ES2211915T3 - Metodos y composiciones utiles en la profilaxis y terapia de estados relacionados con endotoxinas. - Google Patents

Abstract

SE MUESTRA UN TRATAMIENTO Y PROFILAXIS DE LA TOXICIDAD CAUSADA POR LA ENDOTOXINA. ESTO SE CONSIGUE MEDIANTE LA ADMINISTRACION DE COMPOSICIONES QUE CONTIENEN FOSFOLIPIDOS AL PACIENTE. LAS COMPOSICIONES ESTAN LIBRES DE PROTEINAS Y PEPTIDOS, Y PUEDEN CONTENER TRIGLICERIDOS , OTROS LIPIDOS POLARES O NEUTRALES, ACIDOS BILIARES, O SALES DE ACIDOS BILIARES.

Description

Métodos y composiciones útiles en la profilaxis y terapia de estados relacionados con endotoxinas.

Campo de la invención

Esta invención se relaciona con el tratamiento de endotoxemia relacionada con endotoxina. Más particularmente, se relaciona con el tratamiento de intoxicaciones de este tipo por la vía de administración de diversas composiciones que actúan para neutralizar y/o eliminar endotoxinas del organismo, así como a profilaxis que utiliza estas composiciones.

Antecedente y técnica anterior

El choque endotóxico es un síndrome, a menudo fatal, provocado por la liberación de lipopolisacárido (LPS) de la membrana exterior de la mayoría de las bacterias gram negativas (por ejemplo Escherichia coli; Salmonella trymphimurium). La estructura del LPS bacterial ha sido bastante bien explicada, como una única molécula, a la que se hace referencia como lípido A, que se une a cadenas acílicas por vía del esqueleto de glucosamina de la molécula de lípido A. Véase a este respecto Raetz, Ann. Rev. Biochem. 59: 129- 170 (1990).

La molécula de lípido A sirve como anclaje de membrana de una estructura de lipopolisacárido ("LPS") y es el LPS el que está implicado en el desarrollo del choque endotóxico. Se debería señalar que las moléculas de LPS se caracterizan por una estructura del tipo lípido A y una porción de polisacárido. Este último resto puede variar en detalles moleculares en diferentes moléculas de LPS, pero retendrá los esquemas estructurales generales característicos de las endotoxinas. Sería incorrecto decir que la molécula de LPS es la misma de bacteria a bacteria (véase Raetz, anteriormente citado). Es común en la técnica hacer referencia a diversas moléculas de LPS como "endotoxinas", y este término se usará en adelante para hacer referencia colectivamente a moléculas de LPS.

En la patente de EE.UU. nº 5.128.318, cuya descripción se incorpora aquí por referencia, se enseñó que partículas reconstituidas que contienen una apolipoproteína asociada a HDL y un lípido capaces de unirse a una endotoxina para inactivarla se podrían usar como materiales eficaces para aliviar la toxicidad producida por endotoxinas.

En las solicitudes antecesoras citadas en la sección de Solicitudes Relacionadas y que se incorporan aquí por referencia, se describió que diversos materiales distintos se pueden usar para tratar la toxicidad producida por endotoxinas. Específicamente, se encontró que no se requieren apolipoproteínas en las partículas reconstituidas y que la partícula reconstituida puede contener un péptido y un lípido en donde el péptido no es una apolipoproteína.

También se encontró que al menos algunos individuos poseen niveles innatos de apolipoproteína que son más elevados que los niveles normales tales que se puede realizar una terapia eficaz para endotoxemia administrando partículas reconstituidas que no contienen ni apolipoproteína ni péptido, pero que contienen el lípido de la descripción.

Además, la invención en estas solicitudes implicaba el uso de las partículas reconstituidas y los componentes aquí considerados para profilaxis contra la toxicidad producida por endotoxinas, administrando cantidades profilácticamente eficaces a sujetos que necesitan profilaxis. Los sujetos de este tipo incluyen pacientes que sufren infecciones o que se recuperan de operaciones quirúrgicas. A veces, estos pacientes tienen niveles muy bajos de plasma HDL, a veces tan bajos como un 20% de los niveles normales.

En estos casos, es muy deseable una profilaxis temprana con HDL, de modo que se compensen estos descensos.

Se ha encontrado ahora, bastante sorprendentemente, que se pueden usar fosfolípidos solos, o en combinación con materiales adicionales, tales como lípidos neutros, colatos, etc., como agentes eficaces para aliviar y/o prevenir endotoxemia. Por consiguiente, en un primer aspecto, la invención proporciona el uso de una composición farmacéutica sin péptido, sin proteína, que comprende un ácido colanoico o una sal del ácido colanoico, un fosfolípido y un lípido neutro en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de seres humanos o animales que sufren endotoxemia.

