SK16332001A3 - Liečivo na lokálnu aplikáciu obsahujúce fibrinogén, trombín, tranglutaminázové a proteinázové inhibítory - Google Patents

Description

Liečivo na lokálnu aplikáciu obsahujúce fibrinogén, trombín, transglutaminázové a proteinázové inhibítory

Oblasť techniky

Vynález sa týka liečiva na lokálnu aplikáciu obsahujúce fibrinogén, trombín, transglutaminázové a proteinázové inhibítory.

Doterajší stav techniky

Uzatvorenie rany a s ním súvisiace zastavenie krvácania fyziologicky prebieha zrážaním vytekajúcej krvi v ložisku rany, čím príde k uzatvoreniu malých krvných ciev a kapilár. Týmto začínajúce hojenie rany sa uskutočňuje pomocou provizórnej extracelulárnej matrice (ECM), ktorá sa tvorí zrazenou krvou (Clark, R. A. F et al., 1982, J. Invest. Dermatol. 70:264-269; Clark, R.A.F. (ed.), 1996, The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair, Plénum Press, New York). Táto matrica pozostáva, odhliadnuc . od krvných buniek, v podstate z fibrínu ako stavebnej substancie, ktorá slúži ako rezervoár radu plazmatických proteínov, ktoré majú význam pre začatie hojenia rany, ako fibronektín (Mosesson, M. W. und Umfleet, R., 1970, J. Biol. Chem. 245:5726-5736; Clark, R. A. F. etal., 1982, J. Invest. Dermatol. 70:264-269), vitronektín (Preissner, K. T. und Jenne. D., 1991, Thromb. Haemost. 66:189-194), plazminogén (Castellino, F. J. et al., 1983, Ann. NY Acad. Sci. 408:595-601), aktivátor plazminogénu (Thorsen, S. et al., 1972, Thromb. Pathol. Haemost. 28:65-74), inhibítor aktivátora plazminogénu (Wagner, O.F. et al., 1989, Blood 70:1645-1653), a inhibítor a₂ - plazmínu (Sakata, Y. und Aoki, N., 1980, J.Clin. Invest. 65:290-297).

Množstvo aktivátora plazminogénu, inhibítora aktivátora plazminogénu a inhibítora a2-plazmínu a ich vzájomný pomer vykonávajú podstatnú kontrolu nad nasledujúcim rozkladom fibrínu. V tejto stavbe fibrínu sa však nachádzajú ešte ďalšie substancie, ako napríklad trombín, TGF-beta a PDGF, ktoré sú potrebné na presun buniek a viacnásobnú zmenu provizórnej ECM na konečnú ECM s príslušnými bunkovými populáciami.

-2.Ako prvé sa vo veľkom množstve presúvajú do oblasti rany a uzatvárania rany granulocyty. Tieto uvoľňujú rôzne, pre začínajúci proces hojenia rany dôležité substancie, najmä kolagenózy a elastázy, a narušujú mimobunkové a vnútrobunkové mikroorganizmy, ktoré sa dostali do oblasti rany a môžu sa tam rozmnožovať. Zatiaľ čo sa končí presúvanie granulocytov, objavujú sa v oblasti rany rozmnožené monocyty včítane makrofágov. Na tretí deň dochádza v oblasti rany k vyklíčeniu fibroblastómov, ktoré sa cez povrazce fibronektínu dostanú až na povrch uzatvárania rany. Po vyklíčení krvných kapilár dochádza nasledovne k radu bunkových zmien a reformačných procesov, ktoré vo väčšine prípadov majú zase za následok úplnú integritu poraneného tkaniva (Clark, R.A.F. (ed.), 1996, The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair, Plénum Press, New York).

Prvé pokusy uzatvárania rán pomocou krvnej plazmy, ktoré sa vykonali v rokoch 80 až 90, boli neúspešné pre relatívne nízku viskozitu v porovnaní s krvou, nepatrné prilipnutie v ložisku rany a pre vysokú lámavosť v danom prípade z plazmy vytvárajúcej sa zrazeniny zo zrazenej plazmy.

Používanie obohatených roztokov fibrinogénu namiesto plazmy na zastavenie krvácania a na uzatvorenie rany bolo spočiatku tiež bezúspešne, konečne mohol byť predsa dosiahnutý podstatný úspech zvýšením koncentrácie fibrinogénu roztokov viac ako 10násobnú hladinú fibrinogénu v plazme (Lôblich, 1975, nepublikované oznámenie).

Pri transformácii fibrinogénu na fibrín existuje možnosť, že hemostaticky účinné fibrínové uzatvorenie rany sa po niekoľkých hodinách oddelí vplyvom enzýmov ložiska rany a tým dôjde k následnému krvácaniu. Oddelenie fibrínového uzatvorenia rany od ložiska rany je v podstate častejším a preto nebezpečnejším procesom ako fibrinolýza celého fibrínového uzatvorenia rany.

Už pri prvých úspešných použitiach vysokokoncentrovaných roztokov fibrinogénu (Matras, H. et al., 1972, Wr. Med. Wschr. 122:517-523) a transformácii fibrinogénu na fibrín prostredníctvom trombínu v oblasti rany sa ukázalo, že je možné pomocou inhibítorov fibrinolýzy vyhnúť sa oddeleniu fibrínového uzatvorenia rany a tým zväčša nastupujúcemu následnému krvácaniu. Zo skúšaných nízkomolekulámych inhibítorov by za účinné mohli byť považované kyselina ε-aminokapronová a jej deriváty, tieto však majú tú nevýhodu, že rýchlo difundujú zo zrazeného fibrínu a z oblasti rany a tým strácajú svoju lokálnu účinnosť.

•Ο _-r? _

Pridanie vysokomolekulárnych inhibítorov, ako napríklad aprotinin (trasylol), by mohlo byť úspešne uskutočnené, pričom dochádza len k pomalej difúzii inhibítora z oblasti rany, avšak s tou nevýhodou, že pritom ide o bovinný a xenogénny inhibítor proteáz, ktorý môže vyvolať potenciálne alergie a anafylaxie. Najnovšie boli vyslovené námietky proti použitiu zvieracích materiálov pre parenterálnu aplikáciu u ľudí kvôli potencionálnej schopnosti prenosu zoonóz.

Vo WO - A - 99/11301 bolo navrhnuté použiť miesto aprotininu inhobítory elastázy, alebo iné inhibítory účinné proti leukocytovým proteázam. Tento návrh má však podľa poznatkov vynálezcu predmetného vynálezu rôzne nevýhody. Tieto inhibítory sú síce priamo alebo nepriamo účinné prostredníctvom inhibície enzýmov, ktoré môžu aktivovať fibrinolytický systém, môžu však narúšať začatie liečenia rany po vniknutí granulocytov do oblasti rany silným potlačením granulocytmi uvoľnených proteáz, ako kolagenózy a elastázy.

