ES2218167T3 - Medicamento de aplicacion que contiene fibrinogeno, trombina, transglutaminasas e inhibidores de proteinasas. - Google Patents

Abstract

Medicamento de aplicación local destinado a detener el sangrado y/o cerrar heridas y/o promover la cicatrización de heridas, el cual presenta como principios activos ¿ preparados tradicionalmente a partir de plasma o tejido alogénico o mediante ingeniería genética ¿ fibrinógeno o fibrina, trombina y una o varias glutaminasas, caracterizado por el hecho de que el medicamento contiene como principio activo adicional uno o varios inhibidores de proteasas, los cuales se han seleccionado entre el grupo de las serpinas, los cuales no poseen actividad inhibidora de colagenasas y elastasas, siendo todos los principios activos de origen alogénico y habiéndose sometido a un procedimiento para la eliminación de virus y/o la inactivación de virus, a condición de que la inactivación de virus del inhibidor o de los inhibidores de proteasas no se ha llevado a cabo en presencia del resto de los principios activos.

Description

Medicamento de aplicación que contiene fibrinógeno, trombina, transglutaminasas e inhibidores de proteinasas.

El cierre de heridas y la detención de sangrado producida conjuntamente tiene lugar fisiológicamente mediante la coagulación de la sangre saliente en el lecho de la herida, de manera que el cierre se realiza a través de pequeños vasos sanguíneos y capilares. La cicatrización de la herida que se inicia a continuación tiene lugar con la ayuda de la matriz extracelular provisional (ECM) que se forma a través de la sangre coagulada (Clark, R.A.F. et al., 1982, J. Invest. Dermatol. 70:264-269; Clark, R.A.F. (ed.), 1996, The Molecular and Cellular Biology of Cell Repair - Biología Molecular y Celular de la Reparación de Heridas -, Plenum Press, New York). Dicha matriz comprende substancialmente, aparte de células sanguíneas, fibrina como substancia esqueleto, que se utiliza como reserva de una serie de proteínas plasmáticas, las cuales tienen importancia en el inicio de la cicatrización de heridas, como por ejemplo la fibronectina (Mosseson, M.W. y Umfleet, R., 1970, J. Biol.. Chem. 245:5726-5736; Clark, R.A.F. et al., 1982, J. Invest. Dermatol. 70: 264-269), la vitronectina (Preissner, K.T. y Jenne, D., 1991, Thromb.
Haemost. 66: 189-194), el plasminógeno (Castellino, F.J. et al., 1983, Ann. NY Acad. Sci. 408: 595-601), el activador de plasminógeno (Thromb. Pathol. Haemost. 28: 65-74), el activador-inhibidor de plasminógeno (Wagner, O.F. et al., 1989, Blood 70: 1645-1653) y el inhibidor de alfa_{2}-plasmina (Sakata, Y. y Aoki, N., 1980, J. Clin. Invest. 65: 290-297).

La cantidad de activador de plasminógeno, de activador-inhibidor de plasminógeno y de inhibidor de alfa_{2}-plasmina y la relación entre los mismos ejerce un control substancial sobre el subsiguiente proceso de degradación de la fibrina. Sin embargo, en este esqueleto de fibrina están incluidas también otras substancias como por ejemplo la trombina, el TGF-beta y el PDGF, los cuales son necesarios para la migración de las células y la remodelación múltiple (recons-
trucción) de la ECM provisional para dar la ECM definitiva con las correspondientes poblaciones celulares.

En primer lugar migran en grandes cantidades granulocitos en la región de la herida y en la oclusión de la herida. Estos liberan diferentes substancias importantes para el inicio del procedimiento de curación de la herida, en particular colagenasas y elastasas, y destruyen los microorganismos extracelulares e intracelulares que alcanzan la región de la herida y que pueden multiplicarse en la misma. Mientras la migración de granulocitos finaliza, aparecen en la región de la herida cada vez más monocitos, macrófagos inclusive. El tercer día tiene lugar el brote de fibroblastos en la región de la herida, los cuales alcanzan la superficie de la oclusión de la herida a través de fibras de fibronectina. Seguido de la creación de capilares sanguíneos, tiene lugar una serie de transformaciones celulares y de procesos de remodelación que en la mayoría de los casos conducen de nuevo a la completa integridad del tejido dañado. (clark, R.A.F. (ed.), 1996, The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair - biología molecular y celular de la reparación de heridas -, Plenum Press, New York).

Los primeros intentos de cerrar heridas, realizados ya hace 80 o hasta 90 años con la ayuda de plasma sanguíneo, no tuvieron éxito debido a la viscosidad relativamente baja del plasma en comparación con la sangre, a la baja adherencia en el lecho de la herida y debido a la elevada fragilidad de un coágulo de plasma coagulado, que se forma en todo caso a partir del plasma.

La utilización de disoluciones de fibrinógeno enriquecidas en lugar de plasma para la detención del sangrado y para el cierre de heridas tampoco tuvo éxito al principio, pero finalmente pudo alcanzarse un éxito substancial aumentando la concentración de fibrinógeno de dichas disoluciones que contenían fibrinógeno hasta más de 10 veces el nivel de fibrinógeno en plasma (Löblich, 1975, informe no publicado).

Durante la conversión de fibrinógeno en fibrina existe la posibilidad de que la oclusión de la herida, hecha de fibrina, que actúa hemostáticamente, se desprenda después de algunas horas debido a las enzimas del lecho de la herida y que se produzca una hemorragia secundaria. El desprendimiento de la oclusión de la herida, hecha de fibrina, del lecho de la herida es un acontecimiento substancialmente más frecuente y por tanto más peligroso que la fibrinólisis de la oclusión de la herida, hecha de fibrina, en su conjunto.

