ES2233291T3 - Anticuerpos contra el producto de escision de vimentina. - Google Patents
Anticuerpos contra el producto de escision de vimentina.Info
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Abstract
Anticuerpo o un fragmento del mismo que reconoce un fragmento N- ó C-terminal de vimentina, en el que el fragmento N-terminal comprende por lo menos 5 residuos aminoácidos desde Asp259 al extremo N de la vimentina, y en el que, el fragmento C-terminal comprende por lo menos 5 residuos aminoácidos desde Val260 al extremo C de la vimentina, caracterizado porque el anticuerpo o un fragmento del mismo reacciona con el producto de escisión de la vimentina, obtenido mediante escisión de la vimentina intacta, entre Asp259 y Val260, pero no reacciona con la vimentina intacta.
Description
Anticuerpos contra el producto de escisión de
vimentina.
La presente invención se refiere a un anticuerpo
contra el producto de escisión de vimentina, a un procedimiento
para detectar la apoptosis utilizando este anticuerpo, así como a
la utilización de dicho anticuerpo.
La apoptosis es la muerte celular en los
organismos multicelulares. Las células generadas de más durante los
procesos de desarrollo, las células que no son necesarias ya en un
adulto, las células dañadas por la radiación o las sustancias
químicas, o las células peligrosas tales como las células tumorales,
son conducidas a la muerte celular mediante la apoptosis,
eliminándose de este modo de un organismo.
Las caspasas constituyen enzimas proteolíticos
(proteasas) que juegan un papel clave durante la apoptosis. La
investigación sobre la apoptosis se ha extendido rápidamente desde
la década de los 90. Uno de los factores clave que han promovido la
investigación es la identificación de una familia caspasa de
proteasas que implica la ejecución de la apoptosis (Thornberry, N.
& Lazebnik, Y. (1998) Science, 281, 1312-1316).
Por lo menos, 10 o más miembros de la familia de las caspasas se
identifican en los mamíferos. Las caspasas se muestran también
presentes como precursores inactivos en las células normales.
Cuando la apoptosis se inicia para una célula que va a morir, una
caspasa de iniciación en la familia de las caspasas, se activa ella
misma mediante proteolisis limitada (procesamiento). La caspasa
iniciadora activada activa otra caspasa fragmentándola
parcialmente, activando la caspasa escindida otra caspasa,
continuándose el proceso una después de otra. Este mecanismo de
amplificación en cascada se cree que alcanza la activación completa.
Todas las caspasas escinden el lado C-terminal de
un residuo específico de ácido aspártico en las proteínas, pero la
eficiencia de la escisión de cada miembro de la familia de caspasas
varía, dependiendo de las secuencias aminoácidas cercanas al sitio
de escisión.
La apoptosis inducida por la estimulación de un
anticuerpo anti-Fas es la apoptosis mejor analizada
y que se piensa juega un papel central entre los adultos (Nagata,
S. (1997) Cell 88, 355-365). La
caspasa-8, que está implicada en la realización de
la apoptosis, es activada primero en las células entre la familia
de las caspasas, después de la estimulación con el anticuerpo
anti-Fas, y funciona como un iniciador (Boldin,
M.P., Goncharov, T.M., Goltsev, Y.V. & Wallach, D. (1996) Cell
85, 803-815; Muzio, M., Chinnaiyan, A.M., Kishkel,
F.C., O'Rourke, K., Schevchenko, A., Ni, J., Scaffidi, C., Bretz,
J.D., Zhang, M., Gentz, R., Mann, M., Krammer, P.H., Peter, M.E.
& Dixit, V.M. (1996) Cell, 85, 817-827).
Se han utilizado varios procedimientos para
detectar la activación de una caspasa, tales como 1) detección del
procesamiento o activaciónn de una caspasa utilizando u anticuerpo
que la reconozca; o 2) medición de la actividad proteásica
utilizando un análogo del substrato. Cualquiera de estos
procedimientos, sin embargo, tiene inconvenientes, porque la
capacidad de distinguir entre miembros de la familia de las
caspasas es limitada. En el procedimiento de 1), la producción de un
anticuerpo específico capaz de reconocer tanto el precursor
inactivo como el tipo activo, es a menudo difícil. MORISHIMA
("Changes in nuclear morphology during apoptosis correlate with
vimentin cleavage by different caspases located either upstream or
downstream of Bcl-2 action" GENES TO CELLS 1999,
vol. 4, páginas 401-414) describe la escisión de la
vimentina mediante la caspasa-8 que tiene lugar en
sitios múltiples, por ejemplo, entre Asp259 y Val260 de la proteína
en un estadio temprano de la apoptosis. La detección de la escisión
de la vimentina en las células apoptósicas es llevada a cabo
mediante análisis de transferencia Western, utilizando anticuerpo
monoclonal anti-vimentina que interactúa tanto con
la proteína intacta como con sus fragmentos escindidos.
Es un objetivo de la presente invención
proporcionar un anticuerpo contra el producto de escisión de la
vimentina que es un componente principal de una proteína
esquelética intracelular, un procedimiento para detectar la
apoptosis utilizando dicho anticuerpo así como la utilización de
dicho anticuerpo.
Como resultado de una intensa y extensa
investigación respecto al objetivo anteriormente mencionado, los
inventores encontraron finalmente que la vimentina en la célula
apoptósica es escindida específicamente por la
caspasa-8, y han tenido éxito en la producción de
un anticuerpo capaz de detectar la escisión específica de la
vimentina.
