JPH07258296A - 抗ｃｄｃ２キナーゼリン酸化ビメンチンモノクローナル抗体 - Google Patents
抗ｃｄｃ２キナーゼリン酸化ビメンチンモノクローナル抗体Info
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- JPH07258296A JPH07258296A JP6057661A JP5766194A JPH07258296A JP H07258296 A JPH07258296 A JP H07258296A JP 6057661 A JP6057661 A JP 6057661A JP 5766194 A JP5766194 A JP 5766194A JP H07258296 A JPH07258296 A JP H07258296A
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- vimentin
- phosphorylated
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 細胞骨格の中間径フィラメントの一種である
ビメンチンのリン酸化状態を特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体である。すなわち、ｃｄｃ２キナーゼによっ
てリン酸化されたビメンチンとは反応するが、非リン酸
化ビメンチン、または、Ａキナーゼ、Ｃキナーゼ、ｃｄ
ｃ２キナーゼ若しくはＣａ2+カルモジュリンキナーゼＩ
Ｉによってリン酸化されたビメンチンとは反応しない、
抗ｃｄｃ２キナーゼリン酸化ビメンチンモノクローナル
抗体。 【効果】 細胞が増殖刺激を受けてその形状変化を来す
分子機序の解析を容易に行うことができる。
ビメンチンのリン酸化状態を特異的に認識するモノクロ
ーナル抗体である。すなわち、ｃｄｃ２キナーゼによっ
てリン酸化されたビメンチンとは反応するが、非リン酸
化ビメンチン、または、Ａキナーゼ、Ｃキナーゼ、ｃｄ
ｃ２キナーゼ若しくはＣａ2+カルモジュリンキナーゼＩ
Ｉによってリン酸化されたビメンチンとは反応しない、
抗ｃｄｃ２キナーゼリン酸化ビメンチンモノクローナル
抗体。 【効果】 細胞が増殖刺激を受けてその形状変化を来す
分子機序の解析を容易に行うことができる。
Description
【０００１】［発明の背景］
【産業上の利用分野】本発明は、ｃｄｃ２キナーゼによ
ってリン酸化されたビメンチンと特異的に反応するモノ
クローナル抗体およびその製造法、ならびにそれを用い
たｃｄｃ２キナーゼリン酸化ビメンチンの放射性元素を
用いない測定法に関する。
ってリン酸化されたビメンチンと特異的に反応するモノ
クローナル抗体およびその製造法、ならびにそれを用い
たｃｄｃ２キナーゼリン酸化ビメンチンの放射性元素を
用いない測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ヒトを含む哺乳動物の細胞骨格は微小
管、中間径フィラメント、アクチンフィラメントの主要
三線維の相互関連により構成されている。これらは細胞
の骨組み的な役割を担うだけでなく、繊維系の重合、脱
重合により細胞の形態的変化を起こすなど動的な機能を
果たしていると考えられている。また、ガン細胞は、正
常細胞とは違った形態、認識反応応答を示すことから、
細胞のガン化と細胞骨格の質的変化の関係が指摘されて
いる。
管、中間径フィラメント、アクチンフィラメントの主要
三線維の相互関連により構成されている。これらは細胞
の骨組み的な役割を担うだけでなく、繊維系の重合、脱
重合により細胞の形態的変化を起こすなど動的な機能を
果たしていると考えられている。また、ガン細胞は、正
常細胞とは違った形態、認識反応応答を示すことから、
細胞のガン化と細胞骨格の質的変化の関係が指摘されて
いる。
【０００３】細胞骨格の内、中間径フィラメントは生化
学的および免疫学的知見から、ケラチンフィラメント、
デスミンフィラメント、ビメンチンフィラメント、ニュ
ーロフィラメント、グリアフィラメントおよびラミナの
六種類に大別されている（Steinert R M & Roop D R, M
olecular and cellular biology of intermediate fila
ments. Annu Rev Biochem 57, 593-626(1988) ）。
学的および免疫学的知見から、ケラチンフィラメント、
デスミンフィラメント、ビメンチンフィラメント、ニュ
ーロフィラメント、グリアフィラメントおよびラミナの
六種類に大別されている（Steinert R M & Roop D R, M
olecular and cellular biology of intermediate fila
ments. Annu Rev Biochem 57, 593-626(1988) ）。
【０００４】最近、細胞分裂期に活性化されたｃｄｃ２
キナーゼがビメンチンフラグメント（以下単に「ビメン
チン」という）を化学量論的に有意にリン酸化し、この
リン酸化によってビメンチンの脱重合が引き起こされる
