ES2225847T3

ES2225847T3 - Resinas cromatograficas y metodos para usar las mismas.

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Publication number: ES2225847T3
Application number: ES95933659T
Authority: ES
Inventors: Simon C. Burton; Neill Ward Haggarty; David R. K. Harding; Nathaniel Todd Becker; Ben A. Bulthuis; Landon M. Steele
Original assignee: Massey University
Current assignee: Massey University
Priority date: 1994-09-23
Filing date: 1995-09-20
Publication date: 2005-03-16
Anticipated expiration: 2015-09-20
Also published as: US5652348A; JP4127568B2; WO1996009116A1; EP0783366B1; DE69533402D1; MX9701868A; US5945520A; ATE273749T1; DK0783366T3; AU683588B2; CA2200735A1; JP2008156617A; CA2200735C; EP0783366A1; AU3621295A; DE69533402T2; NZ293707A; JPH10506987A; PT783366E

Abstract

SE PRESENTAN UNAS RESINAS EN FORMA MEZCLADA DISEÑADAS RACIONALMENTE QUE SON UTILES EN LA RECUPERACION DE UN COMPUESTO OBJETIVO A PARTIR DE UNA SOLUCION ACUOSA Y UNOS METODOS DE UTILIZACION DE ESTAS RESINAS. ESTAS RESINAS DESCRITAS TIENEN UN CARACTER HIDROFOBAS EN EL PH DE LIGAMENTO DEL COMPUESTO OBJETIVO Y UN CARACTER HIDROFILICO Y/O ELECTROSTATICO EN EL PH DE DESORCION DEL COMPUESTO OBJETIVO A PARTIR DE LA RESINA Y ESTAN DISEÑADAS ESPECIFICAMENTE PARA LIGAR EL COMPUESTO OBJETIVO DESDE UNA SOLUCION ACUOSA EN UNA RESISTENCIA IONICA ALTA Y BAJA.

Description

Resinas cromatográficas y métodos para usar las mismas.

Fundamento de la invención Campo de la invención

Esta invención se refiere a resinas de modo mixto, diseñadas racionalmente, que son útiles para recuperar un compuesto considerado objetivo desde una solución acuosa, y a métodos para usar tales resinas. Las resinas descritas en esta memoria poseen un carácter hidrófobo en el pH de fijación del compuesto considerado objetivo y un carácter hidrófilo y/o electrostático en el pH de desorción desde la resina del compuesto considerado objetivo y están especialmente diseñadas para fijar el compuesto considerado objetivo desde una solución acuosa tanto en fuerza iónica baja como en fuerza iónica alta.

Referencias bibliográficas

Se alude en la memoria descriptiva a las referencias bibliográficas que siguen como números entre corchetes [ ]:

1 Ochoa, J.L., "Hydrophobic (interaction) chromatography", Biochimie, 60:1-15 (1978).

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3 Yon, .R.J., "Chromatography of Lipophilic Proteins on Adsorbents Containing Mixed Hydrophobic and Ionic Groups", Biochem J., 126:765-767 (1972).

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11 McLaughlin, "Mixed-Mode Chromatography of Nucleic Acids", Chem. Rev., 89:309-319 (1989).

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13 Champluvier, B., et al., "Dye-Ligand Membranes as Selective Adsorbents for Rapid Purification of Enzymes: A Case Study", Biotechnol. Bioeng., 40:33-40 (1992).

14 Butler, L.G., "Enzyme Immobilization by Adsortion on Hydrophobic Derivatives of Cellulose and Other Hydrophilic Materials", Arch. Biochem. Biophys., 171: 645-650 (1975).

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18 Hutchinson, D.W., "The Preparation and Properties of Immobiilizad Dipeptidyl-aminopeptidase I (cathepsin C)" Biochim. Biophys. Acta, 916:1-4 (1987).

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23 Ortin, A., et al., "Large Scale Extraction of a \alpha-Lactalbumin and \beta-Lactoglobulin from Bovine Whey by Precipitation with Polyethylene Glycol and Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems". Perp. Biochem., 22:53-66 (1992).

24 Heath, C.A., et al., "Synthetic Membranes in Biotechnology: Realities and Possibilities"., Adv. Biochem. EngJ Biotechnol., 47-45-88 (1992).

25 Luong, J.H.T., et al., "Synthesis and Characterization of a WaterSoluble Affinity Polymer for Trypsin Puirification", Biotechnol. Bioeng., 31:439-446 (1988).

Estado de la técnica

En los últimos años, han sido desarrolladas y/u optimizadas diversas técnicas para llevar a cabo la separación y purificación de compuestos considerados objetivo a partir de una mezcla acuosa. Las técnicas de separación y purificación empleadas hasta la fecha con tales compuestos incluyen, a título de ejemplo, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) [1], cromatografía de afinidad, y semejantes. La multiplicidad de tales técnicas cromatográficas pone de manifiesto la dificultad de llevar a cabo la separación y/o purificación de los compuestos considerados objetivo al tiempo que minimizar la complejidad del procedimiento operatorio de separación/purificación, y cada una de las técnicas citadas adolece de uno o más inconvenientes que limitan su uso amplio a escala industrial.

Resinas cromatográficas de modo mixto han sido empleadas también en la técnica, en donde tales resinas llevan a efecto la fijación de un compuesto considerado objetivo, en condiciones hidrófobas, y efectúan la desorción del compuesto considerado objetivo desde la resina en condiciones electrostáticas (iónicas) o hidrófilas. Ejemplos de tales resinas de modo mixto se encuentran en las publicaciones de Kasche et al., [7], Bischoff, et al., [6], McLaughlin [11] y Bischoff, et al. [12].

Un problema típico de las resinas cromatográficas de modo mixto, de la técnica anterior, es que la eficacia de fijación a la resina de compuestos considerados objetivo, menos hidrófobos, no es muy alta a menos que se emplee una elevada concentración de sal en la solución del compuesto considerado objetivo. Por ejemplo, en el trabajo de Kasche et al., [7], la fijación de proteínas a la resina a nivel preparativo, se llevó a cabo usando una solución de NaCl 1 M. Las técnicas cromatográficas que llevan consigo la adición de sal a una solución acuosa que contiene el compuesto considerado objetivo, requieren el uso de grandes cantidades de reactivos para llevar a efecto la recuperación a escala industrial y pueden necesitar un procesamiento sustancial. Por consiguiente, las resinas cromatográficas que requieren el uso de altas concentraciones salinas no constituyen los métodos más eficaces y más efectivos para recuperar y/o purificar cantidades industriales de tales compuestos.

El documento EP-A-0 172 579 describe un material silícico modificado que comprende sílice enlazada covalentemente a un polímero sintético, cuyo polímero sintético está producido a partir de (a) un compuesto polimerizable capaz de copularse covalentemente, directamente, a dicha sílice, y (b) uno o más compuestos polimerizables que contienen (i) un grupo químico ionizable, (ii) un grupo químico capaz de transformación en un grupo químico ionizable, (iii) Un grupo químico capaz de causar la copulación covalente del compuesto (b) a un ligando de afinidad o una molécula biológicamente activa, o (iv) un compuesto hidrófobo.

El documento EP-A-0 180 563 describe un gel anfótero caracterizado porque un grupo hidrófobo está copulado a un gel hidrófilo a través de un puente que comprende tio-éter-azufre. El gel puede ser un polisacárido reticulado, un derivado de un poliácido acrílico o una sustancia inorgánica, tal como gel de sílice o vidrio o uno de sus derivados, y el grupo hidrófobo puede comprender, además del tio-éter-azufre, alquilo, alquenilo, cicloalquenilo, alcarilo, aralquilo, heteroarilo, alqheteroarilo y sin sustituir o sustituidos con sustituyentes eléctricamente neutros.

Esta invención está dirigida, en parte, al descubrimiento de que el uso de una alta densidad de ligandos en una resina cromatográfica de modo mixto asociado con el uso de un ligando ionizable específico que comprende una funcionalidad ionizable y un brazo espaciador que enlaza covalentemente el ligando a la matriz sólida de soporte de la resina, puede proporcionar suficiente carácter hidrófobo en la resina de tal modo que el compuesto considerado objetivo se une a la resina en fuerza iónica alta y baja. Esta invención está dirigida además, en parte, al descubrimiento de que la desorción desde la resina de compuestos considerados objetivo, puede conseguirse mediante interacciones hidrófilas o electrostáticas (iónicas), simplemente alterando el pH de la solución de desorción aumentando de tal modo la cantidad de carga sobre la resina por medio de la funcionalidad ionizable. Esta última característica permite obtener una ventaja importante sobre las resinas de HIC de alta densidad, proporcionando un medio fácil de conseguir la recuperación de productos al tiempo que la fijación a tales resinas de HIC puede, frecuentemente, ser irreversible.

En esta invención, el ligando ionizable está seleccionado racionalmente con relación al compuesto considerado objetivo, permitiendo con ello la recuperación y/o purificación eficientes, a gran escala, de un compuesto considerado objetivo a partir de un medio acuoso que incluye un caldo de fermentación Las resinas empleadas en esta invención están caracterizadas específicamente por comprender una matriz sólida de soporte y ligandos ionizables seleccionados o mezclas de ligandos ionizables seleccionados enlazados covalentemente a la matriz sólida de soporte en una densidad mayor que la menor de o bien al menos 150 \mumol por mililitro de resina ó 1 mmol por gramo, peso seco, de resina. Los ligandos ionizables comprenden un brazo espaciador y al menos una funcionalidad ionizable, cuya funcionalidad está unida a la matriz a través del brazo espaciador. El ligando ionizable empleado en la resina se selecciona con relación a la matriz sólida de soporte y el compuesto considerado objetivo, de tal modo que el carácter hidrófobo de la resina es suficiente para fijar por lo menos el 50% del compuesto considerado objetivo existente en un medio acuoso de fuerza iónica alta y baja, en un primer pH y se selecciona, además, con relación a la matriz sólida de soporte y el compuesto considerado objetivo, de tal modo que el carácter hidrófilo y/o electrostático (iónico) de la resina en un segundo pH es suficiente para desorber el compuesto fijado a dicho segundo pH. Adicionalmente, la funcionalidad ionizable está, en parte, cargada electrostáticamente en el pH de fijación del compuesto a la resina y está, además, o bien cargada o cargada en una polaridad diferente en el pH de desorción del compuesto desde la resina. Tales resinas cargadas parcialmente pueden proporcionar una base secundaria para mejorar o debilitar la fijación del compuesto considerado objetivo a la resina.

En una realización preferida, la carga electrostática sobre la resina en el pH en el que el compuesto considerado objetivo es sometido a desorción desde la resina, tiene la misma polaridad que la carga electrostática neta sobre el compuesto considerado objetivo en el pH de la desorción. En esta realización, la desorción se consigue mediante repulsiones carga-carga que contrarrestan el carácter hidrófobo de fijación de la resina. En otra realización, la carga electrostática sobre la resina en el pH en que el compuesto considerado objetivo es sometido a desorción desde la resina, tiene polaridad opuesta a la del compuesto considerado objetivo. En otra realización, la desorción puede ser facilitada mediante el uso de una solución de desorción (por ejemplo, eluyentes) de elevada fuerza iónica, o mediante el uso de un agente de reducción de la polaridad tal como etileno o propilenglicol.

Las resinas de esta invención en contraste con las resinas de modo mixto descritas hasta la fecha, se caracterizan porque la resina comprende una densidad de ligandos mayor que la menor de o bien por lo menos 150 \mumoles por mililitro de resina o 1 mmol por gramo de resina, peso seco, y además por el carácter de que el ligando contiene un brazo espaciador que enlaza covalentemente una funcionalidad ionizable a la matriz. Específicamente, en la bibliografía, grupos ionizables han sido deliberadamente introducidos [2, 3] para debilitar la fuerte unión a resinas de Sepharose (hidrófobas) de cadena larga de alquilo y permiten condiciones más favorables de desorción. Se ha calculado que la densidad de ligandos sobre estas matrices es, aproximadamente, de 15-21 \mumol por mililitro.

Una resina carboxilada de poliestireno (Amberlite) ha sido usada también para fijar proteínas, mediante interacciones hidrófobas [8,9] y desorción mediante interacción iónica. Sin embargo, aun cuando se emplea una alta densidad de grupos carboxilo, no hay brazo espaciador que enlace los grupos carboxilo a la matriz sólida de soporte.