Es decir, la presente invención se refiere a un
anticuerpo o a un fragmento del mismo que reconoce un fragmento N-
ó C- terminal de vimentina en el que, el fragmento
N-terminal comprende por lo menos 5 residuos
aminoácidos desde Asp259 al extremo N de la vimentina, y en el que,
el fragmento C-terminal comprende por lo menos 5
residuos aminoácidos desde Val260 al extremo C de la vimentina,
caracterizado porque el anticuerpo o su fragmento reacciona con el
producto de escisión de la vimentina, obtenido mediante escisión de
la vimentina intacta, entre Asp259 y Val260, pero no reacciona con
la vimentina intacta.
El producto de escisión de dicha vimentina es uno
escindido por la acción de la caspasa-8.
El anticuerpo anteriormente mencionado puede ser
un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal.
Dicha vimentina comprende las secuencias que se
dan a conocer como SEC. ID. nº1, SEC. ID. nº 2, SEC. ID. nº 3, SEC.
ID. nº 4.
Además, la presente invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de un anticuerpo monoclonal o de
un fragmento del mismo que reacciona con un producto de escisión de
la vimentina que se escinde entre Asp259 y Val260, pero que no
reacciona con la vimentina intacta, que comprende las etapas de:
- (a)
- provocación de una respuesta inmune en un mamífero no humano mediante la inmunización con un polipéptido antigénico que comprende los fragmentos N- ó C-terminales de la vimentina, en la que el fragmento N-terminal comprende por lo menos 5 residuos aminoácidos desde Asp259 al extremo N de la vimentina, y en el que , el fragmento C-terminal comprende por lo menos 5 residuos aminoácidos desde Val260 hasta el extremo C de la vimentina;
- (b)
- preparación de un hibridoma a partir de las células linfoides del huésped;
- (c)
- selección de un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que reacciona con un producto de escisión de la vimentina pero no lo hace con una vimentina intacta y
- (d)
- opcionalmente, el anticuerpo monoclonal es procesado en un fragmento del mismo y
- (e)
- obtención del anticuerpo o de su fragmento.
Un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo
obtenible mediante el procedimiento anteriormente mencionado.
Además, la presente invención se refiere a un
procedimiento para la preparación de un anticuerpo policlonal que
reacciona con un producto de escisión de la vimentina que se
escinde entre ASp259 y Val260 pero que no reacciona con la
vimentina intacta, que comprende las etapas de:
- (a)
- provocación de una respuesta inmune en un mamífero no humano mediante la inmunización con un polipéptido antigénico que comprende los fragmentos N- ó C-terminales de la vimentina, en la que el fragmento N-terminal comprende por lo menos 5 residuos aminoácidos desde Asp259 al extremo N de la vimentina, y en el que, el fragmento C-terminal comprende por lo menos 5 residuos aminoácidos desde Val260 hasta el extremo C de la vimentina;
- (b)
- obtención de un antisuero a partir de la sangre del huésped mamífero no humano; y
- (c)
- obtención del anticuerpo o de un fragmento del mismo.
Un anticuerpo policlonal o un fragmento del mismo
obtenible mediante el procedimiento anteriormente mencionado.
El producto de escisión de la vimentina se
obtiene mediante la acción de la caspasa-8 y la
vimentina comprende las secuencias que se expone de SEC. ID. nº.1,
SEC. ID. nº. 2, SEC. ID. nº. 3, SEC. ID. nº. 4.
Además, la presente invención se refiere a un
procedimiento para la detección de la actividad de la caspasa in
vitro o un procedimiento para la detección de la apoptosis
in vitro, que comprende permitir que el anticuerpo
anteriormente mencionado o un fragmento del mismo reaccione con el
producto de escisión de la vimentina y detectando el producto
reactivo resultante.
Además, la presente invención se refiere a un
equipo para la detección de la apoptosis, que comprende el
anticuerpo anteriormente mencionado o un fragmento del mismo.
La Figura 1 muestra un diagrama esquemático del
sitio de escisión por la caspasa en la vimentina.
Las Figuras 2 y 3 muestran fotografías del
análisis de transferencia Western.
La Figura 4 muestra fotografías de la tinción de
inmunofluorescencia indirecta de las células apoptósicas.
La presente invención se refiere a un anticuerpo
que reconoce específicamente el producto de escisión de la
vimentina, pero que no reacciona con la vimentina entera (vimentina
intacta), un substrato de una caspasa (por ejemplo,
caspasa-8) que se activa en el estadio inicial de
la apoptosis. Para detectar la actividad de las caspasas, los
presentes inventores han producido un anticuerpo que reacciona con
un sitio de escisión de un substrato escindido por una caspasa,
centrándose en los cambios en el substrato (vimentina), no en la
caspasa en sí misma. Por tanto, la activación de una caspasa puede
ahora ser detectada con una alta sensibilidad, sin tener en cuenta
la de la muestra, tal como los tejidos y las células.
Entre las secuencias aminoácidas de la proteína
vimentina, los presentes inventores han identificado un resido de
ácido aspártico en un sitio específico que es escindido por la
caspasa-8. Los oligopéptidos que tienen una
secuencia en el lado N-terminal o en el lado
C-terminal del residuo de ácido aspártico, se
sintetizan químicamente y se utilizan para la inmunización de un
conejo. Después de varias inmunizaciones en distintos tiempos, se
obtiene el antisuero. Entonces, un anticuerpo que se une
intensamente al oligopéptido utilizado para la inmunización en el
antisuero, es purificado. El anticuerpo purificado no se une a una
proteína vimentina intacta, sino que se une específicamente a un
producto escindido por la caspasa-8. Utilizando este
anticuerpo en el análisis de transferencia Western y llevando a
cabo la inmunotinción de las células y tejidos, la detección de la
activación de la caspasa-8 se hace posible mediante
la escisión de la vimentina in vitro, en la muestra tisular
o en las muestras celulares.
