PT1351697E

PT1351697E - Medicamentos para estimulação da regeneração de tecidos

Info

Publication number: PT1351697E
Application number: PT2709881T
Authority: PT
Inventors: Johann Eibl; Georg Watzek; Reinhard Gruber
Original assignee: Bio Prod & Bio Eng Ag; Georg Watzek; Reinhard Gruber
Priority date: 2001-01-18
Filing date: 2002-01-17
Publication date: 2013-12-24
Also published as: US20040082511A1; ES2444090T3; EP1351697B1; CA2435248A1; WO2002056897A2; WO2002056897A3; DK1351697T3; EP1351697A2

Description

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DESCRIÇÃO "MEDICAMENTOS PARA ESTIMULAÇÃO DA REGENERAÇÃO DE TECIDOS" A presente invenção refere um medicamento de utilização local para estimulação da regeneração de tecidos, em especial de tecidos ósseos.

Através de uma estimulação adequada, as células eucarióticas podem libertar partes da sua membrana plasmática para o espaço extracelular. Estes fragmentos celulares contêm partes citoplasmáticas e são designados por microparticulas. A formação de microparticulas deste tipo pode ser confirmada em monócitos, em linfócitos, células do endotélio, granulócitos e trombócitos. Por exemplo, no caso dos trombócitos, por estimulação com colagénio, trombina, o ionóforo Ca2+ A23187 e a proteína C5b-9 do sistema complemento ocorre a ligação de elementos celulares deste tipo (Tans G., Blood, 1991; Sims PJ., J. Biol. Chem., 1988). Além das substâncias mencionadas, que causam uma alteração da concentração de cálcio intracelular, foram também descritas fosforilações de proteínas, a translocação de fosfolípidos, alterações no citoesqueleto e tensões de corte na formação de microparticulas trombócitas.

As microparticulas de trombócitos possuem propriedades que tanto podem conduzir a uma aceleração como a um 2 ΡΕ1351697 retardamento da coagulação sanguínea. Através de uma ligação altamente específica dos factores de coagulação sanguínea VIII, um co-factor do complexo enzimático tenase e Va, que em conjunto com o factor Xa forma o complexo protrombinase, as micropartículas possuem uma função de estimulação da coagulação. A ligação dos factores à superfície das micropartículas ocorre através da fosfati-dilserina, um fosfolípido da membrana celular. Em oposição, a acumulação de "proteína S" conduz a uma inactivação dos factores de coagulação Va e VIII, assim como a uma ligação da proteína C e à "proteína C activada", podendo inferir-se que as micropartículas têm propriedades anticoagulante (Tans G., Blood, 1991). Em comparação com os trombócitos activados, as micropartículas apresentam um maior número de locais de ligação para os factores de coagulação IXa (Hoffman, M.; Thrombin Haemost, 1992) e Va (Sims, PJ.; JBC, 1988). Além disso, as glicoproteínas GP IIb//IIIa, Ib, Ialla e P-selectina, na superfície celular, possibilitam a ligação de micropartículas à superfície do endotélio vascular (George, JN., JCI, 1986; Gawaz, M.; Aterioscler Thromb. Vasc. Biol., 1996). Através das micropartículas, além da activação de células do endotélio também se verificou a activação de monócitos e de trombócitos (Barry OP, Thromb Haemat, 1999).

Nas doenças que são provocadas por uma activação dos trombócitos também foram observadas elevadas concentrações de micropartículas na corrente sanguínea. 3 ΡΕ1351697

Uma das principais funções do sistema imunitário consiste em levar leucócitos à proximidade da infeção e de tecidos com lesões. Nestes casos, os leucócitos dispõem-se ao longo da parede do endotélio e através da integrina e da selectina migram até à área infectada da ferida. As micropartícuias, através da P-selectina, promovem a acumulação dos leucócitos "rolantes" e, desta forma, podem contribuir para uma hemostase e reacção inflamatória mais fortes (Forlow B., Blood, 2000). A ligação mais forte dos monócitos ao endotélio devido às microparticulas também pode igualmente ser comprovada (Barry OP., JCI, 1997). Outro estudo mostra gue as microparticulas dos trombócitos conduzem a um aumento da proliferação de células musculares lisas vasculares (Weber AA., Thromb Res., 2000).

