SK282493B6

SK282493B6 - Farmaceutická kompozícia a jej použitie

Info

Publication number: SK282493B6
Application number: SK176-97A
Authority: SK
Inventors: Daniel M. Levine; Thomas S. Parker; Albert L. Rubin; Bruce R. Gordon; Stuart D. Saal
Original assignee: Sepsicure, L. L. C.
Priority date: 1994-08-10
Filing date: 1995-08-10
Publication date: 2002-02-05
Also published as: ES2211915T3; DE69532239T2; CA2196906A1; AP9700921A0; SK17697A3; HK1003709A1; CZ37197A3; PL318593A1; DK0767666T3; FI118035B; CY2514B1; HUT77605A; NO970582D0; AU703861B2; EP0767666A4; BG101288A; JP3818660B2; US5674855A; FI970534A; NZ292315A

Abstract

Farmaceutický prostriedok na liečenie a prevenciu toxicity spôsobenej endotoxínom. Prostriedok neobsahuje proteíny a peptidy a je tvorený do 30 % hmotnostných kyseliny cholovej alebo jej soli; do 70 % hmotnostných neutrálneho lipidu, a zvyšnú časť tvorí najmenej jeden fosfolipid. Ďalej môže obsahovať triglyceridy, iné polárne alebo neutrálne lipidy, žlčové kyseliny alebo soli žlčových kyselín.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka kompozícií na liečenie endotoxémie súvisiacej s endotoxínmi. Najmä sa týka prostriedkov na liečenie takej otravy s obsahom zlúčenín, ktoré neutralizujú a/alebo odstraňujú endotoxíny z organizmu a je možné ich použiť aj na prevenciu týchto stavov.

Doterajší stav techniky

Endotoxický šok je stav, často smrteľný, provokovaný uvoľňovaním lipopolysacharidov (LPS) z vonkajšej membrány väčšiny gramnegatívnych baktérií (napríklad Escherichia coli, Salmonella typhimurium). Štruktúra bakteriálnych LPS bola už dobre objasnená vrátane zvláštnej molekuly, označovanej ako lipid A, ktorá je pripojená k acylovým reťazcom prostredníctvom glukozamínovej kostry molekúl lipidu A (pozri Raetz, Ann. Rev. Biochem. 59: 129 až 170 (1990).

Molekula lipidu A slúži ako membránová kotva pre lipopolysacharidové štruktúry („LPS“) a je to LPS, ktorý podmieňuje vývoj endotoxického šoku. Je potrebné zdôrazniť, že molekuly LPS sú charakterizované štruktúrou typu lipidu A a polysacharidovou časťou. Táto posledná časť sa môže v rôznych LPS v detailoch molekuly líšiť, ale zachováva si všeobecné štruktúrne motívy, charakteristické pre endotoxíny. Bolo by nesprávne uvádzať, že molekula LPS je od baktérie k baktérii rovnaká (pozri Raetz). V danej oblasti techniky je bežné označovať rôzne molekuly LPS ako „endotoxíny“ a tento termín bude používaný súhrne na označenie molekúl LPS.

V US patente 5,128,318, tu uvádzanom ako referenčnom, bolo predpokladané, že rekonštituované častice, obsahujúce tak apolipoproteín spojený s HDL, ako aj lipid schopný väzby na endotoxín a jeho inaktiváciu, by mohli byť použité ako účinné materiály na zmiernenie endotoxicity spôsobenej endotoxínmi.

V starších prihláškach (US 07/928,930, 12.8.1992; PCT/US93/07453, 9.8.1993; US 08/288,568, 10.8.1994; US patent 5,344,822 sa uvádza, že na liečenie toxicity, spôsobenej endotoxínmi môžu byť použité rôzne iné látky. Zvlášť bolo zistené, že apolipoproteíny nie sú v rekonštituovaných časticiach nutné a že rekonštituovaná častica môže obsahovať peptid a lipid, pričom peptid nie je apolipoproteín.

Bolo tiež zistené, že toxicita spôsobená endotoxínmi, môže byť liečená postupným podávaním buď apolipoproteínu alebo peptidu, po ktorom nasleduje lipid. Po postupnom podaní sa častice usporiadajú do formy rekonštituovaných častíc a potom odstraňujú endotoxín.

Bolo tiež zistené, že aspoň niektorí jedinci majú prirodzené úrovne apolipoproteínu, ktoré sú vyššie než normálne úrovne, takže účinné liečenie endotoxémie môže byť uskutočnené podávaním rekonštituovaných častíc, ktoré neobsahujú apolipoproteín alebo peptid, ale obsahujú lipid podľa prihlášky.

