siguientes ilustran los principios y
ventajas de la invención.
Con el fin de probar el efecto de añadir heparina
a una composición control de la coagulación, se prepararon tres
composiciones control de Nivel III, designadas como las
composiciones piloto números A, B y C, y se evaluaron tal como
sigue.
Se preparó una disolución de plasma humano normal
heparinizado a partir de plasma humano normal. El plasma humano
congelado y al que se añadió citrato (3-4% de
citrato) se descongeló en un baño de agua a 30-37ºC.
En la composición piloto número A que sirvió como control
experimental, se añadió tampón HEPES (sin heparina) al plasma
descongelado a una concentración de 50 mM de HEPES. En las
composiciones piloto números B y C, se añadió tampón HEPES que
contenía heparina al plasma descongelado a una concentración de 50
mM de HEPES y 0,05 U/ml de heparina para formar una disolución de
plasma humano normal heparinizado. En cada caso, el pH del tampón
HEPES fue de 7,2-7,4 y el tampón se preparó de
antemano como un concentrado 40x para minimizar los efectos de
dilución cuando se añade al plasma. La heparina fue heparina de
calidad farmacéutica derivada de pulmón bovino diluida hasta 1000
U/ml en solución salina al 0,85% (Upjohn Co., Kalamazoo, MI).
Se preparó un plasma humano con déficit de
factores a partir de una parte de la disolución de plasma humano
normal heparinizado preparado anteriormente. Los factores de
coagulación II, VII, IX y X se absorbieron mezclando disolución de
plasma humano heparinizado con hidróxido de aluminio (25 g/L)
durante 30-45 minutos a una temperatura mantenida a
aproximadamente 2-8ºC. La alúmina se eliminó por
centrifugación.
También se preparó una disolución de plasma
bovino normal heparinizado. El plasma bovino normal congelado y al
que se añadió citrato se descongeló en un refrigerador mantenido a
una temperatura que oscilaba desde aproximadamente 2ºC hasta
aproximadamente 8ºC, y después se filtró usando un filtro grueso
(Whitmann Nº 1) para eliminar los materiales precipitados y/o
particulados que se habían formado durante la descongelación a
temperatura fría. Se repitió la congelación, descongelación y
eliminación de los materiales particulados precipitados. El plasma
bovino purificado se preparó a granel y después se almacenó a -70ºC.
Para preparar la disolución de plasma bovino heparinizado, se
descongeló plasma bovino purificado congelado en un baño de agua a
una temperatura de aproximadamente 30ºC a aproximadamente 37ºC, y se
añadió un tampón HEPES que contenía heparina al plasma bovino
descongelado hasta una concentración de 50 mM de HEPES y 0,05 U/ml
de heparina.
Las composiciones control de Nivel III se
prepararon entonces combinando la disolución de plasma humano
heparinizado con déficit de factores (absorbido) (aproximadamente el
89%, en volumen), la disolución de plasma humano normal heparinizado
(aproximadamente el 7%, en volumen) y la disolución de plasma bovino
heparinizado (aproximadamente el 4%, en volumen). En la composición
piloto número C, se añadieron 0,05 U/ml de heparina adicionales tras
la combinación de las diversas disoluciones de plasma para llevar la
concentración de heparina total hasta 0,1 U/ml. Se añadió glicina a
cada composición piloto hasta el 1%, en peso, y las composiciones
piloto se vertieron luego en viales y se liofilizaron.
Cada una de las composiciones piloto se evaluó
posteriormente utilizando los ensayos de tiempo de protrombina (TP)
y tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) tras
reconstituirse con agua hasta el mismo volumen que el volumen de
preliofilización al que se llenaron los viales. Para las pruebas de
estabilidad, las muestras reconstituidas se analizaron
inmediatamente después de la reconstitución, y tras el
almacenamiento cargadas en el analizador a 15-22ºC
durante 24 horas y 48 horas. Los datos se recogieron en un
analizador de coagulación Amelung AMAX CS-190
utilizando un reactivo de TP con un valor de ISI de 2,0 (Sigma
Thromboplastin-XS) y reactivo de TTPA que es
moderadamente sensible a la heparina y a anticoagulante lúpico
(Sigma TTPA-FSL). Se realizaron determinaciones
mecánicas y ópticas.
