ES2220800T3

ES2220800T3 - Preparaciones de chlorella que muestran propiedades inmunomoduladoras.

Info

Publication number: ES2220800T3
Application number: ES01966835T
Authority: ES
Inventors: Jaroslav A. Kralovec
Original assignee: Ocean Nutrition Canada Ltd
Current assignee: Ocean Nutrition Canada Ltd
Priority date: 2000-08-10
Filing date: 2001-08-09
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2021-08-09
Also published as: US20030152587A1; US6974576B2; JP2004505925A; US6551596B2; AU2001287382B8; EP1307213B1; AU2001287382B9; CA2354832C; CA2354832A1; EP1307213A2; US20020031524A1; DE60103066T2; AU2001287382B2; DE60103066D1; US6977076B2; ATE265218T1; AU8738201A; WO2002011746A2; WO2002011746A3; US20040081665A1

Abstract

Extracto que comprende polisacáridos y complejos de polisacárido de Chlorella de alto peso molecular, en el que los polisacáridos y complejos de polisacárido de alto peso molecular son de 1 x 105 Da a 1 x 107 Da y constituyen al menos el 22% (p/p) del contenido derivado de Chlorella total del extracto.

Description

Preparaciones de Chlorella que muestran propiedades inmunomoduladoras.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a extractos de Chlorella para su uso como inmunomoduladores.

Antecedentes de la invención

Chlorella es un alga verde unicelular que se ha denominado supernutriente que utiliza energía solar. Las propiedades beneficiosas atestiguadas de esta microalga comestible incluyen la cicatrización de heridas, detoxificación, alivio del estreñimiento y estimulación del crecimiento. Varios estudios también han indicado que Chlorella tiene efectos beneficiosos sobre el sistema inmune, tanto in vitro como in vivo.

Chlorella se encuentra tanto en agua dulce como en agua marina. Las especies del género Chlorella muestran una sorprendente diversidad de propiedades fisiológicas y bioquímicas (Kessler, E. "Phycotalk" 1989, 1: 141-153; V. Rastogi Publ., Nueva Delhi, India). Chlorella produce algo de celulosa y otros materiales de la pared celular no digeribles y, por tanto, se han investigado extensamente como una nueva fuente posible de alimento, especialmente como materia prima (lee, Robert E. "Phycology" 2ª edición; 1989, página 281; Cambridge University Press).

Chlorella tiene el mayor contenido de clorofila de cualquier planta ccnocida. También contiene vitaminas, minerales, fibra dietética, ácidos nucleicos, aminoácidos, enzimas, etc. Contiene más del 9% de grasas (de las que los ácidos grasos poliinsaturados [PUFA] representan aproximadamente el 82%). El contenido en vitaminas consiste en provitamina A, vitaminas B_{1}, B_{2}, B_{6}, niacina, B_{12}, biotina, vitamina C, vitamina K, ácido pantoténico, ácido fólico, colina, ácido lipoico, inositol, PABA (ácido paraaminobenzoico), etc. Entre los minerales presentes, los más importantes son P, K, Mg, S, Fe, Ca, Mn, Cu, Zn y Co. Los componentes principales de las células de Chlorella son aproximadamente el 60% de proteínas (compuestas por todos los aminoácidos básicos) y el 20% de hidratos de carbono.

Se han utilizado extractos acuosos de Chlorella pyreinodosa por su contenido nutritivo así como por otros beneficios para la salud. Los estudios notifican numerosos beneficios para la salud incluyendo la función mejorada del sistema inmune y la detoxificación de toxinas nocivas. Se introdujo como un alimento dietéticos en los EE.UU. en 1977 cuando se desarrollaron procedimientos de tecnología novedosa que la hicieron más digerible y ha sido el complemento alimenticio dietético más vendido en Japón durante varios años. La empresa Taiwan Chlorella es el mayor proveedor mundial de Chlorella, y vende el producto en todo el mundo, a Asia, Europa y Norte América bajo los nombres de marca: Algea, Bio-REU-RELLA, Green Gem, Green Boost, Green Nature, Green Power, Joyau Vert y Natural Boost.

Varios estudios han documentado que los extractos de C. vulgaris tienen actividad antitumoral, así como actividad frente a Listeria y E. coli (Tanaka et al. Immunopharmacol. Immunotoxicol., 1990, 12(2): 271-291; Tanaka et al. Cancer Immunol. Immunother., 1998, 45(6): 313-320; Hasegawa et al. Int. J. Immunopharmacol., 1990, 12(8): 883-891). Estas actividades parecen estar mediadas inmunológicamente en vez de una toxicidad directa frente al tumor o patógeno.

Están disponibles comercialmente varios extractos de Chlorella, incluyendo productos de Swiss Herbal y Nature's Way. El producto de Swiss Herbal se identifica como células fragmentadas de Chlorella pura que contienen un 61% de proteínas, un 21,1% de hidratos de carbono, un 11,0% de grasas, un 2,866% de clorofila, un 2,94% de ARN y un 0,28% de ADN.

Otras publicaciones referidas al presente campo incluyen las siguientes:

La solicitud de patente japonesa abierta a consulta por el público número Sho 58-15920 describe polisacáridos procedentes de Chlorella de agua dulce que tienen actividad como potenciador inmune y antitumoral.

Neveu et al. Experiencia, 1978, 34(12): 1644-1645 describen que la C. pyrenoidosa es un modulador de la respuesta inmune.

Vermeil y Morin CR Seances Soc. Biol. Fil., 1976, 170(3):646-649 describen que C. pyrenoidosa, presumiblemente por la naturaleza de su pared celular, protege a los ratones frente al injerto de sarcoma.

Miyazawa et al. J. Ethnophasmacol., 1988, 24(2-3): 135-146 describen que las células o el extracto de C. pyrenoidosa median el aumento inmune del huésped de la respuesta antitumoral.

Umezawa et al. Chemotherapy, 1982, 30(9): 1041-1046 y Komiyama et al. Chemotherapy, 1986, 34: 302-307 describen que el polisacárido ácido Chlon A procedente de C. pyrenoidosa tiene efectos de aumento inmune y antitumorales. El Chlon A contiene ramnosa, arabinosa, glucosa, galactosa y ácido glucurónico.

White y Barber, Biochimica Biophysica Acta, 1972, 264: 117-128 describen un polisacárido ácido de 88 kDa procedente de C. pyrenoidosa que contienen principalmente ramnosa, así como arabinosa, galactosa, xilosa, manosa y ácido glucurónico.

La patente de los EE.UU. número 4.533.548 describe el polisacárido ácido CH-1 procedente de C. pyrenoidosa que contiene principalmente ramnosa, así como arabinosa, galactosa, glucosa y ácido glucurónico. El polisacárido se obtuvo mediante filtración en gel con Sephadex G-75.

La patente de los EE.UU. número 4.381.020 describe un extracto de polisacárido procedente de C. minutissima, una Chlorella marina, con actividad inmunoestimulante y antitumoral. Esta patente establece que los polisacáridos procedentes de especies marinas de Chlorella son más eficaces en la activación de la inmunidad que las especies de Chlorella de agua dulce. El extracto de polisacárido se obtuvo mediante filtración en gel con Sephadex G-50.

La patente de los EE.UU. número 4.786.496 describe una fracción lipídica y glucolipídica de Chlorella marina con actividad inmunopotenciadora.

Kojima et al. J. Retic. Soc., 1973, 14: 192-208 describen un glucano activo de 1.250-1.400 Da para el sistema reticuloendotelial (SER) procedente de Chlorella.

La patente de los EE.UU. número 3.462.412 describe un procedimiento para preparar un extracto que estimula el SER procedente de Chlorella.

La solicitud de patente japonesa, publicación número 06248003 describe un extracto de Chlorella de 15 a 25 kDa, que comprende polisacáridos que contienen predominantemente galactosa, con actividad antineoplásica.

Mizuno et al. Bull. Fac. Agr. Shizuoka Univ. (Shizuoka Daigaku Nogakubu Kenkyu Hokoku), 1980, 30: 51-59 describen dos fracciones de glucanos neutros procedentes de Chlorella, ambas aparentemente de bajo peso molecular.

Ukai et al. Ann. Proc. Gifu Pharm. Univ. (Gifu Yakka Daigaku Kilo), 1990, 39: 44-48 describen dos polisacáridos, CP-I y CP-II, procedentes de C. pyrenoidosa con actividad estimulante del SER. CP-I comprende glucosa, fucosa, ramnosa, galactosa y manosa; CP-II comprende glucosa, galactosa, ramnosa y manosa.

Chu et al. Aquaculture, 1982, 29(3-4): 241-252 describen que el polisacárido, la fracción precipitable con etanol de cinco especies de algas incluyendo Chlorella contiene principalmente glucosa, manosa, ribosa/xilosa, ramnosa y fucosa.

Sumario de la invención

Los extractos de Chlorella preparados según la invención muestran actividad de estimulación inmune en pruebas farmacológicas y clínicas. En un aspecto, los extractos previstos por la presente invención tienen una actividad de estimulación inmune superior a la de los extractos preparados y utilizados en la técnica.

En un aspecto, la invención prevé preparaciones que comprenden polisacáridos y complejos de polisacárido de Chlorella de alto peso molecular. Los polisacáridos y complejos de polisacárido de alto peso molecular son de aproximadamente 1 \times 10^{5} Da a aproximadamente 1 \times 10^{7} Da y constituyen al menos el 22% (p/p) del contenido derivado de Chlorella total del extracto. En una realización preferida, el extracto procede de Chlorella pyrenoidosa.

Los polisacáridos y complejos de polisacárido de alto peso molecular pueden ser de un intervalo seleccionado, por ejemplo de 1 \times 10^{5} Da a 3 \times 10^{5} Da, de 3 \times 10^{5} Da a 5 \times 10^{5} Da, de 5 \times 10^{5} Da a 6 \times l0^{5} Da, de 6 \times 10^{5} Da a 7 \times 10^{5} Da, de 7 \times 10^{5} Da a 8 \times 10^{5} Da, de 8 \times 10^{5} Da a 9 \times 10^{5} Da, de 9 \times 10^{5} Da a 1 \times 10^{6} Da, de 1 \times 10^{6} Da a 2 \times 10^{6} Da, de 2 \times 10^{6} Da a 3 \times l0^{6} Da, de 3 \times l0^{6} Da a 4 \times 10^{6} Da, de 4 \times l0^{6} Da a 5 \times 10^{6} Da, de 5 \times 10^{6} Da a 7 \times 10^{6} Da, de 7 \times 10^{6} Da a 9 \times 10^{6} Da y de 9 \times 10^{6} Da a 1 \times 10^{7} Da.

Los extractos contienen al menos un 22% (p/p) de los polisacáridos y complejos de polisacárido como una fracción del contenido derivado de Chlorella total del extracto. El porcentaje puede ser de al menos el 24% (p/p), de al menos el 26% (p/p), de al menos el 28% (p/p), de al menos el 30% (p/p), de al menos el 35% (p/p), de al menos el 40% (p/p), de al menos el 45% (p/p), de al menos el 50% (p/p) o de al menos el 60% (p/p).

En otro aspecto, los polisacáridos y complejos de polisacárido de alto peso molecular contienen glucosa y cualquier combinación de: galactosa, ramnosa, manosa y arabinosa.

En otro aspecto, los polisacáridos y complejos de polisacárido de alto peso molecular están sustancialmente libres de ribosa, ácidos nucleicos, ácidos ribonucleicos y proteínas no asociadas. Los polisacáridos y complejos de polisacárido de alto peso molecular también pueden contener N-acetilglucosamina y N-acetilgalactosamina.