Navyše vynález, opisovaný v týchto prihláškach, zahrnoval použitie rekonštituovaných častíc a tu diskutovaných zložiek na prevenciu endotoxínom spôsobenej toxicity podávaním účinného množstva prostriedku v prípade potreby prevencie. Liečené subjekty zahrnujú pacientov trpiacich infekciami v rekonvalescencii po chirurgickom zákroku. Títo pacienti majú niekedy veľmi nízke hladiny HDL v plazme, niekedy len 20 % normálnej úrovne. V týchto prípadoch je na včasnú prevenciu pomocou HDL nanajvýš žiaduce, aby bola táto nízka hladina vykompenzovaná.

Podstata vynálezu

Teraz bolo celkom prekvapivo zistené, že fosfolipidy môžu byť použité samostatne alebo v kombinácii s ďalšími látkami, ako sú neutrálne lipidy, choláty a podobne, ako účinné prostriedky na zmiernenie a/alebo prevenciu endotoxémie.

Podstatou farmaceutického prostriedku bez proteínov a peptidov, na liečenie alebo prevenciu endotoxémie alebo sepsy u človeka alebo zvieraťa je, že obsahuje: do 30 % hmotnostných kyseliny cholovej alebo jej soli; do 70 % hmotnostných neutrálneho lipidu, a zvyšnú časť tvorí najmenej jeden fosfolipid.

Zvlášť výhodné je použitie fosfatidylcholínov (ďalej označované „PC“), buď samostatne alebo v kombinácii s ďalšími fosfolipidmi, ako sú sfmgolipidy, v prostriedkoch, ktoré v podstate neobsahujú peptidy a proteíny, ako apolipoproteíny alebo od nich odvodené peptidy. Pokiaľ sa prostriedky používajú vo forme intravenóznych jednorázových dávok, neutrálne lipidy, ako sú mono-, di- a triglyceridy je možné kombinovať s fosfolipidmi, pokiaľ celkové množstvo neutrálnych lipidov je pod určitou úrovňou. Pokiaľ sa neutrálne lipidy podávajú inými formami, ako napríklad intravenózne infúziou, ich obsah nie je taký kritický, aleje potrebné ho brať do úvahy.

Ďalšie výhodné uskutočnenia vynálezu zahrnujú emulzie, kde sa spolu s fosfolipidom a neutrálnym lipidom používa žlčová kyselina alebo soľ žlčovej kyseliny.

Je tu preukázaná účinnosť žlčových kyselín a solí žlčových kyselín, teda cholátov, pri liečení endotoxémie. Žlčové kyseliny je možné používať samostatne alebo v kombinácii s jedným alebo viacerými fosfolipidmi a/alebo neutrálnymi lipidmi, ako je fosfatidylcholín a/alebo triglycerid.

Vynález je detailnejšie opisovaný v nasledujúcom texte.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. IA a IB ukazujú výsledky, na testovanie rôznych prostriedkov na modeli, pričom bola určovaná neutralizácia endotoxínu pomocou uvoľňovania TNF v úplnej ľudskej krvi.

Obr. IA ukazuje úlohu proteínu a obr. IB úlohu fosfolipidu. Testovanými zlúčeninami sú prirodzené lipoproteíny a (VLDL, LDL, HDL), rekonštituovaný HDL (R-HDL) a prostriedky INTRALIPID^R, rovnako ako emulzie s obsahom fosfolipidu a proteínu.

Obr. 2A a 2B porovnávajú úlohu triglyceridu (neutrálneho lipidu) a fosfatidylcholinu, fosfolipidu, na rovnakom modeli.

Obr. 3 ukazuje toxicitu spôsobenú podaním rôznych prostriedkov PC a PC/TG na myšacom modeli s použitím modelu s 55 % letalitou, pričom sa podáva LPS E. coli.

Obr. 4 ukazuje údaje, ktoré je možné porovnať s testom s úplnou ľudskou krvou, ale s použitím fosfolipidu s neesterifikovaným cholesterolom, sfingomyelínom alebo zmesou oboch namiesto triglyceridov.

Obr. 5A a 5B ukazujú, porovnateľne s výsledkami na obrázkoch IA a IB s tým rozdielom, že v nových obrázkoch je fosfolipid, neesterifikovaný cholesterol a/alebo sfmgomyelín zmiešaný s triglyceridmi alebo esterifikovaným cholesterolom ako neutrálnym tukom.

Obr. 5 porovnáva výsledky s použitím esteru cholesterolu a emulzie s obsahom triglyceridu na myšacom modeli in vivo.