El término "anticuerpo" en la presente
invención representa la molécula entera del anticuerpo o sus
fragmentos (por ejemplo, el fragmento Fab o F(ab')_{2}),
que puede unirse al producto de escisión de la vimentina como un
antígeno. Este anticuerpo de la presente invención puede ser un
anticuerpo policlonal o monoclonal.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
producirse mediante diversos procedimientos. Dichos procedimientos
de producción de anticuerpos son conocidos en la técnica (Por
ejemplo, véase Harlow E.& Lane D., Antibody, Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1988)).
La vimentina sobre la que las caspasas actúan, es
una proteína filamentosa intermediaria, característica en las
células mesenquimáticas, tal como fibroblastos y leucocitos.
La Figura 1 es un esquema que muestra un sitio de
una proteína filamentosa intermediaria, vimentina, que va a ser
escindido por una caspasa, cuando la apoptosis se inicia por el
tratamiento con el anticuerpo Fas. Las caspasas utilizadas en la
presente invención incluyen la caspasa-8. La
caspasa-8 reconoce y escinde el lado
C-terminal de Asp-259 de una
secuencia aminoácida de la vimentina en el hombre o en el ratón
(SEC. ID. nº:3 para el hombre, SEC. ID. nº:4 para un ratón). Según
la presente invención, los dos tipos de anticuerpos pueden ser
producidos contra la proteína vimentina o el péptido que es
escindido por la caspasa-8 entre
Asp-259 y Val-260: un anticuerpo
que reconoce el fragmento N-terminal resultante (al
que se hace alusión como anticuerpo V1), y un anticuerpo que
reconoce el fragmento C-terminal resultante (al que
se alude como anticuerpo V2). Véase la Figura 1.
Cuando el anticuerpo V1 se produce, un fragmento
proteico o peptídico que posee como máximo 259 residuos aminoácidos,
preferentemente 6 residuos de aminoácidos, o más preferentemente, 5
residuos aminoácidos, desde Asp-259 a la primera Met
(metionina) sobre el extremo N, entre la secuencia aminoácida que
se muestra en SEC. ID. nº:3 ó 4, puede emplearse como un antígeno.
De modo similar, cuando el anticuerpo V2 se produce, un fragmento
proteico o peptídico que posee como máximo 207 residuos
aminoácidos, preferentemente 6 residuos de aminoácidos, o más
preferentemente, 5 residuos aminoácidos, desde
Val-260 a Glu-466 sobre el extremo
C, entre la secuencia aminoácida que se muestra en SEC.ID. nº: 3 ó
4, puede emplearse como un antígeno. Para mejorar además la
antigenicidad, se permitió que cada uno de las fragmentos proteicos
o peptídicos anteriores lleve a cabo una reacción de acoplamiento en
un extremo distinto que el que resultó en la escisión por una
caspasa. Es preferible, para facilitar la reacción de acoplamiento,
que un residuo Cys se una a la proteína o péptido terminal.
Las proteínas o péptidos, tal como son producidas
en (1), son administradas como antígenos a mamíferos, tales como
ratas, ratones, o conejos. Una dosis del antígeno por animal es de
0,1 a 100 mg, cuando no se utiliza adyuvante, y de 1 a 100 \mug
cuando se utiliza adyuvante. Los adyuvantes incluyen el adyuvante
completo de Freund (FCA), el adyuvante incompleto de Freund (FIA), y
adyuvante de hidróxido de aluminio. La inmunización es
principalmente llevada a cabo mediante inyección intravenosa,
subcutánea, o intraperitoneal. Además, los intervalos de
inmunización no están particularmente limitados. La inmunización se
lleva a cabo de 1 a 10 veces, preferentemente de 2 a 5 veces, a
intervalos de varios días a varias semanas, preferentemente de 2 a
5 intervalos semanales. Las células productoras de anticuerpos se
recuperan de uno a 60 días, preferentemente de 1 a 14 días después
de la inmunización final. Ejemplos de células que producen
anticuerpos incluyen las células del bazo, células de nódulos
linfáticos, células sanguíneas periféricas, preferentemente células
del bazo o células de nódulos linfáticos locales.
A las células que producen anticuerpos se las
deja fusionarse con células de mieloma, de forma que se obtengan
hibridomas. Las células de mieloma que van a fusionarse con las
células productoras de anticuerpos pueden incluir progenies
celulares establecidas de animales, generalmente disponibles, tales
como las de un ratón. Las progenies celulares establecidas
preferentemente que se utilizan en la presente memoria tienen
selectividad para los medicamentos y no pueden sobrevivir en medios
selectivos HAT que contengan hipoxantina, aminopterina y timidina
cuando no están fusionadas, pero pueden sobrevivir sólo cuando se
fusionan con las células productoras de anticuerpos. Ejemplos
específicos de células de mieloma incluyen progenies celulares de
mieloma de ratón, tales como X63Ag.8.653,
NSI/1-Ag4-1, y NS0/1; y progenies
celulares de mieloma de rata, tal como YB 2/0.