Os trombócitos são os componentes do sangue mais pequenos no organismo humano e podem reagir a estímulos químicos e físicos. No caso de uma lesão vascular os trombócitos são libertados, agregam-se à superfície endo-telial descoberta e segregam uma variedade de substâncias biologicamente activas. Entre estas, encontra-se o factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), o factor de crescimento tumoral (TGF-β), o factor de crescimento epidérmico (EDF), mas também metabolitos do ácido araquídico, como a prostaglandina D2/E2 e o tromboxano A2, e também microparticulas.

Depreende-se que a libertação das microparticulas estimula a formação de coágulos de fibrina e a migração de 4 ΡΕ1351697 células inflamadas para a área afectada. Por seu lado, os macrófagos e granulócitos neutrófilos segregam factores de crescimento, que por sua vez levam leucócitos, fibroblastos e células endoteliais ao coágulo de fibrina. Os macrófagos destroem o tecido afectado e promovem a proliferação e a sintese de colagénio do tipo I, pelo que é iniciado o desenvolvimento dos designados tecidos de granulação. Neste caso, tratam-se de tecidos de ligação fibrosos que substituem o tecido original. Em paralelo, ocorre uma multiplicação dos vasos e uma epitelização da área lesionada. A formação de um tecido cicatrizado resistente com poucas células, rico em colagénio, constitui a fase final do processo de cicatrização da ferida, sendo este um processo que pode durar semanas ou mesmo meses.

Como um tecido cicatrizado não apresenta as caracteristicas originais, na cura de tecidos moles fala-se de reparação, não de regeneração (Bennet NT., et al., Am. J. Surg., 1993, 165: 728-737; Bennet NT, et al., Am. J. Surg., 1993, 166: 74-81).

No entanto, existem perturbações do processo de cura da ferida que podem ter inúmeras origens. A hiperglicémia impede a cura da ferida possivelmente devido a uma inibição da proliferação de células endoteliais e de fibroblastos (Goodson WH, J. Surg. Res., 1977, 22: 221-227). Além disso, valores de açúcar no sangue elevados fazem diminuir a função dos leucócitos, permanecendo a ferida na fase de inflamação durante mais tempo. Além do 5 ΡΕ1351697 mais, o grau de gravidade do traumatismo também pode ser um motivo para o desfavorável desenrolar da cura da ferida (Holzheimer RG, 1966, Zentralbl. Chir., 121: 231).

Em oposição à formação de um tecido cicatrizado, em lesões de tecidos moles (reparação), no caso de fracturas de ossos ou transplante de ossos, ocorre uma completa reconstrução da estrutura de tecidos original (regeneração). Em principio, os processos regenerativos dos ossos assemelham-se aos esquemas de cura de lesões de tecidos moles: imediatamente após a lesão ocorre, entre outros, a libertação de PDGF e TGF-β através dos trombócitos desgranulantes, seguindo-se a migração dos macrófagos e de outras células de inflamação, que segregam igualmente PDGF e TGF-β, mas também factor de crescimento de fibroblastos (FGF), interleucina-1 (IL-1) e IL-6. Em geral, parte-se do principio que esta acção complexa dos factores de crescimento em conjunto com a estrutura de fibrina formada representa o passo inicial do processo de cura dos ossos, em que os tecidos circundantes, como, a medula óssea, o periosteo e as partes moles participam activamente na regeneração.