ことが報告されている（Chou,Y.H. et al,Intermediate
filament reorganization during mitosis is mediate
d by p34cdc2 phosphorylation of vimentin. Cell 62,
1063-1071(1990)）。
キナーゼがビメンチンフラグメント（以下単に「ビメン
チン」という）を化学量論的に有意にリン酸化し、この
リン酸化によってビメンチンの脱重合が引き起こされる
ことが報告されている（Chou,Y.H. et al,Intermediate
filament reorganization during mitosis is mediate
d by p34cdc2 phosphorylation of vimentin. Cell 62,
1063-1071(1990)）。
【０００５】このリン酸化を容易に観察できれば、例え
ば細胞が増殖刺激を受けてその形状変化を来す分子機序
の解析が可能となり、さらには細胞のガン化との関連な
どの知見を容易に得ることができると思われる。
ば細胞が増殖刺激を受けてその形状変化を来す分子機序
の解析が可能となり、さらには細胞のガン化との関連な
どの知見を容易に得ることができると思われる。
【０００６】このｃｄｃ２キナーゼによるビメンチンの
リン酸化を、例えば［γ−32Ｐ］−ＡＴＰを用いてリン
酸化し、32Ｐの存在によってそのリン酸化を観察するこ
とも可能であるが、放射性元素の利用は設備、廃棄物の
処理などの面で制約がある。従って非放射性的な手法に
よってこのリン酸化が観察できれば好ましいと言える。
リン酸化を、例えば［γ−32Ｐ］−ＡＴＰを用いてリン
酸化し、32Ｐの存在によってそのリン酸化を観察するこ
とも可能であるが、放射性元素の利用は設備、廃棄物の
処理などの面で制約がある。従って非放射性的な手法に
よってこのリン酸化が観察できれば好ましいと言える。
【０００７】［発明の概要］
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明はビメ
ンチンのリン酸化状態を非放射性的な手法によって観察
することを可能にする、ビメンチンのリン酸化状態に特
異的に認識するモノクローナル抗体およびその製造法の
提供をその目的としている。また、本発明は前記モノク
ローナル抗体産生能を有するハイブリドーマ細胞の提供
をその目的としている。さらに、本発明は前記モノクロ
ーナル抗体を含んでなる、ｃｄｃ２キナーゼによってリ
ン酸化されたビメンチンの測定キットの提供をその目的
としている。
ンチンのリン酸化状態を非放射性的な手法によって観察
することを可能にする、ビメンチンのリン酸化状態に特
異的に認識するモノクローナル抗体およびその製造法の
提供をその目的としている。また、本発明は前記モノク
ローナル抗体産生能を有するハイブリドーマ細胞の提供
をその目的としている。さらに、本発明は前記モノクロ
ーナル抗体を含んでなる、ｃｄｃ２キナーゼによってリ
ン酸化されたビメンチンの測定キットの提供をその目的
としている。
【０００８】
【課題を解決するための手段】よって、本発明によるモ
ノクローナル抗体は、ｃｄｃ２キナーゼによってリン酸
化されたビメンチンとは反応するが、非リン酸化ビメン
チン、または、Ａキナーゼ、Ｃキナーゼ、ｃｄｃ２キナ
ーゼ若しくはＣａ2+カルモジュリンキナーゼＩＩによっ
てリン酸化されたビメンチンとは反応しないもの、であ
る。また、本発明によるモノクローナル抗体の製造法
は、ｃｄｃ２キナーゼでリン酸化されたビメンチンで免
疫された動物から得られた脾臓細胞と、ミエローマ細胞
とを融合させ、ｃｄｃ２キナーゼによってリン酸化され
たビメンチンとは反応するが、非リン酸化ビメンチン、
または、Ａキナーゼ、Ｃキナーゼ、ｃｄｃ２キナーゼ若
しくはＣａ2+カルモジュリンキナーゼＩＩによってリン
酸化されたビメンチンとは反応しないモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ細胞を取得し、該ハイブリ
ドーマ細胞を培養し、該培養液から前記モノクローナル
抗体を単離することを特徴とするもの、である。本発明
によれば、ビメンチンのリン酸化状態を非放射性的な手
法によって観察することが可能となる。
ノクローナル抗体は、ｃｄｃ２キナーゼによってリン酸
化されたビメンチンとは反応するが、非リン酸化ビメン
チン、または、Ａキナーゼ、Ｃキナーゼ、ｃｄｃ２キナ
ーゼ若しくはＣａ2+カルモジュリンキナーゼＩＩによっ
てリン酸化されたビメンチンとは反応しないもの、であ
る。また、本発明によるモノクローナル抗体の製造法
は、ｃｄｃ２キナーゼでリン酸化されたビメンチンで免
疫された動物から得られた脾臓細胞と、ミエローマ細胞
とを融合させ、ｃｄｃ２キナーゼによってリン酸化され
たビメンチンとは反応するが、非リン酸化ビメンチン、
または、Ａキナーゼ、Ｃキナーゼ、ｃｄｃ２キナーゼ若
しくはＣａ2+カルモジュリンキナーゼＩＩによってリン
酸化されたビメンチンとは反応しないモノクローナル抗
体を産生するハイブリドーマ細胞を取得し、該ハイブリ