SK 282493 Β6

Obr. 7 ukazuje prostriedky podľa vynálezu a to teoretické množstvá triglyceridov uvoľnené do krvi po podaní rôznych TG s vyznačenou úrovňou toxicity.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1

Faktory, ktoré ovplyvňujú stimuláciu faktora TNF-a prostredníctvom LPS pri zachovaní integrity interakcie medzi proteínmi plazmy a krvnými elementmi je možné vhodne študovať in vitro v systéme úplnej ľudskej krvi. Rovnaký systém bol použitý na určenie, ktorá z lipoproteínových zložiek je dôležitá pri neutralizácii LPS.

Testovanými materiálmi boli rekonštituované proteíny s vysokou denzitou (R-HDL), prirodzené lipoproteíny plazmy (VLDL, LDS, HDL), sérum s nedostatkom lipoproteínov (LPDS) a 20 % emulzia INTRALIPID^R, bohatá na triglyceridy (zmes triglyceridov a fosfolipidov).

Krv bola odoberaná do heparinizovanej skúmavky, zriedená roztokom Hank's Balanced Sált Solution (ďalej „HBSS“) alebo testovaným materiálom, rozpusteným v HBSS. Výsledný materiál bol prenesený do skúmaviek Starstedt (250 μί/skúmavku). LPS bolo rozpustené v apyrogénnom fyziologickom roztoku, obsahujúcom 10 mM HEPES, a pridaných (2,5 μί) na konečnú koncentráciu 10 ng/ml. Po štvorhodinovej inkubácii pri 37 °C boli skúmavky ochladené na 4 °C a centrifugované pri 10 000 x g počas 5 minút. Supematant bol zobraný a testovaný na TNF-α s použitím komerčného testu ELISA.

Nasledujúca tabuľka 1 ukazuje porovnanie prostriedkov, zložených z testovaných materiálov. Obrázky IA a 1B ukazujú výsledky. Údaje ukazujú množstvo produkovaného TNF-α, vyneseného proti koncentrácii pridaného proteínu (obr. 1 A) a fosfolipidu (obr. 1B). Bola použitá logaritmická mierka na zobrazenie širokého rozsahu použitých koncentrácií, pričom 10° zodpovedá 1 mg/ml. Všetky inkubácie úplnej krvi obsahovali 10 ng/ml LPS E. coli 011LB4, doplnený jedným z prostriedkov, ako ukazuje opis obrázkov lAalB.

Fakt, že sa materiály líšia v účinnosti pri vynesenom obsahu proteínu (obr. 1 A), pričom sú veľmi podobné, keď je vynesený obsah fosfolipidu (obr. 1B), ukazujú na to, že fosfolipid je dôležitou zložkou. Toto je potvrdené zistením, že bezproteinová emulzia lipidu je účinnejšia než prirodzený HDL, ale menej účinná než R-HDL. Zdá sa, že proteín nie je pre neutralizáciu dôležitý.

Tabuľka 1

Zloženie prirodzených lipoproteínov a rekonštruovaného HDL

ϋρο proteín		TC	TG	ŕč	Proteín
Trieda	Hustote (g/ml)		% hmotnostné
VLĎL	<1,006	22	53	18	7
LĎL	1,007 -1,063	48	11	ϋ	20,9
hďl	1,063-1,21	18	8	22	52
R-HDL	1,063-1,21	-		79	21
LPDS	>1,21	0	0	2	98
IrrtraJfpid		1	93	é	0

Príklad 2

V ďalšom kroku boli testované v úplnej ľudskej krvi bezproteínové emulzie lipidov, obsahujúce rôzne množstva neutrálneho lipidu. Bol použitý rovnaký test na úplnej ľudskej krvi in vitro, ako je uvedené v príklade L

Všetky opisované častice boli pripravené podľa rovnakého protokolu, ktorý zahrnoval miešanie fosfolipidu, sfingomyelínu alebo fosfatidylcholínu, trioleínu a/alebo neesterifikovaného esteru cholesterolu, rozpusteného v chloroforme a naváženie do fľaštičky. Ako antioxidant bol pridaný vitamín E (0,02 % hmotnosť/objem). Potom bol pripravený film suchého lipidu preháňaním suchého plynného dusíka alebo argónu cez vzorku. Potom bol do fľaštičky pridaný jeden objem apyrogénneho fyziologického roztoku a fľaštičkou bolo miešané na mixéri, pokiaľ nebol všetok lipid suspendovaný. Roztok bol potom homogenizovaný vo vysokotlakovom homogenizátore. Vzorky obsahujúce fosfatidylcholín (PC) s trioleínom alebo bez trioleínu boli homogenizátorom cyklované desaťkrát pri tlaku 136 MPa. Vzorky s obsahom esteru cholesterolu s jedným alebo viacerými ďalšími lipidmi boli cyklované 15 až 20 x pri tlaku 204 MPa. Homogenizované roztoky boli filtrované striekačkou s filtrom 0,45 pm a filtrát bol až do použitia (počas 3 dní) skladovaný pri izbovej teplote. Získané výsledky ukazujú obrázky 2A a 2B. V týchto štúdiách je vynesená produkcia LPS - dependentného TNF-α proti koncentrácii pridaného triglyceridu (obr. 2A) alebo fosfolipidu (obr. 2B). Prostriedky, ako je uvedené v opise obrázku, obsahovali (v percentách hmotnostných) 7 % triglyceridu („TG“), 45 % TG, 89 % TG, 94 % TG, R-HDL alebo fosfolipid bez TG (ukázané len na obr. 2B). Prostriedok s 89 % TG je z 10 % INTRALIPID^Rom, zatiaľ čo 94 % TG sa vzťahuje k 20 % INTRALIPIDu. Vo všetkých ostatných testoch bol použitý vaječný fosfatidylcholín (PC) a trioleín.

