ES2227603T3

ES2227603T3 - Metodo para la purificacion de proteinas.

Info

Publication number: ES2227603T3
Application number: ES96927033T
Authority: ES
Inventors: Pierre Francois Fauquex; Catherine Georges
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1995-07-26
Filing date: 1996-07-17
Publication date: 2005-04-01
Anticipated expiration: 2016-07-17
Also published as: DK0840746T3; EP0840746A2; EP0840746B1; WO1997005159A2; ZA966315B; AU6700796A; US5990289A; CA2226080A1; DE69633567T2; PT840746E; ATE278705T1; JP3833255B2; JPH11509853A; TW442492B; DE69633567D1; WO1997005159A3

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN NUEVO METODO PARA LA PURIFICACION DE PROTEINAS EMPLEANDO CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD DE QUELATO DE COBRE, EN EL QUE LA PROTEINA IMPURA O PREPURIFICADA SE ADSORBE SOBRE IONES DE COBRE (II) INMOVILIZADOS, SE LAVA OPCIONALMENTE CON TAMPON Y AGUA DESIONIZADA, SE LAVA CON UNA SOLUCION DE BASE DE LEWIS, Y SE ELUYE FINALMENTE CON AGUA DESIONIZADA.

Description

Método para la purificación de proteínas.

La presente invención se refiere a un nuevo método para la purificación de proteínas empleando cromatografía de afinidad con quelato de cobre.

La cromatografía de afinidad con quelato de cobre funciona mediante la unión del grupo accesible donador de electrones de una proteína, tal como histidina, a un ión cobre que se mantiene mediante un grupo quelante enlazado covalentemente sobre un soporte estacionario. La presencia de una sola histidina accesible es normalmente suficiente para la adsorción de una proteína sobre un cobre(II)-IDA-quelato (IDA = iminodiacetato). La retención de la proteína en la cromatografía de afinidad con quelato de cobre depende del número y tipo de grupos pendientes en la proteína que pueden interaccionar con el metal. Esta interacción se ve afectada por diversas variables independientes tales como pH, temperatura, tipo de disolvente, tipo de sal y concentración de sal. Las proteínas que se unen al quelato de cobre en una región de pH neutro o de pH alcalino bajo son eluídas normalmente mediante un gradiente de pH en descenso (continuo o gradual) o mediante un gradiente de concentración en aumento (continuo o gradual) de un agente competitivo, por ejemplo, una base de Lewis tal como imidazol, en un tampón. Alternativamente, un tercer método de elución posible incluye un agente de quelación, tal como EDTA, en el eluyente.

Sin embargo, estos métodos presentan varios inconvenientes:

\bullet: baja selectividad, es decir, se eluyen varias proteínas bajo las mismas condiciones,

\bullet: bajo enriquecimiento,

\bullet: co-elución de la proteína con altas concentraciones de iones cobre(II) en el caso de que se utilicen agentes competitivos o quelantes,

\bullet: necesidad de realizar otras etapas de purificación para separar el eluyente,

\bullet: normalmente ha de aplicarse un gradiente continuo para la elución de la proteína deseada, con el fin de aumentar la selectividad.

Por ejemplo, en el caso de que la proteína sea eluída empleando un agente competitivo o un agente quelante, la elución contiene la proteína, el agente competitivo o quelante e iones cobre(II) liberados. Por tanto, el agente competitivo y los iones cobre(II) han de ser separados mediante etapas de purificación adicionales y, además, una cantidad de las proteínas son inestables en presencia de altas concentraciones de iones cobre(II) en solución (oxidación) o a bajos valores pH (precipitación) y se inactivan.

La presente invención proporciona ahora un método sorprendentemente ventajoso para la elución de proteínas a partir de un complejo de quelato de cobre. Empleando el método de la invención, es posible sorprendentemente eluir la proteína deseada con agua desionizada que opcionalmente puede contener otros estabilizantes para la proteína. El uso de agua desionizada presenta varias ventajas con respecto al estado de la técnica:

\bullet: no se emplea agente competitivo o quelante y, por tanto, no se necesitan otras etapas de purificación,

\bullet: la proteína deseada no es co-eluída con altas concentraciones de iones cobre(II) que pueden causar problemas de oxidación,

\bullet: la proteína deseada no es eluída a bajos valores pH que pueden causar problemas de precipitación o inactivación,

\bullet: la proteína deseada se recupera con una pureza particularmente elevada y con un alto rendimiento,

\bullet: la elución puede ser efectuada en una etapa en lugar de aplicar un gradiente (continuo o gradual),

\bullet: la proteína eluída puede ser guardada sin tratamiento adicional.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere aun procedimiento para el enriquecimiento de una proteína impura o pre-purificada que comprende las sucesivas etapas de:

a): adsorción de la proteína impura o pre-purificada sobre iones cobre(II) inmovilizados,

b): lavado de la proteína adsorbida con una solución de una base de Lewis y

\newpage

c): elución de la proteína deseada con agua desionizada que no contiene más de 0,001 M de compuestos iónicos.

Normalmente, los iones cobre(II) están inmovilizados sobre un soporte estacionario que es, por ejemplo, un soporte inorgánico tal como sílice o una matriz polimérica.

Es necesario que el soporte estacionario sea capaz de formar quelatos con iones cobre(II). Ejemplos de dichos soportes estacionarios son aquellos en donde grupos quelantes, tales como ácido imidoacético (IDA), N,N,N'-tris(carboximetil)-etilendiamina (TED), ácido carboxi-aspártico metilado (CM-ASP), ácido tetraetilenpentamina (TEPA) nitrilo acético (NTA) o ácido \alpha, \beta-diamino-succínico carboximetilado (CM-DASA), están enlazados covalentemente al soporte estacionario. Los grupos quelantes pueden estar enlazados al soporte estacionario bien directamente o bien por medio de separadores. El soporte polimérico puede ser cualquier compuesto polimérico tradicionalmente usado para la cromatografía de afinidad con iones metálicos. Ejemplos de dichos materiales poliméricos incluyen agarosa, dextranos u otros polímeros sintéticos; se prefieren agarosa y los polímeros vinílicos. Métodos para la preparación de soportes estacionarios que tienen grupos quelantes enlazados covalentemente se describen, por ejemplo, en Hochuli, CHIMIA (1986), 40, 408-412 (véase también Figueroa et al., J. Chromatography (1986), 371, 335-352; Porta, Protein expression and purification (1992), 3, 263-281; L. K\ring{a}gedal en "Protein purification, principles, high resolution methods and applications" Janson and Ryden Eds. (1989); 227-251, VCH Publishers, New York). En una modalidad preferida de la invención, el soporte estacionario es capaz de formar quelatos con iones cobre(II) a una concentración de 1-200, y más preferentemente 10-100, \mumol/ml del soporte estacionario.