En un segundo aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica sin proteína y sin péptido para administración intravenosa, que comprende un ácido colanoico o una sal del ácido colanoico, un fosfolípido y un lípido neutro en donde el lípido neutro está presente desde 3% hasta 50% con relación a la cantidad total de lípido.

En un tercer aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica sin proteína y sin péptido, que comprende un ácido biliar o una sal de ácido biliar, un fosfolípido y un lípido neutro, en donde la composición comprende desde 5% hasta 30% en peso de ácido biliar o sal de ácido biliar, desde 3% hasta 50% en peso de lípido neutro y desde 10% hasta 95% en peso de fosfolípido y en donde la composición es una emulsión.

Se prefiere especialmente usar fosfatidilcolinas (en adelante "PC"), ya sea solas, o en combinación con otros fosfolípidos, tales como esfingolípidos, en composiciones que están esencialmente exentas de péptidos y proteínas tales como apolipoproteínas o péptidos derivados de las mismas. Se pueden combinar lípidos neutros tales como mono-, di- y triglicéridos con los fosfolípidos en tanto en cuanto la cantidad total de lípidos neutros esté por debajo de ciertos porcentajes en peso cuando la composición se usa en forma de píldora intravenosa. Cuando se usa en otras formas de administración, tales como intravenosamente por ejemplo, por infusión continua, los porcentajes en peso no son tan críticos, aunque son deseables.

Realizaciones particularmente preferidas de la invención incluyen emulsiones en las que se usa un ácido biliar o una sal biliar junto con un fosfolípido y un lípido neutro.

Realizaciones adicionales preferidas de la presente invención se definen en las sub-reivindicaciones que se adjuntan.

Se muestra aquí la eficacia de ácidos biliares y sales de ácidos biliares, que son colatos, en el tratamiento de endotoxemia. Estos ácidos biliares se pueden usar solos o en combinación con uno o más fosfolípidos y/o lípidos neutros, tales como fosfatidilcolina y/o triglicérido.

La invención se describe con mayores detalles en la descripción que sigue.

Breve descripción de las figuras

Las figuras 5A y 5B muestran los resultados obtenidos cuando se ensayaron diversas composiciones en un modelo que determinó la neutralización de endotoxina a través de la determinación de la liberación de TNF en un modelo humano de sangre entera. La figura 5A muestra el papel de la proteína y la 5B el papel del fosfolípido. Las composiciones ensayadas incluían lipoproteínas naturales (VLDL, LDL, HDL), HDL reconstituido ("R-HDL"), y composiciones de INTRALIPID®, así como emulsiones que contenían fosfolípido y proteína.

Las figuras 6A y 6B comparan el papel del triglicérido (un lípido neutro) y la fosfatidilcolina, un fosfolípido, en el mismo modelo.

La figura 7 presenta información sobre la toxicidad asociada con la administración de diversas composiciones de PC y/o PC/TG en un modelo de ratones, usando un modelo con mortandad del 55% en el que se administra LPS de E. coli.

La figura 8 muestra datos comparables a los asegurados para el ensayo humano de sangre entera, anterior, pero usando fosfolípido con colesterol sin esterificar, esfingomielina, o mezclas de ambos, en lugar de triglicéridos.

Las figuras 9A y 9B muestran resultados comparables a los que se muestran en las Figuras 5A y 5B, excepto que, en estas nuevas figuras se mezclan fosfolípido, colesterol sin esterificar y/o esfingomielina con triglicéridos o colesterol esterificado como lípido neutro.

La figura 10 compara los resultados que se obtienen de emulsiones que contienen éster de colesterol y triglicérido en el modelo de ratones in vivo.

La figura 11 representa gráficamente las cantidades teóricas de triglicéridos liberados a la sangre después de la administración de diversas composiciones que contienen TG, con umbrales de toxicidad. "TPN" significa "nutrición parenteral total" mientras que "RI" significa composiciones de acuerdo con la invención.

Descripción detallada de las realizaciones Ejemplo 2

Factores que afectan a la estimulación de TNF-\alpha mediada por LPS al tiempo que preservan la integridad de la interacción entre las proteínas del plasma y los elementos celulares de la sangre, se pueden estudiar apropiadamente en un sistema humano de sangre entera in vitro. Se usó un sistema de este tipo para determinar cuál de los componentes de las lipoproteínas es importante para neutralizar los LPS.

Los materiales ensayados fueron lipoproteína (R-HDL) reconstituida de elevada densidad, lipoproteínas naturales de plasma (VLDL, LDS, HDL), suero deficiente en lipoproteína (LPDS) y emulsión rica en triglicérido de 20% de INTRALIPID® (una mezcla de triglicéridos y fosfolípidos).