ドーマ細胞を培養し、該培養液から前記モノクローナル
抗体を単離することを特徴とするもの、である。本発明
によれば、ビメンチンのリン酸化状態を非放射性的な手
法によって観察することが可能となる。
【０００９】［微生物の寄託］本発明によるハイブリド
ーマ細胞４Ａ４は、平成６年 月 日付けで、通産省工
業技術院生命工学工業研究所に、受託番号「ＦＥＲＭ
Ｐ−１４２４２」のもと寄託されている。
ーマ細胞４Ａ４は、平成６年 月 日付けで、通産省工
業技術院生命工学工業研究所に、受託番号「ＦＥＲＭ
Ｐ−１４２４２」のもと寄託されている。
【００１０】［発明の具体的説明］本発明によるモノク
ローナル抗体は、ｃｄｃ２キナーゼによってリン酸化さ
れたビメンチンと特異的に反応するものである。従っ
て、非リン酸化ビメンチン、または、Ａキナーゼ、Ｃキ
ナーゼ、ｃｄｃ２キナーゼ若しくはＣａ2+カルモジュリ
ンキナーゼＩＩによってリン酸化されたビメンチンとは
反応しない。本発明において、ｃｄｃ２キナーゼリン酸
化ビメンチンに特異的であるとは、ｃｄｃ２キナーゼに
よって部位特異的にリン酸化された部位に特異的である
ことを意味する。
ローナル抗体は、ｃｄｃ２キナーゼによってリン酸化さ
れたビメンチンと特異的に反応するものである。従っ
て、非リン酸化ビメンチン、または、Ａキナーゼ、Ｃキ
ナーゼ、ｃｄｃ２キナーゼ若しくはＣａ2+カルモジュリ
ンキナーゼＩＩによってリン酸化されたビメンチンとは
反応しない。本発明において、ｃｄｃ２キナーゼリン酸
化ビメンチンに特異的であるとは、ｃｄｃ２キナーゼに
よって部位特異的にリン酸化された部位に特異的である
ことを意味する。
【００１１】さらに本発明によるモノクローナル抗体
は、種々の細胞においてビメンチンと特異的に反応する
性質を有している。具体的には、マウスおよびヒトビメ
ンチンのみならず、ハムスター、イヌ、ウシなどの細胞
におけるビメンチンと特異的に反応する性質を有する。
は、種々の細胞においてビメンチンと特異的に反応する
性質を有している。具体的には、マウスおよびヒトビメ
ンチンのみならず、ハムスター、イヌ、ウシなどの細胞
におけるビメンチンと特異的に反応する性質を有する。
【００１２】本発明によるモノクローナル抗体は以上の
ような性質を有することから、それを直接酵素によって
標識し、またはそれと特異的に反応する、酵素によって
標識された二次抗体を用いることによって、ｃｄｃ２キ
ナーゼによってリン酸化されたビメンチンの存在非存
在、さらには存在量を放射性元素を用いることなく測定
することが可能となる。とりわけ、本発明によるモノク
ローナル抗体がマウス由来の抗体である場合、市販の標
識抗マウス抗体を二次抗体として用いることによって容
易にｃｄｃ２キナーゼによってリン酸化されたビメンチ
ンの測定が可能となる。
ような性質を有することから、それを直接酵素によって
標識し、またはそれと特異的に反応する、酵素によって
標識された二次抗体を用いることによって、ｃｄｃ２キ
ナーゼによってリン酸化されたビメンチンの存在非存
在、さらには存在量を放射性元素を用いることなく測定
することが可能となる。とりわけ、本発明によるモノク
ローナル抗体がマウス由来の抗体である場合、市販の標
識抗マウス抗体を二次抗体として用いることによって容
易にｃｄｃ２キナーゼによってリン酸化されたビメンチ
ンの測定が可能となる。
【００１３】本発明によるモノクローナル抗体は、例え
ば次のようにして製造することができる。すなわち、ｃ
ｄｃ２キナーゼによってリン酸化されたビメンチン、好
ましくは下記の抗原の製造手順に従って得た抗原タンパ
ク質、でマウスまたはラットなどの動物を免疫し、免疫
された動物から抗体産生細胞（好ましくは脾臓細胞）を
得、これとミエローマ細胞とを融合し、得られた融合細
胞をクローン化し、本発明によるモノクローナル抗体を
産生し得る融合細胞を選択し、これを培養して抗体を回
収する。上記免疫、融合、融合細胞の選択などは既に公
知の手法によって行うことができる。
ば次のようにして製造することができる。すなわち、ｃ
ｄｃ２キナーゼによってリン酸化されたビメンチン、好
ましくは下記の抗原の製造手順に従って得た抗原タンパ
ク質、でマウスまたはラットなどの動物を免疫し、免疫
された動物から抗体産生細胞（好ましくは脾臓細胞）を
得、これとミエローマ細胞とを融合し、得られた融合細
胞をクローン化し、本発明によるモノクローナル抗体を
産生し得る融合細胞を選択し、これを培養して抗体を回
収する。上記免疫、融合、融合細胞の選択などは既に公
知の手法によって行うことができる。
【００１４】好ましい製造法を説明すれば、次の通りで
ある。本発明者はｃｄｃ２キナーゼによるビメンチンの
リン酸化特異的部位はその５５番のセリンであるとの知
見を得ている。そこで、本発明の好ましい態様によれ
ば、マウスビメンチンのリン酸化特異的部位を中心にそ
の前後５または６つのアミノ酸配列を有する下記の配列
を有するリン酸化合成ペプチドを抗原として用いる。
ある。本発明者はｃｄｃ２キナーゼによるビメンチンの
リン酸化特異的部位はその５５番のセリンであるとの知
見を得ている。そこで、本発明の好ましい態様によれ
