ES2217281T3 - Microcapsulas para la administracion de agentes neuroactivos. - Google Patents
Microcapsulas para la administracion de agentes neuroactivos.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION HACE REFERENCIA A MICROESFERAS POLIMERICAS COMO VEHICULOS INYECTABLES PARA EL TRANSPORTE DE MEDICAMENTOS QUE SE USAN PARA ENVIAR AGENTES BIOACTIVOS A LUGARES DEL INTERIOR DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL, Y PARA LA ESTIMULACION DEL CRECIMIENTO DE LA FIBRA NERVIOSA MEDIANTE EL IMPLANTE DE ESTAS MICROESFERAS EN EL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL DE UN PACIENTE . LAS MICROESFERAS SON INFERIORES A 45{MI}M, PREFERIBLEMENTE INFERIORES A 20{MI}M, Y PREFERIBLEMENTE EN LA PRESENTE INVENCION TIENEN UN DIAMETRO MEDIO ENTRE 0.1 {MI}M Y 10{MI}M, SON TAMBIEN ESCOGIDAS DE FORMA SELECTIVA Y SE ENVIAN CON FORMA DE ASTROCITO DIRECTAMENTE A LOS TEJIDOS NERVIOSOS.
Description
Microcápsulas para la administración de agentes
neuroactivos.
Se ha reconocido durante mucho tiempo que el
suministro de un medicamento a su lugar terapéutico de acción
dentro del sistema nervioso central, es decir el systema
nervosum central (el cerebro y la médula), puede resultar una
tarea difícil debido a las numerosas barreras químicas y físicas
que se deben superar para que este suministro sea exitoso. Se
diseñaron cantidad de métodos para superar algunas de estas
barreras para el suministro del medicamento al sistema nervioso
central como, por ejemplo, la utilización de liposomas para superar
la barrera de la sangre al cerebro. Sin embargo, los inconvenientes
de un sistema de entrega de liposomas, incluidas las cargas bajas
de medicamento, la corta duración de la acción, las maneras
limitadas para manipular la velocidad de liberación del
medicamento, la poca estabilidad de almacenamiento así como los
problemas con los aumentos proporcionales, han imposibilitado la
utilización de dicho sistema. Otro método para vencer algunas de las
barreras para el suministro de medicamentos al sistema nervioso
central consiste en modificar químicamente el medicamento activo
hacia una forma, llamada promedicamento, que es capaz de atravesar
la barrera de sangre al cerebro, y una vez esta barrera atravesada,
el promedicamento vuelve a su forma activa. Un ejemplo de este
sistema de suministro de promedicamento consiste en la dopamina
neurotransmisora unida a la máscara molecular derivada de la
niacina vitamínica liposoluble. Se toma la dopamina modificada en el
cerebro donde entonces se quita lentamente de la máscara de
promedicamento para producir dopamina libre.
El método más común para superar algunas de las
barreras físicas y que impida el suministro de medicamento al
sistema nervioso central ha sido mediante la utilización de bombas.
Se diseñaron una variedad de bombas para suministrar medicamentos a
partir de un recipiente externamente usado a través de un pequeño
tubo dentro del sistema nervioso central. Aunque puedan controlarse
externamente hasta cierto grado estos sistemas de suministro por
bomba, la posibilidad de infección directamente dentro el sistema
nervioso central es muy grande y el lugar exacto de acción del
medicamento en el sistema nervioso central está en gran parte bajo
control.
Para su éxito, no basta sólo con suministrar el
medicamento dentro del sistema nervioso central. Debe suministrarse
el medicamento en el lugar previsto de acción, a la velocidad
requerida de administración y según la dosis terapéutica adecuada.
Comercialmente, la mini-bomba osmótica Alzet se ha
convertido en un medio aceptable, muy útil y exitoso para
suministrar medicamentos a una velocidad y una dosis controladas a
lo largo de períodos prolongados dentro del sistema nervioso
central. Sin embargo, la adaptación de este dispositivo para
suministrar el medicamento deseado a los núcleos discretos del
cerebro presenta grandes dificultades tales como la implantación de
cánulas directamente dentro de la regiones designadas del
cerebro.
No obstante, otra técnica que ha sido
desarrollada para suministrar agentes neuroactivos, como los
neurotransmisores, al sistema nervioso central consiste en el uso
de transplantes nerviosos. Puede implantarse un tejido nervioso
viable directamente dentro de los núcleos discretos del cerebro. La
duración del suministro de la substancia procedente del tejido
transplantado no presenta ningún problema porque el tejido
implantado puede sobrevivir durante largo tiempo en el sistema
nervioso central del huésped. Esta técnica supera una cantidad de
obstáculos anteriormente citados, sin embargo, a pesar de las
reclamaciones de que los injertos nerviosos procedentes de células
fetales de dopamina muestran algunas propiedades de reacción
autorreguladora que se encuentran normalmente en los sistemas
nerviosos de dopamina intacta, la velocidad exacta a la cual se
suministran los neurotransmisores a partir de los transplantes
nerviosos a su lugar de acción no puede ser predeterminada. La
WO9117772 describe un sistema de suministro de medicamentos para
administrar una molécula neuroactiva al sistema nervioso central
que comprende una molécula neuroactiva encapsulada dentro de una
microesfera que comprende un copolímero de
poli-(lactida-co-glicolida) u
homopolímero de polilactida o poliglicolida.
En 1817, James Parkinson describió una enfermedad
que denominó "parálisis temblorosa". Se conoce actualmente
este estado como enfermedad de Parkinson y tiene lugar en las
personas de mediana edad y mayores. Mientras su principio es
insidioso, empezando a menudo por temblores en una mano seguidos por
bradiquinesia creciente y rigidez, es lentamente progresiva y
después de varios años puede producir incapacidad. En la enfermedad
idiopática de Parkinson, existe normalmente una pérdida de células
en la substantia nigra, locus ceruleus y demás neuronas pigmentadas
así como una disminución del contenido de dopamina en los
terminales del axón de las células que se proyecta desde la
substantia nigra hasta el caudate nucleus y el putamen comúnmente
denominado paso estrio-nígrico.
Algunos síntomas de la enfermedad de Parkinson
pueden tratarse mediante la administración de
L-3,4-dihidroxi-fenil-alanina
(levodopa o L-dopa). La L-dopa,
precursor metabólico de la dopamina, se utiliza para terapia de
sustitución porque la dopamina misma no atraviesa la barrera de
sangre del cerebro. Sin embargo, debe darse en grandes dosis de 3 a
15 gramos por día porque gran parte del medicamento se metaboliza
antes de alcanzar el lugar de acción en el cerebro.
Alternativamente, se aplica a menudo en combinación con un inhibidor
de descarboxilasa de dopa, como el carbidopa, que impide el
metabolismo de L-dopa hasta que atreviese la
barrera de sangre en el cerebro. Su mayor efecto es sobre los
síntomas bradiquinésicos. Después de cinco años aproximadamente de
tratamiento, se desarrollan unos efectos secundarios y el
tratamiento se vuelve cada vez menos efectivo aun con el incremento
de las dosis de medicamento. Estos problemas plantearon la pregunta
de si sería posible o no de sustituir la dopamina perdida por otro
medio que pudiera suministrar el medicamento a su lugar terapéutico
de acción dentro del sistema nervioso central.
El descubrimiento de que una lesión unilateral
del paso estrio-nígrico por la neurotoxina
6-hidroxi-dopamina producía una
asimetría de movimiento y postura en la rata, proporcionó un modelo
animal para la enfermedad de Parkinson. Esta asimetría de movimiento
se emplea en el modelo de rotómetro desarrollado para medir el
comportamiento rotacional inducido por los medicamentos que
interfieren en la neutrotransmisión de la dopamina como la
apomorfina. La característica del comportamiento rotacional inducido
por la apomorfina se observa solamente en los animales con una
reducción del 90 al 95% de los niveles de dopamina en el músculo
estriado y la dopamina de sustitución en este tejido bien sea por
transplantes de células fetales de producción de dopamina o por
tejido medular suprarrenal, resulta en disminuciones
insignificantes en el comportamiento rotacional inducido por la
apomorfina.