Se recogió sangre en un tubo heparinizado, se diluyó con Solución Salina Equilibrada de Hank (en adelante "HBSS"), o con el material que se va a ensayar, disuelto en HBSS. El material resultante se transfirió a tubos Startedt (250 \mu/tubo). Se disolvió LPS en una solución salina exenta de pirógenos que contenía 10 mM de HEPES, y se añadieron (2,5 \mul) a una concentración final de 10 ng/ml. Después de incubación durante 4 horas a 37ºC, se enfriaron los tubos a 4ºC y después se sometieron a centrifugación a 10.000xg durante 5 minutos. Se recogió el líquido sobrenadante y se ensayó para determinación de TNF-\alpha usando un ELISA disponible comercialmente.

La Tabla 1, que sigue, compara las composiciones de los materiales ensayados. Las figuras 5A y 5B presentan los resultados. Los datos se representan gráficamente como cantidad de TNF-\alpha producida frente a la concentración de proteína añadida (figura 5A) y fosfolípido (figura 5B). Se usaron escalas logarítmicas para exponer el amplio intervalo de concentraciones usadas, con 10º igual a 1 mg/ml. Todas las incubaciones de sangre entera contenían 10 ng/ml de 0111:B4 LPS de E. coli, suplementadas con una de las composiciones, según muestran las claves para las figuras 5A y 5B.

El hecho de que los materiales difieran en eficacia cuando se representa gráficamente el contenido en proteína (figura 5A), mientras son muy similares cuando se representa gráficamente el contenido en fosfolípidos (figura 5B) sugiere que el fosfolípido es el componente importante. Esto se confirma por el descubrimiento de que una emulsión de lípido sin proteína es más eficaz que HDL natural, pero menos eficaz que R-HDL. La proteína no parece importante para la neutralización.

TABLA 1

1

Ejemplo 3

Como etapa subsiguiente se ensayaron, en sangre humana entera, emulsiones de lípidos sin proteínas que contenían diferentes cantidades de lípido neutro. Se usó el mismo ensayo in vitro de sangre humana entera como se define en el ejemplo 2.

Todas las partículas aquí descritas se fabricaron por el mismo protocolo, que implicaba mezclar fosfolípido, esfingomielina o fosfatidilcolina, trioleína y/o éster de colesterol, disueltos en cloroformo y pesarlo a un frasco. Se añadió vitamina E (0,02% peso/volumen) como antioxidante. A continuación se preparó una película de lípido seco haciendo pasar gas de nitrógeno o de argon sobre la muestra. A continuación se añadió un volumen de solución salina no pirógena al frasco, y después se mezcló sobre una mezcladora de vórtex hasta que se suspendieron todo el lípido. La solución se homogeneizó luego en una homogeneizadora de alta presión. Se hicieron circular, 10 veces a 142 MPa a través de la homogeneizadora, muestras que contenían fosfatidilcolina (PC), con o sin trioleína. Se hicieron circular, 15-20 veces a 214 MPa a través de la homogeneizadora, muestras que contenían éster de colesterol, con uno o más lípidos distintos. Se filtraron las soluciones homogeneizadas a través de filtros de jeringa de 0,45 \mum y el filtrado se almacenó luego a temperatura ambiente hasta que se usó (dentro de tres días). Las figuras 6A y 6B presentan estos resultados. En estos estudios se representa gráficamente la producción de TNF-\alpha que depende de LPS frente a la concentración de triglicéridos (figura 6A), o fosfolípidos (figura 6B) añadidos. Las composiciones, como se indica en la clave, contenían (en peso) 7% de triglicérido ("TG"), 45% de TG, 89% de TG, 94% de TG, R-HDL, o fosfolípido sin TG (que se muestra solamente en la figura 6B). Una composición de 89% de TG es una formulación de 10% de INTRALIPID®, mientras 94% de TG se refiere a 20% de INTRALIPID. En todos los demás ensayos se usaron fosfatidilcolina (PC) de huevo y trioleína.

Estos resultados muestran que las composiciones sin proteínas son muy diferentes cuando se comparan respecto a su contenido en triglicéridos. Éstas son muy similares cuando se ensayan respecto a su contenido en fosfolípidos (PC). Esto confirma el papel del fosfolípido, especialmente porque el fosfolípido solo es eficaz, aunque menos que las emulsiones que contienen hasta 45% de TG.

Ejemplo 4

El trabajo procedió luego con experimentos in vivo en un modelo de ratones, que se acepta como sistema fiable para predecir la eficacia en seres humanos.

En estos experimentos se inyectaron a ratones, en forma de bolos, cantidades suficientes de las formulaciones descritas en el ejemplo 3 así como de otras (fosfatidilcolina pura, 7% de TG, 25% de TG, 45% de TG, 71% de TG, 81% de TG, 89% de TG, 94% de TG), o una solución salina de control, para proporcionar fosfolípido (200 mg/kg o 400 mg/kg) a los animales, junto con 25 mg/kg de 0111:B4 LPS de E. coli. El grupo de control recibió solución salina fisiológica intravenosa en un volumen suficiente para igualar el volumen de la emulsión. En la figura 7 se presenta la supervivencia después de 72 horas. De 344 animales en los grupos de control, sobrevivieron 155.