ば、マウスビメンチンのリン酸化特異的部位を中心にそ
の前後５または６つのアミノ酸配列を有する下記の配列
を有するリン酸化合成ペプチドを抗原として用いる。
【化２】
【００１５】このようなペプチドを抗原として用いるこ
とによって、リン酸化アミノ酸を含まない部分に対する
抗体の産生を極力さけることができる。すなわち、抗体
分子が認識する抗原エピトープがアミノ酸５、６残基で
あることから、上記ペプチドのリン酸化部位以外の部分
に対する抗体分子が産生されても、その抗体はネイティ
ブなビメンチンとは反応しないからである。
とによって、リン酸化アミノ酸を含まない部分に対する
抗体の産生を極力さけることができる。すなわち、抗体
分子が認識する抗原エピトープがアミノ酸５、６残基で
あることから、上記ペプチドのリン酸化部位以外の部分
に対する抗体分子が産生されても、その抗体はネイティ
ブなビメンチンとは反応しないからである。
【００１６】免疫する動物は、マウスに限らずラットな
どのネズミ科の動物またはその他の動物を使用してもよ
いが、通常はマウスを用いるのが好ましい。その際の免
疫計画および抗原タンパク質の濃度は十分な量の抗原刺
激を受けたリンパ球が形成されるように決定される。抗
原タンパク質を数日〜数週間おきに数回、例えば腹腔内
に投与することによって接種し、最終免疫の数日後に融
合のために脾臓細胞を取り出す。
どのネズミ科の動物またはその他の動物を使用してもよ
いが、通常はマウスを用いるのが好ましい。その際の免
疫計画および抗原タンパク質の濃度は十分な量の抗原刺
激を受けたリンパ球が形成されるように決定される。抗
原タンパク質を数日〜数週間おきに数回、例えば腹腔内
に投与することによって接種し、最終免疫の数日後に融
合のために脾臓細胞を取り出す。
【００１７】無菌的に取り出された脾臓細胞から単細胞
懸濁液を調製する。その脾臓細胞と適当なミエローマ細
胞とを常法に従い細胞融合させる。
懸濁液を調製する。その脾臓細胞と適当なミエローマ細
胞とを常法に従い細胞融合させる。
【００１８】ＨＡＴ培地で増殖したハイブリドーマの培
養上清を常用のサンドイッチ法により、ｃｄｃ２キナー
ゼでリン酸化されたビメンチンと結合するモノクローナ
ル抗体の存在について試験し、リン酸化ビメンチンと特
異的に結合するモノクローナル抗体産生能を有するハイ
ブリドーマを得ることが出来る。
養上清を常用のサンドイッチ法により、ｃｄｃ２キナー
ゼでリン酸化されたビメンチンと結合するモノクローナ
ル抗体の存在について試験し、リン酸化ビメンチンと特
異的に結合するモノクローナル抗体産生能を有するハイ
ブリドーマを得ることが出来る。
【００１９】また、本発明によるモノクローナル抗体
は、上記ハイブリドーマを常用の培地中で培養し、培養
上清から目的とするモノクローナル抗体を採取すること
によって得ることができる。あるいは、上記ハイブリド
ーマをマウスの腹腔内に接種し、そのマウス腹水から目
的とするモノクローナル抗体を採取する。培養上清また
は腹水からのモノクローナル抗体の採取、すなわち単
離、精製は、常法に従って行うことができる。例えば、
硫酸アンモニウムによる塩析、ｃｄｃ２キナーゼでリン
酸化されたビメンチンを固定した支持体を用いるアフィ
ニティークロマトグラフィーなどを組み合わせて単離精
製することができる。
は、上記ハイブリドーマを常用の培地中で培養し、培養
上清から目的とするモノクローナル抗体を採取すること
によって得ることができる。あるいは、上記ハイブリド
ーマをマウスの腹腔内に接種し、そのマウス腹水から目
的とするモノクローナル抗体を採取する。培養上清また
は腹水からのモノクローナル抗体の採取、すなわち単
離、精製は、常法に従って行うことができる。例えば、
硫酸アンモニウムによる塩析、ｃｄｃ２キナーゼでリン
酸化されたビメンチンを固定した支持体を用いるアフィ
ニティークロマトグラフィーなどを組み合わせて単離精
製することができる。
【００２０】さらに本発明の別の態様によれば、ｃｄｃ
２キナーゼによってリン酸化されたビメンチンの存在非
存在、さらにはその存在を定量的に測定することができ
る測定キットが提供される。本発明による測定キット
は、少なくとも前記した本発明によるモノクローナル抗
体を含み、さらに好ましくは酵素標識された二次抗体
２キナーゼによってリン酸化されたビメンチンの存在非
存在、さらにはその存在を定量的に測定することができ
る測定キットが提供される。本発明による測定キット
は、少なくとも前記した本発明によるモノクローナル抗
体を含み、さらに好ましくは酵素標識された二次抗体
【００２１】（例えば抗マウス抗体）並びにマイクロタ
イタープレート、緩衝液、標識酵素の基質などを包含す
る。
イタープレート、緩衝液、標識酵素の基質などを包含す
る。
【００２２】
【実施例】本発明を以下の実施例によって更に詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。なお、以下において下記で表されるリン酸化合
成ペプチドをＰＶ−５５と、またその６番のセリンがリ
ン酸化されていないペプチドをＶ−５５と呼ぶことす
る。
