MXPA96006617A - Resinas hidrofobicas con grupos ionizables para cromatografia - Google Patents

Abstract

Se describen resinas, complejos de resinas-proteínas/péptidos y los métodos para purificar proteínas y péptidos usando dichas resinas. Las resinas descritas aquísonútiles para el enlace de la proteína o péptido seleccionado, particularmente a partir de un medio acuoso, asícomo un caldo de fermentación, por interacciones hidrofóbicas entre las resinas y la proteína o péptido seleccionado, la resina se caracteriza por el hecho de que contiene ligandos y/o funcionalidades ionizable, los cuales no están cargados al pH de enlace de la proteína o el péptido objetivo, asípara facilitar las interacciones hidrofóbicas y cargas al pH de desorción, en consecuencia destruyen las interacciones hidrofóbicas establecidas entre la resina y la proteína o péptido objetivo. Muy particularmente, la presente invención estádirigida al uso de las resinas descritas en la purificación o recombinación de los productos recombinantes de enzimas tales como proteasas, por ejemplo, quimosin o substilisna.

Description

RESINAS HIDROFOBICAS CON GRUPOS IONIZABLES PARA CROMATOGRAFÍA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la invención Esta invención describe los complejos de resinas para cromatografía con proteínas y péptidos y los métodos para purificar las proteínas y los péptidos usando tales resinas. En particular, las resinas para cromatografía descritas aquí son útiles para el enlace de proteínas y péptidos seleccionados, particularmente de un medio acuoso tales como los caldos de fermentación, por interacciones hidrofóbicas entre la resina y la proteína o el péptido objetivo. La resina se caracteriza por el hecho de que contiene funcionalidades ionizables las cuales están electrostáticamente sin carga al pH de enlace con la proteína o el péptido objetivo, de tal manera que facilita las interacciones hidrofóbicas, y cargado al pH de desorción, por lo tanto rompe la interacción hidrofóbica establecida entre la resina y la proteína o el péptido objetivo.

REF: 23730 Referencias: Las siguientes referencias están referidas en la especificación como los números en [ ] : 1 Ochoa, J.L. "Hidrophobic (interaction) chromatography", Biochimie, 60: 1-15(1978). 2 Yon, R.J., et al., "Protein Chromatography on Adsorbents with Hydrophobic and Ionic Groups", Biochem j . , 151:281-290 (1975). 3 Yon R.J., "Chromotography of Lipophilic Proteins on Adsorbents Containing Mixed Hydrophobic and Ionic Groups", Biochem j . , 126:765-767 (1972). 4 Hoftsee, B.H.J., "Hidrophobic Affinity Chomatography of Proteins", Anal. Biochem. 52:430- 448 (1973).

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La publicación de cada una de las referencias anteriores está incorporada por una referencia en su totalidad al mismo grado como si cada una de las referencias estuvieran individualmente incorporadas como referencia.

Estado del Arte En años recientes, algunas técnicas han sido desarrolladas y/u optimizadas para efecto de la separación y purificación de una proteína o un péptido seleccionado de una mezcla acuosa. El desarrollo de tales técnicas corresponde, en parte, al crecimiento del desarrollo recombinante de microorganismos los cuales han sido genéticamente modificados para expresar una proteína o un péptido en un caldo de fermentación. Tales caldos, están caracterizados por contener no solamente la proteína o el péptido objetivo sino también una variedad de otras proteínas o péptidos expresados por tales microorganismos así como otros contaminantes incluyendo, como ejemplo, células completas donde las proteínas o péptidos objetivos están expresadas extracelularmente y los fragmentos celulares en esos casos en donde la proteína o péptido objetivo está intracelularmente expresado y la lisis de la célula se requiere para extraer la proteína o el péptido objetivo dentro de la solución acuosa.

Las técnicas de separación o purificación aquí empleadas con proteínas/péptidos incluyen, como ejemplo, cromatografía por intercambio iónico, cromatografía por interacción hidrofóbica, cromatografía por afinidad, y otras similares. La multiplicidad de tales técnicas de cromatografía reflejan la dificultad para efectuar la separación y/o purificación sin desnaturalizar la proteína o péptido seleccionado mientras minimiza la complejidad del procedimiento de separación y purificación y cada una de las técnicas citadas anteriormente sufren de una o más desventajas limitando su amplio uso a escala industrial.

Por ejemplo, en cromatografía de intercambio iónico, un buen enlace entre la resina y la proteína o el péptido requiere de que la solución de la proteína o el péptido primero sea desalada primero por dilución, diálisis, diafiltración o filtración por gel. Adicionalmente, para efecto de remover la proteína o el péptido de la resina, la solución acuosa conteniendo una concentración alta de sal se pone en contacto típicamente con la resina.

En cromatografía de interacción hidrofóbica (CIH) , la resina idealmente no tiene carga y el enlace se debe solamente a las interacciones hidrofóbicas. Para efecto del enlace entre la proteína o el péptido a tales resinas, la solución de la proteína o el péptido es típicamente de alta fuerza iónica [1] . Grandes cantidades de sal tales como sulfato de amonio o cloruro de sodio a molaridades mayores de 1 molar son adicionadas típicamente a la solución de la proteína o el péptido para alcanzar el requisito de alta fuerza iónica. Después del enlace, la proteína o el péptido enlazado se recuperan típicamente por desalación.

Las técnicas de cromatografía que involucran salado y desalado de las soluciones de la proteína o el péptido requieren el uso de grandes cantidades de reactivos para efecto de recuperación a un nivel industrial y pueden necesitar de un procesamiento substancial. Por consiguiente, la cromatografía por interacción hidrofóbica y la cromatografía por intercambio iónico no son las más eficientes y los métodos efectivos de costo para recuperar y/o purificar cantidades industriales de una proteína o un péptido de un caldo de fermentación u otros medios acuosos.

Similarmente, el uso de cromatografía por afinidad para efecto de separación y/o purificación de una proteína o un péptido se limita en alcance debido a las condiciones del riguroso proceso requeridas, el bajo resultado y el alto costo de esta técnica. Por consiguiente, este proceso típicamente no es responsable para la eficiente recuperación de cantidades industriales de la proteína o el péptido de un caldo de fermentación o de un medio acuoso.

Esta invención está dirigida para el uso específico de resinas para cromatografía las cuales permiten la sorprendente y eficiente recuperación a gran escala y/o la purificación de las proteínas o los péptidos del medio acuoso incluyendo los caldos de cultivo. Las resinas empleadas aquí se caracterizan porque comprenden una matriz de soporte sólido y ligandos covalentemente adheridos a ella donde la resina está electrostáticamente sin carga al pH donde la proteína o el péptido objetivo se eluye desde la resina. La resina aquí descrita es más adelante caracterizada por ser capaz de enlazar la proteína o el péptido objetivo de una solución manteniendo tanto un pH alto como una baja fuerza iónica.

En una modalidad preferida, la carga electrostática inducida sobre la resina al pH donde la proteína o el péptido objetivo se desabsorbe de la resina y está a la misma polaridad que la carga neta electrostática sobre la proteína o el péptido objetivo al pH de desorción. En esta modalidad, la desorción se alcanza por repulsiones carga-carga las cuales compensan el carácter, "del enlace hidrofóbico de la resina. En otra modalidad, la carga electrostática inducida es de una polaridad opuesta de la de la proteína objetivo. En cualquiera de las modalidades, la desorción puede facilitarse por el uso de eluyentes de alta fuerza iónica o por el uso de un agente de polaridad reducida, tal como el propilen glicol.

Los complejos de resina-proteína/péptido de esta invención contrastan con los complejos de resina-proteína/péptido hasta aquí descritos por la característica de que la resina no está cargada electrostáticamente al pH del enlace de la proteína y cargada al pH de la desorción. Específicamente, en el caso de las resinas CIH, los grupos cargados han sido deliberadamente introducidos [2,3] para debilitar los fuertes enlaces de la larga* cadena de alquilo (hidrofóbica) , resinas Sefarosas, y permiten condiciones de desorción más favorables. Estas matrices contienen enlaces de isourea cargadas positivamente y grupos carboxilos cargados negativamente y contendrán funcionalidad cargada a todos los pHs .

Una resina de carboxilo poliestireno (Amberlita) ha sido también utilizada para el enlace de proteína por interacciones hidrofóbicas [8,9] . Aunque se dice es en una forma sin carga a pHs menores de 4.5 [8,9] los experimentos de titulación han mostrado que estas matrices están sin carga a pHs menores de 3. En este sistema, las proteínas fueron enlazadas a un pH de aproximadamente 4.5 y eluidas por un incremento de pH, el cual posteriormente se desprotona y carga los grupos de la matriz carboxilo y debilita la hidrofobicidad. En algunos casos, esto causa repulsión electrostática cuando la proteína pasa por diferentes puntos isoeléctricos. Este método es útil solo en un rango de pH estrecho [9] .

También expuestas están las resinas las cuales están cargadas positivamente con grupos de isourea [4,5]. Estas matrices están hidrofóbicamente débiles y típicamente requieren interacciones electrostáticas e hidrofóbicas para enlace de una proteína o un péptido a la resina. Más aún, el grupo cargado en estas resinas está cerca a la matriz de soporte sólido no a la superficie de la resina y un cambio de pH no se utiliza para desorción de la proteína o el péptido de la resina. La desorción de las proteínas o los péptidos de la columna ha sido demostrado que es más fácil cuando la resina utilizada está cargada que cuando no está cargada [6] . Los grupos cargados no fueron encontrados para limitar la capacidad de adsorción mientras facilitan la desorción de las resinas de fenilbutilamina [7] . La adsorción fue atribuida a las interacciones hidrofóbícas . El uso de la funcionalidad cargada para enlazar y luego desabsorber las proteínas o péptidos de la resina típicamente ocasiona, sin embargo, ajustes en las fuerzas iónicas de la solución tanto antes de enlazar o para efecto de desorción. Tales ajustes no son consistentes con un proceso eficiente para efecto de recuperación de la proteína o el péptido y/o de su purificación.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN Esta invención relata los complejos de las resinas con proteínas y péptidos y los métodos de purificación de las proteínas o los péptidos objetivos utilizando tales resinas. Las resinas descritas aquí tienen una funcionalidad ionizable y una matriz de soporte sólido donde la resina no está cargada electrostáticamente al pH de la proteína o el péptido objetivo enlazado a la resina y electrostáticamente cargado a pH de desorción. Debido a la falta de carga sobre la resina al pH de enlace, se pueden evitar las dificultades y/o complejidades asociadas con, por ejemplo, las resinas de intercambio iónico.

En vista de lo anterior, en uno de sus aspectos de composición, esta invención está dirigida al complejo resina-proteína/péptido el cual .comprende una resina y una proteína o un péptido enlazado a esta donde se dice que la resina comprende a) una matriz de soporte sólido; y b) un ligando ionizable seleccionado covalentemente unido a la matriz donde el ligando ionizable está seleccionado de tal forma que la resina está electrostáticamente no cargado al pH donde la proteína o el péptido está enlazado a la resina y está electrostáticamente cargado al pH donde la proteína o el péptido está desabsorbido de la resina y donde más adelante cerca del 40 por ciento o más y preferentemente 50 por ciento o más de la proteína o el péptido objetivo en un medio acuoso se enlaza a la resina cuando el medio acuoso tiene una fuerza iónica tanto alta como baja.

En otros de sus aspectos de composición, esta invención está dirigida al complejo resina-proteína/péptido el cual comprende una resina y una proteína o un péptido objetivo enlazada a esta donde dicha resina comprende a) una matriz de soporte sólido teniendo una funcionalidad ionizable seleccionada incorporada dentro de la columna de ella donde la funcionalidad ionizable está seleccionada de tal manera que la resina no está cargada electrostáticamente al pH donde la proteína o el péptido objetivo está enlazado a la resina y está cargada electrostáticamente al pH donde la proteína o el péptido objetivo se desabsorbe de la resina; y b) un ligando no ionizable covalentemente ligado a ella, donde cerca del 40 por ciento o más preferentemente 50 por ciento o más de la proteína o el péptido objetivo en un medio acuosos se enlaza a la resina cuando el medio acuoso tiene una fuerza iónica tanto alta como baja.

En una modalidad, la carga electrostática inducida sobre la resina en el complejo resina-proteína/péptido es de la misma polaridad que la carga neta electrostática sobre la proteína o el péptido objetivo al pH de la desorción. En esta modalidad, la desorción se facilita por las repulsiones carga-carga entre la resina y la proteína o el péptido objetivo.

En otra modalidad, la carga electrostática inducida sobre la resina en el complejo de resina-proteína/péptido es de una polaridad opuesta a la de la de carga neta electrostática en la proteína o péptido objetivo al pH de desorción. En esta modalidad, puede facilitarse, por ejemplo, el uso de una solución de desabsorbente de alta fuerza iónica o el uso de un agente reductor de polaridad, tal como el propilenglicol.

En uno de sus aspectos del método, esta invención está dirigida a un método para separar una proteína o un péptido objetivo de un medio acuoso que comprende la proteína o el péptido objetivo dicho método comprende poner en contacto al medio con la resina como se describe anteriormente al pH donde la resina está electrostáticamente no cargada y bajo condiciones suficientes para permitir que la proteína o el péptido se enlace a la resina donde cerca del 40 por ciento o más y preferentemente 50 por ciento o más de la proteína o el péptido objetivo en el medio acuoso se enlaza a la resina cuando el medio acuoso tiene una fuerza iónica ya sea alta o baja.

En otro de sus aspectos del método, esta invención está dirigida a un método para enlazar y recuperar una ~ proteína o un péptido de un medio acuoso comprendiendo una proteína o un péptido objetivo el cual comprende: 5 a) el contacto con el medio con una resina como se describió anteriormente al pH donde la resina está electrostáticamente no cargada y bajo condiciones suficientes para permitir que la proteína o péptido 10 objetivo se enlace a la resina donde cerca del 40 por ciento o más y preferentemente 50 por ciento o más de la proteína o el péptido objetivo en el medio acuoso se enlaza a la resina cuando el medio acuoso tiene una fuerza iónica ya sea alta o baja. 15 b) la separación de la resina conteniendo la proteína o el péptido objetivo enlazado de los otros componentes del medio para producir un complejo resina- proteína/péptido; y 20 c) la desabsorción de la proteína o el péptido objetivo enlazado del complejo por contacto del complejo con una solución de desabsorción teniendo un pH el cual induce una carga electrostática sobre la resina donde la carga inducida es de la misma polaridad que la carga neta sobre la proteína o el péptido objetivo al pH del eluyente .