Aun así, estas aproximaciones están bien
documentadas para los modelos animales experimentales, su
utilización como terapia para los trastornos neurodegenerativos
como la enfermedad de Parkinson presentan una cantidad de
consideraciones tanto prácticas como éticas. No solamente la
utilización de tejido humano abortado fetal representa una salida
polémica, sino que esta técnica implica unos procedimientos
quirúrgicos complicados. Además, aunque los experimentos clínicos
de implantes suprarrenales y fetales en los pacientes de la
enfermedad de Parkinson se estén realizando, el mecanismo y la
eficacia a largo plazo de los transplantes de tejido dentro del
sistema nervioso permanecen confusos y siguen siendo una cuestión
de debate médico. La mejor aproximación teórica para el tratamiento
de estas patologías del sistema nervioso central sigue siendo una
que suministraría el agente biológicamente activo directamente a la
región dañada del sistema nervioso central.
Aunque se hayan propuesto y estén siendo
utilizados actualmente una cantidad de diferentes métodos para el
suministro de compuestos farmacéuticamente activos al sistema
nervioso central (tal como se utilizan aquí, "sistema nervioso"
y "sistema nervioso central" se emplean generalmente para
indicar de manera intercambiable que, aunque un aspecto de la
presente invención consista en prever un medio para suministrar un
agente neuroactivo directamente dentro del sistema nervioso central,
otro aspecto consiste en prever la captación de las microesferas de
acuerdo con la presente invención por los astrocitos dondequiera
que tengan lugar en el sistema nervioso), existen bastantes
inconvenientes en cada método para que la necesidad de suministrar
biológicamente las substancias activas al sistema nervioso central
siga existiendo. La presente invención trata esta necesidad de una
manera única.
Definida en términos generales, la presente
invención se refiere, en parte, a unas microesferas que han sido
desarrolladas como vehículos inyectables, suministradores de
medicamentos en las cuales unos agentes bioactivos están contenidos
dentro de un polímero compatible con los tejidos nerviosos. Tal como
se utiliza con respecto a la presente invención, el término
microesfera incluye unas microcápsulas, nanocápsulas,
micropartículas, nanopartículas y nanoesferas. Las microcápsulas,
microesferas y micropartículas son convencionalmente unos polvos de
fluencia libre compuestos de partículas esféricas de 2 milímetros o
menos de diámetro, habitualmente de 500 \mum o menos de diámetro.
Las partículas inferiores a 1 \mum se denominan convencionalmente
nanocápsulas, nanopartículas o nanoesferas. Para la mayor parte, la
diferencia entre una microcápsula y una nanocápsula, una
microesfera y una nanoesfera, o una micropartícula y una
nanopartícula es el tamaño; generalmente, la diferencia, si existe,
es pequeña entre la estructura interna de las dos. En un aspecto de
la presente invención, la captación selectiva de las microcápsulas
dentro de los astrocitos, el diámetro promedio medio es inferior a
aproximadamente 45 \mum, preferentemente inferior a 20 \mum y
con más preferencia, se encuentra entre aproximadamente 0,1 \mum
y aproximadamente 10 \mum. Tal como se utiliza en la presente
invención, el material encapsulado de la microcápsula o nanocápsula
(en la presente invención se trata de un agente bioactivo o
medicamento) está centralmente localizado dentro de una membrana
única. Esta membrana puede calificarse de material polimérico de
formación de pared. Debido a su estructura interna, las
microcápsulas permeables diseñadas para aplicaciones de liberación
controlada, liberan su agente a una velocidad constante (llamada
velocidad de liberación de "orden cero"). Así, tal como se
utiliza en la presente invención, las microcápsulas incluyen unas
micropartículas en general que comprenden un núcleo central rodeado
por una membrana polimérica.
Además, las microesferas envuelven unas
partículas "monolíticas" y similares en las cuales el agente
bioactivo se dispersa por toda la partícula; es decir que la
estructura interna es una matriz del agente bioactivo y un
excipiente de polímero. Normalmente estas partículas liberan sus
agentes bioactivos a una velocidad que se va reduciendo (una
velocidad de liberación de "primer orden"), sin embargo estas
partículas pueden ser designadas para liberar los agentes internos
dentro de la matriz a una velocidad próxima del orden cero. Así, tal
como se utiliza en la presente invención, las microesferas incluyen
también micropartículas en general que tienen una estructura
interna que comprende una matriz de agente bioactivo y excipiente
de polímero. Los polímeros preferidos según la presente invención
son partículas biocompatibles. Una partícula más preferida según la
presente invención es una que es tanto biocompatible como
biodegradable.
Un polímero preferido empleado en la presente
invención, el
poli-(lactida-co-glicólido), posee
una cantidad de ventajas que lo convierte en único con respecto al
método de la presente invención. Una ventaja de este polímero es
que es similar a los materiales utilizados en la fabricación de las
suturas sintéticas actuales reabsorbibles. Otras ventajas que este
polímero comparte con los polímeros aceptables según la presente
invención, es que este material es biocompatible con los tejidos
del sistema nervioso, incluido el sistema nervioso central. Todavía
otra ventaja es que este material es biodegradable dentro de los
tejidos del sistema nervioso central sin producir ningún
subproducto tóxico de degradación. Todavía otra ventaja de este
material es la capacidad para modificar la duración de la
liberación del medicamento mediante la manipulación de las
características cinéticas del polímero, es decir, mediante la
modificación del coeficiente de lactida y glicólido en el polímero;
esto es particularmente importante porque la capacidad para
suministrar moléculas neuroactivas a las regiones específicas del
cerebro a una velocidad controlada durante un período de tiempo
predeterminado es una terapia más efectiva y deseable por encima de
los procedimientos actuales de administración. Las microesferas
realizadas con éste y otros polímeros aceptables similares cumplen
dos funciones: protegen los medicamentos contra la degradación y
liberan los medicamentos a una velocidad controlada durante un
tiempo predeterminado. Aunque se hayan presentado previamente los
polímeros para su utilización en la microencapsulación de los
medicamentos, los parámetros físicos, químicos y médicos del
polímero de microencapsulación para las moléculas neuroactivas a
utilizar en la técnica de implantación del sistema nervioso (como
la implantación dentro del sistema nervioso central) según la
presente invención, son escasos; no existe ninguna equivalencia
general entre los polímeros que permita que un polímero previamente
utilizado para la encapsulación de los medicamentos sea cambiado
libremente por los polímeros utilizados para encapsular las
moléculas neuroactivas para el suministro de medicamentos al
sistema nervioso central o para la captación de células según la
presente invención. Esto resulta especialmente verdadero cuando el
lugar de utilización es el sistema nervioso central.
Aunque los polímeros particularmente denominados
descritos en los Ejemplos contenidos dentro de esta descripción
cumplan con los criterios necesarios para la implantación dentro
del sistema nervioso central, otros polímeros y copolímeros
biocompatibles, biodegradables que tengan las ventajas de poseer
propiedades similares al
poli-(lactida-co-glicólido) pueden
ser sustituidos en su lugar. Los ejemplos de los polímeros
preferidos que tienen las propiedades de biocompatibilidad y
biodegradabilidad incluyen el copolímero de
poli-(lactida-co-glicólido);
homopolímero de polilactida; homopolímero de poliglicólido;
policaprolactona; copolímero de
polihidroxi-butirato /
polihidroxi-valerato;
poli-(lactida-co-caprolactona);
poliéster-amidas; poliortoésteres; ácido de poli
\beta-hidroxi-butírico; y los
polianhídridos.