También están disponibles comercialmente soportes poliméricos adecuados para utilizarse en la presente invención, tales como:

\bullet: Chelating-Sepharose Fast Flow® (Pharmacia, Uppsala), en donde grupos de ácido iminodiacético sobre separadores están acoplados en Sepharose fast Flow mediante enlaces éter estables;

\bullet: Chelating Sepharose 6B® (Pharmacia, Uppsala); y

\bullet: TSK Toyopearl AF-Chelate-650 M® (TosoHaas, Stuttgart), en donde grupos de ácido iminodiacético están inmovilizados sobre un soporte estacionario hidrófilo, semi-rígido, preparado a partir de un copolímero de oligoetilenglicol, metacrilato de glicidilo y dimetacrilato de pentaeritritol.

Antes de la inmovilización de los iones cobre(II), normalmente se lava el soporte estacionario. Por ejemplo, el soporte estacionario se lava sucesivamente con 1-10, preferentemente 3-7, volúmenes de lecho de 5-50%, preferentemente 10- 30%, de etanol; 1-10, preferentemente 3-7, volúmenes de lecho de agua desionizada; 1-10, preferentemente 3-7, volúmenes de lecho de 0,001-0,1 M, preferentemente 0,03-0,07 M, de EDTA y 0,1-1 M, preferentemente 0,3-0,7 M de NaCl; 1-10, preferentemente 3-7, volúmenes de lecho de 0,05-1 M, preferentemente 0,1-0,5 M, de NaOH y 0,1-5 M, preferentemente 0,5-2 M, de NaCl; 1-15, preferentemente 3-10, volúmenes de lecho de agua desionizada; finalmente, 1-10, preferentemente 3-7, volúmenes de lecho de 0,01-1%, preferentemente 0,05-0,5%, de ácido fórmico y 1-15, preferentemente 3-10, volúmenes de lecho de agua desionizada. La velocidad de flujo de estas soluciones de lavado es normalmente de 1-50, preferentemente 5-20, volúmenes de lecho por hora.

La inmovilización de iones cobre(II) en el soporte estacionario anterior se puede lograr simplemente cargando el soporte estacionario con iones cúpricos. Las fuentes de iones cobre(II) usuales son sales de cobre(II) tales como CuCl_{2}, Cu(CH_{3}COO)_{2} y, especialmente, CuSO_{4} Normalmente, se emplean 1-10, preferentemente 3-7, volúmenes de lecho de una solución acuosa 0,001-0,1 M, preferentemente 0,003-0,01 M, de CuSO_{4} x 5H_{2}O y, a continuación el soporte estacionario se leva con un exceso grande de agua con el fin de eliminar el resto de los iones cúpricos que no están enlazados. El soporte estacionario así preparado que contiene iones cobre(II) inmovilizados se encuentra listo para utilizarse en el procedimiento de la presente invención.

Dependiendo del soporte estacionario, del pH y de la concentración iónica de la solución que contiene proteína, a veces es preferible tratar el soporte estacionario con una solución que tiene el mismo pH y concentración iónica antes de cargar la solución que contiene proteína, para evitar la hinchazón o contracción cuando se adsorbe la proteína. La necesidad de dicho tratamiento se puede examinar fácilmente mediante un ensayo a pequeña escala. Este tratamiento previo se puede conseguir haciendo fluir 1-10, preferentemente 3-7, volúmenes de lecho de la solución de tratamiento a través del soporte estacionario.

La adsorción de la proteína en el soporte estacionario así preparado, a través de la formación de quelato, se consigue simplemente cargando una solución que contiene la proteína en la columna que contiene los iones cobre(II) inmovilizados.

La solución de proteína puede ser de diverso origen y puede estar pre-purificada o no. Por ejemplo, si la proteína a aislar es secretada por el hospedante en el caldo de cultivo es posible, por ejemplo, aplicar el caldo de cultivo, después de su centrifugado, directamente al soporte estacionario. Si la proteína se produce y se almacena dentro del hospedante, las células han de ser rotas y la solución que contiene proteína ha de separarse de los restos celulares, por ejemplo mediante centrifugado. Las soluciones que contienen proteína así obtenidas se pueden aplicar directamente al soporte estacionario como antes se ha descrito o bien pueden ser purificadas adicionalmente, por ejemplo, por precipitación, extracción o medios cromatográficos, como ya es bien conocido en la técnica. Por tanto, la solución que contiene la proteína puede ser de diverso origen y puede contener varias impurezas, tales como especies iónicas, proteínas foráneas, etc.

El hecho de que una proteína pueda ser purificada o no con el método de la invención, se puede determinar fácilmente en un ensayo a pequeña escala en donde la proteína es adsorbida en una pequeña cantidad del soporte estacionario cargado con cobre(II), tratada con una base de Lewis como más abajo se define, y posteriormente se determina la cantidad de proteína que puede ser eluída con agua desionizada y se compara con la cantidad de proteína que puede ser eluída con 2M NH_{4}Cl. En general, el procedimiento de la invención se puede aplicar a proteínas caracterizadas porque una base de Lewis como más adelante se define no destruye totalmente un complejo entre dicha proteína y los iones cobre(II). Las proteínas preferidas son innterferon, amilasa, tripsina proteínas relacionadas. Especialmente preferidas son interferon-\alpha, tripsina y \alpha-amilasa.

La cantidad de la solución que contiene proteína a cargar en el soporte estacionario depende de la concentración de iones cobre(II) inmovilizada sobre este soporte estacionario, de la concentración de la proteína en la solución y de la naturaleza de la proteína. Por tanto, la cantidad adecuada de solución a cargar se determina empíricamente mediante la observación del efluente empleando un detector, tal como un monitor UV.