En otro aspecto, los extractos de la invención retienen su actividad inmuncmoduladora tras un tratamiento para eliminar el ADN, ARN y las proteínas no asociados. Tal tratamiento incluye la digestión por pronasa, ADNasa, ARNasa y proteasas.

En otro aspecto, los extractos de la invención retienen su actividad inmunomoduladora tras un tratamiento para llevar a cabo la escisión de enlaces glucosídicos específicos, estando definidos lcs enlaces por su sensibilidad a la escisión por amilasa, amiloglucosidasa, celulasa o neuraminidasa. Tales enlaces sensibles son normalmente:

(i): tres o más unidades de D-glucosa con enlaces \alpha-1,4;

(ii): glucósidos con enlaces \alpha-1,4;

(iii): galactósidos con enlaces \alpha-1,4; o

(iv): D-glucosa con enlaces \alpha-1,4;

La invención también prevé composiciones nutricionales que contiene el extracto de Chlorella de alto peso molecular con al menos una fuente de energía que pueden ser hidratos de carbono, grasas o nitrógeno.

Los extractos de la invención también pueden utilizarse en una combinación o en una mezcla con un complemento convencional tal como vitamina E, vitamina C y ácido fálico. Los extractos también pueden utilizarse con otros productos nutricéuticos tales como aceites de pescado, espirulina y equinácea, especialmente en aquellos productos nutricéuticos que tienen actividad inmunoestimulante.

La invención también prevé un procedimiento para obtener preparaciones de Chlorella que tienen actividad inmunomoduladora. El procedimiento contiene las etapas de:

(a) fraccionar por tamaños un extracto acuoso de Chlorella, y

(b) seleccionar las fracciones que comprenden los polisacáridos y complejos de polisacárido de alto peso molecular de aproximadamente 1 \times 10^{5} Da a aproximadamente 1 \times l0^{7} Da.

El procedimiento para obtener el extracto de Chlorella puede incluir además la etapa de reunir y concentrar las fracciones seleccionadas. El fraccionamiento por tamaños se puede conseguir mediante cromatografía, ultrafiltración o ultracentrifugación.

La invención también prevé un medicamento para su uso en un método para modular la respuesta inmune de un mamífero, incluidos los seres humanos, mediante la administración al mamífero de una cantidad eficaz del extracto de Chlorella de alto peso molecular. Tal modulación incluye el aumento de la proliferación de esplenocitos y el aumento de la producción de citocinas tales como IL-6, IL-10, INF-\gamma y TNF-\alpha y puede utilizarse ventajosamente para tratar o prevenir infecciones bacterianas o fúngicas.

El extracto puede administrarse además como un complemento de un régimen de vacunación para estimular adicionalmente la respuesta inmune. Puede utilizarse ventajosamente una vacuna contra la gripe con el extracto. El extracto puede estar presente como un adyuvante de las vacunas, especialmente como adyuvante de vacuna oral.

Breve descripción de los dibujos

Ahora se describirá la invención en sus diversas realizaciones con referencia a los dibujos adjuntos.

Figura 1: Cromatograma de combinación mediante cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) / detección del índice de refracción (RI) / dispersión de luz láser en múltiples ángulos de preparaciones de recuerdo inmune IBP-1 e IBP-2. El trazo superior es el cromatograma de IR; el trazo inferior es la respuesta de MALS;

figura 2: Perfil del peso molecular acumulado de IBP-1;

figura 3: Cromatograma de SEC de IBP-2 utilizando Sephacryl S 1000 SF;

figura 4: Cromatograma de SEC de IBP-2 (o IBP-1) utilizando Sephacryl S 300 HR;

figura 5: Estimulación de la proliferación de esplenocitos mediante diversas fracciones del extracto de Chlorella resueltas con Sephacryl 300 HR; IBP-6s es la fracción con hombro en el pico de IBP-6; "Células" y "Células + DMSO" son los controles negativos; LPS es lipopolisacárido, utilizado como control positivo;

figura 6: Estimulación de la proliferación de esplenocitos mediante diversas fracciones del extracto de Chlorella resueltas con cromatografía en Sephadex G100 de IBP-2; "Células" es un control negativo; LPS es un control positivo;

figura 7: Curva de valoración - proliferación de esplenocitos de IBP-2; "Células" es un control negativo; LPS es un control positivo;

figura 8: Ensayo de proliferación que mide la incorporación de ^{3}H per células B o T aisladas en presencia de IBP-225 \mug/mL;

figura 9: Producción de óxido nítrico por macrófagos peritoneales inflamatorios de BALB/c cultivados en presencia de diversas concentraciones de IBP-2; "IFN + LPS" es un control positivo;

figura 10: Producción de IL-6 por las células de bazo de ratón BALB/c en presencia de diversas concentraciones de IBP-2; "Con A" es concanavalina A; "Células + Con A" y "Células + LPS" son muestras de control positivo, concanavalina A está a 10 \mug/mL; LPS está a 20 \mug/mL;

figura 11: Efecto de IBP-2 comparado con 4 mg de equinácea (Equin.) sobre la proliferación de Listeria monocytogenes en ratones;

figura 12: Efecto de IBP-2 comparado con el alga bruta y equinácea sobre la proliferación de Candida albicans en ratones;

figura 13: Proliferación de esplenocitos de ratón medido como la incorporación de ^{3}H, cultivados en presencia de IBP-2 de extractos comerciales de Chlorella de Swiss Herbal y Nature's Way.

Figura 14: Cromatograma de electroforesis capilar del extracto crudo y dializado de IBP-2. Los monosacáridos se asignan a los picos tal como sigue: ribosa en la posición 9,05; ramnosa en la posición 10,47; manosa en la posición 10,68; galactosa en la posición 11,14 y glucosa en la posición 11, 65.

Figura 15: Cromatograma de electroforesis capilar de la parte retenida tras hacerse pasar el IBP-2 a través de una membrana de ultrafiltración de MWCO (molecular weight cut off, peso molecular de corte) de 1 MDa. Los monosacáridos se asignan a los picos tal como sigue: N-acetilgalactosamina (Ga1NAc) en la posición 7,30; N-acetilglucosamina (G1cNAc) en la posición 7,43; arabinosa en la posición 10,52; ramnosa en la posición 10,90; manosa en la posición 11,11; (obsérvese que el pico en la posición 11,01 es una burbuja; el pico de manosa está justo a la derecha de este pico); galactosa en la posición 11,62; glucosa en la posición 12,13.

Figura 16: DEAE-Sepharose de flujo rápido de IBP-2. Se aplicó una muestra a una columna de 1,0 \times 30 cm de Pharmacia y se eluyó con tampón de piperazina / HC1 (0,02 M, pH 8,8) a una velocidad de 5 mL/min. Se empleó un gradiente de NaCl: 0-20% en volúmenes de 20 columnas, después 20-100% en volúmenes de 2 columnas.

Figura 17: DEAE-Sepharose de flujo rápido de la parte de retención tras hacerse pasar el IBP-2 a través de una membrana de ultrafiltración de MWCO de 1 MDa. Se aplicó una muestra a una columna de 1,0 \times 30 cm de Pharmacia y se eluyó con tampón de piperazina / HC1 (0,02 M, pH 8,8) a una velocidad de 5 mL/min. Se empleó un gradiente de NaCl: 0-20% en volúmenes de 20 columnas, después 20-100% en volúmenes de 2 columnas.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a la previsión de un medicamento para aumentar los mecanismos de defensa inmunológica de los mamíferos, incluyendo los seres humanos. Las defensas inmunológicas se aumentan mediante la administración de inmunomoduladores derivados de Chlorella en la forma de extractos derivados de Chlorella de pesos moleculares entre 1 \times 10^{5} Da y 1 \times 10^{7} Da.

A.Chlorella

Las especies del género Chlorella utilizadas en la invención incluyen las siguientes: minutissima, marina, salina, pyrenoidosa, vulgaris, anitrata, antactica, autotrophica, regularis, entre otras (véase el Catálogo mundial de algas, 2ª edición, páginas 58-74; Miyachi et al. (Eds); 1989; Japan Scientific Societies Press, cuyo contenido se incorpora como referencia al presente documento).

Las cepas mutantes de Chlorella, que aparecen de manera natural o se producen de manera artificial, por ejemplo mediante irradiación (por ejemplo, ultravioleta, rayos X), mutágenos químicos o mediante mutagénesis dirigida al sitio, están dentro del alcance de la invención. En una realización, se prefieren C. pyrenoidosa y sus variantes. En otra realización, se prefieren C. ellipsoídea y sus variantes. El cultivo de Chlorella se lleva a cabo mediante métodos conocidos en la técnica utilizando medios y condiciones de cultivo adecuados (véase por ejemplo, White y Barber, Biochimica Biophysica Acta, 1972, 264: 117-128).

Puede influirse en la producción de polisacárido mediante manipulación fisiológica y metabólica. La composición de los medios de cultivo puede influir en la velocidad de crecimiento, lo que conduce a cambios en el espesor de la pared celular. Los genes responsables del crecimiento pueden regularse por incremento o por disminución. Para un método utilizado para transformar algas eucarióticas, véase por ejemplo la patente de los EE.UU. 6.027.900; para métodos para seleccionar mutantes de algas, véase por ejemplo la patente de los EE.UU. 5.871.952. Por tanto, mediante la selección entre diversas condiciones, pueden prepararse variantes de inmunomoduladores biopoliméricos procedentes de Chlorella.

B. Extractos de Chlorella y su preparación (a) Preparación del extracto bruto

Se preparan extractos acuosos brutos de Chlorella mediante métodos conocidos en la técnica, incluyendo la extracción con agua caliente de células cultivadas o células secadas por pulverización (documentos US 4.831.020 y US 5.780.096) y los métodos de extracción con disolventes (White y Barber, Biophys. Biochim. Acta, 1972, 264: 117-128; US 3.462.412). Los extractos brutos pueden obtenerse de la empresa Taiwan Chlorella (www.taiwanchlorella.com/
product-3.htm).

En una realización, el extracto bruto se prepara a partir de células de Chlorella secadas por pulverización con un contenido medio de humedad del 0,3%; (el contenido de humedad se determinó tras secar el material secado por pulverización durante 16 h en un vacío de 5 mm). El extracto bruto se prepara tratando las células con medios acuosos, preferiblemente agua o disoluciones débiles de ácidos orgánicos, tales como ácido acético, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido maleico, ácido propiónico, ácido sórbico, ácido succínico, etc., preferiblemente ácido benzoico, con agitación suave. El proceso de extracción podría ejecutarse a diversas temperaturas que oscilan desde 0 hasta 100ºC, preferiblemente de entre 50 y 90ºC. Los rendimientos y la actividad inmunológica que se correlacionan con los perfiles cromatográficos indican que 1 h a 80ºC es una combinación adecuada de tiempo y temperatura para realizar esta etapa de manera eficaz.

Las células residuales y los restos celulares se separaron mediante centrifugación con una fuerza centrífuga relativa (FCR) de 150 a 10.000 g, preferiblemente de 4.000 a 10.000 g. El tiempo necesario para completar esta etapa está relacionado con la fuerza centrífuga; 20 minutos es suficiente a 10.000 g. Entonces, se sometió a microfiltración el sobrenadante. Alternativamente, puede utilizarse la filtración para eliminar células completas y restos, en cuyo caso es necesario el uso de una serie de filtros partiendo de uno grueso, pasando por uno medio y terminando con microfiltración. Se recomienda la filtración de flujo cruzado o la tecnología de membrana vibrante para reducir la suciedad. La filtración es particularmente sensible a la temperatura y el periodo de tiempo requeridos para la extracción. Por tanto, la centrifugación es la vía preferida.