Además de los polímeros que poseen tanto la
biocompatibilidad como la biodegradabilidad y que se utilizan para
sintetizar las microesferas para el suministro de agentes
neuroactivos dentro del sistema nervioso central, pueden utilizarse
polímeros no-biodegradables pero biocompatibles para
sintetizar las microesferas para el segundo aspecto de la presente
invención, es decir para la captación de las microesferas por los
astrocitos.
Estos polímeros biocompatibles pero no
biodegradables incluyen los polidienos como el polibutadieno; los
polialquilenos como el polietileno o el polipropileno; los
polimetacrílicos como el polimetil-metacrilato o el
polihidroxi-etil-metacrilato; los
éteres de polivinilo; los alcoholes de polivinilo; los cloruros de
polivinilo; los ésteres de polivinilo como el acetato de polivinilo;
el poliestireno; los policarbonatos; los poliésteres; los éteres de
celulosa como la metil-celulosa, la
hidroxi-etil-celulosa o la
hidroxi-propil-metil-celulosa;
los ésteres de celulosa como el acetato de celulosa o el
aceto-butirato de celulosa; los polisacáridos; y los
almidones.
Los resultados obtenidos a partir de un número de
estudios indican que la implantación de estas microesferas que
contienen un agente neuroactivo proporciona un método factible para
la liberación prolongada del agente dentro del sistema nervioso
central. Además, los datos obtenidos a partir de los estudios que
implican dopamina como agente encapsulado, indican que los
preparados de microesferas de dopamina tienen la posibilidad de
emplearse como fuente de sustitución de transmisor permitiendo la
difusión de la dopamina microencapsulada directamente dentro del
sistema nervioso central a una velocidad controlada durante
períodos de tiempo predeterminado asegurando la importancia
funcional y al mismo tiempo permaneciendo compatible con el tejido
del sistema nervioso central. Sin embargo, de manera muy
sorprendente, los datos indican que la dopamina microencapsulada
inyectada dentro de las regiones específicas del cerebro tiene la
capacidad no declarada hasta ahora de provocar el crecimiento de
las fibras nerviosas. Así, el método para colocar los agentes
neuroactivos microencapsulados, fabricados de acuerdo con un aspecto
de la presente invención, tiene la capacidad de promover el
crecimiento de estos elementos nerviosos que son responsables de la
producción de la dopamina endógena dentro del sistema nervioso
central. Una vez que el incremento haya tenido lugar y que los
elementos de fibras nerviosas hayan madurado y se hayan
estabilizado dentro de su medio, continuarán produciendo y liberando
dopamina dentro del sistema nervioso central proporcionando por
este medio por primera vez una curación potencial de la enfermedad
de Parkinson.
Entre las moléculas o agentes neuroactivos que
pueden ser microencapsulados y administrados según la presente
invención, se encuentran los neurotransmisores; los neuropéptidos;
y los factores neurotróficos que incluyen estos agentes como la
norepinefrina; epinefrina; serotonina; dopamina; substancia P;
somatostatina; el factor de crecimiento nervioso; angiotensina II;
el factor de liberación de corticotropina; colina; colina de
acetilo; agentes neuronotróficos colinérgicos; el factor de
crecimiento fibroblástico básico; factor de crecimiento
fibroblástico ácido; factor de crecimiento derivado del cerebro;
factor de crecimiento nervioso; factor de crecimiento de insulina;
factor \beta de crecimiento de transformación; factor de
crecimiento epidérmico; factor de transformación del crecimiento;
factor de crecimiento derivado de la glía; estrógeno; productos
inorgánicos utilizados para el tratamiento de la depresión como el
litio; el ácido
\gamma-amino-butírico; miméticos
de ácido \gamma-amino-butírico;
oxitocina; fenetil-amina; o
interleuquina-1.
Entre las condiciones neurológicas que pueden ser
tratadas por agentes neuroactivos microencapsulados que se colocan
directamente dentro de los tejidos del sistema nervioso central se
encuentran las lesiones de la médula espinal, la esclerosis lateral
amiotrófica, enfermedad de Parkinson, corea de Huntington,
enfermedad de Alzheimer, epilepsia y disquinesia tardía. Según la
enfermedad a tratar, puede resultar ventajoso proporcionar más de
un neurotransmisor microencapsulado, neuropéptido y factor
neurotrófico al sistema nervioso central. Por ejemplo, como la
dopamina, la colecistoquina y los factores de crecimiento de
fibroblastos básicos y epidérmicos pueden estar involucrados todos
en la enfermedad de Parkinson, finalmente puede ser ventajoso,
cuando se presentan con un paciente que padece la enfermedad,
proporcionar al sistema nervioso central (ver Ejemplo 4) una mezcla
de microcápsulas que contengan dos o más moléculas neuroactivas.
Además, un método alternativo de suministro de agentes neuroactivos
dentro del sistema nervioso central consiste en proporcionar unas
explantaciones de astrocitos, es decir unos astrocitos que han sido
recogidos y cultivados en un medio de cultivo de tejidos
artificiales, que han sido expuestos a las microesferas poliméricas
que contienen agentes neuroactivos encapsulados según la presente
invención; y al dejar los astrocitos rodear las microesferas (es
decir obtener un cultivo de astrocitos que contienen las
microesferas poliméricas dentro de su membrana celular),
transplantar estos astrocitos que contienen las microesferas
directamente dentro del sistema nervioso central.
Con el objeto de proporcionar una descripción más
completa y proporcionar una mejor comprensión de los distintos
aspectos de la presente invención, se hace referencia a los
ejemplos siguientes:
Se preparó una solución de polímeros de un 1 por
ciento en peso mediante la disolución de 2 g de 50:50
poli-(DL-lactida-co-glicólido)
("DL-PLG") en 198 g de
dicloro-metano (el DL-PLG tenía una
viscosidad inherente de 1,27 dL/g). Se sometieron a suspensión dos
gramos de dopamina (hidrocloruro de
3-hidroxi-tiramina) en la solución
de polímeros mediante homogeneización. La suspensión de dopamina se
vertió entonces en una cuba de resina de 300 ml y se agitó a 3500
rpm con un impulsor de Teflón de 3,81 cm (1,5 pulgadas). Se bombeó
el aceite de silicona a 350 mm^{2}/s (350 cs) dentro de la cuba de
resina a una velocidad de 2 ml por minuto. Después de añadir
aproximadamente 50 ml de aceite, se vertió el contenido de la cuba
de resina dentro de 3,5 l de heptano. Se agitó el heptano a 900 rpm
con un impulsor de acero inoxidable de 2,5 pulgadas. Después de 0,5
h de agitación, se vertió la suspensión de microesferas de dopamina
en un tamiz de acero inoxidable con aberturas de 45 \mum para
eliminar las microesferas mayores de 45 \mum de diámetro. Las
microesferas inferiores a 45 \mum de diámetro se recogieron en un
embudo de filtro de vidrio poroso y se secaron a temperatura
ambiente en un horno de vacío durante 48 horas. Se recogieron
entonces las microesferas de dopamina en frascos de escintilación
de vidrio tarados y se almacenaron en desecante a 4ºC.
Se encapsuló la dopamina según dos tipos de
excipientes de copolímero fabricados según el Ejemplo 1. Un
copolímero tenía un coeficiente molar de 50:50 de lactida con
respecto al glicólido y el otro copolímero tenía un coeficiente
molar de 65:35. Considerando el contenido superior de lactida del
copolímero de 65:35, este copolímero tardará más tiempo en
biodegradarse que el copolímero de 50:50. Así, el tiempo de
suministro del copolímero de 65:35 puede ser más largo que el tiempo
de suministro del copolímero de 50:50. Las variaciones adicionales
de las proporciones reales de lactida y glicólido en el copolímero
y la morfología del copolímero pueden fabricarse para ajustar más o
menos a la medida la velocidad y la cantidad de moléculas
neuroactivas que se estén liberando dentro del sistema nervioso
central.