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。なお、以下において下記で表されるリン酸化合
成ペプチドをＰＶ−５５と、またその６番のセリンがリ
ン酸化されていないペプチドをＶ−５５と呼ぶことす
る。
【化３】
【００２３】実施例１ （１） 抗原タンパク質の調製 ｃｄｃ２キナーゼによるビメンチンのリン酸化部位に相
当すると思われるリン酸化合成ペプチドＰＶ−５５を常
法に従い合成した。
当すると思われるリン酸化合成ペプチドＰＶ−５５を常
法に従い合成した。
【００２４】（２） ハイブリドーマ細胞の作成 ＢＤＦ１マウス（日本エスエルシー社）を、実施例１で
得たリン酸化合成ペプチドとFreund完全アジュバンドと
のエマルジョンを抗原５０μｇ／マウス量で腹腔内に投
与して免疫し、さらに１週間の間隔を置いてリン酸化合
成ペプチドとFreund不完全アジュバンドとのエマルジョ
ンを抗原２５μｇ／マウス量で腹腔内に投与して追加免
疫を行った。３５日目の追加免疫を最終免疫とし、最終
免疫の３日後にその脾臓細胞を摘出した。この摘出脾臓
から細胞を取り出し、メッシュろ過した後、ＰＲＭＩ１
６４０培地に懸濁して脾臓細胞浮遊液を得た。一方、Ｓ
Ｐ２／０ミエローマ細胞を増殖させた後、１０％牛胎児
血清を含むＰＲＭＩ１６４０培地に懸濁してミエローマ
細胞浮遊液を得た。なお、ここでは生細胞率９５％以上
の細胞懸濁液を用いた。脾臓細胞浮遊液およびミエロー
マ細胞浮遊液を調製した後、脾臓細胞の浮遊液に脾臓細
胞数に対し１／１０〜１／５の細胞数でミエローマ細胞
浮遊液を加え、次いでポリエチレングリコールを滴下
し、混合することによって細胞融合を行った。遠心して
上清を除去した後、細胞濃度が５×１０６個／ｍｌとな
るようにＨＡＴ培地を添加し、９６穴ウェルにまき込ん
で培養し、ＨＡＴ選択を行った。
得たリン酸化合成ペプチドとFreund完全アジュバンドと
のエマルジョンを抗原５０μｇ／マウス量で腹腔内に投
与して免疫し、さらに１週間の間隔を置いてリン酸化合
成ペプチドとFreund不完全アジュバンドとのエマルジョ
ンを抗原２５μｇ／マウス量で腹腔内に投与して追加免
疫を行った。３５日目の追加免疫を最終免疫とし、最終
免疫の３日後にその脾臓細胞を摘出した。この摘出脾臓
から細胞を取り出し、メッシュろ過した後、ＰＲＭＩ１
６４０培地に懸濁して脾臓細胞浮遊液を得た。一方、Ｓ
Ｐ２／０ミエローマ細胞を増殖させた後、１０％牛胎児
血清を含むＰＲＭＩ１６４０培地に懸濁してミエローマ
細胞浮遊液を得た。なお、ここでは生細胞率９５％以上
の細胞懸濁液を用いた。脾臓細胞浮遊液およびミエロー
マ細胞浮遊液を調製した後、脾臓細胞の浮遊液に脾臓細
胞数に対し１／１０〜１／５の細胞数でミエローマ細胞
浮遊液を加え、次いでポリエチレングリコールを滴下
し、混合することによって細胞融合を行った。遠心して
上清を除去した後、細胞濃度が５×１０６個／ｍｌとな
るようにＨＡＴ培地を添加し、９６穴ウェルにまき込ん
で培養し、ＨＡＴ選択を行った。
【００２５】（３） ｃｄｃ２キナーゼリン酸化ビメン
チンと特異的に反応するモノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマ細胞の選択および培養 １μｇ／ｍｌのＰＶ５５を１ウェルあたり５０μｌの量
でＥＬＩＳＡ用マイクロプレートに加え撹拌し、ＰＢＳ
で洗浄して、プレート上にペプチドを吸着させた。次い
でＨＡＴ選択した抗体産生細胞の培養上清を加え、室温
下で撹拌した後ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した。５０μ
ｌの酵素標識抗マウス抗体を各ウェルに加え、基質発色
反応によって陽性株を選択した。この陽性株に関し、更
に、その産生抗体についてｃｄｃ２キナーゼリン酸化ビ
メンチンを用いたウェスタンブロットおよびＵ２５１細
胞（ヒト星状神経膠腫細胞）の染色を行い、ｃｄｃ２キ
ナーゼリン酸化ビメンチンと特異的に反応する抗体を産
生する陽性株（４Ａ４）をスクリーニングした。
チンと特異的に反応するモノクローナル抗体産生ハイブ
リドーマ細胞の選択および培養 １μｇ／ｍｌのＰＶ５５を１ウェルあたり５０μｌの量
でＥＬＩＳＡ用マイクロプレートに加え撹拌し、ＰＢＳ
で洗浄して、プレート上にペプチドを吸着させた。次い
でＨＡＴ選択した抗体産生細胞の培養上清を加え、室温
下で撹拌した後ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで洗浄した。５０μ
ｌの酵素標識抗マウス抗体を各ウェルに加え、基質発色
反応によって陽性株を選択した。この陽性株に関し、更
に、その産生抗体についてｃｄｃ２キナーゼリン酸化ビ
メンチンを用いたウェスタンブロットおよびＵ２５１細
胞（ヒト星状神経膠腫細胞）の染色を行い、ｃｄｃ２キ
ナーゼリン酸化ビメンチンと特異的に反応する抗体を産
生する陽性株（４Ａ４）をスクリーニングした。
【００２６】（４） モノクローナル抗体４Ａ４の単離 クローニングが完了した抗体産生細胞をＢＡＬＢ／ｃ
ｎ／ｎマウスの腹腔内に注射して腹水を採取し、その腹