Tras la centrifugación o filtración, puede secarse el sobrenadante (o filtrado) para obtener productos de IBP-1 en forma seca. El secado se consiguió mediante liofilización, flujo de aire frío o preferiblemente mediante secado por pulverización. Alternativamente, en primer lugar podría reducirse el volumen del extracto (hasta el 10-50%, preferiblemente 20%) y luego precipitarse los materiales activos de la disolución con precipitantes adecuados, preferiblemente etanol o sulfato de amonio.

El IBP-1 se liberó de las sales y productos de baja masa molecular. Aunque podría emplearse una variedad de medios acuosos (tales como alcoholes diluidos, diversos tampones, ácido acético diluido, etc.), se encontró que el agua es un medio suficiente para la diálisis. Esta etapa redujo la masa del material extraído en aproximadamente un 50% y aumentó su actividad inmunológica específica (evaluado por el efecto sobre la estimulación de esplenocitos, véase más adelante) en aproximadamente un 25%. La diálisis podría sustituirse por la desalación con medios de filtración en gel, tales como Sephadex G 25, Bio Gel P 6 o equivalentes. De manera similar, podrían utilizarse membranas de ultrafiltración correspondientes con pesos moleculares de corte correspondientes. Tras la etapa de desalación, el material (IBP-2) puede secarse utilizando los métodos descritos para IBP-1.

(b) Fraccionamiento por tamaños de los extractos

El fraccionamiento por tamaños de los extractos de Chlorella puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo la cromatografía de exclusión por tamaños, el análisis por sedimentación, por ejemplo centrifugación en gradiente, y ultrafiltración.

IBP-1 o IBP-2 es una mezcla de polisacáridos y complejos de polisacárido, oscilando una masa molecular media de la fracción inmunomoduladora de interés desde 100 hasta 10.000 kDa. Los complejos de polisacárido son polisacáridos que están asociados no covalentemente con un biopolímero que no es polisacárido que, por sí mismo, no tiene actividad inmune significativa. Los biopolímeros que no son polisacáridos incluyen ADN y proteína que pueden contribuir al peso molecular acumulado del extracto, pero que no tienen actividad inmune significativa.

En diversas realizaciones, los polisacáridos y complejos de polisacárido de alto peso molecular son de aproximadamente 1 \times 10^{5} Da a aproximadamente 1 \times 10^{5} Da, de aproximadamente 3 \times 10^{5} Da a aproximadamente 5 \times 10^{5} Da, de aproximadamente 5 \times l0^{5} Da a aproximadamente 6 \times 10^{5} Da, de aproximadamente 6 \times 10^{5} Da a aproximadamente 7 \times 10^{5} Da, de aproximadamente 7 \times 10^{5} Da a aproximadamente 8 \times 10^{5} Da, de aproximadamente 8 \times 10^{5} Da a aproximadamente 9 \times 10^{5} Da, de aproximadamente 9 \times 10^{5} Da a aproximadamente 1 \times 10^{6} Da, de aproximadamente 1 \times 10^{6} Da a aproximadamente 2 \times 10^{6} Da, de aproximadamente 2 \times 10^{6} Da a aproximadamente 3 \times 10^{6} Da, de aproximadamente 3 \times 10^{6} Da a aproximadamente 4 \times 10^{6} Da, de aproximadamente 4 \times 10^{6} Da a aproximadamente 5 \times 10^{6} Da, de aproximadamente 5 \times 10^{6} Da a aproximadamente 7 \times 10^{6} Da, de aproximadamente 7 \times 10^{6} Da a aproximadamente 9 \times 10^{6} Da y de aproximadamente 9 \times 10^{6} Da a aproximadamente 1 \times 10^{7} Da.

El fraccionamiento por tamaños para obtener las fracciones anteriores se basa en principios de tamizado molecular. Normalmente, se emplean las técnicas de cromatografía de exclusión por tamaños y los métodos de ultrafiltración. Los principios básicos de la cromatografía de exclusión por tamaños son bien conocidos por los expertos en la técnica y se explican en "Gel filtration: Principle and Methods. Octava edición, Amersham Pharmacia Biotech AB, Rahhms I Luna, Uppsala, Suecia". Las columnas apropiadas para fraccionar intervalos particulares pueden seleccionarse fácilmente y utilizarse con eficacia para resolver las fracciones anteriores, por ejemplo Sephacryl S 100 HR; Sephacryl S 200 HR, Sephacryl S 300 HR; Sephacryl S 400 HR y Sephacryl S 500 HR o sus equivalentes. De una manera análoga, podrían utilizarse medios Sepharose o sus equivalentes, por ejemplo Sepharose 6B, 4B, 2B.

La purificación de los polisacáridos o complejos de polisacárido con proteína podría conseguirse en combinación con otras técnicas cromatográficas, incluyendo la cromatografía de afinidad, intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba, etc. Un ejemplo de cromatografía de IBP-2 (el material retenido tras hacerse pasar el IBP-2 a través de la membrana de ultrafiltración con MWCO > 1 MDa), que utiliza cromatografía de intercambio aniónico de DEAE-Sepharose de flujo rápido, se facilita en las figuras 16 y 17. Las figuras demuestran una disminución significativa del contenido en proteínas tras hacerse pasar el IBP-2 a través de la membrana de ultrafiltración.

La ultrafiltración de las muestras podría realizarse utilizando membranas moleculares con masa molecular de corte apropiadas. Las membranas y los procedimientos específicos utilizados para realizar el fraccionamiento están ampliamente disponibles para los expertos en la técnica, tal como se expone en:

http://www.uku.fi/laitokset/anat/PG/c method.htm.

En una realización, el método utilizado para la caracterización y cuantificación de estos materiales se basa en cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) / dispersión de luz láser en múltiples ángulos (MALS) / detección del índice de refracción (RI) combinados. En la técnica híbrida (SEC/MALS/RI), se utiliza un experimento de HPLC isocrática, que utiliza una columna para SEC GMPWXL de Tosohaas, para separar mezclas según el tamaño molecular. La técnica MALS en línea determina la distribución de peso molecular promedio de los biopolímeros que eluyen y proporciona así especificidad en el análisis. La detección de RI se utiliza tanto para la cuantificación como para proporcionar el perfil de elución requerido en el tratamiento de los datos de MALS.

Un ejemplo de cromatograma de SEC obtenido para un extracto típico se muestra en la figura 1. El trazo superior es el cromatograma registrado utilizando el detector de RI mientras que el trazo de abajo es la respuesta de MALS en uno de los detectores (90 grados). El pico de MALS es un máximo para el componente de elevada masa molecular que corresponde realmente a un pequeño porcentaje del extracto total tal como puede observarse a partir del trazo superior. Por tanto, aunque el intervalo de peso molecular se extiende desde algunos kDa hasta aproximadamente 10 MDa, el peso molecular promedio en peso (PM) para el extracto completo se determina que es de aproximadamente 90 kDa. Esto puede observarse más claramente a partir del perfil de peso molecular acumulado de IBP-1 (figura 2).

IBP-1 o IBP-2 pueden fraccionarse adicionalmente utilizando técnicas cromatográficas o de ultrafiltración adecuadas. Las matrices para la cromatografía de exclusión por tamaños con amplio intervalo de fraccionamiento tales como Sephacryl S 1000 SF (figura 3) resolvieron el extracto en dos picos: el primero eluyó justo tras el volumen inicial ("void volume"); su masa molecular promedio, medida mediante MALS, fue de 1.000 kDa en promedio; el segundo pico eluyó justo después del primer pico. Las fracciones combinadas que representaban el primer pico se desalaron y secaron de manera análoga a las de IBP-1, lo que dio como resultado IBP-3. Este material fue superior en su actividad inmunológica comparado con el segundo pico (IBP-4). En este procedimiento cromatográfico se utilizaron medios acuosos, preferiblemente NaCl 0,15 M. Aunque IBP-1 mostró una mayor actividad inmunológica que IBP-2, la diferencia fue insignificante. La contribución a la actividad inmunoestimulante (que aumenta gradualmente con la masa) comienza a estabilizarse cuando la masa molecular alcanza. aproximadamente 500 kDa.

IBP-4 podría fraccionarse adicionalmente utilizando técnicas cromatográficas o de ultrafiltración adecuadas. Se encontró que eran útiles tanto la cromatografía de intercambio fónico (IEC) como SEC para la resolución adicional de IBP-4. Podrían utilizarse matrices para SEC con el intervalo de fraccionamiento apropiado, por ejemplo Sephacryl S 300. Sephacryl S 300 HR resolvió IBP-1 o IBP-2 en dos picos (figura 4). El primer pico comenzó a eluir en las últimas fracciones del volumen inicial de la columna. La mayor parte de los biopolímeros eluidos mostraron masas moleculares que oscilaban desde 100 hasta 500 kDa. Las fracciones combinadas que representaban el primer pico se desalaron y secaron de manera análoga a las de IBP-1, lo que dio como resultado IBP-5. Este material fue supericr en su actividad inmunológica que el segundo pico (IBP-6) que eluyó justo después de que el primer pico tocara la línea base (figura 5). IBP-5 representó normalmente sólo el 30% de la masa combinada de ambos picos. Para este procedimiento cromatográfico se utilizaron medios acuosos, preferiblemente tampón de acetato 0,1 M, pH 4,5 con gradiente lineal de NaCl. La diferencia en la actividad inmunológica de IBP-5 e IBP-6 fue superior que la que hay entre IBP-3 e IBP-4; normalmente la razón de CPM_{IBP-3} con respecto a CPM_{IBP-4} fue de 5:2, medido mediante el nivel de incorporación de ^{3}H en los esplenocitos en proliferación. El procedimiento podría simplificarse, hasta cierto punto, mediante el uso de membranas de ultrafiltración con masa molecular de corte de aproximadamente 500 kDa. Por ejemplo, podría utilizarse satisfactoriamente la membrana Omega ZM 500.

IBP-6 podría fraccionarse adicionalmente utilizando técnicas cromatográficas o de ultrafiltración adecuadas, por ejemplo utilizando matrices cromatográficas tales como Sephadex G 100, Sephadex G 75 o medios análogos o membranas de ultrafiltración correspondientes. Sin embargo, la actividad inmunológica específica que reside en IBP-6 fue significativamente más débil que la de IBP-3 e IBP-5 y, por tanto, no fue de interés principal. Sin embargo, podría utilizarse eficazmente Sephadex G 100 para eliminar de IBP-2 la mayor parte del material de peso molecular inferior (IBP-8), que se asocia con baja actividad inmunológica (figura 6). Normalmente, la razón de CPM_{IBP-7} con respecto a CPM_{IBP-8} fue de 10:1; (siendo IBP-7 la fracción inmunoactiva y de masa molecular elevada). Esta etapa de purificación podría conseguirse asimismo con una membrana de ultrafiltración YM-100.

Los extractos brutos de Chlorella contienen aproximadamente un 61% de proteínas y un 21% de hidratos de carbono. El tratamiento de Chlorella según la presente invención da como resultado un porcentaje superior de polisacáridos y complejos de polisacárido, es decir los extractos de la invención tienen un porcentaje superior de polisacáridos y complejos de polisacárido con respecto al material total derivado de Chlorella, comparado con un extracto bruto de células fragmentadas. Se entiende que pueden añadirse materiales no relacionados con Chlorella al extracto de Chlorella y que tales extractos están dentro del alcance de la invención.