Tieto výsledky ukazujú, že bezproteínové prostriedky, porovnateľné vo vzťahu k obsahu triglyceridu, sú veľmi odlišné. Tieto prostriedky sú si však veľmi podobné, pokiaľ sú testované vzhľadom na obsah fosfolipidu (PC). To potvrdzuje úlohu fosfolipidu, najmä pokiaľ je účinný samotný fosfolipid, ale v menšej miere to nastáva pri emulziách obsahujúcich až do 45 % TG.

Príklad 3

Práca potom pokračovala na experimentoch in vivo na myšacom modeli, ktorý je považovaný za spoľahlivý systém na predpovedanie u ľudí.

V týchto experimentoch bola myšiam podaná jednorazová injekcia dostatočných množstiev opísaných prostriedkov rovnako ako ďalších prostriedkov (čistý fosfatidylcholín, 7 % TG, 25 % TG, 45 % TG, 71 % TG, 81 % TG, 89 % TG a 94 % TG) alebo kontroly s fyziologickým roztokom na vytvorenie dávky fosfolipidu (buď 200 mg/kg alebo 400 mg/kg) spolu s 25 mg/kg LPS E. coli 0111:B4. Kontrolná skupina dostala intravenózne fyziologický roztok v rovnakom množstve ako objem emulzie. Prežívanie po 72 hodinách je uvedené na obr. 3. Z 344 zvierat v kontrolných skupinách prežilo 155.

Samotný PC má mierny ochranný účinok, pri miere spoľahlivosti 95 % štatisticky nevýznamný, zatiaľ čo prostriedky s obsahom TG 7 %, 45 % a 71 % výrazne zlepšovali prežitie. Prostriedky s obsahom 80 % a 89 % TG boli účinné len čiastočne, zatiaľ čo 94 % TG prežitie znižovalo.

Keď bola dávka zvýšená až na 400 mg/kg PC, tak 89 %, ako aj 94 % emulzie TG významne znižovali čas prežitia, pravdepodobne kvôli otrave TG, ako bude vysvetlené ďalej.

SK 282493 Β6

Príklad 4

Práca, opisovaná v príkladoch 1 až 3, ukázala, že fosfolipidy sú aktívnym prostriedkom pôsobiacim pri inhibícii endotoxémie. Fakt, že nepoláme lipidy iné než triglyceridy môžu tvoriť emulzie s fosfolipidmi inými než PC naznačuje, že môžu byť vyskúšané aj ostatné lipidy. Ako príklady uvádzame sfmgomyelín (ďalší fosfolipid) a neesterifikovaný cholesterol (polárny neutrálny lipid) a ich zmesi. Môže byť tiež použitý esterifikovaný cholesterol (nepolámy ester), skvalén (uhľovodík) a vitamín E (nepolámy antioxidant). Na ich testovanie bol navrhnutý rad experimentov s použitím úplnej ľudskej krvi (pozri príklad 1) a test prežívania myší (pozri príklad 3).

Uvedeným spôsobom boli pripravené emulzie s použitím čistého fosfatidylcholínu, fosfatidylcholínu s 10 % hmotnostnými neesterifikovaného cholesterolu, 10 % hmotnostnými sfmgomyelínu alebo celkovo 10 % zmesi oboch. Emulzie boli k úplnej krvi pridané v koncentrácii 100 mg/dl vzhľadom na PC a 10 ng/ml LPS. Zmes bola inkubovaná a bolo merané uvoľnenie INF-a.

Výsledky ukazuje obr. 4. Produkcia TNF-α bola podstatne redukovaná už samotným PC. Uvoľňovanie TNF-a potlačovali aj emulzie s obsahom neesterifikovaného cholesterolu, sfmgomyelínu alebo zmesi oboch.