Ďalšia obťažnosť pri výrobe farmaceutických liečiv, obsahujúcimi fibringén a trombín, ktoré obsahujú alogénny proteinázový inhibítor a transglutaminázový zymogén, je daná už dlhšiu dobu požadovanou vírusovou inaktiváciou takéhoto prípravku. Pri vírusovej inaktiváčii sa stráca zväčša veľký podiel aktivity v prípravku obsiahnutého proteinázového inhibítora, prípadne transglutaminázového zymogénu, takže po uskutočnení procesu vírusovej inaktivácie získané prípravky vykazujú často len nepatrnú aktivitu proteinázového inhibítora, prípadne transglutaminázového zymogénu. Týmto môže dôjsť v ložisku rany k nedostatočnému potlačeniu v ložisku rany existujúcich fibrinolytických enzýmov a následkom toho k oddeleniu fibrínového uzatvorenia rany z ložiska rany.

Podstata vynálezu

Predložený vynález si preto vytýčil úlohu, dať k dispozícii liečivo, ktoré možno lokálne použiť na zastavenie krvácania a/alebo uzatvorenie rany a/alebo podporu hojenia rany, pričom sa vyhne použitiu xenogénneho proteinázového inhibítora, a predsa má byť po nanesení liečiva dané postačujúce brzdenie fibrinolytických enzýmov v ložisku rany, takže nedôjde k žiadnemu oddeleniu fibrínového uzatvorenia rany z ložiska rany. Liečivom sa má ďalej čo možno najviac zabrániť narušeniu začiatku liečenia rany následkom potlačenia po vniknutí granulocytov do oblasti rany uvoľnených proteáz, ako kolagenózy a elastázy.

-VTáto úloha je vyriešená pre liečivo, ktoré má účinné látky - vyrobené konvenčné z alogénnej plazmy alebo tkaniva alebo génovým inžinierstvom - fibrinogén, prípadne fibrín, trombín a jednu alebo viacero transglutamináz, tým že liečivo obsahuje ako ďalšiu účinnú látku jeden alebo viacero proteinázových inhibítorov, ktoré sú vybrané zo skupiny serpín, ktoré nemajú žiaden spomaľujúci účinok na kolagenózy a elastázy, pričom všetky účinné látky majú alogénny pôvod a sú podrobené procesu deštrukcie vírusov a/alebo vírusovej inaktivácii, s ustanovením, že vírusová inaktivácia jedného alebo viacerých proteinázových inhibítorov nie je uskutočňovaná v prítomnosti iných účinných látok.

Použitím serpín, ktoré nemajú žiadny spomaľujúci účinok na kolagenózy a elastázy, ako proteinázové inhibítory bude sa ďalej zabraňovať spomaľovaniu proteáz, ktoré sú uvoľňované granulocytmi vnikajúcimi do oblasti rany, takže nie je obmedzované začatie hojenia rany liečivom podľa vynálezu.

Predkladaný vynález sa zakladá na poznatku, že inhibujúca aktivita alogénnych proteinázových inhibítorov zostane podstatne lepšie zachovaná, keď sa nepodrobia vírusovej inaktivizácii v prípravku, ktorý má jeden alebo viacej iných účinných látok liečiva, ale sa vírusovo inaktivujú oddelene od iných účinných látok. Týmto spôsobom je' možné vyrábať liečivá podľa vynálezu, ktoré obsahujú vírusovo inaktivované alogénne proteinázové inhibítory s postačujúcou aktivitou, takže fibrinolytické enzýmy v ložisku rany sú po nanesení liečiva spomaľované a je zabránené oddeleniu fibrínovému uzatvoreniu rany z ložiska rany.

V tejto súvislosti sa poukazuje na skutočnosť, že pojem „vírusová inaktivácia“, ktorý je použitý pri predloženom vynáleze, neobsahuje postupy, ktoré spôsobujú len deštrukcia vírusov.

Liečivo podľa vynálezu obsahuje ako účinnú látku okrem iných fibrinogén, prípadne fibrín. Pod tým je potrebné rozumieť, že v liečive je predkladaný podľa spôsobu použitia alebo fibrinogén ako taký, alebo z fibrinogénu pôsobením trombínu vzniknutý fibrín.

Predmetom vynálezu je teda zložené liečivo, ktoré predstavuje sterilnú, vírusovo bezpečnú, pomaly vstrebateľnú a reformovateľnú alogénnu, provizórnu extracelulárnu matricu, prípadne vytvorí takú, ktorú možno lokálne použiť alebo sa len lokálne vytvorí. Nakoľko účinné látky tohoto liečiva majú vysokomolekulárny charakter, a preto sú potencionálnymi antigénmi, sú pri výrobe týchto liečiv používané len alogénne účinné látky - vo vzťahu k osobitosti, pri ktorej má byť toto liečivo použité.

Alogénna, provizórna extraceluláma matrica umožňuje pri jej výrobe prípadne nanášaní prostredníctvom prísad ďalších alogénnych, vírusovo bezpečných účinných látok riadenie hojenia rany, predovšetkým tým, že tieto účinné látky sa stavebnou substanciou stávajú imobilnými prostredníctvom transglutamináz a môžu pôsobiť alebo v imobilnom stave, prípadne môžu byť uvoľnené v rámci procesu vstrebávania a reformovania.

Alogénne transglutaminázy, ktoré sa nachádzajú v liečive podľa vynálezu, napríklad faktor XHIa, spôsobujú, že sú alogénne proteinázové inhibítory kovalentne viazané na fibrín, čím prakticky nedochádza k difúzii inhibítorov z oblasti rany.

Spôsob uskutočnenia liečiva podľa vynálezu, ktorému sa dáva prednosť, sa vyznačuje tým, že všetky účinné látky sú k dispozícii v jedinom farmaceutickom prípravku ako alogénna, provizórna extraceluláma matrica, ktorá je napríklad vytvorená v tvare gélu. Liečivo je v tomto tvare spôsobilé na lokálne nanášanie.

Účinné látky môžu byť účelne k dispozícii aj v dvoch alebo viacerých oddelených farmaceutických prípravkoch na zmiešanie pred alebo počas použitia, pričom získaná zmes môže byť nanášaná v tekutej forme alebo až po jej spevnení. Prípravky môžu byť k dispozícii v tekutej forme alebo zmrazené alebo vysušené vymrazóvaním/lyofilizované na roztopenie, prípadne rekonštitúciu pred zmiešaním.

Farmaceutické prípravky môžu byť napríklad zmiešané najmenej desať minút pred nanesením na povrch rany, po čom dochádza ku spevneniu zmesi vytvorením pomaly vstrebáteľnej a reformovateľnej, alogénnej provizórnej exracelulárnej matrice, ktorá je nanesená na povrch rany. Farmaceutické prípravky môžu byť však aj zmiešané a tekutá zmes môže byť bezprostredne po tom, napríklad aj vo forme spreja lokálne nanášaná, takže sa vytvorí pomaly vstrebateľná, reformovateľná, alogénna provizórna extraceluláma matrica.

Dáva sa prednosť tomu, že koncentrácia fibrinogénu a proteinázových inhibítorov je v liečive tak zvolená, že tekutá zmes obsahuje najmenej 30 g/1 fibrinogénu a 500 arbitrárnych plazmových jednotiek proteinázových inhibítorov na liter.