El porcentaje de polisacáridos y complejos de polisacárido en los extractos de la invención es de al menos el 23% (p/p) del contenido derivado de Chlorella total del extracto. En diversas realizaciones, el porcentaje es de al menos el 24% (p/p), de al menos el 26% (p/p), de al menos el 28% (p/p), de al menos el 30% (p/p), de al menos el 35% (p/p), de al menos el 40% (p/p), de al menos el 45% (p/p), de al menos el 50% (p/p) o de al menos el 60% (p/p).

Los polisacáridos y complejos de polisacárido de alto peso molecular pueden. purificarse y aislarse adicionalmente hasta los diversos porcentajes indicados anteriormente mediante la eliminación de los componentes que no son polisacáridos. Tales componentes que no son polisacáridos incluyen ADN, ARN y proteínas no asociadas. (Las proteínas no asociadas se definen para el fin de la presente solicitud como proteínas que no están asociadas con polisacáridos en un complejo de polisacárido).

Un método de eliminación es el uso de enzimas de digestión para escindir los componentes que no son polisacáridos, seguido por fraccionamiento por tamaños para eliminar los productos escindidos tal como se describe en los ejemplos de más adelante (ejemplo 7). Las enzimas de digestión incluyen pronasa, ribonucleasa, ADNasa y proteasas, también conocidas en la técnica y descritas en diversos libros de texto, un ejemplo de los cuales es Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. Las proteasas útiles para la digestión de proteínas no asociadas incluyen: endo y exopeptidasas, pronasa, serín-proteasas tales como tripsina, quimotripsina y subtilisina, tiol-proteasas tales como papaína, y proteasas que requieren calcio tales como termolisina.

Alternativamente, los componentes que no son polisacáridos pueden eliminarse mediante cromatografía de afinidad, por ejemplo, mediante el uso de matrices de unión a ADN o ARN (Maniatis et al., 1982). Otra opción es purificar los polisacáridos y complejos de polisacárido de los componentes contaminantes mediante el uso de matrices de unión a polisacáridos tales como lectinas. En otra realización, los extractos de la invención pueden tratarse con enzimas glucosídicas en condiciones y durante una extensión de tiempo suficiente para llevar a cabo la escisión de:

(i): tres o más unidades de D-glucosa con enlaces \alpha-1,4;

(ii): glucósidos con enlaces \alpha-1,4;

(iii): galactósidos con enlaces \alpha-1,4; o

(iv): D-glucosa con enlaces \alpha-1,4;

Ejemplos de enzimas glucosídicas útiles para la escisión de tales enlaces glucosídicos incluyen: amilasa, amiloglucosidasa, celulasa y neuraminidasa.

C. Caracterización de los extractos

La composición de hidratos de carbono, el contenido en ADN y la composición de aminoácidos de los extractos de Chlorella de la invención pueden determinarse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica.

La actividad inmune de los extractos de la invención se asocia con los polisacáridos de Chlorella de alto peso molecular, definidos como aquellas macromoléculas que consisten en monosacáridos unidos por enlaces glucosídicos. Los polisacáridos están presentes en los extractos en la forma de polisacáridos libres o polisacáridos complejados (es decir, polisacáridos que están asociados no covalentemente con un biopolímero que no es polisacárido que, por sí mismo, no tiene actividad inmune significativa). En una realización, el contenido en proteínas del extracto es de aproximadamente el 20% al 50%, preferiblemente del 20% al 30%. De este porcentaje de proteínas, aproximadamente del 40% al 60% están asociadas con polisacáridos.

Los biopolímeros que no son polisacáridos incluyen ADN, proteína y posiblemente ARN, que pueden contribuir al peso molecular acumulado del extracto pero que no tienen actividad inmune significativa. El ARN, ADN y proteínas no asociados, es decir aquellos no complejados con los polisacáridos, no contribuyen significativamente a la actividad inmune de los extractos. Para los fines de la presente solicitud, el ARN, ADN y proteínas no asociados se definen funcionalmente como aquellos ARN, ADN y proteínas que son sensibles a la escisión mediante una ribonucleasa (ARNasa), desoxirribonucleasa (ADNasa) y proteasas comunes de la clase de la serina y el tiol. Por tanto, los extractos de la presente invención pueden estas esencialmente libres o sustancialmente libres de ARN, ADN o proteínas no asociados. Por "esencialmente libre" se entiende menos del 5% de ADN o ARN no asociados y menos del 15% de proteínas no asociadas. Por "sustancialmente libre" se entiende menos del 2% de ADN o ARN no asociados y menos del 10% de proteínas no asociadas.

Se entiende que, mientras que los biopolímeros que no son polisacárido per se carecen de actividad inmune, su asociación con los polisacáridos puede contribuir a la actividad inmune de los polisacáridos puesto que los biopolímeros que no son polisacárido del complejo pueden cumplir ciertos requisitos estéricos o polares que permiten a los polisacáridos funcionar de manera eficaz como inmunomoduladores.

Los extractos de la presente invención pueden digerirse con amilasa, amiloglucosidasa, celulasa y neuraminidasa sin pérdida significativa de actividad inmune. Por tanto, aparentemente la actividad inmune reside en los polisacáridos o sus complejos que no contienen una cantidad sustancial de tres o más unidades de D-glucosa con enlaces \alpha-1,4; glucósidos con enlaces \alpha-1,4; galactósidos con enlaces \alpha-1,4 o D-glucosa con enlaces \alpha-1,4. Sin embargo, se entiende que los polisacáridos inmunomoduladores pueden contener los enlaces glucosídicos anteriores si tales enlaces no son accesibles a la digestión enzimática.

D. Uso de los extractos

Los modificadores de la respuesta biológica se han definido como aquellos agentes que modifican la respuesta biológica del huésped mediante una estimulación del sistema inmune, que puede dar como resultado diversos efectos terapéuticos. Una de las categorías de sustancias que pertenecen a esta clase es la de los inmunomoduladores. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "inmunomodulador" se refiere a un agente que puede modular una respuesta inmune. En el contexto de la presente invención, tal modulación es un aumento de los mecanismos de defensa inmunológica del huésped.

Se cree que los extractos de Chlorella son principalmente un estimulador de las células B y los macrófagos. Un beneficio de los inmunomoduladores de las células B es que pueden estimular la función inmune en aquellos que tienen una respuesta de anticuerpos alterada frente aun antígeno. También, un estimulador de las células B podría aumentar la rapidez de la respuesta inmune de anticuerpos cuando se presenta con una nueva infección. Los extractos de Chlorella proporcionan una alternativa segura, eficaz y rentable para el tratamiento sanitario preventivo.

Los estudios in vitro demuestran que los extractos de Chlorella estimularon la proliferación de células de bazo de ratón BALB/c y la producción por los macrófagos de IL-6 y NO_{2}. Los extractos de Chlorella también se examinaron in vivo, y se encontró que reducían significativamente la infección con Listeria monocytogenes, así como con el hongo Candida albicans (véanse los ejemplos 8 a 13).

Se ha completado una serie de tres ensayos de toxicología para los extractos de Chlorella. No fue evidente ningún efecto de la administración del extracto de Chlorella durante el estudio de toxicidad oral de 28 días en ratas. Para el estudio de toxicidad oral tras una única dosis en ratas, para determinar la dosis no letal máxima o la dosis letal mínima del producto tras una única administración oral, el estudio encontró que la dosis letal mínima de un extracto bruto de Chlorella era superior a 2000 mg/kg de peso corporal. El ensayo de mutación bacteriana mostró que los extractos de Chlorella no mostraban ninguna actividad mutagénica en las condiciones de prueba.

Un estudio aleatorizado, doble ciego, controlado por placebo completado recientemente encontró que los extractos de Chlorella demostraron efectos inmunoestimulantes significativos en adultos sanos que recibieron la vacuna contra la gripe, comparado con sujetos que recibieron placebo (véase el ejemplo 14).

Los experimentos in vitro con células sanguíneas humanas muestran la estimulación de la producción de interleucinas, similar a la observada en el modelo de ratón.

Los extractos de Chlorella de la invención son adecuados para su uso en cualquier condición o estado de enfermedad en el que se desee el aumento o la modulación de la respuesta inmune. En una realización, los extractos de Chlorella pueden utilizarse en una cantidad eficaz como adyuvantes en diversas formas de preparaciones de vacunas de administración en la mucosa, especialmente para la administración oral.

Los adyuvantes pueden proteger al antígeno de la rápida dispersión secuestrándolo en un depósito local, o pueden contener sustancias que estimulen que el huésped segregue factores que son quimiotácticos para los macrófagos y otros componentes del sistema inmune. Adyuvantes conocidos para la administración en la mucosa incluyen toxinas bacterianas, por ejemplo, la toxina del cólera (TC), la toxina termolábil de E. Coli (TL), la toxina A de Clostridium difficile y la toxina pertussis (TP). Los extractos de Chlorella, siendo un producto comestible de alto peso molecular y en sí mismos estimulantes inmunes, son candidatos para su uso como adyuvantes en vacunas orales.

La expresión "cantidad eficaz" de un inmunomodulador se refiere a una cantidad de un inmunomodulador suficiente para aumentar el mecanismo de defensa de un huésped. Esta cantidad puede variar hasta cierto punto dependiendo del modo de administración, pero estará en el mismo intervalo general. Si se utiliza más de un inmunomodulador (por ejemplo, extracto de Chlorella en combinación con equinácea), cada uno puede estar presente en estas cantidades o la cantidad total puede caer dentro de este intervalo. La cantidad eficaz exacta necesaria podría variar de sujeto a sujeto, dependiendo de la especie, la edad y el estado general del sujeto, la gravedad del estado que se está tratando, el modo de administración, etc. Por tanto, no es posible especificar una cantidad eficaz exacta. Sin embargo, la cantidad eficaz apropiada puede determinarse por un experto en la técnica utilizando sólo la experimentación de rutina o los conocimientos previos en la técnica de los inmunomoduladores.

El término "tratamiento" tal como se utiliza en el presente documento cubre cualquier tratamiento de un animal, particularmente un ser humano, e incluye:

(i) prevenir que se produzca la enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero al que todavía no se le ha sido diagnosticado que la tenga;

(ii) inhibir la enfermedad, es decir, detener su desarrollo; o

(iii) aliviar la enfermedad, es decir, producir la regresión de la enfermedad.

E. Forma de los extractos

Las composiciones nutricionales y farmacéuticas que contienen los extractos de Chlorella de la invención pueden formularse y administrase en cualquier forma adecuada para la administración entérica, por ejemplo la administración oral o la alimentación mediante sonda nasogástrica. Las formulaciones se administran convenientemente en la forma de un líquido acuoso. Las formulaciones adecuadas para la aplicación entérica están, en consecuencia, preferiblemente en forma acuosa o en forma de polvo o granulado, incluyendo la forma en comprimido. El polvo o granulado puede añadirse convenientemente a agua antes de su uso. En forma líquida, la composición tiene un contenido en sólidos de normalmente desde el 0,1% hasta el 50% en peso, preferiblemente desde el 1% hasta el 10% en peso. Como bebida, las composiciones pueden obtenerse de cualquier manera conocida, por ejemplo, mezclando el extracto de Chlorella con una fuente de energía tales como fuentes de hidratos de carbono, grasas y nitrógeno.