Aún en otro de los aspectos de su método, esta invención está dirigida a un método para enlazar y recuperar una proteína o un péptido de un medio ' acuoso comprendiendo una proteína o un péptido objetivo el cual comprende: a) el contacto con el medio con una resina como se describió anteriormente al pH donde la resina está electrostáticamente no cargada y bajo condiciones suficientes para permitir que la proteína o péptido se enlace a la resina donde cerca del 40 por ciento o más y preferentemente 50 por ciento o más de la proteína o el péptido objetivo en el medio acuoso se enlaza a la resina cuando el medio acuoso tiene una fuerza iónica tanto alta como baja. b) la separación de la resina conteniendo la proteína o el péptido objetivo enlazado de los otros componentes del medio para producir un complejo resina-proteína/péptido; y c) la desabsorción de la proteína o el péptido objetivo enlazado del complejo por contacto del complejo con una solución de desabsorción teniendo un pH el cual induce una carga electrostática sobre la resina donde la carga inducida es de polaridad opuesta de la carga neta sobre la proteína o el péptido objetivo al pH de la solución de desabsorción. Es esta modalidad, la desorción puede facilitarse, por ejemplo, el uso de una solución de desabsorción de alta fuerza iónica.

En cualesquiera de las modalidades del método, el uso del agente de polaridad reducida, tal como el propilenglicol, puede facilitar la desabsorción.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra el ligando unido a las matrices activadas de diimidizol carbonilo (CDI) .

La Figura 2 ilustra el acoplamiento de la carbodiimida del ligando a los grupos carboxilos de la matriz .

La Figura 3 ilustra los soportes del ácido CID-caproico.

La Figura 4 ilustra posibles productos de la condensación (reacción) de una amina con la matriz del ácido CID-caproico.

La Figura 5 ilustra la reacción de un tiol con matrices activadas epoxy.

La Figura 6 ilustra la reacción de una amina con una matriz activada epóxido.

La Figura 7 ilustra la estructura de algunas resinas útiles en la presente invención.

Las Figuras 8A-8K ilustran algunas configuraciones para las resinas descritas aquí.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Esta invención está dirigida, en parte, a un método racional para recuperación de una proteína o un péptido (aquí después referida colectivamente como "proteína") de un medio acuoso utilizando resinas. Los métodos de esta invención involucran la selección de una resina para uso en la recuperación cromatográfica de una proteína o un péptido objetivo en la cual la resina está electrostáticamente no cargada al pH donde la proteína o el péptido objetivo está enlazado a la resina y está electrostáticamente cargada al pH donde la proteína o el péptido objetivo se desabsorbe de la resina y más adelante donde cerca del 50 por ciento o más de la proteína o el péptido objetivo en el medio acuoso se enlaza a la resina cuando el medio acuoso tiene una fuerza iónica tanto alta como baja.

En una de las modalidades, un ligando ionizable está covalentemente unido a la matriz de la resina donde la funcionalidad ionízable del ligando ionizable se selecciona para ser electrostáticamente no cargado al pH de la proteína objetivo enlazada a la resina y cargada al pH de la desorción de la proteína objetivo a partir de la resina. Esto implica, por supuesto, que el proceso de selección está hecho relativo a las propiedades de la proteína objetivo tales como su pl, estabilidad, etc. de tal manera que los pHs donde la funcionalidad ionizable está no cargada/cargada que corresponde a un rango de pH donde la proteína objetivo está suficientemente estable, etc. Cualesquiera capacitado en el arte puede rápidamente acertar tales parámetros basados en las enseñanzas aquí mostradas.

En un aspecto preferido de esta modalidad, el proceso de selección se extiende para incluir la selección de la matriz de soporte sólido empleada en la conjunción con el ligando ionizable y la densidad de tales ligandos sobre la matriz donde la selección se hace relativa al grado de hidrofobicidad requerida para toda la resina a los pHs de -c enlace y desorción de la proteína objetivo de la resina. En este aspecto, la matriz de soporte sólido puede ser 5 una funcionalidad tanto libre como ionizable o puede contener una funcionalidad ionizable la cual está electrostáticamante no cargada al pH de la proteína objetivo enlazada y electrostáticamente cargada al pH de la desorción de la proteína objetivo. Adicionalmente, el 10 ligando ionizable puede opcionalmente comprender un brazo espaceador el cual, si se emplea, se selecciona para proporcionar más adelante control sobre la hidrofobicidad a los pHs de la proteína enlazada y de la desorción.

En otra de las modalidades, una matriz de soporte sólido teniendo uno o más funcionalidades ionizables seleccionadas incorporadas dentro de la columna de ella y ligandos no ionizables unidos a ella, se emplea para recuperar la proteína objetivo a partir del medio acuoso.

En esta modalidad, la funcionalidad ionizable se selecciona de tal manera para estar electrostáticamente no cargada al pH de la proteína objetivo enlazada a la resina y electrostáticamente cargada al pH de desorción de la proteína objetivo a partir de la resina. Esto implica, por supuesto, que la selección se hace relativa a las propiedades de la proteína objetivo tales como su pl, estabilidad, etc. de tal manera que los pHs donde la funcionalidad ionizable está no cargada/cargada corresponde a un rango de pH donde la proteína objetivo está suficientemente estable, etc. Cualesquiera capacitado en el arte puede rápidamente acertar tales parámetros basado en las enseñanzas aquí mostradas.

En un aspecto preferido de esta modalidad, el proceso de selección se extiende para incluir la selección de uno o más ligandos no ionizables relativos al grado de hidrofobicidad requerido para toda la resina a los pHs de enlace y desorción. Por ejemplo, un ligando no ionizable más hidrofóbico puede a menudo ser utilizado para incrementar el enlace, si el enlace necesita incrementarse, mientras un ligando no ionizable menos hidrofóbico a menudo puede utilizarse para incrementar la desorción o disminuir la ligadura no específica si tal se requiere. Adicionalmente el ligando no ionizable puede opcionalmente comprender un brazo espaciador para enlazar el ligando no ionizable a la matriz la cual, cuando se emplea, se selecciona para proporcionar más adelante control sobre la hidrofobicidad a los pH's de adsorción y desorción.

En cualquier caso, haciendo la apropiada selección para cada uno de los componentes de la resina, el grado de hidrofobicidad de la resina al pH de enlace de la proteína objetivo puede racionalmente seleccionarse para incrementar la eficiencia de enlace y/o incrementar la especificidad de enlace de la proteína o el péptido objetivo a la resina. Del mismo modo, el grado de hidrofobicidad al pH de la desorción de la proteína objetivo a partir de la resina, incluyendo aquella surgida a partir de la carga inducida, puede ser racionalmente seleccionada así como para asegurar la propia desorción de la proteína objetivo a partir de la resina.

Antes de describir esta invención en más detalle, primero serán definidos los siguientes términos.

Definiciones El término "matriz de soporte sólido" o "matriz sólido" se refiere al material sólido de la columna de la resina el cual contiene una funcionalidad reactiva que permite la unión covalente del ligando a ella. El material de la columna puede ser inorgánico (p. ej . , sílica) u orgánico. Cuando el material de la columna es orgánico, es preferentemente un polímero sólido y polímeros orgánicos adecuados bien conocidos en el arte . Las matrices de soporte sólido adecuadas para utilizarse en las resinas descritas aquí incluyen, por ejemplo, celulosa, celulosa regenerada, agarosa, sílica, sílica recubierta, dextrana, polímeros (tales como poliacrilatos, poliestireno, poliacrilamida, polimetilacrilamida incluyendo loa polímeros comercialmente disponibles tales como Fractogel, Enzacryl, y Azlactone) , copolímeros (tales como copolímeros de estireno y divinilbenceno) , mezclas de ellas o similares. También, co-, ter- y polímeros superiores pueden ser utilizados proporcionando por lo menos uno de los monómeros que contenga o pueda ser derivado para contener una funcionalidad reactiva en el polímero resultante.

Las funcionalidades reactivas de la matriz de soporte sólido permiten ligaduras co'valentes del ligando y son bien conocidas en el arte. Tales grupos incluyendo hidroxilo (p. ej . , Si-OH) , carboxilo, tiol, amino, y similares. La química convencional permite el uso de estos grupos funcionales para ligar covalentemente ligandos a ellos. Adicionalmente, la química convencional permite la inclusión de tales grupos sobre la matriz de soporte sólido. Por ejemplo, los grupos carboxilo, pueden ser incorporados directamente empleando ácido acrílico o un éster de ellos en el proceso de polimerización. En la polimerización, los grupos carboxilo están presentes sí se utiliza el ácido acrílico o el polímero puede ser derivado para contener grupos carboxilo sí se emplea un éster de acrilato.

El término "ligando ionizable" se refiere a un grupo covalentemente ligado a la matriz de soporte sólido tanto directamente como a través de un brazo espaciador cuyo grupo contiene uno o más funcionalidades capaces de ser electrostáticamente cargadas a un pH y electrostáticamente no cargadas a otro pH. Los ligandos ionizables adecuados incluyen por ejemplo, grupos aminos, grupos fenólicos, grupos carboxilos, grupos histidilos, grupos piridilos, grupos anilinos, grupos morfolinilos, grupos imidazolilos, y similares. Los sustituyentes pueden ser incluidos en ligandos sustituibles para el propósito de modificar el pH al cual estos ligandos serán electrostáticamente cargados o no cargados. Por ejemplo, la inclusión de uno o más grupos nitro, grupos halo, grupos alquilo, etc. sobre un grupo fenol cambiará el pH al cual este grupo será electroatáticamente cargado. Tal modificación de ligandos está bien dentro de las habilidades del arte.

El término "ligando ionizable especializado" se refiere a un ligando o una mezcla de ligandos seleccionados para ligarse covalentemente a la matriz de soporte sólido. La selección de ligandos ionizables se hace en relación al pH donde el ligando transportará una carga electrostática inducida. En cambio, los pHs seleccionados para enlace y .asorción dependerán de los factores tales como pl y estabilidad de la proteína objetivo. En consecuencia, la racionalidad de la selección de los ligandos ionizables apropiados será con base, por lo menos en parte, del uso de un ligando ionizable que está electrostáticamente cargado/no cargado bajo condiciones que son compatibles con la proteína objetivo por ser recuperada.

El término "un ligando no ionizable" se refiere a un grupo covalentemente ligado a una matriz de soporte sólido ya sea directa o indirectamente a través de un brazo espaciador cuyo grupo no contiene ninguna funcionalidad. Los ligandos no ionizables adecuados incluyen, por ejemplo, grupos alquilos, grupos aromáticos (p. ej . , fenilos, naftilos) y grupos alguiloaromáticos (p. ej . grupos bencilos) .

Como se hace notar anteriormente, los ligandos ionizables y no ionizables ya sea directa y covalentemente ligados a la matriz de soporte sólido o esos ligandos comprenden un brazo espaciador para ligarse covelentemente la funcionalidad ionizable a la matriz de soporte sólido. En consecuencia, la unión de un ligando ionizable a la matriz de soporte sólido puede ser ilustrado como sigue: Matriz de Soporte Sólido-Ligando Ionizable En lo que respecta al ligando puede comprender un brazo espaciador, la fórmula anterior puede ser más adelante ilustrada como: Matriz de Soporte Sólido- [Brazo espaciador] n - R donde n es 0 ó 1; R es una funcionalidad ionizable y el Brazo Espaciador es un grupo químico capaz de enlazar covalentemente la funcionalidad ionizable para la matriz de soporte sólido. El brazo espaciador puede ser desprovisto de las funcionalidades ionizables o puede contener uno o más funcionalidades ionizables, p. ej . , histidilo, imidazolilo, etc.

Los ligandos no ionizables son similares a los ligandos ionizables descritos anteriormente excepto que R es reemplazado por R el cual no contiene una funcionalidad ionizable y un Brazo Espaciador y está desprovisto de una funcionalidad ionizable.

- Las Figuras 8A a 8K ilustran algunas configuraciones para las resinas descritas aquí. Especialmente, la Figura 8A ilustra la ligadura covalente directa del ligando a la matriz de soporte sólido la cual puede ser lograda por la química conocida per se en el arte. Por ejemplo, la polimerización del ácido acrílico resultará en una matriz de soporte sólido teniendo grupos carboxilo ionizables directa y covalentemente enlazados a la matriz. Del mismo modo, la polimerización del acrilonitrilo resultará en una matriz de soporte sólido teniendo grupos no ionizables directa y covalentemente enlazados a la matriz .

La figura 8B ilustra las ligaduras covalentes del ligando a la matriz de soporte sólido vía un brazo espaciador adecuado incorporado y comprende una parte de un ligando el cual es bien conocido en el arte y se describe más adelante en detalle. La ligadura covalente adecuada del ligando a la matriz de soporte sólido incluye una ligadura a través de un grupo tioéter, un grupo éter, un grupo amido, un grupo uretano, un grupo disulfuro, un grupo urea, y similares. El brazo espaciador incluye, por ejemplo, aguellos derivados de la ß-alanina, ácido t- aminobutírico (GABA) , ácido 6-aminocaproico, 1,6- diaminohexano, ácidos mercaptos, tirosina y nitrotirosina. Otros brazos espaciadores adecuados están bien documentados en el arte y el uso de tales brazos espaciadores no es crítico. • - La Figura 3C ilustra una resina que tiene una 5 funcionalidad ionizable o una mezcla de funcionalidades ionizables incorporadas dentro de la columna de la matriz de soporte sólido.