Predovšetkým existujú fibrinogén a trombín vždy v oddelených farmaceutických prípravkoch, pričom ostatné účinné látky sú obsiahnuté navzájom nezávisle v jednom alebo v obidvoch prípravkoch a/alebo v ďalšom prípravku.

Zodpovedajúcim zložením farmaceutického prípravku obsahujúceho trombín je možné podľa vynálezu generovať vo vytvorenom fibríne až niekoľko hodín po

- c zmiešaní s roztokom obsahujúcim fibrinogén a po spevnení zmesi ešte významné množstvo trombínu. Toto je veľmi dôležité nielen pre stabilitu, ale aj pre kvalitu takto vytvorenej alogénnej, provizórnej extracelulárnej matrice.

V liečivách podľa vynálezu existujúce farmaceutické prípravky môžu byť s výhodou nanesené na alogénnych alebo biokompatibilných nosných materiáloch, ktoré boli podrobené procesu deštrukcie vírusov a/alebo vírusovej inaktivácie. Nosné materiály môžu mať rôzne formy podľa účelu aplikácie. Výroba liečiva pripraveného na použitie sa môže napríklad uskutočniť nanesením ešte tekutej zmesi farmaceutických prípravkov na nosný materiál.

Forma uskutočnenia liečiva podľa vynálezu, ktorej sa dáva prednosť, sa vyznačuje tým, že obsahuje ako ďalšiu účinnú látku alogénne kolagény, ktoré sú podrobené procesu deštrukcie vírusov a/alebo procesu vírusovej inaktivácie. Prídavné použitie kolagénov pri výrobe, prípadne vytvorení alogénnej provizórnej axtracelulámej matrice má za následok značné zvýšenie biomechanickej kvality.

Účelne obsahuje liečivo podľa vynálezu jeden, alebo viacero ďalších alogénnych, procesu deštrukcie vírusov a/alebo procesu vírusovej inaktivácie podrobených účinných látok, ktoré sú vybrané zo skupiny fibronektínu, vitronektínu, trombospondínu, tenascinu, lamininu a proteoglykánu. Pridaním substancií ako napríklad vitronektínu sa môže ešte dosiahnuť zlepšenie účinku určitých proteinázových inhibítorov.

Ďalej je výhodné, ako liečivo podľa vynálezu obsahuje jeden alebo viacero ďalších alogénnych, procesu deštrukcie vírusov a/alebo procesu vírusovej inaktivácie podrobených účinných látok, ktoré sú vybrané žo skupiny rastových faktorov, chemotaktických substancií, enzýmy stimulujúce bunky a/alebo podporujúcich proliferáciu a enzýmové inhibítory, enzýmy spomaľujúce proliferáciu a enzýmové inhibítory, cytokíny a partikulárne tvarované bunkové elementy. Použitie alogénnych enzýmových inhibítorov v súvislosti s uzatvorením rany ponúka možnosť dosiahnuť permanentnú liečbu pri kožnom vrede.

S výhodou obsahuje liečivo podľa vynálezu pridané alogénne plazmatické, prípadne z tkaniva získané enzýmy, zymogény a/alebo enzýmové inhibítory, podrobené procesu deštrukcie vírusov a/alebo procesu vírusovej inaktivácie.

Podľa klinickej požiadavky je účelné, aby liečivu podľa vynálezu boli pridané antiadherentné, antizápalové, antimikrobiálne a/alebo cytostatické účinné látky, ktoré sú

-ϊν prípade potreby podrobené procesu deštrukcie vírusov a/alebo procesu vírusovej inaktivácie. Pridanie antizápalových a antiadherentných, alogénnych účinných látok, ako napríklad určitého imunoglobulínu alebo iných s týmito účinkami v plazme sa vyskytujúcich účinných substancií, umožňuje použitie alogénnej, provizórnej extracelulárnej matrice aj tam, kde sa musíme obávať pooperačných adhézií.

Pri aplikácii liečiva vytvárajúca sa alebo ako taká existujúca alogénna, provizórna extraceluláma matrica môže pôsobiť ako rezervoár, prípadne usadenina substancií, ktorá sa má pomaly z matrice uvoľňovať. Uprednostňovaná forma uskutočnenia liečiva podľa vynálezu sa preto vyznačuje tým, že obsahuje prídavné účinné látky, ktoré sa majú pomaly vstrebávať a v prípade potreby sú podrobené procesu deštrukcie vírusov a/alebo vírusovej inaktivácie.

Výhodne sú vo, farmaceutickom prípravku obsahujúcom trombín liečiva podľa vynálezu obsiahnuté alogénne zymogény a/alebo enzýmy kaskády zrážanlivosti, ktoré sú podrobené procesu deštrukcie vírusov a/alebo vírusovej inaktivácie.

Prednostne obsahuje liečivo podľa vynálezu prídavné alogénne partikuláme bunkové prvky, bunky a/alebo tkanivo, ktoré môžu byť nanesené na vírusovo bezpečné mikrosféry, ktoré pozostávajú z alogénneho fibrínu a/alebo alogénneho kolagénu a/alebo alogénneho kolagénu s alogénnym bibrínom.

Ako nevýhoda doteraz známej farmaceutickej preparácie obsahujúcej fibrinogén, prípadne fibrín, je relatívne veľká fragilita vytvoreného fibrínu, zvlášť ak sú použité roztoky s vysokým precentuálnym obsahom fibrinogénu.

Prítomnosťou faktoru XHIa -transglutaminázy, ktorá sa vo farmaceutickom prípravku tvorí z v ňom sa nachádzajúcom faktore XIII prostredníctvom pôsobenia trombínu - síce pri zrážaní vznikajúci fibrín priečne zosieťuje, ale musia existovať alebo sa tvoriť vo fibríne vysoké koncentrácie trombínu a faktoru XIII, aby nastúpila pokračujúca kompletná reakcia medzi miestami zosietenia vo fibríne. Avšak takéto fibríny sú kvôli ešte vždy existujúcej fragilite ťažko použiteľné, a práve tak vykazujú lokálne vytvorené fibríny ako aj predtým nepatrnú mechanickú pevnosť.

Uprednostnená forma uskutočnenia liečiva podľa vynálezu sa preto vyznačuje tým. že sa alogénna, provizórna extraceluláma matrica spevňuje použitím tlaku a/alebo prostriedku na zbavenie vody. Pritom môže byť matrica ošetrená alogénnymi transglutaminázami pred, počas a/alebo po spevnení zbavením vody.

-g Takéto alogénne matrice môžu byť vzhľadom na postačujúcu mechanickú stabilitu používané aj ako arteficiálna alogénna koža. Takto je aj možné vyrobiť výlučne z ľudských substancií zhotovenú kožnú plastiku a nadväzne vniesť do takejto preparácie aj partikulárne bunkové prvky, bunky a tkanivo, ktoré poskytujú nové možnosti lekárskeho použitia.

S farmaceutickým prípravkom podľa vynálezu je tiež možné na tých miesta tela, kde prišlo k silnému odbúraniu vlastného telového tkaniva, vyplniť tieto miesta a dosiahnuť tým dlhodobé vyhojenie.

