442492 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（） 本發明有關用銅螯合-親和力層析術之蛋由質新純化方 法。 銅螯合物-親和力層析術係利用將蛋ή質之易接近之電 子供予基（例如組胺酸）連結在銅離子上（用螯合基共價 附在靜止撐體上）之方法完成。單獨一個易接近之組胺酸 之存在通常足夠讓蛋白質吸附在一銅(II)-IDA-螯合物h ( IDA =亞胺二乙酸酯）。蛋白質在銅螯合物-親和力層析中之停留 視可與金屬交互作用之蛋白質上之側基之數目及種類而 定。交互作用係受各種獨立變數像pH、溫度、溶劑種類、 鹽種類及鹽濃度影響。在中性或低鹸性pH範圍內與銅螯合 物結合之蛋白質通常利用一競爭性試劑之漸減之pH梯度 (連續或逐步）或漸增之濃度梯度（連續或逐步）溶析， 例如用路易士鹸像咪唑溶於緩衝液之溶液溶析·或者，第 三個可能的溶析方法包括一溶析液中之螯合物（像 EDTA) ° 然而，這些方法有幾個缺點： •低選擇性，即在相同條件下可析出數個蛋白質 •低濃化 •蛋白質與高濃度銅(II)離子共溶析，若使用競爭性或螯合 試劑 •需要另外之純化步驟以去除溶析液 *爲了提高選擇性，通常必須使用連續梯度溶析期望之蛋 白質。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4规格(210 X 297公釐) ......................裝..............:-訂...........::.4 (請先閲讀背面之注意事項蜞寫本頁) 442492 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 例如在蛋白質使用一競爭性或螫合試劑溶析之情況，析出 液含蛋白質、競爭性或螯合試劑及釋出之銅(Π)離子。所 以，競爭性試劑及銅（II)離子必須利用額外之純化步驟去 除，而且，許多蛋白質在溶液中含高濃度銅(II)離子下不安 定（氧化作用）或在低pH値下不安定（沉澱作用），且 失活。 〜 本發明現在提供一特別有利之從銅螯合物-複合物中溶 析蛋白質之方法。利用本發明方法，驚異地可用去離子水 (其可選擇性地含額外之蛋白質安定劑）溶析期望之蛋白 質。使用去離子水有幾個優於先前技術之優點： •不使用競爭性或螯合試劑，所以不需要額外之純化步驟 •期望之蛋白質不與可能引起氧化問題之高濃度銅(Π)離子 共溶析 •期望之蛋白質在可能引起沉澱或失活問題之低pH値下不 析出 •期望之蛋白質以特別高純度及高產率回收 •溶析可利用一步驟實施，而不使用一梯度（連續或逐 步） •析出之蛋白質不用另外處理即可儲存。 發明詳述 本發明有關提高蛋白質濃度之方法，該方法包括以下 之步驟： a)將不純或純化前之蛋甶質吸附在固定之銅(II)離子上， .......................裝........^.......’玎...............^ (請先閲讀背面之注意事Ϊ5填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS>A4规格(210X 297公釐) 442492 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（） b) 用一路易士鹼溶液淸洗吸附之蛋內質，及 c) 用去離子溶析期望之蛋白質。 銅(II)離子通常固著在一靜止撐體（例如，無機載體像 矽石或聚合基質）上。 靜止撐體必須可與銅(II)離子形成螯合物·•此靜止撐體 之實例爲那些，其中之螯合基（像亞胺乙酸(IDA)、Ν，Ν，Ν·-查 (羧甲)·伸乙二胺(TED)、羧甲基化之天冬胺酸(CM-ASP)、四伸 乙基五胺(ΤΕΡΑ)、氮乙酸(NTA)或羧甲基化之οφ·二胺琥珀酸 (CM-DASA))共價結合在靜止撐體上者。螯合基可直接或經 由間隔基附在靜止撐體上。聚合載體可爲任何傳統用於金 屬離子-親和力層析術之聚合化合物此類聚合材料之實例 包括瓊脂糖、葡聚糖或其它合成聚合物；偏愛者爲瓊脂糖 及乙烯基聚合物。有共價附著之螯合基之製備方法係描述 在，例如，Hochu】i，CHIMIA (1986)，40, 408 - 412 (亦參見 Figueroa et al., J. Chromatography (1986), 371, 335 - 352 ； Porath, Protein expression and purification (1992), 3, 263 - 281 i L. KSgedal in "Protein Purification, principles, high resoluton methods and applications" Janson and Ryden Eds. (1989), 227 - 251, VCH Publishers, New York)。在本發明之一偏愛 之具體實施例中，靜止撐體可在1 -200,且更適宜在10-100 微摩爾/毫升靜止撐體之濃度下，與銅（II)離子形成螯合 物。 適合使用在本發明中之聚合載體亦可在市面上購得， 像： 本紙張尺度適用中國S家標準(CNS)A4規格(210X297公釐) .......................裝...............V...............-'# (請先閲讀背面之注意事項%寫本頁) 442492 A7 B7 經涛部中央標準局員工消費合作社印裝 五、發明説明（） •蜜合之西法露快流（Chelating-Sepharose Fast Flow)® ( Pharmacia 公司，Uppsala)，其中間隔基上之亞胺二乙酸基係利用 安定之酸連接鍵稱合至西法露快流（Sepharose Fast Flow) 上； •螯合之西法露 6B (Chelating-Sepharose 6B)® ( Pharmacia 公司， Uppsala);及 • TSK Toyopearl AF-Chelate-650 Μ® ( TosoHaas 公司，Stuttgart)， 其中亞胺二乙酸基係固著在一由寡乙二醇、甲基丙烯酸 縮水甘油酯及二甲基丙烯酸異戊四酯之共聚物製成之親 水性半硬靜止撐體上。 銅(U)離子固定前，靜止撐體通常要淸洗。