Las Figuras 8D-8K ilustran además las configuraciones 10 para las resinas descritas aquí las cuales pueden alcanzarse por la química conocida per se en el arte. A menos que otra cosa se indique, la matriz de soporte sólido es no ionizable.

La frase "una matriz de soporte sólido teniendo una funcionlidad ionizable seleccionada incorporada dentro de la columna de ella" se emplea aquí cuando se refiere a la matriz de soporte sólido conteniendo en su columna una funcionalidad ionizable. Tales funcionalidades ionizables son similares a los ligandos ionizables con la excepción de que los ligandos ionizables están colgados a la columna de la matriz de soporte sólido mientras que la funcionalidad ionizable está incorporada en la columna. Por ejemplo, tal funcionalidad ionizable puede resultar de la incorporación de una funcionalidad amino terciaria o secundaria en la columna incluyendo, por ejemplo, aminas polietileno las cuales son bien conocidas en el arte .

El término "electrostáticamente no cargada al pH donde la proteína o el péptido está enlazado a la resina" significa que menos del 5% de las funcionalidades ionizables en la resina están cargadas al pH de la proteína objetivo enlazada. Preferentemente," menos de cerca del 1% de las funcionalidades ionizables en la resina están cargadas a este pH.

Cualesquiera capacitado en el arte reconoce que el grado de carga generada por una funcionalidad ionizable depende del pH del medio acuoso que está en contacto a la funcionalidad y del pKa de la funcionalidad. Al pKa de la resina, el 50% de las funcionalidades ionizables están electrostáticamente cargadas y 50% de las funcionalidades están electrostáticamente no cargadas. Los ajustes en el pH para alcanzar el requisito de grado de funcionalidad electrostáticamente no cargada en la resina está bien conocido dentro de las habilidades del arte en vista de las enseñanzas aquí mostradas .

El término "alta fuerza iónica" significa una fuerza iónica mayor que o igual que la requerida para proporcionar una conductividad de 4.7 miliohm (miliSiemens (mS/cm ) ) . Por ejemplo, tal conductividad puede ser alcanzada utilizando 250 milimoles (mM) de cloruro de sodio. El término "baja fuerza iónica" significa una fuerza iónica menos de 4.7 miliohm. Los procedimientos para determinar la fuerza iónica de una solución son bien conocidos para aquellos habilitados en el arte.

Metodología El uso de la resina en la purificación de las proteínas generalmente es bien conocido en el arte. Estas resinas normalmente comprenden una matriz de soporte sólido granular o en una cama a la cual los ligandos se enlazan ya sea directamente a ella o a través del brazo espaciador. Una solución que contiene una proteína objetivo se pone en contacto con la resina. Las interacciones entre la resina y la proteína objetivo se basan en, por ejemplo, carga química, hidrofobicidad relativa, o afinidad específica que permite a las proteínas en la solución enlazarse a la resina. Alterando específicamente las condiciones de la solución amortiguadora de desorción para contar las interacciones entre la resina y la proteína, la proteína objetivo puede ser selectivamente desabsorbida.

Los métodos descritos aquí representan una mejora sobre los métodos de recuperación de proteína de los artes previos en la medida en que estos métodos proporcionan métodos altamente eficientes para recuperar cantidades industriales de proteínas naturales o recombinantes a partir de un medio acuoso tales como los caldos de fermentación. En una modalidad particularmente preferida, los métodos descritos aquí son particularmente útiles con proteínas de caldo de fermentación (p. ej . , quimosina y subtilisina) debido a que la purificación puede a menudo acompañarse directamente de la preparación del caldo de cultivo y además debido a que los componentes del caldo purificado además de la proteína objetivo puede no estar enlazada a esas matrices.

Los métodos descritos aquí son particularmente útiles cuando no se requiere una proteína de muy alta pureza , p. ej . , enzimas industriales, porque su nivel de pureza puede ser alcanzado con un paso de purificación. Opcionalmente, los caldos pueden ser cargados después de ajustar el pH, si se requiere, sin dilución, concentración, desalado, adición de sal o separación de partículas. Se contempla que las resinas 'descritas aquí pueden tener una ventaja de regeneración sobre las resinas las cuales no pueden ser ionizadas.

Las resinas descritas aquí proporcionan una combinación de algunas características importantes. Pueden permitir recuperación directa de una proteína a partir de los caldos crudos y de las mezclas, y pueden permitir una purificación significante al comienzo del proceso de corriente abajo. El efecto de desalado puede ser bien adecuado para un paso subsecuente en el proceso de cromatografía, p. ej . , antes del intercambio iónico o cromatografía por afinidad. Permiten una desorción rápida y barata (p. ej . , elución) bajo condiciones no severas. Un paso mínimo o un gradiente de tecnología se requiere, poca o no sal extra, y poco o nada de solvente.

Debido a la naturaleza general del enlace en los métodos de esta invención, estos métodos exhiben menos especificidad que otros procedimientos (p.ej., procedimientos cromatográficos) . Por ejemplo, diferentes organismos huéspedes pueden tener diferente (s) contaminante (s) de proteína (s) principal (es) . con diferentes hidrofobicidades [11] . Por lo tanto, puede ocurrir un nivel significante de enlace de proteína no objetivo. Específicamente utilizando los métodos descritos aquí requieren que la hidrofobicidad de la proteína objetivo y/o el punto isoeléctrico (pl) difieran de la mayoría de los contaminantes. Las proteínas con hidrofobicidad y punto isoeléctrico similar como contaminantes de proteína no objetivo pueden co-eluirse con contaminantes en la ausencia de gradientes de desorción. Esto puede ser cuantificado por un pretratamiento de la muestra o el ligando, variaciones de la matriz y el espaciador, como se describe aquí en detalle. Adicionalmente, a partir de que la proteína recuperada está acompañada tanto alta como de baja fuerza iónica en los métodos descritos aquí, un cambio en la fuerza iónica de la solución en contacto con la resina puede remover algunas impurezas mientras retiene la proteína objetivo enlazada a la resina. También, un cambio de pH a una fuerza iónica baja puede ser útil en desabsorber selectivamente una proteína sobre otra. De otra manera la proteína "total" enlazada es una preferencia en algunos procesos, p. ej . , recuperación de proteína de suero. Los métodos descritos aquí pueden ser útiles para la inmovilización de enzimas covalentes [12-16] , debido a que el enlace es fuerte y la recuperación de la proteína es simple.

Los métodos descritos aquí a continuación emplean resinas específicas útiles para el enlace de proteínas objetivos. El enlace a esas resinas está acompañado a un pH donde la resina está electrostáticamente no cargada y se alcanza principalmente por interacciones hidrofóbicas. El grado de interacción hidrofóbica entre la resina y la proteína objetivo al pH de enlace puede ser racionalmente seleccionado de tal manera que la fuerza de la proteína *.' enlazada a la resina se controla. Tal selección se alcanza por el uso de matrices adecuadas y ligandos, 5 incluyendo brazos espaciadores, donde la combinación de estos materiales proporciona hidrofobicidad controlada de la resina. Uno de los medios para un control de la hidrofobicidad más amplio es incluir una población de ligandos no ionizables en la matriz de soporte sólido ya sea altamente hidrofóbica (p. ej . , conteniendo grupos fenilos o bencilos) o más hidrofílico (p. ej . , conteniendo grupos amido o uretano) . Tales factores están bien dentro de las habilidades del arte con base en las enseñanzas aquí mostradas. Preferiblemente, cuando los ligandos no ionizables se emplean, la población de ligandos no ionizables en la matriz de soporte sólido puede estar en el rango entre 0 a 80 por ciento con base en el número total de- ligandos. (p. ej . , ligandos ionizable + no ionizables) .

Adicionalmente, cuando un ligando esta unido a la matriz de soporte sólido a través de un enlace tioéter, la hidrofobicidad de la resina puede ser controlada por 25 oxidación de algunos o de todos los átomos de azufre en la resina a grupos sülfóxidos y/o sulfones. Incrementando la población de grupos sulfóxidos y/o sulfones presentes en la resina y la hidrofobicidad de la resina se reduce. Los procedimientos adecuados para la oxidación de los grupos tioéter a grupos sulfóxidos y sulfones son bien conocidos en el arte. Cuando una funcionalidad ionizable se incluye en la columna de una matriz de soporte sólido, puede no ser necesario incluir ligandos ionizables en la matriz y, cuando tales no se emplean, todos los ligandos unidos a la matriz de soporte sólido serán no ionizables. En esta modalidad, el ajuste de la cantidad y el tipo de ligandos no ionizables unidos a la matriz de soporte sólido permite más control de la hidrofobicidad de la resina. Los métodos descritos aquí son útiles para recuperación de un amplio rango de proteínas incluyendo productos recombinantes. Los métodos pueden también ser utilizados para efectuar la separación de las proteínas en los extractos de fuentes naturales, tales como fuentes de plantas y animales.

Las resinas descritas aquí emplean ligandos ionizables y no ionizables ligados a matrices de soporte sólido. Cualquier método de ligadura covalente de los ligandos puede ser utilizado, proporcionando que la ligadura no resulta en la introducción de grupos ionizables más que del grupo ionizable deseado en el ligando. Los ejemplos de los métodos de las ligaduras de tales ligandos a las matrices de soporte sólido incluyen enlaces covalente tioéter, éter, amida, y uretano. Otros métodos tioéter, ligaduras disulfuro, y métodos de urea pueden ser utilizados. Adicionalmente, los ligandos hidrazida pueden ser unidos a los grupos funcionales epóxido o aldehido.

La química de las ligaduras de los ligandos representativos se muestran en la Tabla 1. Otras químicas de las uniones de los ligandos se ilustran en otra parte de aquí y/o son bien conocidos en el arte. TABLA 1 Química de la Unión del Ligando Cada una de estas químicas es bien conocida en el arte y los resultados de los acoplamientos en las ligaduras descritas anteriormente. Por ejemplo, los ligandos pueden ser unidos a la matriz de soporte sólido tales como una matriz de celulosa activada a través de un enlace de uretano neutro por el uso del reactivo diimidazol carbonilo (CDI) como se ilustra en las Figuras 1 y 3. Alternativamente, los ligandos pueden ser unidos a través de un enlace amido a la matriz de celulosa derivada con un brazo espaciador del ácido aminocaproico como se ilustran en la Figura 4, las modalidades 1 y 3. Donde sea necesario, un 100% de sustitución de los grupos carboxilo del brazo espaciador puede lograrse. Tal sustitución puede ser confirmada utilizando procedimientos bien conocidos en el arte, tales como pequeña titulación de iones .

La unión del ligando vía matrices activadas de diimidazol carbonilo (CDI) se ilustran en la Figura 1. El acoplamiento carbodiimida del ligando de la matriz de los grupos carboxilo se ilustra en la Figura 2. Los soportes del CDI-ácido caproico se ilustran en la Figura 3. Los posibles derivados de las matrices CDI-ácido caproico se ilustran en la Figura 4.

Alternativas a las matrices activadas de CDI para la unión del ligando son las resinas conteniendo grupos epóxido cuyas preparaciones y unión de ligando se ilustran en las Figuras 5 y 6. Específicamente, la Figura 5 ilustra la unión de los ligandos conteniendo tiol a una matriz de soporte sólido activada epóxido. En esta resina, el ligando está unido a través de un enlace tioéter estable y neutro [10] . Los ligandos los cuales pueden ser utilizados con esta química comprende grupos funcionales los cuales incluyen , a manera de ejemplo, mercaptobencimidazol, 4-mercaptopiridina, 2-mercaptopiridina, metaimidazol y 4-hidroxitiofenol . La Figura 6 ilustra la reacción de una amina con una matriz de soporte sólido activada epóxido. La química utilizada en ambos casos es típicamente acuosa y por lo tanto menos cara que el método CDI. Sin embargo, la química puede introducir entrecruzamiento dentro de la matriz la cual puede reducir su capacidad de carga. Adicionalmente, los niveles de activación utilizando esta química son típicamente bajos.

Otros agentes de activación preferidos para la modificación de la matriz con ligandos tioles tienen grupos altamente reactivos y grupos menos reactivos. El grupo altamente reactivo reacciona con un grupo matriz de hidroxilo a pH alcalino para formar enlace éter estable, mientras en segundo grupo no reacciona bajo estas condiciones. Esto previene el entrecruzamiento. Después del primer paso de la primera activación, el segundo grupo puede ser reaccionado directamente con un radical reactivo o un nucleófilo fuerte, p. ej . , un tiol. El segundo grupo puede también ser modificado a una forma más reactiva, entonces reaccionado con el nucleófilo. Los aluros de alilo (p. ej . , bromuro de alilo)*' y el éter glicidil alilo son los reactivos preferidos. Por ejemplo, las matrices de soporte sólido activadas con éter glicidil alilo pueden permitir niveles de sustitución mayores que aquellos activados con epiclorhidrina. En la unión covalente de esos ligandos a la resina, el grupo alilo puede ser modificado de tal manera que incorpore una funcionalidad ionizable (p. ej . , la reacción con agua de bromuro para formar un derivado de bromo seguido por una reacción con la sal disódica del ácido 4-hidrobenzoico) .

Se entiende, sin embargo, que el ligando ionizable puede ser directamente ligado a la resina. Bajo estas circunstancias, la resina se prepara para incluir una ligadura directa al ligando ionizable o puede ser derivado para incluir tal ligadura directa. Por ejemplo, la polimerización de la composición de un monómero comprendiendo unidades de acrilato de metilo las cuales pueden ser derivadas por solvolisis para proporcionar unidades de ácido acrílico en el polímero.

Se entiende también que la funcionalidad ionizable puede ser incorporada en la matriz de soporte sólido. Por ejemplo, una poliamína o un polímero comprendiendo una funcionalidad amina puede ser utilizada donde el grupo funcional la amina es ionizables a pHs bajos. En tal modalidad, el polímero puede ser preparado para incluir otros grupos funcionales y ligandos ligados que pueden ser a través de grupos aminos o de otros de tales grupos. En la modalidad anterior, las químicas de la unión de los ligandos son empleadas para retener por lo menos una porción de la funcionalidad ionizable en la columna de la matriz. Cuando las funcionalidades ionizables se incluyen en la columna, no es necesario para los ligandos contener funcionalidades ionizables y en una de las modalidades los ligandos unidos a la matriz son no ionizables y en otra modalidad, por lo menos una porción de los ligandos son ionizables.

