ES2220800T3 - Preparaciones de chlorella que muestran propiedades inmunomoduladoras. - Google Patents
Preparaciones de chlorella que muestran propiedades inmunomoduladoras.Info
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Abstract
Extracto que comprende polisacáridos y complejos de polisacárido de Chlorella de alto peso molecular, en el que los polisacáridos y complejos de polisacárido de alto peso molecular son de 1 x 105 Da a 1 x 107 Da y constituyen al menos el 22% (p/p) del contenido derivado de Chlorella total del extracto.
Description
Preparaciones de Chlorella que muestran
propiedades inmunomoduladoras.
La presente invención se refiere a extractos de
Chlorella para su uso como inmunomoduladores.
Chlorella es un alga verde unicelular que
se ha denominado supernutriente que utiliza energía solar. Las
propiedades beneficiosas atestiguadas de esta microalga comestible
incluyen la cicatrización de heridas, detoxificación, alivio del
estreñimiento y estimulación del crecimiento. Varios estudios
también han indicado que Chlorella tiene efectos
beneficiosos sobre el sistema inmune, tanto in vitro como
in vivo.
Chlorella se encuentra tanto en agua dulce
como en agua marina. Las especies del género Chlorella
muestran una sorprendente diversidad de propiedades fisiológicas y
bioquímicas (Kessler, E. "Phycotalk" 1989, 1:
141-153; V. Rastogi Publ., Nueva Delhi, India).
Chlorella produce algo de celulosa y otros materiales de la
pared celular no digeribles y, por tanto, se han investigado
extensamente como una nueva fuente posible de alimento,
especialmente como materia prima (lee, Robert E. "Phycology"
2ª edición; 1989, página 281; Cambridge University Press).
Chlorella tiene el mayor contenido de
clorofila de cualquier planta ccnocida. También contiene vitaminas,
minerales, fibra dietética, ácidos nucleicos, aminoácidos,
enzimas, etc. Contiene más del 9% de grasas (de las que los ácidos
grasos poliinsaturados [PUFA] representan aproximadamente el 82%).
El contenido en vitaminas consiste en provitamina A, vitaminas
B_{1}, B_{2}, B_{6}, niacina, B_{12}, biotina, vitamina C,
vitamina K, ácido pantoténico, ácido fólico, colina, ácido lipoico,
inositol, PABA (ácido paraaminobenzoico), etc. Entre los minerales
presentes, los más importantes son P, K, Mg, S, Fe, Ca, Mn, Cu, Zn
y Co. Los componentes principales de las células de
Chlorella son aproximadamente el 60% de proteínas
(compuestas por todos los aminoácidos básicos) y el 20% de hidratos
de carbono.
Se han utilizado extractos acuosos de
Chlorella pyreinodosa por su contenido nutritivo así como por
otros beneficios para la salud. Los estudios notifican numerosos
beneficios para la salud incluyendo la función mejorada del sistema
inmune y la detoxificación de toxinas nocivas. Se introdujo como un
alimento dietéticos en los EE.UU. en 1977 cuando se desarrollaron
procedimientos de tecnología novedosa que la hicieron más digerible
y ha sido el complemento alimenticio dietético más vendido en Japón
durante varios años. La empresa Taiwan Chlorella es el mayor
proveedor mundial de Chlorella, y vende el producto en todo
el mundo, a Asia, Europa y Norte América bajo los nombres de marca:
Algea, Bio-REU-RELLA, Green Gem,
Green Boost, Green Nature, Green Power, Joyau Vert y Natural
Boost.
Varios estudios han documentado que los extractos
de C. vulgaris tienen actividad antitumoral, así como
actividad frente a Listeria y E. coli (Tanaka et
al. Immunopharmacol. Immunotoxicol., 1990, 12(2):
271-291; Tanaka et al. Cancer Immunol.
Immunother., 1998, 45(6): 313-320; Hasegawa
et al. Int. J. Immunopharmacol., 1990, 12(8):
883-891). Estas actividades parecen estar mediadas
inmunológicamente en vez de una toxicidad directa frente al tumor o
patógeno.
Están disponibles comercialmente varios extractos
de Chlorella, incluyendo productos de Swiss Herbal y
Nature's Way. El producto de Swiss Herbal se identifica como
células fragmentadas de Chlorella pura que contienen un 61%
de proteínas, un 21,1% de hidratos de carbono, un 11,0% de grasas,
un 2,866% de clorofila, un 2,94% de ARN y un 0,28% de ADN.
Otras publicaciones referidas al presente campo
incluyen las siguientes:
La solicitud de patente japonesa abierta a
consulta por el público número Sho 58-15920
describe polisacáridos procedentes de Chlorella de agua
dulce que tienen actividad como potenciador inmune y
antitumoral.
Neveu et al. Experiencia, 1978,
34(12): 1644-1645 describen que la C.
pyrenoidosa es un modulador de la respuesta inmune.
Vermeil y Morin CR Seances Soc. Biol. Fil., 1976,
170(3):646-649 describen que C.
pyrenoidosa, presumiblemente por la naturaleza de su pared
celular, protege a los ratones frente al injerto de sarcoma.
Miyazawa et al. J. Ethnophasmacol., 1988,
24(2-3): 135-146 describen
que las células o el extracto de C. pyrenoidosa median el
aumento inmune del huésped de la respuesta antitumoral.
Umezawa et al. Chemotherapy, 1982,
30(9): 1041-1046 y Komiyama et al.
Chemotherapy, 1986, 34: 302-307 describen que el
polisacárido ácido Chlon A procedente de C. pyrenoidosa tiene
efectos de aumento inmune y antitumorales. El Chlon A contiene
ramnosa, arabinosa, glucosa, galactosa y ácido glucurónico.
White y Barber, Biochimica Biophysica Acta, 1972,
264: 117-128 describen un polisacárido ácido de 88
kDa procedente de C. pyrenoidosa que contienen principalmente
ramnosa, así como arabinosa, galactosa, xilosa, manosa y ácido
glucurónico.
La patente de los EE.UU. número 4.533.548
describe el polisacárido ácido CH-1 procedente de
C. pyrenoidosa que contiene principalmente ramnosa, así como
arabinosa, galactosa, glucosa y ácido glucurónico. El polisacárido
se obtuvo mediante filtración en gel con Sephadex
G-75.
La patente de los EE.UU. número 4.381.020
describe un extracto de polisacárido procedente de C.
minutissima, una Chlorella marina, con actividad
inmunoestimulante y antitumoral. Esta patente establece que los
polisacáridos procedentes de especies marinas de Chlorella
son más eficaces en la activación de la inmunidad que las especies
de Chlorella de agua dulce. El extracto de polisacárido se
obtuvo mediante filtración en gel con Sephadex
G-50.
La patente de los EE.UU. número 4.786.496
describe una fracción lipídica y glucolipídica de Chlorella
marina con actividad inmunopotenciadora.
Kojima et al. J. Retic. Soc., 1973, 14:
192-208 describen un glucano activo de
1.250-1.400 Da para el sistema reticuloendotelial
(SER) procedente de Chlorella.
La patente de los EE.UU. número 3.462.412
describe un procedimiento para preparar un extracto que estimula el
SER procedente de Chlorella.
La solicitud de patente japonesa, publicación
número 06248003 describe un extracto de Chlorella de 15 a 25
kDa, que comprende polisacáridos que contienen predominantemente
galactosa, con actividad antineoplásica.
Mizuno et al. Bull. Fac. Agr. Shizuoka
Univ. (Shizuoka Daigaku Nogakubu Kenkyu Hokoku), 1980, 30:
51-59 describen dos fracciones de glucanos neutros
procedentes de Chlorella, ambas aparentemente de bajo peso
molecular.
Ukai et al. Ann. Proc. Gifu Pharm. Univ.
(Gifu Yakka Daigaku Kilo), 1990, 39: 44-48 describen
dos polisacáridos, CP-I y CP-II,
procedentes de C. pyrenoidosa con actividad estimulante del
SER. CP-I comprende glucosa, fucosa, ramnosa,
galactosa y manosa; CP-II comprende glucosa,
galactosa, ramnosa y manosa.
Chu et al. Aquaculture, 1982,
29(3-4): 241-252 describen
que el polisacárido, la fracción precipitable con etanol de cinco
especies de algas incluyendo Chlorella contiene
principalmente glucosa, manosa, ribosa/xilosa, ramnosa y fucosa.
Los extractos de Chlorella preparados
según la invención muestran actividad de estimulación inmune en
pruebas farmacológicas y clínicas. En un aspecto, los extractos
previstos por la presente invención tienen una actividad de
estimulación inmune superior a la de los extractos preparados y
utilizados en la técnica.
En un aspecto, la invención prevé preparaciones
que comprenden polisacáridos y complejos de polisacárido de
Chlorella de alto peso molecular. Los polisacáridos y
complejos de polisacárido de alto peso molecular son de
aproximadamente 1 \times 10^{5} Da a aproximadamente 1 \times
10^{7} Da y constituyen al menos el 22% (p/p) del contenido
derivado de Chlorella total del extracto. En una realización
preferida, el extracto procede de Chlorella pyrenoidosa.
Los polisacáridos y complejos de polisacárido de
alto peso molecular pueden ser de un intervalo seleccionado, por
ejemplo de 1 \times 10^{5} Da a 3 \times 10^{5} Da, de 3
\times 10^{5} Da a 5 \times 10^{5} Da, de 5 \times
10^{5} Da a 6 \times l0^{5} Da, de 6 \times 10^{5} Da a 7
\times 10^{5} Da, de 7 \times 10^{5} Da a 8 \times
10^{5} Da, de 8 \times 10^{5} Da a 9 \times 10^{5} Da, de
9 \times 10^{5} Da a 1 \times 10^{6} Da, de 1 \times
10^{6} Da a 2 \times 10^{6} Da, de 2 \times 10^{6} Da a 3
\times l0^{6} Da, de 3 \times l0^{6} Da a 4 \times
10^{6} Da, de 4 \times l0^{6} Da a 5 \times 10^{6} Da, de
5 \times 10^{6} Da a 7 \times 10^{6} Da, de 7 \times
10^{6} Da a 9 \times 10^{6} Da y de 9 \times 10^{6} Da a 1
\times 10^{7} Da.
Los extractos contienen al menos un 22% (p/p) de
los polisacáridos y complejos de polisacárido como una fracción
del contenido derivado de Chlorella total del extracto. El
porcentaje puede ser de al menos el 24% (p/p), de al menos el 26%
(p/p), de al menos el 28% (p/p), de al menos el 30% (p/p), de al
menos el 35% (p/p), de al menos el 40% (p/p), de al menos el 45%
(p/p), de al menos el 50% (p/p) o de al menos el 60% (p/p).
En otro aspecto, los polisacáridos y complejos de
polisacárido de alto peso molecular contienen glucosa y cualquier
combinación de: galactosa, ramnosa, manosa y arabinosa.
En otro aspecto, los polisacáridos y complejos de
polisacárido de alto peso molecular están sustancialmente libres
de ribosa, ácidos nucleicos, ácidos ribonucleicos y proteínas no
asociadas. Los polisacáridos y complejos de polisacárido de alto
peso molecular también pueden contener
N-acetilglucosamina y
N-acetilgalactosamina.
En otro aspecto, los extractos de la invención
retienen su actividad inmuncmoduladora tras un tratamiento para
eliminar el ADN, ARN y las proteínas no asociados. Tal tratamiento
incluye la digestión por pronasa, ADNasa, ARNasa y proteasas.