También han sido descritas resinas que están cargadas positivamente con grupos isourea [4,5] que tienen una densidad que se opina que es de aproximadamente, 20 \mumoles por mililitro o menos. Estas resinas son débilmente hidrófobas y requieren, típicamente, interacciones electrostáticas e hidrófobas para la fijación del compuesto considerado objetivo a la resina.

La fijación de compuestos considerados objetivo en fuerzas iónicas alta y baja a las resinas de esta invención cuyas resinas contienen funcionalidad ionizable, esta en contraste con las resinas de la técnica anterior que poseen funcionalidad ionizable, que requieren, típicamente, ajustes en la fuerza iónica de la solución o bien antes de la fijación del compuesto considerado objetivo o bien para efectuar la desorción del compuesto considerado objetivo desde la resina. Tales ajustes no son consistentes con un proceso eficiente a escala industrial, para efectuar la recuperación y/o purificación de compuestos considerados objetivo.

Sumario de la invención

Esta invención se refiere, en parte, a resinas cromatográficas de modo mixto específicamente diseñadas, según las reivindicaciones que se acompañan, que son útiles para recuperar desde un medio acuoso un compuesto considerado objetivo, tal como una proteína o un péptido, y a métodos para usar tales resinas. Las resinas descritas en esta memoria comprenden una matriz sólida de soporte y ligandos ionizables, cuyos ligandos comprenden una funcionalidad ionizable y un brazo espaciador que enlaza covalentemente el ligando a la matriz sólida de soporte. La funcionalidad ionizable está, en parte, cargada electrostáticamente en el pH de fijación del compuesto a la resina y está cargada o se carga con una polaridad diferente en el pH de desorción del compuesto desde la resina.

Estas resinas se caracterizan particularmente por tener una densidad de ligandos ionizables sobre la resina mayor que la menor de al menos 150 \mumoles por mililitro o 1 mmol por gramo de resina, peso seco, en donde el ligando ionizable se selecciona con relación a la matriz sólida de soporte y el compuesto considerado objetivo, de tal modo que el carácter hidrófobo de la resina es suficiente para fijar al menos el 50% del compuesto considerado objetivo existente en un medio acuoso, en fuerza iónica alta y baja, en un primer pH y se selecciona, además, de tal modo que el carácter hidrófilo y/o electrostático de la resina en un segundo pH es suficiente para desorber el compuesto fijado a dicho segundo pH.

Por consiguiente, en uno de sus aspectos de composición, esta invención se refiere a una resina para fijar un compuesto que se considera objeto, que comprende;

una matriz sólida de soporte,

ligandos ionizables seleccionados o mezclas de ligandos ionizables seleccionados enlazados covalentemente a la matriz sólida de soporte, en la que el ligando ionizable comprende un brazo espaciador y por lo menos una funcionalidad ionizable cuya funcionalidad está unida a la matriz a través del brazo espaciador, en donde la densidad de ligando ionizables sobre la matriz sólida de soporte es mayor que el menor de o bien aproximadamente 150 \mumoles por mililitro o bien 1 mmol por gramo de resina, peso seco,

seleccionándose el ligando ionizable con relación a la matriz sólida de soporte y el compuesto que se considera objetivo de tal modo que el carácter hidrófobo de la resina es suficiente para fijar al menos el 50% del compuesto considerado objetivo existente en un medio acuoso de fuerza iónica alta y baja, en un primer pH y seleccionándose, además, con relación a la matriz sólida de soporte de tal modo que el carácter hidrófilo y/o electrostático de la resina en un segundo pH es suficiente para desorber el compuesto fijado a dicho segundo pH, y

o bien cargándose electrostáticamente después la funcionalidad ionizable o bien cargándose en una polaridad diferente en el pH en que el compuesto considerado objetivo es sometido a desorción desde la resina, en comparación con la carga al pH de fijación del compuesto considerado objetivo a la resina.

En una realización preferida, tales resinas comprenden opcionalmente ligandos no ionizables seleccionados enlazados covalentemente a la matriz sólida de soporte, variando el porcentaje de ligandos no ionizables, basado en el total de ligandos ionizables y no ionizables, desde aproximadamente 0 a 80%. En esta realización la cantidad de ligandos no ionizables se selecciona con relación a la cantidad de ligandos ionizables y la matriz sólida de soporte, de tal modo que el carácter hidrófobo de la resina es suficiente para fijar al menos el 50% del compuesto considerado objetivo existente en un medio acuoso, en fuerza iónica alta y baja, a un primer pH, y se selecciona además con relación a la matriz sólida de soporte de tal modo que el carácter hidrófilo y/o electrostático de la resina a un segundo pH sea suficiente para desorber el compuesto considerado objetivo, a dicho segundo pH.

En uno de sus aspectos de método, esta invención se refiere a un método para separar un compuesto considerado objetivo desde un medio acuoso que comprende el compuesto considerado objetivo, cuyo método comprende poner en contacto el medio con una resina tal como la antes descrita, en condiciones adecuadas para fijar al menos el 50% del compuesto considerado objetivo que se fija a la resina, incluyendo el ajuste del pH del medio.

Todavía en otro de sus aspectos de método, esta invención se refiere a un método para fijar y recuperar un compuesto considerado objetivo desde un medio acuoso que comprende el compuesto considerado objetivo, cuyo método comprende:

a): poner en contacto el medio con una resina tal como se ha descrito anteriormente, en condiciones adecuadas para fijar a la resina al menos el 50% del compuesto considerado objetivo;

b): separar la resina que contiene el compuesto considerado objetivo, fijado, de los otros componentes del medio produciendo un complejo resina-compuesto; y

c): desorber desde el complejo el compuesto considerado objetivo, poniendo en contacto el complejo con un eluyente que tiene un pH lo suficientemente diferente del pH del medio indicado en a), de tal modo que el compuesto considerado objetivo se desorbe desde la resina.

En ciertas composiciones de esta invención, dicha funcionalidad ionizable puede derivarse desde un compuesto seleccionado entre el grupo que consta de 4-(aminometil)oiridina, 3-(aminometil)piridina, 2-(aminometil)piridina, 1-(3-aminopropil)-imidazol, 2-(aminometil)-bencimidazol, 4-(3-aminopropil)morfolina, halotriaminas que poseen de 1 a 2 grupos halo seleccionados entre el grupo que consta de fluoro, cloro, bromo y yodo, ácido 4-aminobutítico, (1S, 2S)-(+)-2-amino-1-fenil-1,3-propanodiol, (-)-fenilpropanolamina, feniletilemina, fenilalaninol, 4-(2-aminoetil)bencenosulfonamida, DL-\beta-hidroxifeniletilamina, ácido tiosalicílico, 2-mercapto-1-metilimidazol, 2-mercaptobencimidazol, 4-mercaptoetilpiridina, 2-mercaptoetilpiridina, ácido 4-mercaptobutídico, ácido 5-mercaptovalérico, ácido 6-mercaptohexanoico, 4-hidroxitiofenol, ácido 4-hidroxibenzoico, ácido 4-hidroxifenilacético, ácido3-clorohidroxifenilacético, ácido 3,5-diclorosalicílico, ácido 4-hidroxi-3-nitrobenzoico, 3-nitrotirosina y halotrosinas que poseen desde 1 a 2 grupos halo seleccionados entre el grupo que consta de fluoro, cloro, bromo y yodo, e hidrazida del ácido para-hidroxibenzoico.

En otras composiciones de esta invención, dicha funcionalidad ionizable puede derivarse desde un compuesto seleccionado entre el grupo que consta de ácido aminocaproico, 2-mercaptopiridina, 4-mercaptopiridina, aminoetilbencenosulfonamida tiramina, tirosina e histidina.

Descripción breve de los dibujos

La Figura 1 ilustra la fijación de ligandos a matrices activadas con carbonildiimidazol (CDI).

La Figura 2 ilustra la copulación de ligandos de carbodiimida a grupos carboxilo de la matriz.

La Figura 3 ilustra soportes de CDI-ácido caproico.

La Figura 4 ilustra productos posibles procedentes de la condensación (reacción) de una amina con una matriz de CDI-ácido caproico.

La Figura 5 ilustra la reacción de un tiol con matrices activadas con grupos epoxi.

La Figura 6 ilustra la reacción de una amina con una matriz activada con grupos epoxi en la que está retenida la funcionalidad de amina ionizable.

La Figura 7 ilustra la estructura de algunas resinas útiles en la presente invención.

La Figura 8 ilustra un perfil típico de elución de la recuperación de subtilisina desde un caldo de fermentación crudo que contiene subtilisina, usando una columna de flujo radial.

Descripción detallada de la invención

Esta invención se refiere, en parte, a métodos racionales de recuperación de un compuesto considerado objetivo desde un medio acuoso, usando resinas. Los métodos de esta invención están dirigidos, en parte, a la selección de una resina para usar en la recuperación del compuesto considerado objetivo desde un medio acuoso, en el que el carácter hidrófobo de la resina es suficiente para fijar al menos el 50% del compuesto considerado objetivo existente en un medio acuoso, en fuerza iónica alta y baja, en un primer pH, y además, en donde el carácter hidrófilo y/o electrostático de la resina en un segundo pH, es suficiente para desorber el compuesto fijado, a dicho segundo pH. Los ligandos ionizables de las resinas de esta invención se seleccionan con relación a la matriz sólida de soporte así como respecto a las propiedades del compuesto considerado objetivo, tales como su carga electrostática, pl, estabilidad, etc, de modo que el pH en el que la resina posee un carácter hidrófobo y un carácter hidrófilo y/o electrostático, corresponden a un intervalo de pH en el que el compuesto objetivo es suficientemente estable, etc. Los expertos en la técnica pueden determinar con facilidad tales parámetros basándose en la enseñanzas de esta memoria.

En un aspecto preferido de esta realización, el proceso de selección se extiende para incluir la selección de la matriz sólida de soporte empleada en asociación con el ligando ionizable y la densidad de tales ligandos en la matriz, en donde la selección se lleva a cabo con relación al grado de hidrofobicidad que se requiere para la resina global en los pHs de fijación y desorción desde la resina del compuesto considerado objetivo. A este respecto, la matriz sólida de soporte puede estar o bien desprovista de funcionalidad ionizable o bien puede contener funcionalidad ionizable. Además, tanto la funcionalidad ionizable como el brazo espaciador del ligando ionizable, se seleccionan para proporcionar un control adicional sobre la hidrofobicidad en los pHs de fijación y desorción del compuesto considerado objetivo.

En otro aspecto preferido de esta realización, el proceso de selección se extiende asimismo a incluir la selección de uno o más ligandos ionizables con relación al grado de hidrofobicidad que se requiere para la resina global en los pHs de fijación y desorción. Por ejemplo, la hidrofobicidad de una resina puede ajustarse para aumentar la fijación del compuesto considerado objetivo, si se necesita aumentar la fijación, empleando ligandos no ionizables pendientes de la matriz sólida de soporte, con lo que se regula la hidrofobicidad del ligando. Por ejemplo, ligandos no ionizables muy hidrófobos, tales como unos que incorporen grupos aromáticos, pueden ser empleados para aumentar la hidrofobicidad global de la resina, mientras que un ligando no ionizable, más hidrófilo, tal como uno que contenga varios grupos alcohol no ionizables (por ejemplo, alcanoles) puede ser empleado para favorecer la hidrofilicidad global de la resina con relación a la hidrofobicidad/hidrofilicidad requerida para llevar a cabo la fijación del compuesto considerado objetivo y la desorción desde la resina, del compuesto considerado objetivo.

Llevando a cabo la selección apropiada de cada uno de los componentes de la resina, puede seleccionarse racionalmente el carácter hidrófobo de la resina en el pH de fijación a la misma del compuesto considerado objetivo, para mejorar la eficacia de fijación y/o aumentar específicamente la fijación a la resina del compuesto considerado objetivo. Asimismo, el carácter hidrófilo y/o electrostático (iónico) de la resina al pH de desorción desde la resina, puede seleccionarse racionalmente para asegurar de este modo la desorción apropiada desde la resina, del compuesto considerado objetivo.