Las microesferas finales son polvos de libre
circulación que se componen de partículas esféricas de 1 a 45
\mum aproximadamente de diámetro. Estas microesferas pueden
suspenderse fácilmente en vehículos acuosos e inyectarse por medio
de agujas hipodérmicas convencionales. Aunque la cantidad de
dopamina contenida en cada microesfera pueda variar, las
microesferas fabricadas y utilizadas en el ejemplo siguiente se
componían del 40% (en peso) aproximadamente de dopamina y del 60%
(en peso) aproximadamente de
poli-(DL-lactida-co-glicólido).
Cuando se utilizan como medio terapéutico, las microesferas pueden
contener desde el 1% aproximadamente hasta el 80% aproximadamente
[en peso] de dopamina). Las pruebas de difusión in vitro de
estas microesferas mostraban que la mayor parte de dopamina se
liberaba en agua desionizada en 30 minutos. Antes de la inyección,
se esterilizan las microesferas preferentemente con una radiación
gamma.
La dopamina microencapsulada se formuló (15 mg de
dopamina microencapsulada al 50:50 en una solución salina de 50
\mul o 30 mg de dopamina microencapsulada al 65:35 en una
solución salina de 50 \mul) para su implantación dentro de
modelos de ratas previamente tratadas.
Se lesionaron unilateralmente unas ratas macho en
el haz ascendente de neuronas de monoamina del cerebro anterior
medio mediante la utilización de la neurotoxina
6-hidroxi-dopamina. Dos semanas más
tarde, se pusieron a prueba los animales con apomorfina (0,1 mg/kg
SC) y las respuestas rotacionales fueron controladas en una
disposición de rotómetro computerizado. Solamente las ratas cuya
denervación con dopamina resultó exitosa mostrarán una fuerte
rotación contralateral a la prueba con apomorfina. Por lo tanto, se
eliminaron del estudio los animales con respuesta a la apomorfina
con menos de 400 rotaciones contralaterales por cada 60 minutos
durante las primeras dos semanas. Se continuó entonces con las
pruebas de los respondedores positivos sobre una base semanal
mediante el uso de apomorfina.
Una vez que los animales alcanzaron un nivel
estable sobre una línea de base rotacional con respecto al desafío
agonista de la dopamina, se les inyectó de forma estereotáxica bajo
una ligera anestesia con éter, una suspensión de microesferas de
dopamina. Se inyectaron microesferas de dopamina / 50:50
DL-PLG (15 mg de microesferas/50 \muL de solución
salina) en implantes de 3 \mul dentro del músculo estriado. De
manera correspondiente se implantaron microesferas de dopamina /
65:35 DL-PLG (30 mg de microesferas/50 \muL de
solución salina) en el músculo estriado. Según la experiencia, se
esperaba que las microesferas de 65:35 DL-PLG se
biodegradarían completamente en aproximadamente 12 semanas, y que
las microesferas de 50:50 DL-PLG harían lo mismo en
aproximadamente 6 semanas. Así, para asegurar que unas dosis
similares de dopamina se liberarían por unidad de tiempo, la
cantidad de dopamina en las microesferas de 50:50
DL-PLG fue de la mitad de la dopamina de las
microesferas de 65:35 DL-PLG. Las ratas de control
recibieron microesferas exentas de dopamina. Se utilizaron para las
inyecciones jeringuillas estándar de Hamilton (50 \mul) unidas
por un tubo de polietileno a unas cánulas de inyección de acero
inoxidable. A la finalización de la inyección, se dejaron "in
situ" las cánulas durante 60 segundos adicionales antes de
retirarlas lentamente y que la herida en la piel esté cerrada. A
partir de 1 a 3 días después de la implantación de las microesferas
de dopamina, los animales fueron sometidos a prueba repetidas veces
con respecto a la rotación inducida por la dopamina agonista a
distintos intervalos durante un período de 8 semanas.
Treinta a cuarenta minutos después de la
implantación intraestriatal de la dopamina microencapsulada, las
ratas que habían recibido la implantación de microesferas de
dopamina / 50:50 DL-PLG mostraban rotaciones
contralaterales de un amplitud similar a la de una dosis de prueba
anterior de apomorfina pero de una mayor duración.
Las ratas que habían recibido la implantación de
microesferas de dopamina / 65:35 DL-PLG mostraban
una respuesta algo más prolongada a la implantación; sin embargo
una vez empezada, estos animales tienen una amplitud de rotación de
pico similar a la de las ratas que han recibido las microesferas de
dopamina / 50:50 DL-PLG.
Se administraron también las microesferas vacías
como control, y éstas no modificaron su comportamiento rotacional
inducido por la apomorfina en la rata. Las evaluaciones
histológicas realizadas en los animales sacrificados indican que la
inyección de una suspensión de microesferas según la presente
invención dentro del cerebro de la rata es un medio aceptable de
suministro de dopamina en el sistema nervioso central; después de
la inyección, se observó solamente un daño mínimo en el tejido
circundante así como una reacción glial mínima. Así, existe una
pequeña preocupación de que exista una barrera morfológica que
puede impedir la difusión de la dopamina en la región señalada.
Así, hemos confirmado nuestra creencia original
de que las microesferas poliméricas específicas según la presente
invención, proporcionan un medio único y aceptable para introducir
moléculas neuroactivas dentro del sistema nervioso central.
El resultado más notable en el suministro de
dopamina al sistema nervioso central mediante la utilización del
método y de las microesferas de la presente invención, consiste en
encontrar la presencia de fibras inmunoreactivas de dopamina que
crecen hacia las microesferas de dopamina. Esto no se ve en la
implantación de las microesferas de control (aquellas microesferas
que no contienen dopamina). La capacidad de las microesferas
implantadas de dopamina, fabricadas e implantadas según la presente
invención, para provocar una ramificación neuronal puede
proporcionar no sólo un tratamiento para las enfermedades
neurológicamente debilitantes como la enfermedad de Parkinson, sino
también una curación.
Como parte de la investigación en curso en el
suministro directo de moléculas neuroactivas al cerebro, se
desarrolló un anticuerpo a la dopamina que no muestra ninguna
reactividad cruzada con otros sistemas neurotransmisores (como la
norepinefrina, la serotonina o el aminoácido
\gamma-butírico) cuando se utiliza en los
sistemas de pruebas ELISA. Se ha mostrado este anticuerpo en los
sistemas de pruebas tanto de ELISA como inmunocitoquímicos para
reconocer la dopamina y es un medio fiable para demostrar la
excrecencia de las fibras en el cerebro de las ratas tal como se
describe en el ejemplo siguiente:
El complejo inmunógeno para obtener anticuerpos
contra la dopamina se prepara mediante acoplamiento del hapteno al
glutaraldehído (G) y a la albúmina de suero de bovino (BSA). Se
inmunizan entonces los conejos con este inmunógeno.
Los anticuerpos dirigidos hacia la dopamina se
detectaron 50 días después de la programación de inmunización de 4
inyecciones a intervalos de 10 días. Para eliminar los anticuerpos
que se producen contra el BSA-G, el anticuerpo de
dopamina fue adsorbido por cromatografía de afinidad. Con el fin de
visualizar la dopamina dentro del tejido cerebral, se hizo una
perfusión de gluteraldehído en las ratas, fijando por este medio la
dopamina y las proteínas del tejido. Así, debido a que el
anticuerpo se dirige contra la
dopamina-gluteraldehído y una proteína, el
anticuerpo reconocerá este complejo dentro del cerebro.