Koncentrované roztoky fibrinogénu majú rad nevýhod. Majú nepatrnú stabilitu pri skladovaní a musia byť pri skladovaní hlboko zmrazené alebo podrobené lyofilizácii a nemôžu byť vždy po rozmrazení, prípadne opätovnom rozpustení uspokojivo uvedené do použiteľného stavu, prípadne rekonštituované. Okrem toho si rozpustenie lyofilizátu fibrinogénu vyžaduje dlhší čas. Rozpúšťacie prostriedky alebo ľahko rozpustné fibrinogény sú vo väčšine prípadov pre bunky toxické a preto nepoužiteľné na nerušené hojenie rán.

Najväčším problémom pri skladovaní produktov obsahujúcich fibrinogén je nestabilita fibrinogénu, nakoľko stopy znečistenia s faktormi zrážanlivosti znamenajú pomalú transformáciu z fibrinogénu na nerozpustný fibrín, čo potom už nedovoľuje použitie takého farmaceutického preparátu.

Predložený vynález sa preto týka aj spôsobu výroby roztoku obsahujúceho fibrinogén, ktorý je sám osebe alebo ako zložka liečiv podľa vynálezu skladovateľný pri teplote v chladničke alebo pri izbovej teplote, pričom roztok fibrinogénu, prípadne roztok fibrinogén - fibronektínu je vyrobený z génovým inžinierstvom vyrobeného fibrogénu alebo z fibrinogénu získaného z plazmy frakcionáciou s glycínom pri teplotách pod 0°C.

Roztoky obsahujúce fibrinogén vyrobené podľa vynálezu sú stabilné a môžu byť skladované v tekutom stave so stabilizátormi alebo bez stabilizátorov viac ako dva roky pri teplote 4 °C - 8 °C, alebo zmrazené alebo lyofilizované bez toho, aby sa pritom vyzrážal nerozpustný fibrín, alebo aby vznikali rozkladné produkty fibrinogénu z plazmínu počas skladovania v takom rozsahu, že je narušená zrážateľnosť. Takéto roztoky sa nezrážajú ani po pridaní tromboplastínu a jedu vretenice, ani pridaním aktivovaného parciálneho tromboplastínu. Pri skladovaní v hlboko zmrazenom stave a po opätovnom roztopení fibrinogén obsahujúcich roztokov podľa vynálezu sa neindukujú žiadne procesy zrážania, r

(' a získané roztoky sú aspoň niekoľko hodín stabilné. Lyofilozované preparáty sú ľahko a úplne rekonštituovateľné príslušnými rozpúšťacími prostriedkami.

Predložený vynález dáva k dispozícii aj liečivo, ktoré obsahuje vysokočistý prípravok obsahujúci fibrinogén alebo fibrinogén - fibronektín, ktorého protrombínový aPTT čas a čas vretenicového jedu pri 37 °C nie je kratší ako 200, prípadne 300 sekúnd a ktorý má takú stabilitu, že môže byť skladovaný v tekutom stave so stabilizátorom alebo bez stabilizátora vyše dvoch rokov pri teplote 4 °C - 8 °C ako zložka liečiva alebo ako taký, alebo skladovaný zmrazený alebo lyofilizovaný bez toho, aby sa pritom vyzrážal nerozpustný fibrín, alebo aby sa tvorili rozkladné produkty fibrinogénu následkom vzniku plazmínu počas skladovania.

Napriek použitiu výlučne alogénnych účinných látok môže dôjsť pri vírusovej inaktivácii z alogénnych účinných látok zložených liečiv k tvoreniu neoantigénov alebo interakciou dvoch alebo viacerých účinných látok liečiva počas vírusovej inaktivácie a/alebo interakciou s nečistotami, ktoré sa ešte nachádzajú v účinných látkach.

Ďalšou nevýhodou pri vírusovej inaktivácii zmesí účinných látok je veľmi Často samotná rozdielna inaktivizácia jednotlivých účinných látok, ktorá sťažuje alebo znemožňuje formuláciu liečiv.

Vynález sa preto týka aj spôsobu získavania nepatogénnych, v liečivách podľa vynálezu obsiahnutých účinných látok, obsahujúc kombináciu procesu deštrukcie a procesu inaktivácie včítane krokov deštrukciu vírusov a vírusovú inaktiváciu, pričom na deštrukciu vírusov sú používané ultraodstred’ovanie a ultrafiltrácie včítane nanofiltrácií a/alebo adsorbcií patogénov pri teplotách pod 0 °C a uskutočňované sú najmenej dva rozličné spôsoby vírusovej inaktivácie, pri ktorých sú používané spôsoby tepelných impulzov trvania pod 3 sekundy a/alebo intenzívne ožarovanie laserovými impulzmi s alebo bez fotodynamíckých substancií a/alebo spolu s hydrofóbnymi zosieťovacími prostriedkami.

Spôsobom podľa vynálezu môžu byť účinné látky pred ich formuláciou vírusovo inaktivované s dostatočným stupňom čistoty, pričom zodpovedajúcim výberom spôsobov inaktivácie sa zabezpečí, že všetky účinné látky sú rovnako vírusovo inaktivované bez veľkých strát. Týmto spôsobom je možné najrozsiahlejšie vylúčiť indukciu alebo vyvolávanie alergií, anafylaxií a autoimúnnych procesov prostredníctvom liečiv obsahujúcich tieto účinné látky.

-WSpôsobom podľa vynálezu je možná aj obzvlášť šetrná vírusová inaktivácia proteinázových inhibítorov, ktoré sa nachádzajú v liečivách podľa vynálezu.

Vynález sa ďalej týka spôsobu kovalentnej väzby účinných látok nachádzajúcich v liečivách podľa vynálezu na biologický matricu, pričom na enzymatickú katalýzu väzbovej reakcie sú nasadené vysoké koncentrácie alogénnych, vírusovo ochudobnených a/alebo vírusovo inaktivovaných transglutamináz, ktoré sa nachádzajú nad 10-násobnou oblasťou aktivovanej koncentrácie v plazme sa vyskytujúceho faktoru XlIIa - zymogénu.

Prostredníctvom dostatočne vysokej a dlho trvajúcej koncentrácia trombínu v alogénnej, provizórnej extracelulámej matrici môže byť za prítomnosti dostatočného množstva faktoru XIII vytvorený dostatočný faktor XlIIa, ktorý na jednej strane spôsobuje priečne zosietenie základnej substancie (substancií) fibrínu s alebo bez kolagénu, na druhej strane za prítomnosti TAFI-zymogénu generuje TAFI. TAFI odštiepuje od fibrínu receptor plazmínu, čím sa dosahuje vysoká stabilita fibrín obsahujúcej, provizórnej extracelulámej matrici voči fibrinolytickým enzýmom. Ďalej je možné podľa vynálezu kovalentne viazať prostredníctvom vysokej a dlho trvajúcej transglutaminázovej koncentrácie v alogénnej, provizórnej extracelulámej matrici zodpovedajúce vírusovo inaktivované alogénne inhibítory, ako a2-antiplazmín, PAI-1 a iné a týmto udržať bokom ich difúziu z alogénnej, provizórnej extracelulámej matrice. To isté platí aj pre ostatné účinné látky proteínovej povahy, ktoré sa pomocou transglutamináz dajú kovalentne viazať na stavebné substancie.

