JPH10501523A - 無被覆ゲル粒子を用いる方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ドナー生細胞を宿主動物に、該宿主動物による該ドナー細胞の炎症性応答または拒絶反応なしに移植する方法であって、ドナー生細胞を封入した、生体適合性の非温度依存性ゲルから基本的になる無被覆粒子を得るが、ここで、該無被覆粒子は、宿主動物の免疫細胞が該粒子に進入するのを防ぐが、該粒子への宿主動物のＩｇＧおよび補体の進入は妨げない分子量カットオフを与えるものである段階と、該無被覆粒子を該宿主動物に移植する段階とによって実施する方法を対象とする。

Description

【発明の詳細な説明】 無被覆ゲル粒子を用いる方法 ［発明の背景］ 本発明は、ビーズまたは球体のようなゲル粒子を用いる方法に関する。 比較的少数の生細胞を包有する、例えばアルギン酸塩のゲルマイクロカプセル が、宿主動物にドナー細胞を同種移植片、すなわち同じ種の移植体と異種移植片 、すなわち異なる種の移植体との双方として移植するのに用いられている。マイ クロカプセルは、主として、ドナー細胞を宿主の免疫系から免疫隔離することを 意図して用いられる。アルギン酸マイクロカプセルの場合、それらは、内側のゲ ル核、および外側の半透膜またはその他の、宿主の免疫系の構成要素がマイクロ カプセル核内に進入し、細胞を破壊するのを防ぐよう制御された多孔性を有する 被覆を包含する。 細胞、例えば膵島細胞をアルギン酸ゲルにマイクロカプセルで封入する方法は 、いくつか研究されている。これらは、Lim ら；米国特許第4,391,909 号明細書 、およびSoon-Shiong ら；Transplantation、第54巻769 〜774 ページ（1992年 ）に記載のアルギン酸塩−ポリリシンの手法、Rha ら；米国特許第4,744,933 号 明細書に記載のアルギン酸塩−キトサン系、ならびにSefton；米国 特許第4,353,888 号明細書に記載のポリアクリレート封入法を包含する。これら の方法はそれぞれ、内側の核とは異なる外側の被覆を有する、アルギン酸ゲルの マイクロカプセルを結果的に生じる。 アルギン酸塩−ポリリシンの手法は、ゲル化した一時的な小滴を形成する小滴 発生装置を用いて、細胞とアルギン酸ナトリウムとの混合物をＣａＣｌ₂溶液中 に押出すことを含む。次いで、これらの小滴を正に荷電したポリリシンで被覆し て、ゲル化した小滴の周囲に半透性の外膜または被覆を形成する。試験は、これ らのマイクロカプセルが不安定であり、動物の腹腔内に移植すると、炎症性およ び線維形成性の応答を生じることを示した。しかし、ポリリシン膜を覆う第三の 外側アルギン酸層の追加は、マイクロカプセルの生体適合性を改良して、O'Shea ら；Biochim．Biophys．Acta、第804 巻133 〜136 ページ（1984年）に記載のと おり、糖尿病の齧歯類での膵島同種移植片の機能の持続期間を１年より長く延長 することになった。 アルギン酸塩−ポリリシンマイクロカプセルは、同種移植片および異種移植片 中の細胞を延命させることが示されているものの、これらのマイクロカプセルは 、一般に、シクロスポリン（「ＣｓＡ」）のような免疫抑制剤の補助投与を必要 とする。しかし、治療的な、すなわち免疫抑制する投与量で用いると、これらの 薬剤は、感染、癌および腎毒性をはじめとする重篤な副作用の宿主 を生じる。したがって、治療的投与量での免疫抑制剤の使用は望ましくない。 それにも拘らず、免疫抑制剤は、依然として用いられている。例えば、Soon-S hiong ら；Transplantation、第54巻769 〜774 ページ（1992年）、およびSoon- Shiong ら；P.N.A.S.，USA、第90巻5,843 〜5,847 ページ（1993年）は、糖尿病 のイヌへのイヌ膵島の同種移植片のための、ＣｓＡによる持続的または一時的な 、例えば３０日の免疫抑制をともに有するアルギン酸塩−ポリリシン−アルギン 酸塩マイクロカプセルの使用を記載している。いずれの組のイヌも、平均１００ 日間を超えてインシュリンに依存しないままであった。 もう一つの報告では、Soon-Shiong ら；1st Int'l．Cong．Xenotrans．、22ペ ージ（米国ミネソタ州ミネアポリス、1991年）は、ストレプトゾトシンで誘発し た糖尿病のラットでのアルギン酸塩−ポリリシンマイクロカプセル封入による不 一致膵島異種移植片の機能の延長を記載している。マイクロカプセルに封入した イヌやヒトの膵島をラットに腹腔内移植し、封入しなかった膵島移植体と比較し た。研究の継続期間中に、低投与量ＣｓＡ療法が両群に構築された。イヌ膵島に ついては４３〜１２３日間、ヒト膵島については４２〜１３６日間、適正血糖が 維持された。対照的に、封入しなかった膵島は、２日間に満たない適正血糖を達 成した。 しかしながら、免疫抑制なしのマイクロカプセルの使 用については、少数の報告がある。例えば、Weber ら；Transplantation、第49 巻396 〜404 ページ（1990年）は、不一致の、例えば類縁関係のない種からの異 種移植片を記載していて、イヌ膵島を含有するアルギン酸塩−ポリリシンマイク ロカプセルは、糖尿病のＮＯＤマウスでは平均して１１．５＿３日間機能したに すぎない。しかし、抗ＣＤ４モノクローナル抗体による免疫抑制処理は、何匹か の受容マウスの細胞が平均して８３日間機能性のままであるのを許した。 加えて、Iwata ら；Diabetes、第38巻（増補第１号）224 〜225 ページ（1988 年）は、一致異種移植片、すなわち異なりはするが近縁の種からの移植体、例え ば、ハムスター細胞からマウスへのような齧歯類から齧歯類への移植体とした、 アガロースゲル微小球体に封入した膵島細胞の使用を記載している。この研究で は、免疫抑制剤は全く用いず、マウス２匹が、それぞれ２９日および５３日間正 常血糖のままであった。 第二の同様な一致異種移植片の研究であるIwata ら；Transplantation Proc． 、第24巻952 ページ（1992年）では、宿主マウスに対する１５−デオキシスペル グアリンという薬物の免疫抑制効果を、免疫抑制を全く受けなかった対照マウス と比較した。Iwata らは、血中グルコースレベルが、８個の異種移植片中２個が １００日を超えて生存したにすぎないことを示したことから、免疫抑制なしのア ガロース微小球体は、一致異種移植片を拒絶 反応から効果的に保護できなかったと結論した。しかし、免疫抑制薬を１２０日 間（２．５mg／kg／日）または４０日間（５．０mg／kg／日）受けていたマウス では、血中グルコースレベルは、５個の異種移植片中３個が１００日を超えて生 存したことを示した。 もう一つの研究では、Iwata ら；Transplantation Proc．、第24巻934 ページ （1992年）は、アガロース微小球体に収めたマウス膵島同種移植片を用いて、免 疫抑制なしの糖尿病マウスで正常血糖を達成した。血中グルコースレベルは、こ れらの同種移植片の大部分が１００日を超えて生存したことを示した。 ［発明の要約］ 生体適合性の非温度依存性ゲル粒子、例えばビーズを用いる本方法は、アルギ ン酸ビーズに封入したドナー細胞、例えばブタ、ウシまたはイヌの膵島細胞が、 ビーズの周囲にいかなる保護被覆または半透膜もなしに、また、用いるとしても 最小投与量の免疫抑制薬または抗炎症薬を用いて、宿主動物、例えばマウス、ラ ットまたはイヌに好成績で移植できるとの発見に基づく。これらの簡単な、無被 覆ビーズは、ビーズ内のドナー細胞の線維形成応答または宿主免疫拒絶反応を誘 発することなしに、宿主に移植し、封入された細胞の効果的な免疫隔離を与える ことができる。 広義には、本発明は、ドナー生細胞を宿主動物に、該宿主動物による該ドナー 細胞の炎症応答または拒絶反応 なしに移植する方法であって、ドナー生細胞を封入した生体適合性の非温度依存 性ゲルから基本的になる無被覆粒子を得るが、ここで、該無被覆粒子は、該宿主 動物の免疫細胞が該粒子に進入するのを防ぎ、該粒子への宿主動物のＩｇＧおよ び補体の進入は妨げない分子量カットオフを与えるものである段階と、該無被覆 粒子を該宿主動物に移植する段階とによって移植する方法を特徴とする。 ここで用いられる限りで、「非温度依存性ゲル」は、例えば、カルシウム、カ リウムまたはバリウムイオンのようなイオンの添加によって、温度の変化なしに ゲル化もしくは架橋結合できるゲルである。「無被覆粒子」とは、透過性、およ びゲル基質自体のそれとは異なる分子量カットオフを有する、例えば半透膜の形 態での、いかなる表面もしくは中間層も保有しない生体適合性の非温度依存性ゲ ル基質で構成される、ビーズ、球体または他のゲル構造、例えば円筒を意味する 。 ここで用いられる限りで、「分子量カットオフ」とは、マイクロカプセルを囲 む半透膜によって、または本発明による無被覆ゲル粒子、例えばビーズ内のゲル 基質自体によって実質的に遮断されない最大分子量の大きさを意味する。該カッ トオフを上回る分子量を有する分子は、該マイクロカプセルまたはゲル粒子を出 入りすることが実質的に妨げられる。従来の技術によるアルギン酸マイクロカプ セルの被覆は、一般に、50,000ダルトンよ り大で、100,000 ダルトンより小である分子量カットオフを与える。本発明の無 被覆ゲル粒子は、約500,000 ダルトンより大きい分子量カットオフを有する。す なわち、ＩｇＧや補体のような分子はこれらのゲル粒子に進入できるが、免疫細 胞のような宿主細胞は、これらのゲルへ粒子への進入が妨げられる。