Antes de describir esta invención con mayor detalle, serán definidos primeramente los términos y expresiones siguientes:

Definiciones

La expresión "compuesto considerado objetivo" se refiere al compuesto particular o compuestos particulares que se desea aislar desde una solución acuosa. El compuesto considerado objetivo puede ser una proteína, un péptido, un nucleótido, un oligonucleótido, un sacárido, un oligosacárido, un hidrato de carbono, un esteroide, un compuesto aromático cíclico, un diol, un derivado de indol, un compuesto químico farmacéutico o uno de sus intermedios, un metabolito celular primario o secundario, y semejante. El compuesto considerado objetivo, particular, no es crítico. No obstante, en una realización preferida, el compuesto considerado objetivo se selecciona entre el grupo que consta de una proteína o un péptido, un metabolito celular primario o secundario y un intermedio químico farmacéuti-
co.

La expresión "matriz sólida de soporte" o "matriz sólida" alude al material de la cadena principal sólida de la resina cuyo material contiene funcionalidad reactiva que permite el enlace covalente a ella del ligando. El material que constituye la cadena principal puede ser inorgánico (por ejemplo, sílice) u orgánico. Cuando el material que constituye la cadena principal es orgánico es, preferiblemente, un polímero sólido y polímeros orgánicos adecuados son bien conocidos en la técnica. Las matrices sólidas de soporte, adecuadas para usar en las resinas descritas en esta memoria incluyen, a título de ejemplo, celulosa, celulosa regenerada, agarosa, sílice, sílice recubierta, dextrano, polímeros (tales como poliacrilatos, poliestireno, poliacrilamida, polimetacrilamida con inclusión de polimeros de que se dispone en el comercio tales como Fractogel, Enzacryl y Azlactone), copolímeros (tales como copolímeros de estireno y divinilbenceno), sus mezclas, y semejantes. Asimismo pueden emplearse copolímeros. terpolímeros y superiores, con tal que al menos uno de los monómeros contenga o pueda derivatizarse para que contenga, una funcionalidad reactiva en el polímero que resulte. En una realización adicional, la matriz sólida de soporte puede contener funcionalidad ionizable incorporada en su cadena principal. Por ejemplo, matrices adecuadas incluyen, a título de ejemplo, las polietilenaminas, bien conocidas, así como cualesquiera otras matrices que empleen aminas secundarias o terciarias. Preferiblemente, sin embargo, la matriz sólida de soporte no contiene funcionalidad ionizable alguna.

Funcionalidades reactivas de la matriz sólida de soporte que permiten el enlace covalente del ligando, son bien conocidas en la técnica. Tales grupos incluyen hidroxilo (por ejemplo, Si-OH), carboxilo, tiol, amino y semejante. La química convencional permite el uso de estos grupos funcionales para enlazar covalentemente a ellos ligandos. Adicionalmente, la química convencional permite la inclusión de tales grupos en la matriz sólida de soporte. Por ejemplo, pueden incorporarse directamente grupos carboxilo empleando ácido acrílico o uno de sus ésteres en el proceso de polimerización. En la polimerización se encuentran presentes grupos carboxilo si se emplea ácido acrílico o el polímero puede derivatizarse para que contenga grupos carboxilo, si se emplea un éster acrilato.

La expresión "ligando ionizable" se refiere a un grupo que comprende una funcionalidad ionizable y un brazo espaciador para enlazar convenientemente el ligando a la matriz sólida de soporte, en donde la funcionalidad ionizable contiene uno o más grupos capaces de cargarse electrostáticamente a un pH y descargarse electrostáticamente a otro pH. Los grupos funcionales ionizables incluyen, a título de ejemplo, grupos amino, grupos fenólicos, grupos carboxilo, grupos histidilo, grupos piridilo, grupos anilino, grupos morfolinilo, grupos imidazolilo, y semejantes. Pueden incluirse sustituyentes sobre la funcionalidad ionizable o el brazo espaciador con la finalidad de modificar el pH en el que el ligando ionizable puede empezar a titularse. Por ejemplo, la inclusión de uno o más grupos nitro, grupos halo, grupos alquilo, etc sobre un grupo fenol, cambiará el pH en el que el grupo se cargará electrostáticamente. Tal modificación de ligandos se encuentra dentro de la habilidad de la técnica.

El brazo espaciador alude a cualquier grupo o sustituyente que enlaza covalentemente la funcionalidad ionizable a la matriz sólida de soporte. Tales brazos espaciadores son bien conocidos de la técnica en incluyen, solamente a título de ejemplo, grupos alquileno, grupos aromáticos, grupos alquilaromáticos, grupos amido, grupos amino, grupos urea, grupos carbamato, grupos -R_{1}- Y-R_{2}- en los que R_{1} y R_{2} son grupos alquileno (por ejemplo C_{1}-C_{6}) e Y es oxígeno o azufre, y semejantes.

La expresión "ligando ionizable seleccionado" hace referencia al ligando o mezcla de ligandos que se selecciona para enlazar covalentemente a la matriz sólida de soporte. La selección del ligando ionizable se lleva a cabo con relación al pH en el que el ligando tiene un carácter hidrófobo y en el que el ligando tiene un carácter hidrófilo y/o electrostático, así como respecto a la estabilidad de la resina en estos pHs. A su vez, los pHs seleccionados para la fijación y la desorción, dependerán de las propiedades físicas y químicas del compuesto considerado objetivo y de la estabilidad del compuesto considerado objetivo en estos pHs.

La expresión "parcialmente cargado electrostáticamente en el pH en el que el compuesto considerado objetivo se fija a la resina" significa que más del 5% y menos del 100% de las funcionalidades ionizables sobre la resina, están cargadas en el pH de fijación del compuesto considerado objetivo. De preferencia desde más del 5% hasta aproximadamente 40% de las funcionalidades ionizables existentes en la resina, están cargadas en este pH.

La expresión "un ligando no ionizable" alude a un grupo enlazado covalentemente a la matriz sólida de soporte, o bien directamente o bien indirectamente a través de un brazo espaciador, cuyo grupo no contiene funcionalidad alguna fácilmente ionizable. Los ligandos no ionizables adecuados incluyen, a título de ejemplo, grupos alquilo, grupos aromáticos (por ejemplo, fenilo, naftilo) y grupos alquilaromáticos (por ejemplo, grupos bencilo).

La expresión "fuerza iónica alta" significa una fuerza iónica mayor o igual que la requerida para proporcionar una conductancia específica (conductividad) de aproximadamente 24,3 milimhos (miliSiemens). Por ejemplo, tal conductancia puede ser alcanzada usando cloruro de sodio 250 milimolar (mM). La expresión "fuerza iónica baja" significa una fuerza iónica menor que la necesaria para proporcionar una conductancia específica de menos de 24,3 milimhos. Los procedimientos operatorios para determinar la conductancia específica de una solución, son bien conocidos por los expertos en la técnica.

Metodología

El uso de resinas cromatográficas para la purificación de compuestos considerados objetivo, es bien conocido en la técnica. Estas resinas comprenden, normalmente, una matriz sólida de soporte, granular o globular, a la que se fijan ligandos o bien directamente o bien a través de un brazo espaciador. Una solución acuosa que contiene un compuesto considerado objetivo se pone en contacto con la resina. Interacciones entre la resina y el compuesto considerado objetivo, basadas en, por ejemplo, carga química, hidrofobicidad relativa o afinidad específica, permiten que el compuesto considerado objetivo existente en la solución se fije a la resina. Alterando específicamente las condiciones del tampón de desorción para contrarrestar las interacciones entre la resina y el compuesto considerado objetivo, el compuesto considerado objetivo puede ser recuperado selectivamente.

Los métodos descritos en esta memoria representan una mejora sobre los métodos cromatográficos de recuperación de la técnica anterior, en tanto que estos métodos proporcionan medios altamente eficaces para recuperar cantidades industriales del compuesto considerado objetivo a partir de un medio acuoso tal como un caldo de fermentación. En una realización particularmente preferida, los métodos descritos en esta memoria son particularmente útiles para purificar proteínas partiendo de caldos de fermentación (por ejemplo, quimosina y subtilisina) debido a que la purificación puede ser llevada a cabo con frecuencia directamente, partiendo de una preparación de caldo cruda y debido, además, a que los componentes del caldo clarificado, crudo, distintos de la proteína considerada objetivo, no pueden unirse a estas matrices.

Los métodos descritos en esta memoria son particularmente útiles cuando no se requiere una pureza muy alta del compuesto considerado objetivo, por ejemplo, enzimas industriales, debido a que este nivel de pureza puede ser obtenido con una purificación de una etapa. Opcionalmente, los caldos pueden ser cargados después de ajustar el pH, si se requiere, sin dilución, concentración, desalación, adición de sal o separación de partículas. De modo semejante, la desorción del compuesto considerado objetivo desde la resina, puede ser conseguida simplemente mediante ajuste del pH sin necesidad de salación o desalación. Se contempla que las resinas descritas en esta memoria pueden ser menos susceptibles a ensuciarse y más fáciles de regenerar que las resinas que no pueden ser ionizadas.

Las resinas descritas en esta memoria proporcionan una combinación de varias características importantes. Pueden permitir la recuperación directa de un compuesto considerado objetivo partiendo de una solución acuosa cruda y pueden permitir una purificación importante en el comienzo de tratamiento aguas abajo. La desorción con tampones de fuerza iónica baja, puede adaptarse bien a una etapa subsiguiente de tratamiento cromatográfico, es decir, antes de intercambio iónico o cromatografía de afinidad. Estas resinas permiten una elución rápida, barata, en condiciones nada rigurosas. Se requiere tecnología mínima de etapas o de gradiente, se requiere poca o ninguna sal extra y pueden requerirse pocos o ningún adyuvante.

Debido a la naturaleza general de la fijación en los métodos de esta invención, estos métodos pueden poner de manifiesto menos especificidad que otros procedimientos cromatográficos. Por ejemplo, en el caso de tratamiento de caldos de fermentación, el caldo puede tener contaminantes principales, diferentes de las proteínas, con diferentes hidrofobicidades [19]. Por tanto, puede tener lugar un nivel importante de fijación de proteínas no consideradas objetivo.

La purificación o fraccionamiento llevados a cabo usando los métodos descritos en esta memoria, requiere que la hidrofobicidad del compuesto considerado objetivo y/o el punto isoeléctrico (pi - si es apropiado), difieran de los de la mayoría de los contaminantes. Compuestos considerados objetivo con hidrofobicidad y punto isoeléctrico similares a los de contaminantes constituidos por compuestos no considerados objetivo, pueden eluir conjuntamente con los contaminantes en ausencia de desorción de gradiente. Esto puede ser contrarrestado mediante tratamiento previo de la muestra o variaciones del ligando, el espaciador y la matriz, según se describe con detalle en esta memoria. Adicionalmente, dado que la fijación del compuesto se efectúa en fuerza iónica alta o baja en los métodos aquí descritos, el cambio de la fuerza iónica de la solución que se pone en contacto con la resina puede retirar algunas impurezas al tiempo que retener fijadas a la resina las proteínas consideradas objetivo. Asimismo, el cambio del pH en fuerza iónica baja, puede ser útil para desorber selectivamente un compuesto considerado objetivo sobre otro. Por otra parte, la fijación y recuperación cuantitativa de compuestos es una preferencia en algunos procesos, por ejemplo, la recuperación de la proteína del suero. Los métodos descritos en esta memoria pueden ser útiles también para la inmovilización enzimática no covalente [14-18] debido a que la fijación es fuerte y la recuperación de enzimas es sencilla.

Los métodos descritos más adelante en esta memoria emplean resinas específicas, útiles para la fijación de compuestos considerados objetivo. La fijación a estas resinas se lleva a cabo en un pH en el que la resina posee un carácter hidrófobo y, por consiguiente, la fijación se consigue principalmente mediante interacciones hidrófobas, no obstante el hecho de que los ligandos ionizables sobre la resina a este pH están cargados parcialmente. El grado de interacción hidrófoba entre la resina y el compuesto considerado objetivo al pH de fijación, se selecciona racionalmente de modo que está regulada la fuerza de fijación a la resina del compuesto considerado objetivo. Tal selección se consigue mediante el uso de matrices y ligandos adecuados, incluyendo los brazos espaciadores empleados, donde la combinación de estos materiales proporciona una hidrofobicidad regulada de la resina.

Medios de regular adicionalmente la hidrofobicidad consisten en incluir en la matriz sólida de soporte una población de ligandos no ionizables que son o bien altamente hidrófobos (por ejemplo que contienen grupos fenilo o bencilo) o bien más hidrófilos (por ejemplo, conteniendo grupos amida, uretano o hidroxilo no ionizable). Tales factores están dentro de la capacidad de la técnica basándose en las enseñanzas aquí expuestas. Preferiblemente, cuando se emplean ligandos no ionizables, la población de ligandos no ionizables sobre la matriz sólida de soporte varían de 0 a 80 por ciento, basado en el número total de ligandos ionizables más ligandos no ionizables.