Las ratas fueron anestesiadas profundamente con
pentobarbital sódico y la perfusión se realizó a través de la aorta
con una mezcla compuesta de un 5% de gluteraldehído y un
antioxidante para impedir la liberación rápida de dopamina desde el
tejido cerebral.
Después de realizar la perfusión en las ratas con
esta mezcla, se quitaron los cerebros y se dejaron para que se
equilibraran durante la noche en una solución con un 10% de
sucrosa. Luego, se congelaron, se seccionaron los cerebros y se
incubaron los trozos con antisuero de dopamina durante 24 horas. Al
día siguiente, se sometieron a reacción los trozos con biotina de
anti-conejo de cabra IgG que reconoce el antisuero
producido en el conejo.
A continuación, se incubaron los trozos con el
complejo de biotina-peroxidasa de avidina que
reconoce las moléculas de biotina fijas. Entonces, se sometió a
reacción la peroxidasa con un cromatógeno clásico para este tipo de
reacción, 3,3-diamino-benzidina y
se mejoró la reacción mediante la adición de sulfato de níquel de
amonio que produce un color violeta a la reacción del anticuerpo.
Por lo tanto, la presencia de dopamina en el tejido cerebral se
visualiza como depósito de color violeta en el tejido; si la
dopamina no está presente en el tejido, el tejido sigue sin
teñirse.
Además de la dopamina, se encapsuló también
noradrenalina en microesferas según la presente invención y se
sometió a prueba tal como se describe anteriormente con unos
resultados similares. Con las microesferas que contienen
noradrenalina, implantadas tal como se describe en el Ejemplo 2, la
duración de las disminuciones en el comportamiento rotacional
inducido por la apomorfina era mayor con noradrenalina encapsulada
en microesferas al 50:50 de DL-PLG que con dopamina
encapsulada en microesferas al 50:50 de DL-PLG. En
un estudio comparativo, a las 15 semanas después de la
implantación, se observó una disminución del 35% (el 65% de la línea
de base) en los animales en los cuales se implantaron las
microesferas de noradrenalina / 50:50 de DL-PLG; se
observó una disminución del 40% (60% de la línea de base) en los
animales en los cuales se implantaron las microesferas de dopamina /
65:35 DL-PLG; y se observó un <5% (>95% de
la línea de base) en los animales que recibieron microesferas
vacías de DL-PLG.
Para la visualización de las fibras neurales
después de la implantación de las microesferas que contienen
noradrenalina, se utilizaron un anticuerpo dirigido contra la
hidroxilasa de tirosina, una enzima encontrada en la etapa de
limitación de porcentaje tanto para la dopamina como para la
noradrenalina. Para la inmunoquímica de hidroxilasa de tirosina, se
aplicó a las ratas una sobredosis con pentobarbital sódico y se les
preparó una perfusión con un 4% de paraformaldehído tal como se
describe en el Ejemplo 3. A continuación se dispusieron los
cerebros durante 4 horas en la solución de paraformaldehído y luego
se sumergieron durante toda la noche en una solución salina
tamponada por fosfato que contenía un 10% de sucrosa. Se incubaron
entonces durante toda la noche los trozos de criostato con un
anticuerpo de hidroxilasa de antitirosina (1/800) y se procesaron
luego por medio de la metodología convencional de peroxidasa de
avidina-biotina. La hidroxilasa de tirosina
presente en los trozos aparece inmediatamente como un depósito de
color violeta.
El crecimiento de las fibras después de la
implantación de microesferas de noradrenalina es comparable al que
se observó después de la implantación de microesferas de dopamina.
Los resultados ultraestructurales confirmaron la presencia de
fibras inmunoreactivas de hidroxilasa de tirosina que crecían en el
músculo estriado hasta 4 meses después de la implantación de las
microesferas.
En un estudio similar, se implantó, tal como se
describe en el Ejemplo 2, una mezcla igual de dopamina encapsulada
en microesferas al 50:50 de DL-PLG y de
noradrenalina encapsulada en microesferas ala 50:50 de
DL-PLG. La implantación de esta mezcla de
microesferas produjo una reducciones significativas en el número de
rotaciones inducidas por la apomorfina hasta durante 3 meses; dos
animales en el grupo de prueba mostraron una reducción del 80% (% de
la línea de base) en el número de rotaciones inducidas por la
apomorfina durante 4 semanas. Esta reducción tan dramática en el
número de rotaciones inducidas por la apomorfina no se ha observado
en experimentos con implantación de microesferas que contenían
solamente dopamina o noradrenalina.
Se proporcionan los ejemplos siguientes para
demostrar las microesferas poliméricas alternativas utilizadas en
la presente invención.
Se preparó una solución de un 2 por ciento en
peso de polímeros mediante la disolución de 1 g de policaprolactona
en 49 g de dicloro-metano. (La policaprolactona
tenía una viscosidad inherente de 1,0 dl/g). Se sometió a
suspensión un gramo de dopamina (3-hidrocloruro de
hidroxi-tiramina) en la solución de polímeros
resultante. Se vertió entonces la mezcla de dopamina / polímeros en
una cuba de resina de 100 ml. Mientras se agitaba el contenido de
la cuba de resina a 3500 rpm con un impulsor de Teflón de 3,81 cm
(1,5 pulgadas), se bombeaba el aceite de silicona a 350 mm^{2}/s
(350 cs) dentro de la cuba de resina a una velocidad de 0,6 ml por
minuto. Después de añadir aproximadamente 8 ml de aceite, se vertió
el contenido de la cuba de resina dentro de 3 l de heptano. Se
agitó el heptano a 500 rpm con un impulsor de acero inoxidable de
6,35 cm (2,5 pulgadas). Después de 0,5 h de agitación, se
recogieron las microesferas de dopamina en un embudo de vidrio
poroso y se secaron a temperatura ambiente en un horno de vacío
durante 48 horas. Se procesaron las microesferas a través de un
tamiz de acero inoxidable con aberturas de 45 \mum para eliminar
las microesferas mayores de 45 \mum de diámetro. Se recogieron
entonces las microesferas de dopamina en frascos de escintilación
de vidrio tarados y se almacenaron en desecante a 4ºC.
Se preparó una solución de un 20 por ciento en
peso de polímeros mediante la disolución de 1 g de policaprolactona
en 4 g de dicloro-metano. (La policaprolactona
tenía una viscosidad inherente de 1,0 dl/g). Se formó una
dispersión mediante la suspensión de 1 g de dopamina
(3-hidrocloruro de hidroxi-tiramina)
en la solución de polímeros. Se formó una emulsión cuando se
trasladó la dispersión de dopamina / polímeros dentro de una cuba de
resina de 300 ml que contenía 188 g de un medio de proceso sometido
a agitación a 1200 rpm con un impulsor de Teflón de 3,81 cm (1,5
pulgadas). El medio de proceso se componía de un 5% en peso de
alcohol polivinílico y un 16% en peso de cloruro cálcico saturado
con 4,4 g de dicloro-metano. Después de 1 minuto de
agitación, las microesferas de dopamina fueron sometidas a
endurecimiento mediante extracción del
dicloro-metano de las microesferas. Esta extracción
se realizó por medio de la adición del contenido de la cuba de
resina en un baño que contenía 1022 g de una solución de un 32 por
ciento en peso de cloruro cálcico agitándose a 200 rpm. A los 10 y
20 minutos de esta última adición, se añadieron lentamente 500 ml
de agua al baño de extracción. (El tiempo de extracción total fue
de 30 minutos). Luego, el contenido del baño de extracción se
centrifugó a 1800 X G durante 45 minutos. Después de la
centrifugación, se recogieron las microesferas en un embudo de
vidrio poroso y se secaron a temperatura ambiente en un horno de
vacío durante 48 horas. Se procesaron las microesferas a través de
un tamiz de acero inoxidable con aberturas de 45 \mum para
eliminar las microesferas mayores de 45 \mum de diámetro. Se
recogieron entonces las microesferas de dopamina en frascos de
escintilación de vidrio tarados y se almacenaron en desecante a
4ºC.