A continuación, las células de mieloma se
fusionan con las células productoras de anticuerpos. Brevemente, de
1x10^{6} a 1x10^{7} células/ml de células productoras de
anticuerpos se mezclan con 2x10^{5} a 2x10^{6} células/ml de
células de mieloma en un medio de cultivo de células animales tal
como el DMEM sin suero o el RPMI-1640. La
proporción de células preferibles de las células productoras de
anticuerpos a las células de mieloma es de 2:1 a 3:1. Entonces, se
llevó a cabo la reacción de fusión en presencia de un promotor de la
fusión celular. El promotor de la fusión celular, es, por ejemplo,
polietilenglicol de un peso molecular medio de 1.000 a 6.000
daltons. Además, un dispositivo de fusión celular disponible
comercialmente que utiliza la estimulación mediante impulsos
eléctricos, por ejemplo, electroporación, puede utilizarse para
fusionar células productoras de anticuerpos con células de
mieloma.
Los hibridomas de interés se seleccionaron a
partir de las células fusionadas. En primer lugar, la suspensión
celular se diluyó apropiadamente con un medio tal como el
RPMI-1640 que contiene suero fetal de ternera,
disponiéndose en pocillos de placas de microtitulación alrededor de
3x10^{5} células/pocillo, añadiendo a cada pocillo medio de
selección, y cultivándose las células mientras se reemplaza
apropiadamente el medio de selección. Las células que crecen
alrededor de 14 días después del comienzo de los cultivos en el
medio de selección, pueden obtenerse como hibridomas.
A continuación, se examinaron sobrenadantes de
los cultivos de células de hibridoma, rastreando la presencia de
anticuerpos que reaccionaran con el producto de escisión de la
vimentina. El rastreo de hibridomas puede llevarse a cabo mediante
cualquiera de los procedimientos convencionales y no está limitado
particularmente. Por ejemplo, una parte del sobrenadante del cultivo
contenido en un pocillo en el cual ha crecido un hibridoma, puede
recuperarse y someterse a rastreo, utilizando un inmunoensayo
enzimático o un radioinmunoensayo.
La clonación de células fusionadas se lleva a
cabo mediante el procedimiento de dilución limitante o similar.
Finalmente, se establecen los hibridomas que son células que
producen anticuerpos monoclonales que reaccionan con el producto de
escisión de la vimentina, pero no con la vimentina intacta.
Los anticuerpos monoclonales pueden recuperarse a
partir de hibridomas establecidos utilizando procedimientos
convencionales, tales como un procedimiento de cultivo celular, y
el procedimiento de formación de ascitis.
En el procedimiento del cultivo celular, los
hibridomas se hacen crecer en medio de cultivo para células
animales, tales como suero fetal de ternera al 10% conteniendo
medios RPMI-1640 ó MEM, o medio sin suero bajo
condiciones convencionales de cultivo (por ejemplo, a 37^{0}C,
bajo CO_{2} al 5%), durante 7 a 14 días. Entonces los anticuerpos
se recuperaron a partir de los sobrenadantes del cultivo.
En el procedimiento de formación de la ascitis,
se administraron intraperitonealmente alrededor de 1x10^{7}
células de hibridomas a animales que pertenecían a las mismas
especies de mamíferos a partir de los cuales se derivaron las
células de mieloma, de forma que creció un gran número de
hibridomas. Después de 1 a 2 semanas, se recuperó el líquido
ascítico.
Cuando la purificación de anticuerpos se necesita
en los procedimientos de recuperación anteriormente descritos, los
anticuerpos pueden purificarse mediante procedimientos conocidos
tales el del sulfato amónico, cromatografía de intercambio iónico,
filtración en gel, y cromatografía de afinidad. Estos
procedimientos pueden utilizarse independientemente o
combinados.
Los antígenos preparados tal como se ha descrito
anteriormente, se administraron a mamíferos, tales como ratas,
ratones, y conejos. Una dosis de antígenos por animal es de 0,1 a
100 mg, cuando no se utiliza adyuvante, y de 10 a 1.000 \mug
cuando se utiliza adyuvante. Los adyuvantes utilizados en la
presente invención incluyen el adyuvante completo de Freund (FCA),
el adyuvante incompleto de Freund (FIA), y el adyuvante de
hidróxido de aluminio. La inmunización es principalmente llevada a
cabo mediante inyección intravenosa, subcutánea, o intraperitoneal.
Los intervalos de inmunización no están particularmente limitados.
La inmunización se lleva a cabo de 1 a 10 veces, preferentemente de
2 a 5 veces, a intervalos de varios días a varias semanas,
preferentemente de 2 a 5 intervalos semanales. De seis a 60 días
después de la inmunización final, se midió el título de anticuerpos
utilizando ELISA (ensayo inmunoenzimático), EIA
(enzimoinmunoanálisis) o RIA (radioinmunoensayo). En un día en que
se dio el máximo título de anticuerpos, la sangre se recogió para
obtener el antisuero.
Posteriormente, se midió mediante ELISA la
reactividad de los anticuerpos policlonales en el antisuero contra
el producto de escisión de la vimentina. Los anticuerpos
policlonales que mostraron una reactividad intensa contra el
producto de la vimentina, pero que no lo hicieron contra la
vimentina intacta, se seleccionaron.
Por ejemplo, los anticuerpos policlonales en el
antisuero se aplicaron a una columna de afinidad, a la cual se fijó
el producto de escisión de la vimentina, recuperando por ello los
anticuerpos (fracción de adsorción de la columna) que reaccionaron
con el producto de escisión de la vimentina. Entonces, los
anticuerpos resultantes se aplicaron a una columna de afinidad
fijada con la vimentina intacta, recuperando por ello los
anticuerpos que no se absorbían pero fluían. Finalmente, los
anticuerpos obtenidos se sometieron a ELISA para confirmar si
reaccionaban con el producto de escisión de la vimentina pero no lo
hacían con la vimentina intacta.