Una etapa importante según la invención es el lavado de la proteína adsorbida en el soporte estacionario con una base de Lewis antes de la elución con agua desionizada. Una base de Lewis es un donador de un par de electrones tales como aminas, HO, fosfato o fosfinas. Ejemplos son NH_{3}, CH_{3}NH_{2}, (CH_{3})_{2}NH, (CH_{3})_{3}N, C_{2}H_{5}(CH_{2})

\hbox{ _{2} }

N, C_{2}H_{5}NH_{2}, (C_{2}H_{5})_{2}NH, (C_{2}H_{5})_{3}N, C_{3}H_{7}NH_{2}, C_{4}H_{9}NH_{2}, C_{5}H_{11}NH_{2}, C_{6}H_{13}NH_{2}, CH_{3}PH_{2}, (CH_{3})_{2}PH, (CH_{3})_{3}P, aminoácidos, cistina, aminas que portan grupos hidroxilo tales como HOCH_{2}NH_{2}, (HOCH_{2})_{2}NH o (HOCH_{2})_{3}N, HOC_{2}H_{4}NH_{2}, (HOC_{2}
H_{4})_{2}NH o (HOC_{2}H_{4})_{3}N; o TRIS-HCl.

En una forma preferida de la invención, la solución de base de Lewis contiene NH_{4}^{+} o una amina primaria, secundaria o terciaria en una región de pH neutro o alcalino bajo o OH^{-} en una región de pH alcalino alto. En una modalidad más preferida de la invención, la solución de base de Lewis contiene NH_{4}^{+} o una amina primaria, secundaria o terciaria y con suma preferencia es una solución que contiene NH_{4}^{+} o una amina primaria tal como etanolamina, cistina, NH_{4}SCN, NH_{4}Cl, NH_{4}^{+}CH_{3}COO^{-}, (NH_{4})_{2}SO_{4} y TRIS-HCl.

Con el fin de no eluir la proteína deseada con la solución de base de Lewis, se puede regular la concentración de la base de Lewis o el pH de la solución que contiene la base de Lewis. Un intervalo preferido para la concentración de la amina (base de Lewis) es de 0,001 a 1 M.

La concentración óptima de la base de Lewis depende en gran medida del donador de electrones. Por ejemplo, una concentración de 1 mM es óptima en el caso de cistina, mientras que la concentración de 300-500 mM es óptima en el caso de NH_{4}Cl. Las concentraciones óptimas de varias sales son, por ejemplo, 10-100 mM para NH_{4}SCN, 10-500 mM para NH_{4}Cl, 10-800 mM o más para NH_{4}(CH_{3}COO) y 10-500 mM o más para (NH_{4})_{2}SO_{4}.

En el caso de que se utilice una amina como la base de Lewis, el pH se ajusta, preferentemente, a pH 6-9; más preferentemente 6,5-8,5; y con suma preferencia 7,0-8,0. En el caso de utilizar OH^{-} como base de Lewis, el pH se ajusta preferentemente a 9-11, por ejemplo, con tampón borato o fosfato.

También es posible emplear mezclas de diferentes bases de Lewis para mejorar los resultados o añadir sales adicionales que no son bases de Lewis, tal como NaCl o KCl. La concentración de la sal o sales adicionales puede ser de hasta 5 M y preferentemente de hasta 2 M.

Habitualmente, el soporte estacionario en el cual se ha adsorbido ya la proteína, se lava con 1-10 o, preferentemente, 3-7 volúmenes de lecho de la solución de lavado descrita anteriormente. La velocidad de flujo se determina empíricamente y es, por ejemplo, de 1-10 o, preferentemente, 3-5 volúmenes de lecho/hora.

La etapa de lavado como la descrita anteriormente se lleva a cabo de manera conveniente justo antes de la elución de la proteína con agua desionizada. También es posible realizar esta etapa de lavado de manera simultánea con la carga de la proteína, siempre que la etapa de elución se efectúe inmediatamente después.

La proteína deseada puede ser eluída después del lavado con la base de Lewis como antes se ha descrito mediante el simple lavado del soporte estacionario con agua desionizada. Para obtener una alta pureza, el agua desionizada no deberá contener más de 0,001 M de compuestos iónicos. En contraste con esto, el agua desionizada puede contener compuestos no iónicos, por ejemplo, para estabilizar la estructura ternaria o cuaternaria de la proteína. Compuestos no iónicos adecuados son, por ejemplo, azúcar o polioles tales como manitol, glucosa, lactosa, fructosa, glicerol, polietilenglicol; u otros compuestos que mantienen el estado de oxidación de los grupos sulfhidrilo de la proteína. El agua desionizada se emplea preferentemente en una cantidad de 1-10, y más preferentemente 3-7, volúmenes de lecho.

En el procedimiento de la presente invención, la mayoría de las proteínas foráneas que están enlazadas específicamente en el soporte estacionario no eluyen con agua desionizada. Las mismas permanecen adsorbidas y pueden ser separadas posteriormente empleando una solución de elución clásica (por ejemplo, 2 M NH_{4}Cl en 25 mM de tampón TRIS-HCl, pH 7,6). Por tanto, el enriquecimiento resultante del producto es especialmente elevado. Por ejemplo, para el caso de interferon-\alpha B_{1}D_{2}B_{3}B_{4}, la pureza del producto es tan elevada como del 90% aproximadamente, partiendo de una solución de adsorción con una pureza del 30%, mientras que la cromatografía de afinidad con quelato de cobre del estado de la técnica solo consigue una pureza de 30-50%.

Para optimizar la pureza y recuperación de la proteína deseada, se pueden introducir opcionalmente una o más etapas de lavado adicionales con un tampón adecuado, tal como tampón de borato potásico y/o con agua desionizada, entre la etapa de adsorción de proteína y la etapa de lavado con base de Lewis. Por tanto, en una modalidad más preferida de la invención, la proteína adsorbida se lava con un tampón que no es una base de Lewis y/o con agua desionizada antes del lavado con una solución de una base de Lewis. Este hallazgo es sorprendente dado que la etapa de lavado y la etapa de elución se pueden efectuar empleando el mismo medio, especialmente agua desionizada.

Esta etapa de lavado intermedio empleando agua desionizada resulta eficaz, por ejemplo, para eliminar productos secundarios, especialmente aquellos enlazados en el soporte estacionario a través de interacciones hidrófobas (y no a través de la afinidad específica a iones cobre).