加えて、こ の高い分子量カットオフは、封入した細胞が分泌する分子、例えば第VIII因子ま たはホルモンがゲル粒子から出るのを許す。 本発明は、ドナー生細胞を宿主動物に、該宿主動物によるドナー細胞の炎症応 答または拒絶反応なしに移植する方法であって、水、および生体適合性の非温度 依存性液体ゲルから基本的になる液体培地に該ドナー生細胞を懸濁させる段階と 、少なくとも１個の生細胞を含む該液体培地の小滴を形成する段階と、該小滴を 固化して、該生細胞を封入するゲル粒子を形成し、そのため外側被覆が該粒子に 全く形成されず、また該無被覆粒子は、宿主動物の免疫細胞が該粒子に進入する のを防ぎ、該粒子への宿主動物のＩｇＧおよび補体の進入は妨げない分子量カッ トオフを与えるものである段階と、該無被覆粒子を該宿主に移植する段階とによ って実施する方法も特徴とする。 液体培地が膵島を含むときの特定の実施態様では、それらは、膵島約２〜６０ 個／mm³、より好ましくは約１０〜３５個／mm³、すなわち培地１mm³あたり膵島 10,000〜35,000個の密度で存在できる。液体培地が他の生細胞を含むときは、そ れらは培地１mm³あたり細胞約１０⁵〜１０⁸個、好ましくは１０⁶〜１０⁷個の密 度で存在できる。密度は、個々の膵島の大きさおよび代謝に依存する。 更に、本発明は、患者における物質の不充分な生産によって生じた患者の疾患 を治療する方法であって、該物質を分泌するドナー生細胞を封入した、生体適合 性の非温度依存性ゲルから基本的になる無被覆粒子を得るが、ここで、該無被覆 粒子は、該患者の免疫細胞が該粒子に進入するのを防ぎ、該粒子への患者のＩｇ Ｇおよび補体の進入は妨げない分子量カットオフを与えるものである段階と、該 生細胞が生理的活性のままであり、該物質を該患者内に分泌して、該疾患を治療 するのを許す場所および方式で、該無被覆粒子を該患者に移植する段階とによっ て実施する方法を特徴とする。例えば、無被覆粒子は、患者の免疫免除された部 位に移植できる。 特定の実施態様では、疾患は糖尿病であり、ドナー細胞は膵島細胞である。ド ナー細胞は、第IX因子、第VIII因子、インターロイキン、インターフェロン、内 分泌ホルモン、神経成長因子、腫瘍壊死因子α、向神経性因子または神経伝達物 質を分泌するように選べる。疾患は、真性糖尿病、肝臓病、筋萎縮性側索硬化症 、血友病、甲状腺機能低下症、パーキンソン病、後天性免疫不全症候群、デュシ ェン筋ジストロフィー、不妊症、てんかん、 ハンチントン病、副甲状腺機能低下症、気分障害、運動ニューロン疾患、骨粗鬆 症またはアルツハイマー病であることができる。 本発明は、生細胞を培養する生体内の方法であって、生体適合性の非温度依存 性ゲルから基本的になる無被覆粒子内に該生細胞を封入し、該無被覆粒子を動物 に挿入し、該動物を成長させ、それによって細胞を培養することによって実施す る方法も特徴とする。 更に、本発明は、生細胞を培養する生体外の方法であって、生体適合性の非温 度依存性ゲルから基本的になる無被覆粒子内に該生細胞を封入し、栄養素および 酸素を含む培地中に該無被覆粒子を置き、該細胞を成長させるのに充分な量の栄 養素および酸素を維持し、それによって該細胞を培養することによって実施する 方法も特徴とする。 加えて、本発明は、生細胞を含有する無被覆の非温度依存性ゲル粒子を製造す る方法であって、水、および生体適合性の非温度依存性液体ゲルから基本的にな る液体培地に該生細胞を懸濁させる段階と、該液体培地の小滴を形成する段階と 、該小滴を固化して、該生細胞を封入したゲル粒子を形成し、そのため該粒子に 外側被覆が全く形成されない段階と、ゲル化した無被覆粒子を栄養培地中に貯蔵 して、該生細胞の生存度を維持する段階とからなる方法も特徴とする。 これらの方法のすべてにおいて、ドナー生細胞は、宿 主動物と同じであるか、または異なる種から得ることができ、遺伝的に変化させ たヒトの細胞であることができる。宿主動物は、イヌまたはヒトであることがで きる。ドナー細胞は、ブタ、ウシ、イヌ、細菌、真菌または植物の細胞であるこ とができる。特に、ドナー細胞は、膵島細胞であることができ、あるいは第IX因 子、第VIII因子、インターロイキン、インターフェロン、内分泌ホルモン、神経 成長因子、腫瘍壊死因子α、向神経性因子または神経伝達物質を分泌できる。 特定の実施態様では、ゲル粒子は、球形であり、５０〜６，０００ミクロン、 好ましくは２，０００〜４，５００の直径を有する。ゲルは、アルギン酸塩また はアルギン酸誘導体であることができ、アルギン酸塩は、イオン、例えばカルシ ウム塩中のカルシウムで架橋結合できる。無被覆ゲル粒子は、生物分解可能であ ることができ、無被覆粒子中でのゲルの分解速度は、ドナー細胞の期待寿命に見 合うように選べる。 別の実施態様では、無被覆粒子は、ドナー細胞に加えて自家赤血球も封入する か、または移植前に酸化窒素阻害剤で処理できる。加えて、この方法は、封入せ ずにドナー細胞を宿主動物に移植したときには、無被覆粒子の線維形成および炎 症を阻害するのに効果的であるが、免疫抑制を達成するのに必要とされるより低 い投与量で、薬物を宿主動物に投与する段階を包含できる。例えば、薬物は、シ クロスポリンであることができ、約１００ng ／ml未満の全血トラフレベルを宿主動物で達成する投与量で投与できる。加えて 、薬物は、移植後数週間、例えば１ケ月まで、またはそれより長く投与でき、そ れ以後は投与されない。 本発明は、ビーズの粒径、ゲル基質の型式、および膵島細胞についての最適細 胞密度をはじめとする、移植体の機能および寿命を増強する様々な別の特徴も与 える。ゲル基質は、宿主細胞、すなわち免疫細胞をドナー組織細胞から物理的に 隔離することが不可欠である。封入された生細胞が分泌する抗原を基質中に蓄積 させず、宿主に直接接触させないでおくのに、そして封入したドナー細胞を、酸 化窒素、リンホカイン類、サイトカイン類およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞 毒性因子のような、宿主の小型の可溶性または細胞毒性因子から保護するのに充 分な粒径を粒子が有することも重要である。基質の荷電および化学特性も、この 点で重要である。 別途定義されない限り、ここで用いられるすべての技術的および学術的用語は 、本発明が属する技術の通常の技量を有する者が、一般的に理解するのと同じ意 味を有する。本発明の実施または試験には、ここに記載されたのと同様または等 価の方法および材料が用いる得るものの、好ましい方法および材料を下記に示す 。ここで言及されたすべての出版物、特許出願書、特許その他の参照文献は、参 照によって組み込まれる。加えて、材料、方法および実施例は、例示であるにす ぎず、限定を意図す るものではない。 本発明のその他の特徴および利点は、下記の詳細な説明、および請求項から明 白になると思われる。 ［図面の簡単な説明］ 図１は、１８日経過後の線維形成したアルギン酸ゲルビーズ（細胞内の線維） を消化しているマウスマクロファージの顕微鏡写真である。 図２は、マウスの血漿グルコースレベルに対するブタ膵島移植体の効果を示す グラフである（ＣｓＡなし）。 図３は、マウスの血漿グルコースレベルに対するウシ膵島移植体の効果を示す グラフである（ＣｓＡなし）。 図４は、ラットの血漿グルコースレベルに対するウシ膵島移植体の効果を示す グラフである（ＶＢＲ５３ＣｓＡ）。充実した円は、膵島の４種類の投与レベル （６０Ｋ、８０Ｋ、１００Ｋおよび１２０Ｋ）を表す。充実した棒はＣｓＡを表 す。 図５Ａおよび５Ｂは、低投与量のシクロスポリンとともにイヌ膵島を移植する 前後での糖尿病患者であるイヌの血中グルコースレベルを示すグラフである。 ［詳細な説明］ 本発明によれば、様々な型式のドナー細胞を単離し、封入し、そうして宿主に 移植することができる。細胞の単離 当技術に公知の手順を用いて、細胞を周囲の組織から単離するか、または培地 で増殖させ、次いで、液体培地 に懸濁させてから、封入する。例えば、Lanza ら；P.N.A.S.，USA、第88巻11,10 0〜11,104ページ（1991年）に以前に記載されたとおり、Warnock およびRajotte ；Diabetes、第37巻467ページ（1988年）の方法の変更によって、成体の雑種イ ヌ、ブタまたは仔ウシ（０〜２週齢）のいずれかから、膵島細胞を調製した。 略述すると、無菌手術室の手順下で、無菌の生存可能なブタ膵臓を得た。摘出 （約１５分未満の暖虚血）の後、腺に挿管し、冷やした（４℃）ウィスコンシン 大学（ＵＷ）器官保存液を注入した。管内コラゲナーゼ消化の手順を用いて、膵 組織を解離させた。コラゲナーセは、蠕動ポンプによって送達し、消化された膵 臓は、２〜６mmのガラスビーズを収めたポリプロピレン解離室内で、機械的に破 裂させる。不連続密度勾配遠心分離［Eurosollins 液への２７％、２０．５％お よび１１％（w/v）のＦＩＬＯＬＬ（商品名）（Sigma 社、Ｆ９３７８］によっ て、膵島を外分泌組織から分離した。 次いで、単離した膵島を、１０体積％ウシ胎児血清、３０ mMＨＥＰＥＳ、１ ００mg／dlグルコースおよび４００ＩＵ／mlペニシリン強化Ｍ１９９／アール培 地（イヌ）、またはα−ＭＥＭ＋１０％熱失活ウマ血清（ウシおよびブタ）のい ずれかで、５％ＣＯ₂／９５％空気の湿潤雰囲気中で３７℃で１日間培養した。 膵島の代表的な収率は、成体膵臓（４００ｇの湿潤重量、８０〜１２５μm の膵 島径、８５〜９５％の純度、９０％を超 える生存度（下記参照））について、０．５〜１．８ｘ１０⁶個の膵島の範囲内 となるはずであった。