Las primeras aplicaciones con éxito de las disoluciones de fibrinógeno en altas concentraciones (Matras, H. et al., 1972, Wr. Med. Wschr. 122:517-523) y en las primeras conversiones de fibrinógeno en fibrina mediante trombina en la región de la herida ya mostraron que, mediante inhibidores de la fibrinólisis, puede evitarse el desprendimiento de la oclusión de la herida hecha de fibrina y la hemorragia secundaria que tiene lugar la mayoría de las veces junto a dicho desprendimiento. Entre los inhibidores de bajo peso molecular ensayados, se encontró que eran efectivos el ácido epsilonaminocaprónico y sus derivados, aunque estos presentan la desventaja de que difunden rápidamente apartándose de la fibrina coagulada y de la región de la herida y perdiendo por tanto su acción local.

La adición de inhibidores de elevado peso molecular, como por ejemplo la aprotinina (trasilol), pudo llevarse a cabo con éxito, ya que sólo se produjo una lenta difusión de los inhibidores a partir de la región de la herida, aunque con la desventaja de que se trataba en este caso de un inhibidor de proteasas bovino y por tanto xenógeno que potencialmente puede provocar alergias y anafilaxias. Recientemente, se han establecido objeciones a la utilización de material animal para aplicación parenteral en el hombre debido a la potencial capacidad de transferencia de zoonosis.

En la solicitud de patente WO-A-99/11301 se propone, en lugar de inhibidores de elastasa aprotinina u otros, utilizar inhibidores activos contra las proteasas de leucocitos. Sin embargo, esta propuesta presenta diferentes desventajas según ha descubierto el inventor de la presente invención. Ciertamente, estos inhibidores son efectivos directa o indirectamente mediante la inhibición de enzimas que pueden activar el sistema fibrinolítico, pero pueden perturbar el inicio de la curación de la herida tras la migración de los granulocitos en la región de la herida.

En la preparación de medicamentos farmacéuticos que contiene fibrinógeno y trombina, los cuales contienen un inhibidor de proteasas alogénico y un zimógeno de transglutaminasa, se ha presentado otra dificultad en la inactivación de virus necesaria desde hace mucho tiempo en preparaciones de este tipo. En la inactivación de virus, se pierde en la mayor parte de los casos una gran parte de la actividad del inhibidor de proteasas o del zimógeno de transglutaminasa contenidos en la preparación, de manera que las preparaciones obtenidas después de la realización de la inactivación de virus presenta a menudo sólo una baja actividad del inhibidor de proteasa o del zimógeno de transglutaminasa, respectivamente. De esta manera puede producirse una inhibición insuficiente de las enzimas fibrinolíticas presentes en el lecho de la herida y a continuación el desprendimiento de la oclusión de fibrina del lecho de la herida.

Es objeto de la presente invención proporcionar un medicamento que pueda utilizarse localmente con el objetivo de detener el sangrado y/o cerrar heridas y/o promover la curación de heridas, evitándose la utilización de un inhibidor de proteasas xenógeno y sin embargo proporcionando una inhibición satisfactoria de las enzimas fibrinolíticas en el lecho de la herida tras la aplicación del medicamento, de manera que no se produzca un desprendimiento de la oclusión de la herida hecha de fibrina. Además, debe evitarse en la mayor medida posible la perturbación del inicio de la curación de la herida mediante el medicamento, como resultado de una inhibición de las proteasas liberadas por los granulocitos que han migrado a la región de la herida, como por ejemplo colagenasas y elastasas.

Este objeto se alcanza mediante un medicamento, que presenta como principios activos - preparados tradicionalmente a partir de plasma o tejido alogénico o mediante ingeniería genética - fibrinógeno o fibrina, trombina y una o varias transglutaminasas, conteniendo dicho medicamento como principio activo adicional uno o varios inhibidores de proteasas seleccionados entre el grupo de las serpinas, las cuales no poseen actividad inhibidora de colagenasas y elastasas, siendo todos los principios activos de origen alogénico y habiéndose sometido a un procedimiento para la eliminación de virus y/o la inactivación de virus, a condición de que la inactivación de virus del inhibidor o de los inhibidores de proteasas no se lleve a cabo en presencia del resto de los principios activos.

Mediante la utilización de serpinas, las cuales no poseen actividad inhibidora de colagenasas y elastasas, como inhibidores de proteasas, se evita en gran medida la inhibición de las proteasas liberadas por los granulocitos que han migrado a la región de la herida, de manera que el inicio de la curación de heridas no se ve influido por el medicamento según la invención.

La presente invención también se basa en el descubrimiento de que la actividad inhibidora de los inhibidores de proteasas alogénicas se mantiene substancialmente mejor si estos no se someten a inactivación de virus en una preparación que contenga uno o más de los demás principios activos del medicamento, sino que se someta a inactivación de virus separado de los demás principios activos. De esta manera es posible preparar un medicamento según la invención que contenga inhibidores de proteasas alogénicas con inactivación de virus con actividad satisfactoria, de manera que se puede prevenir la inhibición de las enzimas fibrinolíticas en el lecho de la herida después de la aplicación del medicamento y un desprendimiento de la oclusión de la herida, hecha de fibrina.

En este contexto se hace énfasis en que el término "inactivación de virus" según se utiliza para los objetos de la presente invención no engloba procedimientos que efectúen simplemente una eliminación de virus.

El medicamento según la invención contiene como principio activo fibrinógeno o fibrina, entre otros. Con esto se entiende que en el medicamento, según la forma de aplicación se proporciona bien fibrinógeno como tal o fibrina formada a partir de fibrinógeno mediante la actuación de trombina.

Es por tanto objeto de la invención un medicamento compuesto que constituya una matriz extracelular provisional alogénica lentamente reabsorbible y remodelable, protegida contra virus y estéril, o un medicamento compuesto que forme una matriz de este tipo, que pueda utilizarse localmente o que se forme localmente. Dado que los principios activos de dichos medicamentos poseen carácter de elevado peso molecular y por tanto son potenciales antígenos, se utilizan sólo principios activos alogénicos - referido a la especie en la cual el medicamento debe aplicarse - en la preparación de dichos medicamentos.