Tal como se conoce a partir de otros procedimientos de purificación basados en quelatos de cobre(II), la solución de la proteína aislada puede contener cantidades menores de iones cobre(II). Estos iones pueden ser separados fácilmente por métodos conocidos en la técnica, tal como intercambio iónico o columnas de quelación de iones cobre(II). La última etapa de purificación se puede efectuar por separado o inmediatamente después, por ejemplo llenando la parte inferior de la columna con el material separador de iones cobre(II).

Después de la purificación, el soporte estacionario cargado con cobre puede ser lavado y utilizado para otra purificación o, preferentemente para obtener resultados reproducibles, los iones cobre(II) se separan del soporte estacionario con un agente quelante competitivo, por ejemplo, EDTA y, a continuación, el soporte estacionario se carga de nuevo con iones cobre(II) como anteriormente se ha descrito.

Ejemplos Ejemplo 1 Purificación de IFN-B/D

Se construye el interferon-\alpha B_{1}D_{2}B_{3}B_{4} híbrido humano recombinante, referido de aquí en adelante como IFN-B/D, como se describe en EP-A-205404. El IFN-B/D es producido por la cepa HT 393 de Saccharomyces cerevisiae, que es idéntica a E 95-1-2A publicada por Heinemeyer et al. (EMBO Journal (1991), 10, 555-562; DSM 9697) y que ha sido transformada con el plásmido pDP34R/PH05/IFN AM119. El vector de levadura pDP34R y el promotor de gen de fosfatasa ácida de levadura PH05 se describen por INEN et al. (en: "Yeast Genetic Engineering", Barr et al. Eds, Butterworths, Boston, (1989), 193-213). IFN AM119 es la secuencia de codificación de IRN-B/D y se describe en EP-A-205404.

La cepa de levadura HT 393 que contiene el plásmido recombinante que codifica IFN-B/D se hace crecer en grandes tanques de fermentación. Terminada la fermentación, se recoge la biomasa por centrifugado. El sedimento celular obtenido se diluye a una concentración de células húmedas del 50% (concentración de células secas 10% aproximadamente) con un tampón de fosfato potásico 0,07 M, pH 7, que contiene 0,5 M NaCl. Después de romper las células mediante paso a través de un molino de perlas de vidrio, se extrae la proteína de IFN-B/D del homogenado celular por repartición en un sistema bifásico acuoso que contiene 40% en peso del homogenado celular, 18% en peso de polietilenglicol 1.500, 4% en peso de fosfato potásico pH 7 y NaCl en una concentración total de 1 mol/kg. Después de la separación de fases mediante paso a través de un separador centrífugo de discos apilados a 8150 rpm (13.000 g), la fase superior se recoge y se lava mediante repartición en un segundo sistema bifásico acuoso formado mezclando 4 partes en peso de la fase superior y 1 parte en peso de una solución de 1 mol/kg NaCl que contiene 20% en peso de fosfato potásico, pH 7. Después de la separación de fases en un tanque de sedimentación, se recupera IFN-B/D de la nueva fase superior obtenida mediante retro-extracción en un tercer sistema bifásico acuoso generado mediante la mezcla de 3 partes en peso de la fase superior del segundo sistema bifásico con 7 partes en peso de una solución de 1,56 mol/kg de sulfato de magnesio. Después de la separación de fases en un tanque de sedimentación, la fase pesada se recoge, se diluye con un volumen doble de agua, se filtra a través de un filtro de 0,2 micrómetros y se guarda entonces a 4ºC durante unos cuantos días antes de realizar el tratamiento por cromatografía con quelato de cobre.

Esta solución de adsorción presenta las siguientes características: pH 5,6, conductividad alrededor de 43 mS/cm (debido principalmente a MgSO_{4}), concentración de polietilenglicol 6 mg/ml, concentración de IFN-B/D alrededor de 0,1-0,15 mg/ml, pureza de IFN-B/D alrededor del 30% del contenido total en proteína.

La cromatografía con quelato de cobre se efectúa a temperatura ambiente, empleando una columna (diámetro 44 mm) cargada con 100 ml de Chelating-Sepharose Fast Flow® (Pharmacia, Uppsala). El soporte estacionario se lava sucesivamente con: 5 volúmenes de lecho de etanol al 20%, 5 volúmenes de lecho de agua desionizada, 5 volúmenes de lecho de EDTA 0,05 M y NaCl 0,5 M, 5 volúmenes de lecho de NaOH 0,25 M y NaCl 1 M, 7 volúmenes de lecho de agua desionizada, 5 volúmenes de lecho de ácido fórmico al 0,15 y 7 volúmenes de lecho de agua desionizada, a una velocidad de flujo de 12 volúmenes de lecho por hora. El soporte estacionario se carga entonces con iones cúpricos cargando 5 volúmenes de lecho de una solución 0,008 M de CuSO_{4}-5H_{2}O y se enjuaga con cantidades grandes de agua desionizada, con el fin de eliminar el resto del cobre sin enlazar. Antes de la etapa de adsorción, la columna se equilibra con 500 ml de una solución tampón constituida por MgSO_{4} 0,68 M y acetato sódico 0,092 M, pH ajustado a 5,6 con ácido acético, que tiene aproximadamente la misma conductividad que la solución de adsorción, es decir, 43 mS/cm. Se carga entonces en la columna un volumen de 5.000 ml de la solución de adsorción de IFN-B/D a una velocidad de flujo de 300 ml/h. El efluente es seguido por un monitor UV regulado a una longitud de onda de 280 nm.

Después de la carga, se efectúan tres lavados sucesivos a una velocidad de flujo de 500 ml/h: el primero con 500 ml del tampón de equilibración pH 5,6 ya utilizado antes de la adsorción, el segundo con 500 ml de agua desionizada y el tercero con 500 ml de tampón TRIS-HCl 0,025 M, pH 7,6, conteniendo 0,2 M NH_{4}Cl y 1 M NaCl. Se eluye entonces IFN-B/D empleando simplemente de nuevo 400 ml de agua desionizada a la velocidad de flujo de 500 ml/h. Se recogen los tres lavados y el eluado de agua tal como son controlados por el monitor UV.

La concentración de IFN-B/D de la solución de adsorción, de los tres lavados y del eluado de agua, se mide por análisis HPLC de fase inversa (columna: Vydac C-18, 30 nm, tamaño de partícula 5 micrómetros; fase móvil A: 0,1% de ácido trifluoracético en agua, fase móvil B: 80% de acetonitrilo, 19,91% de agua y 0,09% de ácido trifluoracético; velocidad de flujo 1 ml/min; volumen de inyección 0,05 ml; detección UV a 216 nm).