水をProtein Ａ Sepharose ＣＬ−４βで精製すること
によってモノクローナル抗体４Ａ４を得た。クローニン
グおよび腹水の採取は、常法に従って行った。クローニ
ングが完了した時点で、増殖能力および抗体産生機能に
優れる細胞集団（クローン）を選び、液体窒素中に凍結
保存した。
ｎ／ｎマウスの腹腔内に注射して腹水を採取し、その腹
水をProtein Ａ Sepharose ＣＬ−４βで精製すること
によってモノクローナル抗体４Ａ４を得た。クローニン
グおよび腹水の採取は、常法に従って行った。クローニ
ングが完了した時点で、増殖能力および抗体産生機能に
優れる細胞集団（クローン）を選び、液体窒素中に凍結
保存した。
【００２７】実施例２ モノクローナル抗体４Ａ４の特
徴 モノクローナル抗体４Ａ４を、種々のリン酸化キナーゼ
でリン酸化したビメンチンと反応させて、その反応性を
確認した。図１は、モノクローナル抗体４Ａ４と、非リ
ン酸化ビメンチン（レーン２）並びにＡキナーゼ（レー
ン３）、Ｃキナーゼ（レーン４）、ｃｄｃ２キナーゼ
（レーン５）およびＣａ2+カルモジュリンキナーゼＩＩ
（レーン６）でそれぞれリン酸化されたビメンチンとの
ウエスタンブロッティングの結果を示す。図１から明ら
かなように、モノクローナル抗体４Ａ４はｃｄｃ２キナ
ーゼでリン酸化されたビメンチンのみと特異的に反応す
る性質を有する。
徴 モノクローナル抗体４Ａ４を、種々のリン酸化キナーゼ
でリン酸化したビメンチンと反応させて、その反応性を
確認した。図１は、モノクローナル抗体４Ａ４と、非リ
ン酸化ビメンチン（レーン２）並びにＡキナーゼ（レー
ン３）、Ｃキナーゼ（レーン４）、ｃｄｃ２キナーゼ
（レーン５）およびＣａ2+カルモジュリンキナーゼＩＩ
（レーン６）でそれぞれリン酸化されたビメンチンとの
ウエスタンブロッティングの結果を示す。図１から明ら
かなように、モノクローナル抗体４Ａ４はｃｄｃ２キナ
ーゼでリン酸化されたビメンチンのみと特異的に反応す
る性質を有する。
【００２８】実施例３ モノクローナル抗体４Ａ４によ
るｃｄｃ２キナーゼの活性測定 マイクロタイタープレートに、Ｖ５５ペプチドの０．１
μｇ／ｍｌＰＢＳ溶液０．１ｍｌを入れ、一晩インキュ
ベーションして、Ｖ５５ペプチドをコートした。その
後、５％アルブミン、５％スクロース、０．１％ＮａＮ
３、１０ｍＭリン酸緩衝液を含む溶液によって、ｐＨ
８．０、４℃でブロックキングを行った。ペプチドのリ
ン酸化反応は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３ｍＭ
ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＡＴＰ、ｃｄｃ２キナーゼ
（５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／
ｍｌ、６２．５ｎｇ／ｍｌ、３１．３ｎｇ／ｍｌおよび
１５．７ｎｇ／ｍｌ並びに０ｎｇ／ｍｌ）を含む溶液
０．１ｍｌをマイクロタイタープレートに加え、２５℃
で、０、１５、３０および６０分間反応させて行った。
反応は２０％Ｈ３ＰＯ４を０．１ｍｌ加えることによっ
て停止させた。続いてペプチドのリン酸化を次のように
測定した。すなわち、マイクロタイタープレートの反応
液を捨て、ＰＢＳ（−）で４回洗浄し、ＰＢＳ（−）で
希釈したモノクローナル抗体４Ａ４を一穴当たり０．１
ｍｌ加え、４０分間室温で放置し、その後ＰＢＳで
（−）で４回洗浄した。二次抗体として、ＰＢＳで１０
００倍に希釈したＢｉｏ−ＲＡＤ社製ＧＡＭ−ＨＲＰ
抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を一穴あたり０．１ｍｌ加
え、４０分間室温で放置し、その後ＰＢＳで洗浄した。
オルトフェニレンジアミン８ｍｇをメタノール１ｍｌに
溶解し、それに水を加えて全量２０ｍｌとし、さらにＨ
２Ｏ２を２０μｌ添加した溶液を用意し、その溶液を一
穴あたり０．１ｍｌ加え、発色させた。２Ｎ Ｈ２ＳＯ
４で発色を停止させ、その後４９２ｎｍで吸光度を測定
した。その結果は図２に示される通りである。
るｃｄｃ２キナーゼの活性測定 マイクロタイタープレートに、Ｖ５５ペプチドの０．１
μｇ／ｍｌＰＢＳ溶液０．１ｍｌを入れ、一晩インキュ
ベーションして、Ｖ５５ペプチドをコートした。その
後、５％アルブミン、５％スクロース、０．１％ＮａＮ
３、１０ｍＭリン酸緩衝液を含む溶液によって、ｐＨ
８．０、４℃でブロックキングを行った。ペプチドのリ
ン酸化反応は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、３ｍＭ
ＭｇＣｌ２、０．１ｍＭ ＡＴＰ、ｃｄｃ２キナーゼ
（５００ｎｇ／ｍｌ、２５０ｎｇ／ｍｌ、１２５ｎｇ／
ｍｌ、６２．５ｎｇ／ｍｌ、３１．３ｎｇ／ｍｌおよび
１５．７ｎｇ／ｍｌ並びに０ｎｇ／ｍｌ）を含む溶液
０．１ｍｌをマイクロタイタープレートに加え、２５℃
で、０、１５、３０および６０分間反応させて行った。
反応は２０％Ｈ３ＰＯ４を０．１ｍｌ加えることによっ
て停止させた。続いてペプチドのリン酸化を次のように
測定した。すなわち、マイクロタイタープレートの反応