Além da reorganização des células da medula óssea em zonas de diferentes densidades, os osteoblastos que revestem os ossos e os pré-osteoblastos do cambium são estimulados para a divisão e diferenciação celular. Os novos ossos do plexo formados através destes processos são designados como calos duros. Além da ossificação directa, 6 ΡΕ1351697 ocorre a migração de células mesenquinais indiferenciadas a partir do periosteo e de fibroblastos provenientes de tecidos moles circundantes ao hematoma. Após uma fase de divisão extensiva forma-se um tecido cartilaginoso, o calo macio, cujas células hipertrofiam, mineralizam e após a proliferação vascular são substituídas por ossos do plexo. 0 último passo para o completo restabelecimento da estrutura óssea original é a reconstrução dos ossos do plexo obtendo-se ossos lamelares através dos osteoblastos/da acção dos osteoblastos. Este processo é indirectamente designado por ossificaçao, visto a cartilagem formada só necessitar de ser substituída pelos ossos (Barnes et al., JBMR, 1999, 11: 1805-1815). A consolidação de fracturas de ossos nem sempre está isenta de problemas: infecções, doenças sistémicas (por exemplo, osteoporose) , doenças do sistema metabólico (por exemplo, diabetes mellitus), defeitos genéticos (por exemplo, osteogenese imperfeita) e tratamentos medicamentosos (terapia com glucocorticóides) podem ser a causa de uma regeneração mais lenta.

Além da consolidação das fracturas, o transplante de ossos autólogos e de material de substituição de ossos tem cada vez maior importância em métodos aumentativos ou para preenchimento de defeitos ósseos. Também neste caso seria desejável uma regeneração mais rápida e uma melhor "qualidade dos ossos". 7 ΡΕ1351697

As verdadeiras causas de uma lenta ou da ausência de regeneração óssea não são conhecidas. Da WO 91/13905, da WO 91/04035, da WO 91/16009, da US-A-5165938 e da US-A 5178883 são conhecidos factores de crescimento libertados pelos trombócitos para cura de feridas que podem ser utilizada. A activação dos trombócitos é, por exemplo, conhecida da WO 86/03122. Na activação são libertados factores de crescimento pelos fibroblastos e células musculares. O produto obtido por activação pode ser processado com um veiculo, por exemplo colagénio microcristalino, obtendo-se uma pomada.

De acordo com a WO 90/07 931 esta pomada também pode ser utilizada para ajuda do crescimento de cabelo. A WO 00/15248 descreve uma formulação que contém factores de crescimento dos trombócitos, fibrina e um outro polimero. Esta formulação pode ser utilizada para cura de lesões de tecidos que são caracterizados por uma deficiente irrigação sanguínea e/ou diminuta capacidade de regeneração, sendo estes tecidos, em especial, cartilagem fibrosa elástica ou hialina e tecidos fasciais. A cartilagem das articulações é um tecido avas-cular com um potencial de regeneração limitado. Nenhum dos métodos actualmente utilizados para renovação da cartilagem das articulações de doentes com osteoartrose pode ser ΡΕ1351697 considerado como satisfatório. Actualmente está a ser utilizado um método em que células de cartilagens autólogas são expandidas ex vivo e, em seguida, são colocados no defeito sob uma membrana periosteal (Brittenberg M., NEJM, 1994). A presente invenção tem como objectivo colocar à disposição um medicamento com uma acção melhorada na regeneração de tecidos, em especial tecidos ósseos. 0 medicamento da invenção é caracterizado por - conter microparticulas provenientes de trombócitos e que são obtidas através de um tratamento activante de trombócitos com trombina, colagénio, o ionóforo Ca2+ A23187 e/ou a proteína C5b-9, em solução aquosa, e serem purificadas por centrifugação diferencial, filtração ou cromatografia de afinidade; - serem submetidas a um método de inactivação e/ou redução de vírus; - a esterilidade ser obtida por filtração estéril, e - se encontrar na forma liofilizada ou ultracongelada. A invenção baseia-se no conhecimento de que as microparticulas libertadas das células eucarióticas estimularem, isto é, promoverem a proliferação de fibroblastos, osteoblastos e células cartilaginosas. Neste caso, as microparticulas podem ser de origem homologa. Sob a designação de microparticulas entendem-se todos os componentes 9 ΡΕ1351697 celulares, que se conseguem separar a partir de uma suspensão aquosa recorrendo aos métodos conhecidos da literatura (por exemplo, centrifugação a 100 000 x g / 2 h; Forlow SB, Blood, 2000) . As microparticulas assim separadas por centrifugação podem ser submetidas a um método para redução e/ou inactivação os virus. Na prática, o medicamento pode conter factores de crescimento. O medicamento da invenção pode ser produzido submetendo os trombócitos a um tratamento de activação, num meio aquoso, de modo a libertar as microparticulas que estimulam a regeneração, sendo, em seguida, o meio aquoso que contém as microparticulas libertadas centrifugado de modo a que os componentes celulares maiores sedimentem. Os componentes particulados do sobrenadante aquoso obtido são submetidos a um segundo passo de centrifugação, a um valor de g elevado (por exemplo, 100 000 x g) e submetidos a um método para redução e/ou inactivação de virus. Um exemplo de um tratamento de activação é o contacto dos trombócitos com trombina, colagénio, o ionóforo Ca2+ A23187 e/ou a proteína C5b-9 do sistema complemento. O medicamento da invenção encontra-se no estado ultracongelado ou liofili-zado. O medicamento da invenção também permite uma aplicação repetida, sendo que, deste modo, a elevada concentração de microparticulas resultante na área lesionada possibilita uma mais rápida formação de tecidos de gra- 10 ΡΕ1351697 nulação. Simultaneamente, pode ser administrada uma matriz extracelular provisória de materiais orgânicos (por exemplo, fibrina, colagénio, poliactonas, etc.) ou de materiais inorgânicos (fosfato de cálcio, etc.), que actuam como veiculo para os factores de crescimento e como suporte para as células migradas. A ligação covalente do medicamento da invenção à matriz acima referida pode ser efectuada através de transglutaminases. É também possível incorporar superfícies metálicas no medicamento da invenção.