La PC sola tuvo un efecto protector modesto, que no fue significativo estadísticamente a un nivel de confianza del 95%, mientras que las composiciones de 7% 45% y 71% de TG mejoraron significativamente la supervivencia. Las composiciones de 80% y 89% de TG fueron marginalmente eficaces, mientras que la de 94% de TG disminuyó la supervivencia.

Cuando se incrementó la dosis para proporcionar 400 mg/kg de PC, ambas emulsiones de 89% y 94% de TG disminuyeron significativamente el tiempo de supervivencia, probablemente debido a la intoxicación por TG, como se explica más adelante.

Ejemplo 5

El trabajo descrito en los ejemplos 2-4 estableció que los fosfolípidos son agentes activos útiles para inhibir la endotoxemia. El hecho de que lípidos no polares distintos de los triglicéridos puedan formar emulsiones con fosfolípidos distintos de PC sugirió que se podían ensayar otros. Por ejemplo esfingomielina (otro fosfolípido) y colesterol sin esterificar (un lípido neutro polar) y mezclas de ellos. Así, además, se pueden usar colesterol esterificado (un éster no polar), escualeno (un hidrocarburo) y vitamina E (un antioxidante no polar). Para ensayarlos, se diseñó una serie de experimentos que usó el ensayo de sangre humana entera del ejemplo 2, anterior, y el ensayo de supervivencia de ratones del ejemplo 4.

Se prepararon emulsiones de la manera descrita anteriormente usando fosfatidilcolina pura, fosfatidilcolina con 10% (en peso/peso) de colestrol sin esterificar, 10% (en peso/peso) de esfingomielina o un 10% en total de una mezcla de ambos. Se añadieron las emulsiones a la sangre entera, a una concentración de 100 mg/dl, con referencia a PC, y 10 ng/ml de LPS. Se incubó la mezcla y se midió el TNF-\alpha liberado.

Los resultados se muestran en la figura 8. La producción de TNF-\alpha se redujo sustancialmente con PC sola. Las emulsiones que contenían colesterol sin esterificar, esfingomielina, o mezclas de ambos, también fueron supresoras de la liberación de TNF-\alpha.

Ejemplo 6

También se usó el ensayo de la sangre entera para determinar el efecto del colesterol sin esterificar y/o la esfingomielina en emulsiones que contienen lípido neutro. Nuevamente, se añadieron las emulsiones a 100 mg/dl de PC. Las diversas composiciones (en peso/peso) se exponen en la siguiente tabla.

2

Las figuras 9A y 9B exponen los resultados. Las emulsiones de PC hechas con lípido neutro y con o sin lípidos polares adicionales demostraron inhibición. Nuevamente, la concentración de LPS usó 10 ng/ml, que es una concentración de endotoxina clínicamente relevante. Las emulsiones que contienen éster de colesterol son menos eficaces que las emulsiones que contienen TG, mientras que la emulsiones que contenían colesterol sin esterificar no suprimieron la producción de TNF-\alpha.

Ejemplo 7

Se ensayaron emulsiones que contenían ésteres de colesterol en un modelo in vivo (esto es, el que se usa en el ejemplo 4), con una dosis letal de endotoxina. Se prepararon emulsiones con PC y TG, o PC y éster de colesterol (CE), y se administraron para proporcionar una dosis única de bolo de 200 mg/kg de PC, junto con 25 mg/kg de 0111:B4 LPS de E. coli (una dosis letal) a través de la vena de la cola. Los grupos de control recibieron solución salina fisiológica intravenosa en un volumen para igualar el volumen de la emulsión.

En la figura 10, los datos comparan los resultados de las emulsiones que contienen CE y TG. Se ensayó cada emulsión en un mínimo de dos experimentos, usando un total de 16 animales o más.

Como se ha mostrado, emulsiones que 7% o 45% de CE (en % en peso) mejoraron significativamente la supervivencia. Estos resultados, tomados con los del ejemplo 6, muestran que CE puede sustituir a TG para crear emulsiones que neutralizan endotoxina.