Vynález sa ďalej týka spôsobu výroby gélu s nízkym obsahom vody a s obsahom fibrínu, s obsahom vody medzi 20 až 90 %, pričom gél obsahujúci fibrín môže byť zbavený vody nanesením atoxických, farmaceutický použiteľných vodu odoberajúcich prostriedkov, najmä polyetylénglykolu, alebo voda je odobratá vnesením gélu do týchto prostriedkov, pričom gél môže byť ošetrený transglutaminázami pred alebo po odobratí vody.

Výroba gélu s nízkym obsahom vody a obsahom fibrínu s obsahom vody medzi 20 až 90 % sa môže podľa vynálezu uskutočniť takým spôsobom, pri ktorom je gélu s obsahom fibrínu odobratá voda použitím vysokého tlaku, pričom sa tento zvyšuje stupňovito, aby sa vylúčilo rozrušenie gélu. Pritom môže byť gél ošetrený transglutaminázami v priebehu a/alebo po použití tlaku.

Vynález sa týka aj spôsobu na spevnenie gélu s obsahom fibrínu s a bez odobratia vody, vyznačujúceho sa tým, že gél s obsahom fibrínu je vložený do jedného alebo

-Ηviacerých roztokov obsahujúcich ióny kovov, najmä roztokov, ktoré obsahujú ióny zinku a hliníka o koncentrácii od 0,01 do 2 mol/l.

Prostredníctvom predloženého vynálezu je ďalej daný k dispozícii gel podrobený lyofilizácii, obsahujúci fibrín, ktorý je vyrábaný prostredníctvom prísad zmäkčovadiel, najmä glykolu, pred svojím spevnením a lyofilizáciou.

Vyššie uvedené spôsoby podľa vynálezu na výrobu gélu s nízkym obsahom vody a s obsahom fibrínu ako aj na spevnenie gélov s obsahom fibrínu môžu byť so zvláštnou výhodou použité na výrobu liečiv podľa vynálezu.

Nevýhodou doteraz používaných prípravkov s obsahom fibrínu pri lokálnom nanášaní zmesi účinnej látky s obsahom fibrínu je ich príliš nepatrná viskozita pred spevnením. Preto môže nanesená zmes ľahšie a rýchlejšie stiecť z miesta nanesenia, čó na jednej strane spôsobuje zvýšenú spotrebu liečiva a na druhej strane nedostatočné používanie v súvislosti s chirurgickými zásahmi, keď je požadované nanášanie na operačné pole.

Vynález sa preto týka aj spôsobu na výrobu vysokoviskózneho roztoku s obsahom fibrínu vysokoviskózneho roztoku s obsahom fibrinogénu, pričom sterilný, vírusovo ochudobnený a/alebo vírusovo inaktivovaný roztok fibrínu na gram fibrinogénu so stotinou až desatinou jednotky sterilného vírusovo ochudobneného a/alebo vírusovo inaktivovaného trombínu, ktorý je v čo najmenšom objeme rozpustený, je zmiešaný pomaly a pri silnom miešaní a sterilných podmienkach. Tieto podľa spôsobu podľa vynálezu vyrobené vysokoviskózne roztoky s obsahom fibrinogénu môžu byť so zvláštnou výhodou používané na výrobu liečiv podľa vynálezu.

Predložený vynález predkladá ďalej k dispozícii spôsob na určenie priľnavosti zrazeniny fibrínu v ložisku rany, pri ktorom je vytváraná zrazenina fibrínu so stúpajúcim množstvom proteinázových inhibítorov na povrchu vhodných tkanivových kultúr, najmä ľudských fibroblastov, s nepatrným prídavkom jedného alebo viacerých farbív a/alebo jednou alebo viacerými vo vode nerozpustnými substanciami, ktoré poskytujú zafarbenú, prípadne opalescenčnú zrazeninu fibrínu, a tkanivové kultúry sú udržiavané v pohybe ľahkým chvením alebo rotáciou, pričom je určený čas, po ktorom sa fibrínová krvná zrazenina uvoľní z povrchu tkanivovej kultúry.

Spôsobom podľa vynálezu je možné stanoviť to množstvo proteinázových inhibítorov v alogénnej, provizórnej extracelulámej matrici, ktoré je napríklad k dispozícii v liečivách podľa vynálezu alebo je ich prostredníctvom vytvorené, ktoré je potrebné, aby sa táto

-4Ϊ.

matrica aspoň počas niekoľkých dní ponechala na mieste jej nanesenia a tým zabrániť jej oddeleniu od ložiska rany ako aj tým spôsobenému nasledujúcemu krvácaniu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1:

Získavanie stabilného roztoku fibrinogénu.

Ako východzí materiál je použitých 100 1 plazmy vhodnej na získavanie liečiv, alebo z nej pomocou zrážania etanolovým ochladením získaná Cohnova frakcia - I, alebo zmrazením plazmy a opatrným rozmrazením získaný chladový precipitát.

Plazma je ako taká, Cohnova frakcia-I a chladový precipitát po rozpustení v asi 20 1 0,9 %-ného NaCI a 0,1 %-ného tlmivého roztoku citrátu sodného o pH7 zmiešaná až po nasýtenie s pevným glycínom so stupňom čistoty pre farmaceutické prípravky a pritom ochladená na -2 °C až -3 °C, skladovaná najmenej 10 až maximálne 15 hodín pri tejto teplote, oddelená od nerozpusteného glycínu a usadenina obsahujúcu fibrinogén fibronektín sa oddelí odstredením vo vysokootáčkovej odstredivke.

Zbytky môžu byť použité na ďalšie spracovanie, aby sa z nich izolovali ďalšie plazmatické proteíny.

Rôsolovitá usadenina sa odstráni z rotora odstredivky, rozpustí sa a ako predtým sa zrazí glycínom. Po odstredení získaný sediment sa rozpustí v 0,1 % citrátu a tento postup sa tak často opakuje, až skúška sedimentu v destilovanej vode, s obsahom fibrinogénu 0,1 % - 0,2 % pri 37 °C s reagentom PTT udá aPTT nie menej ako 200 sekúnd. Rovnako sa musí po pridaní tromboplastínu a vretenicového jedu dosiahnuť doba zrážania, ktorá nie je pod 300 sekúnd.

Posledný, na ďalšie spracovanie vhodný, znova rozpustený precipitát sa ďalej uvoľní od glycínu diafiltráciou proti 0,1 % zitrátového roztoku a pritom sa koncentruje na 2 - 3 % obsahu proteínu.

Takto získaný fibrinogén obsahuje ešte aj podstatné množstvá fibronektínu. Ak je to žiadúce, môže byť fibronektín oddelený vyzrážaním pri -2 °C až -3 °C 17 %-ným glycínom. Pritom sa prakticky celý fibrinogén zrazí a v zbytku sa nachádza fibronektín ešte s nepatrnými množstvami fibrinogénu. Nasýtením glycínom môžu byť obidva proteíny

-/3 vyzrážané a získané spoločne. Pôsobenie nanajvýš nepatrných aktivít na aktivátor plazminogénu alebo plazmín môže byť odstránené pridaním nepatrných, nízkomolekulárnych inhibítorov, ako kyseliny ε-aminokapronovej alebo derivátov.