Las composiciones nutricionales pueden estar en la forma de una dieta de fórmula completa (en forma líquida o en polvo), de tal manera que cuando se utiliza como fuente nutritiva exclusiva se cumplen todos los requerimientos diarios calóricos, de nitrógeno, ácidos grasos, vitaminas, minerales y oligoelementos. Sin embargo, las composiciones nutricionales de la invención se destinan preferiblemente al uso como complemento dietético.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden formularse en un formato de dosis única, en el que comprenden extractos de Chlorella y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones farmacéuticas son adecuadas para la administración entérica, tal como la administración oral, nasal o rectal. Las composiciones adecuadas pueden estar en forma líquida o en forma sólida. Las dosificaciones de las composiciones líquidas son normalmente desde el 0,1% hasta el 50% en peso, preferiblemente desde el 1% hasta el 10% en peso del extracto de Chlorella. Las dosificaciones de las composiciones sólidas son normalmente desde 0,2 mg/kg hasta 200 mg/kg, preferiblemente desde 1 mg/mk hasta 10 mg/kg del extracto de Chlorella. Las composiciones pueden estar en la forma de comprimidos, cápsulas duras y blandas y bolsitas.

En la técnica, se conocen vehículos adecuados. Comprenden cargas tales como azúcares o celulosa, aglutinantes tales como almidón, y disgregantes si se necesita.

Se ofrecen los siguientes ejemplos a modo de ilustración y no a modo de limitación.

Ejemplo 1 Preparación de IBP-1

Veinte gramos de polvo seco de Chlorella pyreinodosa se mezclaron con 100 mL de agua destilada y se calentaron con agitación suave durante 1 h a 80ºC. El material se centrifugó a 10.000 g durante 20 min; el sedimento residual se lavó dos veces. Los sobrenadantes combinados se microfiltraron entonces y se secaron por pulverización. El rendimiento medio fue del 10,5%. La extracción del sedimento durante 1 h a 80ºC pudo repetirse varias veces, preferiblemente dos veces, en lugar del lavado simple.

Alternativamente, los sobrenadantes combinados se evaporaron hasta 1/5 de su volumen original usando un evaporador giratorio a presión reducida, luego se precipitaron con etanol (contenido de etanol final del 80%). La mezcla se mantuvo a 4ºC durante 18 h, después el precipitado se filtró, se lavó con etanol absoluto y se secó a vacío.

Ejemplo 2 Preparación de IBP-2

El material extraído, preparado como anteriormente, se desaló por diálisis exhaustiva frente a agua a 4ºC y después se secó por pulverización. El rendimiento medio fue de aproximadamente el 7,5%.

Ejemplo 3 Cromatografía de IBP-2 y preparación de IBP-3

Veinte miligramos de IBP-2 se disolvieron en 1 mL de agua destilada, se filtraron previamente con un filtro de 0,45 \mum y se cargaron en una columna Sephacryl S 1000 HR (1,0 \times 50 cm) y se eluyeron con NaCl 0,15 M. La cromatografía se monitorizó a 280 nm y a 490 nm tras la interacción de las fracciones eluidas con un reactivo de fenol/ácido sulfúrico. La mezcla se resolvió en dos picos. La actividad inmunológica principal estaba en el pico de masa molecular elevada (IBP-3). Sin embargo, el pico de masa molecular inferior (IBP-4) también contenía una parte significativa de actividad inmunológica. El cromatograma se muestra en la figura 3.

Ejemplo 4 Cromatografía de IBP-2 y preparación de IBP-5

Doscientos mg de IBP-2 se disolvieron en 10 mL de agua destilada, se filtraron previamente con un filtro de 0,45 \mum, se cargaron en una columna Sephacryl S 300 HR (2,5 \times 90 cm) y se eluyeron con tampón acetato 0,1 M, pH 4,5 y gradiente lineal de NaCl. La cromatografía se monitorizó a 280 nm y a 490 nm tras la interacción de las fracciones eluidas con un reactivo de fenol/ácido sulfúrico. La mezcla se resolvió en dos picos. La actividad inmunológica principal estaba en el pico de masa molecular elevada (IBP-5). El pico de masa molecular inferior (IBP-6) consistió en dos picos solapados (un hombro aparente en el pico, cuyas fracciones se probaron como IBP-6, figura 5). El perfil de SEC se muestra en la figura 4.

Ejemplo 5 Cromatografía de IBP-2 y preparación de IBP-7

Doscientos mg de IBP-2 se disolvieron en 10 mL de agua destilada, se filtraron previamente con un filtro de 0,45 \mum, se cargaron en una columna Sephadex G 100 (2,5 \times 90 cm) y se eluyeron con tampón acetato 0,1 M, pH 4,5 y gradiente lineal de NaCl. La cromatografía se monitorizó a 280 nm y a 490 nm tras la interacción de las fracciones eluidas con un reactivo de fenol/ácido sulfúrico. La mezcla se resolvió en dos picos. La actividad inmunológica principal estaba en el pico de masa molecular elevada (IBP-7). El pico de masa molecular inferior (IBP-8) conservó mucha menos actividad. IBP-9 representa las fracciones tras IBP-8 (figura 6).

Ejemplo 6 Análisis de la composición

La diálisis o la ultrafiltración demostraron que sólo una pequeña parte de la actividad inmunológica estaba asociada con los compuestos de masa molecular baja (inferior a 100 kDa). El material activo es térmicamente estable y pudo precipitarse a partir de la disolución con etanol o sulfato de amonio. La estabilidad térmica del extracto lo hace adecuado para el secado por pulverización; en efecto, la actividad inmunomoduladora se mantuvo tras el proceso de secado por pulverización. Un contenido habitual en proteínas de una fracción es de aproximadamente el 30%. El contenido en ADN varía desde el 0% hasta el 20%, con del 0% al 2% en las masas moleculares superiores a 100 kDa.

(a) Composición de hidratos de carbono por cromatografía plana y cromatografía de gases (CG)

En una realización, el extracto liofilizado (o fracciones purificadas adicionalmente) se disolvió en agua (1 mg/mL, 400 \muL) y se hidrolizó con ácido trifluoroacético 1 M (TFA, 1 mL) a 100ºC, durante la noche con agitación, en viales de 4 mL con tapón de rosca herméticamente cerrados. La muestra se evaporó entonces repetidamente hasta la sequedad usando metanol. El hidrolizado seco se redujo usando NaBH_{4} 0,5 M en NH_{4}OH 1 M (0,6 mL) con agitación durante la noche a temperatura ambiente. El borohidruro se extinguió entonces con metanol ácido (ácido acético al 20% en metanol, 1 mL) y la mezcla se evaporó hasta la sequedad.

Se añadieron 3 mL de anhídrido acético a la muestra; la mezcla se calentó en un baño de agua a 80ºC durante 2 h para producir acetilalditoles y luego se evaporó hasta la sequedad.

Las muestras de acetilalditol se extrajeron distribuyendo la mezcla de reacción entre acetato de etilo y agua; la fase orgánica se usó directamente para análisis de cromatografía de gases/espectroscopia de masas (CG-EM).

Todos los extractos patrones y de muestra se disolvieron en acetato de etilo y se concentraron hasta aproximadamente 100 \muL. Las muestras se inyectaron usando el modo de fraccionamiento (split) de un cromatógrafo de gases Thermoquest Trace 2000 a un fraccionamiento 10:1 y se cromatografiaron en una columna capilar SGE BPX70 (30 m \times 0,25 mm \times 0,25 \mum de espesor de la película). Se usó gas portador de helio a una velocidad de flujo constante de 1,0 mL/min.

La estufa del cromatógrafo de gases se programó a una temperatura inicial de 190ºC (mantenida durante 1 minuto) seguido por un aumento de 3ºC/minuto hasta 260ºC (mantenida durante 10 minutos a 260ºC). La columna capilar se conectó directamente al espectrómetro de masas (Thermoquest CGQ de trampa iónica), cori la temperatura de la línea de transferencia a 260ºC. Usando este programa de estufa, se encontró que todos los compuestos se interés eluían en un plazo de 20 minutos.

La fuente de iones del espectrómetro de masas se mantuvo a 150ºC. Los espectros se registraron desde 50 hasta 500 m/z usando tanto el modo de impacto electrónico (70 eV) como el modo de ionización química (CI) con reactivo de gas amoniaco.

Los tiempos de retención para los monosacáridos se estabilizaron derivatizando los patrones puros de los azúcares individuales y/o cromatografiando las mezclas comercialmente disponibles de acetatos de alditol (Supelco, Inc.). Los azúcares presentes en los extractos de muestra se identificaron por comparación de los tiempos de retención y los espectros de masas frente a estos patrones. Todas las muestras con actividad inmunomoduladora contenían glucosa, galactosa, ramnosa, manosa y arabinosa. Los extractos de peso molecular superior a 1 x 10^{6} Da están sustancialmente libres de ribosa.

(b) Análisis de la composición de monosacáridos usando electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE)

Se emplearon los protocolos de hidrólisis habituales para liberar monosacáridos ácidos, neutros o básicos de las cadenas de polisacáridos. Los monosacáridos liberados se marcaron primero con el reactivo de marcado fluorescente 2-aminoacridona (AMAC), seguido por la reducción de la base de Schiff formada con cianoborohidruro de sodio. Después se realizó la electroforesis en gel de poliacrilamida de la mezcla sobre geles en gradiente según el manual de instrucciones. Los hidrolizados producidos a partir de IBP-2 contenían glucosa, galactosa, ramnosa, manosa y arabinosa. También se encontró una cantidad sustancial de ribosa. Sin embargo, los hidrolizados producidos por tratamiento de IBP-5 e IBP-7 con TFA 2 M a 100ºC durante 5 h, sólo contenían claramente glucosa y galactosa, así como ramnosa, manosa y arabinosa. No se encontró ribosa en estos hidrolizados. Esto estaba de acuerdo con los hallazgos anteriores de que fragmentos de ARN de masa molecular baja estaban presentes en IBP-2. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño, no podían estar presentes en los picos de masa molecular elevada de IBP-5 e IBP-7 obtenidos a partir de las cromatografías en Sephadex G 100 o Sephacryl S 300, respectivamente. Se detectó otra banda situada entre la N-acetil galactosamina (GalNAc) y la manosa en PAGE, pero no pudo asignarse a ninguno de los monosacáridos convencionales. Las mezclas de reacción obtenidas por hidrólisis realizada en las condiciones usadas para la liberación del ácido siálico (TFA 0,1, 80ºC, 1 h)dieron como resultado un producto con un Rf idéntico al del ácido siálico y otra banda principal con un tiempo de retención significativamente inferior al correspondiente a la GalNAc. La hidrólisis en HC1 4 M durante 3 h a 100ºC (una condición para la liberación del aminoazúcar) dio como resultado en PAGE bandas correspondientes a GalNAc y N-acetil glucosamina (G1cNAc). Sin embargo, a juzgar por la intensidad de otras bandas, fueron componentes no significativos de IBP-5 o IBP-7.

(c) Análisis de la composición de monosacáridos usando electroforesis capilar (EC)

El protocolo seguido fue el de Sato et al. (Sato K., Okubo A., Yamazaki T., (1997)Determination of monosaccharide derivatized with 2-aminobenzoic acid by capillary electrophoresis. Anal Biochem 251: 119-121). IBP-2 o sus fracciones se hidrolizaron primero en TFA 0,1 M (1 mg/mL), a 100ºC durante 18 h, el ácido acuoso se eliminó a presión reducida, el TFA residual se eliminó por una evaporación secuencial con metanol hasta la sequedad.