En otro aspecto, los extractos de la invención
retienen su actividad inmunomoduladora tras un tratamiento para
llevar a cabo la escisión de enlaces glucosídicos específicos,
estando definidos lcs enlaces por su sensibilidad a la escisión por
amilasa, amiloglucosidasa, celulasa o neuraminidasa. Tales enlaces
sensibles son normalmente:
- (i)
- tres o más unidades de D-glucosa con enlaces \alpha-1,4;
- (ii)
- glucósidos con enlaces \alpha-1,4;
- (iii)
- galactósidos con enlaces \alpha-1,4; o
- (iv)
- D-glucosa con enlaces \alpha-1,4;
La invención también prevé composiciones
nutricionales que contiene el extracto de Chlorella de alto
peso molecular con al menos una fuente de energía que pueden ser
hidratos de carbono, grasas o nitrógeno.
Los extractos de la invención también pueden
utilizarse en una combinación o en una mezcla con un complemento
convencional tal como vitamina E, vitamina C y ácido fálico. Los
extractos también pueden utilizarse con otros productos
nutricéuticos tales como aceites de pescado, espirulina y equinácea,
especialmente en aquellos productos nutricéuticos que tienen
actividad inmunoestimulante.
La invención también prevé un procedimiento para
obtener preparaciones de Chlorella que tienen actividad
inmunomoduladora. El procedimiento contiene las etapas de:
(a) fraccionar por tamaños un extracto acuoso de
Chlorella, y
(b) seleccionar las fracciones que comprenden los
polisacáridos y complejos de polisacárido de alto peso molecular de
aproximadamente 1 \times 10^{5} Da a aproximadamente 1 \times
l0^{7} Da.
El procedimiento para obtener el extracto de
Chlorella puede incluir además la etapa de reunir y
concentrar las fracciones seleccionadas. El fraccionamiento por
tamaños se puede conseguir mediante cromatografía, ultrafiltración
o ultracentrifugación.
La invención también prevé un medicamento para su
uso en un método para modular la respuesta inmune de un mamífero,
incluidos los seres humanos, mediante la administración al mamífero
de una cantidad eficaz del extracto de Chlorella de alto
peso molecular. Tal modulación incluye el aumento de la
proliferación de esplenocitos y el aumento de la producción de
citocinas tales como IL-6, IL-10,
INF-\gamma y TNF-\alpha y puede
utilizarse ventajosamente para tratar o prevenir infecciones
bacterianas o fúngicas.
El extracto puede administrarse además como un
complemento de un régimen de vacunación para estimular
adicionalmente la respuesta inmune. Puede utilizarse ventajosamente
una vacuna contra la gripe con el extracto. El extracto puede estar
presente como un adyuvante de las vacunas, especialmente como
adyuvante de vacuna oral.
Ahora se describirá la invención en sus diversas
realizaciones con referencia a los dibujos adjuntos.
Figura 1: Cromatograma de combinación mediante
cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) / detección del índice
de refracción (RI) / dispersión de luz láser en múltiples ángulos de
preparaciones de recuerdo inmune IBP-1 e
IBP-2. El trazo superior es el cromatograma de IR;
el trazo inferior es la respuesta de MALS;
figura 2: Perfil del peso molecular acumulado de
IBP-1;
figura 3: Cromatograma de SEC de
IBP-2 utilizando Sephacryl S 1000 SF;
figura 4: Cromatograma de SEC de
IBP-2 (o IBP-1) utilizando Sephacryl
S 300 HR;
figura 5: Estimulación de la proliferación de
esplenocitos mediante diversas fracciones del extracto de
Chlorella resueltas con Sephacryl 300 HR;
IBP-6s es la fracción con hombro en el pico de
IBP-6; "Células" y "Células + DMSO" son
los controles negativos; LPS es lipopolisacárido, utilizado como
control positivo;
figura 6: Estimulación de la proliferación de
esplenocitos mediante diversas fracciones del extracto de
Chlorella resueltas con cromatografía en Sephadex G100 de
IBP-2; "Células" es un control negativo; LPS es
un control positivo;
figura 7: Curva de valoración - proliferación de
esplenocitos de IBP-2; "Células" es un control
negativo; LPS es un control positivo;
figura 8: Ensayo de proliferación que mide la
incorporación de ^{3}H per células B o T aisladas en presencia de
IBP-225 \mug/mL;
figura 9: Producción de óxido nítrico por
macrófagos peritoneales inflamatorios de BALB/c cultivados en
presencia de diversas concentraciones de IBP-2;
"IFN + LPS" es un control positivo;
figura 10: Producción de IL-6 por
las células de bazo de ratón BALB/c en presencia de diversas
concentraciones de IBP-2; "Con A" es
concanavalina A; "Células + Con A" y "Células + LPS" son
muestras de control positivo, concanavalina A está a 10 \mug/mL;
LPS está a 20 \mug/mL;
figura 11: Efecto de IBP-2
comparado con 4 mg de equinácea (Equin.) sobre la proliferación de
Listeria monocytogenes en ratones;
figura 12: Efecto de IBP-2
comparado con el alga bruta y equinácea sobre la proliferación de
Candida albicans en ratones;
figura 13: Proliferación de esplenocitos de ratón
medido como la incorporación de ^{3}H, cultivados en presencia de
IBP-2 de extractos comerciales de Chlorella
de Swiss Herbal y Nature's Way.
Figura 14: Cromatograma de electroforesis capilar
del extracto crudo y dializado de IBP-2. Los
monosacáridos se asignan a los picos tal como sigue: ribosa en la
posición 9,05; ramnosa en la posición 10,47; manosa en la posición
10,68; galactosa en la posición 11,14 y glucosa en la posición 11,
65.
Figura 15: Cromatograma de electroforesis capilar
de la parte retenida tras hacerse pasar el IBP-2 a
través de una membrana de ultrafiltración de MWCO (molecular weight
cut off, peso molecular de corte) de 1 MDa. Los monosacáridos se
asignan a los picos tal como sigue:
N-acetilgalactosamina (Ga1NAc) en la posición 7,30;
N-acetilglucosamina (G1cNAc) en la posición 7,43;
arabinosa en la posición 10,52; ramnosa en la posición 10,90; manosa
en la posición 11,11; (obsérvese que el pico en la posición 11,01 es
una burbuja; el pico de manosa está justo a la derecha de este
pico); galactosa en la posición 11,62; glucosa en la posición
12,13.
Figura 16: DEAE-Sepharose de
flujo rápido de IBP-2. Se aplicó una muestra a una
columna de 1,0 \times 30 cm de Pharmacia y se eluyó con tampón de
piperazina / HC1 (0,02 M, pH 8,8) a una velocidad de 5 mL/min. Se
empleó un gradiente de NaCl: 0-20% en volúmenes de
20 columnas, después 20-100% en volúmenes de 2
columnas.
Figura 17: DEAE-Sepharose de
flujo rápido de la parte de retención tras hacerse pasar el
IBP-2 a través de una membrana de ultrafiltración de
MWCO de 1 MDa. Se aplicó una muestra a una columna de 1,0 \times
30 cm de Pharmacia y se eluyó con tampón de piperazina / HC1 (0,02
M, pH 8,8) a una velocidad de 5 mL/min. Se empleó un gradiente de
NaCl: 0-20% en volúmenes de 20 columnas, después
20-100% en volúmenes de 2 columnas.
La presente invención se refiere a la previsión
de un medicamento para aumentar los mecanismos de defensa
inmunológica de los mamíferos, incluyendo los seres humanos. Las
defensas inmunológicas se aumentan mediante la administración de
inmunomoduladores derivados de Chlorella en la forma de
extractos derivados de Chlorella de pesos moleculares entre
1 \times 10^{5} Da y 1 \times 10^{7} Da.
Las especies del género Chlorella
utilizadas en la invención incluyen las siguientes: minutissima,
marina, salina, pyrenoidosa, vulgaris, anitrata, antactica,
autotrophica, regularis, entre otras (véase el Catálogo mundial
de algas, 2ª edición, páginas 58-74; Miyachi et
al. (Eds); 1989; Japan Scientific Societies Press, cuyo
contenido se incorpora como referencia al presente documento).
Las cepas mutantes de Chlorella, que
aparecen de manera natural o se producen de manera artificial, por
ejemplo mediante irradiación (por ejemplo, ultravioleta, rayos X),
mutágenos químicos o mediante mutagénesis dirigida al sitio, están
dentro del alcance de la invención. En una realización, se
prefieren C. pyrenoidosa y sus variantes. En otra
realización, se prefieren C. ellipsoídea y sus variantes. El
cultivo de Chlorella se lleva a cabo mediante métodos
conocidos en la técnica utilizando medios y condiciones de cultivo
adecuados (véase por ejemplo, White y Barber, Biochimica Biophysica
Acta, 1972, 264: 117-128).
Puede influirse en la producción de polisacárido
mediante manipulación fisiológica y metabólica. La composición de
los medios de cultivo puede influir en la velocidad de crecimiento,
lo que conduce a cambios en el espesor de la pared celular. Los
genes responsables del crecimiento pueden regularse por incremento
o por disminución. Para un método utilizado para transformar algas
eucarióticas, véase por ejemplo la patente de los EE.UU. 6.027.900;
para métodos para seleccionar mutantes de algas, véase por ejemplo
la patente de los EE.UU. 5.871.952. Por tanto, mediante la
selección entre diversas condiciones, pueden prepararse variantes
de inmunomoduladores biopoliméricos procedentes de
Chlorella.
Se preparan extractos acuosos brutos de
Chlorella mediante métodos conocidos en la técnica,
incluyendo la extracción con agua caliente de células cultivadas o
células secadas por pulverización (documentos US 4.831.020 y US
5.780.096) y los métodos de extracción con disolventes (White y
Barber, Biophys. Biochim. Acta, 1972, 264: 117-128;
US 3.462.412). Los extractos brutos pueden obtenerse de la empresa
Taiwan Chlorella
(www.taiwanchlorella.com/
product-3.htm).
product-3.htm).
En una realización, el extracto bruto se prepara
a partir de células de Chlorella secadas por pulverización
con un contenido medio de humedad del 0,3%; (el contenido de
humedad se determinó tras secar el material secado por
pulverización durante 16 h en un vacío de 5 mm). El extracto bruto
se prepara tratando las células con medios acuosos, preferiblemente
agua o disoluciones débiles de ácidos orgánicos, tales como ácido
acético, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido cítrico, ácido
láctico, ácido maleico, ácido propiónico, ácido sórbico, ácido
succínico, etc., preferiblemente ácido benzoico, con agitación
suave. El proceso de extracción podría ejecutarse a diversas
temperaturas que oscilan desde 0 hasta 100ºC, preferiblemente de
entre 50 y 90ºC. Los rendimientos y la actividad inmunológica que se
correlacionan con los perfiles cromatográficos indican que 1 h a
80ºC es una combinación adecuada de tiempo y temperatura para
realizar esta etapa de manera eficaz.
Las células residuales y los restos celulares se
separaron mediante centrifugación con una fuerza centrífuga
relativa (FCR) de 150 a 10.000 g, preferiblemente de 4.000 a 10.000
g. El tiempo necesario para completar esta etapa está relacionado
con la fuerza centrífuga; 20 minutos es suficiente a 10.000 g.
Entonces, se sometió a microfiltración el sobrenadante.
Alternativamente, puede utilizarse la filtración para eliminar
células completas y restos, en cuyo caso es necesario el uso de una
serie de filtros partiendo de uno grueso, pasando por uno medio y
terminando con microfiltración. Se recomienda la filtración de
flujo cruzado o la tecnología de membrana vibrante para reducir la
suciedad. La filtración es particularmente sensible a la
temperatura y el periodo de tiempo requeridos para la extracción.
Por tanto, la centrifugación es la vía preferida.