Príklad 5

Na určovanie vplyvu neesterifikovaného cholesterolu a alebo sfmgomyelínu na emulzie s obsahom neutrálneho lipidu bol tiež použitý test s úplnou krvou. Emulzie boli opäť pridávané v koncentrácii 100 mg/dl PC. V nasledujúcej tabuľke 2 sú uvedené rôzne prostriedky (v % hmotnostných).

Tabuľka 2

Emulzia	Zlozenie
PCSO45%TG	55:45
PC + TG + C	54,4:45,3:0.3
PC + TG + SP	51,6:43,0:5,4
PC + TG + C + SP	51,4:42,8:0,3:5,4
PC + CE	54,5:45,5
PC + CE + C	54,4 : 45,3 : 0,3
PC + CE + SP	51,6:43,0:5,4
PC + CE + C + SP	51,5:42,9:0,3:5,4

Výsledky sú ukázané na obr. 5A a 5B. Emulzie PC, pripravené vždy s neutrálnym lipidom, s polárnymi lipidmi alebo bez ďalších polárnych lipidov, mali inhibičný účinok. Bola použitá opäť koncentrácia LPS 10 ng/ml, ktorá klinicky zodpovedá koncentrácii endotoxínu. Emulzie obsahujúce ester cholesterolu, majú menšiu účinnosť než emulzie s obsahom TG, zatiaľ čo emulzie s obsahom neesterifikovaného cholesterolu nepotlačujú TNF-α rovnako ako emulzie, ktoré ho neobsahujú. Zdá sa, že prídavok sfmgomyelínu k emulziám zlepšil potlačenie produkcie TNF-a.

Príklad 6

Emulzie, obsahujúce ester cholesterolu, boli testované na modeli in vivo, použitom v príklade 3, s letálnou dávkou endotoxínu. Boli pripravené emulzie s obsahom PC a TG alebo PC a esteru cholesterolu (CE), ktoré boli podávané v jednotlivej dávke 200 mg/kg PC spolu s 25 mg/kg E. coli 0111 :B4 LPS (smrteľná dávka) chvostovou cievou. Kon trolné skupiny dostali intravenózne rovnaký objem fyziologického roztoku.

Na obr. 6 sú porovnané výsledky pre emulzie, obsahujúce CE a TG. Každá emulzia bola testovaná minimálne v dvoch experimentoch s použitím 16 a viac zvierat.

Ako je ukázané, emulzia s obsahom 7 % alebo 45 % CE (% hmotnostné) významne zlepšovali prežitie. Tieto výsledky spolu s výsledkami podľa príkladu 5 ukazujú, že CE môže byť nahradené TG za vytvorenia emulzií, ktoré neutralizujú endotoxín.

Príklad 7

Bezproteínové emulzie fosfolipidu s triglyceridom účinne blokujú produkciu TNF-α v úplnej krvi, stimulovanou LPS. Teoreticky môžu byť aj tieto emulzie účinné in vivo, ak je možné ich bezpečne podávať v dávkach, ktoré vytvoria ochranné koncentrácie fosfolipidu v plazme. Naše predchádzajúce experimenty s R-HDL ukazujú, že minimálna dávka fosfolipidu je približne 200 mg/kg. S použitím tejto dávky a objemu plazmy, ktorá tvorí 4,5 % telesnej hmotnosti, je možné vypočítať koncentráciu triglyceridu, očakávanú v plazme, po podaní radu emulzií so stúpajúcim obsahom triglyceridu. Výsledok ukazuje obr. 7 ako hladkú čiaru, ktorá sa zakrivuje nahor so stúpajúcim hmotnostným TG. Koncentrácia TG v plazme u zdravých dospelých zriedka prekročí 1000 mg/dl dokonca aj po tučnom jedle. U pacientov s koncentráciou TG v plazme nad 2000 mg/dl je hlásená pankreatitída (Farmer a ďalší. Amer. J. Med. 54: 161 až 164 (1973); Krauss a ďalší, Amer. J. Med. 62: 144 až 149 (1977); Glueck a ďalší, J. Lab. Clin. Med. 123: 59 až 61). Koncentrácie TG nad 4000 mg/dl je extrémne vzácna a svedčí o vážnom stave. Posledné dve hladiny sú na obrázku označené vodorovnými čiarami. Podanie buď 10 % alebo 20 % INTRALIPID^i v dávke, ktorá poskytuje 200 mg/kg fosfolipidu, má zvýšiť koncentrácie TG v plazme (pozri dva prázdne krúžky) s istotou nad bezpečné hranice. Naopak podanie emulzií, ktoré obsahujú 7 %, 45 % alebo 75 % (plné štvorce zľava doprava) zvýši koncentráciu TG v plazme na 136,477, 1300 alebo 2000 mg/dl. Emulzie s obsahom TG až do približne 50 % by nemali byť z hľadiska TG toxické.