La matriz extracelular provisional alogénica posibilita un control de la curación de heridas durante su preparación o su aplicación mediante la adición de otros principios activos protegidos contra virus, en particular mediante la inmovilización de dichos principios activos en la substancia esqueleto a través de transglutaminasas, de manera que practican su actividad en el estado inmovilizado o bien se liberan durante el proceso de reabsorción y remodelación.

Las transglutaminasas alogénicas contenidas en el medicamento según la invención, por ejemplo el factor XIIIa, consigue que los inhibidores de proteasas alogénicos se unan covalentemente a la fibrina, de manera que no se produzca prácticamente ninguna difusión de inhibidores desde la región de la herida.

Una forma de realización preferida del medicamento según la invención se caracteriza por el hecho de que todos los principios activos están presentes como matriz extracelular provisional en una única preparación alogénica, conformada por ejemplo en forma de un gel. El medicamento puede utilizarse en esta forma directamente para aplicación local.

Los principios activos también pueden estar presentes de forma apropiada en dos o más preparaciones farmacéuticas separadas a mezclar antes o durante la aplicación, de manera que la mezcla obtenida puede aplicarse en forma líquida o justo después de su compactación. Las preparaciones pueden estar presentes en forma líquida o congelada o liofilizada para descongelar o reconstituir antes del mezclado.

Las preparaciones farmacéuticas pueden mezclarse por ejemplo como mínimo diez minutos antes de su aplicación sobre una superficie de herida, de manera que se produce una compactación de la mezcla mediante la formación de una matriz extracelular provisional alogénica lentamente reabsorbible y remodelable, la cual se aplica sobre la superficie de la herida. Sin embargo, las preparaciones farmacéuticas pueden también mezclarse y aplicarse la mezcla líquida localmente inmediatamente después, por ejemplo también en forma de un spray, de manera que se forma localmente una matriz extracelular provisional alogénica lentamente reabsorbible y remodelable.

Es preferible seleccionar la concentración de fibrinógeno e inhibidores de proteasas en el medicamento de manera que la mezcla líquida contenga como mínimo 30 g/l de fibrinógeno y 500 unidades de plasma arbitrarias de inhibidores de proteasas/l.

Preferentemente, el fibrinógeno y la trombina se encuentran en preparaciones farmacéuticas separadas y los demás principios activos pueden estar contenidos independientemente los unos de los otros en una o ambas de las preparaciones y/o en una preparación adicional.

Mediante la correspondiente mezcla de la preparación farmacéutica que contiene trombina, es posible según la invención generar cantidades significativas de trombina hasta algunas horas después del procedimiento de mezcla con la disolución que contiene trombina y después de la compactación de la mezcla en la fibrina formada. Esto tiene gran importancia tanto para la estabilidad como para la calidad de la matriz extracelular provisional alogénica formada de esta forma.

Las preparaciones farmacéuticas presentes en los medicamentos según la invención pueden también aplicarse ventajosamente sobre materiales portadores alogénicos o biocompatibles, que se hayan sometido a un procedimiento para la eliminación de virus y/o inactivación de virus. Los materiales portadores pueden presentar diferentes formas según la forma de aplicación. La preparación de un medicamento listo para su aplicación puede llevarse a cabo por ejemplo mediante la aplicación de la mezcla aún líquida de las preparaciones farmacéuticas sobre el material portador.

Una realización preferida del medicamento según la invención se caracteriza por el hecho de que contiene como principio activo adicional colágeno alogénico que se ha sometido a un procedimiento para la eliminación de virus y/o inactivación de virus. La utilización adicional de colágenos en la preparación o aplicación de la matriz extracelular provisional alogénica conduce a un aumento considerable de la calidad biomecánica.

De forma adecuada, el medicamento según la invención contiene uno o más principios activos alogénicos adicionales que se han sometido a un procedimiento para la eliminación de virus y/o inactivación de virus, seleccionados entre el grupo que consiste en fibronectina, vitronectina, tromboespondina, tenascina, laminina y proteoglicano. Mediante la adición de substancias como por ejemplo vitronectina puede alcanzarse aún una mejora de la actividad de determinados inhibidores de proteasas.

Además es ventajoso que el medicamento según la invención contenga uno o más principios activos alogénicos adicionales que se han sometido a un procedimiento para la eliminación de virus y/o inactivación de virus, seleccionados los factores de crecimiento, substancias quemotácticas, enzimas estimuladoras celulares y/o promotoras de la proliferación e inhibidores de dichas enzimas, enzimas inhibidoras de la proliferación e inhibidores de dichas enzimas, citoquinas y elementos celulares de forma particulada. La utilización de inhibidores enzimáticos alogénicos en relación con el cierre de heridas ofrece la posibilidad, en particular en el caso de úlcera de la piel, de una curación de la herida.

Preferentemente, el medicamento según la invención contiene enzimas, zimógenos y/o inhibidores enzimáticos alogénicos plasmáticos u obtenidos a partir de tejidos, que se han sometido a un procedimiento para la eliminación de virus y/o inactivación de virus.

Según los requisitos clínicos es adecuado añadir al medicamento según la invención principios activos antiadherentes, antiflogísticos, antimicrobianos y/o citostáticos, sometidos en caso de necesidad a un procedimiento para la eliminación de virus y/o inactivación de virus. La adición de principios activos alogénicos antiflogísticos y antiadherentes, como por ejemplo determinadas inmunoglobulinas u otras substancias activas presentes en el plasma con estas propiedades, posibilita la utilización de una matriz extracelular provisional alogénica también allí donde se estime que puedan ser necesarias adhesiones postoperatorias.