Los ligandos ionizables en las resinas descritas aquí incluyen esos derivados por enlaces covalentes piridina 3- (aminometil) piridina (3AMP) , 4- (aminometil) piridina (4AMP) , l- (3 -aminopropilo) imidazol (API) , 2- (aminometilo) bencimidazol (AMB) , 4- (3-aminopropilo) morfilina (AMP) , histamina, y similares a la matriz de soporte sólido empleando la química descrita anteriormente en la Tabla 1 y en los ejemplos expuestos aquí abajo. Tales uniones químicas incluyen CDI activado y celulosa activada con CDI del ácido caproico los cuales son descritos anteriormente y en las figuras anexas a esto .

Cuando un ligando amino hidrofóbico se utiliza, es preferentemente seleccionado del grupo consistente de 2-feniletilamina, L-fenilalaninol, (IR, bencensulfonamida) , (ÍS, 2S) - (+) -2 -aminofenilpropanediol y 1-hexilamina.

Otros ligandos útiles incluyen esos conteniendo fenol no substituido y fenoles sustituidos con pKa's en el rango de 6-9. Estos pueden ser útiles para el tipo de ligando ionizable negativamente. Sustituyentes adecuados para el grupo fenilo incluye nitro, halo (p. ej . , cloro, bromo), alquilo de 1-10 átomos de carbón, alcoxi de 1-10 átomos de carbón, esteres de carboxilo donde el grupo éster es de 1 a 10 átomos de carbón, grupos ciano, carbonil alquilo (-C(O)R) de 1-10 átomos de carbón, y una mezcla de ellos. Típicamente, los grupos fenilo sustituidos tienen de 1-4 de tales sustituyentes y preferentemente desde 1 a 2. Los sustituyentes anteriores pueden también estar unidos a otros ligandos sustituibles incluyendo ligandos conteniendo grupos piridilos, grupos histidilos, grupos indolilos, grupos imidizolilos , grupos morfilinos, grupos bencimidazolilos y similares.

La lista de ligandos ionizables expuestos aquí no intenta ser exhaustiva tampoco lo es la química empleada para unir covalentemente estos ligandos a la matriz de soporte sólido. Basta hacer notar que los ligandos adecuados son bien conocidos en el arte así como la química empleada para enlaces covalentes de estos ligandos a la matriz. Basta hacer notar además que el común a los ligandos ionizables así como a cualquier funcionalidad ionizable en la matriz de soporte sólido es la presencia de uno o más grupos funcionales los cuales pueden ser electrostáticamente cargados a un pH y electrostáticamente no cargados a otro .pH. El grupo funcional particular empleado en la resina no es crítico.

El ligando ionizable y/o la funcionalidad no ionizable está preferentemente presente en la resina a una concentración suficiente para permitir el enlace de la proteína objetivo a ambas fuerzas iónicas alta y baja. Preferentemente, la funcionalidad ionizable estará presente en la resina a una concentración de 0.4 mmol a cerca de 3 mmol por gramo de peso seco de resina (o 0.05-0.5 mmol/ml) . En una modalidad particularmente preferida, los ligandos no ionizables se emplean en conjunción con la funcionalidad ionizable así como para proporcionar además control sobre el grado de hidrofobicidad/hidrofilicidad al pH de la proteína objetivo enlazada para una desorción de la resina. En esta modalidad, el porcentaje de ligandos no ionizables relativo al número de ligandos varía desde 0 a cerca de 80 por ciento, preferentemente desde 0 a 40 por ciento.

En los métodos de esta invención, una solución o un medio acuoso comprende la proteína objetivo por ser recuperada que está en contacto con la resina a un pH donde la resina está electrostáticamente no cargada. A este pH, el enlace es primariamente por interacción hidrofóbica y el grado de hidrofobicidad de la resina puede ser ajustado por modificación de cualquier brazo espaciador empleado para unir el ligando a la resina, por el empleo de una matriz de soporte sólido más o menos hidrofóbica, por uso de ligandos no ionizables, por el uso de ligandos más o menos ionizables hidrofóbicamente, por ajuste de la densidad de los ligandos en la matriz y una combinación de ellos. En vista de las enseñanzas aquí expuestas, cualquiera habilitado en el arte puecle racionalmente ajustar estos parámetros basados en las propiedades de la proteína objetivo acoplada con el incremento deseado.

El medio comprende la proteína objetivo, p. ej . , quimosina, para ser recuperada puede ser derivada de cualquiera de las fuentes de proteína conocidas, incluyendo la de fuentes microbiana o animal. Por ejemplo, las soluciones de quimosina pueden incluir caldos de fermentación de Apergillus, E. coli , levaduras, así como extractos acuosos obtenidos de estómagos de bovinos .

El medio acuoso puede incluir una solución amortiguadora y/o una sal para mejorar las eficiencias de enlace a la resina. Las sales adecuadas son aquellas convencionalmente empleadas en cromatografía de proteína e incluye, por ejemplo, litio, sodio, potasio y sales de cloruro de amonio, sulfato, fosfato y acetato. Preferentemente, el cloruro de sodio se emplea porque es efectivo, no caro y seguro. Como se hizo notar anteriormente, las resinas descritas aquí enlazarán la proteína del medio acuoso a concentraciones altas y bajas de sal. Específicamente, estas resinas enlazarán aproximadamente 50 o más de la proteína objetivo en el medio acuoso a bajas y altas concentraciones. Se entiende, por supuesto, que la resina empleada tiene suficiente capacidad para enlazar toda la proteína objetivo en el medio.

El medio acusoso está en contacto con la resina el tiempo suficiente para permitir que la proteína objetivo se enlace a la resina. Este contacto puede hacerse, por ejemplo, donde la resina se empaca en la columna, la empleada en la cama fluidizada, o suspendida en un sistema en lote en agitación cuando la resina se mezcla con el medio acuoso de la proteína. Bajo tales condiciones, la proteína objetivo se enlaza a la resina y en consecuencia forma un complejo resina-proteína. Después de hacer contacto el medio acuoso con la resina, la resina entonces se lava con una solución amortiguadora de pH a la del medio acuoso para separar el medio acuoso de la resina y de las proteínas enlazadas a ella. Esta solución amortiguadora puede adicionalmente comprender por lo menos arriba de una concentración de sal de 2 M como se listó anteriormente.

La proteína objetivo es entonces desabsorbida de la resina meramente por contacto de la resina con un medio acuoso teniendo un pH el cual induce a una carga electrostática sobre la resina. La carga electrostática inducida en la resina puede ser la misma o diferente, p. ej . , opuesta, a la polaridad de la proteína objetivo. En una modalidad preferida de la presente invención, la carga inducida en la resina es de la misma polaridad que la carga electrostática neta en la proteína objetivo al pH de desorción y la carga resultante de repulsión carga-carga entre la resina y la proteína objetivo siendo suficiente para vencer cualquier interacción hidrofóbica con la resina y consecuentemente facilitar la desorción de la resina. Esto puede ser alcanzado por selección racional de la hidrofobicidad relativa de la resina como se describió anteriormente y/o por incorporación de ligandos ionizables suficientes para proporcionar efectivamente una gran cantidad de carga electrostática en la resina al pH de desorción.

En otra modalidad preferida de la presente invención, la carga inducida en la resina es de polaridad opuesta a la carga electrostática neta en la proteína objetivo al pH de desorción. En esta modalidad, la desorción de la proteína objetivo a partir de la resina puede facilitarse, por ejemplo, por el uso de una solución de desabsorción de alta fuerza iónica. En otra modalidad, por el uso de un agente de polaridad reducida, tales como el propilenglicol, que pueden facilitar la desorción de la proteína o el péptido objetivo a partir de la resina.

La selección del ligando se basa en las restricciones de pH de la proteína. Por ejemplo, en ciertas circunstancias, puede ser deseable usar una resina teniendo una carga positiva inducible a pHs donde la proteína objetivo es estable de tal manera que los pHs extremosos puedan ser evitados para enlace o desorción de la proteína. De la misma manera, un ligando con una carga negativa inducible a pHs donde la proteína es estable pueden preferirse. Tales ligandos incluyen, a forma de < * ejemplo, ácido caproico (titulado desde un pH « 3.3) . Los ligandos fenólicos, p. ej . , tiramina, son también útiles en este sentido ya que el fenol titula desde aproximadamente pH 6 y superiores. Los fenoles nitrados o clorinados o los ligandos de tiramina son especialmente útiles ya que ellos tienen un valor de pKa cercano al pH neutro. 10 En otra modalidad donde la proteína es estable solamente a pHs fisiológicos, los ligandos ionizables unidos a la matriz de soporte sólido debían proporcionar resinas las cuales empiezan a titular (llegan a ser electrostáticamente cargadas) en un rango de pH de cerca de 5 a 9 y más preferentemente a partir de 5.5 a cerca de 8.5. Tal rango permite enlace y desorción de la proteína objetivo al rango de pH el cual, en el caso de muchas proteínas, reduce el riesgo de desnaturalización, etc. como se compara a rangos más extremosos de pH.

En los métodos descritos aquí, la densidad del ligando en la matriz está seleccionada de tal manera que la proteína enlazada puede ser lograda a una fuerza iónica alta y 25 baja. Esto permite el procesamiento del medio de proteína acuoso sin dilución, concentración o desalado, adición de sal, o separación de partículas. Otra ventaja contemplada por el uso de las resinas descritas aquí es que estas resinas pueden sufrir menos obstrucción que las matrices empleadas previamente para separar proteínas de los caldos .

En la separación de la proteína objetivo de la resina en la manera descrita anteriormente, la solución de la proteína objetivo recuperada puede ser posteriormente tratada por métodos convencionales.

La resina empleada en este proceso puede ser regenerada por los métodos convencionales. Por ejemplo, las resinas que tienen una carga positiva inducible pueden ser regenerada utilizando HCl 0.1 M, con o sin agente reductor de la polaridad tal como el etanol o el etilenglicol. De la misma manera, las resina que tienen una carga negativa inducible pueden ser regeneradas utilizando NaOH 0.1 M, de nuevo con o sin un agente reductor de polaridad tal como el etanol o el etilenglicol. Sin embargo, este último proceso puede resultar en la hidrólisis de las matrices de CDI y puede causar hinchamiento de la matriz . El entrecruzamiento de la matriz de celulosa antes de la activación ha sido utilizado para reducir el hinchamiento y mejorar las velocidades de flujo de la columna. El entrecruzamiento puede también ser utilizado con matrices ionizables positivamente .

Cuando la obstrucción es un problema, el pretratamiento del caldo o de otro medio crudo por flujo a través de una resina barata tal como la DEAE a alta fuerza iónica puede mejorar la separación. Por ejemplo, el uso de un pretratamiento con una columna de DEAE con muestras de subtilisina resultan en un agotamiento significante de incrustaciones, con más del 99% de actividad enzimática remanente. El agotamiento de las incrustaciones mejora la regeneración, la vida de la resina, y su capacidad. Este paso extra puede ser especialmente factible cuando el flujo a través del pretratamiento de la columna puede ser cargado directamente en el sistema de separación de la presente invención sin ajuste de la solución amortiguadora .

En un ejemplo de los métodos descritos aquí, la quimosina enlazada a la celulosa CDI-ácido caproico (o Sefarosa) a pH de 2 donde el grupo carboxilo está esencialmente electrostáticamente no cargado. La elución fue a pH de 6 donde el grupo carboxilo está esencialmente cargado y la desorción involucra una repulsión carga-carga entre la resina y la quimosina.

En un segundo ejemplo, las resinas que utilizan fucionalidades piridina/imidazol son útiles para purificar algunas proteínas. Por ejemplo, la celulosa-CDI-ácido caproico fue 100% sustituido con 3-dietilaminopropilamina (DEAPA) (pKa « 9.5) y l-(3-aminopropil) imidazol (API) (pKa « 6.2). Estas resinas no enlazan proteínas tales como la quimosina a NaCl ÍM, pH 5.5, donde estas resinas son extensamente cargadas a este pH. Sin ser limitado a ninguna teoría, parece que las cargas positivas en estas resinas rompen el enlace hidrofóbico. Por el contrario, la quimosina exitosamente enlaza, en NaCl 0.5M, pH 6, a una resina preparada por reacción de Peraloza CDI-activada con 2- (aminometil) piridina (pKa « 4.1) a la cual el valor de pH de la resina está extensamente no cargada. La resina piridila se eluye con una solución amortiguadora de pH 2 la cual titula los grupos piridina de la resina a una forma cargada. Nótese el trabajo preferido a un rango de pH para quimosina es de 2 y 4.5-6.5 y la resina piridilo satisfactoriamente trabaja en este rango.

Los resultados anteriores ilustran el uso de una resina compatible en conjunción con la proteína objetivo para efecto de recuperación. En consecuencia, el sistema amortiguador y por lo tanto las funcionalidades ionizables utilizadas para recuperación de la proteína están dependientes en la proteína objetivo para ser purificada. Por ejemplo, a diferencia de la quimosina, la subtilisina es inestable abajo de pH 4.5, así las soluciones amortiguadoras abajo de ese pH no pueden ser utilizadas. Además, las soluciones amortiguadoras de citrato deben ser evitadas cuando se trabaja con subtilisina para evitar quelación de Ca2+, ya que Ca2+ estabiliza la enzima. Adicionalmente, las soluciones amortiguadoras de fosfato pueden precipitar Ca2+ y, por lo tanto, tales soluciones amortiguadoras deben evitarse. El rango de trabajo preferido para subtilisina es pH de 5-7. La operación en el rango de pH 7-10 puede ser aceptable para periodos limitados.