Príklad 8

V rovnakom type experimentov, ktorý sa uvádza v predchádzajúcich príkladoch, bola testovaná účinnosť kombinácií fosfolipidu a žlčovej kyseliny, t. j. cholátu sodného.

Spôsob, ktorým boli pripravované prostriedky, podávané testovacím zvieratám, však bol odlišný.

V tomto príklade a v nasledujúcich príkladoch boli prostriedky pripravované s použitím vysokotlakého homogenizátora Microfluidizer. Tento prístroj umožňuje zväčšenie mierky.

Kvapalný trioleín alebo kvapalný sójový triglycerid boli navážené do vhodného množstva vody alebo vody, obsahujúcej 9 mM, 18 mM alebo 36 mM cholát sodný. Na papier bol navážený tuhý granulovaný fosfatidylcholín a potom pomaly za miešania pridávaný k roztoku. Na dispergovanie lipidu je vždy potrebný čas 3 až 5 minút. Po dispergácii boli materiály naliate do homogenizátora. Zariadenie používa na pohon čerpadlá hydraulického tlaku a dva lúče vzorky sú smerované proti sebe. Tlak môže dosiahnuť až 170 MPa. Po zrážke sú lúče pretlačované dýzou v tvare kríža a tým sa roztok homogenizuje.

SK 282493 Β6

Vzorky boli recirkulované homogenizátorom, pričom jeden prechod je definovaný ako čas, ktorý potrebuje čerpadlo na pretlačenie celej vzorky pristrojom. Na dosiahnutie homogénnej vzorky bola vzorka cirkulovaná dvadsaťkrát. Bola pridaná dextróza do konečnej koncentrácie 5 %.

Pri izbovej teplote bolo zmiešané endotoxín, vyčistený z E. coli 0111 :B4 (40 mg/kg a emulzia, ktorá je diskutovaná ďalej (200 mg fosfatidylcholínu/kg) boli zmiešané a ihneď podávané intravenózne injekciou chvostovou cievou myšiam C57BL6/J (hmotnosť medzi 19 a 30 g). Myši, ktorým bol podávaný samotný cholát, dostávali objem cholátu sodného rovnaký ako objem emulzie prípravku cholát/EML pri rovnakej koncentrácii cholátu. Kontrolné myši dostávali rovnaký objem 5 % dextrózy, aby bola zachovaná osmolalita plazmy.

Výsledky sú uvedené v tabuľke 3, ktorá nasleduje. Emulzia fosfatidylcholinu/7 % triglyceridu, bola opísaná v predchádzajúcich príkladoch. Pokiaľ bol použitý cholát sodný, bol pridávaný v uvedených koncentráciách k surovým materiálom pred ich emulgáciou.

Tabuľka 3

Ochrana myší od letálnej dávky endotoxínu

&M	kontrola	7UTÔ		llmMCA
	9mM	18 mM	36 mM	bez PC BeboTG	♦ PC
h	pofiet myil.ktorfpreSHNj
0	28	28	9	16	8	8	8
24	9	12	4	1Ä	&	8	8
48	5	10	2	15	δ	a	8
Ί2	2	5	1	15	8	a	8
96	1	0	1	15	δ	7	8

Ďalej udávame hmotnostné percentá v emulziách. Pri použitom 9 mM choláte sú hmotnostné percentá vzhľadom na emulziu: 7 % cholátu, 6,1 % triglyceridu a 86,9 % fosfatidylcholínu. Pri použitom 18 mM choláte sú hmotnostné percentá vzhľadom na emulziu: 13,1 % cholátu, 5,7 % triglyceridu a 81,2 % fosfatidylcholínu. Pri použitom 36 mM choláte sú hmotnostné percentá vzhľadom na emulziu: 23,2 % cholátu, 5 % triglyceridu a 71,8 % fosfatidylcholínu.

Je treba zdôrazniť, že v týchto experimentoch podávané množstvo LPS (40 mg/kg) je oveľa vyššie než množstvo používané na štúdium letality v predchádzajúcich experimentoch. Účelom týchto vyšších dávok je prekrytý akýkoľvek ochranný vplyv, ktorý by bolo možné pripísať fosfatidylcholínu a/alebo triglyceridu. Záver, ktorý by mal vyplynúť z týchto experimentov je ten, že existuje ochranný účinok, ktorý je možné pripísať soli žlčovej kyseliny, cholátu sodnému.