Los anticuerpos anteriormente mencionados pueden
utilizarse para detectar (por ejemplo, cuantificar) el producto de
escisión de la vimentina en la presente invención. Por ejemplo, una
muestra que contenga el producto de escisión de la vimentina puede
incubarse con el anticuerpo monoclonal o policlonal de la presente
invención, seguido por un anticuerpo anti-IgG de
ratón marcado con un enzima tal como la peroxidasa de rábano (HRP).
La cantidad del producto de escisión de la vimentina en la muestra
puede determinarse midiendo la intensidad de color desarrollada
durante la reacción enzimática, utilizando un dispositivo de
medición. El valor medido puede emplearse como un indicador para la
detección de la actividad de la caspasa. Un valor medido mayor
representa una actividad aumentada de la caspasa, indicando que la
apoptosis de la célula prueba ha progresado.
Los anticuerpos de la presente invención pueden
también utilizarse para detectar la apoptosis haciendo reaccionar
el anticuerpo con células en una muestra biológica. Por ejemplo, la
muestra que va a ensayarse puede incubarse con los anticuerpos
anteriores. El producto de escisión de la vimentina que se encuentra
en la muestra, puede detectarse y cuantificarse utilizando un
anticuerpo anti- IgG de ratón marcado con peroxidasa de rábano
(HRP), según los procedimientos convencionales.
Un valor medido mayor que el control negativo
indica una actividad más alta de caspasa. Por el contrario, un valor
medido inferior al control positivo, indica un actividad más baja
de caspasa. Estos valores medidos pueden utilizarse como datos para
la determinación de la progresión de la apoptosis. Por ejemplo,
pueden utilizarse como indicadores de la progresión de enfermedades
autoinmunes tales como el lupus eritematoso sistémico (SLE), la
anemia hemolítica autoinmune y la enfermedad de Basedow's o el
síndrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA).
El anticuerpo contra el producto de escisión de
la vimentina puede utilizarse como varios reactivos en la presente
invención. Por ejemplo, cuando un anticuerpo se utiliza como un
reactivo para detectar el producto de escisión de la vimentina, la
detección puede llevarse a cabo utilizando el procedimiento que se
muestra anteriormente en la Sección 2. El reactivo según la presente
invención puede incluir, por ejemplo, un anticuerpo
anti-IgG de ratón marcado con HRP, un anticuerpo
anti-IgG de ratón marcado con HRP, un substrato para
HRP y un tampón, así como al anticuerpo anterior.
Alternativamente, cuando el anticuerpo de la
presente invención se utiliza como un reactivo para la tinción
inmunohistoquímica, la detección puede llevarse a cabo según un
procedimiento convencional para la tinción inmunohistoquímica. En
este caso, el reactivo según la presente invención, puede incluir,
por ejemplo, un anticuerpo anti-IgG de ratón
marcado con HRP, un anticuerpo anti-IgG de ratón
marcado fluorescentemente, un substrato para HRP y un tampón, así
como al anticuerpo anterior. Por ejemplo, varios cortes
microscópicos tisulares obtenidos mediante biopsia de pacientes de
SLE, pueden prepararse mediante procedimientos convencionales para
reaccionar con el anticuerpo de la presente invención. Estos cortes
pueden incubarse con un anticuerpo anti-IgG de ratón
marcado con peroxidasa de rábano (HRP) como anticuerpo secundario,
y tratarse entonces con un substrato
3,3'-diaminobencidina para desarrollar un color
castaño. El área de color castaño que se encontró en el corte
(tisular) indica que la caspasa se ha activado en este área.
La presente invención se describe posteriormente
en los ejemplos siguientes. Estos ejemplos se proporcionan sólo con
propósitos ilustrativos, y no tienen la intención de limitar el
alcance de la invención.
Los péptidos utilizados para la inmunización se
obtuvieron de Biologica Co. (Nagoya, Japón). La hemocianina
activada (Imject Maleimide-KLH) se obtuvo de Pierce
(Rockford, IL, USA). La celulofina activada por FMP se obtuvo de
Seikagaku Corp. (Tokyo, Japón). Otros reactivos bioquímicos se
obtuvieron de Sigma-Aldrich Japón
(Tokyo,Japón).
Péptidos sintetizados (2 mg) se disolvieron en
tampón fosfato de Dulbecco (al que en lo sucesivo se hará
referencia como PBS; Harlow E. & Lane, D. (1988)
"Antibody", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY, USA).
Estos péptidos tienen las secuencias siguientes,
respectivamente:
Cys-Gln-Ile-Asp-Val-Asp
(SEC. ID. nº:1; a la que se hará referencia como secuencia V1) y
Val-Ser-Lys-Pro-Asp-Cys
(SEC.ID. nº:2, a la que se hará referencia como secuencia V2).