Para a redução e/ou inactivação da carga virai são adequados os métodos combinados físicos, químicos ou físico-químicos conhecidos no actual estado da técnica. A esterilidade do medicamento da invenção pode ser conseguida por obtenção do concentrado celular estéril e posterior tratamento asséptico ou por esterização por filtração. A obtenção das micropartículas, a produção do medicamento da invenção e o seu efeito em células osteo-blásticas é, em seguida, explicada em mais pormenor através de exemplos. ΡΕ1351697 11

Obtenção de micropartículas

Um concentrado de trombócitos (2 x 109 células) é misturado com um excesso de tampão de tirode (pH 6,4) e centrifugado, a 1200 x g, durante 10 minutos. O sobrena-dante é removido, o resíduo de trombócitos é resuspendido em 2 ml de DMEM/F12-ITS e incubado, durante 30 minutos, à temperatura ambiente, com 10 μΜ de ionóforo Ca2+ A23187 (Sigma). Através deste tratamento são obtidas as micropar-tículas dos trombócitos.

Segue-se uma nova centrifugação, durante 10 minutos, a 1200 x g, na qual se forma um resíduo e um sobrenadante. O sobrenadante (= sobrenadante de trombócitos) que contém as micropartículas libertadas dos trombócitos é removido e novamente sujeito a um processo de centrifugação.

Neste caso, as micropartículas libertadas dos trombócitos por activação são centrifugadas, durante 1 hora, a 14 000 x g e a 4°C, e o resíduo formado (= resíduo de micropartículas) é resuspendido em 2 ml de DMEM/F12-ITS.

Para a obtenção das micropartículas, em vez do ionóforo Ca A23187 acima referido, podem ser utilizados trombina (Baxter, Áustria) ou outros agentes acima referidos . 12 ΡΕ1351697

Inactivação dos vírus do sobrenadante dos trom-bócitos (inactivação fotodinâmica de vírus) A 50 ml de uma suspensão de micropartículas produzidas de acordo com o método acima descrito é adicionado 8-metoxipsoral (dissolvido em dimetilsulfóxido [DMSO]) até obtenção de uma concentração final de 300 pg/ml (concentração final em DMSO de 0,3%) e é irradiado, a uma temperatura entre 22°C e 27°C sob atmosfera de 5% de CO2 e 95% de N2, a uma pressão de 2 psi, durante seis horas, com radiação ultravioleta aplicada por cima e por baixo, de modo que a intensidade de radiação total se situe entre 3,5 mW/cm2 e 4,8 mW/cm2 (Lin L., et al., Blood, 1989). Deste modo, é efectuada a inactivação da carga virai da suspensão de micropartículas.