Tras la centrifugación o filtración, puede
secarse el sobrenadante (o filtrado) para obtener productos de
IBP-1 en forma seca. El secado se consiguió
mediante liofilización, flujo de aire frío o preferiblemente
mediante secado por pulverización. Alternativamente, en primer
lugar podría reducirse el volumen del extracto (hasta el
10-50%, preferiblemente 20%) y luego precipitarse
los materiales activos de la disolución con precipitantes
adecuados, preferiblemente etanol o sulfato de amonio.
El IBP-1 se liberó de las sales y
productos de baja masa molecular. Aunque podría emplearse una
variedad de medios acuosos (tales como alcoholes diluidos, diversos
tampones, ácido acético diluido, etc.), se encontró que el agua es
un medio suficiente para la diálisis. Esta etapa redujo la masa
del material extraído en aproximadamente un 50% y aumentó su
actividad inmunológica específica (evaluado por el efecto sobre la
estimulación de esplenocitos, véase más adelante) en
aproximadamente un 25%. La diálisis podría sustituirse por la
desalación con medios de filtración en gel, tales como Sephadex G
25, Bio Gel P 6 o equivalentes. De manera similar, podrían
utilizarse membranas de ultrafiltración correspondientes con pesos
moleculares de corte correspondientes. Tras la etapa de desalación,
el material (IBP-2) puede secarse utilizando los
métodos descritos para IBP-1.
El fraccionamiento por tamaños de los extractos
de Chlorella puede llevarse a cabo mediante cualquier método
conocido en la técnica, incluyendo la cromatografía de exclusión
por tamaños, el análisis por sedimentación, por ejemplo
centrifugación en gradiente, y ultrafiltración.
IBP-1 o IBP-2 es
una mezcla de polisacáridos y complejos de polisacárido, oscilando
una masa molecular media de la fracción inmunomoduladora de interés
desde 100 hasta 10.000 kDa. Los complejos de polisacárido son
polisacáridos que están asociados no covalentemente con un
biopolímero que no es polisacárido que, por sí mismo, no tiene
actividad inmune significativa. Los biopolímeros que no son
polisacáridos incluyen ADN y proteína que pueden contribuir al peso
molecular acumulado del extracto, pero que no tienen actividad
inmune significativa.
En diversas realizaciones, los polisacáridos y
complejos de polisacárido de alto peso molecular son de
aproximadamente 1 \times 10^{5} Da a aproximadamente 1 \times
10^{5} Da, de aproximadamente 3 \times 10^{5} Da a
aproximadamente 5 \times 10^{5} Da, de aproximadamente 5
\times l0^{5} Da a aproximadamente 6 \times 10^{5} Da, de
aproximadamente 6 \times 10^{5} Da a aproximadamente 7 \times
10^{5} Da, de aproximadamente 7 \times 10^{5} Da a
aproximadamente 8 \times 10^{5} Da, de aproximadamente 8
\times 10^{5} Da a aproximadamente 9 \times 10^{5} Da, de
aproximadamente 9 \times 10^{5} Da a aproximadamente 1 \times
10^{6} Da, de aproximadamente 1 \times 10^{6} Da a
aproximadamente 2 \times 10^{6} Da, de aproximadamente 2
\times 10^{6} Da a aproximadamente 3 \times 10^{6} Da, de
aproximadamente 3 \times 10^{6} Da a aproximadamente 4 \times
10^{6} Da, de aproximadamente 4 \times 10^{6} Da a
aproximadamente 5 \times 10^{6} Da, de aproximadamente 5
\times 10^{6} Da a aproximadamente 7 \times 10^{6} Da, de
aproximadamente 7 \times 10^{6} Da a aproximadamente 9 \times
10^{6} Da y de aproximadamente 9 \times 10^{6} Da a
aproximadamente 1 \times 10^{7} Da.
El fraccionamiento por tamaños para obtener las
fracciones anteriores se basa en principios de tamizado molecular.
Normalmente, se emplean las técnicas de cromatografía de exclusión
por tamaños y los métodos de ultrafiltración. Los principios
básicos de la cromatografía de exclusión por tamaños son bien
conocidos por los expertos en la técnica y se explican en "Gel
filtration: Principle and Methods. Octava edición, Amersham
Pharmacia Biotech AB, Rahhms I Luna, Uppsala, Suecia". Las
columnas apropiadas para fraccionar intervalos particulares pueden
seleccionarse fácilmente y utilizarse con eficacia para resolver
las fracciones anteriores, por ejemplo Sephacryl S 100 HR;
Sephacryl S 200 HR, Sephacryl S 300 HR; Sephacryl S 400 HR y
Sephacryl S 500 HR o sus equivalentes. De una manera análoga,
podrían utilizarse medios Sepharose o sus equivalentes, por ejemplo
Sepharose 6B, 4B, 2B.
La purificación de los polisacáridos o complejos
de polisacárido con proteína podría conseguirse en combinación con
otras técnicas cromatográficas, incluyendo la cromatografía de
afinidad, intercambio iónico, cromatografía de interacción
hidrófoba, etc. Un ejemplo de cromatografía de
IBP-2 (el material retenido tras hacerse pasar el
IBP-2 a través de la membrana de ultrafiltración
con MWCO > 1 MDa), que utiliza cromatografía de intercambio
aniónico de DEAE-Sepharose de flujo rápido, se
facilita en las figuras 16 y 17. Las figuras demuestran una
disminución significativa del contenido en proteínas tras hacerse
pasar el IBP-2 a través de la membrana de
ultrafiltración.
La ultrafiltración de las muestras podría
realizarse utilizando membranas moleculares con masa molecular de
corte apropiadas. Las membranas y los procedimientos específicos
utilizados para realizar el fraccionamiento están ampliamente
disponibles para los expertos en la técnica, tal como se expone
en:
http://www.uku.fi/laitokset/anat/PG/c
method.htm.
En una realización, el método utilizado para la
caracterización y cuantificación de estos materiales se basa en
cromatografía de exclusión por tamaños (SEC) / dispersión de luz
láser en múltiples ángulos (MALS) / detección del índice de
refracción (RI) combinados. En la técnica híbrida (SEC/MALS/RI), se
utiliza un experimento de HPLC isocrática, que utiliza una columna
para SEC GMPWXL de Tosohaas, para separar mezclas según el tamaño
molecular. La técnica MALS en línea determina la distribución de
peso molecular promedio de los biopolímeros que eluyen y
proporciona así especificidad en el análisis. La detección de RI se
utiliza tanto para la cuantificación como para proporcionar el
perfil de elución requerido en el tratamiento de los datos de
MALS.
Un ejemplo de cromatograma de SEC obtenido para
un extracto típico se muestra en la figura 1. El trazo superior es
el cromatograma registrado utilizando el detector de RI mientras
que el trazo de abajo es la respuesta de MALS en uno de los
detectores (90 grados). El pico de MALS es un máximo para el
componente de elevada masa molecular que corresponde realmente a un
pequeño porcentaje del extracto total tal como puede observarse a
partir del trazo superior. Por tanto, aunque el intervalo de peso
molecular se extiende desde algunos kDa hasta aproximadamente 10
MDa, el peso molecular promedio en peso (PM) para el extracto
completo se determina que es de aproximadamente 90 kDa. Esto puede
observarse más claramente a partir del perfil de peso molecular
acumulado de IBP-1 (figura 2).
IBP-1 o IBP-2
pueden fraccionarse adicionalmente utilizando técnicas
cromatográficas o de ultrafiltración adecuadas. Las matrices para
la cromatografía de exclusión por tamaños con amplio intervalo de
fraccionamiento tales como Sephacryl S 1000 SF (figura 3)
resolvieron el extracto en dos picos: el primero eluyó justo tras
el volumen inicial ("void volume"); su masa molecular
promedio, medida mediante MALS, fue de 1.000 kDa en promedio; el
segundo pico eluyó justo después del primer pico. Las fracciones
combinadas que representaban el primer pico se desalaron y secaron
de manera análoga a las de IBP-1, lo que dio como
resultado IBP-3. Este material fue superior en su
actividad inmunológica comparado con el segundo pico
(IBP-4). En este procedimiento cromatográfico se
utilizaron medios acuosos, preferiblemente NaCl 0,15 M. Aunque
IBP-1 mostró una mayor actividad inmunológica que
IBP-2, la diferencia fue insignificante. La
contribución a la actividad inmunoestimulante (que aumenta
gradualmente con la masa) comienza a estabilizarse cuando la masa
molecular alcanza. aproximadamente 500 kDa.
IBP-4 podría fraccionarse
adicionalmente utilizando técnicas cromatográficas o de
ultrafiltración adecuadas. Se encontró que eran útiles tanto la
cromatografía de intercambio fónico (IEC) como SEC para la
resolución adicional de IBP-4. Podrían utilizarse
matrices para SEC con el intervalo de fraccionamiento apropiado,
por ejemplo Sephacryl S 300. Sephacryl S 300 HR resolvió
IBP-1 o IBP-2 en dos picos (figura
4). El primer pico comenzó a eluir en las últimas fracciones del
volumen inicial de la columna. La mayor parte de los biopolímeros
eluidos mostraron masas moleculares que oscilaban desde 100 hasta
500 kDa. Las fracciones combinadas que representaban el primer pico
se desalaron y secaron de manera análoga a las de
IBP-1, lo que dio como resultado
IBP-5. Este material fue supericr en su actividad
inmunológica que el segundo pico (IBP-6) que eluyó
justo después de que el primer pico tocara la línea base (figura
5). IBP-5 representó normalmente sólo el 30% de la
masa combinada de ambos picos. Para este procedimiento
cromatográfico se utilizaron medios acuosos, preferiblemente tampón
de acetato 0,1 M, pH 4,5 con gradiente lineal de NaCl. La
diferencia en la actividad inmunológica de IBP-5 e
IBP-6 fue superior que la que hay entre
IBP-3 e IBP-4; normalmente la razón
de CPM_{IBP-3} con respecto a
CPM_{IBP-4} fue de 5:2, medido mediante el nivel
de incorporación de ^{3}H en los esplenocitos en proliferación.
El procedimiento podría simplificarse, hasta cierto punto,
mediante el uso de membranas de ultrafiltración con masa molecular
de corte de aproximadamente 500 kDa. Por ejemplo, podría utilizarse
satisfactoriamente la membrana Omega ZM 500.
IBP-6 podría fraccionarse
adicionalmente utilizando técnicas cromatográficas o de
ultrafiltración adecuadas, por ejemplo utilizando matrices
cromatográficas tales como Sephadex G 100, Sephadex G 75 o medios
análogos o membranas de ultrafiltración correspondientes. Sin
embargo, la actividad inmunológica específica que reside en
IBP-6 fue significativamente más débil que la de
IBP-3 e IBP-5 y, por tanto, no fue
de interés principal. Sin embargo, podría utilizarse eficazmente
Sephadex G 100 para eliminar de IBP-2 la mayor
parte del material de peso molecular inferior
(IBP-8), que se asocia con baja actividad
inmunológica (figura 6). Normalmente, la razón de
CPM_{IBP-7} con respecto a
CPM_{IBP-8} fue de 10:1; (siendo
IBP-7 la fracción inmunoactiva y de masa molecular
elevada). Esta etapa de purificación podría conseguirse asimismo
con una membrana de ultrafiltración YM-100.
Los extractos brutos de Chlorella
contienen aproximadamente un 61% de proteínas y un 21% de hidratos
de carbono. El tratamiento de Chlorella según la presente
invención da como resultado un porcentaje superior de polisacáridos
y complejos de polisacárido, es decir los extractos de la invención
tienen un porcentaje superior de polisacáridos y complejos de
polisacárido con respecto al material total derivado de
Chlorella, comparado con un extracto bruto de células
fragmentadas. Se entiende que pueden añadirse materiales no
relacionados con Chlorella al extracto de Chlorella y
que tales extractos están dentro del alcance de la invención.