Los resultados se muestran a continuación para
los ensayos de TP (tabla 1A) y los ensayos de TTPA (tabla 1B). Los
datos mostrados en estas tablas demuestran que los controles de la
coagulación que comprenden heparina añadida tras la descongelación y
antes de la adsorción (composiciones piloto números B y C) eran más
estables que los controles que carecían de heparina (composición
piloto número A). La comparación de los datos para las composiciones
piloto números B y C muestra que la heparina añadida tras la
combinación de los diversos plasmas incrementó adicionalmente el
TTPA, pero tuvo poco efecto adicional, si hubo alguno, sobre la
estabilidad.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Con el fin de probar el efecto de las
concentraciones del plasma bovino en las composiciones control de la
coagulación, se prepararon composiciones control de Nivel III, que
tenían diversas cantidades relativas de plasma humano con déficit de
factores, plasma humano normal y plasma bovino y se evaluaron tal
como sigue.
Se preparó una disolución de plasma humano normal
heparinizado y una disolución de plasma bovino normal heparinizado,
tal como se describió en el ejemplo 1. Estas disoluciones de plasma
se combinaron entonces en diversas cantidades relativas, tal como
se resume en la tabla 2. Se añadió glicina a cada una de las
composiciones al 1% en peso, y las disoluciones control se
vertieron luego en viales y se liofilizaron.
Cada una de las composiciones control se evaluó
posteriormente utilizando los ensayos de tiempo de protrombina (TP)
y tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) tras
reconstituirse con agua hasta el mismo volumen que el volumen al que
se llenaron los viales originalmente antes de la liofilización.
Para las pruebas de estabilidad, las muestras reconstituidas se
analizaron inmediatamente después de la reconstitución, y tras el
almacenamiento cargadas en el analizador a 15-22ºC
durante 24 horas y 48 horas. Los datos se recogieron en un
analizador de coagulación Amelung AMAX CS-190
utilizando un reactivo de TP con un valor de ISI de 2,0 (Sigma
Thromboplastin-XS) y reactivo de TTPA que es
moderadamente sensible a la heparina y a anticoagulante lúpico
(Sigma TTPA-FSL). Se realizaron determinaciones
mecánicas y ópticas.
Los resultados se muestran en la tabla 2 para los
ensayos de TP (tabla 2A) y los ensayos de TTPA (tabla 2B). Los datos
mostrados la tabla 2 demuestran que los niveles aumentados de
plasma bovino incrementaron el TP y disminuyeron el TTPA. Mientras
que el plasma bovino parece proteger la estabilidad de TTPA y afecta
poco a la estabilidad de TP en cantidades del 11% o menos, en
volumen, el plasma bovino en niveles del 13% en volumen parece
disminuir la estabilidad de TP.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
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Con el fin de preparar controles de la
coagulación de Nivel I adecuados para imitar al plasma normal, se
prepararon cuatro composiciones control de Nivel I, designadas como
composiciones piloto números 1, 2, 3 y 4, y se evaluaron tal como
sigue.
Se preparó una disolución de plasma humano normal
heparinizado y una disolución de plasma bovino normal heparinizado,
comprendiendo cada una 0,05 U/ml de heparina y 50 mM de HEPES, a
partir de los plasmas normales tal como se describió en el ejemplo
1, excepto en que la heparina empleada era una sal sódica de
heparina derivada de pulmón bovino (Sigma Chemical, St. Louis, MO,
Nº Cat. H4898).
Se preparó un plasma activado heparinizado a
partir de una parte de la disolución de plasma humano normal
heparinizado, descrito anteriormente, poniendo en contacto la
disolución de plasma humano heparinizado con lana de vidrio a una
concentración de 5 g/l de plasma durante aproximadamente
15-18 horas a una temperatura de aproximadamente
2-8ºC. La lana de vidrio se eliminó posteriormente
de la disolución por filtración.