細胞は、別の手順で単離し、別の適切な条件下で培養して もよい。 膵島細胞の虚血による劣化は、適切な大きさの組織断片を用いることによって 最小化する。例えば、膵島断片は、直径が約１２０ミクロン、好ましくは４０〜 １００ミクロン未満でなければならない。膵島細胞の生存度、増殖、寿命および ／または機能は、封入前に、液体培地中で他の細胞型を同時培養、すなわち混合 することによって、増強できる。有用な細胞型としては、成長ホルモンを分泌す る細胞、例えばＧＨ−３細胞、または結合組織および／または細胞外基質の成分 を分泌する細胞、例えば繊維芽細胞および内皮細胞がある。加えて、細胞、例え ば膵島は、酸素利用能を強化するために、赤血球、ヘモグロビンまたは他の酸素 担持因子と同時培養することができる。 異なる時間に調製された異なる組の膵島の比較を可能にするためには、膵島の 品質管理手順を用いる。純度（外分泌組織混入物と比較した膵島組織の量）は、 ジフェニルチオカルバゾン（ジチオゾン）を急速に取り込む膵島の相対的に独自 の特徴に依存する。したがって、膵島を５０μg ／mlのジチオゾン（Ｄ５１３０ 、Sigma社）とともに５〜１０分間温置して、それらを赤く染める。次いで、純 度の定性的推定のために、調製品を光学 顕微鏡下で検査する。純度の定量は、膵島の分散度、および染色細胞と非染色細 胞の計数、またはＤＮＡ１μg あたりのジチオゾン取り込みの分光測光検定によ って実施する。 生存度は、生存可能細胞がある種の染料を排除できる能力に依存する、いくつ かの検定法のいずれか一つを用いて決定できる。例えば、一検定法は、生存可能 細胞のみを緑に染める蛍光染料のアクリジンオレンジと、死滅細胞の核のみを赤 に染めるヨウ化プロピジウムとの組合せを用いる。膵島を、染料（アクリジンオ レンジ；Sigma 社Ａ６０１４、５０μg ／ml、およびヨウ化プロピジウム；Sigm a 社Ｐ４１７０、２．５μg ／ml）とともに、ＰＢＳ液中で１０〜１５分間温置 し、次いで、単細胞に分散させる。赤および緑の蛍光を発する細胞の計数を用い て、生存度の％を計算する。 膵島のインシュリン分泌活性は、静止培養で、例えば膵島体積あたりのインシ ュリン単位として表現するのと、膵島がグルコースの勾配付き濃度に応答できる 能力に基づくのとの双方で決定する。これらの値を、２．８〜２８mMにわたる範 囲のグルコース濃度に接触させた膵島が分泌するインシュリンを測定することに よって、定量的に確定する。封入 細胞は、単離し、液体培地に懸濁させたならば、支持するゲル基質で封入しな ければならない。宿主動物への 移植に適したビーズは、いかなる保護被覆もないゲル基質に、多数のドナー生細 胞を含む。標準的手法を用い、細胞、例えば膵島を、栄養培地と液化したゲル、 例えばアルギン酸ナトリウムとの溶液に加えて懸濁液を形成し、次いで、例えば 塩化カルシウムのような架橋結合剤の添加によって、ゲルを架橋結合させること によって、ゲル基質を形成する。ゲル基質は、宿主動物に対して生体適合性であ る様々な物質のいずれか一つ、またはそれらの組合せであることができ、細胞の 生存度を維持すること、ならびに組織または細胞を、必要とされる濃度および純 度をそれらが有する限り、懸濁液中に物理的に支持することができる。 ゲルは、封入しようとする生細胞に有害または致命的であり得る温度変化なし に、例えばカルシウム、カリウムまたはバリウムイオンのようなイオンの添加に よって、ゲル化もしくは架橋結合できるという点で、非温度依存性でなければな らない。非温度依存性ゲルとしては、アルギン酸塩、カラゲーナン、およびキサ ンタンガムのようなガムがある。ここで用いられる限りで、アルギン酸塩という 用語は、アルギン酸誘導体を包含する。これらのゲルは、標準的手法を用いて、 多価フェノール、リポ多糖類、内毒素その他の不純物を除去するよう処理しなけ ればならない。 アルギン酸塩は、β−Ｄ−マンヌロン酸（Ｍ）とα−１−グルロン酸（Ｇ）と がともに、例えばＭとＧのブロ ックが交互に、１，４結合したブロックで構成される。好適なアルギン酸塩は、 例えば約６０％以上という高いＧブロック含量で配合されたそれである。Ｇブロ ックの百分率が高ければそれだけ、ゲル基質の孔径および強度が大きい。加えて 、高Ｍブロック含量のアルギン酸ゲルは、高Ｇブロック含量のゲルより免疫原性 であるらしいことが注目されている。例えば、Soon-Shiong ら；Transplant．Pr oc．、第23巻758 〜759 ページ（1991年）およびSoon-Shiong ら；Transplantat ion、第54巻769 〜774 ページ（1992年）を参照されたい。 ゲル基質は、細胞を分散した状態に保つのに充分なだけ粘稠でなければならな い。アルギン酸塩をゲル基質として用いるときは、液体培地の約３％まで、好ま しくは約１〜２％までそれを加え、溶液を架橋結合させて、細胞を懸濁させた半 固体のゲルを形成する。これらの百分率は、その形状を維持し、生体内で数カ月 間健在であるのに充分な機械的強度を有する基質を与える。 例えば、膵島は、下記のとおりに封入できる。一晩、予備培養した後、培地＋ 添加物（ブタ膵島にはα−ＭＥＭ、１０mMＨＥＰＥＳ：pH７．１、ペニシリン、 ２mMグルタミン；イヌ膵島には同じ添加物を加えたＭ１９９）への１．５％（w/ v）のPronova ＬＶＧというアルギン酸ナトリウム（Protan社、ノルウェー国Dra mmen）の溶液に、膵島細胞を20,000個／ml、すなわち２０個／mm³の密度で均一 に懸濁させた。注射筒ポンプを用いて、空 気噴射装置（直線エッジ付き２２ゲージのニードルを内蔵）へと懸濁液を３ml／ 分の速度で圧送した。ニードルの先端に形成された小滴は、７〜８ｍ／秒の気速 の同心空気流を用いて剥ぎ取った。４cmの間隔で落下して得られた小滴を、１０ mMＨＥＰＥＳ（pH７．１）への１．５％ＣａＣｌ₂溶液中に捕集して、ゲル化し たビーズを形成させた。これらのビーズは、空気流の速度を変えることによって 、直径が約７００〜３，５００μm の範囲の様々な大きさで製造でき、流速が速 ければそれだけ、ビーズは小さい。 各ビーズは約１〜２５個の膵島を含有する。３分後に、（用いる膵島の種に適 した）培地で３回ビーズを洗浄し、次いで、移植するまで、組織培養用恒温器内 で３７℃、５％ＣＯ₂で培養した。 直径3,500 〜6,000 mmまでの大型のビーズは、同様にして製造したか、または 製造でき、あるいは、１４ゲージのカテーテルを取り付けた注射筒から押出せる 。得られるビーズが、下記に記載した好適な特徴を有する限り、他の標準的手法 によってもビーズを製造できる。 ビーズは、生体外で最長４週間培養し、インシュリン分泌を、上記のとおりに 調製した遊離膵島と比較した。ビーズのインシュリン分泌応答は、遊離膵島のそ れの約５０〜８０％であった。４週間目の組織学検査は、ビーズ内の生存可能な 内分泌組織を明らかにした。膵島は、形態学的に健全であり、充分に顆粒に富む β−細胞を含 んでいた。 無被覆粒子に関する特異的パラメータ 粒子、例えばビーズは、外形が球形であるのが好ましく、約６００〜６，００ ０μm、好ましくは１，５００〜３，５００μm の直径を有する。５０μm とい う小さな粒子が製造できる。好適な大きさは、ビーズの表面からその中の細胞ま での拡散距離に基づく。加えて、より小さなビーズ、例えば７００〜９００μm のそれは、同種移植の移植体に適しているのに対し、より大きなビーズ、例えば ２，０００〜５，０００μm のそれは、異種移植の移植体に適している。 辺縁のない滑らかな外表面は、ビーズの線維形成性封入を阻害する傾向があり 、それを提示するためのビーズには、球形の形状が好適である。ビーズは、意図 される用途に応じて、多少とも生物分解できるように設計してよい。例えば、ビ ーズが、一定の期間内に破壊されることが意図されるならば、セルロースまたは コラーゲンのような材料をゲル基質に加えて、破壊を促進できる。しかし、図１ に示したとおり、純粋なアルギン酸ビーズでさえ、ゲル粒子が宿主によって線維 形成組織で被覆された後、マクロファージによって攻撃かつ消化されることを出 願者らは発見した。図１は、細胞の中央にアルギン酸線維を有するマクロファー ジを示す。その他の分解の機序も生じる。結果的に生じる破壊生成物は、身体に よって再吸収されるか、または架橋結合したか、もしくは 架橋結合していないアルギン酸塩分子の断片として、尿中に排出される。ビーズ のこの破壊は、数週間もしくは数ケ月以内、または１年以内に始まってよく、ビ ーズの大きさ、ビーズを形成するのに用いた架橋結合剤、および、数週間後には それ自体で溶解して、ビーズ構造を弱体化するコラーゲンのような添加された成 分によって、制御される。一般に、この破壊は、６〜１２ケ月後に生じるのが代 表的である。 無被覆粒子のその他の特徴としては、（１）形態学的および化学的特性、例え ば、表面の滑らかさ、基質の構造、および他の化学物質と反応できる能力、なら びに（２）輸送特性、例えば、微細溶質、栄養素、Ｏ₂、老廃物、巨大溶質（例 えばインシュリン）、必須蛋白質に対する透過性、および、上記に考察のとおり 、免疫細胞（リンパ球／マクロファージ）がビーズに進入するのを防ぐ分子量カ ットオフがある。形態学的および化学的な特徴は、ドナー細胞を宿主細胞から物 理的に隔離し、栄養素および酸素が基質に自由に流入するのを許す、細胞の生存 度を促進するゲル基質によって、双方とも達成される。加えて、ある種のゲル、 例えばアルギン酸ナトリウムの負電荷は、体液性免疫応答の蛋白質（補体／サイ トカイン）がゲル粒子に進入するのを防ぐのを助けるものと思われる。 