例如，靜止 撐體連續用M0，較適宜者爲3-7倍床體積之5-50%，較適宜 者爲10-30%乙醇；1-10,較適宜者爲3-7倍床體積之去離子 水；M0,較適宜者爲3-7倍床體積之0.01-0.1M，較適宜者爲 0.03-0.07 M EDTA 及 0.1-1 Μ，較適宜者爲 0.3-0.7 M NaCl ; M5， 較適宜者爲3-1〇倍床體積之去離子水清洗；最後用1-10,較 適宜者爲3-7倍床體積之0.01-1%，較適宜者爲0.05-0.5%甲酸及 1-15,較適宜者爲3-10倍床體積之去離子水淸洗。這些淸洗 溶液之流率通常爲每小時1-50,較適宜者爲5_20倍床體積。 銅(II)離子在以上之靜止撐體中之固著可簡單地用銅離 子充滿靜止撐體之方法達成。常見之銅(II)離子源爲銅(Π) 鹽，像CuCl2、CMCHgCOOh及特別是CuS04 "通常使用M0，較 適宜者爲3-7倍床體積之0.001-0.1\1，較適宜者爲0.003-0,11^之 CuS04x5H20水溶液，隨後將靜止撐體用大過量之水淸洗， (請先閱讀背面之注意事項再填寫本筲) 、-° 丁 ·- 本紙張尺度適用中國國家標芈（CNS ) Λ4規格（210 X 297公婕） -7- 442492 Λ7 Β7 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 五、發明説明（） 以消除剩餘之未結合銅離子。如是製備之含固著之銅(Π)離 子之靜止撐體立即可用於本發明之方法中。 視靜止撐體、含蛋白質之溶液之pH及離子強度而定， 有時在充塡含蛋白質之溶液前，較適宜用一有相同PH及離 子強度之溶液處理，以避免吸附蛋白質時發生膨脹或收 縮。此一處理之必要性可利用一小規模試驗很容易地檢 查。此預處理可將M0,較適宜者爲3·7倍床體積之處理溶 液流過靜止撐體而達成。 蛋白質經由螯合物之形成在以上製備之靜止撐體上之 吸附係簡單地將一含蛋白質之溶液載入含固著之銅(Π)離子 之管柱中而達成。 蛋白質溶液可得自各種來源，且可預純化或未預純 化。例如，若要單離之蛋白質被宿主分泌至培養液內，例 如，可在離心後直接將培養液加於靜止撐體。若蛋白質在 宿主內產生及儲存，細胞必須破壞且含蛋白質之溶液必須 從細胞碎屑中分離出，例如利用離心法。如此得到之含蛋 白質之溶液可如上所述直接加入靜止撐體中，或可進一步 純化，例如利用技術上熟知之沉澱、萃取或層析法。因 此，含蛋白質之溶液可得自各種來源，且其可能含各種不 純物，像離子物種、外來蛋白質等。 蛋白質是否可用本發明方法純化可輕易地在一小規模 試驗中決定，其中蛋白質係吸附在少量充塡銅(Π)之靜止撐 體上，用如下定義之路易士鹸處理，接著決定可用去離子 水溶析之蛋白質量，並與可用2MNH4C1溶析之蛋白質量比 (婧先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4规格（210X297公釐} -8 - 442492 經濟部中央樣準局員工消費合作社印黎 A7 B7 五、發明説明（） 較。通常，本發明方法可應用於以如下定義之路易士鹸不 完全破壞該蛋白質與銅(Π)離子間之複合物爲特徵之蛋白 質。偏愛之蛋白質爲干擾素、澱粉酶、胰蛋甬酶及相關之 蛋白質。特別偏愛者爲干擾素-α、胰蛋白酶及〇t-源粉酶。 要載入靜止撐體上之含蛋白質溶液之量係決定於固著 在此靜止撐體上之銅(Π)離子濃度、溶液中之蛋白質濃度及 蛋白質性質。所以，要載入之適當溶液量係靠經驗決定， 使用一檢測器（像紫外光監測器）觀測流出液。 本發明之一重要步驟爲用去離子水溶析前，用路易士 鹼淸洗吸附在靜止撐體上之蛋白質。路易士鹼爲一電子對 予體像胺、HCT、磷烷或膦。實例爲NH3、CH3NH2、 (CH3)2NH、（CH3)3N、（^(CH+N、C2H5NH2、（QH^NH、 (C2H5>3N、CjH7NH2、C4H9NH2、C5HUNH2、C6H13NH2、CH3PH2、 (CH4PH、（CHAP、胺基酸、胱胺酸、帶有羥基之胺像 HOCH2NH2、（HOCHANH 或(HOCH2)3N、HOC2H4NH2、（HOQH^NH 或(HOQHAN ;或爲 TRIS-HC1。 在本發明之一偏愛之形式中，路易士鹼溶液含中性或 低鹸性pH範圍之NH/或第一、第二或第三胺、或高鹸性PH 範圍之OH·。在本發明之一更偏愛之具體實施例中，路易士 鹼溶液含NH/或第一、第二或第三胺，且最偏愛者爲一含 NH4+或第一胺像乙醇胺、胱胺酸、nh4SCN、NH4C1、 NH4+CH3COCT、（NH^SCX» 或 TRIS-HC1 之溶液。 本紙張尺度適用中國國家標华（CNS ) A4規格（210X 297公嫠）
It ^^^^1 I . ml fluv ti 1^1^1 1 rr (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -9- 442492
經濟部中央標準扃員工消費合作社印I A7 B7 五、發明説明（） 爲了不使路易士鹼溶液溶析期望之蛋白質，可調節路 易士鹼之濃度或含路易士鹼溶液之pH。適宜之胺（路易士 鹼）之濃度範圍爲從0.001至 路易士鹼之最佳濃度強烈地決定於電子予體。例如， 在胱胺酸之情況，最佳濃度爲ImM，然而在NH4C12情況， 最佳濃度爲300-500 mM。數種鹽之最佳濃度爲，例如， Nl^SCN 爲 10-100 mM，NH4CI 爲 10-500 mM，NH4(CH3COO)爲 10-800 mM或更高及(NH4>2S04爲10-500 mM或更高。 在使用胺爲路易士鹸之情況，pH宜調成pH 6-9;更適宜 者爲6.5-8.5 ;且最適宜者爲7·0-8.0。在使用OH_爲路易士鹸之 情況，pH宜調成9-11，例如用硼酸鹽或磷酸鹽緩衝液。 亦可使用不同路易士鹼之混合物以改進結果，或額外 加入非路易士鹼之鹽像NaCl或KC1。額外鹽之濃度可高至 5M，且較適宜者爲高至2M。 典型上，已吸附蛋白質之靜止撐體係用M0或較適宜者 爲3-7倍床體積之上述之淸洗溶液淸洗。流率係由經驗決 定，且爲，例如，1-10或較適宜者爲3-5倍床體積/小時。 上述之淸洗步驟最好是恰在蛋白質用去離子水溶析前 實施。亦可在載入蛋白質同時進行此淸洗步驟，倘若其後 立即實施溶析步驟。 期望之蛋白質可在用如上述之路易士鹸淸洗後溶析， 簡單地用去離子水淸洗靜止撐體。爲了得到高純度，去離 子水不可含超過0.001M之離子化合物。