液を捨て、ＰＢＳ（−）で４回洗浄し、ＰＢＳ（−）で
希釈したモノクローナル抗体４Ａ４を一穴当たり０．１
ｍｌ加え、４０分間室温で放置し、その後ＰＢＳで
（−）で４回洗浄した。二次抗体として、ＰＢＳで１０
００倍に希釈したＢｉｏ−ＲＡＤ社製ＧＡＭ−ＨＲＰ
抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を一穴あたり０．１ｍｌ加
え、４０分間室温で放置し、その後ＰＢＳで洗浄した。
オルトフェニレンジアミン８ｍｇをメタノール１ｍｌに
溶解し、それに水を加えて全量２０ｍｌとし、さらにＨ
２Ｏ２を２０μｌ添加した溶液を用意し、その溶液を一
穴あたり０．１ｍｌ加え、発色させた。２Ｎ Ｈ２ＳＯ
４で発色を停止させ、その後４９２ｎｍで吸光度を測定
した。その結果は図２に示される通りである。
【００２９】実施例４ モノクローナル抗体４Ａ４と細
胞中のビメンチンとの反応 モノクローナル抗体４Ａ４とヨウ化プロピジウムを用い
た蛍光抗体染色法によって種々の細胞を解析した。細胞
として、Ｕ２５１（ヒト星状神経膠腫細胞）、Ｌｔｋ−
（マウス線維芽細胞）、ＭＤＣＫ（イヌ腎臓細胞）、Ｃ
ＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、およ
び、ＭＤＢＫ（ウシ腎臓細胞）を用い、抗体量はＩｇＧ
換算で１０μｇ／ｍｌとした。その結果、モノクローナ
ル抗体４Ａ４は全ての細胞において、その細胞分裂期に
あるものと特異的に反応することが観察された。
胞中のビメンチンとの反応 モノクローナル抗体４Ａ４とヨウ化プロピジウムを用い
た蛍光抗体染色法によって種々の細胞を解析した。細胞
として、Ｕ２５１（ヒト星状神経膠腫細胞）、Ｌｔｋ−
（マウス線維芽細胞）、ＭＤＣＫ（イヌ腎臓細胞）、Ｃ
ＨＯ−Ｋ１（チャイニーズハムスター卵巣細胞）、およ
び、ＭＤＢＫ（ウシ腎臓細胞）を用い、抗体量はＩｇＧ
換算で１０μｇ／ｍｌとした。その結果、モノクローナ
ル抗体４Ａ４は全ての細胞において、その細胞分裂期に
あるものと特異的に反応することが観察された。
【００３０】
配列番号：１ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：ペプチド 配列の特徴：６番のSer がリン酸化されている
【図１】モノクローナル抗体４Ａ４と、非リン酸化ビメ
ンチン（レーン２）並びにＡキナーゼ（レーン３）、Ｃ
キナーゼ（レーン４）、ｃｄｃ２キナーゼ（レーン５）
およびＣａ2+カルモジュリンキナーゼＩＩ（レーン６）
でそれぞれリン酸化されたビメンチンとのウエスタンブ
ロッティングの結果を示す。
ンチン（レーン２）並びにＡキナーゼ（レーン３）、Ｃ
キナーゼ（レーン４）、ｃｄｃ２キナーゼ（レーン５）
およびＣａ2+カルモジュリンキナーゼＩＩ（レーン６）
でそれぞれリン酸化されたビメンチンとのウエスタンブ
ロッティングの結果を示す。
【図２】マイクロタイタープレートにコートされたＶ５
５ペプチドの、ｃｄｃ２キナーゼによるリン酸化の程度
をモノクローナル抗体４Ａ４によって測定した結果を表
す図である。
５ペプチドの、ｃｄｃ２キナーゼによるリン酸化の程度
をモノクローナル抗体４Ａ４によって測定した結果を表
す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/08 9161−4Ｂ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 33/577 Ｂ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (8)
- 【請求項１】ｃｄｃ２キナーゼによってリン酸化された
ビメンチンとは反応するが、非リン酸化ビメンチン、ま
たは、Ａキナーゼ、Ｃキナーゼ、ｃｄｃ２キナーゼ若し
くはＣａ2+カルモジュリンキナーゼＩＩによってリン酸
化されたビメンチンとは反応しない、抗ｃｄｃ２キナー
ゼリン酸化ビメンチンモノクローナル抗体。 - 【請求項２】ハイブリドーマ細胞４Ａ４から得られる、
請求項１記載のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】請求項１記載のモノクローナル抗体産生能
を有する、ハイブリドーマ細胞。 - 【請求項４】ハイブリドーマ細胞４Ａ４（ＦＥＲＭ Ｐ
−１４２４２）である、請求項３記載のハイブリドー
マ。 - 【請求項５】ｃｄｃ２キナーゼでリン酸化されたビメン
チンで免疫された動物から得られた脾臓細胞と、ミエロ
ーマ細胞とを融合させ、 ｃｄｃ２キナーゼによってリン酸化されたビメンチンと
は反応するが、非リン酸化ビメンチン、または、Ａキナ
ーゼ、Ｃキナーゼ、ｃｄｃ２キナーゼ若しくはＣａ2+カ
ルモジュリンキナーゼＩＩによってリン酸化されたビメ
ンチンとは反応しないモノクローナル抗体を産生するハ
イブリドーマ細胞を取得し、 該ハイブリドーマ細胞を培養し、該培養液から前記モノ
クローナル抗体を単離することを特徴とする、モノクロ
ーナル抗体の製造法。 - 【請求項６】動物が、下記の配列： 【化１】 を有するペプチドで免疫されたものである、請求項５記