Ejemplo 8

Emulsiones de fosfolípidos con triglicéridos sin proteínas bloquean eficazmente la producción de TNF-\alpha en sangre entera estimulada con LPS. En teoría, estas emulsiones también podrían ser eficaces in vivo si se pudieran administrar de modo seguro en dosis que proporcionaran concentraciones protectoras de fosfolípidos en plasma. Los experimentos previos de los autores de la presente invención con R-HDL sugieren que la dosis mínima de fosfolípidos es de 200 mg/kg aproximadamente. Usando esta dosis y un volumen de plasma del 4,5% del peso corporal, se puede calcular la concentración de triglicéridos esperada en el plasma después de la administración de una serie de emulsiones con contenido creciente de triglicéridos. El resultado se muestra en la figura 11 como una línea que se curva suavemente hacia arriba al aumentar el porcentaje en peso de TG. Las concentraciones de TG en plasma raramente suben por encima de 1000 mg/dl en adultos sanos incluso después de una comida grasa. Se ha reseñado pancreatitis en pacientes con TG en plasma por encima de 2000 mg/ml (Farmer y otros, Amer. J. Med. 54:161-164 (1973); Krauss y otros, Amer. J. Med. 62:144-149 (1977); Glueck y otros, J. Lab. Clin. Med. 123:59-61). Es extremadamente raro un valor de TG en plasma por encima de 4000 mg/dl y motivo de grave preocupación. Estos dos últimos umbrales se muestran por medio de dos líneas horizontales en la figura anterior. Se espera que la administración tanto de 10% como de 20% de INTRALIPID® en una dosis para proporcionar 200 mg/kg de fosfolípido haga subir las concentraciones de TG en plasma (véanse los dos círculos claros) muy por encima de los límites de seguridad. En contraposición, la administración de emulsiones que contienen 7%, 45%, 71% o 78% (cuadrados rellenos de izquierda a derecha) hace subir los TG en plasma a 136, 477, 1300 y 2000 mg/dl respectivamente. Se espera que emulsiones con contenido en TG hasta \sim50% estén exentas de toxicidad de TG.

Ejemplo 9

Se ensayó la eficacia de combinaciones de fosfolípido y ácido biliar, esto es colato de sodio, en el mismo tipo de experimento que se ha expuesto en los ejemplos previos.

Sin embargo, fue diferente el procedimiento por el que se prepararon las formulaciones administradas a los animales de ensayo.

En este ejemplo, y en los ejemplos que siguen, se prepararon formulaciones usando un Microfluidizador homogeneizador de alta presión. Este aparato facilita la extrapolación a mayor escala.

Tanto la trioleína líquida como los triglicéridos líquidos se pesaron en una cantidad apropiada de agua o agua con 9 mM, 18 mM o 36 mM de colato de sodio. Se pesó fosfatidilcolina sólida granular sobre papel de pesar y se añadió luego, lentamente, a la disolución al tiempo que se agitaba. En todo caso se requieren 3-5 minutos para dispersar el lípido. Después de la dispersión, los materiales se vertieron al microfluidizador. El dispositivo utiliza presión hidráulica para hacer funcionar una bomba que, a su vez, dirige dos chorros opuestos de la muestra. La presión puede ser tan alta como 178 MPa. Después de la colisión, los chorros son forzados a través de un orificio con forma de signo más, homogeneizando con ello la muestra.

Se recirculó la muestra a través del microfluidizador, siendo definida "una pasada" como la cantidad de tiempo que se tarda en bombear toda la muestra a través de la máquina. La muestra se circuló durante 20 pasadas para producir una muestra homogeneizada. Se añadió dextrosa a una concentración final del 5%.

Se administraron endotoxina purificada 0111:B4 de E. coli (40 mg/kg) y emulsión, según se discutió anteriormente (200 mg de fosfatidilcolina/kg) en inyección por vía intravenosa a través de la vena de la cola. A los ratones que recibían colato solo se les suministró un volumen de colato de sodio igual al de la preparación colato/EML (emulsión), a la misma concentración de colato. Los ratones de control recibieron el mismo volumen de dextrosa del 5%, de modo que se igualara la osmolalidad del plasma.

Los resultados se ofrecen en la Tabla que sigue inmediatamente. La emulsión es la de fosfatidilcolina/7% de triglicérido que se ha descrito en los ejemplos precedentes. Cuando se usó, el colato de sodio se añadió a la concentración indicada, a las materias primas, antes de la emulsificación de los materiales.

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TABLA 2

3

Por conveniencia, los porcentajes en peso de las emulsiones son como sigue. Cuando se usa 9 mM de colato, los porcentajes en peso relativos a la emulsión son 7% de colato, 6,1% de triglicérido y 86,9 de fosfatidilcolina. A 18 mM de colato los porcentajes en peso son 13,1% de colato, 5,7% de triglicérido y 81,2 de fosfatidilcolina. A 36 mM de colato los valores relativos son 23,2% de colato, 5% de triglicérido y 71,8% de fosfatidilcolina.

Se ha de señalar que la cantidad de LPS administrada en estos experimentos (40 mg/kg) es mucho más elevada que la cantidad usada para los estudios de mortandad en los experimentos anteriores. La intención de estas dosis más elevadas es descartar cualquier efecto protector atribuible a fosfatidilcolina y/o triglicérido. Así, la conclusión a la que se ha llegar después de estos experimentos es que hay un efecto protector atribuible a la sal del ácido biliar, colato de sodio.