Após ser efectuada a inactivação da carga virai, a suspensão é ultracongelada ou liofilizada como se descreve seguidamente.

Ultra congelação: Cada 1 ml de suspensão de micropartículas é congelado por choque térmico a -80°C, durante 30 a 40 minutos. Antes da utilização a preparação é descongelada à temperatura ambiente.

Liofilização: Cada 1 ml da suspensão de micropartículas é ultracongelada a -80°C, durante pelo menos 24 horas e, em seguida, liofilizado, sob vávuo, a uma 13 ΡΕ1351697 temperatura entre -20°C e -40°C durante 20 a 24 horas. O resíduo da liofilização é armazenado a uma temperatura entre -20°C e -80°C e, antes de utilização, é rehidratado com meio DMEM/F12.

Inactivação dos vírus de uma matriz extracelular provisória, que contém substâncias de suporte (inactivação química de vírus) A inactivação dos vírus de matrizes às quais foi adicionada uma suspensão de micropartícuias produzidas de acordo com o método acima descrito, é efectuada através do método de solvente-detergente. Para tal, a uma suspensão de matrizes é adicionada, a 30°C, 1% (m/m) de tri-(n-butil)fosfato e 1% (m/m) de Triton X-100, sendo a mistura agitada durante quatro horas. Em seguida, a mistura de solvente-detergente é removida da suspensão de biomaterial por cromatografia numa coluna C18 (Waters, Millipore) com adição de óleo de sementes de soja (5% (v/v)) (Horowitz B., et al., Blood, 1992, 79: 826-831; Piet MP., et al., Transfuslon, 1990, 30: 591-598; Piquet Y., et al., 1992, 63: 251-256).

As matrizes tratadas com o processo químico de inactivação da carga virai acima descrito podem, em seguida, sofrer ainda uma inactivação da carga virai por um processo fotodinâmico. ΡΕ1351697 14

Cultivo de osteoblastos humanos A obtenção de osteoblastos primários humanos pode ser efectuada a partir de fragmentos de ossos com uma dimensão de cerca de 1 mm3 a 5 mm3. Para tal, os fragmentos de ossos são lavados com uma solução tampão salina de fosfato (PBS) e cultivados, durante 2 a 3 semanas, a uma temperatura de 37°C, humidade do ar de 95% e CO2 5%. Como meio de cultura é utilizado DMEM/F12 com adição de 10% de soro fetal bovino (FBS), antibióticos e fungicidas.

Os osteoblastos crescidos obtidos a partir dos fragmentos de ossos são removidos dos frascos de cultura celular com tripsina (2,5%) e, após uma diluição 1:3, são passados nas mesmas condições (passagem 1). Este processo é repetido por duas vezes para multiplicação das células. Os meios e aditivos podem ser obtidos da Life Technologies, Grand Island, NY, USA.

Para a subsequente estimulação da proliferação dos osteoblastos com as micropartículas obtidas a partir dos trombócitos, os osteoblastos são ajustados a uma densidade celular de 10 000 células/cm2 em microplacas (Packard, Meriden, CT, USA) e pré-cultivados, durante 2 a 4 dias, em meio completo que, para efeitos de testes, é substituído por meio isento de soro. Neste caso, trata-se de meio DMEM/F12 ao qual, em vez de FBS, é adicionada uma mistura de insulina/transferrina/selénio a 5 mg/ml (ITS, Boehringer Mannheim, Alemanha). ΡΕ1351697 15