El extracto bruto de IBP-2 contiene principalmente glucosa y galactosa; la glucosa es el monosacárido más frecuente en el extracto. También están presentes ramnosa, manosa y arabinosa, si bien es cierto que en cantidades significativamente inferiores (figura 14). Cuando el extracto se sometió a ultrafiltración usando una membrana con MWCO de 1 MDa (figura 15), la razón entre glucosa y galactosa cambió y el pico de ribosa desapareció, lo que indica (de acuerdo con los datos de PAGE) la eliminación de ARN de sus fragmentos.

(d) Composición de aminoácidos

Los aminoácidos libres contenidos en los extractos se determinaron tal como sigue: las muestras se disolvieron en agua destilada desioriizada para obtener una concentración final de 10 mg/mL. A 25 \muL (250 \mug) de cada muestra, se añadieron 75 \muL del tampón de muestra Beckman (Na-S). Las muestras se centrifugaron a 16.000 \times g hasta eliminar la materia particulada antes del análisis en el analizador de aminoácidos Beckman Modelo 6300. La centrifugación aclaró la disolución y el secimento se retuvo; el sobrenadante se analizó para determinar los aminoácidos libres.

Para determinar la composición de aminoácidos de los hidrolizados totales, se colocaron partes de cada muestra (250 \mug) en un tubo de ensayo de vidrio limpio junto con el patrón interno norleucina y 1 mL de HC1 6 N. Los tubos se sellaron a vacío y los péptidos y polipéptidos se hidrolizaron a 105ºC durante 20 horas. Los tubos se abrieron y las muestras se secaron en concentradores centrífugos Speed-vac de Savan Environmental a temperatura ambiente. Los residuos se volvieron a disolver en tampón Na-S y se manipularon tal como se describió anteriormente para la determinación de aminoácidos libres.

(e) Contenido en ADN

El extracto de Chlorella se disolvió en agua destilada (500 \muL). Se añadió un volumen igual de una disolución de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1, v/v). La mezcla se agitó vigorosamente, después se centrífugo a 13.000 rpm durante 5 minutos. La capa acuosa superior se pipeteó y se volvió a extraer con 500 \muL adicionales de la mezcla orgánica. La capa acuosa se volvió a extraer hasta que la capa de proteínas (una interfase visible entre las capas acuosa y orgánica) fue insignificante. Tras la extracción de proteínas final, la capa acuosa se transfirió a un tubo nuevo y a él se añadió glucógeno (10 \muL), acetato de sodio 3 M (50 \muL) y etanol frío (1 mL). La mezcla se agitó y se colocó en el congelador a -80ºC durante una hora. Entonces se centrífugo a 13.000 rpm durante 15 minutos y el sobrenadante se vertió. El sedimento se secó en un concentrador centrífugo y se volvió a disolver en agua. Su absorbancia se midió a 260 nm frente a un blanco de agua. Puesto que las proteínas también absorben a 260 nm, las lecturas de la absorbancia de proteínas a 280 nm también se tomaron como una medida del contenido de proteínas en la muestra de ADN.

Ejemplo 7 Digestión enzimática de los extractos

La degradación enzimática se usó como una técnica para eliminar selectivamente varias clases moleculares de los extractos de Chlorella. IBP-2 o sus fracciones (tanto IBP-2 como sus fracciones se designan ONC-107 en este ejemplo) se trataron con pronasa, ADNasa, ARNasa, amilasa, amiloglucosidasa, celulasa y neuraminidasa en experimentos separados. Se utilizó electroforesis en SDS PAGE y en gel de agarosa, así como cromatografía en capa fina, para monitorizar las reacciones enzimáticas (véanse las secciones (a) a (g) más adelante). Las mezclas de reacción finales se dializaron, se liofilizaron y se probaron para determinar la capacidad para estimular a las células del bazo no diferenciadas mediante la incorporación de timidina en esplenocitos murinos (ejemplos 9 y 11). Los resultados se resumen a continuación:

\bullet: Ausencia de efecto sobre la capacidad para estimular células de bazo no diferenciadas dentro de una significación estadística tras el tratamiento con las enzimas seleccionadas.

\bullet: Ausencia de presencia de ARN de masa molecular grande en IBP-2. Esto está de acuerdo con otros hallazgos (anteriormente), específicamente con que no se encontrara ribosa en las especies de masa molecular elevada (IBP-5, IBP-7) y en las fracciones sometidas a ultrafiltración con MWCO > 1 MDa. Esto demuestra claramente que el ARN no es la fuente principal de actividad inmunoestimulante.

\bullet: Se encontró una cantidad muy pequeña de ADN, lo que está de acuerdo con los datos obtenidos a partir del aislamiento de ADN usando una columna de carburo de silicio (contenido de aproximadamente el 2%, 500 pb) (véase Haj-Ahmad Y (1999) Nucleic acid purification and process. Canadian published application 2, 270, 106).

Todas las digestiones enzimáticas se realizaron en paralelo con controles positivos para garantizar que las enzimas fueran activas. Los experimentos indican claramente que no es probable que las proteínas y los ácidos nucleicos no asociados, accesibles por las enzimas, fueran el origen de la actividad. El origen de la actividad inmunológica es un polisacárido (quizá acomplejado con otro biopolímero que no tiene efecto significativo por sí mismo y que podría tener un papel indirecto, por ejemplo, en la estabilidad). La actividad inmunológica del polisacárido no resulta afectada por escisiones en las regiones de tres o más unidades de D-glucosa unidas en \alpha-1,4, galactósidos y glucósidos unidos en \alpha-1,4 o D glucosa unida en \alpha-1,4, suponiendo que tales enlaces son accesibles para la escisión enzimática.

(a) Tratamiento con proteasa

Se añadió proteasa (100 \mug/mL, Streptomyces griseus) a ONC-107 (20 mg/mL) en tampón TRIS (0,05 M, pH 7,4) y se incubó durante 1 hora a 36ºC. La incubación se detuvo mediante la desactivación térmica de la enzima a 80ºC durante 1 hora, seguido por centrifugación durante 10 minutos a 13.000 rpm. Se tomaron alícuotas de la disolución a intervalos de tiempo de 0, 5, 10, 15, 30 y 60 minutos y se prepararon para el análisis por electroforesis en SDS-PAGE (gel al 12%, tinción de proteínas total). La concentración óptima de proteasa se determinó por un curso de tiempo electroforético similar que incluyó BSA (albúmina sérica bovina) (1 mg/mL). La mezcla del digesto final se analizó mediante electroforesis en agarosa (al 1% teñida con bromuro de etidio).

(b) Tratamiento con ADNasa

Se añadió ADNasa (100 \mug/mL) a ONC-107 (20 mg/mL) en tampón TRIS (0,05 M, pH 7,4, MgCl_{2} 10 mM) y se incubó durante 1 hora a 36ºC. La incubación se detuvo mediante la desactivación térmica de la enzima a 80ºC durante 1 hora, seguido por centrifugación durante 10 minutos a 13.000 rpm. La mezcla del digesto final se analizó mediante electroforesis en SDS-PAGE (gel al 12%, tinción de proteínas total) para comprobar la degradación de proteínas. Se utilizó la electroforesis en agarosa (al 1% teñida con bromuro de etidio) para confirmar la degradación de ácidos nucleicos.

(c) Tratamiento con ARNasa

Se añadió ARNasa (100 \mug/mL) a ONC-107 (20 mg/mL) en tampón TRIS (0,05 M, pH 7,4, NaCl 10 mM) y se incubó durante 1 hora a 36ºC. La incubación se detuvo mediante la desactivación térmica de la enzima a 80ºC durante 1 hora, seguido por centrifugación durante 10 minutos a 13.000 rpm. La mezcla del digesto final se analizó mediante electroforesis en SDS-PAGE (gel al 12%, tinción de proteínas total) para comprobar la degradación de proteínas. Se utilizó la electroforesis en agarosa (al 1% teñida con bromuro de etidio) para confirmar la degradación de ácidos nucleicos.

(d) Tratamiento con amilasa

Se añadió amilasa (100 \mug/mL) a ONC-107 (20 mg/mL) en tampón TRIS (0,05 M, pH 7,4) y se incubó durante 1 hora a 36ºC. La incubación se detuvo mediante la desactivación térmica de la enzima a 80ºC durante 1 hora, seguido por centrifugación durante 10 minutos a 13.000 rpm. La mezcla del digesto final se analizó mediante electroforesis en SDS-PAGE (gel al 12%, tinción de proteínas total) para comprobar la degradación de proteínas. Se utilizó la electroforesis en agarosa (al 1% teñida con bromuro de etidio) para confirmar la degradación de ácidos nucleicos.

Adicionalmente, la cromatografía en capa fina (CCF) confirmó la actividad de la enzima tal como sigue. Se añadió amilasa (100 ug/mL) a una disolución de almidón (1 mg/mL) y se incubó durante una hora a 36ºC. La disolución se analizó mediante CCF usando placas de sílice Kiesegel eluidas con isopropanol: acetato de etilo: agua (7:1:2). Las placas se desarrollaron tras 1C minutos secando en posición horizontal usando una disolución de ácido sulfúrico/etanol. Se usó glucosa (1 mg/mL) como control, al igual que el almidón no tratado. El tratamiento del almidón con amilasa dio como resultado la liberación de glucosa.

(e) Amiloglucosidasa

Se añadió amiloglucosidasa (100 \mug/mL) a ONC-107 (20 mg/mL) en tampón TRIS (0,05 M, pH 4,4) y se incubó durante 1 hora a 36ºC. La incubación se detuvo mediante la desactivación térmica de la enzima a 80ºC durante 1 hora, seguido por centrifugación durante 10 minutos a 13.000 rpm. La CCF confirmó la actividad de la enzima tal como sigue. Se añadió amiloglucosidasa (100 ug/mL) a una disolución de almidón (1 mg/mL) y se incubó durante una hora a 36ºC. La disolución se analizó mediante CCF usando placas de sílice Kiesegel eluidas con isopropanol : acetato de etilo: agua (7:1:2). Las placas se desarrollaron tras 10 minutos secando en posición horizontal usando una disolución de ácido sulfúrico/etanol. Se usó glucosa (1 mg/mL) como control, al igual que el almidón no tratado. El tratamiento del almidón con amiloglucosidasa dio como resultado la liberación de glucosa.

(f) Celulasa

Se añadió celulasa (100 \mug/mL) a ONC-107 (20 mg/mL) en tampón TRIS (0,05 M, pH 7,4) y se incubó durante 1 hora a 36ºC. La incubación se detuvo mediante la desactivación térmica de la enzima a 80ºC durante 1 hora, seguido por centrifugación durante 10 minutos a 13.000 rpm. La CCF confirmó la actividad de la enzima tal como sigue. Se añadió celulasa (100 ug/mL) a una disolución de celulosa (1 mg/mL) y se incubó durante una hora a 36ºC. La disolución se analizó mediante CCF usando placas de sílice Kiesegel eluidas con isopropanol: acetato de etilo: agua (7:1:2). Las placas se desarrollaron tras 10 minutos secando en posición horizontal usando una disolución de ácido sulfúrico/etanol. Se usó glucosa (1 mg/mL) como control, al igual que la celulosa no tratada. El tratamiento de la celulosa con celulasa dio como resultado la liberación de glucosa.