Estudios que no se presentan aquí son los estudios que se llevaron a cabo usando otras sales de ácidos biliares y sales biliares que contenían taurina. Ejemplos adicionales de ácidos biliares incluyen ácido alodeoxicólico, ácido litocólico, ácido hiodeoxicólico, ácido hiocólico, ácidos \alpha, \beta, \omega-muricólicos, ácido murodeoxicólico, ácido ursodeoxicólico, ácido ursocólico y todas las sales de éstos, tales como las sales de sodio y los conjugados de taurina o glicina. Véase Hoffman, anteriormente citado.

Ejemplo 10

Se llevaron a cabo, luego, estudios adicionales, el primero de los cuales fue un estudio de supervivencia, usando ratones como sujetos animales.

En el estudio de supervivencia se dividieron los sujetos animales en cuatro grupos. El primer grupo recibió una solución de dextrosa al 5% y actuó como control. El segundo grupo recibió una emulsión de 93% (en peso) de fosfatidilcolina y 7% (en peso) de triglicérido, preparada como se ha descrito anteriormente. La emulsión contenía 5% de dextrosa y fosfolípidos de soja a aproximadamente 50 mg/ml de lípido.

En los grupos tercero y cuarto, los animales recibieron una emulsión similar a la que se dio al segundo grupo, suplementada con 18 mM de colato de sodio o 18 mM de desoxicolato de sodio. En este experimento el protocolo usado fue idéntico al que se presenta en el ejemplo 9.

La supervivencia se midió 72 horas después del reto, y se sumariza en la tabla siguiente:

TABLA 3

4

Tanto los porcentajes de supervivencia como los análisis estadísticos muestran la clara e inesperada superioridad de las formulaciones que contienen sal de ácido biliar.

Ejemplo 11

Un segundo conjunto de experimentos utilizó un modelo de conejos. En este modelo se determinó la liberación de TNF (factor de necrosis tumoral)-\alpha.

Los conejos se dividieron en tres grupos, y recibieron solución de dextrosa al 5%, la emulsión de fosfolípidos y triglicéridos (93%/7%), discutida anteriormente, o una emulsión 93%/7% que también contenía 18 mM de ácido cólico. Todas las emulsiones se ajustaron a 5% de dextrosa, como en el ejemplo 10. Los conejos recibieron un bolo preparatorio de emulsión y dos horas más tarde fueron retados con 100 \mug de 0111:B4 LPS de E. coli. Después del bolo preparatorio, se administraron formulaciones para proporcionar una infusión continua de mantenimiento, por vía de administración intravenosa, de 50 mg de lípido por kilogramo de peso corporal por hora. La administración intravenosa se continuó durante tres horas después del reto.

Se extrajo sangre de los conejos en la línea de base, 30 minutos después de la administración del bolo primario y cada hora a los largo de las cinco horas después de la administración.

En la tabla que sigue, se presentan los valores pico de TNF-\alpha. Éstos se produjeron dos horas después de la administración de la endotoxina.

Se determinó la significación estadística usando el bien conocido ensayo de Student. Como muestra la tabla, los valores de TNF-\alpha se redujeron significativamente después de la administración de ácido cólico 18 mM.

5

Los siguientes ejemplos detallan la invención que implica, en un aspecto, el alivio o la prevención de la endotoxemia en un sujeto por la vía de administrar una cantidad eficaz de un fosfolípido con el que se asocia una endotoxina. La asociación de fosfolípido y endotoxina se elimina luego del sujeto por vía de procesos fisiológicos típicos, bien conocidos para los que estén familiarizados con los procesos por medio de los que se eliminan partículas de lipoproteínas. La asociación de la endotoxina con el fosfolípido inactiva aquella.

Los ejemplos también muestran que la administración de un miembro de la familia de ácidos colanoicos o de las sales de ácidos colanoicos, tal como un ácido biliar o una sal de ácido biliar también se puede usar para lograr el mismo fin que los fosfolípidos, esto es el alivio o la prevención de endotoxemia. Así, se pueden usar para tratar endotoxemia composiciones sin péptidos y sin proteínas, que contienen uno o ambos ácido biliar/sal de ácido biliar y fosfolípido. Se describen ácidos colanoicos por ejemplo por Hofmann, Hepatología 4(5):4S-14S (1984), que se incorpora por referencia. Se dirige la atención en particular a la página 5S, figuras 1 y 2, que se incorporan por referencia y que muestran las estructuras características de los ácidos colanoicos.

El sujeto que se ha de tratar es preferiblemente un ser humano, pero la práctica de la invención es igualmente aplicable también en el contexto veterinario.

"Alivio", según se usa aquí, se refiere al tratamiento que reduzca la carga de la endotoxemia causada por cualquiera de las diversas endotoxinas que producen, por ejemplo, las bacterias gram negativas (S. tymphimurium, E. coli, etc.). La profilaxis se puede lograr administrando el agente en un punto en el que el sujeto esté en una situación en que se pueda producir una exposición a la endotoxina o próximo a ella. Clásicamente, esto se produce durante las operaciones quirúrgicas. Así, un sujeto que está a punto de experimentar una operación quirúrgica puede tomar el ingrediente activo administrado como preparación de la operación.