Cultivo de fibroblastos humanos A obtenção de fibroblastos primários humanos pode ser efectuada a partir de bocados da mucosa oral. Para tal, os pedaços da mucosa oral são lavados com uma solução tampão salina de fosfato (PBS) e cultivados, durante 2 a 3 semanas, a uma temperatura de 37°C, humidade do ar de 95% e CO2 5%. Como meio de cultura foi utilizado DMEM/F12 com adição de 10% de soro fetal bovino (FBS), antibióticos e fungicidas. Os fibroblastos crescidos (fibroblastos gengivais) obtidos a partir dos pedaços da mucosa oral foram removidos dos frascos de cultura celular com tripsina (2,5%) e, após uma diluição 1:3, foram passados nas mesmas condições (passagem 1). Este processo foi repetido por duas vezes para multiplicação das células. Os meios e aditivos podem ser obtidos da Life Technologies, Grand Island, NY, USA.

Cultivo de condrócitos humanos A obtenção de condrócitos primários humanos pode ser efectuada a partir de pedaços de cartilagem das articulações. Para tal, os pedaços de cartilagem são lavados com PBS, fragmentados e as células são libertadas por digestão com uma solução de colagénio B (0,4% (m/v),

Boehringer Mannheim, Alemanha). Os restantes passos estão acima descritos (F. Héraud, Ann Rheum Dis, 2000) . ΡΕ1351697 16

Actividade miótica das micropartlculas

As preparações de micropartículas obtidas pelo método acima descrito foram analisadas relativamente à sua actividade miótica.

Para a determinação da actividade biológica, as preparações foram diluidas na razão 1:5 em DMEM/F12-ITS. A diluição assim obtida é designada por primeira diluição (I) e corresponde a uma concentração em microparticulas que foi obtida a partir de um número de trombócitos original de 2 x 108 células/ml. A partir de uma parte da primeira diluição (I) é efectuada, por sucessivas diluições, uma diluição seriada na razão de 1:5, a que correspondem sobrenadantes de 4 x 107 células/ml (segunda diluição II), 8 x 106 células/ml (terceira diluição III), 1,6 x 106 células/ml (quarta diluição IV) e 3,2 x 105 células/ml (quinta diluição V).

Estimulação da proliferação de osteoblastos É efectuado um ensaio de proliferação de osteoblastos utilizando as cinco diluições obtidas nos passos I, II, III, IV e V como em seguida descrito: 4 x 100 μΐ de cada uma das diluições são cultivadas com osteoblastos durante 24 horas. Durante as 6 17 ΡΕ1351697 últimas horas é efectuada a adição de 1 μΟι [ H] -timidina/ponto, cuja velocidade de incorporação é considerada como uma medida para a proliferação dos osteoblas-tos. A radioactividade absorvida é determinada através de cintilação do liquido (Packard). Como controlo utiliza-se DMEM/F12-ITS, sendo o valor assim obtido considerado como 100%. A figura 1 mostra a proliferação dos osteoblastos obtidos com os passos de diluição I a V e com o controlo. A figura 1 documenta uma proliferação de osteoblastos dependente da dosagem, em que para as maiores concentrações (passo de diluição I) é incorporado cerca de 3 a 7 vezes mais [3H]-timidina no DNA que no controlo sem microparticulas.

Estimulação da proliferação de fibroblastos

Os fibroblastos com as cinco diluições obtidas nos passos I, II, III, IV e V são estimulados como acima descrito: A figura 2 documenta uma proliferação celular dependente da dosagem, em que para as maiores concentrações (passo de diluição I) é incorporado cerca de 2 a 3 vezes mais [3H]-timidina no DNA que no controlo sem microparticulas. (Barra preta: Microparticulas do dador A; barra branca: microparticulas do dador B). ΡΕ1351697 18

Estimulação da proliferação de condrócitos

Os condrócitos com as cinco diluições obtidas nos passos I, II, III, IV e V são estimulados como acima descrito: A figura 3 documenta uma proliferação celular dependente da dosagem, em que para as maiores concentrações (passo de diluição I) é incorporado cerca de 2 a 3 vezes mais [3H]-timidina no DNA que no controlo sem micropar-tícuias. (Barra preta: Microparticulas do dador A; barra branca: microparticulas do dador B).