Con los métodos de recuperación de subtilisina, las soluciones reguladoras con molaridades de 100-200 mM se prefieren para el ajuste de pH inicial requerido para la desorción. Una vez que el pH se ha ajustado, la molaridad de la solución amortiguadora puede reducirse por dilución. La solución amortiguadora de acetato (pH 5.2) dieron recuperación eficiente para la mayoría de las matrices ionizables positivamente hidrofóbicas. Una solución amortiguadora de glicol conteniendo 8% de formato, 40% de propilenglicol, pH 5.5 desabsorbe subtilisina a partir de todas las matrices probadas. Con matrices ionizables negativamente hidrofóbicas, la eficiencia de desorción fue incrementada con incremento del pH, pero la estabilidad de la subtilisina se redujo. La solución amortiguadora de glicol a pH de 7-9 se prefirió. Esto dio un rápido ajuste de pH y buenos perfiles de desorción sin pH extremoso.

En otro ejemplo, se utilizaron los ligandos amino hidrofóbicos. Estos ligandos fueron unidos a la Sefarosa epoxi y están extensamente electrostáticamente no cargados a pH de 10. A valores de pH abajo de 10. estas matrices llegan a ser electrostáticamente cargados al enlace de la amina secundaria. La carga a pH de 10.5, a una baja fuerza iónica, una subtilisina (como se describe en la patente U.S. No. 5,185,258, publicada en Febrero 9, 1993 e incorporada aquí como referencia en su totalidad) fue enlazada utilizando los siguientes ligandos: APP, AEBS y triptamina. Solamente la triptamina Sefarosa enlazada a pH 10.5 + NaCl 0.5 M. Ninguna de las matrices enlaza fuertemente a pH 9 , aunque el paso de la subtilisina a través de estas matrices fue retrasado. Lo anterior indica que un ligando fuertemente hidrofóbico y un pH extremoso se requirieron para purificación de subtilisina utilizando tales resinas.

Un alto pH requerido para carga de la subtilisina es insatisfactorio debido a los problemas de estabilidad. En consecuencia, las resinas que están electrostáticamente no cargadas a pH de 7-9 y las cuales pueden permitir el enlace de la subtilisina a esos pH's, pero ionizarían parcialmente o completamente a pH 5-6, causando que la desorción de la subtilisina fuera desarrollada. Un ejemplo de tales resinas es una celulosa CDI-ácido caproico API-sustituda 100% la cual está electrostáticamente no cargada arriba del pH de 8 (a una alta fuerza iónica) y enlaza subtilisina a pH de 8.5.

Otro ejemplo fue la mezcla de resina APP (67%) y API (33%) las cuales enlazan subtilisina a pH de 8.0.

Un ejemplo más incluye las resinas conteniendo ligandos 3- y 4-piridilos 100% sustituidos los cuales están electrostáticamente no cargados arriba del pH 6.5 y enlazan subtilisina a pH de 7.

La proteína objetivo puede ser eluida a partir de cada una de las resinas por una reducción en un pH de una solución amortiguadora en contacto con la resina. Por ejemplo, la subtilisina fue desabsorbida de cada uno de estos materiales por una reducción de pH a 5.2, el cual tituló algunos de esos grupos de ligandos ionizables a la forma protonada. En consecuencia, el enlace de la subtilisina fue por interacciones hidrofóbicas, con la posibilidad de una contribución del hidrógeno enlazado y una transferencia de carga, y la desorción fue por repulsión de carga y/o destrucción de interacciones hidrofóbicas. Estas resinas pueden ser cargadas a una fuerza iónica alta y baja, así remueve el requerimiento para diálisis o dilución en el pretratamiento de la muestra.

En el caso de la quimosina, la desorción de esta proteína a partir de la resina utiliza una solución amortiguadora teniendo un pH ajustado para bajar a cerca de un pH de 4, preferentemente de 2. Una solución amortiguadora de elución preferida adicionalmente comprende cerca de 20 mM a cerca de 50 mM de cloruro de potasio.

Una modalidad más de los métodos descritos aquí relata los métodos de purificación de proteínas, incluyendo enzimas, utilizando las resinas descritas anteriormente. Se entiende que las proteínas objetivo pueden estar contenidas en un medio acuoso conteniendo otras proteínas a partir de las cuales se purifica. Este medio puede ser un caldo crudo de fermentación el cual incluye, además de las proteínas, una amplia variedad de biológicos, incluyendo aminoácidos, polisacáridos, azúcares, ácidos orgánicos y sales. Estos métodos están descritos en detalle aguí utilizando quimosina y subtilisina como ejemplos, aunque se contempló que otras proteínas objetivo podrían ser purificadas utilizando las resinas y los métodos descritos.

En una modalidad particular, la presente invención relata un método para 1 separación de quimosina a partir de un medio acuoso de proteínas comprendiendo quimosina el método comorende en poner en contacto el medió acuoso de las proteínas con cualquiera de las resinas previamente descritas por un tiempo suficiente para permitir que la quimosina se enlace a la resina; la separación del complejo de la resina/quimosina del medio acuoso; y entonces la recuperación de la quimosina a partir de la resina. La quimosina por ser purificada puede ser derivada de cualquiera de las fuentes de enzimas conocidas, incluyendo Aspergillus, E. coli , levaduras, y estómagos de bovinos. Un proceso similar de la separación de subtilisina y su purificación está también comprendida dentro de la presente invención.

En la modalidad del procedimiento donde la resina comprende un ligando positivamente inducible enlazado a la matriz de soporte sólido y la proteína objetivo que comprende quimosina, el método preferiblemente comprende ajustes de pH del medio acuoso tal que la resina está electrostáticamente no cargada. Este método puede más adelante comprender la adición de sal 2 M al medio acuoso de proteínas antes de ponerse en contacto con la resina. Las sales útiles se incluyen en las en listadas anteriormente.

El medio acuoso de proteínas se pone entonces en contacto con la resina por un tiempo suficiente para permitir que la quimosina se enlace a la resina. Este contacto puede hacerse, por ejemplo, cuando la resina es empacada en la columna, empleando una cama fluidizada, o un sistema de lote agitado o suspendido cuando la resina está mezclada con el medio acuoso de proteína, entonces se filtra del medio acuoso. Después de ponerse en contacto el medio acuoso con la resina se lava con una solución amortiguadora de pH igual al del medio acuoso para separar el medio acuoso de la resina y de las proteínas enlazadas a ella. Esta solución amortiguadora puede adicionalmente comprender arriba de 2 M de sales enlistadas previamente.

La quimosina puede entonces recuperarse de la resina utilizando una solución amortiguadora teniendo un pH ajustado suficientemente bajo como para inducir una carga positiva en la resina. Una solución amortiguadora de desorción preferida adicionalmente comprende desde 20 mM a cerca de 50 mM de cloruro de sodio o de potasio.

Aunque las resinas descritas aquí tienen particularmente utilidad para recuperación de proteína a gran escala utilizando procedimientos de enlace simple y de desorción, las resinas y métodos descritos aquí pueden ser utilizados en FPLC y HPLC analíticos o el uso de un preparado de alto valor. En particular, gradientes descendientes de sal pueden ser utilizados con matrices electrostáticamente no cargadas y (a) un cambio de pH a la forma electrostáticamente cargada seguida por un incremento del gradiente de sal o (b) elución con un gradiente de pH para un cambio adicional de pH lejos de la forma neutral.

Por el uso de una mezcla de ligandos de afinidad más ligandos ionizables, las ventajas de afinidad de enlace pueden ser acopladas con fácil desorción por repulsión electrostática. El enlace puede ser a un pH donde el ligando titulable está electrostáticamente no cargado o inerte y la desorción podría ser por un cambio de pH.

Adicionalmente, las resinas y los sistemas de la presente invención pueden ser aplicados a un sistema de resina no cromatográfica tal como extracciones líquido-líquido y sistemas polímero/UF. Los polímeros de separación de fase modificada tales como polietilenglicol, para extracción líquido-líquido [19, 20] , membranas modificadas [21] o métodos polímero soluble-UF [22,23] pueden también emplear los sistemas de la presente invención. En tales modalidades, la resina y la matriz necesita no ser sólida o insoluble en agua.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se presentan para ilustrar modalidades específicas de la presente invención y no deben ser interpretados como limitaciones en el alcance de la invención.

Los métodos de I a VI demuestran métodos para preparar resinas activadas y/o subsecuente unión a ligandos representativos. El ejemplo VII ilustra la capacidad de enlace de las resinas representativas para la enzima subtilisina. Los ejemplos VIII y IX muestran los datos de la titulación típica para resinas representativas útiles en la presente invención. Y en los ejemplos X y XI, se demuestra la recuperación de la subtilisina.

En estos ejemplos, las abreviaciones utilizadas tienen los siguientes significados. Si no se define, cualquier abreviación utilizada más adelante tiene un significado generalmente aceptado. A?BS = p- (2-aminoetil) bencensulfonamida; API = APImidazol=l- (3 -aminopropil) imidazol; AMB = AMBbencimidazol=2- (aminometil) bencimidazol; APM = APMorfolina=l- (3 -aminopropil) morfolina; 2AMP = 2AMPiridina=2- (aminometil) piridina; 3AMP = 3AMPiridina=3- (aminometil) piridina; 4AMP = 4AMPiridina=4- (aminometil) piridina; APP = (ÍS, 2S) - (+) -2-aminofenilpropanediol,• CDI = carbonil diimidazol; CM = carboximetilo; CMC = l-ciclohexil-3- (2- morfolinoetil) carbodiimida; VC = volumen de la columna; DAH = diaminohexano; DEAPA= 3-dietilaminopropilamina; DMF = dimetilformamida; DMSO = dimetilsulfóxido; ECH = epiclorhidrina; EDC = (l-etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida; EEDQ = N-etoxicarbonil-2-etoxihidroquinolina; g = gramos; HEX = hexilamina=l-hexilamina; LIS = baja fuerza iónica,- M = molar; mg = miligramos; MG1 = resina Perloza sustituida l-(3- aminopropil) imidazol ; MG2 = ^==i a Perloza sustituida 4- (aminometil) piridina ; mM = milimolar mmho = milimho (miliSeimens/cm o mS/cm2) ; mmol = milimoles; metimazol= 2-mercapto-lmetilimidazol ; MP = 4MP=4-mercaptopiridina; P = Perloza,• PCC = resina Perloza CDI ácido aminocaproico; PCDI = Perloza CDI activada; PPA = fenilpropanolamina; S = Sefarosa; TRPN = triptamina. MB = mercaptobencimidazol Utilizando las abreviaciones anteriores, las resinas empleadas en los siguientes ejemplos están generalmente abreviadas como sigue: [Matriz] - [Método de acoplamiento] - [Brazo Espaceador, si existe] / [Funcionalidad ionizable].

Por ejemplo, "P CDI 4AMPiridina" se refiere a una matriz de soporte sólido Perloza (P) activada con carbonil diimidazol (CDI) y acoplada con un grupo 4- aminometilpiridina; "S ECH MB" se refiere a una matriz de soporte sólido Sefarosa (S) activada con epiclorhidrina (ECH) y acoplada con un grupo mercaptobencilimidazol (MB) ; y "P CDI DAH ácido hidroxifenilacético" se refiere a una matriz de soporte sólido (P) activada con carbonil diimidazol (CDI) y acoplada a través de un espaciador diaminohexano (DAH) con ácido hidroxifenilacético. Se entiende, por supuesto, que el brazo espaciador (si existe) y la funcionalidad (es) ionizable (s) comprende el ligando ionizable.

EJEMPLO I Activación Epóxido La Sefarosa 6B (50g) , previamente lavada con 10 volúmenes de agua, fue mezclada con 47 ml de NaOH 1 M y 5 ml de epiclorhidrina por 24 horas a 4° C. La sustitución del grupo epóxido fue determinada por métodos conocidos en el arte para ser 1.06 mmol/g. Activaciones similares dieron sustituciones de grupo epóxido de 1.28 y 1.02 mmol/g.

EJEMPLO II Unión de nn Ligando Amina a una Sefarosa Epoxidada La Sefarosa Epoxidada (10g, 1.06 mmol/g seca) preparada como se describe en el EJEMPLO I se mezcló con un exceso molar (p. ej . , 5 moles del ligando/mol de grupos reactivos de resina) de un ligando seleccionado de AEBS, APP, o TRPN solvatado con 4 ml DMSO y 2 ml de agua por 24 horas a 37° C. Un exceso 5 molar de HEX se mezcló de la misma manera con 10 g de Sefarosa epoxidada (1.28 mmol/g seca) . La resina resultante se lavó con 10 volúmenes de 50% DMSO (DMSO:agua 1 : 1) (solamente resina triptamina), 10 volúmenes de agua, 2 volúmenes de HCl 0.1 M y 10 volúmenes adicionales de agua. La sustitución de ligandos fue determinada por titulación con HCL 0.1 M a pH de 4 para dar 0.81 mmol/g para APP Sefarosa y 0.99 mmol/g para HEX Sefarosa. Esto representa aproximadamente 80% de eficiencia de la sustitución de ligando de los grupos epóxido .

EJEMPLO III Activación Éter Glicidil Alilo La Perloza celulosa (celulosa en cama Perloza MT 100 fina disponible de Secheza, Checoslovaquia) se lavó con 5 volúmenes de agua (grado MilliQ) y 3 volúmenes de NaOH 0.3 M y se secó por succión. A una cantidad de 40 g de la matriz se secó con 12 ml de 99% éter glicidil alilo con agitación vigorosa. La matriz se dejó a temperatura ambiente por 48 horas con agitaciones ocasionales. La matriz activada se lavó con 10 volúmenes de agua y se suspendió en 3 volúmenes de agua. Se adicionó agua bromada (1%) lentamente durante 5 minutos hasta que la mezcla no decoloró más el agua bromada. La resina bromada se lavó con 10 volúmenes de agua. La concentración de grupos alilo en la resina se determinó por la cantidad de agua bromada decolorada. La concentración de grupos bromuros reactivos en la resina (1 g de muestra suspendida en 9 ml de agua) se determinó por sustitución con 0.5 g de sulfato de sodio (4 horas, 60° C) , seguida de una titulación con NaOH 0.1 M a pH de 8.