ドナー細胞および宿主の特徴性 ドナー生細胞は、哺乳類の細胞が好ましいが、所望の蛋白質、ホルモンまたは 他の物質を発現もしくは分泌する細菌、真菌または植物の細胞であることもでき る。封入されたこれらの細胞の特徴性は、一度でも宿主に移植された粒子内の細 胞の生存には重要である。例えば、総抗原負荷は、所望の治療効果を達成するの に充分な数のドナー細胞を移植しつつも、できるだけ低く保たなければならない 。 この抗原負荷は、ビーズ１個あたりの細胞の密度の調整、および／または宿主 に移植するビーズの総数の調整によって制御できる。これらの数は、細胞型およ び宿主の型式に応じて変動する。例えば、下記のイヌの実施例では、約２０個／ mm³の密度でブタの膵島を含むゲル３２．０mlから製造したビーズで、糖尿病を 治療した。膵島投与量を標準化するには、ＥＩＮ（等価膵島数）を用いることが できる。この数は、直径１５０ミクロンの標準的な膵島の島体積に基づく。 患者に移植する総ＥＩＮは、患者のインシュリン必要度、ならびに膵島の代謝 、型式および質に依存するが、これは、ここに記載のとおり、封入した膵島の生 体外試験によって、移植前に決定する。例えば、ブタ膵島は、ウシまたはイヌの 膵島より多くのインシュリンを生産することが公知である。患者が必要とするイ ンシュリンの量（インシュリン単位）は、個体ベースで経験的に決定 され、１日数回監視された糖レベルに基づく。例えば、糖尿病のイヌは、１日あ たり約５〜４０単位のインシュリンを必要とし得るが、代表的なヒト糖尿病患者 は、１日あたり２０〜５０単位を必要とし得る。いずれにしても、これらの量は 、疾患の重篤度、食餌、運動量その他の因子に依存する。ヒトの患者についてこ のレベルのインシュリン生産を達成するには、約１００万〜２５０万のブタ膵島 が必要とされる。 加えて、ドナー細胞の免疫原性を考慮しなければならない。例えば、胎児また は新生児の組織は、宿主反応を誘発することが成体組織より少ないと考えられる 。例えば器官培養、ＵＶ照射、および／またはドナー細胞の表面の抗原を遮蔽す るための抗体による前処理によって、移植前にドナー組織を修飾して、その免疫 原性を低下させることもできる。器官培養は、ドナー組織から樹枝状細胞（抗原 提示細胞）を選択的に除去するが、それは、それらが培養中に他の細胞より速く 死ぬためである。高酸素および低温度のような培養条件は、より感受性である樹 枝状細胞を選択的に破壊するのに効果的である。ドナー組織を修飾するこれらの 方法はすべて、参照によってここに組み込まれるLanza ら（編者）；Immunomodu lation of Pancreatic Islets（RG Landes 社、米国テキサス州、1994年）の第 ９、１０、１１章に記載されている。 封入したドナー細胞の移植の前後に、宿主の免疫系を 修飾して、移植された細胞の生存を確保することもできる。マウスまたはラット より大型の哺乳類の同種移植片は、低投与量での短クールの免疫抑制剤または抗 炎症薬を必要とする。ヒトのようなより大型の哺乳類での、例えば直径が７００ 〜９００μm の小さなビーズによる不一致異種移植片も、補助的免疫抑制を必要 とする。下記に考察のとおり、より大きなビーズでは、最小限の免疫抑制もしく は抗炎症療法が必要であるか、または全く不要である。 免疫抑制薬としては、シクロスポリンＡ（「ＣｓＡ」）、ＦＫ−５０６および デオキシスペルグアリンがある。抗炎症薬／抗線維形成薬としては、プレドニゾ ンのようなステロイド性薬物、およびイブプロフェンやアスピリンのような非ス テロイド性薬物がある。ＣｓＡのようなある種の免疫抑制剤は、非常に低い、「 治療未遂の」投与量、例えばＨＰＬＣで分析したとき１００ng／ml未満のいわゆ る「全血トラフレベル」で、抗線維形成効果を有する。初期投与量は、封入して いない異種膵島についてイヌでは５５０〜９００ng／mlの範囲である治療的な、 例えば免疫抑制性の、投与量には達しない、より高い量、例えば数百ng／mlまで であることができる。したがって、ＣｓＡは、他のいかなる薬物も必要とせずに 、効果的な抗線維形成薬として用い得る。同種移植片での１００ng／ml未満の維 持血中レベル、例えば３０ng／mlは、数週間以内ないし３ケ月未満で中断できる 。 ヒトの患者では、ＣｓＡの最高治療投与量は、毒性の問題を避けるために、８ ００ng／ml未満でなければならない。しかし、本発明によれば、低投与量の、例 えば数百ng／mlの免疫抑制／抗線維生成剤の初期投与量、次いで１００ng／ml未 満の維持投与量の、投与を要するにすぎない。 加えて、生体外での観察によれば、ゲルビーズ内のドナー生細胞は、細胞毒性 の酸化窒素ラジカルから保護できるが、それは、例えばWiegand ら；Transplant ation、第56巻1,206 〜1,212 ページ（1993年11月）に記載のとおり、ゲルビー ズを一度でも移植したならばそれに進入し得る酸化窒素を捕捉する、自家赤血球 とともに細胞を同時封入することによる。加えて、ゲルビーズは、移植前にＮ^G −メチル−Ｌ−アルギニンのような酸化窒素阻害剤で処理して、保護効果を与え ることができる。移植 直径１，０００μm 未満のビーズに対しては、例えば１６ゲージのニードルを 有する、標準的なカテーテルまたは注射筒での注入によって、ビーズを宿主に簡 単に移植できる。より大きなビーズは、小さな切開を通じて、例えばカテーテル または漏斗様装置を用いて、挿入できる。ビーズは、好ましくは、腹腔内経由で 宿主に移植する。筋内または皮下経由でビーズを移植することもできる。これに 代えて、Lanza ら（編者）；Immunomodulation of Pancreatic Islets（RG Land es 社、米国テキサ ス州、1994年）の第７章に記載のとおり、脳、睾丸または胸腺のような、宿主の 免疫応答が最も不活発である免疫免除された部位に、ビーズを移植することもで きる。加えて、外科的に創出した小開口を通じて、ビーズを皮下に滑り込ませる 銃／套管針型式の装置を用いて、ビーズを挿入できる。 ［実施例］マウスおよびラットへのブタ膵島の移植 封入した膵島細胞が機能できるか否か、例えば、長期にわたって宿主動物内で インシュリンを分泌できるかを決定するために、動物１匹あたり全部で１０Ｋ〜 １００Ｋの膵島を含有する、直径８００±１００μm のビーズを、不一致異種移 植片としてマウスおよびラット糖尿病モデルに移植した。移植体の宿主としては 、体重２５０〜３００ｇのLewis 系雄ラットの成体（Charles River 社、米国マ サチューセッツ州Wilmington）、および体重約２０〜３０ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊ 系マウスを用いた。ビーズの移植１０〜１４日前に、ストレプトゾトシン（「Ｓ ＴＺ」）の一回注射によって、これらの動物に真性糖尿病を誘発した。ラットに は、体重１kgあたり４２mgのＳＴＺを尾静脈内に注射した。マウスには、体重１ kgあたり１６５mgのＳＴＺを腹腔内に注射した。 グルコース酸化酵素法を用いて、双方の動物からの尾出血によって、絶食血漿 グルコース濃度（mg／dl）を測定した（Beckman Glucose Analyzer ２、米国カ リフォ ルニア州Fullerton）。測定は、週３回ずつ１カ月間、次いで、各研究の継続期 間中は毎週実施した。連続２回の試験でグルコース濃度が２５０mg／dlを超えた とき、封入した膵島が高血糖を覆すことに失敗したと考えた。 宿主動物は、移植前にケタミン／キシラジン（ラット：０．５μｌ／ｇ筋内、 マウス：５．０〜７．５μｌ／ｇ腹腔内）で麻酔した。ブタ膵島を単離し、上記 のとおり、直径８００μm のビーズに封入した。１６ゲージのカテーテルを用い るか、または小さな（１〜２cm）正中線切開を通じてかのいずれかによって、１ ０Ｋ〜１００Ｋの膵島をラットまたはマウスの腹腔内に移植した。これは、ビー ズ中に形成された全部で約０．５〜５．０mlのゲルに相当する。すなわち、膵島 は、ゲル１mlあたり約２０Ｋの密度でゲル中に存在する。傷口は、４−０絹縫合 で２層に閉鎖した。免疫抑制薬は、全く用いなかった。 上記に考察のとおり、概して、ビーズは、宿主の高血糖を覆した。この状態は 、組織学的解析で確認された。移植２週間後に殺したストレプトゾトシン誘発糖 尿病動物から、封入した膵島を回収し、定型的に固定し、組織学的に検査した。 定型的な組織学の方法によって、ドナー膵島をブアン液で固定し、次いで脱水し 、パラフィンに包埋した。組織を連続切片（５μm 切片）に切断し、ヘマトキシ リン−エオシンで染色した。ドナー膵島中のインシュリン、グルカゴンおよびソ マトスタチンの存在 を、Warnkeら；J．Histochem．Cytochem．、第28巻771ページ（1980年）またはL ikeら；Lab．Invest.、第38巻340 ページ（1978年）に記載のとおり、免疫ペル オキシダーゼ組織化学を用いて決定した。これらの試験は、膵島内のこれらホル モン分泌細胞型がすべて、生存可能であるか否かを決定するのに用いられる。 そのような組織学的試験は、化学的に誘発した糖尿病動物に移植した後の、膵 島の生存度を決定するための唯一の正確な方法であるが、それは、そのような動 物が非糖尿病状態へと反転することは稀ではなく、それが、血中グルコースレベ ルのような血液試験のみによって決定したならば、膵島生存度の虚偽の指示を与 えるからである。 図２に示したとおり、アルギン酸ゲル１．