Adicionalmente, cuando un ligando está unido a la matriz sólida de soporte a través de un enlace tioéter, la hidrofobicidad de la resina puede ser regulada oxidando algunos o todos los átomos de azufre de la resina a grupos sulfóxido y/o sulfona. Aumentando la población de grupos sulfóxido y/o sulfona presentes en la resina, la hidrofobicidad de la resina se reduce. Procedimientos adecuados para oxidar grupos tioéter a grupos sulfóxido o sulfona son conocidos en la técnica.

Los métodos descritos en esta memoria son útiles para recuperar una amplia variedad de compuestos considerados objetivo que incluyen proteínas y péptidos con inclusión de productos recombinantes. Los métodos pueden ser usados también para llevar a cabo separaciones de compuestos existentes en extractos procedentes de fuentes naturales, tales como fuentes de origen vegetal y animal.

Las resinas aquí descritas emplean ligandos ionizables y, opcionalmente, ligandos no ionizables, unidos a las matrices sólidas de soporte. Puede usarse cualquier método para unir covalentemente los ligandos, con tal que la unión no de como resultado la introducción de grupos ionizables diferentes del grupo o grupos ionizables deseados. Ejemplos de métodos para la unión de tales ligandos a las matrices sólidas de soporte incluyen enlaces covalentes de tioéteres, éteres, amidas, aminas y uretanos. Pueden emplearse otros métodos para tioéteres, unión de disulfuros y métodos de urea. Adicionalmente, ligandos de hidrazida pueden ser enlazados a grupos funcionales epóxido o aldehído. En el caso de unión a través del aldehído se prefiere la reducción subsiguiente de la imina (por ejemplo con cianoborohidruro de sodio).

Características químicas de unión de ligandos representativos se indican en la Tabla 1. Otras características químicas de unión de ligandos se ilustran en otra parte en esta memoria y/o son conocidos en la técnica.

TABLA 1

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1

Cada una de estas características químicas es conocida en la técnica y resulta copulación en el enlace arriba descrito. Por ejemplo, los ligandos pueden unirse a la matriz sólida de soporte tal como una matriz de celulosa activada, por medio de un enlace de uretano neutro mediante el uso de reactivo de carbonildiimidazol (CDI) como se ilustra en las Figuras 1 y 3. Alternativamente, los ligandos pueden ser unidos a través de una unión amida a una matriz de celulosa derivatizada con un brazo espaciador de ácido aminocaproico según ilustra la Figura 4, realizaciones 1 y 3. Cuando es necesario puede conseguirse una sustitución del 100% de los grupos carboxilo del brazo espaciador. Tal sustitución puede ser confirmada usando procedimientos conocidos en la técnica, tales como titulación de iones pequeños.

La fijación de los ligandos por medio de matrices activadas con carbonildiimidazol (DCI) se ilustra en la Figura 1. La copulación de la carbodiimida del ligando a los grupos carboxilo de la matriz se ilustra en la Figura 2. Soportes de CDI-ácido caproico se ilustran en la Figura 3. Derivaciones posibles de las matrices de CDI-caproico se ilustran en la Figura 4.

Una alternativa a las matrices activadas con CDI para la fijación de ligandos, son resinas que contienen grupos epóxido cuya preparación y fijación a ellos de ligandos se ejemplifican en las Figuras 5 y 6. Específicamente, la Figura 5 ilustra la unión de ligandos que contienen tiol a una matriz sólida de soporte activada con epóxido. En esta resina, el ligando está unido a través de enlace de tioéter neutro, estable [10]. Los ligandos que pueden ser usados con está característica química incluyen, a título de ejemplo, mercaptobencimidazol, 4-mercaptopiridina, 2-mercaptopiridina, metimazol y 4-hidroxitiofenol. La Figura 6 ilustra la reacción de una amina con una matriz sólida de soporte activada con epóxido. La característica químicas empleada en ambos casos es típicamente acuosa y por consiguiente menos costosa que el método del CDI. Sin embargo, esta química puede introducir reticulación en la matriz, lo que puede reducir la capacidad de carga. Como ilustra la Figura 6, la funcionalidad de amina ionizable está retenida en el ligando que resulta y, por consiguiente, el grupo unido a la amina en la figura o bien puede contener otra funcionalidad ionizable (por ejemplo, piridina, -CH_{2}-piridina), o bien puede ser no ionizable (por ejemplo, alquilo).

Otros agentes de activación preferidos para la modificación de matrices con ligandos tiol poseen un grupo altamente reactivo y un grupo que puede ser derivatizado a un grupo reactivo. El grupo altamente reactivo reacciona con un grupo hidroxilo de la matriz en un pH alcalino formando un enlace estable, al tiempo que el segundo grupo no reacciona en estas condiciones. Esto evita la reticulación. Después de la primera etapa de activación, el segundo grupo es derivatizado a un grupo reactivo que luego puede hacerse reaccionar directamente. Haluros de alilo (por ejemplo, bromuro de alilo) y éter alil-glicidílico son reactivos preferidos. Otros reactivos incluyen, a título de ejemplo, 2- y 4-vinilpiridina, 2- y 4-mercapto-etilpiridinas y aminopiridinas. Por ejemplo, matrices sólidas de soporte activadas con éter alil-glicidílico pueden permitir niveles de sustitución mayores que las activadas con epiclorhidrina. Por enlace covalente de estos ligandos a la resina, el grupo alilo puede ser modificado para incorporar de este modo una funcionalidad ionizable (por ejemplo reacción con agua de bromo para formar un derivado bromado, seguido de reacción con la sal de bis-sodio del ácido 4-hidroxibenzoico).

Ha de entenderse que la funcionalidad ionizable puede estar incorporada en la matriz sólida de soporte. Por ejemplo, puede usarse una poliamina o un polímero que comprenda funcionalidad de amina, en el que los grupos funcionales amina sean ionizables a pHs bajos. En una realización tal, el polímero puede prepararse para que incluya otros grupos funcionales, y la unión del ligando puede llevarse a cabo o bien a través del grupo amina o bien de tales otros grupos funcionales. En la primera realización, se emplean condiciones químicas de unión de ligandos para retener al menos una parte de la funcionalidad ionizable existente sobre la cadena principal de la matriz.

Los ligandos ionizables, útiles en las resinas descritas en esta memoria, incluyen los derivados que enlazan covalentemente 3-(aminometil)piridina (3AMP), 4-(aminometl)piridina (4AMP), 1-(3-aminopropil)imidazol (API), 2-(aminometil)bencimidazol (AMB), 4-(3-aminopropil)morfolina (APM), histamina y semejantes a la matriz sólida de soporte, empleando las condiciones químicas anteriormente descritas en la Tabla 1 y en los Ejemplos que figuran más adelante en esta memoria. Otros compuestos adecuados para formar las resinas de esta invención incluyen 4-(aminometil)piridina, 2-(aminometil)piridina, halotriaminas que tienen de 1 a 2 grupos halo seleccionados entre el grupo que consta de fluoro, cloro, bromo y yodo, ácido 4-aminobutírico (1S,2S)-(+)-2-amino-1-fenil-1,3-propanodiol, (-)-fenilpropanolamina, feniletilamina, fenilalaninol, 4-(2-aminoetil)bencenosulfonamida, DL-\beta-hidroxi-feniletilamina, ácido tiosalicílico, 2-mercapto-1-metilimidazol, 2-mercaptobencimidazol, 4-mercaptoetilpiridina, 2-mercaptoetilpiridina, ácido 4-mercaptobutírico, ácido 5-mercaptovalérico, ácido 6-mercaptohexanoico, 4-hidroxitiofenol, ácido 4-hidroxibenzoico, ácido 4-hidroxifenilacético, ácido 3-clorohidroxifenilacético, ácido 3,5-diclorosalicílico, ácido 4-hidroxi-3-nitrobenzoico, 3-nitrotirosina, tirosina, halotrosinas que tienen de 1 a 2 grupos halo seleccionados entre el grupo que consta de fluoro, cloro, bromo y yodo, histidina, anilina e hidrazida del ácido para-hidroxibenzoico.

Cuando se usa un compuesto hidrófobo aminado para generar el ligando ionizable o no ionizable, se selecciona preferiblemente entre el grupo que consta de 2-feniletilamina, L-fenilalaninol, (1R, 2S)-(-)-fenilpropanolamina, triptamina, 4-(2-aminoetil)bencenosulfonamida, (1S,2S)-(+)-2-aminoofenilpropa- nodiol y 1-hexilamina. Cuando han de ser generados ligandos ionizables, el grupo amino es retenido en estas moléculas, por ejemplo, por reacción con un epóxido y la amina forma parte del brazo de enlace. Cuando han de ser generados ligandos no ionizables, el grupo amino es eliminado de la molécula por reactividad, mediante, por ejemplo, reacción con un ácido carboxílico generando de este modo una amida.

Otros ligandos útiles incluyen aquellos que contienen fenol sin sustituir y fenoles sustituidos, con un pKa en el intervalo de 6-9. Los sustituyentes adecuados para el grupo fenilo incluyen nitro, halo (por ejemplo, cloro, bromo), alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono, ésteres carboxílicos en los que el grupo éster tiene de 1 a 10 átomos de carbono, ciano, grupos carbonil-alquilo (-C(O)R) de 1 a 10 átomos de carbono, y sus mezclas. Típicamente, los grupos fenilo sustituidos tienen de 1 a 4 de tales sustituyentes y, preferiblemente, de 1 a 2. Los sustituyentes anteriores pueden también ser unidos a otros ligandos sustituibles incluyendo ligandos que contienen grupos piridilo, grupos histidilo, grupos indolilo, grupos imidazolilo, grupos morfolinilo, grupos bencimidazolilo y semejantes.

No se pretende que la lista de ligandos ionizables expuesta en esta memoria sea exhaustiva ni lo son las condiciones químicas empleadas para enlazar covalentemente estos ligandos a la matriz sólida de soporte. Basta hacer notar que el enlace de ligandos adecuados a la matriz sólida de soporte emplea condiciones químicas bien conocidas en la técnica.

El ligando ionizable se encuentra presente sobre la resina, preferiblemente, en una concentración suficiente que permite que la proteína considerada objetivo se fije en una fuerza ióniza tanto alta como baja. Preferiblemente, la funcionalidad ionizable estará presente en la resina en una concentración mayor que la menor de al menos aproximadamente 1 mmol por gramo de resina, peso seco, o al menos aproximadamente 150 \mumol/ml de resina. En una realización particularmente preferida, se emplean ligandos no ionizables en asociación con funcionalidad ionizable, proporcionando de este modo un control adicional sobre el grado de hidrofobicidad/hidrofilicidad en el pH de fijación a la resina del compuesto considerado objetivo y de desorción desde la resina. En esta realización, el porcentaje de ligandos no ionizables con respecto al número total de ligandos, varía desde aproximadamente 0 hasta aproximadamente 80 por ciento, de preferencia desde 0 a 40 por ciento.

En los métodos de esta invención, una solución o un medio acuoso que comprende el compuesto considerado objetivo que ha de ser recuperado, se pone en contacto con la resina en un pH en el que el carácter hidrófobo de la resina es suficiente para fijar al menos el 50% del compuesto considerado objetivo en alta y baja fuerza iónica. En este pH, la fijación se efectúa, principalmente, por interacción hidrófoba y el grado de hidrofobicidad de la resina puede ser ajustado por modificación de los brazos espaciadores y/o la funcionalidad ionizable que comprende el ligando, empleando una matriz sólida de soporte más o menos hidrófoba, mediante el uso de ligandos no ionizables, aumentando la densidad de ligandos sobre la matriz sólida de soporte y sus combinaciones. A la vista de las enseñanzas que aquí figuran, los expertos en la técnica pueden ajustar racionalmente estos parámetros basándose en las propiedades del compuesto considerado objetivo, asociado a las mejoras deseadas.

El medio que comprende el compuesto considerado objetivo, por ejemplo, una proteína tal como la quimosina, que ha de ser recuperado, puede haber sido derivado de cualquier fuente conocida, incluyendo fuentes microbianas o animales. Por ejemplo, las soluciones de quimosina pueden incluir un caldo de fermentación procedente de Aspergillus, E. coli, levadura así como extractos acuosos obtenidos de abomasos bovinos.