相反地，去離子水 可含非離子化合物，例如，以安定蛋白質之第三或第四結 本紙張尺度通用中國國家標隼（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） H. (^^1 d— rp^^i n^i i . <m n^i ] i ri. I* (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -10- 442492 A 7 B7 五、發明説明（） 構。適合之非離子化合物爲’例如’糖或多醇像甘露糖 醇、葡萄糖、乳糖、果糖、甘油、聚乙二醇：或含維持蛋 白質之锍基氧化態之其它化合物。去離子水之用量宜爲1-10,且更適宜者爲3-7倍床體積。 在本發明之方法中，大多數與靜止撐體特異結合之外 來蛋白質不被去離子水溶析。其仍然被吸附，且其後可使 用傳統溶析溶液（例如2M NH^Cl在25 mM TRIS-HC1緩衝液 中，pH7.6)去除。所以，造成之產物濃化特別高。例如， 對干擾素-αΒΛΒ：^之情況，產物純度高至大約90% (由30% 純度之吸附溶液開始），然而先前技術銅螯合物-親和力層 析術達到之純度僅爲30-50°/〃 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 n - -- « HI ^^^1 —I» I 111. 1 nf n^i m n^i ^1.^1 El--SJ1 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 爲了使期望之蛋白質達到最佳純度及回收，可在蛋白 質吸附步驟與用路易士鹸淸洗步驟間選擇性地加入一或多 個用適當緩衝液（像硼酸鉀緩衝液）及/或用去離子水之 額外淸洗步驟。因此，在本發明之一更偏愛之具體實施例 中，被吸附之蛋白質係用非路易士鹸緩衝液淸洗，及/或 在用路易士鹼溶液淸洗前用去離子水淸洗。此發現是驚人 的，因爲淸洗步驟及溶析步驟可利用相同手法（即去離子 水）進行。 此使用去離子水之中間淸洗步驟是有效的，例如，用 於消除副產物，特別是那些經由疏水性交互作用（及非經 特異之銅離子親和力）與靜止撐體結合者。 由其它基於銅(Π)螯合物之純化程序得知，單離蛋白質 之溶液可含極少量銅(Π)離子。這些離子可利用技術上已知 本紙張尺度適用中國國家操準（CNS〉Λ4規格（210X297公嫠） -11 - 442492
經濟部中央標準局負工消費合作社印製 五、發明説明（） 之方法（像離子交換或銅(II)離子螯合管柱）輕易地去除。 後一個純化步驟可各別進行或，例如，緊接在管柱下半部 塡滿銅(II)離子去除材料後進行。 純化後，銅充塡之靜止撐體可淸洗或及用於另一純 化，或爲了得到可再現之結果，銅(U)離子最好用一競爭性 螯合劑（例如EDTA)從靜止撐體中去除，接著將靜止撐體 再度如上述地塡滿銅(Π)離子》 實施例 實施例1 : IFN-B/D之純化 基因重組之人類雜交干擾素(以下稱爲IFN-B/D)係如專利案EP-A-205404中所述而建造。IFN-B/D係利用 啤酒酵母菌菌株HT 393產生，其相當於海因梅爾(Heinemeyer) 等人發表之 E 95-1-2A (EMBO Journal (1991)，10, 555-562; DSM 9697)，且其用質體pDP34R/PH05/IFNAM119轉形。酵母菌載體 PDP34R及酵母菌酸磷酸酶基因啓動子PH05參見海連(Hinnen) 等人（在："Yeast Genetic Engineering' Barr et al.，Eds, Butterworths， Boston (1989), 193-213 中）。IFN AM119 爲 IFN-B/D 之編碼序列， 且參見專利案EP-A-205404。 含編碼IFN-B/D之基因重組質體之酵母菌菌株HT 393在 大發酵槽中生長。發酵完全後，將生物量利用離心收集。 將得到之細胞沉澱物用含0.5 M NaCl之0.07 Μ磷酸鉀緩衝液 (ρΗ7)稀釋成5〇%之濕綑胞濃度。當細胞流過一玻璃珠硏磨 器打碎後，利用一含40% (重量百分比）細胞勻漿、18% nn mt tut n 1 «^—^1 T4 -¾ i (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙张尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4规格（210 X 297公嫠） -12- 442492 經濟部中央標準局貝工消費合作社印褽 A7 B7 五、發明説明（） (重量百分比）聚乙二醇1500、4% (重量百分比）磷酸鉀 (pH 7)及總濃度1摩爾/公斤之NaCl之水性兩相系統中分 配，將IFN-B/D蛋白質從細胞勻漿萃取出。在流過轉速815〇 rpm(13000g)之離心盤架分離爲相分離後，收集上層相，並 在第二個水性兩相系統中分配淸洗（第二個系統係將4份 (重量百分比）上層相及1份（重量百分比）含20% (重量 百分比）磷酸鉀（pH 7)之1摩爾/公斤NaCl溶液混合而 成）。在一沉降槽中相分離後，將IFN-B/D從新的上層相利 用在第三個水性兩相系統中反萃取而回收（第三個系統係 將3份（重量百分比）第二個兩相系統之上層相及7份（重 量百分比）1.56摩爾/公斤硫酸鎂溶液混合而成）。在一沉 降槽中相分離後，將重相收集，用雙倍體積的水稀釋，經 由一 〇.2μ濾網過濾，然後在利用銅螯合物層析術加工前， 在4°C下儲存數天。 此吸附溶液具有以下之特性：PH5.6，電導度約43mS/ cm (主要爲MgS〇4所致），聚乙二醇濃度6毫克/毫升，IFN-B/D濃度約0.1-0.5毫克/毫升，IFN-B/D純度約30%之總蛋白 質含量。 銅螯合物層析術係在室溫下，使用一充塡100毫升螯合 之西法露快流（Chelating-Sepharose Fast Flow)® ( Pharmacia 公司， Uppsala)之管柱（直徑44毫米）實施。將靜止撐體連續用下 列溶液淸洗：5倍床體積之2〇%乙醇、5倍床體積之去離子 水、5倍床體積之0.