Las secuencias V1 y V2 corresponden a cinco
residuos aminoácidos que se encuentran inmediatamente N- y C-
terminales al sitio de escisión por la caspasa-8 en
la proteína vimentina, teniendo cada uno, respectivamente, un
residuo Cys para la reacción de acoplamiento, en un extremo distinto
que el sitio de escisión por la caspasa-8 (Figura
1). Las secuencias V1 y V2 se disolvieron en 400 \mul y 200
\mul de PBS, respectivamente. Cada solución se mezcló con 200
\mul de hemocianina activada (Imject
Maleimide-KLH) para empezar la reacción de
acoplamiento. Cada mezcla reactiva se sometió suavemente a
rotación, a temperatura ambiente, durante 2,5 horas. El producto de
la reacción se dializó con PBS a 4^{0}C para eliminar los
péptidos que no habían reaccionado. El conjugado
péptido-transportador resultante se diluyó con PBS
hasta un volumen final de 5 ml.
El conjugado
péptido-transportador anteriormente mencionado se
mezcló bien con el adyuvante de Freund (Harlow E. & Lane, D.
(1988) "Antibody", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
Spring Harbor, NY, USA), y se inyectó subcutáneamente a un conejo
blanco New Zealand para inmunización. El conjugado
péptido-transportador que contenía 400 \mug del
péptido se utilizó por inyección. El conejo se inmunizó 4 veces en
los días 1, 9, 22 y 31. La sangre circulante se recogió después de 8
días de la inmunización final para preparar el antisuero mediante
procedimientos convencionales.
0,3 g de una resina activada (celulofina activada
por FMP) se hincharon en agua destilada (50 ml) y con ella se
rellenaron columnas Econo (Bio-Rad, Hercules, CA,
USA). La resina en la columna se lavó posteriormente con 10 ml de
agua destilada. Un miligramo del péptido sintetizado (secuencia V1
o V2) se disolvió en 10 ml de tampón de acoplamiento (50 mM
Na_{2}CO_{3}/NaHCO_{3}, pH 8,5) y se mezcló con la resina en
la columna para empezar la reacción de acoplamiento. Ésta continuó
por la noche a 4ºC con rotación. La resina se incubó posteriormente
con 20 ml de tampón bloqueante (50 mM Tris-HCL, pH
8,0, 0,1 M monoetanolamina) a temperatura ambiente durante 4 horas
con rotación, con objeto de bloquear la resina que no había
reaccionado. Posteriormente, los péptidos que no habían reaccionado
se eliminaron lavando secuencialmente con las soluciones siguientes
(20 ml cada una): 1) agua destilada; 2) 0,1 M
Gly-HCL (pH 2,5); 3) 10 ml de agua destilada; 4)
tampón de lavado (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M NaCl,
Tritón X-100 al 1%) y 5) agua destilada.
La columna de afinidad preparada se lavó con 10
ml de tampón de elución (0,1 M Gly-HCl, pH 2,5), 10
ml de agua destilada, seguido por 20 ml TBS (20 mM
Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 M NaCl) utilizado
inmediatamente antes para la purificación por afinidad.
El antisuero (3 ml para la secuencia V1, 6 ml
para la secuencia V2) se cargó en la columna anteriormente
considerada y se mezcló bien con una resina de afinidad. Se dejó
que la columna permaneciera a temperatura ambiente durante 1 hora
para causar la unión de los anticuerpos a la resina. Para eliminar
las proteínas no unidas específicamente, la columna se lavó
secuencialmente con las soluciones siguientes: 1) 10 ml TBS; 2) 30
ml de tampón de lavado (supra); 3) 30 ml TBS y 4) 10 ml de
0,15 M NaCl. Los anticuerpos específicos se eluyeron con un tampón
de elución de 4 ml (supra). La fracción proteica eluída a
partir de la columna, se mezcló inmediatamente con 1 M Tris (0,2 ml)
en hielo para recuperar su pH en un intervalo neutral (de
valores).
Finalmente, se obtuvieron respectivamente 4 ml
del anticuerpo anti-V1 (2,75 mg/ml) y 0,15 mg/ml
del anticuerpo anti-V2. Estos anticuerpos
purificados se dividieron en alícuotas y se guardaron congelados a
-20^{0}C.
Se indujo a la progenie celular T humana Jurkat o
SKW66.4 (4x10^{5} células/ml) a experimentar apoptosis mediante
tratamiento con 200 ng/ml del anticuerpo anti-Fas
(Medical & Biological Laboratories Co., Ltd, Nagoya, Japón). El
tratamiento continuó entre 0 y 8 horas, siendo ésta la duración más
larga. Las células (2x10^{6}) se recuperaron mediante
centrifugación (1.000 rpm/min, 5 minutos), suspendiéndose entonces
en PBS. Las células se centrifugaron otra vez bajo idénticas
condiciones, tal como se definió anteriormente, para eliminar el
medio de cultivo en la muestra. Cada muestra celular se trató
mediante ultrasonidos durante 20 segundos en 40 \mul del tampón
de la muestra (62, 5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 6M urea,
dodecilsulfato sódico al 2% (SDS), glicerol al 10%, azul de
bromofenol al 0,003%) para llevar a cabo una electroforesis en gel
de SDS-poliacrilamida. Las proteínas en cada muestra
de lisado celular se separaron mediante una electroforesis en gel
de poliacrilamida al 12% (Laemmli, U.K. (1970) Nature, 227,
680-685) y se transfirieron a una membrana de
nitrocelulosa utilizando un dispositivo de transferencia Semidry
(Nihon EIDO, Tokyo, Japón) para formar transferencias Western.