El medio acuoso puede incluir un tampón y/o una sal para mejorar la eficacia de fijación a la resina. Sin embargo, como se ha indicado antes, la fijación del compuesto considerado objetivo puede conseguirse en fuerza iónica alta y baja, por consiguiente la adición de sal al medio acuoso se hace simplemente para proporcionar una fijación adicional. Las sales adecuadas son aquellas empleadas convencionalmente en cromatografía e incluyen, a título de ejemplo, las sales de litio, sodio, potasio, amonio, calcio y magnesio, de cloruro, sulfato, fosfato y acetato. Preferiblemente se emplea cloruro de sodio debido a que es eficaz, barato y seguro.

Como se ha indicado antes, las resinas descritas en esta memoria fijan el compuesto considerado objetivo desde medios acuosos, tanto en altas como en bajas fuerzas iónicas. Específicamente, estas resinas fijan aproximadamente el 50 por ciento o más del compuesto considerado objetivo existente en el medio acuoso en baja y alta fuerza iónica. Ha de entenderse, como es lógico, que el volumen de resina que se emplea tiene suficiente capacidad para fijar la totalidad de la proteína considerada objetivo existente en el medio.

El medio acuoso se pone en contacto con la resina durante un tiempo suficiente para permitir que el compuesto considerado objetivo se fije a la resina. Este contacto puede establecerse, por ejemplo, cuando la resina está empaquetada en una columna, empleada en forma de un lecho fluidizado, o suspendida en un sistema por cargas agitado, en el que la resina se mezcle con el medio acuoso. En tales condiciones el compuesto considerado objetivo se fija a la resina formando con ello un complejo resina-compuesto. Después de poner en contacto el medio acuoso con la resina, se lava luego la resina con una solución tampón de un pH igual al del medio acuoso para separar el medio acuoso de la resina y los compuestos fijados en ella. Esta solución tampón puede comprender adicionalmente, al menos hasta una concentración 2 M de sal según se ha indicado anteriormente.

El compuesto considerado objetivo es sometido a desorción luego desde la resina simplemente poniendo en contacto la resina con un medio acuoso de un pH que altere el carácter de la resina, desde un carácter hidrófobo a un carácter hidrófilo y/o electrostático. Esto se consigue seleccionando un pH en el que las funcionalidades ionizables existentes en el ligando lleguen a cargarse más o lleven una carga de polaridad diferente de la de los ligandos en el pH de fijación del compuesto considerado objetivo. Ha de entenderse que la desorción desde la resina puede facilitarse también mediante cambios en las propiedades de fijación del compuesto considerado objetivo, en el pH de desorción.

En una realización preferida de la presente invención, la carga sobre la resina en el pH de desorción tiene la misma polaridad que la carga electrostática neta sobre el compuesto considerado objetivo en el pH de desorción, y la repulsión carga-carga que resulta entre la resina y el compuesto considerado objetivo es suficiente para obviar cualquier interacción hidrófoba con la resina, facilitando con ello la desorción desde la resina. Esto puede conseguirse seleccionando racionalmente la hidrofobicidad relativa de la resina como se ha descrito anteriormente y/o por incorporación de ligandos ionizables suficientes para proporcionar una carga electrostática efectivamente grande, sobre la resina, en el pH de desorción.

En otra realización de la presente invención, la carga inducida sobre la resina tiene polaridad opuesta a la carga electrostática neta sobre el compuesto considerado objetivo, en el pH de desorción. En esta realización, la desorción del compuesto considerado objetivo desde la resina, puede facilitarse, por ejemplo, mediante el uso de un eluyente de alta fuerza iónica. En cualquiera de las dos realizaciones el uso de un agente reductor de la polaridad, tal como etilen- o propilenglicol, puede facilitar la desorción del compuesto considerado objetivo desde la resina.

La elección de ligandos se basa en restricciones del pH impuestas por compuesto considerado objetivo. Por ejemplo, en determinadas circunstancias puede ser deseable emplear una resina que tenga ligandos con funcionalidad ionizable que lleguen a cargarse positivamente en pHs en que el compuesto considerado objetivo es estable, por lo que deben evitarse pHs extremos para la fijación o desorción del compuesto. Asimismo, pueden preferirse resinas que tengan ligandos con funcionalidad ionizable que lleguen a cargarse negativamente en pHs en que el compuesto es estable. Los compuestos que tienen funcionalidad ionizable, útiles como ligandos en esta invención, incluyen, a título de ejemplo, ácido caproico, con inclusión del ácido 6-aminocapropico (titulos desde pH \approx 3,3). Compuestos fenólicos, por ejemplo tiramina, son también útiles a este respecto, dado que el grupo hidroxilo del fenol titula desde aproximadamente pH 6 y por encima. Los ligandos de fenol o tiramina, nitrados o clorados, son especialmente útiles dado que poseen un valor del pKa cercano al pH neutro. Todavía otros compuestos que poseen funcionalidad ionizable, útiles como ligandos en esta invención, incluyen, a título de ejemplo soolamente, 4-(aminometil)piridina, 3-(aminometil)piridina, 2-(aminometil)piridina, 1-(3-aminopropil)-imidazol, 2-(aminometil)-bencimidazol, 4-(3-aminopropil)morfolina, halotriaminas que tienen de 1 a 2 grupos halo seleccionados entre el grupo que consta de fluoro, cloro, bromo y yodo, ácido 4-aminobutírico, (1S,2S)-(+)-2-amino-1-fenil-1,3-propanodiol, (-)-fenilpropanolamina, feniletilamina, fenilalaninol, 4-(2-amino-etil)bencenosulfonamida, DL-\beta-hidroxifeniletilamina, ácido tiosalicílico, 2-mercapto-1-metilimidazol, 2-mercaptobencimidazol, 4-mercaptoetilpiridina, 2-mercaptoetilpiridina, ácido 4-mercaptobutírico, ácido 5-mercaptovalérico, ácido 6-mercaptohexanoico, 4-hidroxitiofenol, ácido 4-hidroxibenzoico, ácido 4-hidroxifenilacético, ácido 3-clorohidroxifenilacético, ácido 3,5-diclorosalicílico, ácido 4-hidroxi-3-nitrobenzoico, 3-nitrotirosina, tirosina, halotirosinas, histidina, e hidrazida del ácido para-hidroxibenzoico.

En otra realización en que el compuesto considerado objetivo (por ejemplo, una proteína) es estable solamente en pHs fisiológicos (es decir, pHs desde 5 a 9) los ligandos ionizables unidos a la matriz sólida de soporte deben proporcionar resinas que titulan total o parcialmente, en un intervalo de pH desde aproximadamente 5 a 9 y más preferiblemente desde aproximadamente 5,5 hasta aproximadamente 8,5. Tal intervalo permite la fijación y desorción de una proteína considerada objetivo en un intervalo de pH que, en el caso de muchas proteínas, reduce los riesgos de desnaturalización, etc., en comparación con intervalos de pH más extremos.

En los métodos que se describen en esta memoria, la densidad de los ligandos sobre la matriz se selecciona de modo que la fijación del compuesto considerado objetivo se consigue en alta y baja fuerza iónica. Sobre base húmeda, la densidad de ligandos que se requiere para efectuar tal fijación es, preferiblemente, al menos aproximadamente 150 \mumoles por mililitro de resina y más preferiblemente, al menos aproximadamente 175 \mumoles por mililitro de resina y todavía más preferiblemente, al menos aproximadamente 200 \mumoles por mililitro de resina. Sobre base seca, la densidad de ligandos que se requiere para efectuar tal fijación es, preferiblemente, al menos aproximadamente 1 mmol por gramo de resina, peso seco, y más preferiblemente al menos aproximadamente 1,33 mmol por gramo de resina, peso seco. Esto puede permitir el tratamiento de medios acuosos sin dilución, concentración, desalación, adición de sal o separación de partículas. Otra ventaja contemplada mediante el uso de las resinas descritas en esta memoria consiste en que estas resinas pueden sufrir menos ensuciamiento que las resinas previamente empleadas para separar compuestos considerados objetivo tales como proteínas, a partir de caldos.

Para la separación del compuesto considerado objetivo desde la resina del modo anteriormente descrito, la solución del compuesto considerado objetivo, recuperado, puede ser tratada posteriormente por métodos convencionales..

La resina empleada en este proceso puede ser regenerada por métodos convencionales. Por ejemplo, las resinas que emplean ligandos con grupos funcionales que llegan a cargarse positivamente, pueden ser regeneradas usando HCl 0,1 M, con o sin agente de reducción de la polaridad tal como etanol o etilenglicol. Asimismo, las resinas que emplean ligandos con grupos funcionales que llegan a cargarse negativamente, pueden ser regeneradas usando NaOH 0,1 M, de nuevo con o sin agente reductor de la polaridad tal como etanol o etilenglicol. No obstante, la exposición a compuestos cáusticos puede dar como resultado la hidrólisis de matrices con CDI y puede ocasionar hinchamiento de la matriz. La reticulación de la matriz de celulosa antes de efectuar la activación ha sido utilizada para reducir el hinchamiento y mejorar los caudales de la columna. La reticulación puede ser usada también con matrices ionizables positivamente.

Cuando el ensuciamiento constituye un problema, el tratamiento preliminar del medio acuoso haciéndolo fluir a través de una resina barata tal como DEAE, en fuerza iónica alta, puede mejorar la separación. Por ejemplo, cuando el compuesto considerado objetivo es la subtilisina, el uso de un tratamiento preliminar en una columna de DEAE con muestras de subtilisina, da por resultado una disminución importante de los compuestos que ocasionan el ensuciamiento, quedando más del 99% de la actividad enzimática. La merma de compuestos que ocasionan ensuciamiento mejora la regeneración, el tiempo de vida de la resina y su capacidad. Esta etapa extra puede ser especialmente factible cuando el flujo procedente de la columna de tratamiento preliminar puede ser cargado directamente a los sistemas de separación de la presente invención, sin ajuste con solución tampón.

Como se ha indicado anteriormente, la resina así como las condiciones del proceso (por ejemplo, soluciones tampón) seleccionadas, son relativas con respecto al compuesto considerado objetivo que ha de ser purificado. Por ejemplo la proteína subtilisina es inestable por debajo de un pH 4,5, por lo que no pueden emplearse soluciones tampón por debajo de esta pH. Además, han de evitarse soluciones tampón con citrato cuando se trabaja con subtilisina, al objeto de evitar la quelación de Ca^{2+}, dado que el Ca^{2+} estabiliza la enzima. Adicionalmente las, soluciones tampón con fosfatos pueden precipitar Ca^{2+} y por tanto tales tampones deben ser evitados también. El intervalo de trabajo preferido para la subtilisina es pH 5-7. La operación en el intervalo de pH de 7-10 puede ser aceptable durante períodos limitados. También, con métodos de recuperación de subtilisina, soluciones tampón con molaridades de 100-200 mM son preferidas para el ajuste de pH inicial requerido para la desorción. Una vez ajustado el pH, la molaridad de la solución tampón puede reducirse por dilución. Las soluciones tampón de acetato (pH 5,2) proporcionan una recuperación eficaz para la mayor parte de las matrices hidrófobas ionizables positivamente. Una solución tampón de glicol que contenía formiato al 8% y propilenglicol al 40%, pH 5,5, eluyó subtilisina desde la totalidad de las matrices ensayadas.

Aun cuando las resinas descritas en esta memoria poseen utilidad particular para la recuperación a gran escala de compuestos considerados objetivo, usando procedimientos sencillos de fijación y desorción, las resinas y los métodos que aquí se describen pueden ser usados para FPLC y HPLC analíticas o para uso preparativo de alto valor. En particular, pueden emplearse gradientes salinos descendentes cuando la resina tiene un carácter hidrófobo y (a) desplazamiento del pH a la forma hidrófila y/o electrostática (iónica) seguida de un gradiente salino creciente, o (b) elución con gradiente de pH para desplazarse posteriormente fuera del pH de la forma hidrófoba.

Usando una mezcla de ligandos de afinidad, más ligandos ionizables, las ventajas de fijación por afinidad pueden asociarse con una desorción fácil por repulsión electrostática. La fijación tendría lugar en un pH en el que el ligando titulable solamente se carga, en parte, electrostáticamente o es inerte y la desorción tendría lugar mediante cambio de pH. Esto resulta por analogía con el método de Ruann [20] y la repulsión de afinidad de Teichberg [21].