El porcentaje de polisacáridos y complejos de
polisacárido en los extractos de la invención es de al menos el 23%
(p/p) del contenido derivado de Chlorella total del
extracto. En diversas realizaciones, el porcentaje es de al menos el
24% (p/p), de al menos el 26% (p/p), de al menos el 28% (p/p), de
al menos el 30% (p/p), de al menos el 35% (p/p), de al menos el 40%
(p/p), de al menos el 45% (p/p), de al menos el 50% (p/p) o de al
menos el 60% (p/p).
Los polisacáridos y complejos de polisacárido de
alto peso molecular pueden. purificarse y aislarse adicionalmente
hasta los diversos porcentajes indicados anteriormente mediante la
eliminación de los componentes que no son polisacáridos. Tales
componentes que no son polisacáridos incluyen ADN, ARN y proteínas
no asociadas. (Las proteínas no asociadas se definen para el fin de
la presente solicitud como proteínas que no están asociadas con
polisacáridos en un complejo de polisacárido).
Un método de eliminación es el uso de enzimas de
digestión para escindir los componentes que no son polisacáridos,
seguido por fraccionamiento por tamaños para eliminar los productos
escindidos tal como se describe en los ejemplos de más adelante
(ejemplo 7). Las enzimas de digestión incluyen pronasa,
ribonucleasa, ADNasa y proteasas, también conocidas en la técnica y
descritas en diversos libros de texto, un ejemplo de los cuales es
Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(1982) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
Nueva York. Las proteasas útiles para la digestión de proteínas no
asociadas incluyen: endo y exopeptidasas, pronasa,
serín-proteasas tales como tripsina, quimotripsina
y subtilisina, tiol-proteasas tales como papaína, y
proteasas que requieren calcio tales como termolisina.
Alternativamente, los componentes que no son
polisacáridos pueden eliminarse mediante cromatografía de afinidad,
por ejemplo, mediante el uso de matrices de unión a ADN o ARN
(Maniatis et al., 1982). Otra opción es purificar los
polisacáridos y complejos de polisacárido de los componentes
contaminantes mediante el uso de matrices de unión a polisacáridos
tales como lectinas. En otra realización, los extractos de la
invención pueden tratarse con enzimas glucosídicas en condiciones y
durante una extensión de tiempo suficiente para llevar a cabo la
escisión de:
- (i)
- tres o más unidades de D-glucosa con enlaces \alpha-1,4;
- (ii)
- glucósidos con enlaces \alpha-1,4;
- (iii)
- galactósidos con enlaces \alpha-1,4; o
- (iv)
- D-glucosa con enlaces \alpha-1,4;
Ejemplos de enzimas glucosídicas útiles para la
escisión de tales enlaces glucosídicos incluyen: amilasa,
amiloglucosidasa, celulasa y neuraminidasa.
La composición de hidratos de carbono, el
contenido en ADN y la composición de aminoácidos de los extractos de
Chlorella de la invención pueden determinarse mediante
cualquier método adecuado conocido en la técnica.
La actividad inmune de los extractos de la
invención se asocia con los polisacáridos de Chlorella de
alto peso molecular, definidos como aquellas macromoléculas que
consisten en monosacáridos unidos por enlaces glucosídicos. Los
polisacáridos están presentes en los extractos en la forma de
polisacáridos libres o polisacáridos complejados (es decir,
polisacáridos que están asociados no covalentemente con un
biopolímero que no es polisacárido que, por sí mismo, no tiene
actividad inmune significativa). En una realización, el contenido
en proteínas del extracto es de aproximadamente el 20% al 50%,
preferiblemente del 20% al 30%. De este porcentaje de proteínas,
aproximadamente del 40% al 60% están asociadas con
polisacáridos.
Los biopolímeros que no son polisacáridos
incluyen ADN, proteína y posiblemente ARN, que pueden contribuir al
peso molecular acumulado del extracto pero que no tienen actividad
inmune significativa. El ARN, ADN y proteínas no asociados, es
decir aquellos no complejados con los polisacáridos, no contribuyen
significativamente a la actividad inmune de los extractos. Para los
fines de la presente solicitud, el ARN, ADN y proteínas no
asociados se definen funcionalmente como aquellos ARN, ADN y
proteínas que son sensibles a la escisión mediante una ribonucleasa
(ARNasa), desoxirribonucleasa (ADNasa) y proteasas comunes de la
clase de la serina y el tiol. Por tanto, los extractos de la
presente invención pueden estas esencialmente libres o
sustancialmente libres de ARN, ADN o proteínas no asociados. Por
"esencialmente libre" se entiende menos del 5% de ADN o ARN no
asociados y menos del 15% de proteínas no asociadas. Por
"sustancialmente libre" se entiende menos del 2% de ADN o ARN
no asociados y menos del 10% de proteínas no asociadas.
Se entiende que, mientras que los biopolímeros
que no son polisacárido per se carecen de actividad inmune,
su asociación con los polisacáridos puede contribuir a la actividad
inmune de los polisacáridos puesto que los biopolímeros que no son
polisacárido del complejo pueden cumplir ciertos requisitos
estéricos o polares que permiten a los polisacáridos funcionar de
manera eficaz como inmunomoduladores.
Los extractos de la presente invención pueden
digerirse con amilasa, amiloglucosidasa, celulasa y neuraminidasa
sin pérdida significativa de actividad inmune. Por tanto,
aparentemente la actividad inmune reside en los polisacáridos o sus
complejos que no contienen una cantidad sustancial de tres o más
unidades de D-glucosa con enlaces
\alpha-1,4; glucósidos con enlaces
\alpha-1,4; galactósidos con enlaces
\alpha-1,4 o D-glucosa con enlaces
\alpha-1,4. Sin embargo, se entiende que los
polisacáridos inmunomoduladores pueden contener los enlaces
glucosídicos anteriores si tales enlaces no son accesibles a la
digestión enzimática.
Los modificadores de la respuesta biológica se
han definido como aquellos agentes que modifican la respuesta
biológica del huésped mediante una estimulación del sistema inmune,
que puede dar como resultado diversos efectos terapéuticos. Una de
las categorías de sustancias que pertenecen a esta clase es la de
los inmunomoduladores. Tal como se utiliza en el presente
documento, el término "inmunomodulador" se refiere a un agente
que puede modular una respuesta inmune. En el contexto de la
presente invención, tal modulación es un aumento de los mecanismos
de defensa inmunológica del huésped.
Se cree que los extractos de Chlorella son
principalmente un estimulador de las células B y los macrófagos.
Un beneficio de los inmunomoduladores de las células B es que
pueden estimular la función inmune en aquellos que tienen una
respuesta de anticuerpos alterada frente aun antígeno. También, un
estimulador de las células B podría aumentar la rapidez de la
respuesta inmune de anticuerpos cuando se presenta con una nueva
infección. Los extractos de Chlorella proporcionan una
alternativa segura, eficaz y rentable para el tratamiento sanitario
preventivo.
Los estudios in vitro demuestran que los
extractos de Chlorella estimularon la proliferación de
células de bazo de ratón BALB/c y la producción por los macrófagos
de IL-6 y NO_{2}. Los extractos de
Chlorella también se examinaron in vivo, y se
encontró que reducían significativamente la infección con
Listeria monocytogenes, así como con el hongo Candida
albicans (véanse los ejemplos 8 a 13).
Se ha completado una serie de tres ensayos de
toxicología para los extractos de Chlorella. No fue evidente
ningún efecto de la administración del extracto de Chlorella
durante el estudio de toxicidad oral de 28 días en ratas. Para el
estudio de toxicidad oral tras una única dosis en ratas, para
determinar la dosis no letal máxima o la dosis letal mínima del
producto tras una única administración oral, el estudio encontró
que la dosis letal mínima de un extracto bruto de Chlorella
era superior a 2000 mg/kg de peso corporal. El ensayo de mutación
bacteriana mostró que los extractos de Chlorella no
mostraban ninguna actividad mutagénica en las condiciones de
prueba.
Un estudio aleatorizado, doble ciego, controlado
por placebo completado recientemente encontró que los extractos de
Chlorella demostraron efectos inmunoestimulantes
significativos en adultos sanos que recibieron la vacuna contra la
gripe, comparado con sujetos que recibieron placebo (véase el
ejemplo 14).
Los experimentos in vitro con células
sanguíneas humanas muestran la estimulación de la producción de
interleucinas, similar a la observada en el modelo de ratón.
Los extractos de Chlorella de la invención
son adecuados para su uso en cualquier condición o estado de
enfermedad en el que se desee el aumento o la modulación de la
respuesta inmune. En una realización, los extractos de
Chlorella pueden utilizarse en una cantidad eficaz como
adyuvantes en diversas formas de preparaciones de vacunas de
administración en la mucosa, especialmente para la administración
oral.
Los adyuvantes pueden proteger al antígeno de la
rápida dispersión secuestrándolo en un depósito local, o pueden
contener sustancias que estimulen que el huésped segregue factores
que son quimiotácticos para los macrófagos y otros componentes del
sistema inmune. Adyuvantes conocidos para la administración en la
mucosa incluyen toxinas bacterianas, por ejemplo, la toxina del
cólera (TC), la toxina termolábil de E. Coli (TL), la toxina A de
Clostridium difficile y la toxina pertussis (TP). Los
extractos de Chlorella, siendo un producto comestible de
alto peso molecular y en sí mismos estimulantes inmunes, son
candidatos para su uso como adyuvantes en vacunas orales.
La expresión "cantidad eficaz" de un
inmunomodulador se refiere a una cantidad de un inmunomodulador
suficiente para aumentar el mecanismo de defensa de un huésped.
Esta cantidad puede variar hasta cierto punto dependiendo del modo
de administración, pero estará en el mismo intervalo general. Si
se utiliza más de un inmunomodulador (por ejemplo, extracto de
Chlorella en combinación con equinácea), cada uno puede estar
presente en estas cantidades o la cantidad total puede caer dentro
de este intervalo. La cantidad eficaz exacta necesaria podría
variar de sujeto a sujeto, dependiendo de la especie, la edad y el
estado general del sujeto, la gravedad del estado que se está
tratando, el modo de administración, etc. Por tanto, no es posible
especificar una cantidad eficaz exacta. Sin embargo, la cantidad
eficaz apropiada puede determinarse por un experto en la técnica
utilizando sólo la experimentación de rutina o los conocimientos
previos en la técnica de los inmunomoduladores.
El término "tratamiento" tal como se utiliza
en el presente documento cubre cualquier tratamiento de un animal,
particularmente un ser humano, e incluye:
(i) prevenir que se produzca la enfermedad en un
sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad pero al que
todavía no se le ha sido diagnosticado que la tenga;
(ii) inhibir la enfermedad, es decir, detener su
desarrollo; o
(iii) aliviar la enfermedad, es decir, producir
la regresión de la enfermedad.
Las composiciones nutricionales y farmacéuticas
que contienen los extractos de Chlorella de la invención
pueden formularse y administrase en cualquier forma adecuada para
la administración entérica, por ejemplo la administración oral o
la alimentación mediante sonda nasogástrica. Las formulaciones se
administran convenientemente en la forma de un líquido acuoso. Las
formulaciones adecuadas para la aplicación entérica están, en
consecuencia, preferiblemente en forma acuosa o en forma de polvo o
granulado, incluyendo la forma en comprimido. El polvo o granulado
puede añadirse convenientemente a agua antes de su uso. En forma
líquida, la composición tiene un contenido en sólidos de
normalmente desde el 0,1% hasta el 50% en peso, preferiblemente
desde el 1% hasta el 10% en peso. Como bebida, las composiciones
pueden obtenerse de cualquier manera conocida, por ejemplo,
mezclando el extracto de Chlorella con una fuente de energía
tales como fuentes de hidratos de carbono, grasas y nitrógeno.