Las transferencias Western se sometieron a
inmunotinción mediante un procedimiento de marcado
quimioluminiscente (ECL) (Harlow E. & Lane, D. (1988)
"Antibody", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY, USA). Un anticuerpo primario fue un anticuerpo V9
anti-vimentina comercialmente disponible (8,8
\mug/ml, Sigma-Aldrich Japón, Tokyo, Japón) o el
anticuerpo anti-V1 o V2 (0,2 \mug/ml). Un
anticuerpo secundario fue un anticuerpo anti-IgG de
ratón o conejo marcado con peroxidasa de rábano (dilución de 1000
veces, Cappel, Durham, NC, USA). Después de la incubación con el
anticuerpo secundario, las transferencias Western se visualizaron
utilizando el equipo ECL Plus (Amersham Japan, Tokyo, Japón). Se
llevó a cabo la inmunotinción según las instrucciones del
fabricante. Los resultados se muestran en las Figs 2 y 3.
La Figura 2 muestra transferencias Western del
lisado celular Jurkat tratadas con el anticuerpo
anti-Fas. Después de la electroforesis, las
transferencias se sometieron a inmunotinción con el anticuerpo
anti-vimentina (V9). Después del tratamiento con el
anticuerpo anti-Fas durante varias horas, las
caspasas escindieron la vimentina (58 kDa) en un máximo de tres
sitios en fragmentos de distinto tamaño.
Cuando el lisado de las células que
experimentaban la apoptosis se sometió al análisis de transferencia
Western utilizando el anticuerpo anti-V1 o
anti-V2, estos anticuerpos tiñeron sólo
específicamente los fragmentos de vimentina generados por la
escisión de la secuencia
Ile-Asp-Val-Asp
(Figura 3). El anticuerpo anti-V1 detectó
fragmentos de 30 kDa y 19, 5 kDa, mientras que el anticuerpo
anti-V2 detectó fragmentos de 27 kDa y 21 kDa,
porque otras caspasas provocaron otra escisión casi simultáneamente
con o a continuación de la escisión por la
caspasa-8. Por otra parte, ni el anticuerpo
anti-V1 ni el anticuerpo anti-V2
reaccionaron con la vimentina intacta (58 kDa) que no había sufrido
escisión (véase la Figura 3, carril horario 0). Por tanto, la Figura
3 muestra que el anticuerpo de la presente invención reconoce sólo
fragmentos de vimentina que se encontraron en células que
experimentaban apoptosis.
La progenie celular T humana Jurkat
(4x10^{5}células/ml) fue inducida a experimentar apoptosis
mediante tratamiento con 200 ng/ml del anticuerpo anti- Fas (Medical
& Biological Laboratories Co., Ltd, Nagoya, Japón). Después del
tratamiento durante 6 horas, las células (1,5x10^{6}) se
recuperaron mediante centrifugación (1000 rpm/min, 5 min) y se
suspendieron entonces en PBS. Las células se centrifugaron otra vez
bajo idénticas condiciones, tal como las que se definieron
anteriormente, para eliminar el medio de cultivo en la muestra.
Las células recuperadas se fijaron en metanol
enfriado a -20^{0} durante 2 minutos. Las células fijadas se
lavaron con PBS y se sometieron a tinción de inmunofluorescencia
indirecta (Harlow E. & Lane, D. (1988) "Antibody", Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, USA). En
primer lugar, las células se incubaron con el anticuerpo
anti-V1 o anti-V2 (0,2 \mug/ml, en
PBS que contenía albúmina sérica bovina al 3%) a temperatura
ambiente durante 1 hora, lavándose con PBS para eliminar los
anticuerpos que no se habían unido. A continuación, se utilizó un
anticuerpo anti-IgG de conejo marcado
fluorescentemente (Alexa 448, Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA)
como un anticuerpo secundario, que se diluyó 500 veces y se añadió
a las células anteriormente citadas para llevar a cabo una
incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las células
se lavaron con PBS para eliminar los anticuerpos secundarios no
unidos. PBS contenía un reactivo DAPI de tinción del ADN (0,1
\mug/ml, Sigma-Aldrich) con objeto de visualizar
los cromosomas nucleares. Las células se examinaron entonces
mediante el microscopio de fluorescencia IX70 (Olympus Optical Co.,
Ltd, Tokyo, Japón).
Los resultados se muestran en la Figura 4. La
Figura 4 muestra una fotografía de las células sometidas a tinción
fluorescente con el anticuerpo anti-V2. Las células
apoptosicas podían identificarse mediante condensación y escisión de
sus núcleos, cuando se visualizaron utilizando DAPI (véanse las
pequeñas flechas en la Figura 4). Se encontró que el anticuerpo
anti-V2 sólo teñía las células que experimentaban
apoptosis. Las células que no experimentaban ésta (véanse las
flechas grandes en la Figura 4), no se tiñeron con el anticuerpo
anti-V2. Como control, las células Jurkat no
tratadas con el anticuerpo anti-Fas se examinaron
de modo similar, indicando que ninguna de estas células se teñía con
el anticuerpo anti-V2.
Se mostró que el anticuerpo de la presente
invención reaccionaba sólo con el producto de escisión de la
vimentina, pero no con la vimentina intacta.
La presente invención puede detectar la escisión
actual de los sustratos por la caspasa, sin tener en cuenta la de la
muestra, sea ésta proteína, célula o tejido. por tanto, la presente
invención permite :1) observar la conversión de
caspasa-8 desde su precursor a su forma activa; 2)
encontrar la forma activa de la caspasa-8 que
funciona actualmente en el interior celular; y 3) distinguir
selectivamente las células en las que la caspasa-8
se ha activado en las poblaciones celulares.
La presente invención proporciona el anticuerpo
que reacciona con el producto de escisión de la vimentina, pero no
con la vimentina intacta. Utilizando el anticuerpo de la presente
invención, la caspasa iniciadora que está en forma activa y escinde
proteínas, puede ser identificada detectando el producto de
escisión de la vimentina.