(g) Neuraminidasa

Se añadió neuraminidasa (100 \mug/mL) a ONC-107 (20 mg/mL) en tampón TRIS (0,05 M, pH 5,0) y se incubó durante 1 hora a 36ºC. La incubación se detuvo mediante la desactivación térmica de la enzima a 80ºC durante 1 hora, seguido por centrifugación durante 10 minutos a 13.000 rpm. La CCF confirmó la actividad de la enzima tal como sigue. Se añadió neuraminidasa (100 ug/mL) a una disolución de N-acetil-neuramidasa (1 mg/mL) y se incubó durante una hora a 36ºC. La disolución se analizó mediante CCF usando placas de sílice Kiesegel eluidas con isopropanol: acetato de etilo: agua (7:1:2). Las placas se desarrollaron tras 10 minutos secando en posición horizontal usando una disolución de ácido sulfúrico/etanol.

Ejemplo 8 Estimulación de la proliferación de esplenocitos

Se cultivaron en placa células de esplenocito nuevas (cultivo primario de esplenocitos) a 3 \times 10^{5} células/pocillo en medio cRPMI en un volumen de 100 \muL en placas de cultivo tisular con fondo plano de 96 pocillos. Las muestras de prueba en 100 \muL de medio celular se añadieron por triplicado a los pocillos, dando un volumen total final en cada pocillo de 200 \muL. Las placas se cubrieron con tapas estériles y se incubaron en CO_{2} al 5% a 37ºC y el 100% de humedad en un incubador de CO_{2} durante 48 h. Las células se pulsaron entonces con ^{3}H-timidina (1 \muCi por pocillo en 10 \mul de cRPMI) y se incubaron durante 18 h. Las células se recogieron con un aparato automático para recoger células equipado con bandas de filtro. Las bandas de filtro se dejaron secar durante 3 h a 37ºC. La radiactividad incorporada por las células se determinó contando las bandas de filtro sumergidas en medio de centelleo en un contador de centelleo líquido. Un ejemplo del experimento se ilustra en la figura 7. Una comparación del extracto del solicitante con dos muestras comerciales se ilustra en la figura 13.

Ejemplo 9 Aislamiento de células B y células T de esplenocitos y estimulación de las células

Se aislaron esplenocitos de ratón mediante métodos habituales y se colocaron en matraces de cultivo tisular a 37ºC durante 2 h, para permitir que los macrófagos se establecieran y se adhirieran al matraz. Los linfocitos (que están suspendidos y no se adhieren) se extraen entonces y se colocan en un tubo de centrífuga de 50 mL, se centrifugan y se resuspenden en una pequeña cantidad de tampón PBS-EDTA-BSA frío (pH 7,4; 1-3 mL) y se colocan en hielo. Las células se contaron y se volvieron a centrifugar. Después se resuspendieron en 1 \times 10^{8} en 0,3 mL de tampón PBS-EDTA-BSA en un tubo de centrífuga.

Aislamiento negativo de células B: Se añadieron 100 \mul de microperlas Miltenyi recubiertas con anticuerpo anti-Thy-1.2 a las células resuspendidas y la mezcla se incubó durante 20 minutos. Se añadió PBS-EDTA-BSA (5 mL) y la suspensión se pipeteó en una columna midiMACS en un imán midiMACS. La columna tenía una aguja de calibre 25 en el flujo de salida para limitar la velocidad de flujo. Las células T, unidas a las perlas magnéticas recubiertas por el anticuerpo anti-Thy-1.2, se adhirieron a la columna. Las células B pasaron a través y se recogieron. La columna, sin extraerse del imán, se enjuagó con 5 mL del tampón para eliminar cualquier célula B residual. Las células B se combinaron, se centrifugaron, se resuspendieron en 1 mL de cRPMI y se contaron. Entonces se resuspendieron hasta 5 \times 10^{6} células por mL de cRPMI y se sembraron en placa a 100 \muL/pocillo para los ensayos de estimulación.

Aislamiento negativo de células T: Se siguió el mismo procedimiento que para el aislamiento de células B, excepto que las perlas magnéticas usadas para la incubación se recubrieron con el anticuerpo anti-B220, en lugar de con anti-Thy-1.2.

Las poblaciones de células T y B purificadas se probaron tal como se describe en el ejemplo 8. Los resultados se muestran en la figura 8.

Ejemplo 10 Ensayo de nitrito para macrófagos peritoneales de ratón

Se sacrificaron ratones mediante dislocación cervical y se colocaron tumbados sobre la espalda con las extremidades extendidas. Se esterilizaron los abdómenes con alcohol al 70% y se realizó una cuidadosa incisión central que expuso la pared peritoneal INTACTA. Se usó una jeringuilla de 10 mL para inyectar 10 mL de cRPMI-1640 frío en la cavidad peritoneal del ratón. El ratón se sacudió suavemente de un lado a otro con la aguja todavía insertada. El cRPMI-1640 que contenía los macrófagos peritoneales se extrajo lentamente de la cavidad peritoneal a través de la aguja. Aproximadamente se recuperaron 8 mL de líquido por ratón. El líquido peritoneal se reunió y se colocó dentro de tubos de centrífuga de 50 mL en hielo. Las células se centrifugaron, se lavaron y se resuspendieron en 1 mL de cRPMI-1640. Tras el recuento, se resuspendieron hasta 1-2 \times 10^{6} células/mL y se sembraron en placas de cultivo tisular de 96 pocillos a 1 \times 10^{5} células/pocillo en un volumen de 100 \muL. Las muestras de prueba se añadieron en cRPMI (100 \muL) con y sin IFN-\mu (interferón \mu). Los controles positivos fueron las células + IFN-\mu y LPS (lipopolisacárido) + IFN-\mu. Las células se incubaron durante 48 h en un incubador de CO_{2} en CO_{2} al 5%.

Se recogieron 50 \muL de líquido de cultivo y se transfirieron a pocillos en una placa de ELISA de fondo plano de 96 pocillos. Se realizaron diluciones seriadas dobles de NaNO_{2} (desde 125 \muM hasta 1 \muM de concentración final) en cRPMI, y se añadieron 50 \muL de disolución de reactivo de Greiss y de disoluciones de NaNO_{2} a un conjunto de pocillos para obtener una curva patrón. Se midió la absorbancia a 550 nm y se realizó una representación gráfica de los valores de la absorbancia frente a las concentraciones de NaNO_{2}. La curva patrón se utilizó para determinar la cantidad de NO_{2} producida por las muestras de macrófago peritoneal. Un ejemplo del experimento se ilustra en la figura 9.

Ejemplo 11 Determinación mediante ELISA de fase doble (sándwich) de la estimulación de la producción de citocina por esplenocitos de ratón

La producción de citocina se midió en esplenocitos de ratón, en macrófagos de ratón y en linfocitos T y B de ratón separados. Las muestras de prueba se añadieron a varias concentraciones a las células en placas de cultivo tisular de microtítulo. Tras la incubación durante 24-48 h, dependiendo de la citocina de interés, se extrajo el líquido de cultivo del sobrenadante para una prueba de ELISA.

Las placas de ELISA se recubrieron con anticuerpos monoclonales anti-citocina mediante la incubación a 4ºC durante la noche en tampón carbonato, pH 9,6. Las placas se lavaron entonces con solución salina con tampón Tris (TBS), se recubrieron posteriormente con BSA 2 mg/mL en TBS, (200 \muL/pocillo) durante 2 h a temperatura ambiente y se lavaron con TBS/Tween. Las muestras y los patrones (estos últimos diluidos desde 1 ng/mL hasta 15 pg/mL en diluciones dobles) se diluyeron en TBS/Tween que contenía BSA 1 mg/mL (100 \muL/pocillo), se añadieron a la placa, se incubaron durante la noche a 4ºC y después se lavaron con TBS-Tween.

Se añadió el mAc anti-citocina biotinilado apropiado (0,5 \mug/mL) en PBS-Tween que contenía BSA 1 mg/mL (100\muL/pocillo). La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h y después se lavó con TBS-Tween. Se añadió extravidina-peroxidasa en PBS-Tween que contenía BSA 1 mg/mL (100 \muL/pocillo) y se incubó a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las placas se lavaron entonces. Se añadieron 100 \muL/pocillo de disolución de sustrato TMB (tetrametilbenzidina), y tras de 10 a 30 minutos, dependiendo del desarrollo de color, se detuvo la reacción con 100 \muL/pocillo de H_{3}PO_{4} 1 M. La placa se leyó a 450 nm. Un ejemplo de estimulación de producción de IL-6 se ilustra en la figura 10.

Ejemplo 12 Efecto de IBP-2 sobre la proliferación de Listeria monocytogenes en ratones infectados

Se administraron dos dosis de IBP-2 (0,1 mg o 4 mg) o agua natural (control negativo) a ratones Balb/c mediante tubo intragástrico tres veces a la semana durante cuatro semanas. Los ratones se infectaron entonces mediante inyección intravenosa de 5.000 microorganismos viales Listeria monocytogenes. Los ratones se sacrificaron tres días después de las inyecciones de Listeria. Se obtuvieron suspensiones celulares de sus bazos y se cultivaron en placas de cultivo para determinar el número de bacterias en los bazos. Los animales alimentados con agua tenían 92.202 (\pm23.000) unidades formadoras de colonias (UFC) en sus bazos; (el número entre paréntesis se refiere a la desviación estándar). Los animales alimentados con 0,1 mg de IBP-2 por dosis tenían 43.310 (\pm7.021) UFC y los animales alimentados con 4 mg de IBP-2 por dosis tenían sólo 5.317 (\pm492) UFC (p < 0,05) (figura 11).

Ejemplo 13 Efecto de IBP-2 sobre la proliferación de Candida albicans en ratones infectados

Se administró IEP-2 (4 mg), algas brutas (4 mg o 20 mg), o agua natural a ratones Balb/c mediante tubo intragástrico 3 veces por semana durante dos semanas. Los ratones se infectaron entonces mediante inyección intravenosa de 500.000 microorganismos viables de Candida albicans. La alimentación continuó hasta que los ratones se sacrificaron 12 días tras la infección. Se extrajeron los riñones y se obtuvieron suspensiones celulares y se cultivaron en agar Sabouraud para determinar el número de colonias de C. albicans que se desarrollaron durante la noche. Se obtuvieron los resultados siguientes: ratones alimentados con agua, 594 (\pm556) colonias (media \pm desviación estándar); ratones alimentados con IBP-2 (4 mg), 42 (\pm75) (p < 0,05, en comparación con los ratones alimentados con agua), ratones alimentados con algas (4 mg), 335 (\pm 663), ratones alimentados con algas (20 mg), 79 (\pm70); (estadísticamente, el valor de p para este grupo en comparación con el grupo alimentado con agua fue > 0,05, aunque estuvo muy cerca de ser significativo). Los resultados se ilustran en la figura 12.

Ejemplo 14 Estudio de ensayo clínico de fase 2

Este estudio se diseñó para evaluar la eficacia inmunoestimuladora de los extractos de Chlorella como un complemento nutricional en adultos sanos de más de 50 años de edad. Se completó un estudio primero en hombres, que demostró la seguridad y la tolerancia de un extracto de Chlorella que corresponde a IBP-1 cuando se administra como un complemento diario durante tres semanas. El objetivo de este estudio de fase 2 fue aumentar la experiencia en humanos con extractos de Chlorella mediante la evaluación del aumento de la seguridad y la tolerancia y para investigar la capacidad de los extractos de Chlorella como un complemento nutricional inmunoestimulante en humanos.