La matriz extracelular provisional alogénica que está presente como tal o que se forma durante la aplicación del medicamento puede funcionar como reserva o depósito de substancias que deban liberarse lentamente a partir de la matriz. Una realización preferida del medicamento según la invención se caracteriza por tanto por el hecho de que contiene principios activos adicionales que deben reabsorberse lentamente y que se han sometido en caso de necesidad a un procedimiento para la eliminación de virus y/o inactivación de virus.

Es ventajoso que la preparación farmacéutica que contiene trombina del medicamento según la invención contenga adicionalmente zimógenos y/o enzimas de la cascada de coagulación alogénicos, que se hayan sometido a un procedimiento para la eliminación de virus y/o inactivación de virus.

Preferentemente, el medicamento según la invención contiene adicionalmente elementos celulares, células y/o tejido alogénicos que pueden aplicarse sobre microesferas protegidas contra virus, las cuales constan de fibrina alogénica y/o colágeno alogénico y/o colágeno alogénico con fibrina alogénica.

Una desventaja de las preparaciones farmacéuticas que contenían fibrinógeno o fibrina conocidas hasta el momento es la fragilidad relativamente elevada de la fibrina formada, incluso cuando se utilizan disoluciones de fibrinógeno en proporción muy elevada.

Ciertamente, mediante la presencia del factor XIIIa - una transglutaminasa, que se forma en la preparación farmacéutica a partir del factor XIII contenido en la misma por la acción de la trombina -, se reticula la fibrina que se va formando durante la coagulación para dar un esqueleto, aunque deben estar presente o formarse todavía altas concentraciones de trombina y de factor XIII en la fibrina para que se produzca una reacción prácticamente completa entre los lugares de reticulación en la fibrina. Sin embargo, dichas fibrinas son como tal difíciles de utilizar, debido a la fragilidad existente todavía y de la misma manera las fibrinas formadas localmente muestran todavía una baja estabilidad mecanística.

Una realización preferida del medicamento según la invención se caracteriza por tanto por el hecho de que la matriz extracelular provisional alogénica se compacta mediante la aplicación de presión y/o mediante un agente deshidratante. La matriz puede tratarse con transglutaminasas alogénicas antes, durante y/o después de la estabización por deshidratación.

Las matrices alogénicas de este tipo pueden también utilizarse como piel alogénica artificial debido a su satisfactoria estabilidad mecanística. De esta manera también se ha hecho posible preparar una piel artificial exclusivamente a partir de substancias humanas y adicionalmente introducir también en una preparación de este tipo elementos particulados, células y tejidos que ofrezcan nuevas posibilidades de aplicación médicas.

Con las preparaciones farmacéuticas según la invención también es posible rellenar lugares corporales donde se ha encontrado una fuerte descomposición de tejido propio del cuerpo y alcanzar de esta manera una curación a largo plazo.

Las disoluciones de fibrinógeno concentradas presentan una serie de desventajas. Tienen una baja estabilidad de almacenamiento y deben ultracongelarse o liofilizarse para ser almacenadas y no siempre pueden ser reutilizadas o reconstituidas de forma satisfactoria mediante la descongelación o redisolución, respectivamente. Además, la disolución de un liofilizado de fibrinógeno requiere cierto tiempo. Los mediadores de disolución o fibrinógenos fácilmente solubles son tóxicos en la mayoría de los casos y por lo tanto no se utilizan para una curación de heridas sin complicaciones.

La mayor dificultad en el almacenamiento de productos que contienen fibrinógeno es la inestabilidad del fibrinógeno, dado que trazas de impurezas con factores de coagulación provocan una lenta transformación de fibrinógeno en fibrina insoluble, lo cual ya no permite utilizar más un preparado farmacéutico de este tipo.

En conexión con lo anterior, la presente invención se refiere también a un procedimiento para la preparación de una disolución que contiene fibrinógeno, la cual puede almacenarse como tal o como componente de un medicamento según la invención a temperatura frigorífica o a temperatura ambiente, habiéndose preparado la disolución de fibrinógeno o una disolución de fibrinógeno-fibronectina a partir de fibrinógeno preparado mediante ingeniería genética o a partir de fibrinógeno obtenido del plasma mediante fraccionamiento con glicina a temperaturas por debajo de los 0ºC.

Las disoluciones que contienen fibrinógeno preparadas según la invención son estables y pueden almacenarse en estado líquido con o sin estabilizadores más de dos años a una temperatura de 4º-8ºC o ultracongelados o liofilizados, sin que precipite fibrina insoluble o sin que se formen productos de degradación del fibrinógeno a través de la formación de plasmina durante el almacenamiento en tal medida que se perturbe la capacidad de coagular. Dichas disoluciones no coagulan tras la adición de tromboplastina y veneno de víbora de Taipan, o mediante la adición de tromboplastina parcialmente activada. Mediante el almacenamiento en estado ultracongelado y después de la redisolución de las disoluciones que contienen fibrinógeno según la invención no se induce ningún procedimiento de coagulación y las disoluciones obtenidas son estables como mínimo varias horas. Las preparaciones ultracongeladas pueden reconstituirse fácil y completamente con los correspondientes agentes de disolución.

También puede prepararse un medicamento que contienen una preparación que contiene fibrinógeno ultrapuro o que contiene fibrinógeno-fibronectina ultrapuro, cuyo aPTT y tiempo de protrombina del veneno de víbora de Taipan a 37ºC no es menor de 200 o 300 segundos y que presenta una estabilidad tal que puede almacenarse en estado líquido con o sin estabilizadores, como componente de medicamentos o como tal, más de dos años a una temperatura de 4º-8ºC o ultracongelados o liofilizados, sin que precipite fibrina insoluble o sin que se formen productos de degradación del fibrinógeno a través de la formación de plasmina durante el almacenamiento.

A pesar de la utilización de principios activos exclusivamente alogénicos puede producirse la formación de neoantígenos durante la inactivación de virus en medicamentos compuestos de principios activos alogénicos, bien mediante la interacción de dos o más principios activos del medicamento durante la inactivación de virus y/o mediante la interacción con impurezas que todavía están presentes en los principios activos.