Vírusová inaktivácia vysokočistého fíbrinogénu alebo komplexu fibrinogén fibronektínu sa môže uskutočniť zmiešaním plazmy rozpustenej Cohnovej frakcie-I alebo rozpusteného chladového precipitätu s detergentmi a zosieťujúcimi prostriedkami, alebo metódou tepelného impulzu alebo metódou laserového svetla. Vírusovp inaktivovaný roztok fíbrinogénu možno ako taký uložiť v chladničke pri teplote 4 °C až 8 °C; na skladovanie alebo zmrazený, alebo podrobený lyofilizácii.

Príklad 2:

Výroba trombínového roztoku s trombín generujúcim potenciálom.

Tento trombínový roztok sa získava zmiešaním dvoch roztokov s rovnakým podielom, ktoré boli získané z vhodnej ľudskej plazmy na výrobu liečiv pre použitie na ľuďoch. Obidva roztoky nespôsobujú horúčku, sú bez vápenatých iónov a sú sterilné. Jeden roztok obsahuje vírusovo bezpečný trombín s voliteľnou koncentráciou od 20 do 2 500 jednotiek/ml, druhý roztok obsahuje vírusovo bezpečnú zmes protrombínových faktorov zrážanlivosti, ktorá môže generovať po pridaní iónov vápnika aspoň 1 000 trombínových jednotiek na mililiter.

Tejto zmesi je primiešaná objemová stotina sterilného roztoku 10 %-ného polyetylénglykol u (farmaceutickej čistoty) a zmes je potom podľa želaného dávkovania naplnená do prepichovateľných fľaštičiek alebo do hotových striekačiek a hlboko zmrazená, prípadne podrobená lyofilizácii, uzatvorená, uložená, opatrená etiketami a zabalená.

Príklad 3:

Výroba vhodných liečiv z farmaceutických prípravkov obsahujúcich fibrín a trombín na lokálne použitie pre ľudí.

800 ml tekutého, horúčku nespôsobujúceho prípravku účinnej látky podľa príkladu 1, ktorý bol získaný z výroby pre liečivá pre ľudí vhodnej ľudskej plazmy a má aspoň % obsahu fibrinogénu, je použitých na rozpustenie lyofilizovaného, sterilného, nespôsobujúceho horúčku, vírusovo inaktivovaného, z výroby pre liečivá pre ľudí vhodnej ľudskej plazmy získaného farmaceutického prípravku, ktorý obsahuje 1 200 jednotiek PAI-1 vzťahovaných na ľubovoľnú ľudskú plazmu alebo iný serpín, prípadne zmes serpínov, ktorý má kolagenózu alebo elastázu tlmiaci účinok a ekvivalentný obsah transglutaminázyzymogénu aspoň 4 000 jednotiek faktoru XIII. Ďalej obsahuje prípravok 2 g CaChTento fibrinogén obsahujúci farmaceutický prípravok je teraz zmiešaný s v príklade 2 udaným trombín obsahujúcim prípravkom po jeho rekonštitúcii so zodpovedajúcim množstvom vody pre injekčné účely, a síce 4 diely prípravku obsahujúceho fibrinogén s 1 dielom prípravku obsahujúceho trombín.

Príklad 4:

Výroba alogénnej provizórnej extracelulárnej matrice ako liečiva.

Určité množstvo zmesi podľa príkladu 3 sa naleje do zvolenej sterilizovanej formy a po dobu 5 hodín za sterilných podmienok podrobí inkubácii medzi 35 °C a 37 °C. Táto vo forme vytvorená, sterilná, nespôsobujúca horúčku, vírusovo bezpečná, na použitie u ľudí, alogénna, extraceluláma matrica je zabalena do sterilných, parotesných polyetylénových obalov, zatavená a uskladnená v chladničke pri teplote 4 - 8 °C; uvoľní sa po príslušných kontrolách kvality. Po opatrení etiketami, zabalení a uvoľnení môže byť dané liečivo do obehu.

Príklad 5:

Výroba alogénnej, provizórnej, extracelulárnej matrice zmiešaním troch farmaceutických prípravkov, ktoré sú ponúkané ako zložené liečivá.

Liečivo obsahuje tri farmaceutické prípravky, ktoré po zmiešaní tvoria alogénnu, provizórnu, extracelulámu matricu:

a. 6 %-ný roztok fibrinogénu podľa príkladu 3,

-<4b. lyofilizovaný roztok z transglutaminázyzymogénu, serpínu, alebo zmesi serpínov, bez kolagenózu alebo elastázu tlmiaceho účinku a kalciumchloridu v množstvách udaných v príklade 3,

c. lyofilizácii podrobený roztok trombínu podľa príkladu 2.

V liečive je ďalej k dispozícii voda pre injekcie, ktorá sa použije, aby rozpustila farmaceutický prípravok podľa príkladu 2 obsahujúci trombín, zatiaľ čo farmaceutický prípravok, ktorý obsahuje transglutaminázový zymogén a serpín, je rozpustený v 6 %-nom roztoku fibrinogénu podľa príkladu 3. Po zmiešaní roztoku obsahujúceho fibrinogén a roztoku obsahujúceho trombín sa pred zrazením zmesi táto alebo dá do potrebnej, sterilnej, horúčku nespôsobujúcej formy a po spevnení sa vyberie z formy a lokálne sa nanáša, alebo sa nanáša ešte tekutá zmes na potrebné miesto, prípadne na potrebné miesta, pričom sa len potom vytvorí pre ľudí alogénna, provizórna, extraceluláma matrica.

Príklad 6

Biochemický spevnená, alogénna, provizórna extraceluláma matrica za použitia alogénneho kolagénu.

V zmesi farmaceutického prípravku podľa príkladov 4 a 5 môže byť podaný vláknitý, sterilný, nespôsobujúci horúčku, vírusovo bezpečný ľudský kolagén, a síce medzi 5 až 100 mg/ml, alebo zmes je nanesená na rýchlo sajúcu, penovú kolagénovú platničku, pričom je obsah trombínu tak nastavený, aby tvorba fibrínu započala až po ukončení procesu vstrebávania. Takáto platnička môže byť použitá bezprostredne po začatí procesu zrážania alebo po inkubácii 5 hodín medzi 35 °C a 37 °C, sterilné zabalená, pripravená na ďalšie spracovanie alebo prepracovanie na hotové liečivo.

Príklad 7

Stanovenie potrebnej koncentrácie serpínov, ktoré neinhibujú kolagenózu alebo elastázu.

Zvolená fibroblastová bunková línia, ktorej voľba sa uskutočňuje podľa najväčšej •7 fibrino lyrickej aktivity, je podávaná o hustote buniek asi 10 buniek na ml do fliaš

- Ί(ό2 2 · * s tkanivovou kultúrou s plochou rastu aspoň 30 cm , takže na cm plochy tkanivovej kultúry je k dispozícii 10⁵ buniek. Po pridaní najmenej 10 ml média tkanivovej kultúry sú fľaše tak dlho inkubované, až sa vytvorí kompletná adherentná bunková vrstva. Ak je to potrebné, uskutočňuje sa v určitých intervaloch zmena média.