Se añadió glicina a las disoluciones de plasma
activado, bovino y humano heparinizados al 1% en peso, y las
disoluciones de plasma se combinaron entonces en diversas
cantidades relativas, tal como se resumen en la tabla 3A, como
mini-composiciones piloto de 1 ml.
Cada una de las composiciones control se evaluó
posteriormente utilizando los ensayos de tiempo de protrombina (TP)
y tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) tal como se
preparan, sin liofilización ni reconstitución. Los datos se
recogieron en un analizador de coagulación Amelung AMAX
CS-190 utilizando un reactivo de TP con un valor de
ISI de 2,0 (Sigma ThromboMAX®) y reactivo de TTPA que es
moderadamente sensible a la heparina y a anticoagulante lúpico
(Sigma TTPA-FSL). Se realizaron determinaciones
mecánicas y ópticas. Los resultados se muestran en la tabla 3A para
los ensayos de TP y los ensayos de TTPA.
La composición piloto número 3, que comprende
aproximadamente el 96% del plasma humano normal, aproximadamente el
3% del plasma activado con lana de vidrio y aproximadamente el 1%
de plasma bovino, en volumen, estaba dentro de los valores objetivo
piloto para el TP mecánico (11,3-12,8 segundos) y
TTPA mecánico (21-30 segundos). Se preparó
posteriormente un control de la coagulación que tenía la misma
composición que la composición piloto número 3, a granel, en un
procedimiento de escala de producción (20 litros), añadiéndose
glicina a la composición a granel al 1% en peso. La composición
control de nivel I a escala de producción se evaluó tal como se
prepara ("a granel") y tras la liofilización y la
reconstitución ("terminada"), con la recogida de datos tal
como se describió anteriormente, pero sólo con pruebas mecánicas.
Los resultados mostrados en la tabla 3B, demuestran que la
composición piloto control de Nivel I se podía obtener a escala
para cantidades comerciales sin pérdida de estabilidad. Además, los
controles de Nivel I a escala de producción estaban dentro de los
valores objetivo a granel para el TP mecánico
(11,1-12,8 segundos) y el TTPA mecánico
(20-32 segundos). Se realizaron series adicionales
de producción a volúmenes de hasta 40 litros con resultados
similares (datos no mostrados).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Con el fin de preparar controles de la
coagulación de Nivel II adecuados para imitar al plasma de
pacientes bajo tratamiento suave de anticoagulación, se prepararon
nueve composiciones control de Nivel II, designadas como
composiciones piloto números 1-9, y se evaluaron
tal como sigue.
Se preparó una disolución de plasma humano normal
heparinizado, una disolución de plasma bovino normal heparinizado y
una disolución de plasma humano normal heparinizado con déficit de
factores, comprendiendo cada una 0,05 U/ml de heparina y 50 mM de
HEPES, tal como se describe en el ejemplo 3.
El plasma humano normal, el bovino normal y el
humano con déficit de factores, heparinizados, se combinaron
entonces en diversas cantidades relativas, tal como se resumen en
la tabla 4A, como mini-composiciones piloto de 1
ml.
Cada una de las composiciones control se evaluó
posteriormente utilizando los ensayos de tiempo de protrombina (TP)
y tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) tal como se
preparan, sin liofilización ni reconstitución. Los datos se
recogieron en un analizador de coagulación Amelung AMAX
CS-190 utilizando un reactivo de TP con un valor de
ISI de 2,0 (Sigma ThromboMAX^{RM}) y reactivo de TTPA que es
moderadamente sensible a la heparina y a anticoagulante lúpico
(Sigma TTPA-FSL). Sólo se realizaron determinaciones
mecánicas. Los resultados se muestran en la tabla 4A para los
ensayos de TP y los ensayos de TTPA.