〇5MEDTA及0.5MNaCl、5倍床體積之0.25 MNaOH及lMNaCl、7倍床體積之去離子水、5倍床體積之 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210Χ297公麓〉 I i 裝— I I I I I 訂—— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -13- ^ 442492 A7 B7 五、發明説明（） 0.1%甲酸及7倍床體積之去離子水，流率爲每小時12倍床體 積。然後將靜止撐體充滿銅離子，加入5倍床體積之0.008M CuS(>r5H20溶液，並用大量去離子沖洗，以消除剩餘之未結 合之銅。在吸附步驟前，將管柱用5〇〇毫升緩衝溶液使之平 衡，該緩衝溶液係由〇.68MMgS04& 0.092M醋酸鈉（pH用醋 酸調成5.6)組成，具有大約與吸附溶液相同之電導度，即 43mS/cm。然後將一體積爲5000毫升之IFN-B/D吸附溶液以300 毫升/小時之流率加入管柱中。流出液係利用一設定在28〇 塵米波長之紫外光監測器監控= 裝塡後，在500毫升/小時之流率下連續進行三次淸 洗：第一次用500毫升之已在吸附前使用過之平衡緩衝液(PH 5.6)，第二次用500毫升去離子水及第三次用500毫升之含02 M NH4CI 及 1 M NaCl 之 0.025 M TRIS-HC1 緩衝液(pH 7.6)。然後將 IFN-B/D再度簡單地使用400毫升去離子水，在500毫升/小 時之流率下析出"將利用紫外光監測器監控之三次淸洗液 及水析出液收集。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ---.- — - - 1^1 111 m - - 1^1 In _ In ιϊ·^f (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 吸附溶液、三次淸洗液及水析出液中之IFN-B/D濃度係 利用反相高效液相層析術(HPLC)分析測量（管柱：VydaeO 18, 30塵米，粒子大小5ιη;移動相A: 0.1%三氟乙酸水溶 液，移動相B: 80%乙腈、19.91%水及0.09%三氟乙酸；流率1 毫升/分；注射體積〇.〇5毫升；在216塵米下實施紫外光檢 測）。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐} -14- 442492 經濟部中央橾準局貝工消費合作社印製 A7 B7__ 五、發明説明（） 在三個淸洗液中發現之IFN-B/D量可忽略不計。出乎意 料地，發現水析出液中含回收產率約70%之IFN-B/D，且具有 高純度：大約90%之總蛋白質含量（即IFN-B/D加濃3倍）。 這種水溶析是特別驚人的，因爲在第二個淸洗液中未 發現IFN-B/D (回收產率小於5%)，其完全由相同液體（即 純水）組成。 在低鹽濃度及大約8之pH値下有特別高IFN-B/D濃度 (大約1毫克/毫升）之水析出液在4°C下儲存時是安定 的；經過數天未發生IFN-B/D沉澱。 實施例2 :利用水溶析得到之各個IFN-B/D溶液之特性 IFN-B/D水溶液係利用類似於實施例1中描述之水溶析得 到，但改變溶析所用之水體積及/或恰在水溶析前之淸洗 步驟所用之緩衝液之組成。 第一個IFN-B/D溶液係使用與實施例1相同之淸洗緩衝液 (含 0.2 M NH4C1 及 1 M NaCl 之 0.025 M TRIS-HC1 緩衝液（pH 7.6))，且僅使用大約0.67倍床體積之去離子水溶析獲得。 第二個IFN-B/D溶液係使用含0.2 MNH4CI之0.025 Μ磷酸鉀 緩衝液(pH 7.6)爲淸洗緩衝液及1.5倍床體積之去離子水爲溶 析液獲得。 第三個IFN-B/D溶液係使用0.025 M TRIS-HC丨緩衝液(pH 7.6) (不含NH4CI及NaCl)爲淸洗緩衝液及4倍床體積之去離子水 爲溶析液獲得。三個IFN-B/D溶液之特性列於表1中。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4現格（210X297公釐} nn l —It Mrnf ^^^1 n If ^ (請先M讀背面之注意事項再填寫本頁) -15- 442492 A7 B7 經濟部中央樣準局員工消費合作社印製 五、發明説明（） 表1 :利用水溶析得到之各個IFN-B/D溶液之特性 麵之淸_衝液 IFN-B/D 濃度 (毫克/毫升） pH 電導度 (mS/cm) 0.025 M TRIS-HC1 pH 7.6 + 0.2 M NH4C1 + l.OMNaCl 7.0 8.8 11.3 0.025 M磷酸鉀 pH b + 0.2 M NH4CI 2.5 7.6 7.4 0.025 M TRIS-HC1 pH 7.6 1.5 8.2 0.4 第一個溶液有特別高的干擾素濃度（7毫克/毫升）， 且發現在4°C下儲存時驚異地安定；經過一夜未發生IFN-B/D 沉澱。比較上，純IFN-B/D在(UM磷酸鉀緩衝液(pH7.6)中或 在0.1 Μ碳酸氫鈉緩衝液(pH 8.0)中之溶解度低於0.5毫克/毫 升。 第二及第三個溶液在4°c下儲存數天。1週後，利用反 相高效液相層析術分析測量（如實施例1中所述），發現這 兩個溶液中之干擾素濃度未改變。在第三個溶液之情況， 此安定性特別驚人，其在高至1.5毫克/毫升之干擾素濃度 下，有非常低的鹽濃度（電導度<〇.5mS/cm)。 實施例3 : IFN-B/D溶析之回收產率之估計 實驗係在室溫下，使用一 FPLC®層析術系統（Phannacia 公司，Uppsala)及一充塡5毫升螯合之西法露快流(〇^对^-Sepharose Fast Flow)® ( Pharmacia 公司，Uppsala)之玻璃管柱（直 徑10毫米）實施。所有泵經管柱之溶液之流率設定在60毫 升/小時。流出液係利用一波長設定在280塵米之紫外光監 測器監控。靜止撐體之再生及製備係如實施例1中所述實 施，連續將以下之溶液泵經管柱：25毫升之0.05MEDTA及 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS) A4規格（210X297公嫠〉 ^^1- m ^^^1 ^^^1 ^^^1 ^^^1 —^^1 mV nn mV n tetMMt ^ J (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -]6- ;442492 Α7 Β7_____ 五、發明説明（） 0.5 M NaCl、25 毫升之 0.25 M NaOH 及 1 M NaCl、35 毫升去離子 水、25毫升之0.1%甲酸、35毫升去離子水、25毫升之〇⑽8M CuS04x5H20及40毫升去離子水。 