Potom, ako vyrastie úplná adherentná bunková vrstva, je médium odstránené a dvakrát umyté s minimálne po 20 ml média adherentnej bunkovej vrstvy, médium je v ďalšom odstránené z fľaše a pomocou vhodnej pipety a na vyznačenom mieste vonkajšej strane fliaš sa nanesie po 50 μΐ nasledujúcej zmesi na presne vodorovne nastavenú adherentnú bunkovú vrstvu, potom sa uzatvoria fľaše s tkanivovou kultúrou a skladujú sa 1 hodinu pri teplote miestnosti, potom sa znova ako predtým naplnia médiom, uzatvoria sa ponechajú na hojdačke s asi 10 kyvmi za minútu v inkubátore pri 37 °C; po 30, 100 a 300 minútach a potom každých 8 hodín treba dozerať na odlučovanie na adherentnú bunkovú vrstvu nanesenej zrazeniny obsahujúceho fibrín.

Nanášanie nasledujúcej zmesi sa uskutočňuje nasledovne:

Na šesť predznačených miest sa nanesie plazma, ktorá bola pred zmiešaním s metylénovou modrou v potrebnej miere zmiešaná s tisíc jednotkami trombínu na ml plazmy. Pokusne sa vyrábajú zmesi podľa príkladu 3, ktoré sa zafarbujú potrebným množstvom fenolovej červenej, obsahujúce rozličné množstvá plazmatických alebo génovým inžinierstvom vyrobených serpínov. Z každej koncentrácie serpínu sa nanesie rovnako 6 x 50 μΐ zmesi na predznačené miesta. Po spevnení nanesených zmesí vzoriek sa postupuje ako je vyššie uvedené.

Teraz sa stanovujú doby, za ktoré sa vzorky obsahujúce fibrín oddeľujú od povrchu tkanivovej kultúry. Doby oddeľovania vzoriek obsahujúcich serpín sa porovnávajú s dobami na plazmových vzorkách. Výhodne sa volia tie koncentrácie serpínu, ktoré spôsobujú najmenej také dlhé oddeľovania, aké sa pozorujú pri z plazmy vyrobených a nanesených zrazenín.

Claims (26)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Liečivo na lokálne použitie s cieľom zastaviť krvácanie a/alebo uzatvoriť ranu a/alebo podporiť hojenie rany, ktoré má ako účinné látky - vyrobené konvenčné z alogénnej plazmy alebo z tkaniva alebo vyrobené génovým inžinierstvom - fibrinogén, prípadne fibrín, trombín a jednu alebo viacej transglutamináz, vyznačujúce sa tým, že liečivo obsahuje ako ďalšiu účinnú látku jeden alebo viacej proteinázových inhibítorov, ktoré sú vybrané zo skupiny serpínov, ktoré nemajú žiadny spomaľujúci účinok na kolagenózy a elastázy, pričom všetky účinné látky sú alogénneho pôvodu a sú podrobené procesu deštrukcie vírusov a/alebo vírusovej inaktivácie, s ustanovením, že vírusová inaktivácia jedného alebo viacerých proteinázových inhibítorov nie je uskutočňovaná za prítomnosti iných účinných látok.
2. 2. Liečivo podľa nároku l, vyznačujúce sa tým, že všetky účinné látky sú k dispozícii v jedinom farmaceutickom prípravku ako alogénna provizórna extracelulárna matrica.
3. 3. Liečivo podľa nároku l, vyznačujúce sa tým, že účinné látky sú k dispozícii v dvoch alebo viacerých oddelených farmaceutických prípravkoch na namiešanie pred alebo počas používania, pričom získaná zmes môže byť nanášaná v tekutej forme alebo len po jej spevnení.
4. 4. Liečivo podľa nároku 3, vyznačujúce sa tým, že fibrinogén a trombín sú k dispozícii vždy v oddelených farmaceutických prípravkoch a ostatné účinné látky sa nachádzajú nezávisle od seba v jednom alebo obidvoch prípravkoch a/alebo v ďalšom prípravku.
5. 5. Liečivo podľa niektorého z nárokov 2 až 4, vyznačujúce sa tým, že farmaceutické prípravky sú nanesené na alogénne alebo biokompatibilné nosné materiály, ktoré boli podrobené procesu deštrukcie vírusov a/alebo procesu vírusovej inaktivácie.

   -fx
6. 6. Liečivo podľa niektorého z nárokov 1 až 5, vyznačujúce sa tým, že obsahuje ako ďalšiu účinnú látku alogénne kolagény, ktoré boli podrobené procesu deštrukcie vírusov a/alebo procesu vírusovej inaktivácie.
7. 7. Liečivo podľa niektorého z nárokov 1 až 6, vyznačujúce sa tým, že obsahuje jednu alogénnu (alebo viacero alogénnych), procesu deštrukcie vírusov a/alebo procesu vírusovej inaktivácie podrobenú účinnú látku (podrobených účinných látok), ktorá je vybraná (ktoré sú vybrané) zo skupiny fibronektín, vitronektín, trombospondin, tenascin, laminin a proteoglykány.
8. 8. Liečivo podľa niektorého z nárokov 1 až 7, vyznačujúce sa tým, že obsahuje jednu alogénnu (alebo viacero alogénnych), procesu deštrukcie vírusov a/alebo procesu vírusovej inaktivácie podrobenú účinnú látku (podrobených účinných látok), ktorá je vybraná (ktoré sú vybrané) zo skupiny rastových faktorov, chemotaktických substancií, bunky stimulujúcich a/alebo proliferáciu podporujúcich enzýmov a inhibítorov enzýmovej reakcie, proliferáciu tlmiacich enzýmov a inhibítorov enzýmovej reakcie, zýtokinov a partikuláme tvarovaných bunkových elementov.
9. 9. Liečivo podľa niektorého z nárokov 1 až 8, vyznačujúce sa tým, že obsahuje pridané alogénne plazmatické prípadne z tkaniva získané enzýmy, zymogény a/alebo inhibítory enzýmovej reakcie, ktoré boli podrobené procesu deštrukcie vírusov a/alebo procesu vírusovej inaktivácie.
10. 10. Liečivo podľa niektorého z nárokov 1 až 9, vyznačujúce sa tým, že obsahuje pridané antiadherentné a/alebo antiflogistické účinné látky, ktoré boli v prípade potreby podrobené procesu deštrukcie vírusov a/alebo procesu vírusovej inaktivácie.
11. 11. Liečivo podľa niektorého z nárokov 1 až 10, vyznačujúce sa tým, že obsahuje pridané antimikróbne a/alebo cytostatické účinné látky, ktoré boli v prípade potreby podrobené procesu deštrukcie vírusov a/alebo procesu vírusovej inaktivácie.