La composición piloto número 8, que comprende
aproximadamente el 77% del plasma humano con déficit de factores, el
19% de plasma humano normal y aproximadamente el 4% del plasma
bovino, en volumen, estaba dentro de los valores objetivo piloto
para el TP mecánico (18-21 segundos) y TTPA mecánico
(51-55 segundos). Se preparó posteriormente un
control de la coagulación que tenía la misma composición que la
composición piloto número 8, a granel, en un procedimiento de
escala de producción (20 litros), pero añadiéndose glicina al 1% en
peso. La composición control de nivel II a escala de producción se
evaluó tal como se prepara ("a granel") y tras la
liofilización y la reconstitución ("terminada"), con la
recogida de datos tal como se describió anteriormente. Los
resultados mostrados en la tabla 4B demuestran que la composición
piloto control de Nivel II se podía obtener a escala para cantidades
comerciales sin pérdida de estabilidad. Además, los controles de
Nivel II a escala de producción estaban dentro de los valores
objetivo a granel para el TP mecánico (17-22
segundos) y el TTPA mecánico (50-57 segundos). Se
realizaron series adicionales de producción de hasta 40 litros con
resultados similares (datos no mostrados).
| * Combinación piloto escogida para la evaluación a escala de producción |
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Con el fin de preparar controles de la
coagulación de Nivel III adecuados para imitar al plasma de
pacientes bajo tratamientofuerte de anticoagulación, se prepararon
once composiciones control de Nivel III, designadas como
composiciones piloto números 1-11, y se evaluaron
tal como sigue.
Se preparó una disolución de plasma humano normal
heparinizado, una disolución de plasma bovino normal heparinizado y
una disolución de plasma humano normal heparinizado con déficit de
factores, comprendiendo cada una 0,05 U/ml de heparina y 50 mM de
HEPES, tal como se describe en el ejemplo 3.
El plasma humano normal, el bovino normal y el
humano con déficit de factores, heparinizados, se combinaron
entonces en diversas cantidades relativas, tal como se resumen en la
tabla 5A, como mini-composiciones piloto de 1
ml.
Cada una de las composiciones control se evaluó
posteriormente utilizando los ensayos de tiempo de protrombina (TP)
y tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) tal como se
preparan, sin liofilización ni reconstitución. Los datos se
recogieron en un analizador de coagulación Amelung AMAX
CS-190 utilizando un reactivo de TP con un valor de
ISI de 2,0 (Sigma ThromboMAX^{RM}) y reactivo de TTPA que es
moderadamente sensible a la heparina y a anticoagulante lúpico
(Sigma TTPA-FSL). Sólo se realizaron determinaciones
mecánicas. Los resultados se muestran en la tabla 5A para los
ensayos de TP y los ensayos de TTPA.
La composición piloto número 11, que comprende
aproximadamente el 90% del plasma humano con déficit de factores, el
6% de plasma humano normal y aproximadamente el 4% del plasma
bovino, en volumen, estaba dentro de los valores objetivo piloto
para el TP mecánico (25-31 segundos) y TTPA mecánico
(71-79 segundos). Se preparó posteriormente un
control de la coagulación que tenía la misma composición que la
composición piloto número 11, a granel, en un procedimiento de
escala de producción (10 litros), pero añadiéndose glicina al 1% en
peso. La composición control de nivel III a escala de producción se
evaluó tal como se prepara ("a granel") y tras la liofilización
y la reconstitución ("terminada"), con la recogida de datos tal
como se describió anteriormente. Los resultados mostrados en la
tabla 5B demuestran que la composición piloto control de Nivel III
se podía obtener a escala para cantidades comerciales sin pérdida de
estabilidad. Además, los controles de Nivel III a escala de
producción estaban dentro de los valores objetivo a granel para el
TP mecánico (25-31 segundos) y el TTPA mecánico
(71-80 segundos). Se realizaron series adicionales
de producción de hasta 40 l con resultados similares (datos no
mostrados).
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| * Combinación piloto escogida para la evaluación a escala de producción |
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Los controles de la coagulación de Nivel I, Nivel
II y Nivel III preparados en las series de escala de producción tal
como se describe en el ejemplo 3, ejemplo 4 y ejemplo 5,
respectivamente, se evaluaron para determinar la estabilidad cuando
están reconstituidos.