Además, las resinas y sistemas de la presente invención pueden aplicarse a sistemas de resinas no cromatográficos tales como extracciones líquido-líquido y sistemas de polímeros/UF. Polímeros modificados de separación de fases tales como polietilenglicol para extracciones líquido-líquido [22,23], membranas modificadas [24] o métodos de polímeros solubles-UF [13,25] pueden emplear también los sistemas de la presente invención. En tales realizaciones la resina y la matriz no necesitan ser sólidas ni insolubles en agua.

Ejemplos

Los ejemplos que siguen se presentan para ilustrar realizaciones específicas de la presente invención y no deben ser interpretados como limitaciones al alcance de la invención.

Los Ejemplos I a VI demuestran métodos de preparación de resinas activadas y/o la fijación subsiguiente de ligandos representativos. Estos ejemplos figuran descritos en la Solicitud de patente de EE.UU. Ser. No. 08/268.178, presentada el 29 de Junio de 1994, como expediente del apoderado No. 010055-126, cuya solicitud de patente se incorpora en esta memoria por referencia, en su totalidad.

En estos ejemplos, las abreviaturas usadas tienen los significados que siguen. Si no se ha definido, cualquier abreviatura usada más adelante tiene el significado generalmente aceptado.

AEBS =	p-(2-aminoetil)bencenosulfonamida;
API =	APImidazol = APIMID = 1-(3-aminopropil)imidazol;
AMB =	AMBencimidazol = 2-(aminometil)bencimidazol;
APM =	APMorfolina = 1-(3-aminopropil)morfolina;
2AMP =	2AMPiridina = 2-(aminometil)piridina;
3AMP =	3AMPiridina = 3-(aminometil)piridina;
4AMP =	4AMPiridina = 4-(aminometil)piridina;
APP =	(1S, 2S)-(+)-2-aminofenilpropanodiol;
CDI =	carbonildiimidazol;
DAH =	diaminohexano;
DEAPA =	3-dietilaminopropilamina;
DMSO =	sulfóxido de dimetilo;
ECH =	epiclorhidrina;
EDC =	(1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida;
EEDQ =	N-etoxicarbonil-2-etoxidihidroquinolina;
g =	gramos;

HEX =	hexilamina = 1-hexilamina;
kPa =	kilopascales;
M =	molar;
mg =	miligramos;
MG1 =	resina Perloza sustituida con 1-(3-aminopropil)imidazol;
MG2 =	resina Perloza sustituida con 4-(aminometil)piridina;
MG3 =	\begin{minipage}[t]{135mm} resina sin reticular en Perloza MT 100 Fine (diámetro: 80-10 micrómetros; densidad de ligandos: 207 \mu moles de ácido caproico/ml);\end{minipage}
MG3a =	\begin{minipage}[t]{135mm} Resina en Perloza MT 100 Fine, reticulada con epiclorhidrina al 1% (densidad de ligandos: 225 \mu mol/ml); \end{minipage}
MG3b =	\begin{minipage}[t]{135mm} Resina en Perzola MT 100 Medium, Perzola (diámetro: 100-250 micrómetros; densidad de ligandos: 218 \mu mol/ml); \end{minipage}
ml =	mililitro
mM =	milimolar
mmho =	milimho (1 mS - miliSiemens);
mmol =	milimoles;
MB =	mercaptobencimidazol;
metimazol =	2-mercapto-1-metilimidazol;
MP =	4MP = 4-mercaptopiridina;
P =	Perloza;
PALOL =	fenilalaninol;
PCC =	resina de Perloza con CDI, con ácido aminocaproico;
PCDI =	Perloza activada con CDI;
PEA =	feniletilamina;
PPA =	fenilpropanolamina;
rpm =	revoluciones por minuto;
S =	Sepharose
TRPN =	triptamina
\mul =	microlitros.

Al usar las abreviaturas anteriores, las resinas empleadas en los ejemplos que siguen se abrevian, en general, del modo siguiente: [Matriz]-[Método de copulación]-[Brazo espaciador]/[Funcionalidad ionizable]. Por ejemplo, "P CDI 4Ampiridina" se refiere a una matriz de soporte sólida de Perloza(P) activada con carbonildiimidazol (DCI) y copulada con un grupo 4-aminometilpiridina; "S ECH Metimazol" se refiere a una matriz sólida de soporte de Sepharose (S) activada co epiclorhidrina (ECH) y copulada con el grupo 2-mercapto1-metilimidazol (Metimazol), y "P CDI DAH ácido Hidroxifenilacético" se refiere a una matriz sólida de soporte de Perloza (P) activada con carbonildiimidazol (CDI) y copulada por medio de un espaciador de diaminohexano (DAH) con ácido hidroxifenilacético. Ha de entenderse, como es lógico, que el brazo espaciador y las funcionalidades ionizables comprenden el ligando ionizable.

Ejemplo I Activación con epóxido

Sepharose 6B (50 g) previamente lavada con 10 volúmenes de agua, se mezcló con 47 ml de NaOH 1M y 5 ml de epiclorhidrina durante 24 horas, a 4ºC. La sustitución de grupos epóxido se determinó mediante métodos conocidos en la técnica resultando ser 1,06 mmol/g. Activaciones similares dieron sustituciones de grupos epóxido de 1,28 y 1,02 mmol/g.

Ejemplo II Unión de ligandos de amina a Sepharose epoxidada

Sepharose epoxidada (10 g, 1,06 mmol/g, seca) preparada según se ha descrito en el Ejemplo I, se mezcló con un exceso 5 molar (es decir, 5 moles de ligando/mol de grupos reactivos de la resina) de un ligando seleccionado entre AEBS, APP, TRPN solvatado con 4 ml de DMSO y 2 ml de agua, durante 24 horas, a 37ºC. Se mezcló asimismo un exceso 5 molar de HEX con 10 g de Sepharose epoxidada (1,28 mmol/g, seca). Las resinas resultantes se lavaron con 10 volúmenes de DMSO al 50% (DMSO:agua, 1:1) (resina de triptamina solamente), 10 volúmenes de agua, 2 volúmenes de HCl 0,1 M y otros 10 volúmenes de agua. La sustitución de ligandos se determinó mediante titulación con HCl 0,1 M hasta pH 4, resultando ser de 0,81 mmol/g para Sepharose con APP y de 0,99 mmol/g para Sepharose con HEX. Esto representó, aproximadamente, un 80% de eficacia de sustitución de ligandos de grupos epóxido. Pueden conseguirse densidades de ligandos mejoradas mediante los procedimientos operatorios descritos en los Ejemplos III a VII que figuran seguidamente.

Ejemplo III Activación con éter alil glicidílico

Celulosa Perloza (celulosa globular Perloza MT 100 Fine, obtenible de Secheza, Checoslovaquia) se lavó con 5 volúmenes de agua (agua de calidad MilliQ) y 3 volúmenes de NaOH 0,3 M, y se secó por succión. Una cantidad de 40 g de la matriz se mezcló con 12 ml de éter alil glicidílico de 99+ %, agitando fuertemente. La mezcla se dejó a temperatura ambiente durante 48 horas, agitando ocasionalmente. La matriz activada se lavó con 10 volúmenes de agua y se suspendió en 3 volúmenes de agua. Se añadió agua de bromo (1%), lentamente, a lo largo de 5 minutos, hasta que la mezcla no decoloró más el agua de bromo. La resina bromada se lavó con 10 volúmenes de agua. La concentración de grupos alilo sobre la resina se determinó por la cantidad de agua de bromo decolorada. La concentración de grupos de bromo reactivos sobre la resina (1 g de muestra suspendida en 9 ml de agua) se determinó mediante sustitución con 0,5 de sulfito de sodio (4 horas, 60ºC), seguido de titulación con NaOH 0,1 M hasta pH 8.

Activación con bromuro de alilo

Celulosa Perloza (MT 100 Fine) se lavó con 5 volúmenes de agua (calidad MilliQ) y se secó por succión. Una cantidad de 10 g de la matriz se mezcló con 0,8 ml de bromuro de alilo (redestilado), 0,8 g de hidróxido de bario octahidrato, 2 ml de DMSO y 1 ml de agua, durante 48 horas, a temperatura ambiente. La matriz activada se lavó con 5 volúmenes de una mezcla de 10% de DMSO/90% de agua, 5 volúmenes de HCl 0,1 M y 10 volúmenes de agua. La concentración de grupos alilo se determinó mediante el método del agua de bromo anteriormente descrito. Se obtuvo una medida independiente de grupos alilo mezclando 1 g de la resina activada con 3 ml de agua y 100 \mul de ácido 3-mercaptopropiónico, a 60ºC, durante 4 horas. Esta resina derivatizada se lavó con 20 volúmenes de agua, 20 volúmenes de NaoH 0,1 M, 50 volúmenes de agua, 20 volúmenes de HCl 0,1 M y 100 volúmenes de agua, y se tituló con NaOH 0,1 M. Este método de titulación puede aplicarse también a las matrices activadas anteriormente descritas.

Ejemplo IV Unión de ligandos tiol

Una resina (5 g), producida según se ha descrito en los Ejemplos I ó III anteriores, se suspendió en 5 ml de solución tampón de fosfato 1 M (pH 7) y se hizo pasar una corriente de nitrógeno. Se añadieron un exceso 5 molar de un ligando (4MP, metimazol, o MD (disuelto en 5 ml de DMSO) o ácido tiosalicílico) y 0,1 g de borohidruro de sodio, y la mezcla se dejó reaccionar durante seis horas. Las resinas producidas mediante el método del Ejemplo I se mantuvieron a temperatura ambiente. Las resinas producidas mediante los métodos de los Ejemplos III ó IV se mantuvieron a 60ºC. La resina con tioéter resultante se lavó con 5 volúmenes de HCl 0,1 M, 10 volúmenes de agua, 5 volúmenes de NaOH 0,1 M y 20 volúmenes de agua. Una muestra (1 g) se tituló con HCl 0,1 M hasta pH 3,5 - 2,7 (pH final inferior para el ligando MB). Las resinas con ácido tiosalicílico se lavaron con NaOH, agua, HCl y agua, y se titularon con NaOH 0,1 M hasta pH 8.

Ejemplo V Unión de ligando de (Fenol) hidroxilo

La resina (5 g) producida según se ha descrito en el Ejemplo III, se mezcló con un exceso 10 molar de ácido hidroxifenilacético (preparado por disolución en 2 ml de agua y suficiente NaOH 1M para ajustar el pH a 11,5). La mezcla se hizo reaccionar durante veinticuatro horas a temperatura ambiente. La resina se lavó con 5 volúmenes de NaOH 0,1 M, 10 volúmenes de agua, 5 volúmenes de HCl 0,1 M y 20 volúmenes de agua. Una muestra (1 g) se tituló con NaOH 0,1 M hasta pH 8.

Pudo emplearse también ácido 4-hidroxibenzoico de un modo similar, excepto que el pH se ajusta a pH 11. Este compuesto así como también el ácido tiosalicílico son útiles para preparar ligandos adecuados para la recuperación de subtilisina.

Ejemplo VI Activación con CDI y uniones de ligando/brazo espaciador

Sepharose CL6B y celulosa Perloza fueron activadas con CDI y tituladas mediante métodos conocidos en la técnica. Se obtuvieron niveles de activación entre 1,0 y 3,5 mmol/g, usando 30 a 80 mg de CDI por g de Sepharose y 30 a 120 mg de CDI por g de celulosa.

Reactivos aminados solubles en dioxano [API, APM, histamina, AMB, 4AMP, 3AMP, 2AMP, DAH, tiramina (preparada a partir del hidrocloruro disolviendo en agua, ajustando el pH a 12 con NaOH 1 M y liofilizando) y dibromotiramina (preparada a partir de hidrocloruro de tiramina mediante métodos conocidos en la técnica) se hicieron reaccionar directamente con muestras de 110 gramos de matrices activadas con CDI solvatadas con dioxano (1 ml de agua se incluyó con los ligandos de tiramina). Se usó un exceso 5 molar de reactivo aminado excepto para el DAH que se empleó en exceso 10 molar. Se añadió dioxano (5 ml) y la resina se mezcló durante 24 horas a temperatura ambiente. Las resinas se lavaron con 3 volúmenes de dioxano al 75%, 2 volúmenes de dioxano al 33%, 10 volúmenes de agua, 2 volúmenes de HCl 0,1 M y después con 10 volúmenes de agua.