La cantidad de IFN-B/D encontrado en los tres lavados es despreciable. En contra de todas estas expectativas, se comprueba que el eluado de agua contiene IFN-B/D recuperado con un rendimiento de alrededor de 70% y que tiene una pureza elevada: alrededor del 90% del contenido total en proteína (es decir, enriquecimiento de IFN-B/D en un factor de 3).

Esta elución con agua resulta particularmente sorprendente ya que no se encuentra IFN-B/D en el segundo lavado (rendimiento de recuperación menor del 5%), el cual consiste exactamente en el mismo líquido, es decir, agua pura.

El eluado de agua, que tiene una concentración particularmente elevada de IFN-B/D (alrededor de 1 mg/ml) a una baja concentración de sal y a un valor pH de alrededor de 8, es estable cuando se almacena a 4ºC: en el transcurso de días no se presenta precipitación alguna de IFN-B/D.

Ejemplo 2 Caracterización de varias soluciones de IFN-B/D obtenidas mediante elución con agua

Se obtienen soluciones acuosas de IFN-B/D mediante elución con agua de manera similar a la descrita en el ejemplo 1, pero cambiando el volumen de agua empleada para la elución y/o la composición del tampón empleado para la etapa de lavado justo antes de la elución con agua.

Se obtiene una primera solución de IFN-B/D empleando el mismo tampón de lavado mencionado en el ejemplo 1 (tampón de TRIS-HCl 0,025 M pH 7,6 conteniendo 0,2 M NH_{4}Cl y 1 M NaCl) y empleando solo alrededor de 0,67 volúmenes de lecho de agua desionizada para la elución.

Se obtiene una segunda solución de IFN-B/D empleando tampón de fosfato potásico 0,025 M pH 7,6 conteniendo 0,2 M NH_{2}Cl como tampón de lavado y 1,5 volúmenes de lecho de agua desionizada para la elución.

Se obtiene una tercera solución de IFN-B/D empleando tampón TRIS-HCl 0,025 M pH 7,6 (sin NH_{4}Cl y sin NaCl) como tampón de lavado y 4 volúmenes de lecho de agua desionizada para la elución. Las características de las tres soluciones de IFN-B/D se ofrecen en la tabla 1.

TABLA 1 Características de varias soluciones de IFN-B/D obtenidas mediante elución con agua

1

La primera solución tiene una concentración particularmente alta de interferon (7 mg/ml) y se comprueba que resulta sorprendentemente estable cuando se almacena a 4º C: durante la noche no se presenta precipitación alguna de IFN-B/D. En comparación, la solubilidad de IFN-B/D puro en tampón de fosfato potásico 0,1 M pH 7,6 o en tampón de bicarbonato sódico 0,1 M pH 8,0 es menor de 0,5 mg/ml.

Las soluciones segunda y tercera se guardan durante días a 4ºC. Para ambas soluciones, se comprueba que la concentración de interferon medida por análisis HPLC de fase inversa (como se ha descrito en el ejemplo 1) permanece inalterada después de una semana. Esta estabilidad es particularmente sorprendente en el caso de la tercera solución, la cual tiene una concentración de sal muy baja (conductividad <0,5 mS/cm) a una concentración de interferon tan elevada como 1,5 mg/ml.

Ejemplo 3 Estimación de los rendimientos de recuperación para la elución de IFN-B/D

Los experimentos se realizan a temperatura ambiente, empleando un sistema de cromatografía FPLC® (Pharmacia, Uppsala) y una columna de vidrio (diámetro 10 mm) cargada con 5 ml de Chelating-Sepharose Fast Flow® (Pharmacia, Uppsala). La velocidad de flujo se establece en 60 ml/h para todas las soluciones bombeadas a través de la columna. El efluente es seguido por un monitor UV regulado a una longitud de onda de 280 nm. La regeneración y la preparación del soporte estacionario se efectúan en la forma descrita en el ejemplo 1, bombeando sucesivamente las siguientes soluciones a través de la columna: 25 ml de 0,05 M EDTA y 0,5 M NaCl, 25 ml de 0,25 M NaOH y 1 M NaCl, 35 ml de agua desionizada, 25 ml de ácido fórmico al 0,1%, 35 ml de agua desionizada, 25 ml de 0,008 M CuSO_{4}x 5H_{2}O y 40 ml de agua desionizada.

En un primer experimento, se cargan en la columna alrededor de 80 ml de una solución de IFN-B/D puro (pureza: 99,9% del contenido en proteína; concentración: alrededor de 0,3 mg/ml) en manitol 0,2 M y fosfato sódico 0,03 M, pH 7,6. Después del lavado con 35 ml de tampón de cloruro amónico 0,3 M, pH 7,6, el interferon es eluído empleando 35 ml de agua desionizada. Se bombea entonces, a través de la columna, un volumen de 25 ml de tampón TRIS-HCl 0,025 M, pH 7,6, conteniendo cloruro amónico 2 M, con el fin de asegurar la elución de todo el interferon enlazado todavía en el soporte estacionario. La concentración de interferon de las fracciones recogidas se mide mediante análisis HPLC de fase inversa como se ha descrito en el ejemplo 1. Los correspondientes rendimientos de recuperación obtenidos se ofrecen en la tabla 2.

Se repite el mismo experimento, pero empleando borato potásico 0,1 M pH 7,6 como tampón de lavado en lugar de cloruro amónico 0,3 M pH 7,6. Los resultados se indican también en la tabla 2.

TABLA 2 Rendimientos de recuperación para la elución de IFN-B/D

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Como se muestra en la tabla 2, la composición del tampón empleado para la etapa de lavado justo antes de la elución afecta en gran medida a la elución con agua.

Ejemplo 4 Influencia de la etapa de lavado

Se efectúa varias veces el mismo experimento que el establecido en el ejemplo 3, cambiando únicamente la composición del tampón de lavado. Los diversos tampones de lavado ensayados y los correspondientes rendimientos de recuperación obtenidos se ofrecen en la tabla 3.