La vimentina se expresa intensamente en varios
tejidos que se están desarrollando. También se observa a menudo un
aumento en su expresión cuando los tejidos se vuelven cancerosos.
De acuerdo con esto, el anticuerpo de la presente invención puede
constituir un reactivo útil para examinar la actividad de las
caspasas en los tejidos en desarrollo o en las células cancerosas,
para la detección de la apoptosis, o para decidir regímenes
terapéuticos en las enfermedades relacionadas con la apoptosis.
SEC.ID. nº:1 PÉPTIDO SINTÉTICO
SEC.ID. nº:2 PÉPTIDO SINTÉTICO
Claims (14)
1. Anticuerpo o un fragmento del mismo que
reconoce un fragmento N- ó C-terminal de
vimentina,
en el que el fragmento N-terminal
comprende por lo menos 5 residuos aminoácidos desde Asp259 al
extremo N de la vimentina,
y en el que, el fragmento
C-terminal comprende por lo menos 5 residuos
aminoácidos desde Val260 al extremo C de la vimentina,
caracterizado porque el anticuerpo o un
fragmento del mismo reacciona con el producto de escisión de la
vimentina, obtenido mediante escisión de la vimentina intacta,
entre Asp259 y Val260, pero no reacciona con la vimentina
intacta.
2. Anticuerpo o fragmento del mismo según la
reivindicación 1, en el que el producto de escisión de la vimentina
se obtiene por la acción de la caspasa-8.
3. Anticuerpo o un fragmento del mismo o el
fragmento del mismo, según la reivindicación 1 ó la reivindicación
2, en el que la vimentina comprende la secuencia referida como
SEC. ID. nº:1, SEC. ID. nº:2, SEC. ID. nº:3, o SEC. ID. nº:4.
4. Anticuerpo o el fragmento del mismo, según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el anticuerpo es
un anticuerpo policlonal o un anticuerpo monoclonal.
5. Procedimiento para la preparación de un
anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo que reacciona con un
producto de escisión de vimentina que es escindido entre Asp259 y
Val 260, pero que no reacciona con la vimentina intacta, que
comprende las etapas siguientes:
- (a)
- provocación de una respuesta inmune en un mamífero no humano mediante la inmunización con un polipéptido antigénico que comprende los fragmentos N- ó C-terminales de la vimentina,
en el que el fragmento N-terminal
comprende por lo menos 5 residuos aminoácidos desde Asp259 al
extremo N de la vimentina,
y en el que, el fragmento
C-terminal comprende por lo menos 5 residuos
aminoácidos desde Val260 hasta el extremo C de la vimentina;
- (b)
- preparación de un hibridoma a partir de las células linfoides del huésped;
- (c)
- selección de un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que reacciona con un producto de escisión de la vimentina, pero no lo hace con una vimentina intacta; y
- (d)
- opcionalmente, el anticuerpo monoclonal es procesado en un fragmento del mismo; y
- (e)
- obtención del anticuerpo o de un fragmento del mismo.
6. Procedimiento para la preparación de un
anticuerpo policlonal que reacciona con un producto de escisión de
la vimentina que se escinde entre Asp259 y Val260 pero que no
reacciona con la vimentina intacta, que comprende las etapas
siguientes:
- (a)
- provocación de una respuesta inmune en un mamífero no humano mediante la inmunización con un polipéptido antigénico que comprende los fragmentos N- ó C-terminales de la vimentina, escindida entre Asp259 y Val260
en la que el fragmento N-terminal
comprende por lo menos 5 residuos aminoácidos desde Asp259 al
extremo N de la vimentina,
y en el que, el fragmento
C-terminal comprende por lo menos 5 residuos
aminoácidos desde Val260 hasta el extremo C de la vimentina;
- (b)
- obtención de un antisuero a partir de la sangre del huésped mamífero no humano; y
- (c)
- obtención del anticuerpo o de un fragmento del mismo.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el
que el producto de escisión de la vimentina se obtiene mediante la
acción de una caspasa-8.
8. Procedimiento según la reivindicación 6 ó 7,
en el que la vimentina comprende las secuencias referidas SEC. ID.
nº:1, SEC. ID. nº:2, SEC. ID. nº:3, o SEC. ID. nº:4.
9. Anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo
susceptible de ser obtenido mediante el procedimiento según la
reivindicación 5.
10. Anticuerpo policlonal o un fragmento del
mismo susceptible de ser obtenido mediante el procedimiento según
cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8.
11. Procedimiento para la detección de la
actividad in vitro de la caspasa, en el que la caspasa
reconoce y escinde la vimentina entre Asp259 y Val260, que
comprende las etapas siguientes:
- (a)
- permitir que el anticuerpo o el fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, reaccione con un producto de escisión de la vimentina; y
- (b)
- detección del producto reactivo resultante.
12. Procedimiento para la detección de la
apoptosis in vitro, que comprende las etapas siguientes:
- (a)
- permitir que el anticuerpo o el fragmento del mismo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, reaccione con un producto de escisión de la vimentina que se escinde entre Asp259 y Val260 mediante una caspasa; y
- (b)
- detección del producto reactivo resultante.
13. Equipo para la detección de la apoptosis, que
comprende el anticuerpo o un fragmento del mismo según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4.
14. Equipo según la reivindicación 13, que
comprende un primer anticuerpo, un segundo anticuerpo marcado con un
enzima, un substrato y un tampón.
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