０mlから製造した直径８００±１０ ０μm のビーズに封入し、糖尿病マウスに移植したブタ膵島（約20,000個）は、 移植直後の血漿グルコースレベルの約４００〜４５０mg／dlから約２００mg／dl への降下、および約２００〜２５０mg／dlでの血漿グルコースレベルの維持によ って証明されるとおり、１０週間を超えて高血糖を覆した。 これらの結果は、１０週間後の健全な、生存可能な膵島を立証する組織学的解 析で確認された。加えて、ビーズは、１０週間の間、線維形成を僅かしか、また は全く示さなかった。ＳＴＺで誘発した糖尿病のLewis 系ラットに、約100,000 個の未封入のイヌ、ウシまたはブタ膵 島を腹腔内移植した対照実験は、これらの異種移植片が１週間以内にすべて失敗 したことを示した。 別の実験では、異なる５種類の大きさの無被覆アルギン酸ビーズ（直径８８０ 、１，６００、２，２００、３，０００および３，７００μm）中に、ブタ膵島 を固定化した。これらを、ＳＴＺで誘発した糖尿病マウスの腹腔内に、１１〜１ ４日間移植した（全試験についてｎ＝２）。これらの実験では、免疫抑制剤は全 く用いなかった。直径８００μm または１，６００μm のビーズのいずれでも、 生存した膵島は皆無であった。したがって、ブタ膵島を含有する、より小径のビ ーズは、免疫抑制剤なしではラットで機能しないように思われる。別の実験では 、血中グルコースの制御の喪失、および組織学によって、より小径のゲルビーズ は、移植後約６〜１０日以内に拒絶されることが確認される。 しかしながら、より大きなビーズ、例えば直径２，２００、３，０００および ３，７００μm のビーズを用いた不一致異種移植片の研究は、ブタの膵島細胞が 、いかなる免疫抑制もなしに、ラットで４週間を超えて生存可能で存続すること を示した。結果（４週間後の生存度の％）を下記の表１に示す。 したがって、より大径のビーズは、いかなる免疫抑制剤または抗線維形成薬も なしに、ドナーのブタ膵島を宿主ラットの免疫系から保護するのが好成績である 。マウスまたはラットへのウシ膵島の移植 もう一つの不一致異種移植片の研究では、仔ウシの膵島細胞を単離し、ブタ膵 島について上記に記載したとおりに封入した。やはり、これらのビーズを、上記 のマウスおよびラットの糖尿病モデルで解析した。 図３に示したとおり、アルギン酸ゲル１．０mlから製造した直径８００±１０ ０μm のビーズに封入し、マウスに移植したウシ膵島（約20,000個）は、移植直 後の血漿グルコースレベルの約５５０mg／dlから約１５０mg／dlへの降下、およ び研究の継続期間中のこのレベルの維持によって証明されるとおり、６０日間を 超えて高血糖を覆した。組織学的解析は、６０日間を超える、線維形成を僅かし か、または全く伴わない健全で生存可能な膵島を立証した。 同様に、異なる数の封入したウシ膵島をラットに移植 した。研究の最初の２週間は、ＣｓＡをラットに皮下投与し、次いで中止した（ −１、０および１日目に３０mg／kg、２〜５日目には１５mg/kg、そして６〜１ ４日目には７mg／kg）。図４に示したとおり、４種類の膵島の投与レベル（６０ Ｋ、８０Ｋ、１００Ｋおよび１２０Ｋ）はすべて、高血糖を４０日間を超えて覆 した。血漿グルコースレベルは、移植後に約５２５〜７２５mg/dlから２５０mg ／dl未満に降下し、研究の継続期間中、これらのレベルを維持した。 組織学的解析は、線維形成を僅かしか、または全く伴わない、健全で生存可能 な膵島を６４日に立証した。イヌへの膵島細胞の移植 同種移植片研究では、ドナーのイヌ膵島（約100,000個）を、アルギン酸ゲル ５．０mlから製造した直径８００±１００μm のビーズに封入し、イヌの宿主に 移植した。そのような同種移植片は、通常は、７日以内に宿主によって拒絶され るが、封入ドナー膵島は、３週間後もすべて生存可能であった。１匹のイヌは、 免疫抑制薬を全く受けず、もう１匹は、１日１回、１０mg／kgのＣｓＡの注射を 受けたが、これは、投与の実際の時間、肝機能、および測定の時間に応じて、約 ２００〜３００ng／mlの血中トラフレベルを与える。いずれのイヌも、一方のイ ヌはいかなる免疫抑制剤も用いなくてさえ、移植したビーズの線維形成は皆無で あった。組織学は、３週間後の双方のイヌで、膵島の５０％が生存可能であ ることを示した。したがって、同種移植片は、免疫抑制剤または抗線維形成薬を 用いても、用いなくても好成績であった。 不一致異種移植片のイヌでの研究では、ブタ膵島（約140,000 個）を単離し、 アルギン酸ゲル７．０mlから製造した８００±１００μm のビーズに封入し、ブ タ膵島について上記に記載のとおり移植した。これらのビーズを正常なイヌで解 析した。研究の全過程を通じて、１０mg／kg／日の投与量で、免疫抑制性ＣｓＡ をイヌに経口投与した。組織学的解析は、３週間後にいくつかの生存可能な膵島 を示した。 対照として、同じ大きさの無内容のビーズをイヌに注入して、ビーズ自体がな んらかの炎症またはその他の免疫反応を宿主に生じたか否かを決定した。組織学 的検査は、１ケ月以上の後も、無内容のビーズも、含島ビーズも、宿主のイヌの 内部に何らの線維形成も生じなかったことを示した。糖尿病イヌの治療 もう一つのイヌでの研究では、２匹の実際の糖尿病罹患のイヌを、アルギン酸 ゲル３０．０〜３３．０mlから製造し、上記のとおり移植した８００±１００μ m のビーズ中の約600,000 〜650,000 個のイヌ膵島の移植によって治療した。第 一の糖尿病のイヌは、移植前に１日あたり約１１〜１２単位のインシュリンを必 要とした。図５Ａに示したとおり、これらのビーズは、高血糖の即座 の反転（移植後の血漿グルコースレベルの約６５０mg／dlから約１５０mg／dlへ の降下）、および研究の継続期間中の、インシュリンのいかなる外部投与の必要 もない、約１２５mg／dlの血漿グルコースレベルの維持によって証明されるとお り、高血糖を６週間以上覆した。 加えて、移植後１ケ月に、グルコースの静脈内大量投与は、血中グルコースレ ベルの３００mg／dlへの一過性にすぎない上昇を生じ、それは約１時間以内に正 常化した（データは示さず）。移植前は、同じ試験が６００mg／dlを上回る糖レ ベルを示し、試験の継続期間中も、著しく高血糖のままであった（６００より大 ）。これらの移植前後の試験は、動物が移植体の不在では真に糖尿病であるとの 証拠を与える。 第二の糖尿病のイヌは、移植前は１日あたり約８〜１０単位のインシュリンを 必要とした。図５Ｂに示したとおり、これらの移植ビーズは、移植直後の血漿グ ルコースレベルの約３５０mg／dlから約１００mg／dlへの降下、および研究の継 続期間中の、インシュリンのいかなる外部投与の必要もない、約１００mg／dlの 血漿グルコースレベルの維持によって証明されるとおり、高血糖を７日間以上覆 した。 この研究では、低投与量のＣｓＡをそれぞれのイヌに投与した。最初の２週間 は、１０mg／kg／日の投与量でＣｓＡを投与し、次いで、５mg／kg／日に減らし た。しかし、２１日までに、イヌの血液のＨＰＬＣ分析は、 ＣｓＡの検出可能な痕跡を全く示さなかった。すなわち、ＣｓＡの血中レベルは 、この測定手法の最低の検出可能限度である、約３０ng／ml未満であった。第IX因子発現細胞 ヒト第IX因子を発現する２種類のレトロウイルス配列である、モロニーマウス 白血病ウイルスのＬＴＲ（Ｍｏ−ＬＴＲ）または骨髄増殖性肉腫ウイルスのＬＴ Ｒ（ＭＰＳＶ−ＬＴＲ）のうち一方によるトランスフェクションによって、Ｈｅ Ｌａ細胞、初代ウサギ線維芽細胞（ＷＨＨＬ）および肝癌細胞（ＨｅｐＧ２）を 、ヒト第IX因子を発現するよう加工した。ヒトＦＩＸは、このレトロウイルスの ５’ＬＴＲプロモーターから発現されるが、優性選択可能マーカーのｎｐｔ（ネ オマイシンリン酸基転移酵素；ｎｅｏ耐性；Ｇ４１８耐性）は、内部プロモータ ーから発現される。４種類の細胞集団（ＨｅＬａ、ＷＨＨＬおよびＨｅｐＧ２の 各々のうち一つ）のうち３種類は、Ｍｏ−ＬＴＲを用いる同じレトロウイルスベ クターで生成した。第四の集団（ＷＨＨＬ）は、ＭＰＳＶ−ＬＴＲを用いて生成 した。４細胞集団はすべて、ＥＬＩＳＡで決定した限りで、検出可能レベルのヒ トＦＩＸを分泌した。 次いで、これらの細胞を下記のとおり封入した。アルギン酸塩１．０mlから製 造した直径８００±１００μm のビーズに、１ｘ１０⁶または２ｘ１０⁶個の細胞 を封入した。次いで、これらのビーズを、高グルコース （０．８mg／mlの濃度のＧ４１８）としてＤＭＥＭ中で生体外で培養して、これ らの封入細胞が分泌したヒト第IX因子の量を決定した。封入細胞は、高レベルの 第IX因子を生産した。Ｇ４１８についての選択は、細胞が培地で２．５週間を超 えて増殖したならば、適用しなければならない。 これらの封入細胞が生体内で生産する、第IX因子のレベルを決定するには、そ れらをマウスに腹腔内注射する。未処理マウスは対照として役立つ。移植後の様 々な時間に、尾出血により、酵素免疫検定法（Asserachrom IX：Ａｇ；American Bioproducts社）を用いて、血漿ヒト第IX因子の濃度を測定する。無被覆ゲルビーズの用途 本発明の無被覆ゲルビーズは、身体による特定の酵素またはホルモンの不完全 もしくは不充分な生産に起因する様々な疾患を治療するのに用い得る。その結果 、本方法は、ある種の補欠療法を提供する。身体の特定の細胞の喪失または機能 不全によって生じる、充分に特徴付けられる多数の障害が、補欠療法に応じ得る 。例えば、ランゲルハンス島は糖尿病の治療に、肝細胞は肝不全に、副腎細胞は パーキンソン病に、神経成長因子（ＮＧＦ）を生産する細胞はアルツハイマー病 に、第VIII因子や第IX因子を生産する細胞は血友病に、そして内分泌細胞は、ホ ルモンの欠乏に起因する障害、例えば副甲状腺機能低下を治療するのに用い得る 。 