EJEMPLO IV Unión de un Ligando Tiol Una resina (5 g) , producida como se describió anteriormente en el EJEMPLO I o III, se suspendió en 5 mL de solución amortiguadora de fosfato 1 M (pH 7) y se reflujo con nitrógeno. Un exceso de 5 molar del ligando seleccionado de MB, 4MP o metimazol, disuelto en 5 ml de DMSO, y 0.1 g de borohidruro de sodio se adicionó y se mezcló para reaccionar por 6 horas. Las resinas producidas por el método del EJEMPLO I se mantuvieron a temperatura ambiente. Las resinas producidas por el método del EJEMPLO III se mantuvieron a 60° C. La resina tioéter resultante se lavó con 5 volúmenes de 0.1 M de HCl, 10 volúmenes de agua, 5 volúmenes de 0.1 M de NaOH y volúmenes de agua. Una muestra de (1 g) se tituló con 0.1 M de HCl a pH de 3.5 - 2.7 (más bajo del pH final del f~ ligando MB) .

EJEMPLO V Activación CDI y Unión Ligando/Brazo Espaciador La Sefarosa CL6B y la celulosa Perloza se activaron con CDI y se titularon por métodos conocidos en el arte. Los 10 niveles de titulación entre 1.0 y 3.5 mmol/g se obtuvieron utilizando 20 a 80 mg de CDI por g de Sefarosa y 30 a 120 mg de CDI por g de celulosa.

Los reactivos de aminas solubles en dioxano API, APM, histamina, AMB, 4AMP, 2AMP, DAH, tiramina (preparada a partir del hidrocloruro por disolución en agua, ajustando el pH a 12 con NaOH ÍM y liofilizado) y dibromotiramina (preparada a partir de hidrocloruro de tiramina por métodos conocidos en el arte) se reaccionaron directamente con muestras de 10 g de matrices activadas de CDI solvatadas con dioxano (1 ml de agua se incluyó con los ligandos de tiramina) . Un exceso de reactivo amina 5 molar se utilizó excepto para DAH el cual fue utilizado en exceso 10 molar. El dioxano (5 ml) se adicionó y la resina se mezcló por 24 horas a temperatura ambiente. Las resinas se lavaron con 3 volúmenes de dioxano 75%, 2 volúmenes de dioxano 33%, 10 volúmenes de agua, 2 volúmenes de HCl 0.1 M y posteriormente 10 volúmenes de agua.

El ácido aminocaproico y la nitrosamina (en sus formas de sales de sodio) no fueron solubles en dioxano. En consecuencia, una solución de aminocaproato de sodio al 40% se preparó disolviendo 80 g de ácido aminocaproico en 64 ml de NaOH 10 M y agua a un volumen final de 200 ml . La celulosa activada solvatada en dioxano (300 g de resina + 150 ml de dioxano) y la Sefarosa (100 g de resina + 50 ml de dioxano) se mezclaron con 80 ml y 30 ml respectivamente de una solución de aminocaproato de sodio por 24 horas a temperatura ambiente. Las resinas aminocaproico fueron lavadas con 2 volúmenes de 66% de dioxano, 2 volúmenes de 33% de dioxano y 20 volúmenes de agua. Similarmente, la nitrotirosina se disolvió en agua y NaOH 3 M para producir 15% de una solución a pH de 11.3. La celulosa activada (10 g) , solvatada con 50% de dioxano se mezcló con 13 ml de solución de nitrotirosina por 24 horas a temperatura ambiente .

EJEMPLO VI Unión del Ligando por Enlaces Amida Acoplamiento de los Lisandos Amida a los Grupos Carboxilo de la Resina Un exceso de ligandos seleccionados 5 molar de 4AMP, 3AMP, DEAPA o API se ajustó a pH 4.7 con HCl 6 M y se mezcló con resina aminocaproico (1.55 mmol/g) preparada como se describió en el EJEMPLO V. El pH se ajustó a 4.7 con HCl o NaOH 1 M como sea adecuado y se adicionó un exceso 3 molar de carbodiimida soluble en agua (EDC, 50% en solución de agua) . El pH se mantuvo a 4.7 por 1 hora con HCl o NaOH 1 M como sea adeacuado y se mezcló adicinalmente por 10 horas sin ajuste a temperatura ambiente. Un exceso posterior de 1 molar de EDC se adicionó y el pH se ajustó por 1 hora y se agitó continuamente por 10 horas como antes. La resina entonces se lavó con 10 volúmenes de agua, 2 volúmenes de HCl y 10 volúmenes de agua. La etanolamina se acopló a la celulosa nitrotirosina por el mismo método. No pudieron detectarse grupos carboxilos residuales en la resina por métodos de titulación sensibles a 20 micromoles/g.

B. Acoplamiento de los Ligandos Carboxilo a las Resinas niaminohexano El método utilizado fue similar al utilizado en el EJEMPLO VI (a) anterior pero el pH de la solución del ligando (conteniendo un ligando seleccionado del ácido 4-hidroxibenzoico, ácido 3-cloro-4-hidrofenilacético o ácido 3-nitro-4- hidroxibenzoico) se ajustó con NaOH 1 M, el pH se mantuvo a 5, la celulosa dia inohexano se utilizó y un lavado con NaOH 0.1 M reemplazó el HCl de lavado .

Para el ácido diclorosalicílico, se preparó una sal de sodio por adición de NaOH 1 M a una suspensión del ácido (0.3 g) en agua hasta que el pH estuvo estable a 7 y la solución entonces se liofilizó. La sal resultante fue disuelta en 10 ml de DMSO y se mezcó con EEDQ (0.5 g disueltos en 5 ml de etanol) y celulosa diaminohexano solvatada con 50% de DMSO. La mezcla se agitó por 6 horas a temperatura ambiente. Un adición posterior de 0.5 g de EEDQ se hizo y la reacción se continuó por 18 horas. La resina se lavó con 5 volúmenes de DMSO, 2 volúmenes de DMSO al 50%, 10 volúmenes de NaOH 0.1 M y 10 volúmenes de agua. El acoplamiento de los grupos amino a la resina por estos métodos fue solo completa entre el 80 al 90%. Los grupos amino resuduales fueron bloqueados por métodos conocidos en el arte (p. ej . , por acetilación).

EJEMPLO VII Capacidad de la Resina La capacidad de prueba fue conducida en una operación en lote utilizando una variante de subtilisina obtenida como se describe en la Patente U.S. No. 5,185,258 publicada en Febrero 9, 1993, la divulgación completa se incorporó aqui en la referancia. Las soluciones amortiguadoras cargadas fueron: pH 8: 25 mM TRIS™ + NaCl 0.5 M pH 7: 10 mM fosfato + NaCl 0.5 M La resina se equilibró con una carga de solución amortiguadora (5 volúmenes) y se secó por succión. Una muestra de la resina (2 a 4 g) se pesó en un cilindro midiendo 10 ml, se suspendieron en una carga de solución amortiguadora y se dejó por 48 horas (para determinar la relación peso:volumen de la resina) . Otra muestra de la resina (0.1 a 0.15 g) se pesó en un frasco de 25 ml y se mezcló con 8 ml de sulbtilisina previamente ajustada para una carga con pH con NaOH 1 M por 1 hora a 4° C en una rueda rotativa. La resina fue eluida con una solución amortiguadora 25 mM de acetato (pH 5.2) en un matraz volumétrico de 10 ml. La elución se probó para la actividad enzimática (utilizando un método de prueba con un sustrato de succinil-ala-ala-pro-fen-pNA) y un contenido de proteína (utilizando una absorbancia a 280 nm y una prueba de ácido bicincónico) . Los datos de capacidad, expresados en mg de proteína/ml de resina, se muestran en la Tabla 2.

La actividad se refiere a la concentración de subtilisina calculada para proporcionar la concentración de proteína activa en mg/ml.

Tabla 2 Dato* da Capacidad de Subtilißina Capacidad del Lote mg/ml Absorbancia Resina Actividad (280nm) * Proteínas** PCC 3 AMPiridina 13 51 50 Carga pH 7.0 PCC 4 AMPiridina 15.2 59 35 Carga pH 7.0 PCC 4 AMPiridina 20 60 75 Carga pH 8.0 P CDI 4 AMPiridina 18.2 51 67 Carga pH 8.0 PCC APP 67/API 33 13.5 41 44 Suponiendo A 2B0pm de 1 0 equivalente a 1 mg ml. Análisis de proteína de acido bianconic. BSA Standar Los datos en la Tabla 2 demuestran que las resinas anteriores tienen buena capacidad de enlace para subtilisina.

EJEMPLO VIII Titulación de Resinas Ionizables Positivamente Hidrofóbicas Una muestra de la resina (1 g: peso húmedo) para ser titulada se lavó con NaOH 0.1 M y entonces se enjuagó con agua. La muestra entonces se suspendió en 9 ml de una solución de 500 mM de NaCl (o como se indica en la Tabla 3) y se tituló con HCl 0.1 N. Los datos de titulación se corrigieron por efectos de dilución por substracción de los valores de titulación obtenidos para un control no derivado de Perloza. Los datos de titulación se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3 Datos de Titulación pH de la forma pH al 90% Resina pKa de la Resina no cargada cuando Cargada empieza a titular PCC DEAPA 9 .3 10.5 8.4 P CDI APMorfolina 7.1 8.9 6.2 PCC APImidazol 6.25 8.0 4.8 P CDI AMBencimidazol 4.8 6.75 4.0 P CDI 2AMPiridina 4.1 6.1 3.0 P CDI 4AMPiridina 4.7 7.2 3.7 PCC 3AMPiridina 4.2 7.0 3.3 PCC API (10 mM NaCl) 5.0 8.0 3.6 P CDI APM (10 mM NaCl) 5.8 8.05 4.8 P CDI AMB (10 mM NaCl) 3.6 6.45 3.0* S ECH Metimazol 5.6 7.6 4.5 S ECH 4-Mercaptopiridina 5.35 7.6 4.2 S ECH Mercaptobencimidazol 4.2 6.5-7.0 3.1 * A valores de pH bajos mayor error se espera debido a la dilución del ácido EJEMPLO IX Tit-plar-i?n de Resinas Ionizables Negativamente Hidrofóbicas Una muestra de la resina (1 g) en NaCl 0.5 M se ajustó a pH de 12 con NaOH 1 M y entonces se tituló a pH de 3 con con HCl 0.1 M. Los datos de titulación se corrigieron por efectos de dilución por substracción de los valores de titulación obtenidos para un control no derivado de Perloza. Los datos de titulación se muestran en la Tabla 4.

Tabla 4 Datos d* Titulación pH de la forma pH 90% Resina Resina pKa no cargada cuando Cargado empieza a titular P CDI DAH Acido 6.4 7.5 Nitrohidroxifenilacético P CDI Nitrotirosina/ 7.2 9.0 etanolamina P CDI DAH Acido 7.2 9.3 Diclorosalicilico P CDI Dibro otiramina 7.7 9.3 P CDI DAH Acido Clorohidroxifenilacético 9.8 6.5 10.8 P CDI DAH Acido Hidroxifenilacético 10.7 7.5 11.2 P CDI Tiramina 10.7 7.5 11.2 PCC 5.2 3.0 6.5 PCCaOmM NaCl) 6.1 3.3 7.5 Los datos en las Tablas 3 y 4 muestran que el rango de pH en el cual las resinas representativas tienen una carga inducible son convertidas de un estado electrostáticamente no cargado a un estado electrostáticamente cargado. Estos datos ilustran que cualquiera habilitado en el arte puede preparar y seleccionar varias resinas teniendo diferentes perfiles de ionización de tal manera que permitan el -uso de una resina la cual es compatible con la proteína por ser recuperada.

EJEMPLO X Recuperación de Subtilisina Utilizando Enlazamien o en Lote A. Recuperación utilizando Perloza API Sustituida (MG1) La resina Perloza 1- (3 -aminopropil) imidazol-substituida (MG1) se preparó utilizando una matriz original de Perloza MT 100 fina (disponible de Secheza, Praga, Checoslovaquia). El volumen expandido de resina es de 6.8 ml por gramo de resina seca. La química de activación utilizada fue la activación del ácido carbonil diimidazol-aminocaproico. La activación sustitución fue de 1.55 M grupos de ácido caproico/g. La funcionalidad ionizable utilizada fue 1- (3 -amin.propil) imidazol , con sustitución de 95-100% de grupos caproico carboxilo. La estructura de la resina se muestra en la Figura 7.

El efecto de sal y el tiempo sobre el enlazamiento en el caldo de subtilisina para la resina MG1 se examinó. La condición de alta sal incluyó la adición de NaCl 0.5 M para la solución amortiguadora de Equilibrio/Lavado. La condición de baja sal no tuvo NaCl extra. El efecto de adición de sal para la solución amortiguadora de elución también se examinó. Las condiciones experimentales fueron como siguen: SAL BAJA SAL ALTA Solución Amortiguadora de 50 mM de Glicina 50 mM de Glicina/0.5 Equilibrio/lavado : M NaCl pH 9.1 pH 9.1 0.8 mm o 48.7 mmho Solución Amortiguadora de 50 mM de Acetato 50 mM de Acetato Elución pH 5.2 0.5 M NaCl 4.3 mmho pH 5.2/52.6 mmho Regeneración: Propilen Glicol/Etanol/0.1 N HCl Caldo: Caldo filtrado a 20 micrones pH 9 18 mmho Cuatro gramos de la resina húmeda fueron equilibrados con una solución amortiguadora de equilibrio de alta o baja sal para dar un volumen total de 10 L. El volumen establecido de resina fue registrado antes del experimento .