El estudio se diseñó como un ensayo clínico aleatorizado, controlado por placebo, en el que adultos de 50 años de edad o mayores se asignaron al azar para recibir una cápsula de 200 mg de un extracto de Chlorella correspondiente a IBP-1, (denominado ONC-107 para el objeto de este estudio), una cápsula de 400 mg de ONC-107, o una cápsula de placebo (que no contenía ONC-107). Mientras el ensayo estaba en curso, los investigadores, enfermeros y otro personal del estudio y los participantes desconocían a qué grupo estaban asignados. La seguridad y los efectos secundarios se midieron mediante el registro meticuloso por parte de los participantes de cualquier acontecimiento adverso y su notificación al personal del estudio. Los acontecimientos adversos específicos medidos incluyeron fiebre, dolor abdominal, náuseas, vómitos, diarrea, fatiga, disminución del apetito, cefalea, dolores corporales, articulaciones doloridas y exantema. La seguridad también se midió mediante una serie de análisis de sangre antes de comenzar a tomar las cápsulas del estudio y a la finalización de las cápsulas del estudio. Estas pruebas incluyeron pruebas de la función hepática (AST (aspartato aminotransferasa), ALT (alanina aminotransferasa)), perfiles sanguíneos (hemograma completo) y función inmunológica (ANA (anticuerpos antinucleares), anti-ADN, factor reumatoide, Coombs, C3, C4, IgG, IgA, IgM e IgE cuantitativas). La medicación se administró durante 28 días; tras 21 días, los participantes se inmunizaron con una vacuna contra la gripe con virión fragmentado, inactivada y comercialmente disponible. Se evaluó la respuesta de anticuerpos a la inmunización mediante la medición de anticuerpos para las tres cepas de virus contra la gripe antes, y 7 y 21 días después de la inmunización. La inmunidad mediada por células se midió evaluando la respuesta a la prueba cutánea con el virus contra la gripe al comienzo del estudio y una semana después de la inmunización.

Se incluyó en el estudio un total de 124 sujetos y se les administró la medicación; 7 participantes se retiraron del estudio. Sólo un participante se retiró debido a acontecimientos adversos (náuseas y dolor abdominal). Los tres grupos de tratamiento fueron similares en cuanto a la edad, sexo e historia y examen físico inicial al comienzo del estudio. La mayoría de los participantes fueron mujeres (73,2-80,5% de cada grupo). El cumplimiento de los participantes fue excelente. La respuesta de anticuerpos a la vacuna contra la gripe no fue significativamente mayor en los participantes tratados con ONC-107 en general, aunque en los participantes de 55 años de edad o menos hubo un aumento significativo de la respuesta para algunas medidas de anticuerpos (y una tendencia constante para las otras). No hubo acontecimientos adversos graves en ninguno de los participantes del estudio. Un acontecimiento adverso se notificó por la mayoría de los participantes en varias ocasiones durante el estudio, pero en su mayor parte, estos acontecimientos no se notificaron con más frecuencia en los que recibieron ONC-107 en comparación con los que recibieron placebo (la fatiga se notificó con más frecuencia por los que recibieron 200 mg de ONC-107 y el dolor abdominal con más frecuencia por los que recibieron placebo y tenían más de 55 años de edad). No hubo cambios significativos en las medidas de laboratorio antes y después del tratamiento, o entre los que recibieron ONC-107 y placebo.

Los resultados de este estudio de fase 2 del complemento nutricional ONC-107 a dosis de 200 mg y 400 mg durante 28 días en adultos sanos se explican a continuación. Estos resultados indican que, a pesar de un efecto de la edad, este producto es bien tolerado y seguro para la administración oral y tiene un efecto inmunoestimulador que se puede medir.

El efecto inmunoestimulador se midió por la respuesta de anticuerpos a la vacuna contra la gripe en adultos sanos mayores de 50 años de edad, aunque estas respuestas estuvieron limitadas, en general, a la cohorte más joven en la población del estudio (50-55 años de edad). El aumento de respuesta de anticuerpos en este subgrupo fue estadísticamente significativo para algunas de las comparaciones, pero la tendencia fue evidente en todas las comparaciones serológicas realizadas. La hipótesis antes del estudio de que el efecto de ONC-107 se observaría mejor en los sujetos de mayor edad debido a su disminución del grado de respuesta a la vacuna contra la gripe no resultó apoyada por los datos; por el contrario, fueron los sujetos más jóvenes y con mayor respuesta los que demostraron un efecto de ONC-107.

Los sujetos más jóvenes tendieron a mostrar efectos inmunoestimuladores de ONC-107 (especialmente a la dosis de 400 mg). Un posible motivo para la falta de efecto en el grupo de mayor edad fue que el grupo de mayor edad podía haber tenido títulos más elevados de anticuerpo antes de la inmunización, lo que puede indicar un mayor grado de exposición anterior a las cepas A del virus contra la gripe, antigénicamente similares (pero no a las cepas B).

1. Para la cepa A/Caledonia de la vacuna contra la gripe, el grupo de menor edad (<= 55 años) tuvo mayores títulos medios de anticuerpo con ambas dosis que con placebo a los 7 (no significativo a los 7 d) y a los 21 días (p = 0,05): placebo = 43,2; 200 mg = 84,3; 400 mg = 84,4.

2. Para la cepa B/Yamanashi de la vacuna de la gripe, el grupo de 400 mg tuvo mayores títulos (30,1) a los 7 días frente al placebo (14,4, p = 0,03), pero esto no fue significativo a los 21 días. La dosis de 200 mg no fue significativamente mayor que el placebo a los 7 días (15,9) ni a los 21 días (25,3).

3. Para la cepa A/Panamá de la vacuna contra la gripe, hubo una tendencia similar a favor de la dosis de 400 mg, pero no fue significativa. A los 7 días, el grupo de 400 mg tuvo títulos de 64,5, en comparación con el placebo (39,9), lo que no es significativo. El grupo de 200 mg tuvo títulos de 26,6. A los 21 días, también hubo una tendencia a favor de los 400 mg frente al placebo; de nuevo, 200 mg no fueron mejores que el placebo (57,4).

Se observaron tendencias similares para la proporción de sujetos que tenían respuestas de anticuerpos de 2 y 4 veces más.

Para la cepa B/Yamanashi en el grupo < 55 años, sólo el 5% de los que tornaron placebo tuvo una respuesta de anticuerpos de 2 veces superior a los 7 días. Esto está en contraposición con el grupo de 400 mg (41,2%, p = 0,01) y el grupo 200 mg (6,3%, p = 0,04).

También hubo una tendencia no significativa a un aumento de la respuesta a los 21 días y una tendencia no significativa en la proporción del grupo de edad < 55 años que logró niveles seroprotectores de 40 DR (diluciones recíprocas) a los 7 días tras la inmunización.

Pueden hacerse numerosas modificaciones, variaciones y adaptaciones a las realizaciones particulares de la invención descrita anteriormente sin apartarse del alcance de la invención que se define en las reivindicaciones.

Claims

1. Extracto que comprende polisacáridos y complejos de polisacárido de Chlorella de alto peso molecular, en el que los polisacáridos y complejos de polisacárido de alto peso molecular son de 1 \times 10^{5} Da a 1 \times 10^{7} Da y constituyen al menos el 22% (p/p) del contenido derivado de Chlorella total del extracto.

2. Extracto que consiste en polisacáridos y complejos de polisacárido de Chlorella de alto peso molecular, en el que los polisacáridos y complejos de polisacárido de Chlorella de alto peso molecular son de 1 \times 10^{5} Da a 1 \times 10^{7} Da.

3. Extracto según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que los polisacáridos y complejos de polisacárido de alto peso molecular contienen glucosa y al menos un monosacárido seleccionado del grupo que consiste en: galactosa, ramnosa, manosa y arabinosa.

4. Extracto según la reivindicación 3, en el que los polisacáridos y complejos de polisacárido de alto peso molecular también contienen N-acetilglucosamina y N-acetilgalactosamina.

5. Extracto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que los polisacáridos y complejos de polisacárido de alto peso molecular están sustancialmente libres de un compuesto seleccionado del grupo que consiste en ribosa, ácidos nucleicos, ácidos ribonucleicos y proteínas no asociadas, o cualquier combinación de los mismos.

6. Extracto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que retiene su actividad inmunomoduladora tras el tratamiento en condiciones y durante una extensión de tiempo suficiente para llevar a cabo la digestión del ADN no asociado, el ARN no asociado y/o la proteína no asociada.

7. Extracto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que retiene su actividad inmunomoduladora tras el tratamiento en condiciones y durante una extensión de tiempo suficiente para llevar a cabo la escisión de los enlaces glucosídicos con al menos una glucosidasa seleccionada del grupo que consiste en: amilasa, amiloglucosidasa, celulasa y neuraminidasa.

8. Extracto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que retiene su actividad inmunomoduladora tras el tratamiento en condiciones y durante una extensión de tiempo suficiente para llevar a cabo la escisión de:

(i): tres o más unidades de D-glucosa con enlaces \alpha-1,4;

(ii): glucósidos con enlaces \alpha-1,4;

(iii): galactósidos con enlaces \alpha-1,4; o

(iv): D-glucosa con enlaces \alpha-1,4;

9. Extracto según la reivindicación 6, en el que el tratamiento es la digestión con una enzima seleccionada del grupo que consiste en pronasa, ADNasa, ARNasa, o cualquier combinación de las mismas.

10. Extracto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que los polisacáridos y complejos de polisacárido de Chlorella de alto peso molecular son de Chlorella pyrenoidosa.

11. Procedimiento para obtener un extracto de Chlorella que tiene actividad inmunomoduladora, que comprende:

(a) fraccionar por tamaños un extracto acuoso de Chlorella, y

(b) seleccionar las fracciones que comprenden los polisacáridos y complejos de polisacárido de alto peso molecular de 1 \times l0^{5} Da a 1 \times 10^{7} Da.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que la etapa de fraccionamiento por tamaños comprende cromatografía o ultrafiltración.

13. Extracto obtenido a partir del procedimiento según la reivindicación 11 ó 12.

14. Composición farmacéutica que comprende el extracto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 13, junto con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.

15. Composición nutricional que comprende el extracto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 13, y al menos una fuente de energía seleccionada del grupo que consiste en fuentes de hidratos de carbono, grasas y nitrógeno.

16. Complemento nutricional que comprende el extracto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 13, y un complemento convencional seleccionado del grupo que consiste en: vitamina E, vitamina C y ácido fólico.

17. Complemento nutricional que comprende el extracto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 13, y un producto nutricéutico seleccionado del grupo que consiste en: aceites de pescado, espirulina y equinácea.

18. Uso del extracto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 13, en la fabricación de un medicamento para la modulación de la respuesta inmune de un mamífero.

19. Uso según la reivindicación 18, en el que la modulación comprende el aumento de la proliferación de esplenocitos.

20. Uso según la reivindicación 18, en el que la modulación comprende el aumento de la producción de una citocina.

21. Uso según la reivindicación 20, en el que la citocina se selecciona del grupo que consiste en IL-6, IL-10,
INF-\gamma y TNF-\alpha.

22. Uso del extracto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 13, en la fabricación de un medicamento para complementar la respuesta inmune a una vacuna de un mamífero.

23. Uso según la reivindicación 22, en el que la vacuna es una vacuna contra la gripe.

24. Uso del extracto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 13, en la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar una infección bacteriana en un mamífero.

25. Uso del extracto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 13, en la fabricación de un medicamento para prevenir o tratar una infección fúngica en un mamífero.