在第一個實驗中，將大約80毫升之純IFN-B/D(純度： 99.9%之蛋白質含量；濃度：大約0.3毫克/毫升）溶於0.2M 甘露糖醇及0.03M磷酸鈉(PH7.6)之溶液載入管柱中。用35毫 升之0.3M氯化銨緩衝液(pH7.6)淸洗後，使用35毫升去離子 水析出干擾素。然後，將一 35毫升體積之含2M氯化銨之 0.025MTRIS-HC1緩衝液(PH7.6)泵經管柱，以確定所有仍結合 在靜止撐體上之干擾素之溶析<收集液之干擾素濃度係利 用反相高效液相層析術分析測量，如實施例t中所述。得到 之相當回收產率列於表2中。 重覆相同實驗，但使用0.1M硼酸鉀(pH7.6)爲淸洗緩衝 液取代0.3 Μ氯化銨(pH7.6)。結果亦列於表2中。 表2: IFN-B/D溶析之回收產率 使用之淸洗 緩讎 用淸雛酿 析出之％ 用氏〇 析出之％ 用 2 M NH4CI 析出之〇/〇 0.3 Μ ΝΗ,ΟΙ pH 7.6 0 92 8 o.l Μ硼酸押pH 7.6 0 9 | 91 經濟部中央標準爲貝工消費合作社印製
In'— ^^—^1 ^^^1 HI ·^低^~4— tn ,~aJ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 如表2中所示，恰在溶析前之淸洗步驟使用之緩衝液之 組成大大地影響用水之溶析。 實施例4 :淸洗步驟之影馨 進行數次與實施例3中相同之實驗，僅改變淸洗緩衝液 之組成。各個測試之淸洗緩衝液及得到之相當之回收產率 列於表3中。 本紙張尺度適用中國國家標率（CNS ) A4規格（2丨0 X 297公痠） -17- 442492 A7 B7 五、發明説明（） 表3: IFN-B/D溶析之回收產率 使用之淸洗 用淸洗緩衝液 用h2o 用2 Μ卿(：1 緩衝液 析出之％ 析出之％ 析出之％ 0.1 Μ mmm pH 7.6 0 9 91 0.1 Μ 硼麵 pH 8.5 0 35 65 0.1 M ISM pH 9.5 0 66 34 0.3 Μ ㈣ pH 7.6 0 26 74 0.3 Μ 醋藤 pH 7.6 0 85 15 0.2 Μ N(CH3)4C1 pH 7.6 0 12 88 0.2 Μ 三乙醇胺 pH 7.6 0 68 32 0.2 Μ 二乙醇胺 pH 7.6 0 70 30 0.2 Μ 乙醇胺 pH 7.6 0 82 18 0.3 Μ nh4ci pH 7.6 0 92 8 0.001 Μ臓酸 pH 7.6 0 ΊΊ 23 0.5 Μ ΝΗ4〇 pH 7.6 19 72 9 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中决榇準局員工消费合作社印策 如表3中所示，用水溶析得到好的產率（高於60%)， 若淸洗緩衝液之pH値在鹼性範圍內（例如用0.1M硼酸鉀(pH 9.5))，或若淸洗緩衝液含一接近中性pH値之胺或銨鹽（例 如用〇·3Μ醋酸銨(PH7.6)，而不是用0.5M醋酸鉀(pH7.6))。 在此情況，胺可爲第一胺（例如乙醇胺）、第二胺（例如 二乙醇胺）或第三胺（例如三乙醇胺），但不能爲第四胺 (例如氯化四甲敍）。淸洗緩衝液之最佳濃度大大地視使 用之胺而定：例如在胱胺酸(pH 7.6)之情況約1 mM，或在 NH4CI (pH 7·6)之情況爲 300^500 mM。 實施例5 :路易士鹼處理後之第二淸洗步驟之影響 重覆實施例3中描述之相同實驗，但在用35毫升之0.3M 氯化銨緩衝液(pH7.6)進行之第一淸洗步驟與用水溶析間插 丁 本紙張尺度適用中國國家標隼（CNS ) Μ規格（210_乂297公釐） -18- 442492 A7 B7 五、發明説明（） 入用35毫升之0.1M硼酸鉀(pH7.6)進行之第二步驟。發現之 回收產率爲： 在第一次淸洗液中 (0.3 M NH4C1 pH 7.6): 0% 在第二次淸洗液中 (0.1 Μ 硼酸鉀 pH 7.6): 0% 在第一次析出液中 (水） 22% 在第二次析出液中 (2M NH4C1 + 0.025M TRIS-HC1 pH 7.6): 78% 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 在水析出液中發現少量的IFN-B/D。但儘管在第一次淸 洗步驟中存在銨離子，得到之回收產率仍低（大約22%)， 表示恰在溶析前之淸洗步驟有較高影響。 實施例6 :無淸洗步驟之IFN-B/D溶析之回收產率 重覆實施例3中描述之相同實驗，但在吸附歩驟與用水 之溶析步驟間無淸洗步驟。 第一次實驗係完全使用實施例3中提到之相同之載入溶 液（0.3毫克/毫升IFN-B/D在0.2M甘露糖醇及0.03^I磷酸鈉 (pH7.6)中）進行。然後第二次實驗亦用相同之載入溶液進 行，但額外含濃度爲0.3摩爾/升之氯化銨。得到之相當之 回收產率列於表4中。 表4: IFN-B/D溶析之回收產率（無淸洗步驟情況） 載入緩衝液 用邮 析出之％ 用 2 M NH4C1 析出之％ 〇·〇3 M 碟_ pH 7·6 + 0·2 M 甘露糖醇 37 63 0.03 Μ pH 7.6 + 0.2 Μ 甘露糖醇 + 0.3MNH4C1 95 5 如表4中所示，恰在溶析前之載入緩衝液之組成大大地 影響用水之溶析。 本紙浪尺度適用中國國家標隼（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） Γ- -1 ti —^ϋ mi f a^n— eJ (請先閱讀背而之注意事項再填寫本頁) -19^ 1 442492 Μ Β7 五、發明説明（） 實施例7 :鹽析效應之影響 部份純IFN-B/D (純度：大約90%之蛋白質含量）之水溶 液係利用類似於實施例1中描述之方法，用水溶析獲得。將 此溶液部份冷凍，在大約-5至-10°C下儲存，並在使用前解 凍。 