Nie sú tu uvedené štúdie, uskutočňované s použitím iných solí žlčovej kyseliny s obsahom taurínu. Ďalšie príklady žlčových kyselín sú allodeoxycholová kyselina, litocholová kyselina, hyodeoxycholová kyselina, hyocholová kyselina, α, β a muricholové kyseliny, murodeoxycholová kyselina, ursodeoxycholová kyselina, ursocholová kyselina a všetky ich soli, ako sú soli sodné alebo konujugáty s taurínom alebo glycínom (pozri Hoffman).

Príklad 9

Ďalej bolo študované prežívanie s použitím myší ako pokusných zvierat.

V tejto štúdii boli pokusné zvieratá rozdelené do štyroch skupín. Prvá skupina dostala roztok 5 % dextrózy a bola použitá ako kontrolná. Druhá skupina dostala emulziu 93 % hmotnostných fosfatidylcholínu a 7 % hmotnostných triglyceridu pripravených, ako je uvedené. Emulzia obsahovala 5 % dextrózy a sójové fosfolipidy v množstve približne 50 mg/ml lipidu. V tretej a vo štvrtej skupine bola zvieratám podaná podobná emulzia ako druhej skupine, doplnená buď 18 mM cholátom sodným alebo 18 mM deoxycholátom sodným. V tomto experimente bol použitý rovnaký protokol ako v príklade 8.

Prežívanie bolo merané 72 hodín po podaní aje uvedené v nasledujúcej tabuľke.

Tabuľka 4

Účinok prídavku žlčovej kyseliny k 7 % emulzii triglyceridu na 72 hodinové prežívanie myší

Skupina	N	Prežitie Hodnota p v skupine
%	1	2	3
1 5% dextróza	28	4		-
2 7%TG	64	8	NS	-	-
3 cholát sodný+ 7 %TG	16	94	0,00001	0,00001
4 deoxycholátaodný + 7%TG	8	75	0,0001	0,00001	NS

Pri porovnávaní prežitia bola štatistická významnosť medzi skupinami testovaná generalizovanou Wilcoxovou metódou s použitím počítačového programu. Porovnania so skupinou 1 kontroly sú uvedené v riadku „1“, porovnania so skupinou 2, ošetrenou 7 % emulziou sú uvedené v riadku „2“ a porovnania so skupinou 3, liečenou emulziou s cholátom sodným sú uvedené v riadku „3“.

Tak percento prežitia, ako aj štatistická analýza jasne ukazujú neočakávanú prevahu prostriedkov s obsahom žlčovej kyseliny.

Príklad 10

V druhej sérii experimentov bol ako model použitý králik. V tomto modeli sa určovalo uvoľňovanie TNF-a (tumor necrosis factor).

Králiky boli rozdelené do troch skupín a dostali 5 % roztok dextrózy, emulziu fosfolipidu a triglyceridu (93 %/7 %), ako je diskutované alebo emulziu 93 %/7 % s obsahom 18 mM kyseliny cholovej. Koncentrácia dextrózy bola pri všetkých emulziách nastavená na 5 %, ako v príklade 9. Králiky dostali uvádzaciu dávku emulzie a o 2 hodiny neskoršie im bolo podaných 100 pg LPS E. coli 0111:B4. Po uvádzacej dávke boli prostriedky podávané intravenózne priebežnou infúziou rýchlosťou 50 mg lipidu na kg telesnej hmotnosti za hodinu. Intravenózne podanie pokračovalo 3 hodiny po podaní LPS.

Králikom bola odobraná krv pred začiatkom experimentu, 30 minút po podaní uvádzacej dávky a v hodinových intervaloch v priebehu 5 hodín po podaní.

V nasledujúcej tabuľke sú uvedené špičkové hodnoty TNF-α. Tie boli dosiahnuté 2 hodiny po podaní endotoxínu.

Bola určovaná štatistická významnosť s použitím známeho Študentovho testu. Ako je ukázané v tabuľke, po podaní 18 mM kyseliny cholovej došlo k podstatnému zníženiu hladiny TNF-a.

Tabuľka 5

Účinok emulzie na produkciu TNF-α u králika

Emulzia	TNF-a	Významnosť
ng/ml	N	P
Kontrola 5 % dextróza	134170	Θ
Emulzia 7 % G	8615	5	<0.05
Emulzia 7% TG + 18 ml kyseliny chotovaj	39120	4	<0,01

Predchádzajúce príklady detailnejšie opisujú vynález, ktorý v jednom hľadisku zahrnuje zmiernenie alebo prevenciu endotoxémie u pacienta podávaním účinnej dávky fosfolipidu, s ktorým sa endotoxín spája. Fosfolipid spojený s endotoxínom je potom z tela odstránený štandardnými biologickými spôsobmi, ktoré sa nelíšia od normálnych v danej oblasti techniky známych spôsobov odstraňovania lipoproteínových častíc. Spojenie endotoxínu s fosfolipidom endotoxin inaktivuje.