Se preparó una solución de un 15 por ciento en
peso de polímeros mediante la disolución de 0,75 g de un copolímero
de polihidroxi-butirato /
polihidroxi-valerato (PHBV) en 4,3 g de
dicloro-metano. Se formó una dispersión mediante la
suspensión de 1 g de dopamina (3-hidrocloruro de
hidroxi-tiramina) en la solución de polímeros. Se
formó una emulsión cuando se trasladó la dispersión de dopamina /
polímeros dentro de una cuba de resina de 300 ml que contenía 179 g
de un medio de proceso sometido a agitación a 1400 rpm con un
impulsor de Teflón de 3,81 cm (1,5 pulgadas). El medio de proceso se
componía de un 5 por ciento en peso de alcohol polivinílico
saturado con 4,3 g de dicloro-metano. Después de 1
minuto de agitación, las microesferas de dopamina fueron sometidas
a endurecimiento mediante extracción del
dicloro-metano de las microesferas. Esta
extracción se realizó por medio de la adición del contenido de la
cuba de resina en un baño que contenía 1021 g de agua agitándose a
740 rpm. A los 30 minutos de agitación, se centrifugaron las
microesferas a 1800 x G durante 45 minutos. Luego, se recogieron las
microesferas en un embudo de vidrio poroso y se secaron a
temperatura ambiente en un horno de vacío durante 48 horas. Se
procesaron las microesferas a través de un tamiz de acero inoxidable
con aberturas de 45 \mum para eliminar las microesferas mayores de
45 \mum de diámetro. Se recogieron entonces las microesferas de
dopamina en frascos de escintilación de vidrio tarados y se
almacenaron en desecante a 4ºC.
Se preparó una solución de un 2 por ciento en
peso de polímeros mediante la disolución de 3 g de 55:45 de
DL-PLG en 150 g de dicloro-metano
(el DL-PLG tiene una viscosidad inherente de 1,0
dl/g). Se sometieron a suspensión tres gramos de norepinefrina en la
solución de polímeros resultante. Se vertió entonces la mezcla de
norepinefrina / polímero dentro de una cubeta de vidrio de 250 ml y
se mantuvo a 20ºC en un baño de hielo. Mientras se agitaba el
contenido de la cubeta a 4500 rpm con un emulsor Silverson, se
bombearon 350 mm^{2}/s (350 cs) de aceite de silicona dentro de
la cubeta a una velocidad de 1,9 ml por minuto. Después de añadir
aproximadamente 47 ml de aceite, se vertió el contenido de la cubeta
en 4,5 l de heptano. Se agitó la mezcla resultante a 1000 rpm con un
impulsor de acero inoxidable de 6,35 cm (2,5 pulgadas). A los 30
minutos, se recogieron las microesferas de norepinefrina en un
embudo de vidrio poroso y se secaron a temperatura ambiente en un
horno de vacío durante 48 horas. Se procesaron las microesferas a
través de un tamiz de acero inoxidable con aberturas de 45 \mum
para eliminar las microesferas mayores de 45 \mum de
diámetro.
Se pesaron en un tubo para cultivos (17 mm por
100 mm) de poliestireno 10 mg aproximadamente de microesferas de
dopamina, se añadieron luego 6 ml de fluido receptor (agua
destilada) en el tubo para cultivos. Se colocó en el tubo para
cultivos un filtro (16 mm por 4 mm) de suero y se posicionó la
extremidad inferior del filtro justo por encima de la superficie
del fluido receptor. La formación resultante se colocó en un
soporte de tubos de ensayo y se situó entonces en una incubadora
mantenida a 37ºC.
Se recogió una muestra de fluido receptor al
bajar el filtro hacia la parte inferior del tubo para cultivos
hasta que el fluido receptor fuera empujado lo más posible por
encima del filtro. Este fluido receptor se reservó luego para una
cuantificación de dopamina. Se trasladaron entonces 6 ml de fluido
receptor fresco al tubo para cultivos y se volvió a colocar el
filtro por encima del fluido receptor. La formación fue devuelta a
la incubadora hasta recoger la siguiente muestra. Se recogieron
muestras de liberación in vitro a los 15, 30, 45, 60, 120,
240 y 1440 minutos. La dopamina de las muestras fue cuantificada
espectrofotométricamente a 292 nm.
Tal como se observó en el Ejemplo 2, la
implantación de las microesferas de control no modificó las
respuestas rotacionales inducidas por la apomorfina en la rata,
indicando al menos una disminución del 95% de dopamina en el sistema
nervioso central. Las observaciones microscópicas de los tejidos
después de la coloración según el Ejemplo 3, confirmaron que la
dopamina estaba ausente en el músculo estriado de las ratas que
recibieron las microesferas de control, es decir que el tejido
cerebral permaneció sin coloración. Sin embargo, en los animales
que recibieron las microesferas de dopamina y que mostraron una
disminución continua en el comportamiento rotacional por la
apomorfina, las observaciones microscópicas indicaron que la
dopamina estaba presente tanto en las microcápsulas como en el
tejido. Tal como se observó anteriormente, se vieron crecer
numerosas extensiones de fibras finas hacia las microesferas
implantadas y la dopamina estaba presente en estas fibras. Estos
descubrimientos indican que las fibras nerviosas de dopamina
estaban creciendo dentro del sistema nervioso central de los
animales huésped, fenómeno hasta ahora no registrado. Las
microesferas implantadas que contienen la dopamina tienen
aparentemente la capacidad de provocar el crecimiento de fibras
nerviosas desde la parte ventral del cerebro hacia las
microesferas. Estas fibras estaban presentes en todos los animales
que mostraban una disminución continua en el número de rotaciones
inducidas por la apomorfina, lo que parecía debido a una liberación
de dopamina desde las microesferas así como a las fibras crecientes
de dopamina dentro del sistema nervioso central del huésped. Se
tomaron nota de observaciones similares para las microesferas de
dopamina tanto al 50:50 DL-PLG como al 65:35
DL-PLG.
La colocación anatómica de las microesferas de
dopamina parece importante tanto para el crecimiento de las fibras
como para la recuperación funcional cuando la colocación se
encuentra dentro del cerebro. Un músculo estriado de rata es
aproximadamente de 3 mm de ancho y de 4 mm de profundo. Las fibras
de dopamina que crecen desde la parte ventral del cerebro están
situadas principalmente en la parte ventral más central del músculo
estriado en comparación con la parte lateral extrema de este núcleo.
La colocación de las microesferas de dopamina en la parte ventral
del cerebro de la rata estimula el crecimiento de estas fibras
particulares. Parece que la difusión de la dopamina desde estas
microesferas colocadas en este lugar alcanza estas fibras y crecen
hacia las microesferas. La colocación lateral extrema de las
microesferas que contienen dopamina parece por lo tanto demasiado
distante para que la dopamina difundida desde las microesferas
pueda influir en estas fibras.
Las investigaciones inmunocitoquímicas con un
anticuerpo a la proteína asociada al crecimiento, proteína asociada
con sistemas que experimentan un crecimiento de las fibras,
indicaron que las fibras crecientes eran reactivas a esta proteína,
indicación de que las fibras nerviosas están experimentando un
crecimiento de fibras. La inyección de oro fluorado dentro del
músculo estriado denervado, 2 semanas después de la implantación de
microesferas de dopamina, indica la marcación retrógrada de las
neuronas dentro de la región tegmental ventral, lo que sugiere que
las microesferas de dopamina desencadenan el crecimiento de las
fibras de dopamina, que emanan de las células nerviosas en esta
región.