I -=: - J l^ii ^^^1 -I n I- I - ti ft— ^^^1^iJ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 此儲液之組成爲 • IFN-B/D: 0.5-1毫克/毫升 TRIS-HC1: 大約0.02 Μ NaCl: 大約0.01 Μ 醋酸鈉： 大約0.01 Μ NH4C1: 大約0.002 Μ Cu2+: 大約ΙμΜ pH： 8 電導度： 2.2 mS/cm 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 進行數次與實施例3中相同之實驗，載入50毫升之此儲 液，並僅改變淸洗緩衝液之組成。各個測試之淸洗緩衝液 及得到之相當之回收產率列於表5中。 表5: IFN-B/D溶析之回收產率 使用之淸洗 緩衝液 用淸洗緩衝液 析出之％ 用h2o 析出之％ 用2 Μ戰<：1 析出之％ 0.025 M NH4SCN pH 7.6 0 84 16 0.1 Μ nh4scn pH 7.6 0 96 4 0.2 Μ NH4SCN pH 7.6 50 50 0 0.3 Μ NH4SCN pH 7.6 98 2 0 0.4 Μ NH4SCN pH 7.6 100 0 0 0.5 Μ nh4scn pH 7.6 100 0 0 0.025 Μ NH4C1 pH 7.6 2 97 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公嫠） -20- 442492 Λ7 B7 五、發明説明（） 0.1 Μ NH4CI pH 7.6 丨 0 100 0 0.2 Μ NH4C1 pH 7.6； 0 100 0 0.3 Μ NH4CI pH7.6| 0 96 4 0.5 Μ NH4CI pH 7.6： 8 91 1 0.8 Μ NH4CI pH 7.6： 19 81 0 0.025 Μ醋酸敍 ρΗ7.ό| 0 89 11 0.1 Μ 醋酸銨 pH 7.6| 0 97 3 0.5 Μ 醋難 pH7.6| 0 98 2 0.8 Μ 醋酸銨 pH 7.6； 0 ioo 0 0.025 Μ (NH4)2S04 pH 7.6; 0 80 20 0.1 Μ (NH4)2S04 pH 7.6| 0 98 2 0.2 Μ (NH^SCU pH 7.61 0 96 4 0.3 Μ 卿以04 pH 7.61 0 100 0 0.5 Μ (NH4>2S〇4 pH 7.6 j 0 97 3 (請先W讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作杜印製 所有測試之淸洗緩衝液爲PH7.6之銨鹽。用作相對離子 之陰離子係依照順序排在表5中，這些結果顯示破壞水結構 之趨勢（紊向效應），並造成疏水性交互作用強度之相對 降低（相對增加疏水性交互作用（鹽析效應）特別有效 者）： 漸增之鹽析效應：SCN^Cl cO^COCnO广 如表5中所示： 一在NI^SCN之情況（低鹽析效應），若銨離子濃度太高(2 0-3M”則IFN-B/D直接用淸洗緩衝液析出。當NFUSCN之 濃度S0.1M時，水溶析得到高產率(>90%)。 —在NH4C1之情況，當NH4C1之濃度S0.5M時，水溶析得到 高產率。 一在醋酸銨之情況，可使用高至0.8M之濃度，且水溶析 可得到局產率。 丁 本紙張尺度適用中國國家標羋（CNS)A4规格（210X297公釐） -21 - 442492 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（） 一在(NH4)2S04之情況（高鹽析效應），可使用高至1.0M之 銨離子濃度，且水溶析可得到高產率。 實施例8: pH及濃度之影響 重覆與實施例7相同之實驗，而改變淸洗緩衝液之組 成a各個測試之淸洗緩衝液及得到之相當之回收產率列於 表6中。 表6: IFN-B/D溶析之回收產率 使用之淸洗 緩衝液 用淸洗緩衝液 析出之％ 用托〇 析出之％ 用 2 M NH4C1 析出之％ 0.025 Μ 醋_ pH 5.6 0 5 95 0.1 Μ 醋_ pH 5.6 0 9 91 0.25 Μ 醋_ pH 5.6 0 6 94 0.5 Μ 醋酸 pH 5.6 0 3 | 97 0.025 M TRIS-HC1 pH 5.6 0 21 79 0.1 Μ TRIS-HC1 pH 5.6 0 21 79 0.3 Μ TRIS-HC1 pH 5.6 0 22 78 0.5 Μ TR1S-HC1 pH 5.6 0 17 83 0.025 Μ TRIS-HC1 pH 7.6 0 62 | 38 0.1 Μ TRIS-HC1 pH 7.6 0 89 11 0.3 Μ TRIS-HC1 pH 7.6 1 89 | 10 0.5 Μ TRIS-HC1 pH 7.6 26 71 3 0.025 Μ TRIS-HC1 pH 7.6 0 98 I 2 + 1.7MNaCI 0.1 Μ TRIS-HC1 pH 7.6 0 98 2 + 1.7MNaCl 0.2 Μ TRIS-HC1 pH 7.6 10 89 ! 1 + 1.7MNaCl 如表6中所示： 本紙張尺度適用中國國家標苹（CNS ) Λ4规格（210X297公釐） ^^^1 —Bn· —^ϋ 111 i —-H n^i· In·! nn I 、 穿 i (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 442492 Α7 Β7 五、發明説明（） 一在醋酸鉀(pH 5.6)之情況（低pH値；不含胺）及在TR]S· HCi(pH5.6)之情況（低pH値：有胺存在），水溶析得到 之回收產率非常低。 —在TRIS-HC1 (pH 7.6)之情況（接近中性之pH値；有胺存 在），水溶析得到之回收產率佳（高於60%)。若胺濃 度太高(>〇.3M)’則直接用淸洗緩衝液產生IFN_B/D部份 溶析。若胺濃度太低(<0.1 M)，則水溶析無法定量，且 剩餘量之 IFN-B/D 其後可使用 2 M NH4C1 + 0.025 M TRIS-HC1 緩衝液(ρΗ7.6)析出。這最後一個問題可利用NaC丨（濃度 爲1.7M)之加入而避免，NaCi將阻止靜止撐體與干擾素 蛋白質間之離子交互作用。 實施例9 :用梯度之溶析 進行與實施例7相同之實驗，使用0.1M TRIS-HC1 (pH 7.6) 爲淸洗緩衝液。