TABLA 3 Rendimientos de recuperación para la elución de IFN-B/D

3

Como se muestra en la tabla 3, la elución con agua ocurre con un buen rendimiento (mayor del 60%) tanto si el tampón de lavado tiene un valor pH en el intervalo básico (por ejemplo, con borato potásico 0,1 M pH 9,5) como si el tampón de lavado contiene una amina o una sal amónica a un valor pH casi neutro (por ejemplo, con acetato amónico 0,3 M pH 7,6, pero no con acetato potásico 0,3 M pH 7,6). En este caso, se permite que la amina sea primaria (por ejemplo, etanolamina), secundaria (por ejemplo, dietanolamina) o terciaria (por ejemplo, trietanolamina), pero no cuaternaria (por ejemplo, cloruro de tetrametilamonio). La concentración óptima del tampón de lavado depende en gran medida de la amina usada: por ejemplo, alrededor de 1 mM en el caso de cistina pH 7,6 o 300-500 mM en el caso de NH_{4}Cl pH 7,6.

Ejemplo 5 Influencia de una segunda etapa de lavado después del tratamiento con base de Lewis

Se repite el mismo experimento que el establecido en el ejemplo 3, pero introduciendo una segunda etapa de lavado con 35 ml de tampón de borato potásico 0,1 M pH 7,6 entre la primera etapa de lavado efectuada con 35 ml de tampón de cloruro amónico 0,3 M pH 7,6 y la elución con agua. Los rendimientos de recuperación encontrados son:

en el primer lavado	(0,3 M NH_{4}Cl pH 7,6):	0%
en el segundo lavado	(0,2 M K-borato pH 7,6):	0%
en el primer eluado	(agua):	22%
en el segundo eluado	(2 M NH_{4}Cl + 0,025 M TRIS-HCl pH 7,6):	78%

En el eluado de agua se encuentra una pequeña cantidad de IFN-B/D. Sin embargo, y a pesar de la presencia de amonio en la primera etapa de lavado, el rendimiento de recuperación obtenido es bajo (alrededor de 22%), indicando ello una influencia más alta de la etapa de lavado justo antes de la elución.

Ejemplo 6 Rendimientos de recuperación para la elución de IFN-B/D sin etapa de lavado

Se repite el mismo experimento que el establecido en el ejemplo 3, pero sin la etapa de lavado entre la etapa de adsorción y la etapa de elución con agua.

Se efectúa un primer experimento empleando exactamente la misma solución de carga que la mencionada en el ejemplo 3 (0,3 mg/ml IFN-B/D en manitol 0,2 M y fosfato sódico 0,03 M pH 7,6). Se efectúa entonces un segundo experimento también con la misma solución de carga, pero conteniendo además cloruro amónico en una concentración de 0,3 mol/l. Los correspondientes rendimientos de recuperación obtenidos se indican en la tabla 4.

TABLA 4 Rendimientos de recuperación para la elución de IFN-B/D (caso sin etapa de lavado)

4

Como se muestra en la tabla 4, la composición del tampón de lavado justo antes de la elución afecta en gran medida a la elución con agua.

Ejemplo 7 Influencia del efecto de salificación

Se obtiene una solución acuosa de IFN-B/D parcialmente puro (pureza: alrededor del 90% del contenido en proteína) mediante elución con agua de manera similar a la descrita en el ejemplo 1. Partes alícuotas de esta solución se congelan, se guardan a -5 a -10ºC aproximadamente y se descongelan antes de su uso.

La composición de esta solución madre es:

IFN-B/D:	0,5-1 mg/ml
TRIS-HCl:	aprox. 0,02 M
NaCl:	aprox. 0,01 M
Na-acetato:	aprox. 0,01 M
NH_{4}Cl:	aprox. 0,002 M
Cu^{+2}:	aprox. 1 \muM
pH:	8
conductividad:	2,2 mS/cm

Se realizó varias veces el mismo experimento que el indicado en el ejemplo3, cargando 50 ml de esta solución madre y cargando solo la composición del tampón de lavado. Los diversos tampones de lavado ensayados y los correspondientes rendimientos de recuperación obtenidos se ofrecen en la tabla 5.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 5 Rendimientos de recuperación para la elución de IFN-B/D

5

Todos los tampones de lavado ensayados son sales de amonio a pH 7,6. Los aniones usados como contra-iones están dispuestos en la tabla 5 en el orden que va desde aquellos que muestran una tendencia a romper la estructura del agua (efecto caotrópico) y conducen a un descenso relativo en las intensidades de las interacciones hidrófobas hasta aquellos que son particularmente eficaces a la hora de aumentar las interacciones hidrófobas (efecto de salificación):

efecto de salificación en aumento: SCN^{-} < Cl^{-} < CH_{3}COO^{-} < SO_{4}^{2-}

Como se muestra en la tabla 5:

-: En el caso de NH_{4}SCN (bajo efecto de salificación), si la concentración de amonio es demasiado alta (\geq 0,3 M), el IFN-B/D es eluído directamente con el tampón de lavado. La elución con agua se presenta con un alto rendimiento (\geq 90%) cuando la concentración de NH_{4}SCN es \leq 0,1 M.

-: En el caso de NH_{4}Cl, la elución con agua se presenta con un alto rendimiento cuando la concentración de NH_{4}Cl es \leq 0,5 M.

-: En el caso de NH_{4}-acetato, es posible emplear una concentración tan alta como de 0,8 M y obtener un alto rendimiento para la elución con agua.

-: En el caso de (NH_{4})_{2}SO_{4} (alto efecto de salificación), es posible emplear una concentración de amonio tan alta como de 1,0 M y obtener un alto rendimiento para la elución con agua.

Ejemplo 8 Influencia del pH y de la concentración

Se repiten los mismos experimentos que en el ejemplo 7, cambiando la composición del tampón de lavado. Los diversos tampones de lavado ensayados y los correspondientes rendimientos de recuperación obtenidos se ofrecen en la tabla 6.

TABLA 6 Rendimientos de recuperación para la elución de IFN-B/D

6

Como se muestra en la tabla 6:

-: En el caso de K-acetato pH 5,6 (bajo valor pH; sin amina) y en el caso de TRIS-HCl pH 5,6 (bajo valor pH; presencia de amina), los rendimientos de recuperación obtenidos para elución con agua son muy bajos.