Estimulação da diferenciação das células osteo- blásticas

As células osteoblásticas com as cinco diluições obtidas nos passos I, II, III, IV e V são estimuladas como de seguida descrito: 4 x 100 μΐ de cada um dos passos de diluição são cultivados, durante 4 dias, com células osteoblásticas. Em seguida, as células são lavadas com PBS e lisadas com 100 μΐ de uma solução de Triton X-100 a 0,5%. De cada um dos lisados são retirados 20 μΐ para a determinação da proteína total (Gruber R., Cytokine, 2000) . A actividade enzimática determinada é normalizada relativamente à quantidade de proteína. Este método serve para determinação da diferenciação de osteoblastos. Como controlo é utilizado 19 ΡΕ1351697 DMEM/F12-ITS, sendo o valor assim obtido considerado como 100%. A figura 4 mostra uma estimulação da diferenciação das células osteoblásticas no passo de diluição I. A actividade da fosfatase alcalina é cerca de 80% superior à actividade no grupo de comparação sem microparticulas.

Ligação de microparticulas a uma matriz extra-celular provisória, que contém substâncias de suporte Às suspensões de microparticulas, estéreis e cuja carga virai foi inactivada, produzidas de acordo com o método acima descrito, é adicionada uma solução de uma matriz extracelular provisória, que contém as substâncias de suporte. Neste caso, tanto se pode tratar de biomate-riais reticuláveis (fibrinogénio, fibronectina, factor de coagulação XIII, colagénio), que podem ter sidos submetidos a um ou mais processos de inactivação da carga virai, como de materiais orgânicos (por exemplo, poli-lactonas) ede materiais inorgânicos (por exemplo, fosfato de cálcio). Os componentes podem ser utilizados individualmente ou combinados entre si. A razão de mistura da suspensão de microparticulas com a matriz extracelular deve ser, de preferência, 1:3. De modo a obter uma durabilidade adequada, a mistura assim obtida é ultracongelada ou liofi-lizada de acordo com o método acima descrito. 20 ΡΕ1351697

Em vez do processo de inactivação da carga virai descrito para cada um dos componentes individuais, também é possível efectuar a inactivação da carga virai da mistura da suspensão de micropartículas e da matriz adicionada.

Além disso, existe a possibilidade das micropartículas serem ligadas às matrizes acima referidas por ligações covalentes através de transglutaminases.

Lisboa, 13 de dezembro de 2013

Claims

ΡΕ1351697 1 REIVINDICAÇÕES 1. Medicamentos para utilização local para estimulação da regeneração de tecidos, caracterizados por: - conterem microparticulas provenientes de trombócitos e que são obtidas através de um tratamento activante dos trombócitos com trombina, colagénio, o ionóforo Ca2+ A23187 e/ou a proteina C5b-9, em solução aquosa, e serem purificados por centrifugação diferencial, filtração ou cromatografia de afinidade; - serem submetidas a um método de inactivação e/ou redução da carga virai; - a estelidade ser obtida por filtração estéril; se encontrarem na forma liofilizada ou ultracon-gelada.
2. Medicamentos de acordo com a reivindicação 1 caracterizados por conterem substâncias, solúveis ou insolúveis, que promovem a cura.
3. Medicamentos de acordo com a reivindicação 1 ou com a reivindicação 2 caracterizados por conterem citocina e/ou factores de crescimento.
4. Medicamentos de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizados por conterem uma substância que seja ou possa formar uma matriz extracelular provisória . 2 ΡΕ1351697
5. Medicamentos de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizados por conterem colagénio.
6. Medicamentos de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizados por conterem fibrinogénio e trombina para formação do suporte de fibrina.
7. Medicamentos de acordo com a reivindicação 4, caracterizados por conterem como matriz extracelular provisória um polímero orgânico, em especial uma poli-lactona.
8. Medicamentos de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizados por conterem compostos inorgânicos .
9. Um produto farmacêuto caracterizado por apresentar - um medicamento de acordo com uma das reivindicações 1 a 8 e um material biocompatível que é utilizado con-juntamente com o medicamento. Lisboa, 13 de dezembro de 2013