Otra desventaja en la inactivación de virus en mezclas de principios activos es la diferente inactivación, a menudo muy notoria, de cada principio activo, lo cual complica o imposibilita la formulación del medicamento.

En conexión con lo anterior, la obtención de los principios activos contenidos en los medicamentos según la invención libres de patógenos puede comprender una combinación de procedimientos de eliminación y de procedimientos de inactivación, inclusive etapas para la eliminación de virus y la inactivación de virus, utilizándose para la eliminación de virus ultracentrifugaciones y ultrafiltraciones, inclusive nanofiltraciones y/o adsorciones de patógenos a temperaturas bajo los 0ºC y llevándose a cabo como mínimo dos procedimientos para la inactivación de virus diferentes, en los cuales se utilizan procedimientos de impulso por calor por debajo de los 3 segundos y/o irradiación de impulso láser intenso con o sin substancias fotodinámicas y/o detergentes junto a agentes reticulantes hidrofóbicos.

Mediante dicho procedimiento pueden inactivarse virus en principios activos con un grado de purificación satisfactorio antes de su formulación, de manera que se asegura mediante la correspondiente selección del procedimiento de inactivación que se han inactivado los virus en todos los principios activos en un mismo grado sin pérdidas demasiado grandes. De esta manera puede evitarse en máximo grado una inducción o desencadenamiento de alergias, anafilaxis y procesos autoinmunes debido a dicho medicamento que contiene dichos principios activos.

En particular, también es posible una inactivación de virus particularmente meticulosa de los inhibidores de proteasas contenidos en los medicamentos según la invención.

Para la unión covalente en una matriz biológica de los principios activos contenidos en los medicamentos según la invención, se añaden, para la catálisis enzimática de la reacción de unión, altas concentraciones de transglutaminasas alogénicas en las que se han eliminado y/o inactivado los virus, las cuales se encuentran en el rango de concentraciones superior a 10 veces la concentración activa del zimógeno del factor XIIIa presente en el plasma.

Mediante una concentración de trombina suficientemente elevada y sostenida durante un largo intervalo de tiempo en la matriz extracelular provisional alogénica puede formarse suficiente factor XIIIa en presencia de cantidades suficientes de factor XIII, el cual por una parte produce la reticulación de la substancia(s) base fibrina con o sin colágeno, por otro lado genera TAFI en presencia del zimógeno de TAFI.

TAFI disocia el receptor de plasmina a partir de fibrina, de manera que se alcanza una gran estabilidad de la matriz extracelular provisional alogénica frente a las enzimas fibrinolíticas. Además es posible según la invención unir covalentemente a la matriz extracelular provisional alogénica, mediante una concentración de transglutaminasas elevada y sostenida durante un largo intervalo de tiempo, inhibidores de proteasas alogénicos, como por ejemplo alfa_{2}-antiplasmina, PAI-1 y otros y de esta manera detener su difusión desde la matriz extracelular provisional alogénica. Lo mismo es válido también para otros principios activos con carácter proteico que pueden unirse covalentemente a la substancia esqueleto con la ayuda de transglutaminasas.

Para preparar un gel que contiene fibrina seco con un contenido en agua del 20% al 90%, el gel que contiene fibrina puede deshidratarse mediante la adición de agentes deshidratantes que pueden utilizarse farmacéuticamente y atóxicos, en particular polietilenglicol, o sumergiendo el gel en estos agentes, de manera que el gel puede tratarse con transglutaminasas antes o después de la deshidratación.

La preparación de un gel que contiene fibrina seco con un contenido en agua del 20% al 90% puede también llevarse a cabo mediante un procedimiento en el cual el gen que contiene fibrina puede deshidratarse mediante la aplicación de una presión elevada, de manera que dicha presión se va elevando gradualmente para evitar la destrucción del gel. Entonces, el gel puede tratarse con transglutaminasas antes, durante y/o después de la aplicación de presión.

Para compactar un gel que contiene fibrina con y sin la deshidratación, el gel que contiene fibrina se introduce en una o más disoluciones que contienen metales, en particular disoluciones que contienen iones de zinc y aluminio en una concentración de 0,01 a 2 molar.

Además, puede proporcionarse un gel que contiene fibrina liofilizado, el cual se prepara mediante la adición de agentes ablandadores, en particular glicol, antes de su compactación y liofilización.

El procedimiento llevado a cabo anteriormente para la preparación de geles que contienen fibrina secos así como para compactar geles que contienen fibrina pueden utilizarse de forma particularmente ventajosa para la preparación de un medicamento según la invención.

Una desventaja de las preparaciones que contenían fibrinógeno utilizadas hasta ahora en la aplicación local de mezclas de principios activos que contienen fibrinógeno es su extremadamente baja viscosidad antes de la compactación. Por este motivo, la mezcla aplicada puede desprenderse fácil y rápidamente del lugar de aplicación, lo cual por un lado conduce a un consumo del medicamento y por otro lado a una utilización insatisfactoria, en particular en relación con las intervenciones quirúrgicas, en el caso en que sea necesaria una aplicación en el campo de operaciones.

Para preparar una disolución que contiene fibrina de alta viscosidad, puede mezclarse una disolución que contiene fibrinógeno estéril en la que se han eliminado y/o inactivado los virus con una centésima hasta décima parte de trombina estéril por gramo de fibrinógeno, habiéndose eliminado y/o inactivado los virus en dicha trombina, que está disuelta en el mínimo volumen posible, lentamente y con fuerte agitación bajo condiciones estériles. Las disoluciones que contienen fibrinógeno de elevada viscosidad preparadas según el procedimiento según la invención pueden utilizarse de forma especialmente ventajosa para la preparación de un medicamento según la invención.