水溶析得到之回收產率爲89%。IFN-B/D(11%) 之剩餘量隨後用2M NH4C1 + 0.025 M TRIS-HC1緩衝液(pH 7.6)析 出。 經濟部中央標準局貞工消費合作社印裝 ---------裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 用相同之淸洗緩衝液（20毫升之0.1M TRIS-HC1 (pH 7.6)) 重覆此實驗，但在此淸洗步驟後，進行Π倍床體積（60毫 升）之從100%淸洗緩衝液至100%去離子水之線性梯度溶 析。將管柱另外用55毫升水沖洗，然後使用7倍床體積（35 毫升）之從 100% 水至 100% 之 2M NH4C1 + 0.025 M TRIS-HC1 緩衝 液(ρΗ7.6)之第二個線性梯度溶析。最後將管柱用15毫升之 此最後緩衝液沖洗。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS } Λ4規格（210Χ29?公轉：} -23- 442492 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Α7 Β7 五、發明説明（） IFN-B/D被發現在第一個梯度末端，在大約10至5ιηΜ TRIS-HCl(pH7.6)之相當濃度下析出，且回收產率爲60%。IFN-B/D (40%)之剩餘量在第二個梯度中段，在大約1M NH4C1 + 12.5 mM TRIS-HC1 (pH 7.6)之相當濃度下析出。 實施例10:溶析溶液之組成 重覆與實施例7相同之實驗，仍使用0.1M TRIS-HC1 (pH 7-6)之溶液爲淸洗緩衝液，但改變第一個溶析溶液之組成， 即水溶析之組成。各個測試之溶析溶液及得到之相當之回 收產率列於表7中。 表7: IFN-B/D溶析之回收產率 溶析溶液 電導度 (mS/cm) 用淸洗緩衝 液析出之％ 用溶析溶液 析出之％ 用 2MNH4C1 析出之％ 去離子水 0.0012 0 89 11 0.001 MNaCl 0,17 0 45 55 0.003 M NaCl 0.36 0 18 82 0.005 M NaCl 0.59 0 2 98 0.001 Μ MES <0.03 0 59 41 0.010 Μ MES <0.03 0 0 100 0.002 Μ甘露糖醇 <0.03 0 87 13 0.010 Μ甘露糖醇 <0.03 0 77 23 0.5 Μ甘露糖醇 <0.03 0 90 10 2.7 Μ甘油 <0.03 0 65 35 如表7中所示： 水中殘留之鹽濃度必須極低(<0.001Μ)，以得到回收產率 高於50%之IFN-B/D溶析。 未帶電荷之溶質如甘露糖醇或甘油可存在溶析溶液 中，甚至在高濃度下（在1Μ之範圍內），但兩性離子 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） tut I ——^κ I Mu ml m HI \ 1· 淨-=5 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -24- 442492 A7 B7 經濟部中央標準扃貝工消費合作社印聚 五、發明説明（ ’ _2___軸）之濃度必須低 於0·001Μ’以得到良好的回收產率。 -溶析賴Μ導度不可腳_依據，以翻刪柳 溶析發生或不發生。
實施例 11 · jp^_D 實驗係用人類干擾素_αΒ(_)或用人類干擾素⑽ (1胸），浦施例3中描述之人類雜交干擾素·aBiD她㈣_ B/D)之方法實施，但使用僅充塡Q5毫升螯合之西法露快流 (Chelating-Sepharose Fast Flow)® ( Pharmacia 公司，Uppsaia)之較小 玻璃管柱（直徑5毫米）。泵經管柱之相當之流率及相當之 溶液體積縮小10倍a IFN-B及IFN-D (專利案EP-A-205404中描述之IFN-B/D之母 分子）係利用在酵母菌（啤酒酵母菌）中基因重組之DNA 表現，發酵’回收及部份純化而產生。 在 0_025 M TRIS-HC1 緩衝液(pH 7.6)中得到一 IFN-B 儲液， 其具有一〇.〇5毫克/毫升之干擾素濃度及與實施例7中描述 之IFN-B/D儲液大約相同之純度。
得到一 IFN-D儲液，其具有與實施例1中描述之IFN_B/D 吸附溶液相同之組成及大約相同之純度。 如實施例3中所述，載入管柱之干擾素係連續用一適當 緩衝液淸洗，用去離子水溶析及用含2M氯化銨之0.025 M TRIS-HC1緩衝液(pH7.6)溶析。收集液之干擾素濃度係利用反 相高效液相層析術分析測量，如實施例1中所述，且利用牛 細胞（Madin-Darby牛細胞）上對體外疱狀口炎病毒之生物抗 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（2丨0X297公釐） I - i I i n ^^^1 ^^^1 . —m I -I HI— K) I --SJ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -25- 442492 Λ7 B7 五、發明説明（） 病毒活性分析確定。各個測試之淸洗緩衝液及得到之相當 之回收產率列於表8中。 表8:丨FN-B或〗FN-D溶析之回收產率 IFN 使用之淸難衝液 用淸洗緩衝 液析出之％ 用112〇析 出之％ 用 2MNH4CI 析出之％ IFN-BjO.lM TRIS-HC1 pH 7.6 0 53 47 ” ;0.3M TRIS-HC1 pH 7.6 39 61 0 "；0.3Μ 〇NfH4)2S〇4 pH 7.6 Ϊ8 82 0 〇·3 M 醋麟 pH 7.6 2 -------------------- 98 0 IFN-D|0.01M TRIS-HC1 pH 7.6 0 91 9 如表8中所示，IFN-B及IFN-D可用水析出。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 實施例12: 〇·殺粉酶及胰蛋白酶 實驗係用各種蛋白質實施，如實施例3中描述之IFN-B/D，使用相同之FPLC®層析術系統、相同量（5毫升）之螯 合之西法露快流(Chelating-Sepharose Fast Flow)®及相同之層析術 條件實施。 