Se realizó otra observación del crecimiento de
las fibras cuando se implantaron las microesferas dentro del
músculo estriado de un modelo genético de ratón. La raza de ratón
Weaver lleva una mutación recesiva autosómica y proporciona a los
investigadores un medio para investigar el crecimiento de las fibras
después de la implantación de microesferas de dopamina dentro de
una región cerebral donde la dopamina se reduce
"naturalmente". Estos ratones genéticamente anormales están
empobrecidos seriamente de su dopamina cerebral. La anormalidad es
particularmente notable en el tracto estrio-nígrico
de la dopamina mientras las neuronas mesolímbicas de dopamina
parecen menos afectadas. La implantación de las microesferas de
dopamina dentro del músculo estriado de este modelo de ratones
estimula igualmente el crecimiento de las fibras de dopamina en el
músculo estriado, las cuales emanan probablemente del sistema de
dopamina genéticamente no afectado.
Las observaciones microscópicas de los tejidos
cerebrales de las ratas después de la administración de
microesferas según la presente invención, confirmaron que la
dopamina estaba ausente en el músculo estriado de las ratas que
recibían las microesferas vacías. Sin embargo, en los animales que
recibieron las microesferas de dopamina y mostraron una disminución
continua en el comportamiento rotacional por apomorfina, las
observaciones microscópicas indicaban que la dopamina estaba
presente tanto en las microesferas como en el tejido. Se observaron
unos resultados similares en los animales que recibieron las
microesferas de noradrenalina. Se vieron crecer numerosas
extensiones de fibras finas dentro del sistema nervioso central de
los animales huésped.
Mientras las observaciones microscópicas
electrónicas revelaban la presencia de neuritas inmunoreactivas que
tenían contactos postsinápticos con los axones inmunonegativos,
este estudio demostró también un descubrimiento de lo más
inesperado: las microesferas estaban absorbidas por los astrocitos
dentro del tejido nervioso de los animales huésped. Los factores
derivados de los astrocitos regulan la supervivencia neuronal, la
maduración bioquímica y la diferenciación morfológica in
vitro. La pérdida intracelular continua de los agentes
neuroactivos procedentes de las microesferas "ingeridas" pueden
desencadenar sistemas mensajeros secundarios en los astrocitos que
conducen eventualmente a una activación de los "genes dormidos"
en el núcleo y una inducción, o incremento, de la producción de
factores de crecimiento. Estos factores de crecimiento pueden ser
un factor específico o un cóctel de factores que los astrocitos
pueden segregar dentro del espacio extracelular y que ejercen una
influencia trófica a distancia. Se ha mostrado por ejemplo, que
"la transmisión de volumen", es decir la difusión de moléculas
a zonas distantes en el tejido cerebral, puede desempeñar un papel
importante para la neuromodulación/ transmisión normal y es
probable que esté implicada en el trofismo. Los diversos efectos
neuronotróficos de los astrocitos sugieren que estas células pueden
expresar moléculas solubles y/o de membrana asociada con un
espectro de actividades biológicas. El descubrimiento de que las
microesferas que contienen neuroactivos están presentes dentro de
los astrocitos puede explicar así los efectos de estimulación del
crecimiento de las fibras neurales observados con las microesferas
según la presente invención.
A la vista de estos descubrimientos inesperados,
se realizó un estudio in vitro para confirmar lo que se
había observado in vivo.
Los astrocitos fueron obtenidos originalmente a
partir del músculo estriado de una rata de un día de edad. Se
separaron los astrocitos de las neuronas y otras células nerviosas
pasando el tejido disecado por una red de nylon estéril. Luego se
cultivaron las células en un matraz de cultivo en un medio de
cultivo completado por suero durante una semana y se trasladaron
luego en cubetas de cultivo de 35 mm.
Se colocaron las microesferas de dopamina (15 mg)
en 10 ml del medio de cultivo durante toda la noche a 37ºC para que
se equilibraran. Se añadió a las cubetas de cultivo un ml del medio
agitado que contenía las microesferas dispersas y se dejaron
permanecer en contacto con los cultivos de tejido de astrocitos
durante una semana.
Las observaciones por microscopio electrónico de
exploración de las células después de este protocolo de cultivo
confirmaron que los astrocitos absorben las microesferas que tienen
un promedio de diámetros medios desde menos de 10 \mum
aproximadamente. Aunque no se observaran con esta técnica
microesferas de mayor tamaño, es posible que unas microesferas de
mayor diámetro fueran absorbidas y por lo tanto se consideran los
tamaños mayores de microesferas como modificaciones y alteraciones
potenciales de la presente invención.
Después de la incubación de una semana, se aspiró
el medio de cultivo, se enjuagaron las células con una solución
salina tamponada por fosfato y se sometieron a la tripsina durante
cinco minutos. Se añadió un medio que contenía suero de becerro a
las células sometidas a la tripsina para parar la reacción. Se
centrifugaron entonces las células durante 5 minutos y se volvieron
a suspender en 200 \mul de medio de cultivo.
Se denervaron las ratas adultas con
6-OHDA durante un mes después de los protocolos
conocidos. Luego se implantó a las ratas 2 x 3 \mul del cultivo de
astrocitos en suspensión en dos lugares distintos en el músculo
estriado.
Doce semanas después de la implantación, los
animales que habían recibido las microesferas que contenían
astrocitos, mostraron una reducción del 45% (% de la línea de base)
de las rotaciones (ver Ejemplo 2), mientras que los animales que
habían recibido las microesferas vacías de astrocitos mostraron una
reducción del 15% aproximadamente de rotaciones. Estos resultados
pueden interpretarse como indicación de que dentro del sistema
nervioso central las microesferas absorbidas por los astrocitos
pueden proporcionar un medio para asegurar una liberación más
prolongada de dopamina porque la dopamina está realmente
encapsulada dos veces en este sistema: una vez dentro del polímero y
una segunda vez dentro del astrocito. La utilización de los
astrocitos como sistema de suministro puede mejorar el crecimiento
de las fibras ya que estas células están implicadas en la
producción y mantenimiento de numerosos factores de
crecimiento.
La inmunoquímica realizada 9 meses más tarde,
reveló el crecimiento de las fibras y la viabilidad de los
astrocitos; se visualizó el crecimiento de las fibras con
hidroxilasa de antitirosina, y los astrocitos con la proteína
fibrilar antiglial.
Claims (27)
1. Un vehículo suministrador de un medicamento
para proporcionar un agente neuroactivo dentro del sistema nervioso
central que comprende unos astrocitos, teniendo dichos astrocitos
dentro de su membrana celular una microesfera que comprende el
agente neuroactivo encapsulado dentro de una microesfera
polimérica, dicha microesfera (1) siendo permeable a la molécula
neuroactiva, (2) siendo biocompatible con los tejidos del sistema
nervioso central, y (3) teniendo las características cinéticas de
que pueden ser manipuladas para tener en cuenta la penetración de la
molécula neuroactiva a través de la microesfera a una velocidad
controlada y un período de tiempo predeterminado.
2. El vehículo suministrador del medicamento
según la Reivindicación 1, caracterizado porque el diámetro
medio de las microesferas se sitúa entre 0,1 \mul y 20
\mum.
3. El vehículo suministrador del medicamento
según la Reivindicación 1, caracterizado porque el diámetro
medio de las microesferas se sitúa entre 0,1 \mul y 10
\mum.
4. El vehículo suministrador del medicamento
según la Reivindicación 1, caracterizado porque el polímero
es biodegradable dentro de los tejidos del sistema nervioso
central.
5. El vehículo suministrador del medicamento
según la Reivindicación 1, caracterizado porque la molécula
neuroactiva comprende un neurotransmisor, un neuropéptido, o un
factor neurotrófico.