Para comprobar la capacidad de adherencia de un coágulo de fibrina en el lecho de la herida pueden formarse coágulos de fibrina con cantidades crecientes de inhibidores de proteasas en la superficie de cultivos de tejidos apropiados, en particular de fibroblastos humanos, con la adición de una pequeña cantidad de uno o varios colorantes y/o una o más substancias insolubles en agua, la cuales rinden coágulos de fibrina teñidos u opalescentes, respectivamente, manteniendo los cultivos celulares en movimiento mediante ligeros movimientos de sacudida o rotación, de manera que se determina el intervalo de tiempo después del cual se desprenden las materias coaguladas de fibrina de la superficie del cultivo celular.

Con este procedimiento es posible utilizar en una matriz extracelular provisional alogénica, como por ejemplo la existente en los medicamentos según la invención o formada mediante dichos medicamentos, una determinada cantidad de proteasas requerida para mantener una matriz de este tipo durante cómo mínimo varios días en el lugar de su aplicación y de esta manera evitar un desprendimiento del lecho de la herida así como una hemorragia secundaria causada por dicho desprendimiento.

Ejemplos Ejemplo 1 Obtención de una disolución de fibrinógeno estable

Se utiliza como material de partida plasma 1001 apropiado para la obtención de medicamentos o una fracción-I de Cohn obtenida a partir de dicho plasma por precipitación con etanol frío o un precipitado en frío mediante la congelación del plasma y descongelación con cuidado.

El plasma como tal, la fracción-I de Cohn y el precipitado en frío después de la descongelación se mezclan en aproximadamente 20 litros de NaCl al 0,9% y tampón de citrato sódico pH 7 al 0,1% con glicina sólida con un grado de pureza para preparaciones farmacéuticas hasta la saturación y se enfría de -2ºC hasta -3ºC, se almacena como mínimo durante 10 hasta como máximo durante 15 horas a esta temperatura, se separa de la glicina no disuelta y el precipitado que contiene fibrinógeno-fibronectina se separa mediante centrifugación en una ultracentrífuga.

Los sobrenadantes pueden utilizarse para procesamientos posteriores, para aislar a partir de los mismos otras proteínas del plasma.

El precipitado tipo gelatina se separa del rotor de la centrífuga, se disuelve y se precipita con glicina tal como se ha realizado anteriormente. El sedimento obtenido después de centrifugar se disuelve en una disolución de citrato al 0,1% y este procedimiento de precipitación se repite las veces necesarias hasta que una muestra del sedimento obtenido disuelto en agua con contenido en fibrinógeno del 0,1% - 0,2%, dé como resultado, a 37ºC junto a un reactivo PTT, una aPTT no menor de 200 segundos. De la misma manera, debe alcanzarse un tiempo de coagulación que no se encuentre por debajo de los 300 segundos, tras la adición de tromboplastina y veneno de víbora de Taipan.

El último precipitado redisuelto, apropiado para procesamientos posteriores, se exime completamente de glicina mediante diafiltración frente a una disolución de citrato al 0,1% y se concentra de esta manera hasta un contenido en proteína del 2%-3%.

El fibrinógeno obtenido de esta manera contiene también todavía cantidades substanciales de fibronectina. Si se desea, puede separarse la fibronectina mediante precipitación a -2ºC hasta -3ºC con glicina al 17%. De esta manera, se precipita prácticamente todo el fibrinógeno y en el sobrenadante se encuentra la fibronectina junto a una pequeña cantidad de fibrinógeno. Mediante saturación con glicina pueden precipitarse y obtenerse conjuntamente ambas proteínas. En todo caso, el efecto de las bajas actividades presentes de activador de plasminógeno o plasmina pueden suprimirse mediante la adición de pequeñas cantidades de inhibidores de bajo peso molecular como por ejemplo el ácido epsilonaminocaprónico o sus derivados.

La inactivación de virus del fibrinógeno o del complejo fibrinógeno-fibronectina con alto grado de pureza puede llevarse a cabo mezclando el plasma de la fracción-I de Cohn disuelta o del precipitado frío disuelto con detergentes y agentes reticulantes o con un procedimiento de impulso por calor o un procedimiento láser. La disolución de fibrinógeno con inactivación de virus puede ultracongelarse o liofilizarse como tal a temperatura frigorífica de 4ºC hasta 8ºC para su almacenamiento.

Ejemplo 2

Preparación de una disolución de trombina con potencial generador de trombina.

Dicha disolución de trombina se obtiene mezclando dos disoluciones a partes iguales, las cuales se han obtenido a partir de plasma humano destinado a la preparación de medicamentos para su utilización en el hombre. Ambas disoluciones están libres de pirógenos, libres de iones de calcio y son estériles. Una disolución contiene trombina protegida contra virus en una concentración seleccionada entre las 20 hasta las 2.500 unidades/ml, la otra contiene una mezcla protegida contra virus de protrombina-factores de coagulación, la cual puede generar después de la adición de iones de calcio, como mínimo 1.000 unidades de trombina por ml.

Dicha mezcla se entremezcla con una centésima parte en volumen de una disolución estéril de polietilenglicol al 10% (pureza farmacéutica) y la mezcla se introduce después en la dosificación deseada en frascos de tapón perforable o en jeringas prefabricadas y se ultracongela, o en todo caso se liofiliza, se cierra el recipiente, se almacena, se etiqueta y se empaqueta.

Ejemplo 3

Preparación de un medicamento apropiado para el hombre para su aplicación local como preparación farmacéutica que contiene fibrina y trombina.