Cada una de las composiciones control se evaluó
utilizando los ensayos de tiempo de protrombina (TP) y tiempo de
tromboplastina parcial activada (TTPA). Los ensayos se llevaron a
cabo en los controles, inmediatamente después de su reconstitución
con agua hasta el mismo volumen que el volumen al que se llenaron
los viales antes de la liofilización, y también en los tiempos de 8
horas, 24 horas y 48 horas tras la reconstitución. Las disoluciones
reconstituidas se almacenaron a aproximadamente
2-8ºC. Los datos se recogieron en un analizador de
coagulación Amelung AMAX CS-190 utilizando un
reactivo de TP con un valor de ISI de 2,0 (Sigma ThromboMAX®) y
reactivo de TTPA que es moderadamente sensible a la heparina y a
anticoagulante lúpico (Sigma TTPA-FSL). Se
realizaron determinaciones mecánicas y ópticas.
Los resultados se muestran en la tabla 6A para
los ensayos de TP y en la tabla 6B para los ensayos de TTPA. Los
datos mostrados en estas tablas también se presentan en las figuras
1A y 1B para el TP óptico y el TP mecánico, respectivamente, y en
las figuras 2A y 2B para el TTPA óptico y el TTPA mecánico,
respectivamente. Estos datos demuestran que los controles de Nivel
I, II y III preparados según los protocolos descritos y
reivindicados en el presente documento tienen estabilidad superior,
incluso hasta 48 horas después de su reconstitución.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
A la vista de la descripción detallada de la
invención y de los ejemplos presentados anteriormente, puede
apreciarse que se logran los diversos objetos de la invención.
Las explicaciones e ilustraciones presentadas en
el presente documento pretenden familiarizar a otros expertos en la
técnica con la invención, sus principios y su aplicación práctica.
Los expertos en la técnica pueden adaptar y aplicar la invención en
sus numerosas formas, ya que puede ser más apropiada para las
necesidades de un uso particular. En consecuencia, las realizaciones
específicas de la presente invención tal como se presentan no
pretenden ser exhaustivas ni limitantes de la invención.
Claims (24)
1. Composición control de la coagulación para
determinar el tiempo de protrombina (TP) o el tiempo de
tromboplastina parcial activada (TTPA), comprendiendo el control de
la coagulación:
plasma de mamífero no primate y plasma de
primate, siendo la razón de plasma de mamífero no primate con
respecto a plasma de primate dentro del intervalo de 1:200 a
1:5;
y un anticoagulante.
2. Control de la coagulación según la
reivindicación 1, en el que el plasma de primate comprende plasma de
primate anómalo.
3. Control de la coagulación según la
reivindicación 1 ó 2, en el que el plasma comprende plasma de
mamífero no primate anómalo.
4. Control de la coagulación según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticoagulante tiene
actividad para potenciar la actividad de la antitrombina III (ATIII)
o del cofactor II de la heparina (CIIH) (i) frente a trombina, o
(ii) frente a un factor de coagulación seleccionado del grupo que
consiste en los factores IXa, Xa y XIa.
5. Control de la coagulación según la
reivindicación 2 ó 3, en el que el plasma de primate o de mamífero
no primate anómalo es un plasma activado, plasma total, un derivado
de plasma, o un plasma con déficit de factores que carece de uno o
más factores de coagulación seleccionados del grupo que consiste en
los factores II, VII, IX y X.
6. Control de la coagulación según la
reivindicación 4 ó 5, en el que la concentración del anticoagulante
oscila desde 0,01 U/ml hasta 0,15 U/ml en disolución, u oscila desde
0,1 U/g hasta 1,80 U/g en una base en peso seco, donde U es unidades
equivalentes de heparina.
7. Control de la coagulación según una cualquiera
de las reivindicaciones 4 a 6, en el que el anticoagulante es un
glucosaminoglucano.
8. Control de la coagulación según la
reivindicación 7, en el que el glucosaminoglucano es heparina, un
derivado de la heparina o un análogo de la heparina.