更に、組換えＤＮＡ法、いわゆる「遺伝子療法」を用いるか、または他の組織 を封入することによって、慢性疼痛、癌（例えば毛様細胞白血病、黒色腫および 腎癌）、ＡＩＤＳ（免疫学的増強で治療）、カポジ肉腫（インターフェロン、Ｉ Ｌ−２またはＴＮＦ−αの投与で治療）、原発性血液学的障害、長期持続性形成 不全の患者、および骨髄抑制された患者（骨髄移植や攻撃的化学療法で治療）に 罹患した患者を治療することも可能なはずである。無被覆ゲルビーズは、情緒障 害、ハンチントン病、デュシェン筋ジストロフィー、てんかん、不妊、脊髄損傷 の治療ならびに創傷治癒にも役立つはずである。 特定の細胞の移植は、循環からの有害物質の解毒または除去にも役立ち得る。 例えば、適切な生細胞の移植は、例えば肝性脳疾患（肝臓病によって生じる）ま たは尿毒症（腎不全によって生じる）で、疾患を有する細胞、組織または器官の 補欠を与えることによって、正常な生理学的機能を回復する。 それぞれの適用では、所望の生細胞を含有する充分な数の無被覆ビーズを、例 えば外科的に、または注射器で、患者に移植する。ビーズは、全身的効果のため には、例えば腹腔内に、あるいは局所的効果のためには特定の場所、例えばパー キンソン病を治療するには脳内に、または脊髄損傷を治療するには脊髄内に移植 する。 用いようとする無被覆ビーズの投与量は、当初は、生 体外での研究の結果から決定する。加えて、例えばマウス、ラットまたはイヌで の生体内での結果が、これらの試験は、一般に、ヒトの患者での薬効を予測させ るものであるから、必要な投与量の更に正確な査定を容易にすると思われる。例 えば、イヌでの特発性糖尿病は、ヒトでの１型糖尿病に類似すると考えられる［ Soon-Shiong ら；Transplantation、第54巻769 〜774 ページ（1992年）］。 ビーズは、数ケ月または数年までの長期間、生存可能なドナー細胞を有して患 者内に存続することが意図される。しかし、例えばドナー細胞が分泌する蛋白質 の一定のレベルについて、患者の血液を監視することによって、ドナー細胞がも はや生存可能ではないと決定されたならば、患者内のビーズの供給を更新するこ とは、簡単な仕事である。 真性糖尿病 例えばイヌまたはヒトの患者の、糖尿病を治療するには、移植できるビーズは 、単離されたイヌもしくはブタ膵島、またはインシュリンもしくはインシュリン 様増殖因子１（ＩＧＦ−１）を生産するその他の細胞を封入するのが好ましい。 上記の手順を用いて、膵島を調製かつ封入する。封入した細胞または膵島のイン シュリン分泌活性を、例えば島体積あたりで表される、静止培養でと、勾配付き 濃度のグルコースに応答する膵島の能力に基づいてとの双方で決定する。これら の値は、上記のと おりに確定させる。封入した膵島の特定のバッチのインシュリン分泌活性を決定 したならば、ビーズの適正な数を決定し、糖尿病患者に移植することができる。 例えば、１日あたり２０〜５０単位のインシュリンを必要とするヒトの患者を治 療するには、全部で約１００万ないし２５０万のブタ膵島を含有するように、ビ ーズの総数を選ばなければならない。ゲル１mlあたり平均して20,000の膵島を含 有するよう設計したビーズについては、適正な投与量は、ゲル５０〜１２５mlか ら製造したビーズとなるであろう。 血友病 血友病は、第VIII因子または第IX因子の欠乏によって生じる、Ｘ染色体に連関 した遺伝的出血障害である。現在は、上記のとおり、第VIII因子および第IX因子 生産細胞を生成するための組換え法が、好成績で用いられている。したがって、 本発明による、そのような細胞の無被覆ゲルビーズへの封入および移植を、血友 病に対する改良された治療に用いることができる。 肝臓病 肝細胞移植は、不可逆的肝不全ばかりでなく、肝臓の再生する能力は依然とし て存在する可能性がある、遺伝的酵素異常、急性肝不全を包含するいくつかの病 的過程にも、また医学的進行または拒絶反応関連併発症のいずれかに起因する、 急激な肝不全を発祥した患者での全肝移植までのつなぎとしても役立つ。 WongおよびChang ；Biomat．Art．Cells Art．Org.、第16巻731 ページ（1988 年）は、マウスに移植した、マイクロカプセルに封入したラット肝細胞の生存度 および再生を立証している。生存可能な肝細胞を、アルギン酸塩−ポリ（Ｌ−リ シン）のマイクロカプセルに封入し、正常マウス、およびガラクトサミン誘発肝 不全マウスに腹腔内移植した。誘発肝不全のマウスへの移植の８日後に、封入ラ ット肝細胞の生存度は、４２％からほぼ１００％へと上昇した。２９日後には、 正常マウスに移植した封入肝細胞の生存度も、４２％からほぼ１００％へと上昇 した。対照的に、マウスに移植した遊離ラット肝細胞は、異種移植片移植後４日 または５日以内にすべて死滅した。本発明の無被覆ビーズは、肝不全を治療する のに充分適している。 別の研究者らは、マイクロカプセルに封入した肝細胞は、多くの特異的な蛋白 質や酵素の合成および分泌を継続することを示している。Cai ら；Hepatology、 第10巻855 ページ（1989年）は、初代ラット肝細胞のマイクロカプセル封入の体 系を開発および評価した。尿素の形成、プロトロンビンおよびコリンエステラー ゼ活性、細胞内蛋白質へのトリチウム化ロイシンの取り込み、および合成アルブ ミンの免疫定位を培養内で監視した。これらの活性のいくつかの漸減にも拘らず 、封入肝細胞は、３５日間の観察期間を通して機能し続けた。加えて、Bruni お よびChang ；Biomat．Art．Cell Art．Org．、 第17巻403 ページ（1989年）は、高ビリルビン血症でビリルビンレベルを下げる ためのマイクロカプセル封入肝細胞の用途を証明した。マイクロカプセル封入肝 細胞をGrunn 系ラットの腹腔内に注入した。ビリルビンは、１４mg／１００mlか ら６mg／１００mlへと低下し、９０日後も抑制されたままであった。やはり、本 発明の無被覆ゲルビーズを、これらの肝臓病を治療するのに上記のとおりに用い ることができる。 パーキンソン病 パーキンソン病は、黒質線条体のドーパミン作動系の退化を伴うニューロン系 統の疾患である。齧歯類とヒトではない霊長類との双方での実験的研究は、腹側 中脳からの黒質（ドーパミン作動性）ニューロンを含む胎児組織のドーパミン枯 渇線条体への移植が、ドーパミンによるほぼ正常な神経支配を回復し、運動異常 を軽減することを示した。加えて、副腎クロム親和性細胞の移植は、齧歯類で化 学的に誘発したパーキンソン病を覆すことが示されている。 Widnerら；Transplant．Proc．、第23巻793 ページ（1991年）は、最近、ヒト パーキンソン病患者での移植および免疫抑制（シクロスポリン、アザチオプリン およびプレドニゾン）後１０ケ月までの、胎児黒質の同種移植片の生存および機 能の証拠を報告した。 移植２ケ月後から間始して、Ｌ−ドーパの一回投与後の四肢硬直の継続的な低 下、腕、手および足の運動の多 くにおける運動速度の増加、ならびに「オン」期間（＞８０％の増大）の延長を 彼らは観察した。 したがって、ドーパミンおよび神経成長因子または他の向神経性因子を生産す るよう遺伝子加工した胎児の神経組織または細胞の移植は、神経学的障害の患者 における新たな治療方策として、多大な潜在的可能性を有するはずである。しか し、移植異種ドナー組織の場合は、免疫免除部位を用いることと、免疫抑制薬を 用いることとを組合せた方策によってさえ、拒絶反応が重大な問題を提起するこ とになるであろう。したがって、本発明の無被覆ビーズは、この問題に対する新 規な方策、すなわち動物または遺伝子加工した細胞から採集した封入ドナー組織 を用いる、パーキンソン病の治療のためのドーパミンの送達を可能にする。 アルツハイマー病 ２５０万〜３００万と推定される米国人がアルツハイマー病に苦しんでいる。 この疾患は、前脳脳底のコリン作動性ニューロンの退化に付随する認識機能の進 行性喪失を特徴とする。動物での研究は、神経成長因子（ＮＧＦ）、例えば、そ れぞれRegeneron 社およびAmgen 社から入手できる脳由来の神経栄養因子（ＢＤ ＮＦ）およびニューロトロフィン３（ＮＴ−３）、ならびに他の向神経性因子が 正常に作用して、これらニューロン細胞の生存度および機能を支援すること、そ して脳室へのＮＧＦの連続注入は、Williamsら；P.N.A.S.，USA、第83巻 9,231 ページ（1986年）に記載のとおり、コリン作動性ニューロンの傷害誘発性 退化を防止できることを示す。この治療は、Fisherら；Neurobiol．Aging、第10 巻89ページ（1989年）に記載のとおり、記憶損傷した齧歯類での改善された認識 機能と相関する。 これらの研究は、アストログリア細胞または発生中の皮膚のような、組換えも しくは天然のＮＧＦ分泌組織の移植片を含有する無被覆ゲルビーズが、アルツハ イマー病に罹患した患者を治療するのに用い得ることを示唆する。 遺伝子療法 遺伝子療法は、治療遺伝子を人体に直接送り込むことによって、広範囲の疾患 を治療する方策である。遺伝子療法で治癒できる可能性のある疾患としては、癌 、心臓病、アルツハイマー病、高血圧、アテローマ性動脈硬化症および関節炎の ような、高齢層に付随する疾患；後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）およびヘル ペスのようなウイルス性感染症；ならびに糖尿病、血友病、嚢胞性線維症および 筋ジストロフィーのような遺伝病がある。 