Las composiciones nutricionales pueden estar en
la forma de una dieta de fórmula completa (en forma líquida o en
polvo), de tal manera que cuando se utiliza como fuente nutritiva
exclusiva se cumplen todos los requerimientos diarios calóricos, de
nitrógeno, ácidos grasos, vitaminas, minerales y oligoelementos.
Sin embargo, las composiciones nutricionales de la invención se
destinan preferiblemente al uso como complemento dietético.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
también pueden formularse en un formato de dosis única, en el que
comprenden extractos de Chlorella y un vehículo
farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones farmacéuticas son
adecuadas para la administración entérica, tal como la
administración oral, nasal o rectal. Las composiciones adecuadas
pueden estar en forma líquida o en forma sólida. Las dosificaciones
de las composiciones líquidas son normalmente desde el 0,1% hasta
el 50% en peso, preferiblemente desde el 1% hasta el 10% en peso
del extracto de Chlorella. Las dosificaciones de las
composiciones sólidas son normalmente desde 0,2 mg/kg hasta 200
mg/kg, preferiblemente desde 1 mg/mk hasta 10 mg/kg del extracto de
Chlorella. Las composiciones pueden estar en la forma de
comprimidos, cápsulas duras y blandas y bolsitas.
En la técnica, se conocen vehículos adecuados.
Comprenden cargas tales como azúcares o celulosa, aglutinantes tales
como almidón, y disgregantes si se necesita.
Se ofrecen los siguientes ejemplos a modo de
ilustración y no a modo de limitación.
Veinte gramos de polvo seco de Chlorella
pyreinodosa se mezclaron con 100 mL de agua destilada y se
calentaron con agitación suave durante 1 h a 80ºC. El material se
centrifugó a 10.000 g durante 20 min; el sedimento residual se lavó
dos veces. Los sobrenadantes combinados se microfiltraron entonces
y se secaron por pulverización. El rendimiento medio fue del 10,5%.
La extracción del sedimento durante 1 h a 80ºC pudo repetirse
varias veces, preferiblemente dos veces, en lugar del lavado
simple.
Alternativamente, los sobrenadantes combinados se
evaporaron hasta 1/5 de su volumen original usando un evaporador
giratorio a presión reducida, luego se precipitaron con etanol
(contenido de etanol final del 80%). La mezcla se mantuvo a 4ºC
durante 18 h, después el precipitado se filtró, se lavó con etanol
absoluto y se secó a vacío.
El material extraído, preparado como
anteriormente, se desaló por diálisis exhaustiva frente a agua a
4ºC y después se secó por pulverización. El rendimiento medio fue
de aproximadamente el 7,5%.
Veinte miligramos de IBP-2 se
disolvieron en 1 mL de agua destilada, se filtraron previamente con
un filtro de 0,45 \mum y se cargaron en una columna Sephacryl S
1000 HR (1,0 \times 50 cm) y se eluyeron con NaCl 0,15 M. La
cromatografía se monitorizó a 280 nm y a 490 nm tras la interacción
de las fracciones eluidas con un reactivo de fenol/ácido sulfúrico.
La mezcla se resolvió en dos picos. La actividad inmunológica
principal estaba en el pico de masa molecular elevada
(IBP-3). Sin embargo, el pico de masa molecular
inferior (IBP-4) también contenía una parte
significativa de actividad inmunológica. El cromatograma se muestra
en la figura 3.
Doscientos mg de IBP-2 se
disolvieron en 10 mL de agua destilada, se filtraron previamente
con un filtro de 0,45 \mum, se cargaron en una columna Sephacryl
S 300 HR (2,5 \times 90 cm) y se eluyeron con tampón acetato 0,1
M, pH 4,5 y gradiente lineal de NaCl. La cromatografía se
monitorizó a 280 nm y a 490 nm tras la interacción de las
fracciones eluidas con un reactivo de fenol/ácido sulfúrico. La
mezcla se resolvió en dos picos. La actividad inmunológica
principal estaba en el pico de masa molecular elevada
(IBP-5). El pico de masa molecular inferior
(IBP-6) consistió en dos picos solapados (un hombro
aparente en el pico, cuyas fracciones se probaron como
IBP-6, figura 5). El perfil de SEC se muestra en la
figura 4.
Doscientos mg de IBP-2 se
disolvieron en 10 mL de agua destilada, se filtraron previamente
con un filtro de 0,45 \mum, se cargaron en una columna Sephadex G
100 (2,5 \times 90 cm) y se eluyeron con tampón acetato 0,1 M, pH
4,5 y gradiente lineal de NaCl. La cromatografía se monitorizó a
280 nm y a 490 nm tras la interacción de las fracciones eluidas con
un reactivo de fenol/ácido sulfúrico. La mezcla se resolvió en dos
picos. La actividad inmunológica principal estaba en el pico de
masa molecular elevada (IBP-7). El pico de masa
molecular inferior (IBP-8) conservó mucha menos
actividad. IBP-9 representa las fracciones tras
IBP-8 (figura 6).
La diálisis o la ultrafiltración demostraron que
sólo una pequeña parte de la actividad inmunológica estaba asociada
con los compuestos de masa molecular baja (inferior a 100 kDa). El
material activo es térmicamente estable y pudo precipitarse a partir
de la disolución con etanol o sulfato de amonio. La estabilidad
térmica del extracto lo hace adecuado para el secado por
pulverización; en efecto, la actividad inmunomoduladora se mantuvo
tras el proceso de secado por pulverización. Un contenido habitual
en proteínas de una fracción es de aproximadamente el 30%. El
contenido en ADN varía desde el 0% hasta el 20%, con del 0% al 2% en
las masas moleculares superiores a 100 kDa.
En una realización, el extracto liofilizado (o
fracciones purificadas adicionalmente) se disolvió en agua (1 mg/mL,
400 \muL) y se hidrolizó con ácido trifluoroacético 1 M (TFA, 1
mL) a 100ºC, durante la noche con agitación, en viales de 4 mL con
tapón de rosca herméticamente cerrados. La muestra se evaporó
entonces repetidamente hasta la sequedad usando metanol. El
hidrolizado seco se redujo usando NaBH_{4} 0,5 M en NH_{4}OH 1 M
(0,6 mL) con agitación durante la noche a temperatura ambiente. El
borohidruro se extinguió entonces con metanol ácido (ácido acético
al 20% en metanol, 1 mL) y la mezcla se evaporó hasta la
sequedad.
Se añadieron 3 mL de anhídrido acético a la
muestra; la mezcla se calentó en un baño de agua a 80ºC durante 2 h
para producir acetilalditoles y luego se evaporó hasta la
sequedad.
Las muestras de acetilalditol se extrajeron
distribuyendo la mezcla de reacción entre acetato de etilo y agua;
la fase orgánica se usó directamente para análisis de cromatografía
de gases/espectroscopia de masas (CG-EM).
Todos los extractos patrones y de muestra se
disolvieron en acetato de etilo y se concentraron hasta
aproximadamente 100 \muL. Las muestras se inyectaron usando el
modo de fraccionamiento (split) de un cromatógrafo de gases
Thermoquest Trace 2000 a un fraccionamiento 10:1 y se
cromatografiaron en una columna capilar SGE BPX70 (30 m \times
0,25 mm \times 0,25 \mum de espesor de la película). Se usó gas
portador de helio a una velocidad de flujo constante de 1,0
mL/min.
La estufa del cromatógrafo de gases se programó a
una temperatura inicial de 190ºC (mantenida durante 1 minuto)
seguido por un aumento de 3ºC/minuto hasta 260ºC (mantenida durante
10 minutos a 260ºC). La columna capilar se conectó directamente al
espectrómetro de masas (Thermoquest CGQ de trampa iónica), cori la
temperatura de la línea de transferencia a 260ºC. Usando este
programa de estufa, se encontró que todos los compuestos se interés
eluían en un plazo de 20 minutos.
La fuente de iones del espectrómetro de masas se
mantuvo a 150ºC. Los espectros se registraron desde 50 hasta 500 m/z
usando tanto el modo de impacto electrónico (70 eV) como el modo de
ionización química (CI) con reactivo de gas amoniaco.
Los tiempos de retención para los monosacáridos
se estabilizaron derivatizando los patrones puros de los azúcares
individuales y/o cromatografiando las mezclas comercialmente
disponibles de acetatos de alditol (Supelco, Inc.). Los azúcares
presentes en los extractos de muestra se identificaron por
comparación de los tiempos de retención y los espectros de masas
frente a estos patrones. Todas las muestras con actividad
inmunomoduladora contenían glucosa, galactosa, ramnosa, manosa y
arabinosa. Los extractos de peso molecular superior a 1 x 10^{6}
Da están sustancialmente libres de ribosa.
Se emplearon los protocolos de hidrólisis
habituales para liberar monosacáridos ácidos, neutros o básicos de
las cadenas de polisacáridos. Los monosacáridos liberados se
marcaron primero con el reactivo de marcado fluorescente
2-aminoacridona (AMAC), seguido por la reducción de
la base de Schiff formada con cianoborohidruro de sodio. Después se
realizó la electroforesis en gel de poliacrilamida de la mezcla
sobre geles en gradiente según el manual de instrucciones. Los
hidrolizados producidos a partir de IBP-2 contenían
glucosa, galactosa, ramnosa, manosa y arabinosa. También se encontró
una cantidad sustancial de ribosa. Sin embargo, los hidrolizados
producidos por tratamiento de IBP-5 e
IBP-7 con TFA 2 M a 100ºC durante 5 h, sólo
contenían claramente glucosa y galactosa, así como ramnosa, manosa y
arabinosa. No se encontró ribosa en estos hidrolizados. Esto estaba
de acuerdo con los hallazgos anteriores de que fragmentos de ARN de
masa molecular baja estaban presentes en IBP-2. Sin
embargo, debido a su pequeño tamaño, no podían estar presentes en
los picos de masa molecular elevada de IBP-5 e
IBP-7 obtenidos a partir de las cromatografías en
Sephadex G 100 o Sephacryl S 300, respectivamente. Se detectó otra
banda situada entre la N-acetil galactosamina
(GalNAc) y la manosa en PAGE, pero no pudo asignarse a ninguno de
los monosacáridos convencionales. Las mezclas de reacción obtenidas
por hidrólisis realizada en las condiciones usadas para la
liberación del ácido siálico (TFA 0,1, 80ºC, 1 h)dieron como
resultado un producto con un Rf idéntico al del ácido siálico y otra
banda principal con un tiempo de retención significativamente
inferior al correspondiente a la GalNAc. La hidrólisis en HC1 4 M
durante 3 h a 100ºC (una condición para la liberación del
aminoazúcar) dio como resultado en PAGE bandas correspondientes a
GalNAc y N-acetil glucosamina (G1cNAc). Sin embargo,
a juzgar por la intensidad de otras bandas, fueron componentes no
significativos de IBP-5 o
IBP-7.
El protocolo seguido fue el de Sato et al.
(Sato K., Okubo A., Yamazaki T., (1997)Determination of
monosaccharide derivatized with 2-aminobenzoic acid
by capillary electrophoresis. Anal Biochem 251:
119-121). IBP-2 o sus fracciones se
hidrolizaron primero en TFA 0,1 M (1 mg/mL), a 100ºC durante 18 h,
el ácido acuoso se eliminó a presión reducida, el TFA residual se
eliminó por una evaporación secuencial con metanol hasta la
sequedad.