Cincuenta mL de caldo de fermentación conteniendo una variante de subtilisina, obtenida como se describió en la U.S. serie 137,240, registrada en Octubre 14, 1993, la divulgación entera de ella se incorporó aquí en la referencia, se ajustó al pH propio. Al tiempo .0, se adicionaron al caldo 10 mL de solución amortiguadora y la resina. Una adición de 1 mL de agua se adicionó para enjuagar el tubo de prueba. La mezcla fue agitada en un matraz de peso conocido bajo condiciones de regrigeración por 5 minutos. Al término de ese tiempo, una porción del sobrenadante se filtró a través de un embudo Buchner conteniendo papel filtro Whatman. Una muestra de 0.1 mL se colectó. Entonces el sobrenadante y la resina fueron una vez más puestas en contacto por 30 minutos adicionales .

Al final de ese tiempo todo el sobrenadante se separó de la resina por filtración. La resina se enjuagó con una solución amortiguadora de Equilibrio/Lavado, entonces se colocó de regreso en el matraz y se puso en contacto con 100 mL de solución amortiguadora de Lavado para remover cualquiera de los componentes de enlace no selectivo. La solución de nuevo se filtró. La resina entonces se puso en contacto con 100 mL de solución amortiguadora de elución por lo menos una hora.

Después de la elución, la resina se puso en contacto con propilenglicol por lo menos durante 10 minutos. Esto fue seguido de un breve enjuague de etanol. Finalmente, la resina se puso en contacto con una solución amortiguadora de regeneración de HCl 0.1 M por lo menos durante 15 minutos .

Las muestras de los sobrenadantes y las fracciones de elución fueron analizadas para determinar actividad. Más subtilisina fue enlazada a la resina después de 35 minutos cuando se comparó con la enlazada después de 5 minutos. Los resultados después de 35 minutos se .muestran en la Tabla 5.

Tabla 5 Enlace de la Subtilisina en el lote MG1 Sal Baja Sal Alta Volumen de Resina (ml) 6.0 6.0 Total de Enzima activa en 343.99 328.50 Contacto con Resina (mg) Total de Enzima no ligada (mg) 192.06 175.74 Total de Enzima Ligada (mg) 151.93 152.76 Total de Enzima eluída (mg) 19.35 62.63 Total de Enzima no Recuperada (mg) 132.58 90.13 Capacidad de la Resina (mg/ml) 25.32 25.46 Los datos de la Tabla 5 demuestran que la resina MG1 enlaza aproximadamente la misma cantidad de subtilisina a una fuerza iónica alta y baja, con capacidad de cerca de 25 mg/ml bajo cualesquiera de las condiciones. La eficiencia de elución fue mejor utilizando solución amortiguadora de elución de alta sal.

R. Recuperación utilizando Perloza 4AMP Sustituida (MG2) La resina Perloza 4- (aminometil) piridina-substituida (MG2) se preparó utilizando una matriz original de Perloza MT 100 fina. El volumen expandido de resina preparada fue de 6.8 ml por gramo de resina seca. La química de activación utilizada fue la activación del ácido carbonil diimidazol-aminocaproico . La* activación sustitución fue de 1.55 mM grupos de ácido caproico/g. La funcionalidad ionizable utilizada fue 4- ( minometil) piridina, con sustitución de 95-100% de grupos caproico carboxilo. La estructura de la resina se muestra en la Figura 7.

El efecto de la concentración de sal sobre el enlazamiento de subtilisina para la resina MG2 se examinó. La condición de alta sal incluyó la adición de NaCl 0.5 M para la solución amortiguadora de Equilibrio/Lavado. La condición de baja sal no tuvo NaCl extra. La misma solución amortiguadora de elución fue utilizada para ambos. Las condiciones experimentales fueron como siguen: SAL BAJA SAL ALTA Equilibrio/ Solución Amortiguadora: 50 mM de Tris 50 mM de Tps/0.5 M NaCl pH 7.7 pH 7.7 3.3 mmho 51.2 mmho Solución Amortiguadora de Elución 1 & 2: 100 mM de Acetato 100 mM de Acetato pH 5.2 pH 5.2 8.2 mmho 8.2 mmho Regeneración: Propilen Glicol/Etanol/0.1 N HCl Caldo: Caldo filtrado a 20 micrones pH 7.7 16.8 mmho Los procedimientos seguidos fueron como en el EJEMPLO X-A anterior, excepto que la muestra se puso en contacto con la primera solución amortiguadora de elución por 90 minutos y con la segunda solución amortiguadora de elución por 30 minutos.

Las muestras de los sobrenadantes y las fracciones de elución fueron analizadas para determinar contenido total de proteína y actividad. Los resultados después de 35 minutos se muestran en la Tabla 6.

Tabla 6 Enlace de la Subtilisina en el lote MG2 Sal Baja Sal Alta Tot. Prot. Enzima Otros Tot. Prot . Enzima Otros Proteína en contacto con resina (mg) 1552.27 431.86 1120.40 1709.95 467.38 1242.57 Proteínas no enlazada ( g) 1092. .24 219. .99 872, .25 990, .03 213. .17 776. ,86 Enlace Total (mg) 460, .02 211. .87 248. .16 719, .92 254, .21 465. .71 Elución El 343. .86 153 .79 190 .08 403 .54 161 .29 242 .25 Elución E2 2 .98 11, .57 15 .41 18 .75 12, .14 6 .61 Total de Proteínas no Recuperada (mg) 104.58 46.51 58.07 333.49 80.78 233.97 Capacidad de la Resina (mg/ml) 73.02 33.63 39.39 128.56 45.39 83.17 Volumen de Resina (ml) 6.3 5.6 Los datos de la Tabla 6 ilustran que la MG2 tiene una capacidad de enzima activa de cerca de 33 mg/ml a baja sal y de cerca de 42 mg/ml a alta sal. La capacidad de proteína total es significativamente más alta a 73 y 129 mg/ml respectivamente. Aunque el enlace hidrofóbico se mejoró a una concentración alta de sal, aproximadamente % de la proteína total y aproximadamente 50% de ia proteína objetivo fue enlazada a concentraciones bajas de sal. La elución fue más eficiente que en MG1, y la segunda elución no removió mucha de la subtilisina adicional.

EJEMPLO XI Recuperación de Subtilisina Utilizando Perloza Aminomefil Piridina Sustituida A. Recuperación en una columna de fluio radial de 50 L La matriz de celulosa regenerada Perloza MT 100 fina (Secheza, Praga, Checoslovaquia) se activó con CDI de acuerdo al Ejemplo VI. Fue sustituida con 4-aminopeptilpiridina como funcionalidad ionizable utilizando un brazo espaciador de ácido aminocaproico. El volumen expandido de resina preparada fue de 6.8 ml por gramo de resina seca. La química de activación utilizada fue la activación del ácido carbonil diimidazol-aminocaproico. La sustitución de la funcionalidad ionizable fue de 95-100% de grupos caproico carboxilo. La estructura de la resina se muestra en la Figura 7.

A una columna de cromatografía de flujo radial de 50 mL (Sepragen, Corp., San Leandro, California) fue empacada con la resina preparada anteriormente y utilizada para recuperar subtilisina PURAFECT™, comercialmente disponible de Genencor International, Inc., South San Francisco, California, como se describe a continuación: Tratamiento del caldo: El caldo completo se centrifugó por 45 min. en una centífuga Sorvall de congelación a 4,500 rpm. La conductividad del concentrado no se ajustó, y no se hicieron diluciones. Se filtró para remover las partículas mayores de 10 micrones. El pH del caldo no se ajustó (era ya de 7.6) La conductividad del caldo fue de 16 mmho. El caldo contenía 8.9 mg/ml de proteína activa, así como algunas proteínas contaminantes.

Soluciones amortiguadoras: Solución amortiguadora de equilibrio: 50 mM TRIS™: pH 7.8 + NaCl a 17 mmho Solución amortiguadora de lavado: 50 mM TRIS™/ pH de 7.8; + NaCl a 17 mmho. Solución amortiguadora de elución: 25 mM acetato, 40% de propilenglicol, 8% formato de sodio, pH 5.2, 30 mmho. Solución amortiguadora de regeneración: HCl 0.1 N, pH 1.9, 30 mmho .

El caldo central (251 ml) se cargó en una columna a pH de 7.8 y a una conductividad de 16-18 mmho (equivalente a una concentración de NaCl de 0.15-0.18 M) . La velocidad de flujo fue de 10 ml/min. La subtilisina enlazada a la resina no cargada, formó un complejo resina/proteína. La columna se lavó con 25 volúmenes de la columna a 15 ml/min y se eluyó sobre 15 volúmenes de columna a 5 ml/min. Hubo una mínima activadad de enzima detectada en el flujo a través de las fracciones, el 93% de la subtilisina formó un complejo con la resina. El 42% de la enzima enlazada se perdió durante el lavado. La presión a través de la corrida fue abajo de 10 psi.

Este complejo se rompió y la enzima se eluyó por disminución del pH e incremento de la conductividad utilizando la solución amortiguadora de elución anterior.

El 91% de la enzima enlazada se recuperó. La concentración máxima de la fracción fue de 12.8 mg/ml, y el 90% de la enzima recuperada eluida con 4 CVs . Debido a las pérdidas por lavado, la recuperación total fue de 48.6%. La relación de activad de enzima a proteína total que mostraron la mayor parte de las fracciones de elución concentradas fueron de 15-25% más puras que las alimentadas .

B. Recuperación en una columna de fluí o axial e ^ =; mL A una columna de cromatografía de flujo axial de 3.5 L (Pharmacia) fue empacada con la misma resina preparada anteriormente y utilizada para recuperar subtilisina de caldo similar, utilizando diferente tratamiento del caldo y soluciones amortiguadoras algo diferentes.

Tratamiento del caldo: Ei caldo completo se centrifugó por 45 min. en una centífuga Sorvall de congelación a 4,500 rpm. La conductividad del concentrado no se ajustó, y no se hicieron diluciones. Se filtró para remover las partículas mayores de 10 micrones. El pH del caldo no se ajustó (era ya de 7.6) . La conductividad del caldo fue de 14 mmho. El caldo contenía 9.8 mg/ml de proteína activa, así como algunas proteínas contaminantes.

Soluciones amortiguadoras: Solución amortiguadora de equilibrio: 50 mM TRIS™, + NaCl a 14 mmho, pH 7.6. Solución amortiguadora de lavado: 50 mM TRIS™, + NaCl a 14 mmho, pH 7.6. Solución amortiguadora de elución: 25 mM acetato, 40% de propilenglicol, 0.8% formato de sodio, pH 5.2 , 5 mmho.

Solución amortiguadora de regeneración: HCl 0.1 N, El caldo central (14.4 ml) se cargó en una columna a pH de 7.6 y a una conductividad de 14 mmho (equivalente a una concentración de NaCl de 0.13 M) . La velocidad de flujo fue de 0.85 CV/min. La subtilisina enlazada a la resina no cargada, formaron un complejo resina/proteína. La columna se lavó con 155 volúmenes de la columna y se eluyó sobre 93 volúmenes de columna a 5 ml/min. No hubo enzima activa detectada en el flujo a través de las fracciones. En consecuencia, todala subtilisina formó un complejo con la resina. Hubo una pérdida del 32% de la enzima enlazada en los últimos lavados. La presión de corrida fue abajo de 15 psi.

Este complejo se rompió y la enzima se eluyó por disminución del pH utilizando la solución amortiguadora anterior (equivalente a una concentración de NaCl de 0.03). El 86% de la enzima enlazada se recuperó. La recuperación total de subtilisina fue de 58% cuando se incluyeron las pérdidas por lavado.

Puede ser aparente para cualesquiera habilitado en el arte que varios de los cambios y modificaciones de naturaleza obvia pueden ser hechos sin tomar en cuenta el espíritu de la invención, y todas aquellas modificaciones son consideradas dentro del alcance de la invención, como se establece en las siguientes reivindicaciones:

Claims (6)

REIVINDICACIONES

1. Un complejo resina-proteína/péptido el cual comprende una resina y una proteína o un péptido objetivo enlazado a esta, caracterizado porque la resina comprende a) una matriz de soporte sólido; y b) un ligando ionizable, seleccionado covalentemente, unido a la matriz donde el ligando ionizable está seleccionado de tal forma que la resina está electrostáticamente no cargada al pH donde la proteína o el péptido objetivo está enlazado a la resina y está electrostáticamante cargado al pH donde la proteína o el péptido objetivo está desabsorbido de la resina y donde además cerca del 50 por ciento o más de la proteína o el péptido objetivo en un medio acuoso se enlaza a la resina cuando el medio acuoso tiene una fuerza iónica tanto alta como baja.

2. El complejo resina-proteína/péptido de la reivindicación 1, caracterizado porque el ligando ionizable está electrostáticamente no cargado al pH donde la proteína o el péptido objetivo está enlazado a la resina y está positivamente cargado al pH donde la proteína o el péptido objetivo está desabsorbido de ia resina .

3. El complejo resina-proteína/péptido de la reivindicación 1 , caracterizado porque el ligando ionizable está electrostáticamente no cargado al pH donde la proteína o el péptido objetivo está enlazado a la resina y está negativamante cargado al pH donde la proteína o el péptido objetivo está desabsorbido de la resina.