El ácido aminocaproico y la nitrotirosina (formas de sal sódica) no eran solubles en dioxano. Por tanto, se preparó una solución al 40% de aminocaproato sódico disolviendo 80 g de ácido aminocaproico en 64 ml de NaOH 10 M y agua suficiente hasta conseguir un volumen final de 200 ml. La celulosa activada solvatada con dioxano (300 g de resina + 150 ml de dioxano) y Sepharose (100 g de resina + 50 ml de dioxano) se mezclaron con 80 ml y 30 ml respectivamente de la solución de aminocaproato sódico durante 24 horas, a temperatura ambiente. Las resinas con aminocaproico fueron lavadas con 2 volúmenes de dioxano al 66%, 2 volúmenes de dioxano al 33% y 20 volúmenes de agua. De modo semejante, se disolvió nitrotirosina en agua y NaOH 3M para producir una solución al 15%, a pH 11,3. Celulosa activada (10 g), solvatada con dioxano al 50% se mezcló con 13 ml de solución de nitrotirosina, durante 24 horas, a temperatura ambiente.

Ejemplo VII Fijación de ligandos mediante uniones amida (reacciones de condensación) (a) Copulación de 100% de ligandos de aminas a grupos carboxilo de la resina

Un exceso 5 molar de ligando (4-AMP, 3-AMP, dimetilaminopropilamina o API) se ajustó a pH 4,7 con HCl 6 M y se mezcló con resina de aminocaproico (1,55 mmol/g). Se ajustó el pH a 4,7 con HCl 1M o NaoH 1M, según fuera apropiado y se mezcló con un exceso 3 M de carbodiimida soluble en agua (EDC, solución al 60% en agua). El pH se mantuvo en 4,7 durante 1 hora con HCl 1 M o NaOH 1 M, según fuera apropiado, y se mezcló durante otras 10 horas sin ajustar a temperatura ambiente. Se aplicó otro exceso 1 molar de EDC del mismo modo que anteriormente (1 + 10 horas). La resina se lavó con 10 volúmenes de agua, 2 volúmenes de HCl 0,1 M y 10 volúmenes de agua. Se copuló etanolamina a celulosa de nitrotirosina mediante el mismo método. No pudo detectarse grupos carboxilo residuales en estas resinas mediante métodos de titulación sensibles a 20 \mumol/g.

(b) Copulación parcial (50-80%) de ligandos aminados a grupos carboxilo de las resinas

Un exceso 1,5 molar de un ligando seleccionado entre APP, PPA, PEA o PALOL, se ajustó a pH 4,7 con HCl 6 M y se mezcló con resina de aminocaproico. El pH se mantuvo en 4,7 con HCl 1 M ó NaOH 1 M, según fuera apropiado, y se añadió un exceso 1, 5 M de EDC. El pH se mantuvo en 4,7 durante 1 hora seguido de mezcla durante 10 horas sin ajuste del pH, como se ha descrito anteriormente. La resina se lavó como se ha descrito anteriormente y se determinó mediante titulación el número de grupos carboxilo residuales.

c) Copulación del 100% de ligandos carboxilados con resinas de diaminohexano (1,24 mmol/g):

Este método es similar al apartado (a) anterior, pero el ligando (ácido 4-hidroxifenilacético, ácido 3-cloro-4-hidroxifenilacético ó ácido 3-nitro-4-hidroxibenzoico) se ajustó al pH con NaOH 1 M. El pH se mantuvo en 5, se usó celulosa con diaminohexano y un lavado con NaOH 0,1 M reemplazó al lavado con HCl. Para el ácido diclorosalicílico, se preparó una solución de la sal sódica mediante adición de NaOH 1 M a una suspensión del ácido (0,3 g) en agua, hasta que el pH fue estable en 7, y se liofilizó. La sal se disolvió en 10 ml de DMSO y se mezcló con etoxicarboniletoxidihidroquinolina (EEDQ), (0,5 g disueltos en 5 ml de etanol) y celulosa con diaminohexano solvatada con DMSO al 50%. La mezcla se agitó fuertemente durante 6 horas a temperatura ambiente. Se introdujeron otros 0,5 g de EEDQ y la reacción se continuó durante 18 horas. La resina se lavó con 5 volúmenes de DMSO, 2 volúmenes de DMSO al 50%, 10 volúmenes de NaOH 0,1 M y 10 volúmenes de agua. La copulación de grupos amino de la resina mediante estos métodos fue solamente de 80 a 90%. Los grupos amino residuales fueron bloqueados mediante métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, acetilación.

Ejemplo VIII Métodos de purificación de quimosina

Resinas producidas según se ha descrito en los Ejemplos II, III (usando 4AMP) y VI (usando 2AMP, 3AMP y 4AMP) fueron rellenadas en columnas desechables y equilibradas con tampón de carga A (pH 5,5; citrato 10 mM \pm NaCl 0,5 M). Muestras de quimosina fueron ajustadas al mismo pH y la misma fuerza iónica y se aplicaron a la columna. Los contaminantes sin fijar fueron retirados por lavado con tampón de carga en ambas fuerzas iónicas indicadas en este ejemplo usando los tampones A y B (30 volúmenes de columna cada uno). Las resinas fueron sometidas a elución con KCl 50 mM ajustado a pH 2 con HCl. La presencia de actividad de quimosina fue determinada cuantitativamente incubando una muestra de 200 \mul con 5 ml de leche sin desnatar fresca, a 37ºC, durante hasta 1 hora. Se detectó actividad solamente en la fracción de elución.

Resinas producidas tal como se ha descrito en el Ejemplo VI (PCC) y el Ejemplo VIIb, fueron rellenadas como anteriormente pero se equilibraron con un tampón de carga, B, (pH 4,4 y citrato 10 mM \pm NaCl 0,5 M). Las muestras de quimosina fueron ajustadas a estas condiciones de carga y aplicadas a la columna. Los contaminantes fueron separados por lavado con solución tampón de carga, B, como antes. Las resinas fueron sometidas a elución con citrato 20 mM, pH 6,2. Solamente se detectó actividad de quimosina en la fracción de elución.

Por contraste con los resultados de este ejemplo, resinas preparadas partiendo de una matriz similar y empleando DEAPA y APIMID no fijaron quimosina en altas fuerzas iónicas debido a que el equilibrio de la hidrofobicidad/hidrofilicidad y la carga no era adecuado. Estos resultados demuestran claramente la necesidad de una selección adecuada de la funcionalidad ionizable, el brazo espaciador y la matriz sólida de soporte, para efectuar tanto la fijación a un pH como la desorción a otro pH.

Ejemplo IX Capacidades de las resinas para la quimosina

El ensayo de la capacidad fue llevado a cabo mediante operaciones por cargas usando quimosina recombinante purificada. La quimosina fue dializada y liofilizada antes de su uso. Las soluciones tampón de carga usadas eran aquellas que contenían NaCl 0,5 M descritas en el Ejemplo VIII. La resina fue equilibrada con solución tampón de carga (5 volúmenes) y secada por succión. Una muestra de esta resina (2 - 4 g) fue pesada en una probeta de 10 ml, se suspendió en tampón de carga y se dejó sedimentar durante 48 horas (para determinar la relación de peso de resina:volumen). Otra muestra de la resina (0,1 - 0.15 g) se pesó en un vial de 25 ml y se mezcló con 25 mg de quimosina disuelta en 10 ml de solución tampón de carga, durante 1 hora, a 4ºC, en una rueda giratoria. El contenido del vial se hizo pasar cuantitativamente a una minicolumna de 2 ml, desechable, de Pierce, y se lavó con 10 ml de solución tampón de carga. La resina se sometió a elución con la solución tampón apropiada (según se ha descrito en el Ejemplo VIII) recogiendo el eluido en un matraz aforado de 10 ml. El eluído se analizó mediante absorbancia ultravioleta a 280 nanómetros y valoración de la proteína (usando el análisis de ácido bicincónico). Los resultados de la capacidad expresados en mg de proteína/ml de resina, se exponen en la Tabla 2 que figura a continuación.

TABLA 2

2

Ejemplo X Titulación de resinas hidrófobas ionizables positivamente

Una muestra de la resina (1 g, peso húmedo) que ha de titularse se lavó con NaOH 0,1 M y luego se enjuagó con agua. Después se suspendió la muestra en 9 ml de solución de NaCl 500 mM (o como se indica en la Tabla 3) y se tituló con HCl 0,1 N. Las cifras de titulación fueron corregidas para tener en cuenta los efectos de dilución, restando los valores de titulación obtenidos para un testigo de Perloza sin derivatizar. Los resultados de las titulaciones se indican en la Tabla 3.

TABLA 3

3

Ejemplo XI Titulación de resinas hidrófobas ionizables negativamente

Una muestra de la resina (1 g) en NaCl 0,5 M se ajustó a pH 12 con NaOH 1 M y luego se titulo hasta pH 3 con HCl 0,1 M. Las cifras obtenidas por la titulación fueron corregidas para tener en cuenta los efectos de la dilución, sustrayendo los valores de la titulación obtenidos para un testigo de Perloza sin derivatizar. Los resultados de la titulación se indican en la Tabla 4.

TABLA 4

4

Los resultados de las Tablas 3 y 4 ponen de manifiesto el intervalo de pH en que las resinas representativas que tienen una funcionalidad ionizable se convierten desde un estado sin cargar electrostáticamente en un estado cargado electrostáticamente. Los resultados obtenido ilustran que los expertos en la técnica pueden preparar y seleccionar diversas resinas con diferentes perfiles de ionización, permitiendo con ello el uso de una resina compatible con el compuesto considerado objetivo que haya de ser recuperado.

Ejemplo XII Capacidades de fijación, por cargas, de Subtilisina procedente de caldos de fermentación crudos, de la celulosa Perloza activada con CDI, que contiene ligandos de ácido aminocaproico

Celulosa Perloza fue activada con CDI y los ligandos de ácido aminocaproico fueron unidos de un modo similar al descrito en el Ejemplo VI anterior. Se prepararon del modo siguiente tres variaciones de la resina:

MG3 = Resina sin reticular en Perzola MT 100 Fine (diámetro 80-100 micrómetros; densidad de ligandos: 207 \mumol de ácido caproico/ml).

MG3a = Resina en Perzola MT 100 Fine reticulada con epiclorhidrina al 1% (densidad de ligandos: 225 \mumol/ml)

MG3b = Resina en Perzola MT 100 Medium Perzola (diámetro: 100-250 micrómetros; densidad de ligandos; 216 \mumol/ml).

El ensayo de capacidad se llevó a cabo mediante operación por cargas usando caldos de fermentación similares de Bacillus Subtilis. El ensayo de capacidad usando la resina MG3 empleó una variante de Bacillus Subtilis tal como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. Ser. No. 08/137.240, presentada el 14 de Octubre de 1993 e incorporada en esta memoria por referencia. El ensayo de capacidad realizado usando las resinas MG3a y MG3b empleó subtilisina obtenible en el comercio (subtilisina PURAFECT™ obtenible de Genencor International, Inc., South San Francisco, California, EE.UU.). En todos los casos, la subtilisina era el componente considerado objetivo. En todos los casos el caldo contenía también una gran variedad de compuestos extraños, incluyendo proteínas. La conductividad del caldo era 16 mmho. La separación de células crudas se llevó a cabo por centrifugación del caldo a 45.000 rpm en una centrífuga refrigerada Sorvall, durante 20 minutos, y usando solamente el sobrenadante.

4,0 g de la resina húmeda se equilibraron con una solución tampón de acetato sódico 50 mM a pH 5,2 hasta un volumen de 10 ml. El volumen sedimentado de la resina se registró antes del comienzo del experimento.

50 ml del caldo se ajustaron a pH 5,2 con ácido acético glacial. La cantidad de caldo representa un gran exceso de concentración de proteína sobre la capacidad de la resina y asegura que la concentración de proteína en la resina está en su máximo práctico. Al tiempo cero, 10 ml de solución tampón y resina fueron añadidos al caldo. Se añadió 1 ml adicional de agua para enjuagar el tubo de ensayo. La mezcla se agitó en un vaso de precipitados de peso conocido, con refrigeración, durante 3 horas. Al cabo de este tiempo, el sobrenadante se filtró a través de un embudo Buchner que contenía papel de filtro Whatman nº 47. El sobrenadante se pesó y se recogió una muestra de 0,5 ml.