La cantidad eficaz de fosfolípido y combinación de ácidos biliares necesaria para el tratamiento del sujeto puede variar. En general, se prefiere una dosis desde aproximadamente 200 mg totales hasta aproximadamente 800 mg de fosfolípido por kilogramo de peso corporal del sujeto, aunque la cantidad puede bajar, o subir, dependiendo de la severidad de la endotoxemia y del grado de riesgo en el contexto de la profilaxis. Para ácidos y sales colanoicos tales como los ácidos biliares y sus sales, se usa una dosis desde aproximadamente 10 mg hasta aproximadamente 300 mg/kg de peso corporal, más preferiblemente 15 mg hasta aproximadamente 275 mg por kg de peso corporal.

Es deseable administrar el ácido biliar/sal de ácido biliar y los fosfolípidos en composiciones que contengan también lípidos neutros, aunque esto no es necesario, ya que también se contemplan emulsiones de fosfolípidos exentas de lípidos neutros. La deseabilidad de la administración combinada de los fosfolípidos se deriva del hecho de que los lípidos neutros y los fosfolípidos se asocian en partículas que se parecen a las lipoproteínas, aunque difieren de ellas en que no contienen proteínas de componentes péptidos, las cuales están siempre presentes, evidentemente, en las lipoproteínas.

Son formas de tratamiento especialmente deseables aquellas en las que el posfolípido es una fosfatidilcolina, tal como fosfatidilcolina de yema de huevo, fosfatidilcolina basada en soja o un esfingolípido. Para ácido biliar/sal de ácido biliar se prefiere ácido cólico y/o sus sales, tal como colato de sodio, desoxicolato de sodio y quenodesoxicolato de sodio. Con respecto a los lípidos neutros se prefiere usar ésteres de colesterol o triglicérido, aunque también se pueden usar otros lípidos neutros tales como escualeno y otros aceites de hidrocarburos, di- y mono-glicéridos y antioxidantes tales como la vitamina E.

La forma en que se pueden administrar las composiciones puede variar, siendo especialmente preferidos un bolo u otras formas intravenosas. Cuando se usa la forma de un bolo, y la composición contiene por ejemplo triglicérido, hay que tener cuidado con la dosis. Es bien conocido que los trigliceridos son tóxicos si se administran en una cantidad demasiado grande. Sin embargo, un profesional de habilidad normal puede formular fácilmente composiciones de modo que se reduzca, o se elimine, el riesgo de intoxicación por triglicéridos. En general, cuando se usa la forma de un bolo, las composiciones no deberían contener más de aproximadamente 80 por ciento en peso de triglicérido u otro lípido neutro, preferiblemente no más de 70 por ciento en peso. Más preferiblemente, las composiciones no deberían contener más de aproximadamente 50 por ciento en peso, de lípido neutro, cuando se administra un bolo.

Sin embargo, cuando se emplean formas que no son bolo, tales como otras formas intravenosas, disminuye el riesgo de intoxicación. No obstante, se prefieren los intervalos anteriormente delineados para las formas de administración intravenosas y las otras, aunque se ha de entender que no se requieren. Para ácidos biliares y sales de ácidos biliares, las dosis son preferiblemente desde aproximadamente 25 mg/kg de peso corporal hasta aproximadamente 500 mg/kg de peso corporal, siendo las dosis preferidas desde aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal hasta aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Para los fosfolípidos se prefiere una dosis desde aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal hasta aproximadamente 1000 mg/kg de peso corporal. Sin embargo, estas dosis son generales y variarán dependiendo del sujeto y del modo de administración.

Como se ha indicado anteriormente, las formulaciones sin proteínas y sin péptidos requieren que esté presente al menos un fosfolípido o ácido biliar/sal de ácido biliar. Para los fosfolípidos se prefiere que esté presente al menos un lípido neutro, tal como triglicérido, diglicérido o monoglicérido. Las composiciones pueden incluir adicionalmente material tal como esteroles (por ejemplo colestrol, \beta-sitosterol), lípidos esterificados o sin esterificar (por ejemplo éster de colesterol o colesterol sin esterificar), aceites de hidrocarburos tales como escualeno, antioxidantes tales como vitamina E, aunque éstos no son imprescindibles. Evidentemente, se puede usar más de un fosfolípido y/o más de un lípido neutro en cualquier formulación de este tipo. Cuando se usan combinaciones de lípido neutro y fosfolípido, el lípido neutro debería estar presente desde aproximadamente 3% hasta aproximadamente 50% en peso con relación a la cantidad total de lípido en la composición.

En el caso de ácido biliar/sales de ácido biliar, éstos se pueden usar separadamente o en combinación con un fosfolípido, con un lípido neutro o con ambos. Con respecto a estos materiales adicionales (por ejemplo fosfolípidos y lípidos neutros) las especies preferidas son las anteriormente mencionadas y discutidas. Ingredientes adicionales opcionales incluyen los que se han relacionado anteriormente.