El extracto bruto de IBP-2
contiene principalmente glucosa y galactosa; la glucosa es el
monosacárido más frecuente en el extracto. También están presentes
ramnosa, manosa y arabinosa, si bien es cierto que en cantidades
significativamente inferiores (figura 14). Cuando el extracto se
sometió a ultrafiltración usando una membrana con MWCO de 1 MDa
(figura 15), la razón entre glucosa y galactosa cambió y el pico de
ribosa desapareció, lo que indica (de acuerdo con los datos de PAGE)
la eliminación de ARN de sus fragmentos.
Los aminoácidos libres contenidos en los
extractos se determinaron tal como sigue: las muestras se
disolvieron en agua destilada desioriizada para obtener una
concentración final de 10 mg/mL. A 25 \muL (250 \mug) de cada
muestra, se añadieron 75 \muL del tampón de muestra Beckman
(Na-S). Las muestras se centrifugaron a 16.000
\times g hasta eliminar la materia particulada antes del análisis
en el analizador de aminoácidos Beckman Modelo 6300. La
centrifugación aclaró la disolución y el secimento se retuvo; el
sobrenadante se analizó para determinar los aminoácidos libres.
Para determinar la composición de aminoácidos de
los hidrolizados totales, se colocaron partes de cada muestra (250
\mug) en un tubo de ensayo de vidrio limpio junto con el patrón
interno norleucina y 1 mL de HC1 6 N. Los tubos se sellaron a vacío
y los péptidos y polipéptidos se hidrolizaron a 105ºC durante 20
horas. Los tubos se abrieron y las muestras se secaron en
concentradores centrífugos Speed-vac de Savan
Environmental a temperatura ambiente. Los residuos se volvieron a
disolver en tampón Na-S y se manipularon tal como se
describió anteriormente para la determinación de aminoácidos
libres.
El extracto de Chlorella se disolvió en
agua destilada (500 \muL). Se añadió un volumen igual de una
disolución de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1, v/v). La
mezcla se agitó vigorosamente, después se centrífugo a 13.000 rpm
durante 5 minutos. La capa acuosa superior se pipeteó y se volvió a
extraer con 500 \muL adicionales de la mezcla orgánica. La capa
acuosa se volvió a extraer hasta que la capa de proteínas (una
interfase visible entre las capas acuosa y orgánica) fue
insignificante. Tras la extracción de proteínas final, la capa
acuosa se transfirió a un tubo nuevo y a él se añadió glucógeno (10
\muL), acetato de sodio 3 M (50 \muL) y etanol frío (1 mL). La
mezcla se agitó y se colocó en el congelador a -80ºC durante una
hora. Entonces se centrífugo a 13.000 rpm durante 15 minutos y el
sobrenadante se vertió. El sedimento se secó en un concentrador
centrífugo y se volvió a disolver en agua. Su absorbancia se midió a
260 nm frente a un blanco de agua. Puesto que las proteínas también
absorben a 260 nm, las lecturas de la absorbancia de proteínas a 280
nm también se tomaron como una medida del contenido de proteínas en
la muestra de ADN.
La degradación enzimática se usó como una técnica
para eliminar selectivamente varias clases moleculares de los
extractos de Chlorella. IBP-2 o sus
fracciones (tanto IBP-2 como sus fracciones se
designan ONC-107 en este ejemplo) se trataron con
pronasa, ADNasa, ARNasa, amilasa, amiloglucosidasa, celulasa y
neuraminidasa en experimentos separados. Se utilizó electroforesis
en SDS PAGE y en gel de agarosa, así como cromatografía en capa
fina, para monitorizar las reacciones enzimáticas (véanse las
secciones (a) a (g) más adelante). Las mezclas de reacción finales
se dializaron, se liofilizaron y se probaron para determinar la
capacidad para estimular a las células del bazo no diferenciadas
mediante la incorporación de timidina en esplenocitos murinos
(ejemplos 9 y 11). Los resultados se resumen a continuación:
- \bullet
- Ausencia de efecto sobre la capacidad para estimular células de bazo no diferenciadas dentro de una significación estadística tras el tratamiento con las enzimas seleccionadas.
- \bullet
- Ausencia de presencia de ARN de masa molecular grande en IBP-2. Esto está de acuerdo con otros hallazgos (anteriormente), específicamente con que no se encontrara ribosa en las especies de masa molecular elevada (IBP-5, IBP-7) y en las fracciones sometidas a ultrafiltración con MWCO > 1 MDa. Esto demuestra claramente que el ARN no es la fuente principal de actividad inmunoestimulante.
- \bullet
- Se encontró una cantidad muy pequeña de ADN, lo que está de acuerdo con los datos obtenidos a partir del aislamiento de ADN usando una columna de carburo de silicio (contenido de aproximadamente el 2%, 500 pb) (véase Haj-Ahmad Y (1999) Nucleic acid purification and process. Canadian published application 2, 270, 106).
Todas las digestiones enzimáticas se realizaron
en paralelo con controles positivos para garantizar que las enzimas
fueran activas. Los experimentos indican claramente que no es
probable que las proteínas y los ácidos nucleicos no asociados,
accesibles por las enzimas, fueran el origen de la actividad. El
origen de la actividad inmunológica es un polisacárido (quizá
acomplejado con otro biopolímero que no tiene efecto significativo
por sí mismo y que podría tener un papel indirecto, por ejemplo, en
la estabilidad). La actividad inmunológica del polisacárido no
resulta afectada por escisiones en las regiones de tres o más
unidades de D-glucosa unidas en
\alpha-1,4, galactósidos y glucósidos unidos en
\alpha-1,4 o D glucosa unida en
\alpha-1,4, suponiendo que tales enlaces son
accesibles para la escisión enzimática.
Se añadió proteasa (100 \mug/mL,
Streptomyces griseus) a ONC-107 (20 mg/mL) en
tampón TRIS (0,05 M, pH 7,4) y se incubó durante 1 hora a 36ºC. La
incubación se detuvo mediante la desactivación térmica de la enzima
a 80ºC durante 1 hora, seguido por centrifugación durante 10 minutos
a 13.000 rpm. Se tomaron alícuotas de la disolución a intervalos de
tiempo de 0, 5, 10, 15, 30 y 60 minutos y se prepararon para el
análisis por electroforesis en SDS-PAGE (gel al 12%,
tinción de proteínas total). La concentración óptima de proteasa se
determinó por un curso de tiempo electroforético similar que incluyó
BSA (albúmina sérica bovina) (1 mg/mL). La mezcla del digesto final
se analizó mediante electroforesis en agarosa (al 1% teñida con
bromuro de etidio).
Se añadió ADNasa (100 \mug/mL) a
ONC-107 (20 mg/mL) en tampón TRIS (0,05 M, pH 7,4,
MgCl_{2} 10 mM) y se incubó durante 1 hora a 36ºC. La incubación
se detuvo mediante la desactivación térmica de la enzima a 80ºC
durante 1 hora, seguido por centrifugación durante 10 minutos a
13.000 rpm. La mezcla del digesto final se analizó mediante
electroforesis en SDS-PAGE (gel al 12%, tinción de
proteínas total) para comprobar la degradación de proteínas. Se
utilizó la electroforesis en agarosa (al 1% teñida con bromuro de
etidio) para confirmar la degradación de ácidos nucleicos.
Se añadió ARNasa (100 \mug/mL) a
ONC-107 (20 mg/mL) en tampón TRIS (0,05 M, pH 7,4,
NaCl 10 mM) y se incubó durante 1 hora a 36ºC. La incubación se
detuvo mediante la desactivación térmica de la enzima a 80ºC durante
1 hora, seguido por centrifugación durante 10 minutos a 13.000 rpm.
La mezcla del digesto final se analizó mediante electroforesis en
SDS-PAGE (gel al 12%, tinción de proteínas total)
para comprobar la degradación de proteínas. Se utilizó la
electroforesis en agarosa (al 1% teñida con bromuro de etidio) para
confirmar la degradación de ácidos nucleicos.
Se añadió amilasa (100 \mug/mL) a
ONC-107 (20 mg/mL) en tampón TRIS (0,05 M, pH 7,4) y
se incubó durante 1 hora a 36ºC. La incubación se detuvo mediante la
desactivación térmica de la enzima a 80ºC durante 1 hora, seguido
por centrifugación durante 10 minutos a 13.000 rpm. La mezcla del
digesto final se analizó mediante electroforesis en
SDS-PAGE (gel al 12%, tinción de proteínas total)
para comprobar la degradación de proteínas. Se utilizó la
electroforesis en agarosa (al 1% teñida con bromuro de etidio) para
confirmar la degradación de ácidos nucleicos.
Adicionalmente, la cromatografía en capa fina
(CCF) confirmó la actividad de la enzima tal como sigue. Se añadió
amilasa (100 ug/mL) a una disolución de almidón (1 mg/mL) y se
incubó durante una hora a 36ºC. La disolución se analizó mediante
CCF usando placas de sílice Kiesegel eluidas con isopropanol:
acetato de etilo: agua (7:1:2). Las placas se desarrollaron tras 1C
minutos secando en posición horizontal usando una disolución de
ácido sulfúrico/etanol. Se usó glucosa (1 mg/mL) como control, al
igual que el almidón no tratado. El tratamiento del almidón con
amilasa dio como resultado la liberación de glucosa.
Se añadió amiloglucosidasa (100 \mug/mL) a
ONC-107 (20 mg/mL) en tampón TRIS (0,05 M, pH 4,4) y
se incubó durante 1 hora a 36ºC. La incubación se detuvo mediante la
desactivación térmica de la enzima a 80ºC durante 1 hora, seguido
por centrifugación durante 10 minutos a 13.000 rpm. La CCF confirmó
la actividad de la enzima tal como sigue. Se añadió amiloglucosidasa
(100 ug/mL) a una disolución de almidón (1 mg/mL) y se incubó
durante una hora a 36ºC. La disolución se analizó mediante CCF
usando placas de sílice Kiesegel eluidas con isopropanol : acetato
de etilo: agua (7:1:2). Las placas se desarrollaron tras 10 minutos
secando en posición horizontal usando una disolución de ácido
sulfúrico/etanol. Se usó glucosa (1 mg/mL) como control, al igual
que el almidón no tratado. El tratamiento del almidón con
amiloglucosidasa dio como resultado la liberación de glucosa.
Se añadió celulasa (100 \mug/mL) a
ONC-107 (20 mg/mL) en tampón TRIS (0,05 M, pH 7,4) y
se incubó durante 1 hora a 36ºC. La incubación se detuvo mediante la
desactivación térmica de la enzima a 80ºC durante 1 hora, seguido
por centrifugación durante 10 minutos a 13.000 rpm. La CCF confirmó
la actividad de la enzima tal como sigue. Se añadió celulasa (100
ug/mL) a una disolución de celulosa (1 mg/mL) y se incubó durante
una hora a 36ºC. La disolución se analizó mediante CCF usando placas
de sílice Kiesegel eluidas con isopropanol: acetato de etilo: agua
(7:1:2). Las placas se desarrollaron tras 10 minutos secando en
posición horizontal usando una disolución de ácido sulfúrico/etanol.
Se usó glucosa (1 mg/mL) como control, al igual que la celulosa no
tratada. El tratamiento de la celulosa con celulasa dio como
resultado la liberación de glucosa.