-: En el caso de TRIS-HCl pH 7,6 (valor pH casi neutro; presencia de amina), el rendimiento de recuperación obtenido para la elución con agua es bueno (mayor del 60%). Si la concentración de amina es demasiado alta (> 0,3 M), la elución parcial de IFN-B/D ocurre directamente con el tampón de lavado. Si la concentración de amina es demasiado baja (< 0,1 M), la elución con agua no es cuantitativa y una cantidad restante de IFN-B/D puede ser eluída posteriormente empleando el tampón de 2 M NH_{4}Cl + 0,025 M TRIS-HCl pH 7,6. Este último problema puede ser evitado mediante la inclusión de NaCl (en una concentración de 1,7 M), el cual enfriará rápidamente las interacciones iónicas entre el soporte estacionario y la proteína de interferon.

Ejemplo 9 Elución con un gradiente

Se realiza el mismo experimento que el indicado en el ejemplo 7, empleando 0,1 M TRIS-HCl pH 7,6 como tampón de lavado. El rendimiento de recuperación obtenido para la elución con agua es de 89%. La cantidad restante de IFN-B/D (11%) es eluída posteriormente con el tampón de 2 M NH_{4}Cl + 0,025 M TRIS-HCl pH 7,6.

Se repite este experimento empleando el mismo tampón de lavado (20 ml de 0,1 M TRIS-HCl pH 7,6), pero después de esta etapa de lavado se efectúa una elución en gradiente lineal desde 100% de tampón de lavado a 100% de agua desionizada en 12 volúmenes de lecho (60 ml). La columna es enjuagada además con 55 ml de agua y luego se aplica un segundo gradiente lineal desde 100% de agua a 100% del tampón de 2 M NH_{4}Cl + 0,025 M TRIS-HCl pH 7,6 en 7 volúmenes de lecho (35 ml). La columna se enjuaga finalmente con 15 ml de este último tampón.

Se comprueba que el IFN-B/D ha sido eluído al término del primer gradiente, en una concentración correspondiente de alrededor de 10 a 15 mM de TRIS-HCl pH 7,6 y con un rendimiento de recuperación del 60%. La cantidad restante de IFN-B/D (40%) es eluída en la parte media del segundo gradiente, a una concentración correspondiente de alrededor de 1 M NH_{4}Cl + 12,5 mM TRIS-HCl pH 7,6.

Ejemplo 10 Composición de la solución de elución

Se repiten los mismos experimentos que en el ejemplo 7, empleando siempre una solución de 0,1 M TRIS-HCl pH 7,6 como tampón de lavado, pero cambiando la composición de la primera solución de elución, especialmente la composición del agua para la elución. Las diversas soluciones de elución ensayadas y los correspondientes rendimientos de recuperación obtenidos se indican en la tabla 7.

TABLA 7 Rendimientos de recuperación para la elución de IFN-B/D

7

Como se muestra en la tabla 7:

-: La concentración de sal residual en agua ha de ser extremadamente baja (<0,001 M) con el fin de lograr la elución de IFN-B/D con un rendimiento de recuperación mayor del 50%.

-: Se deja que los solutos no cargados, tales como manitol o glicerol, estén presentes en la solución de elución, incluso a elevada concentración (del orden de 1 M), pero no los zwitteriones. Por ejemplo, la concentración de MES (ácido 2-[N-morfolino]etanosulfónico) ha de ser menor de 0,001 M con el fin de obtener un buen rendimiento de recuperación.

-: La conductividad de la solución de elución no puede ser utilizada como criterio con el fin de predecir la realización o no de la elución de IFN-B/D.

Ejemplo 11 IFN-B e IFN-D

Se realizan los experimentos con interferon-\alpha B (IFN-B) humano o con interferon-\alpha D (IFN-D) humano como se ha descrito en el ejemplo 3 para el interferon-\alpha B_{1}D_{2}B_{3}B_{4} (IFN-B/D) híbrido humano, pero empleando una columna de vidrio más pequeña (diámetro 5 mm) cargada con solo 0,5 ml de Chelating-Sepharose Fast Flow® (Pharmacia, Uppsala). La correspondiente velocidad de flujo y los correspondientes volúmenes de las soluciones bombeadas a través de la columna se emplean a una menor escala en un factor de 10.

IFN-B e IFN-D, las moléculas parentales de IFN-B/D descritas en EP-A-205404, son producidos por la expresión de DMA recombinante en levadura (Saccharomyces cerevisiae), fermentación, recuperación y purificación parcial.

Para IFN-B, se obtiene una solución madre en 0,025 M TRIS-HCl pH 7,6, que tiene una concentración de interferon de 0,05 mg/ml y aproximadamente la misma pureza que la solución madre de IFN-B/D descrita en el ejemplo 7.

Para IFN-D, se obtiene una solución madre, que tiene la misma composición y aproximadamente la misma pureza que la solución de adsorción de IFN-B/D descrita en el ejemplo 1.

Como se ha descrito en el ejemplo 3, el interferon cargado en la columna es sucesivamente lavado con un tampón adecuado, eluído con agua desionizada y eluído con tampón 0,025 M TRIS-HCl pH 7,5 que contiene cloruro amónico 2 M. La concentración de interferon de las fracciones recogidas se mide por análisis HPLC de fase inversa como se ha descrito en el ejemplo 1, y se confirma por análisis de la actividad antivírica biológica en células bovinas (células bovinas Madin-Darby) contra el virus de estomatitis vesicular in vitro. Los diversos tampones de lavado ensayos y los correspondientes rendimientos de recuperación obtenidos se ofrecen en la tabla 8.

TABLA 8 Rendimientos de recuperación para la elución de IFN-B o IFN-D

8

Como se muestra en la tabla 8, IFN-B e IFN-D pueden ser eluídos con agua.

Ejemplo 12 \alpha-amilasa y tripsina

Se realizan los experimentos con varias proteínas como se ha descrito en el ejemplo 3 para IFN-B/D, empleando el mismo sistema de cromatografía FPLC®, la misma cantidad (5 ml) de Chelating-Sepharose Fast Flow® y las mismas condiciones de cromatografía.

Las proteínas ensayadas son: \alpha-amilasa de especies de Bacillus (Sigma, producto Nº A 6380), tripsina de páncreas bovino (Serva, producto Nº 37260). Los experimentos se efectúan cargando aproximadamente 50 ml de la correspondiente solución de proteína (concentración 0,5 mg/ml), bien en tampón 0,01 M TRIS-HCl pH 7,6 si se emplea TRIS-HCl como el siguiente tampón de lavado, o bien en tampón de borato potásico 0,01 M pH 7,6 si se emplea K-borato como el siguiente tampón de lavado o si se omite la etapa de lavado.