La resina se enjuagó, se colocó de nuevo en el vaso de precipitados y se puso en contacto con menos de 100 ml de solución tampón de acetato 50 mM, pH 5,2, para separar los componentes de unión no selectivos. La etapa de lavado tardó 25-30 minutos. Esta solución se filtró otra vez y se recogió una muestra. Las muestras de unión y las fracciones de lavado fueron analizadas para determinar su actividad. La Tabla 5 que figura a continuación, ilustra que después de lavar, todas las resinas tenían una capacidad muy alta para la subtilisina existente en el caldo que había sido tratado mínimamente antes de realizar la carga.

TABLA 5

5

Ejemplo XIII Recuperación de subtilisina desde un caldo de fermentación crudo usando celulosa Persoa activada con CDI que contenía ligandos de ácido aminocaproico, en una columna de flujo radial

La resina reticulada MG3a descrita en el Ejemplo XII fue preparada según se ha descrito en el Ejemplo VI.

Una columna de cromatografía de flujo radial, de 50 ml, (Sepragen Corp., San Leandro, California) se rellenó con la resina y se usó para efectuar la recuperación de subtilisina desde un caldo de fermentación de Bacillus subtilis, según se describe a continuación.

Tratamiento del caldo

El caldo total se centrifugó durante 30 minutos en una centrífuga Sorvall enfriada, a 4.500 rpm. La conductividad del centrifugado se ajustó a pH 5,2 usando ácido acético glacial. No se hicieron diluciones. La conductividad del caldo era 20 mmho. La subtilisina era el compuesto considerado objetivo y el caldo contenía también una gran variedad de compuestos extraños, incluyendo proteínas.

6

460 ml de caldo centrifugado se cargaron en la columna a pH 5,2 y una conductividad de 20 mmho. La columna fue sobrecargada a propósito con objeto de estimar la capacidad dinámica, por lo que era de esperar enzimas en exceso en las fracciones de flujo a través de la columna y en las fracciones de lavado. El flujo a través de la columna fue de 10 ml/minuto. La columna se lavó a 15 ml/minuto hasta que la absorbancia en el ultravioleta cayó por debajo del 15% de la escala total. Esto requirió 61 volúmenes de la columna, de solución tampón de lavado. La columna se sometió a elución sobre 16 volúmenes de la columna, a 5 ml/minuto. Después del lavado, la capacidad de la resina para la subtilisina era de 31 mg/ml. La presión en toda la operación fue inferior a 28 kPa.

La proteína fue eluída aumentando el pH y la conductividad empleando la solución tampón de elución anteriormente indicada,. Se recuperó el 94% de la proteína fijada. Se recogieron fracciones de elución de 0,5 ó 0 1 volúmenes de columna, y la concentración de proteína (subtilisina) por fracción recogida se ilustra en la Figura 8. La concentración máxima de las fracciones fue de 17,4 mg/ml y el 90% de la proteína recuperada eluyó dentro de 3 volúmenes de columna.

Este procedimiento pone de manifiesto una captura de subtilisina sencilla y de alta capacidad, a partir de un caldo de fermentación, con tratamiento preliminar mínimo del caldo. La recuperación cuantitativa en un pico de elución concentrado, estrecho, es posible también con este procedimiento.

Siguiendo los procedimientos operatorios anteriormente expuestos con la modificación de cargar menos proteína y usar una etapa de lavado más corta, este compuesto puede ser recuperado con un alto rendimiento global. El uso de propilenglicol en la solución tampón de elución sirve de ayuda, pero no es necesaria para conseguir la elución completa. Este procedimiento operatorio puede, asimismo, ser modificado con facilidad para permitir la recuperación de otros compuestos considerados objetivo.

Será evidente para una persona de habilidad ordinaria en la técnica que pueden realizarse diversos cambios y modificaciones de naturaleza obvia, sin apartarse del alcance de la invención, que se expone en la reivindicaciones que siguen.

Claims

1. Una resina para fijar un compuesto considerado objetivo, cuya resina comprende:

: una matriz sólida de soporte, y

: ligandos seleccionados o mezclas de ligandos seleccionados enlazados covalentemente a la matriz de soporte,

: caracterizada porque

: la resina comprende ligandos ionizables o mezclas de ligandos ionizables comprendiendo los ligandos ionizables un brazo espaciador y al menos una funcionalidad ionizable, cuya funcionalidad está unida a la matriz a través del brazo espaciador;

: la densidad de los ligandos ionizables sobre la matriz sólida de soporte es mayor que la menor de al menos aproximadamente 150 \mumol por mililitro de resina y al menos aproximadamente 1 mmol por gramos de peso seco de resina; y

: la funcionalidad ionizable, seleccionada con relación a la matriz sólida de soporte y el compuesto considerado objetivo, se carga parcialmente electrostáticamente en el pH de fijación del compuesto a la resina y o bien se carga además electrostáticamente o se carga en una polaridad diferente en un segundo pH en comparación con la carga en un primer pH;

de tal modo que el carácter hidrófobo de la resina es suficiente para fijar ak menos el 50% del compuesto considerado objetivo existente en un medio acuoso con fuerza iónica alta y baja en el primer pH y el carácter hidrófilo y/o electrostático de la resina en el segundo pH es suficiente para desorber el compuesto fijado,

en donde "parcialmente cargada electrostáticamente" significa que más del 5% a menos del 100% de las funcionalidades ionizables son cargadas.

2. La resina según la reivindicación 1, en la que dicha resina comprende, opcionalmente, ligandos no ionizables seleccionados enlazados covalentemente a la matriz de soporte sólida y, además, en la que el porcentaje de ligandos no ionizables basado en el total de ligandos ionizables y no ionizables varía desde aproximadamente 0 hasta
80%,

seleccionándose el ligando no ionizable con relación al ligando ionizable y la matriz sólida de soporte de tal modo que el carácter hidrófobo de la resina es suficiente para fijar al menos el 50% del compuesto considerado objetivo existente en un medio acuoso con fuerza iónica alta y baja, en un primer pH, y estando seleccionado, además, con relación a la matriz sólida de soporte de tal modo que el carácter hidrófilo y/o electrostático de la resina en un segundo pH es suficiente para desorber en dicho segundo pH el compuesto fijado.

3. La resina según la reivindicación 1, en la que la carga electrostática sobre la resina en el pH de desorción del compuesto desde la resina, tiene la misma polaridad que la carga electrostática neta sobre el compuesto considerado objetivo, en este pH.

4. La resina según la reivindicación 1, en la que la carga electrostática sobre la resina en el pH de desorción del compuesto desde la resina, tiene polaridad opuesta a la carga electrostática neta sobre el compuesto considerado objetivo, en este pH.

5. La resina según la reivindicación 1, en la que dicho grupo funcional ionizable se selecciona entre el grupo que consta de grupos carboxilo, amino y fenólico.

6. La resina según la reivindicación 2, en la que el porcentaje de ligandos no ionizables enlazados a la matriz sólida de soporte, basado en el total de ligandos ionizables y no ionizables, varía desde más de 0% hasta aproximadamente 40%.

7. La resina según la reivindicación 1, en la que la matriz de soporte sólida está reticulada.

8. La resina según la reivindicación 1, en la que la matriz sólida de soporte es no ionizable.

9. La resina según la reivindicación 1, en la que la matriz sólida de soporte comprende funcionalidad ionizable dentro de su cadena principal.

10. La resina según la reivindicación 1, en la que dicho compuesto considerado objetivo es una proteína o un péptido.

11. La resina según la reivindicación 10, en la que dicha proteína o péptido está seleccionado entre el grupo que consta de quimosina y subtilisina.

12. La resina según la reivindicación 1, en la que la densidad de ligandos es al menos, aproximadamente 150 \mumol por mililitro de resina.

13. La resina según la reivindicación 1, en la que la densidad de ligandos es al menos, 1 mmol por gramos de peso seco de resina.

14. Un método para separar un compuesto considerado objetivo desde un medio acuoso que comprende el compuesto considerado objetivo, cuyo método comprende poner en contacto el medio con una resina según la reivindicación 1, en condiciones adecuadas para fijar a la resina al menos el 50% del compuesto considerado objetivo, incluyendo el ajuste del pH del medio.

15. El método según la reivindicación 14, en el que dicho compuesto considerado objetivo es una proteína o un péptido.

16. El método según la reivindicación 15, en el que dicha proteína o péptido se selecciona entre el grupo que consta de quimosina y subtilisina.

17. Un método para fijar y recuperar un compuesto considerado objetivo desde un medio acuoso que comprende el compuesto considerado objetivo, cuyo método comprende:

a): poner en contacto el medio con una resina según la reivindicación 1, en condiciones adecuadas para fijar a la resina al menos el 50% del compuesto considerado objetivo;

b): separar la resina que contiene fijado el compuesto considerado objetivo, de los otros componentes del medio, produciendo un complejo de resina-compuesto; y

c): desorber desde el complejo el compuesto considerado objetivo, fijado, poniendo en contacto el complejo con un eluyente que posee un pH suficientemente diferente del pH del medio citado en a) anterior, de tal modo que el compuesto considerado objetivo se desorbe desde la resina.

18. El método según la reivindicación 17, en el que dicho compuesto considerado objetivo es una proteína o un péptido.

19. El método según la reivindicación 18 en el que dicha proteína o dicho péptido se selecciona entre el grupo que consta de quimosina y subtilisina.

20. El método según la reivindicación 17, en el que el medio acuoso se pone en contacto con la resina en un proceso por cargas, con agitación.

21. El método según la reivindicación 17 en el que el medio acuoso se pone en contacto con la resina en una columna cromatográfica.

22. El método según la reivindicación 22, en el que la columna es una columna de flujo radial.

23. El método según la reivindicación 21, en el que la columna es un lecho fluidizado expandido.

24. El método según la reivindicación 17, en el que la densidad de ligandos es al menos 150 \mumol por mililitro de resina, aproximadamente.

25. El método según la reivindicación 17, en el que la densidad de ligandos es al menos 1 mmol por gramo de peso seco de resina.

26. Una resina según la reivindicación 1,

en la que dicha funcionalidad ionizable se deriva de un compuesto seleccionado entre el grupo que consta de 4-(aminometil)piridina, 3-(aminometil)piridina, 2-(aminometil)piridina, 1-(3-aminopropil)-imidazol, 2-(aminometil)-bencimidazol, 4-(3-aminopropil)morfolina, halotriaminas que tienen de 1 a 2 grupos halo seleccionados entre el grupo que consta de fluoro, cloro, bromo y yodo, ácido 4-aminobutírico, (1S, 2S)-(+)-2-amino-1-fenil-1,3-propanodiol,
(-)-fenilpropanolamina, feniletilamina, fenilalaninol, 4-(2-aminoetil)bencenosulfonamida, DL-\beta-hidroxifeniletilamina, ácido tiosalicílico, 2-mercapto-1-metilimidazol, 2-mercaptobencimidazol, 4-mercaptoetilpiridina, 2-mercaptoetilpiridina, ácido 4-mercaptobutírico, ácido 5-mercaptovalérico, ácido 6-mercaptohexanoico, 4-hidroxtiofenol, ácido 4-hidroxibenzoico, ácido 4-hidroxifenilacético, ácido3-clorohidroxifenilacético, ácido 3,5-diclorosalicílico, ácido 4-hidroxi-3-nitrobenzoico, 3-nitrotirosina, halotirosinas que tienen de 1 a 2 grupos halo seleccionados entre el grupo que consta de fluoro, cloro, bromo y yodo, e hidrazida del ácido para-hidroxibenzoico.

27. La resina según la reivindicación 26, en la que dicha funcionalidad ionizable se deriva de un compuesto seleccionado entre el grupo que consta de4- (aminometil)piridina, 3-(aminometil)piridina, 2-(aminometil)piridina, 1-(3-aminopropil)-imidazol, 2-(aminometil)-bencimidazol y 4-(3-aminopropil)morfolina.

28. Una resina según la reivindicación 1,

en la que dicha funcionalidad ionizable se deriva de un compuesto seleccionado entre el grupo que consta de ácido aminocaproico 2-mercaptopiridina, 4-mercaptopiridina, aminoetilbencenosulfonamida, tiramina, tirosina e histidina.

29. la resina según la reivindicación 1, en la que "parcialmente cargada electrostáticamente" significa que más del 5% hasta aproximadamente el 40% de las funcionalidades ionizables están cargadas.