測試之蛋白質爲：得自桿菌屬之％澱粉酶（Sigma產品 N1380)、得自牛胰朦之胰蛋白酶（Serva產品N°37260)。各 實驗係利用裝入大約50毫升相當之蛋白質溶液（濃度〇.5毫 克/毫升）之方法，在0.01MTRIS-HC1緩衝液(pH7.6)中（若 使用TRIS-HC1爲以下之淸洗緩衝液），或在0.01M硼酸鉀緩 衝液(pH7·6)中（若使用硼酸鉀爲以下之淸洗緩衝液或取消 淸洗步驟）進行。 如實施例3中所述，載入管柱之蛋白質係連續用一緩衝 液（TRIS-HC1或硼酸鉀）淸洗，用去離子水溶析及用含2M 氯化銨之0.025\11^5_1«：1緩衝液印117.6)溶析。收集液之蛋白 H H I ^^1 —II- . ϋ^ρ ^^1 ^^1 ii‘·^ei (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4规格（210X297公嫠） -26- 442492 A7 B7 五、發明説明（） 質濃度係利用Bio-Rad蛋由質分析法（Bio-Rad產品N° 500-0006,微量分析法）測量。測試之蛋白質及淸洗緩衝液，以 及得到之相當之回收產率，列於表9中。 表9:各個蛋白質溶析之回收產率 蛋白質 使用之淸洗緩衝液 用淸洗緩衝 液析出之％ 用乐〇析 出之％ 用 2M NH4C1 析出之％ 0.010 M TRIS-HC1 pH 7.6 —0 _71 9 rt 0.025 M TR1S-HC1 pH 7.6 ——0…. 97 3 ” 0.050 M TRIS-HC1 pH 7.6 0 97 …―………3…………一.. " 0.100M TRIS-HC1 pH 7.6 5 89 6 0.300 M TRIS-HC1 pH 7.6 100 0 0 " ............................. 0.100 M 硼隨 pH 7.6 —.〇— 15 85 "|〇, 100 Μ 硼酸鉀 pH 9.5 0 ................... 100 〇 無淸洗緩衝液 一 22 78 胰蛋白酶 0.025 M TRIS-HCl pH 7.6 0 43 57 如表9中所示： (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 袈_ 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 一 α-殿粉酶（得自桿菌屬）可用水析出（回收產率：大約 90-100%)，若淸洗緩衝液之pH値在鹼性範圍內（例如 用0.1M硼酸鉀(pH9.5))，或淸洗緩衝液含一接近中性pH 値及適當濃度之胺（例如用0.025 Μ至0.1 M TRIS-HC1 (pH 7.6))。 一胰蛋白酶（得自牛胰臟）亦可用水析出（回收產率高 於40% )，例如使用0.025 M TRIS-HC1 (pH 7.6)爲淸洗緩衝液。 實施例13 :層析介質 進行兩次與實施例7相同之實驗，仍使用0.1MTRIS-HC1 (pH7.6)爲淸洗緩衝液，但改變層析介質。 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X297公釐） -27- 442492 A 7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（） 第一個實驗使用之介質爲螯合之西法露快流(Chelating-Sepharose Fast Flow)® ( Pharmacia 公司，Uppsala )，如在實施例 1 至12中所用者。粒徑爲0.045-0.165毫米。螯合之西法露快流 (Chelating-Sepharose Fast Flow)包含間隔基上之亞胺二乙酸基， 係利用安定之醚連接鍵耦合至西法露快流（Sepharose Fast Flow)® ： [西法露快流(Sepharose Fast F!ow)]-0-CH2-CHOH-CH2-〇-CH2-CHOH-CH2-N-(CH2COOH)2 基質-西法露快流(SepharoseFastFlow)-爲交聯之瓊脂糖。 第二個實驗使用之介質爲TSK Toyopearl® AF-Chelate-650 Μ (Tosohaas 公司，Stuttgart)。粒徑爲大約 0.065 毫米。TSK Toyopeari®爲一親水性半硬凝膠、一寡乙二醇、甲基丙烯酸 縮水甘油酯及二甲基丙烯酸異戊四酯之共聚物。配位子由 固著之亞胺二乙酸基組成。 每一個實驗之玻璃管柱（直徑10毫米）充塡5毫升各自 之凝膠。整合之西法露快流(Chelating-Sepharose Fast Flow)®介質 及TSK Toyopearl AF-Chelate-650 Μ®介質使用相同之再生及製備 方法（載入銅離子），如實施例3中所述。使用之IFN-B/D之 吸附溶液爲實施例7中描述之儲液。得到之相當之回收產率 列於表10中。在兩情況中，用水溶析得到高回收產率。 (請先W讀背面之注項再填寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4规格（210 X 297公釐） 4424 9 2 at B7 五、發明説明（） 表10:各個層析介質之IFN七/D溶析之回收產率（淸洗緩衝 液爲 0.1 M TR1S-HC1 (pH 7.6)) 層析介質 凝膠之基質 用淸洗緩衝 液析出之％ 用呔〇析 出之％ 用 2M NH4CI 析出之％ 螯合之西法露 快流(Chelating-Sepharose Fast Flow)® 瓊脂糖 0 89 11 TSK Toyopearl AF-Chelate-650 "乙稀基聚 合物，型 0 100 0 微生物之寄存 以下之微生物菌株係寄存在德國菌體收集中心(DSM)， 地址：德國，D-38142布朗席維格，馬歇歐得路1B(登錄號 及寄存日期如下）： 啤酒酵母菌 HT 393 DSM 9697 27.01.1995 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝 丁 *-° .¾. 經濟部中央標準局員工消費合作社印m 本紙張尺度適用中國國家標準（<^^)/\4規格（2丨0><297公婕） -29-