4. El complejo resina-proteína/péptido de la reivindicación 1 , caracterizado porque el ligando ionizable comprende un grupo funcional ionizable directamente unido a la matriz de soporte sólido. 5. El complejo resina-proteína/péptido de la reivindicación 1, caracterizado porque el ligando ionizable comprende un brazo espaciador y por lo menos una funcionalidad ionizable donde la funcionalidad ionizable está unida a la matriz de soporte sólido vía el brazo espaciador. 6. El complejo resina-proteína/péptido de la reivindicación 1 , caracterizado porgue la matriz de soporte sólido está funcionalizada con grupos carboxilo los cuales están protonados al pH donde la proteína o el péptido objetivo está enlazado a la resina y están desprotonados y negativamente cargados al pH donde la proteína o el péptido objetivo está desabsorbido de la res a. 7. El complejo resina-proteína/péptido de la reivindicación 1, caracterizado porque la resina también comprende ligandos no ionizables. 8. El complejo resina-proteína/pépticto de la reivindicación 1 , caracterizado porque los rangos de los porcentajes de ligandos no ionizables unidos a la matriz de soporte sólido basados sobre el total de ligandos ionizables y no ionizables son más grande de 0% y cerca de 80%. 9. El complejo resina-proteína/péptido de la reivindicación 8, caracterizado porque los rangos de los porcentajes ligandos no ionizables unidos a la matriz de soporte sólido basados sobre el total de ligandos ionizables y no ionizables son más grandes de 0% y cerca de 40%. 10. El complejo resina-proteína/péptido de la reivindicación 1, caracterizado porque la matriz de soporte sólido está entrecruzada. 11. El complejo resina-proteína/péptido de la reivindicación 1, caracterizado porque la resina contiene cerca de 0.05 mmol a cerca de 0.5 mmol de ligando ionizable por ml de matriz de soporte sólido antes de la unión covalente a cualquiera de los ligandos no ionizables. 12. El complejo resina-proteína/péptido de la reivindicación 1 , caracterizado porque la matriz de soporte sólido base es no ionizable. 13. El complejo resina-proteína/péptido de la reivindicación 1 , caracterizado porque la matriz de soporte sólido contiene una funcionalidad ionizable la cual está electrostáticamente no cargada al pH donde la proteína o el péptido objetivo está enlazado a la resina y está electrostáticamente cargada al pH donde la proteína o el péptido objetivo está desabsorbido de la resina. 14. El complejo resina-proteína/péptido de la reivindicación 1 caracterizado porque la carga electrostática inducida del complejo resina-proteína/péptido está a la misma polaridad que la carga electrostática neta en la proteína o el péptido objetivo al pH de desorción. 15. El complejo resina-proteína/péptido de la reivindicación 1 , caracterizado porque la carga electrostática inducida en el complejo resina-proteína/péptido está en polaridad opuesta a la carga electrostática neta en la proteína o el péptido objetivo al pH de desorción. 16. Un complejo resina-proteína/péptido el cual comprende una resina y una proteína o péptido objetivo enlazada a ella, caracterizado porque dicha resina comprende : a) una matriz de soporte sólido teniendo una funcionalidad ionizable seleccionada, incorporada dentro de la columna de ella donde la funcionalidad ionizable está seleccionada de tal manera que la resina está electrostáticamente no cargada al pH donde la proteína o el péptido objetivo está enlazado a la resina y está electrostáticamente cargada al pH donde la proteína o el péptido objetivo está desabsorbida de la resina; y b) un ligando no ionizable covalentemente unido a ella, donde cerca del 50 por ciento o más de la proteína o el péptido objetivo en un medio acuosos se enlaza a la resina cuando el medio acuoso tiene una fuerza iónica tanto alta como baja. 17. El complejo resina-proteína/péptido de la reivindicación 16, caracterizado porque la funcionalidad ionizable está electrostáticamente no cargada al pH donde la proteína o el péptido objetivo esta enlazado a la resina y está positivamente cargada al pH donde la proteína o el péptido objetivo está desabsorbido de la resina. 18. El complejo resina-proteína/péptido de la reivindicación 16, caracterizado porque la funcionalidad ionizable está electrostáticamente no cargada al pH donde la proteína o el péptido objetivo esta enlazado a la resina y está negativamente cargada al pH donde la proteína o el péptido objetivo está desabsorbido de la resina. 19. El complejo resina-proteína/péptido de la reivindicación 16, caracterizado porgue la funcionalidad ionizable comprende grupos amino covalentemente unidos a la columna de la matriz de soporte sólido. 20. El complejo resina-proteína/péptido de la reivindicación 16/ caracterizado porque la matriz de soporte sólido está entrecruzada. 21. El complejo resina-proteína/péptido de la reivindicación 16, caracterizado porque la resina contiene cerca de 0.05 mmol a cerca de 0.5 mmol de ligando no ionizable por ml de matriz de soporte sólido. 22. El complejo resina-proteína/péptido de la reivindicación 16 / caracterizado porque la carga electrostática inducida sobre la resina del complejo resina-proteína/péptido está a la misma polaridad que la carga electrostática neta en la proteína o el péptido objetivo al pH de desorción. 23. El complejo resina-proteína/péptido de la reivindicación 16 t caracterizado porque la carga electrostática inducida en la resina del complejo resina-proteína/péptido está a la polaridad opuesta que la carga electrostática neta en la proteína o el péptido objetivo al pH de desorción. 24. Un método para enlace y recuperación de una proteína o un péptido objetivo de un medio acuoso que comprende la proteína o el péptido objetivo, caracterizado porque el método comprende: a) poner en contacto al medio con la resina bajo condiciones suficientes que permiten que la proteína o el péptido objetivo se enlace a la resina donde dicha resina comprende una matriz y un ligando ionizable seleccionado covalentemente unido a la matriz donde el ligando ionizable está seleccionado de tal manera que la resina está electrostáticamente no cargada al pH donde la proteína o el péptido está enlazado a la resina y está electrostáticamente cargada al pH donde la proteína o el péptido está desabsorbido de la resina y donde posteriormente cerca del 50 por ciento o más de la proteína o el péptido objetivo en el medio acuoso se enlaza a la resina cuando el medio acuoso tiene una fuerza iónica ya sea alta o baja. b) la separación de la resina conteniendo la proteína o el péptido objetivo enlazado de los otros componentes del medio para producir un complejo resina-proteína/péptido; y c) la desabsorción de la proteína o el péptido objetivo enlazado del complejo por contacto del complejo con una solución de desabsorción teniendo un pH el cual induce una carga electrostática sobre la resina donde la carga inducida es de la misma polaridad que la carga neta sobre la proteína o el péptido objetivo al pH de la solución de desabsorción. 25. Un método para enlace y recuperación de una proteína o un péptido objetivo de un medio acuoso que comprende la proteína o el péptido objetivo, caracterizado porque el método comprende : a) poner en contacto al medio con la resina bajo condiciones suficientes que permiten que la proteína o el péptido objetivo se enlace a la resina donde dicha resina comprende una matriz y un ligando ionizable seleccionado covalentemente unido a la matriz donde el ligando ionizable está seleccionado de tal manera que la resina está electrostáticamente no cargada al pH donde la proteína o el péptido está enlazado a la resina y está electrostáticamente cargada al pH donde la proteína o el péptido está desabsorbido de la resina y donde posteriormente cerca del 50 por ciento o más de la proteína o el péptido objetivo en el medio acuoso se enlaza a la resina cuando el medio acuoso tiene una fuerza iónica ya sea alta o baja. b) la separación de la resina conteniendo la proteína o el péptido objetivo enlazado de los otros componentes del medio para producir un complejo resina-proteína/péptido; y c) la desabsorción de la proteína o el péptido objetivo enlazado del complejo por contacto del complejo con una solución de desabsorción teniendo un pH el cual induce una carga electrostática sobre la resina donde la carga inducida es de la misma polaridad que la carga neta sobre la proteína o el péptido objetivo al pH de la solución de desabsorción. 26. El método de la reivindicación 24 o de la reivindicación 25, caracterizado porque la carga inducida en la resina es una carga positiva. 27. El método de la reivindicación 24 o de la reivindicación 25, caracterizado porque la carga inducida en la resina es una carga negativa. 28. El método de la reivindicación 24 o de la reivindicación 25, caracterizado porque el medio acuoso está en contacto con la resina en un proceso en agitación en lote. 29. El método de la reivindicación 24 o de la reivindicación 25, caracterizado porque el medio acuoso está en contacto con la resina en una columna de cromatografía. 30. El método de la reivindicación 29, caracterizado porque el medio acuoso está en contacto con la resina en una cama fluidizada expandida. 31. El método de la reivindicación 29, caracterizado porque la columna es una columna de flujo radial. 32. El método de la reivindicación 24 o de la reivindicación 25, caracterizado porque el medio acuoso es un caldo crudo de fermentación. 33. El método de la reivindicación 32, caracterizado porque el caldo crudo de fermentación comprende una proteína seleccionada del grupo consistente de quimosina y subtilisina. 34. El método de la reivindicación 24 o de la reivindicación 25, caracterizado porque el enlace de la proteína o el péptido objetivo a la resina se conduce a un pH desde 2 hasta 12. 35. El método de la reivindicación 34, caracterizado porque el enlace de la proteína o el péptido objetivo a la resina se conduce a un pH desde 5 hasta 9. 36. El método de la reivindicación 34, caracterizado porque la desorción de la proteína o el péptido objetivo a la resina se conduce a un pH dentro del rango desde 2 hasta 12 pero a un pH diferente que el empleado para enlazar la proteína o el péptido objetivo a la resina. 37. El método de la reivindicación 35, caracterizado porque la desorción de la proteína o el péptido objetivo a la resina se conduce a un pH dentro del rango de 5 a 9 pero a un pH diferente que el empleado para enlazar la proteína o el péptido objetivo a la resina. 38. El método de la reivindicación 34, caracterizado porque el pH de la mezcla acuosa es ajustado a un pH de cerca de 2 a cerca de 12 antes del contacto de la mezcla con la resina. 39. Un método para enlace y recuperación de una proteína o un péptido objetivo de un medio acuoso que comprende la proteína o el péptido objetivo, caracterizado porque el método comprende: a) poner en contacto al medio con la resina bajo 5 condiciones suficientes que permiten que la proteína o el péptido objetivo se enlace a la resina donde dicha resina comprende una matriz de soporte sólido teniendo una funcionalidad ionizable seleccionada, incorporada a la columna de ella donde la funcionalidad ionizable está seleccionada de tal 10 manera que la resina está electrostáticamente no cargada r al pH donde la proteína o el péptido objetivo está enlazado a la resina y está electrostáticamente cargada al pH donde la proteína o el péptido está desabsorbido de la resina donde cerca del 50 por ciento o más de la proteína o el 15 péptido objetivo en el medio acuoso se enlaza a la resina cuando el medio acuoso tiene una fuerza iónica ya sea alta o baja. / b) la separación de la resina conteniendo la 20 proteína o el péptido objetivo enlazado de los otros componentes del medio para producir un complejo resina- proteína/péptido; y c) la desabsorción de la proteína o el péptido 25 objetivo enlazado del complejo por contacto del complejo con una solución de desabsorción teniendo un pH el cual induce una carga electrostática sobre la resina donde la carga inducida es de la misma polaridad a la carga neta sobre la proteína o el péptido objetivo al pH de la solución de desabsorción. 40. Un método para enlace y recuperación de una proteína o un péptido objetivo de un medio acuoso que comprende la proteína o el péptido objetivo, caracterizado porque el método comprende: a) poner en contacto al medio con la resina bajo condiciones suficientes que permiten que la proteína o el péptido objetivo se enlace a la resina donde dicha resina comprende una matriz teniendo una funcionalidad ionizable incorporada a la columna de ella donde la funcionalidad ionizable está seleccionada de tal manera que la resina está electrostáticamente no cargada al pH donde la proteína o el péptido objetivo está enlazado a la resina y está electrostáticamente cargada al pH donde la proteína o el péptido está desabsorbido de la resina donde más del 50 por ciento de la proteína o el péptido objetivo en el medio acuoso se enlaza a la resina cuando el medio acuoso tiene una fuerza iónica ya sea alta o baja. b) la separación de la resina conteniendo la proteína o el péptido objetivo enlazado de los otros componentes del medio para producir un complejo resina-proteína/péptido; y c) la desabsorción de la proteína o el péptido objetivo enlazado del complejo por contacto del complejo con una solución de desabsorción teniendo un pH el cual induce una carga electrostática sobre la resina donde la carga inducida es de polaridad opuesta a la carga neta sobre la proteína o el péptido objetivo al pH de la solución de desabsorción. 41. El método de la reivindicación 39 o de la reivindicación 40, caracterizado porque la carga inducida en la resina es una carga positiva. 42. El método de la reivindicación 39 o de la reivindicación 40, caracterizado porque la carga inducida en la resina es una carga negativa. 43. El método de la reivindicación 39 o de la reivindicación 40, caracterizado porque el medio acuoso está en contacto con la resina en un proceso en agitación en lote. 44. El método de la reivindicación 39 o de la reivindicación 40, caracterizado porque el medio acuoso está en contacto con la resina en una columna de cromatografía. 45. El método de la reivindicación 44, caracterizado porque el medio acuoso está en contacto con la resina en una cama fluidizada. 46. El método de la reivindicación 44, caracterizado porque la columna es una columna de flujo radial. 47. El método de la reivindicación 39 o de la reivindicación 40, caracterizado porque el medio acuoso es un caldo crudo de fermentación. 48. El método de la reivindicación 47, caracterizado porque el caldo crudo de fermentación comprende una proteína seleccionada del grupo consistente de quimosina y subtilisina. 49. El método de la reivindicación 39 o de la reivindicación 40, caracterizado porque el enlace de la proteína o el péptido objetivo a la resina se conduce a un pH desde 2 hasta 12. 50. El método de la reivindicación 49, caracterizado porque el enlace de la proteína o el péptido objetivo a ia resina se conduce a un pH desde 5 a 9. 51. El método de la reivindicación 49, caracterizado porque la desorción de la proteína o el péptido objetivo a la resina se conduce a un pH dentro del rango de 2 a 12 pero a un pH diferente que el empleado para enlazar la proteína o el péptido objetivo a la resina. 52. El método de la reivindicación 50, caracterizado porque la desorción de la proteína o el péptido objetivo a la resina se conduce a un pH dentro del rango de 5 a 9 pero a un pH diferente que el empleado para enlazar la proteína o el péptido objetivo a la resina. 53. El método de la reivindicación 49, caracterizado porque el pH de la mezcla acuosa es ajustado a un pH de cerca de 2 a cerca de 12 antes del contacto de la mezcla °on la resina.

5 . Un método para la separación de una proteína o un péptido objetivo de un medio acuoso comprendiendo una proteína o un péptido objetivo, caracterizado porque el método comprende poner en contacto el medio con una resina bajo condiciones suficientes para permitir que la proteína o el péptído objetivo se enlace a la resina de tal manera que se forme el complejo resina-proteína/péptido de la reivindicación 1 o de la reivindicación 1

6.