特定の一実施例では、ヒトの遺伝子療法のための好都合な方策は、例えばRose nberg ら；New Eng．J．Med.、第323 巻570 〜578 ページ（1988年）に記載の、 患者への遺伝的に変化させた細胞の移植を含む。この方策は、標的細胞を非標的 細胞から隔離するための、各患者からの細胞の外科的移転を必要とする。ウイル スベクターその他の手段を用いて、これらの細胞に遺伝子を導入し、次いで、遺 伝的に変化させた細胞を患者に移植し返す。この方策は、酵素補欠療法（例えば 、罹患細胞がもはや分泌できないホルモンを分泌する細胞の患者への移植のため ）のような目的には役立つものの、移植という戦略は、嚢胞性線維症または癌の ような、罹患細胞自体を矯正しなければならない疾患を治療するのに適する可能 性が比較的少ない。この方策で一般的に遭遇する別の問題としては、幹細胞の不 充分な形質導入、導入遺伝子の低い発現率、および癌の素質を有する細胞を選抜 する可能 性のある、組織培養での細胞の増殖をはじめとする、技術的問題がある。 本発明の無被覆粒子は、患者からの外科的移転を必要とするのではなく、移植 する細胞として、例えば線維芽細胞、Ｈｅｌａ細胞のような上皮細胞、およびＨ ｅｐＧ２のような肝癌細胞という、標準的なヒトの細胞系を用いるのを許すこと から、これらの問題を回避するのに充分適している。これらの細胞系を、必要に 応じて、標準的手法で遺伝的に変化させ、封入し、患者に移植する。これらの細 胞系は、入手し、培養し、加工するのが個々の患者の細胞よりはるかに容易であ る。その上、無被覆粒子は、患者の免疫系が移植細胞を認識かつ攻撃するのを防 ぐため、いかなるヒト細胞系も用いて、遺伝子療法の手法を一層普遍的に適用可 能にすることができる。 副甲状腺機能低下症 副甲状腺機能低下症の急性および慢性の症状は、治療されなかった低カルシウ ム血症に起因し、先天性および後天性副甲状腺機能低下症の双方が共有している 。先天性形態は、代表的には、他の内分泌性または皮膚科学的発現を伴わない孤 立した疾患として、あるいは、より代表的には、胸腺の不完全な発達、または、 甲状腺もしくは卵巣のようなその他の内分泌器官の不全のような、その他の異常 に付随して発生する。後天性副甲状腺機能低下症は、通常、副甲状腺全体の意図 しない外科的除去の結果であり、副甲状腺の腺腫または過形成に派生する手 術を受ける患者には問題である。副甲状腺機能低下症は、低カルシウム血症のラ ットでは、生体人工副甲状腺として役立つ、マイクロカプセル封入副甲状腺細胞 の投与によって治療されている。動物およびヒトの患者への投与に用いるために 、副甲状腺細胞を本発明の無被覆ゲルビーズに封入することもできる。 骨粗鬆症 骨粗鬆症という用語は、骨の単位体積あたりの質量の減少を生じる様々な病因 の疾患を対象とする。これらの疾患は、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ−１） 、閉経後の女子では、負のカルシウムバランスを軽減し、尿中ヒドロキシプロリ ンを減少させるためのエストロゲン、性腺機能不全を有する骨粗鬆症の男子の治 療でのアンドロゲン、または確定した骨粗鬆症に用いるためのカルシトニンを分 泌する細胞を含有する、無被覆ゲルビーズの投与によって治療できる。 生殖障害 プロゲストーゲン、エストロゲンその他のホルモンで治療できる、卵巣および 女子生殖路の多数の障害が存在する。これらは、脳下垂体の性腺刺激ホルモンを 阻害するため（女子での早発性青春期）、およびＰＣＯＤの過形成を防ぐ予防の ためのプロゲストーゲン、例えばプロゲステロンによる治療法を包含する。エス トロゲン療法は、性腺不全の治療、受胎能力の制御、および機能不全性子宮出血 の管理に用いる。アンドロゲン、性腺刺激ホ ルモンその他のホルモンは、睾丸の障害の治療に、例えばアンドロゲン療法は、 性腺機能低下の男子で、または性腺刺激ホルモンは、性腺刺激ホルモン欠乏の患 者で受胎能力を確立もしくは回復するために用いる。したがって、これらの疾患 は、適切なホルモン生産細胞を含有する無被覆ビーズで治療できる。 ハンチントン病 ハンチントン病は、中年の人生で始まるのを常とする舞踏アテトーセ運動と進 行性痴呆の併発を特徴とする。この疾患に特有であるのは、尾状核および、より 少ない程度で、脳底神経節のその他の構造（被殻および淡蒼球）の萎縮である。 齧歯類の向神経性因子を分泌する細胞が、ハンチントン病に似た状態を有するヒ ヒの脳に移植され、ハンチントン病患者では全身にわたる制御の進行性喪失に導 く、損傷した神経網のいくつかを反転させている。同様に、ヒトの患者のハンチ ントン病は、適切な神経栄養因子を分泌する、ヒトまたは組換えの細胞を含有す る無被覆ビーズの投与によって治療できる。 脊髄傷害 脊髄傷害の大部分は、周囲の脊柱の損傷に、または骨折、脱臼もしくは両者に 起因する。そのような傷害の治療は、中枢および末梢神経系の修復を促進するた めの、繊毛性向神経性因子（ＣＮＴＦ）、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ−１ ）および向神経因子のような神経成長因子の投与を必要とする。したがって、自 然にか、また は遺伝子工学を通じてかのいずれかによってそのような因子を分泌する、細胞を 含有する無被覆ゲルビーズを、脊髄傷害に用いることができる。 気分（または情緒）障害 気分障害は、生理的（植物的）な、認知の、および精神運動性の機能不全に付 随する、気分や情緒の極端な誇張および混乱を特徴とする、精神分裂病のような 一群の知的障害である。多くの気分障害は、適切な細胞を含有する無被覆ゲルビ ーズで治療できる、甲状腺機能低下、パーキンソン病、アルツハイマー病、およ びここで考察した限りでの悪性腫瘍のような医学的疾患に付随する。加えて、抑 鬱症患者の脳脊髄液では、セロトニン代謝物である、神経伝達物質の５−ヒドロ キシインドール酢酸（５−ＨＩＡＡ）が減少することが示されている。ドーパミ ンおよびγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）のようなその他の神経伝達物質の欠乏も、 鬱病の患者で特定されている。したがって、これらの神経伝達物質を分泌する細 胞を含有する無被覆ゲルビーズは、これらの不全を治療するのに役立つ。 運動ニューロン疾患 退行性運動ニューロン疾患は、ＡＬＳ（上記を参照されたい）、遺伝性運動ニ ューロン疾患（脊髄性筋萎縮：ＳＭＡ）、および、オリーブ橋小脳萎縮や腓骨筋 萎縮のようなその他の退行性障害に付随するそれを包含する。これらの疾患は、 脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）およ びニューロトロフィン３（ＮＴ−３）のような向神経性因子を分泌する細胞を含 有する、無被覆ゲルビーズの投与によって治療できる。 後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ） ＡＩＤＳは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による細胞介在免疫の根底にあ る欠陥によって生起され、二次感染、新生物および神経学的疾患のような持続的 な全身性の症状および／または疾患を生じる。患者は、例えば組換えヒトＩＬ− ２（Ｔ細胞アジュバント活性の上昇を招く抑制細胞活性を低下させるため）、ま たは組換えヒトＩＮＦ−γ（マクロファージの増強）を分泌する、遺伝子加工さ れた細胞を含有する無被覆ビーズで、免疫学的増強によって症状を改善するよう 治療できる。カポジ肉腫のようなＡＩＤＳ関連腫瘍は、ヒトインターフェロンα 、インターロイキン２および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を分泌する封入細胞で治療 できる。 筋萎縮性側索硬化症（ルー・ゲーリッグ病） ＡＬＳは、最もしばしば遭遇する形態の進行性運動ニューロン疾患であり、大 脳皮質と脊髄前角との双方の運動ニューロンの、脳幹の運動核のそれらの相同体 と一体となった進行性喪失を特徴とする。ＡＬＳは、ミオトロフィン、インシュ リン様成長因子（ＩＧＦ−１）、繊毛性向神経性因子（ＣＮＴＦ）、脳由来神経 栄養因子（ＢＤＮＦ）およびニューロトロフィン３（ＮＴ−３）のような神経成 長因子を分泌する細胞を含有する、無被 覆ビーズで治療できる。これらの因子（ＩＧＦ−１はCepharon社から、ＣＮＴＦ はRegeneron 社から、ＮＴ−３はAmgen から入手できる）による動物研究は、神 経の損傷または疾患によって生起された退行性効果を、それらが除去できること を立証している。 癌 ほとんどの場合、癌は、増殖して悪性細胞のクローンを形成する、ただ一個の 幹細胞に由来する。増殖は、環境中の正常な生化学的および物理的影響によって 適正に調節されることはない。正常な、調和した細胞分化の欠如も存在する。癌 細胞は、不連続的な成長、および身体のその他の部分への転移の能力を発達させ る。 本発明によれば、インターフェロンα（ＩＮＦ−α：充実性腫瘍、毛様細胞白 血病、カポジ肉腫、骨肉腫および各種リンパ腫に対して）；組換えインターロイ キン２（ＩＬ−２：黒色腫、腎癌およびカポジ肉腫に対して）；腫瘍壊死因子（ カポジ肉腫に対してＩＬ−２とともに）；組換えヒトＩＮＦ−αおよび組換えヒ トコロニー刺激因子−顆粒球マクロファージ（ＣＳＦ−ｇｍ：カポジ肉腫に対し て）；組換えヒトＩＮＦ−γ（マクロファージの増強に）；ＣＳＦ（攻撃的化学 療法、骨髄移植、および化学療法に対する感受性を高め、投与量強化を支援する ための白血病細胞の始動のため）；繊毛性向神経性因子（ＣＮＴＦ）およびイン シュリン様成長因子（ＩＧＦ−１：化学療法で生じた末梢神経病に対して） ；副腎細胞（下部脊柱に注入して自然鎮痛物質を分泌させたときの痛み止めに） ならびにプロゲストーゲン生産細胞（子宮癌および乳癌での軽減のため）を分泌 する細胞を含有する無被覆ゲルビーズの投与によって、様々な癌が治療できる。 