También son parte de la invención las composiciones útiles en el tratamiento de endotoxemia. Una realización de esta característica de la invención es una composición que contiene al menos uno de ácido biliar/sal de ácido biliar, fosfolípido y lípido neutro, en la que la composición en conjunto contiene una cantidad de ingrediente activo que alivia la endotoxemia. Esta composición contiene preferiblemente, en porcentajes en peso, desde aproximadamente 5% hasta aproximadamente 30% en peso de ácido biliar/sal de ácido biliar, desde aproximadamente 3% hasta aproximadamente 50% en peso de lípido neutro y desde aproximadamente 10% hasta aproximadamente 95% en peso de fosfolípido. Especialmente preferidas son las composiciones que contienen desde aproximadamente 10-15% en peso de ácido biliar/sal de ácido biliar, desde aproximadamente 5% hasta aproximadamente 10% en peso de lípido neutro y siendo fosfolípido el resto hasta equilibrar el 100% de la composición.

Se debería señalar que estos porcentajes en peso son relativos a composiciones que constan de tres componentes. Cuando el sistema de tres componentes se combina, por ejemplo con soporte, adyuvante, ingredientes opcionales tales como los anteriormente discutidos, descenderá el porcentaje en peso relativo a la composición entera. Se ha de tener en cuenta que las composiciones terapéuticas siempre son sin proteínas y sin péptidos.

En el caso de composiciones que no contienen ácido biliar ni sal de ácido biliar, las composiciones de este tipo sin proteínas, sin péptidos, contienen preferiblemente al menos aproximadamente 3% en peso de lípido neutro, hasta aproximadamente 50% en peso de lípido neutro, siendo el resto al menos un fosfolípido. Preferiblemente, el lípido neutro es un triglicérido, pero puede ser cualquiera de los lípidos neutros adicionales anteriormente discutidos. Además, el fosfolípido es preferiblemente fosfatidilcolina.

Otros aspectos de la invención quedarán claros para un profesional experto y no necesitan ser reiterados aquí.

Se entenderá que la memoria de patente y los ejemplos son ilustrativos pero no limitantes de la presente invención y que otras realizaciones dentro del espíritu y alcance de la invención se sugerirán por sí mismos a los expertos en la técnica.

Claims (17)

1. Uso de una composición farmacéutica sin proteínas, sin péptidos, que comprende un ácido colanoico o una sal de ácido colanoico, un fosfolípido y un lípido neutro, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de un ser humano o un animal que sufre endotoxemia.

2. Un uso según la reivindicación 1, que comprende no más de 80% en peso de un lípido neutro.

3. Un uso según la reivindicación 1 ó 2, que comprende no más de 70% en peso de un lípido neutro.

4. Un uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende no más de 50% en peso de un lípido neutro.

5. Un uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende desde 3% hasta 50% de lípido neutro con relación al peso total de la composición.

6. Una composición farmacéutica sin proteínas, sin péptidos, para administración intravenosa, que comprende un ácido colanoico o una sal de ácido colanoico, un fosfolípido y un lípido neutro, en la que el lípido neutro está presente desde 3% hasta 50% con relación a la cantidad total de lípido.

7. Una composición farmacéutica según la reivindicación 6, en la que el ácido colanoico o la sal de ácido colanoico es un ácido biliar o una sal de ácido biliar.

8. Una composición farmacéutica sin proteínas, sin péptidos, que comprende un ácido biliar o una sal de ácido biliar, un fosfolípido y un lípido neutro, en la que la composición comprende desde 5% hasta 30% en peso de ácido biliar o de sal de ácido biliar, desde 3% hasta 50% en peso de lípido neutro y desde 10% hasta 95% en peso de fosfolípido neutro, y en la que la composición es una emulsión.

9. Una composición farmacéutica según la reivindicación 8, que es adecuada para administración intravenosa.

10. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 6-9, en la que el fosfolípido es una fosfatidilcolina.

11. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 6-9, en la que el fosfolípido es un esfingolípido.

12. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 6-9, en la que el lípido neutro es un triglicérido.

13. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 6-9, en la que el lípido neutro es un éster de colesterol.

14. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 7-13, en la que la sal de ácido biliar se selecciona de colato de sodio, desoxicolato de sodio y quenodesoxicolato de sodio.

15. Una composición farmacéutica según la reivindicación 14, en la que la sal de ácido biliar es colato de sodio.

16. Una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 6-10, 12 y 15, en la que el colato de sodio, fosfatidilcolina y triglicérido tienen una relación de peso total de 13,1:81,2:5,7, respectivamente.

17. Uso de una composición farmacéutica según una cualquiera de las reivindicaciones 6-16 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de un ser humano o animal que sufre endotoxemia.