800 ml de una preparación líquida de principio activo y libre de pirógenos según el ejemplo 1, la cual se ha obtenido a partir de plasma humano apropiado para la preparación de medicamentos para el hombre y que presenta un contenido en fibrinógeno del 6% como mínimo, se utiliza para la disolución de una preparación farmacéutica ultracongelada, estéril, libre de pirógenos, con inactivación de virus, obtenida a partir de plasma humano apropiado para la preparación de medicamentos para el hombre, cuya preparación farmacéutica presenta 1.200 unidades arbitrarias, referidas al plasma humano, de PAI-1 o de otra serpina o de una mezcla de serpinas, las cuales no presentan actividad inhibidora de la actividad colagenasa o elastasa y cuya preparación farmacéutica contiene un porcentaje de zimógeno de transglutaminasas equivalente a como mínimo 4.000 unidades de Factor XIII. Además, la preparación contiene 2 g de CaCl_{2}.

Dicha preparación farmacéutica que contiene fibrinógeno se mezcla ahora con la preparación que contiene trombina indicada en el ejemplo 2 tras su reconstitución con la correspondiente cantidad de agua para fines de inyección, más concretamente 4 partes de la preparación que contiene fibrinógeno con una parte de la preparación que contiene trombina.

Ejemplo 4

Preparación de una matriz extracelular provisional alogénica como medicamento.

Una cantidad determinada de la mezcla según el ejemplo 3 se vierte en un molde esterilizado deseado y se incuba durante 5 horas bajo condiciones estériles entre 35ºC y 37ºC. La matriz extracelular alogénica, estéril, libre de pirógenos, protegida contra virus y apropiada para su utilización en el hombre obtenida en el molde se termosolda en un envase estéril recubierto de polietileno impermeable al vapor de agua y se almacena a temperatura frigorífica de 4ºC - 8ºC para su extracción del molde tras los correspondientes controles de calidad. Después del etiquetado, embalaje y extracción del molde, el medicamento puede transportarse.

Ejemplo 5

Preparación de una matriz extracelular provisional alogénica mediante la mezcla de tres preparaciones farmacéuticas, que se ofrece como medicamento compuesto.

El medicamento contiene tres preparaciones farmacéuticas, las cuales tras su mezcla forman una matriz extracelular provisional alogénica:

a.

una disolución de fibrinógeno al 6% según el ejemplo 3,

b.

una mezcla ultracongelada de zimógeno de transglutaminasas, serpina o una mezcla de serpinas, cuyas serpinas están libres de actividad inhibidora de actividad colagenasa y elastasa, y cloruro cálcico en las cantidades indicadas en el ejemplo 3,

c.

una disolución de trombina ultracongelada según el ejemplo 2.

En el medicamento también existe agua para fines de inyección, la cual se utiliza para disolver la preparación farmacéutica que contiene trombina según el ejemplo 2, mientras que la preparación farmacéutica que contiene el zimógeno de transglutaminasa y la serpina se disuelve en la disolución de fibrinógeno al 6% según el ejemplo 3. Después de mezclar la disolución que contiene fibrinógeno con la disolución que contiene trombina, antes de la coagulación de dicha mezcla, se introduce la mezcla en un molde deseado estéril y libre de pirógenos y, o bien después de la compactación se extrae del molde y se aplica localmente o bien se aplica localmente la mezcla aún líquida en el lugar deseado o en los lugares deseados, formándose entonces localmente una matriz extracelular provisional alogénica apropiada para el hombre.

Ejemplo 6

Matriz extracelular provisional alogénica reforzada bajo la utilización de colágeno alogénico.

En la mezcla de las preparaciones farmacéuticas según los ejemplos 4 y 5, puede introducirse también colágeno humano fibrilar, estéril, libre de pirógenos y protegido contra virus, más concretamente entre 5 - 100 mg/ml, o la mezcla se aplica sobre un flujo de colágeno en forma de espuma con poder de absorción rápida, de manera que el contenido en trombina de la mezcla se ajusta de tal manera que la formación de fibrina se produce sólo después de finalizar el procedimiento de absorción. Un flujo de este tipo puede utilizarse justo después del inicio del procedimiento de coagulación o después de la incubación durante 5 horas entre 35ºC y 37ºC, puede empaquetarse de forma estéril y continuar procesándose para dar el medicamento acabado.

Ejemplo 7

Determinación de las concentraciones requeridas de serpinas no inhibidoras de la actividad colagenasa o elastasa.

Una línea celular de fibroblastos seleccionada, cuya selección se lleva a cabo según la actividad fibrinolítica máxima, se introduce en una densidad celular de aproximadamente 10^{7} células por ml en matraces de cultivo de tejidos con una superficie de crecimiento de 30 cm^{2} como mínimo en una cantidad tal que existen 10^{5} células por cm^{2} de matraz de cultivo de tejidos. Después de la adición de 10 ml de medio de cultivo como mínimo, los matraces se cultivan hasta que se forme una capa celular completa. En caso necesario, se lleva a cabo un cambio de medio a intervalos de tiempo determinados. Una vez haya crecido una capa celular completa, el medio se separa y se lava cada capa celular con 20 ml de medio como mínimo, se separa el medio del matraz completamente se introducen 50 \mul de una mezcla indicada más abajo sobre la capa colocada exactamente horizontalmente con la ayuda de pipetas apropiadas, a través de posiciones indicadas sobre la cara exterior de los matraces y después se cierran los matraces de cultivo de tejidos y se almacenan durante 1 hora a temperatura ambiente, después se rellena con medio y se cierra de la misma manera que se había realizado anteriormente y se mantiene en una estufa de cultivo a 37ºC en un agitador de cultivo de tejidos con una velocidad de agitación de aproximadamente 10 sacudidas por min. y se analizan los coágulos que contienen fibrina aplicados sobre la capa celular después de 30 min., 100 min. y 300 min. y después, cada 8 horas.

La aplicación de las mezclas que se indican más abajo se lleva a cabo tal como se describe a continuación:

Sobre seis lugares marcados se aplica plasma, que se había mezclado antes de la mezcla con azul de metileno en la cantidad deseada y con cien unidades de trombina/ml de plasma. A modo de experimentación, se preparan las mezclas según el ejemplo 3, las cuales se tiñen con una cantidad deseada de rojo de fenol y que contienen cantidades diferentes de serpina plasmática o preparada mediante ingeniería genética. De la misma manera, de cada concentración de serpina se aplican 6 x 50 \mul de la mezcla sobre lugares marcados. Después de la compactación de las muestras de mezcla aplicadas, se procede tal como se ha indicado más arriba.