載のモノクローナル抗体の製造法。 - 【請求項７】請求項３記載のハイブリドーマ細胞を用い
る、請求項５記載のモノクローナル抗体の製造法。 - 【請求項８】請求項１記載のモノクローナル抗体を含ん
でなる、ｃｄｃ２キナーゼによってリン酸化されたビメ
ンチンの測定キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6057661A JPH07258296A (ja) | 1994-03-28 | 1994-03-28 | 抗ｃｄｃ２キナーゼリン酸化ビメンチンモノクローナル抗体 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6057661A JPH07258296A (ja) | 1994-03-28 | 1994-03-28 | 抗ｃｄｃ２キナーゼリン酸化ビメンチンモノクローナル抗体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07258296A true JPH07258296A (ja) | 1995-10-09 |
Family
ID=13062091
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6057661A Pending JPH07258296A (ja) | 1994-03-28 | 1994-03-28 | 抗ｃｄｃ２キナーゼリン酸化ビメンチンモノクローナル抗体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07258296A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1067142A1 (en) * | 1999-07-07 | 2001-01-10 | Riken | Antibody against cleavage product of vimentin |
| JP2012154884A (ja) * | 2011-01-28 | 2012-08-16 | Kinki Univ | 牛の判別方法、及び牛の判別用キット |
| JP2016156840A (ja) * | 2016-05-25 | 2016-09-01 | 学校法人近畿大学 | 牛の判別方法、及び牛の判別用キット |
| JP5985101B1 (ja) * | 2016-05-25 | 2016-09-06 | 学校法人近畿大学 | 牛の判別方法、及び牛の判別用キット |
| WO2022163845A1 (ja) * | 2021-01-31 | 2022-08-04 | 株式会社バランス・イースト | 検査システム、検査方法、プログラム、およびコンピュータが読み取り可能な記憶媒体 |
-
1994
- 1994-03-28 JP JP6057661A patent/JPH07258296A/ja active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1067142A1 (en) * | 1999-07-07 | 2001-01-10 | Riken | Antibody against cleavage product of vimentin |
| US7029864B2 (en) | 1999-07-07 | 2006-04-18 | Riken | Antibody against cleavage product of vimentin |
| JP2012154884A (ja) * | 2011-01-28 | 2012-08-16 | Kinki Univ | 牛の判別方法、及び牛の判別用キット |
| JP2016156840A (ja) * | 2016-05-25 | 2016-09-01 | 学校法人近畿大学 | 牛の判別方法、及び牛の判別用キット |
| JP5985101B1 (ja) * | 2016-05-25 | 2016-09-06 | 学校法人近畿大学 | 牛の判別方法、及び牛の判別用キット |
| WO2022163845A1 (ja) * | 2021-01-31 | 2022-08-04 | 株式会社バランス・イースト | 検査システム、検査方法、プログラム、およびコンピュータが読み取り可能な記憶媒体 |
| JPWO2022163845A1 (ja) * | 2021-01-31 | 2022-08-04 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
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Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20040430 |
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| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20040903 |