    -í^ci
12. 12. Liečivo podľa niektorého z nárokov 1 až 11, vyznačujúce sa tým, že obsahuje pridané účinné látky, ktoré majú byť pomaly vstrebateľné a boli v prípade potreby podrobené procesu deštrukcie vírusov a/alebo procesu vírusovej inaktivácie.
13. 13. Liečivo podľa niektorého z nárokov 1 až 12, vyznačujúce sa tým, že vo farmaceutickom prípravku obsahujúcom trombín sa nachádzajú doplnkové alogénne zymogény a/alebo enzýmy stupňovitej zrážanlivosti, ktoré boli podrobené procesu deštrukcie vírusov a/alebo procesu vírusovej inaktivácie.
14. 14. Liečivo podľa niektorého z nárokov 1,2 a 5 až 13, vyznačujúce sa tým, že obsahuje doplnkové alogénne partikuláme bunkové elementy, bunky a/alebo tkanivo.
15. 15. Liečivo podľa nároku 14, vyznačujúce sa tým, že alogénne partikuláme bunkové elementy, bunky a/alebo tkanivo sú nanesené na vírusovo bezpečné mikrosféry, ktoré pozostávajú z alogénneho fibrínu a/alebo alogénneho kolagénu a/alebo alogénného kolagénu s alogénnym fibrínom.
16. 16. Liečivo podľa niektorého z nárokov 2 a 5 až 15, vyznačujúce sa tým, že alogénna provizórna extraceluláma matrica je spevnená použitím tlaku a/alebo prostriedkom na odobratie vody.
17. 17. Liečivo podľa nároku 16, vyznačujúce sa tým, že alogénna provizórna extraceluláma matrica bola pred, počas a/alebo po spevnení ošetrená odobratím vody alogénnymi transglutaminázami.
18. 18. Spôsob výroby roztoku obsahujúceho fibrín, ktorý je ako taký alebo ako zložka liečiva podľa niektorého z nárokov 1 až 17 skladovateľný pri teplote v chladničke alebo pri izbovej teplote, vyznačujúci sa tým, že roztok fibrinogénu, prípadne roztok fibrinogén - fibronektínu je vyrábaný z génovým inžinierstvom vyrobeného fibrinogénu alebo z plazmy získaného fibrinogénu frakcionáciou s glycínom pri teplotách pod 0 °C.

    -2019. Liečivo, vyznačujúce sa tým, že obsahuje vysokočistý prípravok s obsahom fibrinogénu alebo fibrinogén - fibronektínu, ktorého protrombínový čas aPTT a vretenicového jedu pri 37 °C nie je kratší ako 200 prípadne 300 sekúnd, a-ktorý má takú stabilitu, že môže byť v tekutom-stave s alebo bez stabilizátorov vyše dvoch rokov skladovaný pri teplote 4 °C—8 °C ako súčasť liečiv alebo ako taký, alebo skladovaný zmrazený alebo lyofilizovaný bez toho, aby sa pritom vyzrážal nerozpustný fibrín alebo sa počas skladovania tvorili rozkladné produkty- fibrinogénu vznikom plazmínu.
19. 20. Spôsob získavania nepatogénnych účinných látok, nachádzajúcich sa v liečivách podľa nárokov 1 až 17, obsahujúci kombináciu procesu deštrukcie a procesu inaktivácie včítane krokov na vírusovú deštrukciu a vírusovú inaktiváciu, pričom na vírusovú deštrukciu sú používané ultraodstreďovania a ultrafiltrácie včítane nanofiltrácie a/alebo pohlcovania patogénov pri teplotách pod 0 °C a uskutočňujú sa aspoň dva rozličné spôsoby vírusovej inaktivácie, pri ktorých sú používané spôsob tepelných impulzov s trvaním pod 3 sekundy a/alebo intenzívne ožarovanie laserovými impulzmi s alebo bez fotodynamických substancií a/alebo detergentov spoločne s hydrofóbnymi zosieťujúcimi prostriedkami.
20. 21. Spôsob kovalentnej väzby zo strany v liečivách podľa niektorého z nárokov 1 až 17 nachádzajúcich sa účinných látok na biologickú matricu, vyznačujúci sa tým, že na enzymatickú katalýzu väzbových reakcií sú nasadené vysoké koncentrácie alogénnych, vírusovo deštruovaných a/alebo vírusovo inaktivovanýčh transglutamináz, ktoré ležia nad 10 - násobnou oblasťou koncentrácie aktivovanej koncentrácie v plazme sa vyskytujúceho faktoru XHIa - zymogénu.
21. 22. Spôsob výroby gélu s-nízkym obsahom vody a s obsahom fibrínu, s obsahom vody medzi 20 až 90 %, vyznačujúci sa tým, že je gélu s obsahom fibrínu odobratá voda nanesením atoxických, farmaceutický použiteľných vodu odoberajúcich prostriedkov, najmä polyetylénglykolu, alebo voda je odobratá vnesením gélu do týchto prostriedkov.

    -2123. Spôsob výroby gélu s-nízkym obsahom vody a s obsahom fibrínu, s obsahom vody medzi 20 až 90 %, vyznačujúci sa tým, že je gélu s obsahom fibrínu odobratá voda použitím vysokého tlaku, pričom tento sa zvyšuje stupňovité, aby sa vylúčilo rozrušenie gélu.
22. 24. Spôsob podľa niektorého z nárokov 22 alebo 23, vyznačujúci sa tým, že gél je ošetrený transgutaminázami pred, počas alebo po odobratí vody.
23. 25. Spôsob na spevnenie gélu s obsahom fibrínu s a bez odobratia vody, vyznačujúci sa tým, že gél s obsahom fibrínu je vložený do jedného alebo viacerých roztokov obsahujúcich ióny kovov, najmä roztokov, ktoré obsahujú ióny zinku a hliníka o koncentrácii od 0,01 do 2 mol/l.
24. 26. Gél podrobený lyofilizácii, obsahujúci fibrín, vyznačujúci sa tým, že je vyrábaný prostredníctvom prísad zmäkčovadiel, najmä glykolu, pred svojím spevnením a lyofilizáciou.
25. 27. Spôsob výroby vysokovizkózneho roztoku s obsahom fibrinogénu, vyznačujúci sa tým, že sterilný, vírusovo deštruovaný a/alebo vírusovo inaktivovaný fibrínový roztok je pomaly a za silného miešania pri sterilných podmienkach zmiešaný na gram fibrinogénu so stotinou až desatinou jednotky sterilného vírusovo deštruovaného a/alebo vírusovo inaktivovaného trombínu, ktorý je rozpustený v čo možno najmenšom objeme.
26. 28. Spôsob stanovenia priľnavosti fibrínovej zrazeniny v ložisku rany, vyznačujúci sa tým, že fibrínová zrazenina so stúpajúcim množstvom proteinázových inhibítorov sa vytvorí na povrchu vhodnej tkanivovej kultúry, najmä ľudských fibroblastov, s nepatrným prídavkom jednej alebo viacerých farbív a/alebo jednej alebo viacerých vodou nerozpustných substancií, ktoré dávajú zafarbenú, prípadne opalescenčnú fibrínovú zrazeninu, a tkanivové kultúry sú udržiavané v pohybe ľahkým striasaním alebo rotáciou, pričom je určovaný čas, po ktorom sa oddelí fibrínová krvná zrazenina z povrchu tkanivovej kultúry.