Se determinan ahora las tiempos a los cuales se desprenden las muestras que contienen fibrina de la superficie de cultivo de tejido. Los tiempos de desprendimiento de las muestras que contienen serpina se comparan con los de las muestras de plasma. Se selecciona ventajosamente aquellas concentraciones de serpina que alcanzan un tiempo de desprendimiento como mínimo tan largo como los de los observados en los coágulos aplicados preparados a partir de plasma.

Claims (18)

1. Medicamento de aplicación local destinado a detener el sangrado y/o cerrar heridas y/o promover la cicatrización de heridas, el cual presenta como principios activos - preparados tradicionalmente a partir de plasma o tejido alogénico o mediante ingeniería genética - fibrinógeno o fibrina, trombina y una o varias glutaminasas, caracterizado por el hecho de que el medicamento contiene como principio activo adicional uno o varios inhibidores de proteasas, los cuales se han seleccionado entre el grupo de las serpinas, los cuales no poseen actividad inhibidora de colagenasas y elastasas, siendo todos los principios activos de origen alogénico y habiéndose sometido a un procedimiento para la eliminación de virus y/o la inactivación de virus, a condición de que la inactivación de virus del inhibidor o de los inhibidores de proteasas no se ha llevado a cabo en presencia del resto de los principios activos.

2. Medicamento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que todos los principios activos están presentes en una única preparación farmacéutica como matriz extracelular provisional alogénica.

3. Medicamento según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que los principios activos están presentes en dos o más preparaciones farmacéuticas separadas para mezclar antes o durante su aplicación, pudiéndose aplicar la mezcla obtenida en forma líquida o justo después de su compactación.

4. Medicamento según la reivindicación 3, caracterizado por el hecho de que el fibrinógeno y la trombina están presentes en preparaciones farmacéuticas separadas y que los demás principios activos están contenidos independientemente los unos de los otros en una o ambas preparaciones o en una preparación adicional.

5. Medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizado por el hecho de que las preparaciones farmacéuticas se aplican sobre materiales portadores alogénicos o biocompatibles, los cuales se han sometido a un procedimiento para la eliminación de virus y/o inactivación de virus.

6. Medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por el hecho de que contiene como principio activo adicional colágenos alogénicos, los cuales se han sometido a un procedimiento para la eliminación de virus y/o inactivación de virus.

7. Medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por el hecho de que contiene uno o más principios activos adicionales alogénicos que se han sometido a un procedimiento para la eliminación de virus y/o inactivación de virus, los cuales se han seleccionado entre el grupo que consiste en fibronectina, vitronectina, tromboespondina, tenascina, laminina y proteoglicano.

8. Medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por el hecho de que contiene uno o más principios activos adicionales alogénicos, sometidos a un procedimiento para la eliminación de virus y/o inactivación de virus, seleccionados entre el grupo de los factores de crecimiento, substancias quemotácticas, enzimas estimuladoras celulares y/o promotoras de la proliferación e inhibidores de dichas enzimas, enzimas inhibidoras de la proliferación e inhibidores de dichas enzimas, citoquinas y elementos celulares de forma particulada.

9. Medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado por el hecho de que contiene enzimas, zimógenos y/o inhibidores enzimáticos alogénicos adicionales, plasmáticos u obtenidos a partir de tejidos, los cuales se han sometido a un procedimiento para la eliminación de virus y/o inactivación de virus.

10. Medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por el hecho de que contiene principios activos adicionales antiadherentes y/o antiflogísticos, los cuales se someten en caso necesario a un procedimiento para la eliminación de virus y/o inactivación de virus.

11. Medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por el hecho de que contiene principios activos adicionales antimicrobianos y/o citostáticos, los cuales se someten en caso necesario a un procedimiento de eliminación de virus y/o inactivación de virus.

12. Medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por el hecho de que contiene principios activos adicionales, los cuales deben reabsorberse de forma lenta y que se someten en caso necesario a un procedimiento para la eliminación de virus y/o inactivación de virus.

13. Medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado por el hecho de que la preparación farmacéutica que contiene trombina contiene adicionalmente zimógenos alogénicos y/o enzimas de la cascada de coagulación, los cuales se han sometido a un procedimiento para la eliminación de virus y/o inactivación de virus.

14. Medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 1, 2 y 5 hasta 13, caracterizado por el hecho de que contiene adicionalmente elementos celulares particulados, células y/o tejidos alogénicos.

15. Medicamento según la reivindicación 14, caracterizado por el hecho de que los elementos particulados, células y/o tejidos alogénicos se aplican sobre microesferas protegidas contra virus, las cuales constan de fibrina alogénica y/o colágeno alogénico y/o colágeno alogénico con fibrina alogénica.

16. Medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 2 y 5 hasta 15, caracterizado por el hecho de que la matriz extracelular provisional alogénica se compacta mediante la aplicación de presión y/o agentes deshidratantes.

17. Medicamento según la reivindicación 16, caracterizado por el hecho de que la matriz extracelular provisional alogénica se trata con transglutaminasas alogénicas antes, durante y/o después de la compactación por deshidratación.

18. Procedimiento para la preparación de una disolución que contiene fibrinógeno, la cual puede almacenarse a temperatura frigorífica o temperatura ambiente como componente de un medicamento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado por el hecho de que la disolución de fibrinógeno o una disolución de fibrinógeno-fibronectina se prepara a partir de fibrinógeno producido mediante ingeniería genética o a partir de fibrinógeno obtenido a partir del plasma mediante fraccionamiento con glicina a temperaturas por debajo de los 0ºC.