6. El vehículo suministrador del medicamento
según la Reivindicación 1, caracterizado porque la molécula
neuroactiva comprende norepinefrina, epinefrina, serotonina,
dopamina, substancia P, somatostatina, el factor de crecimiento
nervioso, angiotensina II, el factor de liberación de
corticotropina, colina, acetilcolina, agentes colinérgicos
neurona-tróficos, el factor de crecimiento
fibroblástico básico, el factor de crecimiento fibroblástico ácido,
el factor de crecimiento derivado del cerebro, el factor de
crecimiento de insulina, el factor \beta de crecimiento de
transformación, el factor de crecimiento epidérmico, el factor de
crecimiento de transformación, factor de crecimiento derivado de la
glía, estrógeno, litio, ácido
\gamma-amino-butírico, miméticos
de ácido \gamma-amino-butírico,
oxitocina, fenetil-amina, o
interleuquina-1.
7. El vehículo suministrador del medicamento
según la Reivindicación 1, caracterizado porque la molécula
neuroactiva es dopamina.
8. El vehículo suministrador del medicamento
según la Reivindicación 1, caracterizado porque el polímero
comprende una poliéster-amida, un poliortoéster, un
ácido de poli
\beta-hidroxi-butírico, un
polianhídrido, un polidieno, un polialquileno, un polimetacrilato,
un éter de polivinilo, un alcohol de polivinilo, un cloruro de
polivinilo, un éster de polivinilo, un policarbonato, un poliéster,
un éter de celulosa, un éster de celulosa, un polisacárido, una
policaprolactona, o almidón.
9. El vehículo suministrador del medicamento
según la Reivindicación 1, caracterizado porque el polímero
comprende el copolímero de
poli-(lactida-co-caprolactona), el
copolímero de polihidroxi-butirato /
polihidroxi-valerato, polibutadieno,
polimetil-metacrilato,
polihidroxi-etil-metacrilato,
acetato de polivinilo, metil-celulosa,
hidroxi-etil-celulosa,
hidroxi-propil-metil-celulosa,
acetato de celulosa, o aceto-butirato de
celulosa.
10. El vehículo suministrador del medicamento
según la Reivindicación 1, caracterizado porque el polímero
comprende un copolímero de
poli-(lactida-co-glicólido), un
homopolímero de polilactida, o un homopolímero de
poliglicólido.
11. El vehículo suministrador del medicamento
según la Reivindicación 1, caracterizado porque las
microesferas comprenden una mezcla de microesferas que contienen
dos o más grupos de microesferas, en las cuales cada grupo contiene
un tipo diferente de molécula neuroactiva.
12. Utilización del vehículo de cualquiera de las
reivindicaciones anteriores para preparar una preparación para
tratar un estado neurológico o una lesión de la médula espinal.
13. La utilización según la Reivindicación 12,
caracterizada porque el estado neurológico es la enfermedad
de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica, la corea de
Huntington, la enfermedad de Alzheimer, la epilepsia, o la
disquinesia tardía.
14. Un método para fabricar un dispositivo
suministrador del medicamento según la Reivindicación 1, que
comprende la exposición de explantaciones de astrocitos a las
microesferas poliméricas que contienen agentes neuroactivos
encapsulados y permitir que los astrocitos rodeen las
microesferas.
15. El método según la Reivindicación 14 que
comprende:
- a.
- obtener las explantaciones de astrocitos;
- b.
- poner en contacto las explantaciones con las microesferas poliméricas que tienen encapsuladas dentro, un agente neuroactivo en el cual las microesferas tienen un diámetro inferior a 45 \mum aproximadamente, y en el cual se selecciona el polímero de dichas microesferas a partir de aquellos polímeros definidos en una de las reivindicaciones 8 a 10.
16. El método según la Reivindicación 14 ó 15,
caracterizado porque el diámetro medio de las microesferas se
sitúa entre 0,1 \mum y 20 \mum.
17. El método según la Reivindicación 16,
caracterizado porque el diámetro medio de las microesferas
se sitúa entre 0,1 \mum y 10 \mum.
18. La utilización de las microesferas
poliméricas que comprenden una molécula neuroactiva, dichas
microesferas poliméricas (1) siendo permeables a la molécula
neuroactiva, (2) siendo biocompatibles con los tejidos del sistema
nervioso central, caracterizadas porque el polímero (3)
tiene las características cinéticas que tienen en cuenta la
penetración de la molécula neuroactiva a través de la microesfera a
una velocidad controlada y un período de tiempo predeterminado para
la fabricación de un sistema que los astrocitos deben absorber para
tratar un estado neurológico en el cual el diámetro medio de las
microesferas se sitúa entre 0,1 \mum y 10 \mum y en el cual se
selecciona el polímero a partir de la policaprolactona, el
copolímero de polihidroxi-butirato /
polihidroxi-valerato,
poli-(lactida-co-caprolactona),
poliéster-amida, poliortoéster, un ácido poli
\beta-hidroxi-butírico, un
polidieno, un polialquileno, un polimetacrilato, un éter de
polivinilo, un alcohol de polivinilo, un cloruro de polivinilo, un
éster de polivinilo, un policarbonato, un poliéster, un éter de
celulosa, un éster de celulosa, un polisacárido, o almidón.
19. La utilización según la Reivindicación 18,
caracterizada porque la preparación se utiliza como sistema
suministrador de dopamina.
20. La utilización según la Reivindicación 18,
caracterizada porque el polímero comprende el copolímero de
polihidroxi-butirato /
polihidroxi-valerato, polibutadieno,
polimetil-metacrilato,
polihidroxi-etil-metacrilato,
acetato de polivinilo, metil-celulosa,
hidroxi-etil-celulosa,
hidroxi-propil-metil-celulosa,
acetato de celulosa, o aceto-butirato de
celulosa.
21. La utilización según la Reivindicación 18,
caracterizada porque el polímero es una policaprolactona o
el copolímero de polihidroxi-butirato /
polihidroxi-valerato.
22. La utilización según la Reivindicación 18,
caracterizada porque la molécula neuroactiva comprende un
neurotransmisor, un neuropéptido, o un factor neurotrófico.
23. La utilización según la Reivindicación 18,
caracterizada porque la molécula neuroactiva comprende la
norepinefrina, epinefrina, serotonina, dopamina, substancia P,
somatostatina, el factor de crecimiento nervioso, angiotensina II,
el factor de liberación de corticotropina, colina, acetilcolina,
agentes colinérgicos neurona-tróficos, el factor de
crecimiento fibroblástico básico, el factor de crecimiento
fibroblástico ácido, el factor de crecimiento derivado del cerebro,
el factor de crecimiento de insulina, el factor \beta de
crecimiento de transformación, el factor de crecimiento epidérmico,
el factor de crecimiento de transformación, factor de crecimiento
derivado de la glía, estrógeno, litio, ácido
\gamma-amino-butírico, miméticos
de ácido \gamma-amino-butírico,
oxitocina, fenetil-amina, o
interleuquina-1.
24. La utilización según la Reivindicación 18,
caracterizada porque las microesferas comprenden una mezcla
de microesferas que contienen dos o más grupos de microesferas, en
las cuales cada grupo contiene un tipo diferente de molécula
neuroactiva.
25. La utilización según la Reivindicación 18,
caracterizada porque la molécula neuroactiva es dopamina y
el polímero es una policaprolactona.
26. La utilización según la Reivindicación 18,
caracterizada porque la molécula neuroactiva es dopamina y
el polímero es un copolímero de
polihidroxi-butirato /
polihidroxi-valerato.
27. La utilización según la Reivindicación 18,
caracterizada porque la preparación se utiliza para tratar
la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica, la
corea de Huntington, la enfermedad de Alzheimer, la epilepsia o la
disquinesia tardía.
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