9. Control de la coagulación según una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el plasma de primate o el
plasma de mamífero no primate es plasma total, un derivado de plasma
o plasma normal.
10. Control de la coagulación según una
cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 ó 5, en el que el plasma
anómalo comprende un plasma con déficit de factores que carece de
uno o más factores de coagulación seleccionados del grupo que
consiste en los factores II, VII, IX o X.
11. Control de la coagulación según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que comprende una cantidad
de plasma de mamífero no primate que oscila desde el 0,5% hasta el
12% en volumen.
12. Control de la coagulación según una
cualquiera de las reivindicación 1 a 11, en el que el plasma de
primate comprende plasma humano.
13. Control de la coagulación según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que el plasma de
mamífero no primate comprende plasma bovino.
14. Método para preparar una composición control
de la coagulación para determinar los ensayos de tiempo de
protrombina (TP) y tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA),
comprendiendo el método
combinar plasma de mamífero no primate, plasma de
primate y un anticoagulante para formar una disolución control que
comprende una razón de plasma de mamífero no primate con respecto a
plasma de primate dentro del intervalo de 1:200 a 1:5.
15. Método según la reivindicación 14, en el que
el anticoagulante tiene actividad para potenciar la actividad de la
antitrombina III (ATIII) o del cofactor II de la heparina (CIIH)
frente a la trombina o frente a un factor de coagulación
seleccionado del grupo que consiste en los factores IXa, Xa y
XIa.
16. Método para el control de calidad de un
sistema de ensayo de tiempo de protrombina (TP) o tiempo de
tromboplastina parcial activada (TTPA), comprendiendo el método
combinar un reactivo de TP o un reactivo de TTPA
con una composición control de la coagulación para formar una
disolución de ensayo, comprendiendo la composición control de la
coagulación un plasma de mamífero no primate y plasma de primate en
una razón de desde 1:200 hasta 1:5, y un anticoagulante que tiene
actividad para potenciar la actividad de antitrombina III (ATIII) o
del cofactor II de la heparina (CIIH) frente a trombina o frente a
un factor de coagulación seleccionado del grupo que consiste en los
factores IXa, Xa y XIa,
detectar la formación de coágulos en la
disolución de ensayo, y
determinar el tiempo transcurrido desde la
formación de la disolución de ensayo hasta la detección de la
formación del coágulo en la disolución de ensayo.
17. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 16, en el que la disolución control comprende
una cantidad de plasma de mamífero no primate que oscila desde el
0,5% hasta el 12% en volumen.
18. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 15 a 17, en el que la concentración de
anticoagulante en la disolución control de la coagulación oscila
desde 0,01 U/ml hasta 0,15 U/ml, donde U es unidades equivalentes de
heparina.
19. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 18, en el que el plasma de primate comprende
un plasma anómalo.
20. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 19, en el que el plasma de mamífero no primate
comprende un plasma anómalo.
21. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 20, en el que el plasma de primate comprende
plasma humano.
22. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 21, en el que el plasma de mamífero no primate
comprende plasma bovino.
23. Método según la reivindicación 22, en el que
el plasma de mamífero no primate es un plasma bovino purificado
preparado usando las etapas siguientes:
preparar u obtener plasma bovino congelado,
descongelar el plasma bovino congelado a una
temperatura que oscila desde aproximadamente 2ºC hasta
aproximadamente 8ºC, por lo que se forman materiales particulados en
el plasma bovino descongelado, y
eliminar los materiales particulados del plasma
bovino descongelado para formar un plasma bovino purificado.
24. Método según la reivindicación 23 que
comprende además
volver a congelar el plasma bovino
purificado,
volver a descongelar el plasma congelado de nuevo
a una temperatura que oscila desde aproximadamente 2ºC hasta
aproximadamente 8ºC, por lo que se forman materiales particulados
adicionales en el plasma bovino descongelado de nuevo, y
eliminar los materiales particulados adicionales
del plasma bovino descongelado de nuevo.
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