デュシェン筋ジストロフィー デュシェンジストロフィーは、肢帯筋の進行性衰弱、１２歳以降の歩行不能、 後側湾（脊柱の湾曲）および４０歳以降の呼吸不全を特徴とする、Ｘ染色体連関 の劣性の障害である。この疾患は、筋芽細胞および成長因子類を含有する、無被 覆ビーズの投与によって治療できる。見出せない構造蛋白質を細胞が供給できる か否かを決定するために、デュシェン筋ジストロフィーの少年に筋芽細胞が注射 されている。研究者らは、数人の少年に筋強度の改善を認めている。 てんかん てんかんは、脳の電気的活性の異常によって生起される、神経学的機能の慢性 かつ再発性の発作的変化を特徴とする、一群の障害である。焦点性てんかんのい くつかの形態では、阻害性介在ニューロンが優先的に喪失しているように思われ る。向神経性因子その他の神経ペプチドによる治療が効果的であることが見出さ れている。したがって、てんかんを治療するのに、これらの因子を分泌する細胞 を含有する、本発明の無被覆ビーズを用いることができる。 ［その他の実施態様］ 本発明は、その詳細な説明と結び付けて記載されていること、およびこれまで の説明は、例示することが意図されていて、本発明の範囲を限定するためではな く、本発明は、付記された請求の範囲によって定義されることが理解されるはず である。本発明の範囲内でのその他の側面、利点および変更は、本発明が関与す る技術の習熟者には明らかであると思われる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 31/395 ＡＡＭ 9454−4Ｃ Ａ６１Ｋ 31/395 ＡＡＭ ＡＢＡ 9454−4Ｃ ＡＢＡ ＡＢＪ 9454−4Ｃ ＡＢＪ ＡＢＹ 9454−4Ｃ ＡＢＹ ＡＣＶ 9454−4Ｃ ＡＣＶ ＡＤＦ 9454−4Ｃ ＡＤＦ ＡＤＴ 9454−4Ｃ ＡＤＴ Ｃ１２Ｎ 5/06 9735−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｅ (72)発明者 クートライバー，ウィレム エム. アメリカ合衆国 01545 マサチューセッ ツ，シュロウズベリー・フェザント ヒル ドライブ ６ (72)発明者 チック，ウィリアム エル. アメリカ合衆国 02181 マサチューセッ ツ，ウェルズリー・ウィロウ ロード 32

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ドナー生細胞を宿主動物に、該宿主動物による該ドナー細胞の炎症性応答 または拒絶反応なしに移植する方法であって、 ドナー生細胞を封入した、生体適合性の非温度依存性ゲルから基本的になる無 被覆粒子を得るが、ここで、該無被覆粒子は、宿主動物の免疫細胞が該粒子に進 入するのを防ぎ、該粒子への宿主動物のＩｇＧおよび補体の進入は妨げない分子 量カットオフを与えるものである段階と、 該無被覆粒子を該宿主動物に移植する段階と を含む方法。 ２．宿主動物と同じである種から該ドナー細胞を得る請求項１記載の方法。 ３．宿主動物がイヌである請求項２記載の方法。 ４．宿主動物がヒトである請求項２記載の方法。 ５．ドナー細胞が遺伝的に変化させたヒトの細胞である請求項４記載の方法。 ６．宿主動物とは異なる動物種からドナー細胞を得る請求項１記載の方法。 ７．宿主動物がイヌである請求項６記載の方法。 ８．宿主動物がヒトである請求項６記載の方法。 ９．ドナー細胞がブタ、ウシまたはイヌの細胞である請求項８記載の方法。 １０．ドナー細胞が膵島細胞である請求項８記載の方法。 １１．ドナー細胞が第IX因子、第VIII因子、インターロイキン、インターフェ ロンまたは内分泌ホルモンを分泌する請求項１記載の方法。 １２．ドナー細胞が神経成長因子、腫瘍壊死因子α、向神経性因子または神経 伝達物質を分泌する請求項１記載の方法。 １３．該ゲル粒子が球形であり、５０〜６，０００ミクロンの直径を有する請 求項１記載の方法。 １４．該ゲル粒子が２，０００〜４，５００ミクロンの直径を有する請求項１ ３記載の方法。 １５．該ゲルがアルギン酸塩またはアルギン酸誘導体である請求項１記載の方 法。 １６．該アルギン酸塩が鉄によって架橋結合している請求項１５記載の方法。 １７．該アルギン酸塩がカルシウム塩によって架橋結合している請求項１６記 載の方法。 １８．該無被覆ゲル粒子が生物分解可能である請求項１記載の方法。 １９．該無被覆粒子中の該ゲルの分解速度を、該ドナー細胞の期待寿命に見合 うように選ぶ請求項１８記載の方法。 ２０．該無被覆粒子が、ドナー細胞に加えて自家赤血球も封入している請求項 １記載の方法。 ２１．生細胞を含有する該無被覆粒子を、移植前に酸化窒素阻害剤で処理する 請求項１記載の方法。 ２２．該無被覆粒子の周囲の線維形成および炎症を阻害するのに効果的である が、封入せずに該ドナー細胞を宿主動物に移植したときに、免疫抑制を達成する のに必要とされるよりは低い投与量で、薬物を宿主動物に投与する段階を更に含 む請求項１記載の方法。 ２３．該薬物がシクロスポリンであり、約１００ng／ml未満の全血トラフレベ ルを宿主動物で達成する投与量で投与する請求項２２記載の方法。 ２４．該薬物を移植後１ケ月まで投与し、それ以後は投与しない請求項２２記 載の方法。 ２５．ドナー生細胞を宿主動物に、該宿主動物によるドナー細胞の炎症性応答 または拒絶反応なしに移植する方法であって、 水、および生体適合性の非温度依存性液体ゲルから基本的になる液体培地に該 ドナー生細胞を懸濁させる段階と、 少なくとも１個の生細胞を含有する該液体培地の小滴を形成する段階と、 該小滴を固化して、該生細胞を封入するゲル粒子を形成し、そのため該粒子に 外側の被覆が全く形成されず、また該無被覆粒子は、宿主動物の免疫細胞が該粒 子に進入するのを防ぎ、該粒子への宿主動物のＩｇＧおよび補体の進入は妨げな い分子量カットオフを与えるものであ る段階と、 該無被覆粒子を該宿主に移植する段階と を含む方法。 ２６．該液体培地が膵島を含有する請求項２５記載の方法。 ２７．該膵島が該培地１mlあたり10,000〜35,000個の膵島という密度で該液体 培地に含まれる請求項２５記載の方法。 ２８．該液体培地が該培地１mlあたり約１０⁵〜１０⁸個の細胞という密度で生 細胞を含有する請求項２５記載の方法。 ２９．患者での物質の不充分な生産によって生じた患者の疾患を治療する方法 であって、 該物質を分泌するドナー生細胞を封入する生体適合性の非温度依存性ゲルから 基本的になる無被覆粒子を得るが、ここで、該無被覆粒子は、患者の免疫細胞が 該粒子に進入するのを防ぎ、該粒子への患者のＩｇＧおよび補体の進入は妨げな い分子量カットオフを与えるものである段階と、 該生細胞が生理的活性なままであり、該物質を該患者内に分泌して該疾患を治 療するのを許す場所および方式で、該無被覆粒子を該患者に移植する段階と を含む方法。 ３０．該患者と同じである動物種からドナー細胞を得る請求項２９記載の方法 。 ３１．患者がイヌである請求項３０記載の方法。 ３２．患者がヒトである請求項３０記載の方法。 ３３．ドナー細胞が遺伝的に変化させたヒトの細胞である請求項３２記載の方 法。 ３４．患者とは異なる種からドナー細胞を得る請求項２９記載の方法。 ３５．患者がイヌである請求項３４記載の方法。 ３６．患者がヒトである請求項３４記載の方法。 ３７．ドナー細胞がブタ、ウシ、イヌ、細菌、真菌または植物の細胞である請 求項２９記載の方法。 ３８．疾患が糖尿病であり、ドナー細胞が膵島細胞である請求項２９記載の方 法。 ３９．ドナー細胞が第IX因子、第VIII因子、インターロイキン、インターフェ ロン、内分泌ホルモン、神経成長因子、腫瘍壊死因子α、向神経性因子または神 経伝達物質を分泌する請求項２９記載の方法。 ４０．疾患が真性糖尿病、肝臓病、筋萎縮性側索硬化症、血友病、甲状腺機能 低下症、パーキンソン病、後天性免疫不全症候群、デュシェン筋ジストロフィー 、不妊症、てんかん、ハンチントン病、副甲状腺機能低下症、気分障害、運動ニ ューロン疾患、骨粗鬆症またはアルツハイマー病である請求項２９記載の方法。 ４１．ゲル粒子を患者の免疫免除された部位に移植する請求項２９記載の方法 。 ４２．生細胞を培養する生体内の方法であって、 生体適合性の非温度依存性ゲルから基本的になる無被覆粒子に該生細胞を封入 する段階と、 該無被覆粒子を動物に挿入する段階と、 該動物を成長させ、それによって細胞を培養することと を含む方法。 ４３．生細胞を培養する生体外の方法であって、 生体適合性の非温度依存性ゲルから基本的になる無被覆粒子に該生細胞を封入 する段階と、 栄養素および酸素を含む培地中に該無被覆粒子を置く段階と、 該細胞を成長させるのに充分な量の栄養素および酸素を該培地中に維持し、そ れによって該細胞を培養する段階と を含む方法。 ４４．生細胞を含有する無被覆の非温度依存性ゲル粒子を製造する方法であっ て、 水、および生体適合性の非温度依存性液体ゲルから基本的になる液体培地に該 生細胞を懸濁させる段階と、 該液体培地の小滴を形成する段階と、 該小滴を固化して、該生細胞を封入したゲル粒子を形成し、そのため該粒子に 外側被覆が全く形成されない段階と、 ゲル化した無被覆粒子を栄養培地中に貯蔵して、該生細胞の生存度を維持する 段階と からなる方法。