Se añadió neuraminidasa (100 \mug/mL) a
ONC-107 (20 mg/mL) en tampón TRIS (0,05 M, pH 5,0) y
se incubó durante 1 hora a 36ºC. La incubación se detuvo mediante la
desactivación térmica de la enzima a 80ºC durante 1 hora, seguido
por centrifugación durante 10 minutos a 13.000 rpm. La CCF confirmó
la actividad de la enzima tal como sigue. Se añadió neuraminidasa
(100 ug/mL) a una disolución de
N-acetil-neuramidasa (1 mg/mL) y se
incubó durante una hora a 36ºC. La disolución se analizó mediante
CCF usando placas de sílice Kiesegel eluidas con isopropanol:
acetato de etilo: agua (7:1:2). Las placas se desarrollaron tras 10
minutos secando en posición horizontal usando una disolución de
ácido sulfúrico/etanol.
Se cultivaron en placa células de esplenocito
nuevas (cultivo primario de esplenocitos) a 3 \times 10^{5}
células/pocillo en medio cRPMI en un volumen de 100 \muL en
placas de cultivo tisular con fondo plano de 96 pocillos. Las
muestras de prueba en 100 \muL de medio celular se añadieron por
triplicado a los pocillos, dando un volumen total final en cada
pocillo de 200 \muL. Las placas se cubrieron con tapas estériles
y se incubaron en CO_{2} al 5% a 37ºC y el 100% de humedad en un
incubador de CO_{2} durante 48 h. Las células se pulsaron
entonces con ^{3}H-timidina (1 \muCi por
pocillo en 10 \mul de cRPMI) y se incubaron durante 18 h. Las
células se recogieron con un aparato automático para recoger
células equipado con bandas de filtro. Las bandas de filtro se
dejaron secar durante 3 h a 37ºC. La radiactividad incorporada por
las células se determinó contando las bandas de filtro sumergidas
en medio de centelleo en un contador de centelleo líquido. Un
ejemplo del experimento se ilustra en la figura 7. Una comparación
del extracto del solicitante con dos muestras comerciales se
ilustra en la figura 13.
Se aislaron esplenocitos de ratón mediante
métodos habituales y se colocaron en matraces de cultivo tisular a
37ºC durante 2 h, para permitir que los macrófagos se establecieran
y se adhirieran al matraz. Los linfocitos (que están suspendidos y
no se adhieren) se extraen entonces y se colocan en un tubo de
centrífuga de 50 mL, se centrifugan y se resuspenden en una pequeña
cantidad de tampón PBS-EDTA-BSA frío
(pH 7,4; 1-3 mL) y se colocan en hielo. Las células
se contaron y se volvieron a centrifugar. Después se resuspendieron
en 1 \times 10^{8} en 0,3 mL de tampón
PBS-EDTA-BSA en un tubo de
centrífuga.
Aislamiento negativo de células B: Se
añadieron 100 \mul de microperlas Miltenyi recubiertas con
anticuerpo anti-Thy-1.2 a las
células resuspendidas y la mezcla se incubó durante 20 minutos. Se
añadió PBS-EDTA-BSA (5 mL) y la
suspensión se pipeteó en una columna midiMACS en un imán midiMACS.
La columna tenía una aguja de calibre 25 en el flujo de salida para
limitar la velocidad de flujo. Las células T, unidas a las perlas
magnéticas recubiertas por el anticuerpo
anti-Thy-1.2, se adhirieron a la
columna. Las células B pasaron a través y se recogieron. La columna,
sin extraerse del imán, se enjuagó con 5 mL del tampón para eliminar
cualquier célula B residual. Las células B se combinaron, se
centrifugaron, se resuspendieron en 1 mL de cRPMI y se contaron.
Entonces se resuspendieron hasta 5 \times 10^{6} células por mL
de cRPMI y se sembraron en placa a 100 \muL/pocillo para los
ensayos de estimulación.
Aislamiento negativo de células T: Se
siguió el mismo procedimiento que para el aislamiento de células B,
excepto que las perlas magnéticas usadas para la incubación se
recubrieron con el anticuerpo anti-B220, en lugar
de con anti-Thy-1.2.
Las poblaciones de células T y B purificadas se
probaron tal como se describe en el ejemplo 8. Los resultados se
muestran en la figura 8.
Se sacrificaron ratones mediante dislocación
cervical y se colocaron tumbados sobre la espalda con las
extremidades extendidas. Se esterilizaron los abdómenes con alcohol
al 70% y se realizó una cuidadosa incisión central que expuso la
pared peritoneal INTACTA. Se usó una jeringuilla de 10 mL para
inyectar 10 mL de cRPMI-1640 frío en la cavidad
peritoneal del ratón. El ratón se sacudió suavemente de un lado a
otro con la aguja todavía insertada. El cRPMI-1640
que contenía los macrófagos peritoneales se extrajo lentamente de
la cavidad peritoneal a través de la aguja. Aproximadamente se
recuperaron 8 mL de líquido por ratón. El líquido peritoneal se
reunió y se colocó dentro de tubos de centrífuga de 50 mL en hielo.
Las células se centrifugaron, se lavaron y se resuspendieron en 1
mL de cRPMI-1640. Tras el recuento, se
resuspendieron hasta 1-2 \times 10^{6}
células/mL y se sembraron en placas de cultivo tisular de 96
pocillos a 1 \times 10^{5} células/pocillo en un volumen de 100
\muL. Las muestras de prueba se añadieron en cRPMI (100 \muL)
con y sin IFN-\mu (interferón \mu). Los
controles positivos fueron las células + IFN-\mu y
LPS (lipopolisacárido) + IFN-\mu. Las células se
incubaron durante 48 h en un incubador de CO_{2} en CO_{2} al
5%.
Se recogieron 50 \muL de líquido de cultivo y
se transfirieron a pocillos en una placa de ELISA de fondo plano
de 96 pocillos. Se realizaron diluciones seriadas dobles de
NaNO_{2} (desde 125 \muM hasta 1 \muM de concentración final)
en cRPMI, y se añadieron 50 \muL de disolución de reactivo de
Greiss y de disoluciones de NaNO_{2} a un conjunto de pocillos
para obtener una curva patrón. Se midió la absorbancia a 550 nm y
se realizó una representación gráfica de los valores de la
absorbancia frente a las concentraciones de NaNO_{2}. La curva
patrón se utilizó para determinar la cantidad de NO_{2} producida
por las muestras de macrófago peritoneal. Un ejemplo del
experimento se ilustra en la figura 9.
La producción de citocina se midió en
esplenocitos de ratón, en macrófagos de ratón y en linfocitos T y B
de ratón separados. Las muestras de prueba se añadieron a varias
concentraciones a las células en placas de cultivo tisular de
microtítulo. Tras la incubación durante 24-48 h,
dependiendo de la citocina de interés, se extrajo el líquido de
cultivo del sobrenadante para una prueba de ELISA.
Las placas de ELISA se recubrieron con
anticuerpos monoclonales anti-citocina mediante la
incubación a 4ºC durante la noche en tampón carbonato, pH 9,6. Las
placas se lavaron entonces con solución salina con tampón Tris
(TBS), se recubrieron posteriormente con BSA 2 mg/mL en TBS, (200
\muL/pocillo) durante 2 h a temperatura ambiente y se lavaron con
TBS/Tween. Las muestras y los patrones (estos últimos diluidos
desde 1 ng/mL hasta 15 pg/mL en diluciones dobles) se diluyeron en
TBS/Tween que contenía BSA 1 mg/mL (100 \muL/pocillo), se
añadieron a la placa, se incubaron durante la noche a 4ºC y después
se lavaron con TBS-Tween.
Se añadió el mAc anti-citocina
biotinilado apropiado (0,5 \mug/mL) en PBS-Tween
que contenía BSA 1 mg/mL (100\muL/pocillo). La placa se incubó a
temperatura ambiente durante 1 h y después se lavó con
TBS-Tween. Se añadió
extravidina-peroxidasa en PBS-Tween
que contenía BSA 1 mg/mL (100 \muL/pocillo) y se incubó a
temperatura ambiente durante 30 minutos. Las placas se lavaron
entonces. Se añadieron 100 \muL/pocillo de disolución de sustrato
TMB (tetrametilbenzidina), y tras de 10 a 30 minutos, dependiendo
del desarrollo de color, se detuvo la reacción con 100
\muL/pocillo de H_{3}PO_{4} 1 M. La placa se leyó a 450 nm. Un
ejemplo de estimulación de producción de IL-6 se
ilustra en la figura 10.
Se administraron dos dosis de
IBP-2 (0,1 mg o 4 mg) o agua natural (control
negativo) a ratones Balb/c mediante tubo intragástrico tres veces a
la semana durante cuatro semanas. Los ratones se infectaron entonces
mediante inyección intravenosa de 5.000 microorganismos viales
Listeria monocytogenes. Los ratones se sacrificaron tres días
después de las inyecciones de Listeria. Se obtuvieron
suspensiones celulares de sus bazos y se cultivaron en placas de
cultivo para determinar el número de bacterias en los bazos. Los
animales alimentados con agua tenían 92.202 (\pm23.000) unidades
formadoras de colonias (UFC) en sus bazos; (el número entre
paréntesis se refiere a la desviación estándar). Los animales
alimentados con 0,1 mg de IBP-2 por dosis tenían
43.310 (\pm7.021) UFC y los animales alimentados con 4 mg de
IBP-2 por dosis tenían sólo 5.317 (\pm492) UFC (p
< 0,05) (figura 11).
Se administró IEP-2 (4 mg), algas
brutas (4 mg o 20 mg), o agua natural a ratones Balb/c mediante
tubo intragástrico 3 veces por semana durante dos semanas. Los
ratones se infectaron entonces mediante inyección intravenosa de
500.000 microorganismos viables de Candida albicans. La
alimentación continuó hasta que los ratones se sacrificaron 12 días
tras la infección. Se extrajeron los riñones y se obtuvieron
suspensiones celulares y se cultivaron en agar Sabouraud para
determinar el número de colonias de C. albicans que se
desarrollaron durante la noche. Se obtuvieron los resultados
siguientes: ratones alimentados con agua, 594 (\pm556) colonias
(media \pm desviación estándar); ratones alimentados con
IBP-2 (4 mg), 42 (\pm75) (p < 0,05, en
comparación con los ratones alimentados con agua), ratones
alimentados con algas (4 mg), 335 (\pm 663), ratones alimentados
con algas (20 mg), 79 (\pm70); (estadísticamente, el valor de p
para este grupo en comparación con el grupo alimentado con agua fue
> 0,05, aunque estuvo muy cerca de ser significativo). Los
resultados se ilustran en la figura 12.
Este estudio se diseñó para evaluar la eficacia
inmunoestimuladora de los extractos de Chlorella como un
complemento nutricional en adultos sanos de más de 50 años de edad.
Se completó un estudio primero en hombres, que demostró la
seguridad y la tolerancia de un extracto de Chlorella que
corresponde a IBP-1 cuando se administra como un
complemento diario durante tres semanas. El objetivo de este estudio
de fase 2 fue aumentar la experiencia en humanos con extractos de
Chlorella mediante la evaluación del aumento de la seguridad
y la tolerancia y para investigar la capacidad de los extractos de
Chlorella como un complemento nutricional inmunoestimulante
en humanos.
El estudio se diseñó como un ensayo clínico
aleatorizado, controlado por placebo, en el que adultos de 50 años
de edad o mayores se asignaron al azar para recibir una cápsula de
200 mg de un extracto de Chlorella correspondiente a
IBP-1, (denominado ONC-107 para el
objeto de este estudio), una cápsula de 400 mg de
ONC-107, o una cápsula de placebo (que no contenía
ONC-107). Mientras el ensayo estaba en curso, los
investigadores, enfermeros y otro personal del estudio y los
participantes desconocían a qué grupo estaban asignados. La
seguridad y los efectos secundarios se midieron mediante el
registro meticuloso por parte de los participantes de cualquier
acontecimiento adverso y su notificación al personal del estudio.