Como se ha descrito en el ejemplo 3, la proteína cargada en la columna es sucesivamente lavada con un tampón (TRIS-HCl o K-borato) eluída con agua desionizada y eluída con tampón 0,025 M TRIS-HCl pH 7,6 conteniendo cloruro amónico 2 M. La concentración de proteína de las fracciones recogidas se mide mediante el análisis de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad, producto Nº 500-0006, procedimiento de microanálisis). Las proteínas y los tampones de lavado ensayados, así como los correspondientes rendimientos de recuperación obtenidos, se ofrecen en la tabla 9.

TABLA 9 Rendimientos de recuperación para la elución de varias proteínas

9

Como se muestra en la tabla 9:

-: La \alpha-amilasa (de especies de Bacillus) puede ser eluída con agua (rendimiento de recuperación: aproximadamente 90-100%), bien si el tampón de lavado tiene un valor pH en el intervalo básico (por ejemplo con borato potásico 0,1 M pH 9,5), o bien si el tampón de lavado contiene una amina a un valor pH casi neutro y a una concentración adecuada (por ejemplo con 0,025 a 0,1 TRIS-HCl pH 7,6).

-: La tripsina (de páncreas bovino) puede ser también eluída con agua (rendimiento de recuperación mayor del 40%), por ejemplo empleando 0,025 M TRIS-HCl pH 7,6 como tampón de lavado.

Ejemplo 13 Medios cromatográficos

Se realiza dos veces el mismo experimento que el indicado en el ejemplo 7, empleando siempre 0,1 M TRIS-HCl pH 7,6 como tampón de lavado, pero cambiando el medio de cromatografía.

Para el primer experimento, el medio empleado es Chelating-Sepharose Fast Flow® (Pharmacia, Uppsala), como en los ejemplos 1 a 12. El diámetro de las perlas es de 0,045-0,165 mm. El medio Chelating-Sepharose Fast Flow consiste en grupos de ácido iminodiacético sobre separadores, acoplados a Sepharose Fast Flow® mediante enlaces éter estables:

[Sepharose Fast Flow]-O-CH_{2}-CHOH-CH_{2}-O-CH_{2}-CHOH-CH_{2}-N- (CH_{2}COOH)_{2}

La matriz base -Sepharose Fast Flow- es agarosa reticulada.

Para el segundo experimento, el medio empleado es TSK Toyopearl® AF-Chelate-650 M (TosoHaas, Stuttgart). El diámetro de las perlas es de alrededor de 0,065 mm. El medio TSK Toyopearl® es un gel hidrófilo semi-rígido, un copolímero de oligoetilenglicol, metacrilato de glicidilo y dimetacrilato de pentaeritritol. El ligando consiste en grupos de ácido iminodiacético inmovilizados.

Para cada experimento, se carga una columna de vidrio (diámetro 100 mm) con 5 ml del respectivo gel. Se aplica el mismo método de regeneración y preparación (carga de los iones cúpricos) para el medio Chelating-Sepharose Fast Flow® y para el medio TSK Toyopearl AF-Chelate-650 M®, como se ha descrito en el ejemplo 3. La solución de adsorción de IFN-B/D empleada es la solución madre descrita en el ejemplo 7. Los correspondientes rendimientos de recuperación obtenidos se ofrecen en la tabla 10. En ambos casos, se consigue un alto rendimiento de recuperación para la elución con agua.

TABLA 10 Rendimientos de recuperación de la elución de IFN-B/D para diversos medios cromatográficos

(el tampón de lavado es 0,1 M TRIS-HCl pH 7,6)

10

Depósito de microorganismos

Las siguientes cepas de microorganismos fueron depositadas en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM), Mascheroder Weg 1B, D-38142 Braunschweig, Alemania (se indican los números de registro y las fechas de depósito):

Saccharomyces cerevisiae HT 393

DSM 9697

27.01.1995

Claims

1. Procedimiento para el enriquecimiento de una proteína impura o pre- purificada, que comprende las etapas sucesivas de:

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde los iones cobre(II) están inmovilizados sobre un soporte estacionario.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en donde el soporte estacionario es agarosa o un polímero vinílico.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde la solución de base de Lewis contiene NH_{4}^{+} o una amina primaria, secundaria o terciaria en una región de pH neutro o alcalino bajo o OH^{-} en una región de pH alcalino alto.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde la solución de base de Lewis contiene NH_{4}^{+} o una amina primaria, secundaria o terciaria.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde la solución de base de Lewis contiene NH_{4}^{+} o una amina primaria.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde la solución de base de Lewis contiene OH^{-} en una región de pH tamponado de 9-11.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde la base de Lewis se elige del grupo consistente en etanolamina, cistina, NH_{4}SCN, NH_{4}Cl, NH_{4}^{+}CH_{3}COO^{-}, (NH_{4})_{2}SO_{4} y TRIS-HCl.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde la base de Lewis se emplea en una concentración de 0,001 a 1 M.

10. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde la solución de base de Lewis contiene una o más sales adicionales que no son bases de Lewis.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en donde la sal adicional es NaCl o KCl.

12. Procedimiento según la reivindicación 10, en donde la sal adicional se emplea en una concentración de hasta 5 M.

13. Procedimiento según la reivindicación 10, en donde la sal adicional se emplea en una concentración de hasta 2 M.

14. Procedimiento según la reivindicación 5, en donde la base de Lewis se ajusta a pH 6-9.

15. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde la proteína impura o pre-purificada se caracteriza porque una base de Lewis no destruye totalmente un complejo entre dicha proteína e iones cobre(II).

16. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde la proteína impura o pre-purificada se caracteriza porque es interferon, amilasa, tripsina o una proteína relacionada.

17. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde la proteína impura o pre-purificada se caracteriza porque se elige del grupo consistente en interferon-a, tripsina y co-amilasa.

18. Procedimiento según la reivindicación 1, en donde el agua desionizada contiene compuestos no iónicos.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, en donde el agua desionizada contiene azúcar o poliol.

20. Procedimiento según la reivindicación 18, en donde el agua desionizada contiene manitol o glicerol.