Los acontecimientos adversos específicos medidos incluyeron fiebre,
dolor abdominal, náuseas, vómitos, diarrea, fatiga, disminución del
apetito, cefalea, dolores corporales, articulaciones doloridas y
exantema. La seguridad también se midió mediante una serie de
análisis de sangre antes de comenzar a tomar las cápsulas del
estudio y a la finalización de las cápsulas del estudio. Estas
pruebas incluyeron pruebas de la función hepática (AST (aspartato
aminotransferasa), ALT (alanina aminotransferasa)), perfiles
sanguíneos (hemograma completo) y función inmunológica (ANA
(anticuerpos antinucleares), anti-ADN, factor
reumatoide, Coombs, C3, C4, IgG, IgA, IgM e IgE cuantitativas). La
medicación se administró durante 28 días; tras 21 días, los
participantes se inmunizaron con una vacuna contra la gripe con
virión fragmentado, inactivada y comercialmente disponible. Se
evaluó la respuesta de anticuerpos a la inmunización mediante la
medición de anticuerpos para las tres cepas de virus contra la gripe
antes, y 7 y 21 días después de la inmunización. La inmunidad
mediada por células se midió evaluando la respuesta a la prueba
cutánea con el virus contra la gripe al comienzo del estudio y una
semana después de la inmunización.
Se incluyó en el estudio un total de 124 sujetos
y se les administró la medicación; 7 participantes se retiraron del
estudio. Sólo un participante se retiró debido a acontecimientos
adversos (náuseas y dolor abdominal). Los tres grupos de
tratamiento fueron similares en cuanto a la edad, sexo e historia y
examen físico inicial al comienzo del estudio. La mayoría de los
participantes fueron mujeres (73,2-80,5% de cada
grupo). El cumplimiento de los participantes fue excelente. La
respuesta de anticuerpos a la vacuna contra la gripe no fue
significativamente mayor en los participantes tratados con
ONC-107 en general, aunque en los participantes de
55 años de edad o menos hubo un aumento significativo de la
respuesta para algunas medidas de anticuerpos (y una tendencia
constante para las otras). No hubo acontecimientos adversos graves
en ninguno de los participantes del estudio. Un acontecimiento
adverso se notificó por la mayoría de los participantes en varias
ocasiones durante el estudio, pero en su mayor parte, estos
acontecimientos no se notificaron con más frecuencia en los que
recibieron ONC-107 en comparación con los que
recibieron placebo (la fatiga se notificó con más frecuencia por
los que recibieron 200 mg de ONC-107 y el dolor
abdominal con más frecuencia por los que recibieron placebo y
tenían más de 55 años de edad). No hubo cambios significativos en
las medidas de laboratorio antes y después del tratamiento, o entre
los que recibieron ONC-107 y placebo.
Los resultados de este estudio de fase 2 del
complemento nutricional ONC-107 a dosis de 200 mg y
400 mg durante 28 días en adultos sanos se explican a continuación.
Estos resultados indican que, a pesar de un efecto de la edad, este
producto es bien tolerado y seguro para la administración oral y
tiene un efecto inmunoestimulador que se puede medir.
El efecto inmunoestimulador se midió por la
respuesta de anticuerpos a la vacuna contra la gripe en adultos
sanos mayores de 50 años de edad, aunque estas respuestas
estuvieron limitadas, en general, a la cohorte más joven en la
población del estudio (50-55 años de edad). El
aumento de respuesta de anticuerpos en este subgrupo fue
estadísticamente significativo para algunas de las comparaciones,
pero la tendencia fue evidente en todas las comparaciones
serológicas realizadas. La hipótesis antes del estudio de que el
efecto de ONC-107 se observaría mejor en los
sujetos de mayor edad debido a su disminución del grado de
respuesta a la vacuna contra la gripe no resultó apoyada por los
datos; por el contrario, fueron los sujetos más jóvenes y con mayor
respuesta los que demostraron un efecto de
ONC-107.
Los sujetos más jóvenes tendieron a mostrar
efectos inmunoestimuladores de ONC-107
(especialmente a la dosis de 400 mg). Un posible motivo para la
falta de efecto en el grupo de mayor edad fue que el grupo de mayor
edad podía haber tenido títulos más elevados de anticuerpo antes de
la inmunización, lo que puede indicar un mayor grado de exposición
anterior a las cepas A del virus contra la gripe, antigénicamente
similares (pero no a las cepas B).
1. Para la cepa A/Caledonia de la vacuna contra
la gripe, el grupo de menor edad (<= 55 años) tuvo mayores
títulos medios de anticuerpo con ambas dosis que con placebo a los
7 (no significativo a los 7 d) y a los 21 días (p = 0,05): placebo
= 43,2; 200 mg = 84,3; 400 mg = 84,4.
2. Para la cepa B/Yamanashi de la vacuna de la
gripe, el grupo de 400 mg tuvo mayores títulos (30,1) a los 7 días
frente al placebo (14,4, p = 0,03), pero esto no fue significativo
a los 21 días. La dosis de 200 mg no fue significativamente mayor
que el placebo a los 7 días (15,9) ni a los 21 días (25,3).
3. Para la cepa A/Panamá de la vacuna contra la
gripe, hubo una tendencia similar a favor de la dosis de 400 mg,
pero no fue significativa. A los 7 días, el grupo de 400 mg tuvo
títulos de 64,5, en comparación con el placebo (39,9), lo que no
es significativo. El grupo de 200 mg tuvo títulos de 26,6. A los 21
días, también hubo una tendencia a favor de los 400 mg frente al
placebo; de nuevo, 200 mg no fueron mejores que el placebo
(57,4).
Se observaron tendencias similares para la
proporción de sujetos que tenían respuestas de anticuerpos de 2 y 4
veces más.
Para la cepa B/Yamanashi en el grupo < 55
años, sólo el 5% de los que tornaron placebo tuvo una respuesta de
anticuerpos de 2 veces superior a los 7 días. Esto está en
contraposición con el grupo de 400 mg (41,2%, p = 0,01) y el grupo
200 mg (6,3%, p = 0,04).
También hubo una tendencia no significativa a un
aumento de la respuesta a los 21 días y una tendencia no
significativa en la proporción del grupo de edad < 55 años que
logró niveles seroprotectores de 40 DR (diluciones recíprocas) a
los 7 días tras la inmunización.
Pueden hacerse numerosas modificaciones,
variaciones y adaptaciones a las realizaciones particulares de la
invención descrita anteriormente sin apartarse del alcance de la
invención que se define en las reivindicaciones.
Claims (25)
1. Extracto que comprende polisacáridos y
complejos de polisacárido de Chlorella de alto peso
molecular, en el que los polisacáridos y complejos de polisacárido
de alto peso molecular son de 1 \times 10^{5} Da a 1 \times
10^{7} Da y constituyen al menos el 22% (p/p) del contenido
derivado de Chlorella total del extracto.
2. Extracto que consiste en polisacáridos y
complejos de polisacárido de Chlorella de alto peso
molecular, en el que los polisacáridos y complejos de polisacárido
de Chlorella de alto peso molecular son de 1 \times
10^{5} Da a 1 \times 10^{7} Da.
3. Extracto según la reivindicación 1 o la
reivindicación 2, en el que los polisacáridos y complejos de
polisacárido de alto peso molecular contienen glucosa y al menos un
monosacárido seleccionado del grupo que consiste en: galactosa,
ramnosa, manosa y arabinosa.
4. Extracto según la reivindicación 3, en el que
los polisacáridos y complejos de polisacárido de alto peso molecular
también contienen N-acetilglucosamina y
N-acetilgalactosamina.
5. Extracto según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que los polisacáridos y complejos de
polisacárido de alto peso molecular están sustancialmente libres de
un compuesto seleccionado del grupo que consiste en ribosa, ácidos
nucleicos, ácidos ribonucleicos y proteínas no asociadas, o
cualquier combinación de los mismos.
6. Extracto según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, que retiene su actividad inmunomoduladora
tras el tratamiento en condiciones y durante una extensión de tiempo
suficiente para llevar a cabo la digestión del ADN no asociado, el
ARN no asociado y/o la proteína no asociada.
7. Extracto según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, que retiene su actividad inmunomoduladora
tras el tratamiento en condiciones y durante una extensión de tiempo
suficiente para llevar a cabo la escisión de los enlaces
glucosídicos con al menos una glucosidasa seleccionada del grupo que
consiste en: amilasa, amiloglucosidasa, celulasa y
neuraminidasa.
8. Extracto según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, que retiene su actividad inmunomoduladora
tras el tratamiento en condiciones y durante una extensión de tiempo
suficiente para llevar a cabo la escisión de:
- (i)
- tres o más unidades de D-glucosa con enlaces \alpha-1,4;
- (ii)
- glucósidos con enlaces \alpha-1,4;
- (iii)
- galactósidos con enlaces \alpha-1,4; o
- (iv)
- D-glucosa con enlaces \alpha-1,4;
9. Extracto según la reivindicación 6, en el que
el tratamiento es la digestión con una enzima seleccionada del grupo
que consiste en pronasa, ADNasa, ARNasa, o cualquier combinación de
las mismas.
10. Extracto según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que los polisacáridos y complejos de
polisacárido de Chlorella de alto peso molecular son de
Chlorella pyrenoidosa.
11. Procedimiento para obtener un extracto de
Chlorella que tiene actividad inmunomoduladora, que
comprende:
(a) fraccionar por tamaños un extracto acuoso de
Chlorella, y
(b) seleccionar las fracciones que comprenden los
polisacáridos y complejos de polisacárido de alto peso molecular de
1 \times l0^{5} Da a 1 \times 10^{7} Da.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, en
el que la etapa de fraccionamiento por tamaños comprende
cromatografía o ultrafiltración.
13. Extracto obtenido a partir del procedimiento
según la reivindicación 11 ó 12.
14. Composición farmacéutica que comprende el
extracto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 13,
junto con un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable.
15. Composición nutricional que comprende el
extracto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 13, y
al menos una fuente de energía seleccionada del grupo que consiste
en fuentes de hidratos de carbono, grasas y nitrógeno.
16. Complemento nutricional que comprende el
extracto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 13, y
un complemento convencional seleccionado del grupo que consiste en:
vitamina E, vitamina C y ácido fólico.
17. Complemento nutricional que comprende el
extracto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y 13, y
un producto nutricéutico seleccionado del grupo que consiste en:
aceites de pescado, espirulina y equinácea.
18. Uso del extracto según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 y 13, en la fabricación de un medicamento
para la modulación de la respuesta inmune de un mamífero.
19. Uso según la reivindicación 18, en el que la
modulación comprende el aumento de la proliferación de
esplenocitos.
20. Uso según la reivindicación 18, en el que la
modulación comprende el aumento de la producción de una
citocina.
21. Uso según la reivindicación 20, en el que la
citocina se selecciona del grupo que consiste en
IL-6, IL-10,
INF-\gamma y TNF-\alpha.
INF-\gamma y TNF-\alpha.
22. Uso del extracto según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 y 13, en la fabricación de un medicamento
para complementar la respuesta inmune a una vacuna de un
mamífero.
23. Uso según la reivindicación 22, en el que la
vacuna es una vacuna contra la gripe.
24. Uso del extracto según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 y 13, en la fabricación de un medicamento
para prevenir o tratar una infección bacteriana en un mamífero.
25. Uso del extracto según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10 y 13, en la fabricación de un medicamento
para prevenir o tratar una infección fúngica en un mamífero.
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