Príklady tiež ukazujú, že na dosiahnutie rovnakého účinku ako pri fosfolipidoch, t. j. na liečenie a prevenciu endotoxémie, je možné podávať aj niektorú látku z rodiny kyselín cholových alebo solí kyselín cholových, ako je kyselina žlčová alebo soľ kyseliny žlčovej. Na liečenie endotoxémie môžu byť teda použité prostriedky, neobsahujúce peptidy a proteíny, v ktorých je prítomná žlčová kyselina, soľ žlčovej kyseliny alebo obe látky. Kyseliny cholové sa opisujú napríklad u: Hofmann, Hepatology 4 (5): 4S-14S (1984), ktorá sa tu uvádza ako referencia. Pozornosť je potrebné venovať zvlášť obrázkom 1 a 2 na strane 5S, ktoré ukazujú štruktúry charakteristické pre kyseliny cholové.

Liečebným subjektom je najmä človek, ale vynález je možné použiť aj vo veterinárnom lekárstve.

Termín „zmiernenie“ sa tu používa na liečenie, ktoré znižuje záťaž endotoxémiou, spôsobenou niektorým z produkovaných endotoxínov, napríklad gramnegatívnych baktérií (S. typhimurium, E. coli atď.). Prevenciu je možné vykonávať podávaním prostriedku v okamihu, keď jedinec je alebo pravdepodobne bude v situácii, keď môže dôjsť k expozícii endotoxínom. To sa klasicky vyskytuje v priebehu chirurgického zákroku. Jedinec, ktorý sa má podrobiť chirurgickému výkonu, teda môže dostať aktívnu zložku ako prípravu na výkon.

Účinné množstvo kombinácie fosfolipidu a žlčovej kyseliny, nutné na liečenie pacienta, môže byť rôzne. Všeobecne sa dáva prednosť dávke od 200 až do približne 800 mg fosfolipidu na kg telesnej hmotnosti, ale množstvo môže byť nižšie alebo vyššie v závislosti od vážnosti endotoxémie alebo stupňa rizika vo vzťahu k prevencii. Pre kyseliny cholové a ich soli, ako sú žlčové kyseliny a ich soli, sa používa dávka od približne 10 mg až do približne 300 mg na kg telesnej hmotnosti, lepšie 15 mg až približne 275 mg na kg telesnej hmotnosti.

Je žiaduce podávať žlčovú kyselinu alebo soli žlčovej kyseliny a fosfolipidy v prostriedkoch, ktoré tiež obsahujú neutrálne lipidy, ale nie je to nevyhnutné, pretože emulzia bez neutrálnych lipidov sa pravdepodobne budú vyskytovať tiež. Požiadavka na kombinované podávanie fosfolipidov vyplýva zo skutočnosti, že sa neutrálne lipidy a fosfolipidy spájajú do častíc, ktoré sa podobajú lipoproteínom, ale líšia sa od nich tým, že neobsahujú žiadne proteínové alebo peptidové zložky, ktoré sú samozrejme v lipoproteínoch vždy prítomné.

Zvlášť požadovanými formami liečenia sú tie, kde fosfolipidom je fosfatidylcholín, ako napríklad fosfatidylchoíín vaječného žitka, fosfatidylcholín zo sóje alebo sfingolipid. Ako žlčová kyselina alebo soľ žlčovej kyseliny je vý hodná kyselina cholová a/alebo jej soľ, ako je cholát sodný, deoxycholát sodný a chenodeoxycholát sodný. Čo sa týka neutrálnych lipidov, je výhodné používať ester cholesterolu alebo triglycerid, ale môžu byť tiež použité iné neutrálne lipidy, ako je skvalén alebo iné uhľovodíkové oleje, di- a monoglyceridy a antioxidanty, ako je vitamín E.

Je možné použiť rôzne formy podávania prostriedkov, pričom zvlášť výhodná je jednorazová injekcia alebo iné intravenózne formy. Pokiaľ sa použije forma jednorazovej injekcie a prostriedok obsahuje triglycerid, musí sa venovať určitá pozornosť dávkovaniu. Je totiž pomerne dobre známe, že triglyceridy sú toxické, keď sa podávajú v príliš veľkej dávke. Odborník so zvyčajnou skúsenosťou v danej oblasti techniky však môže ľahko zostaviť prostriedok tak, aby bolo riziko otravy triglyceridom znížené alebo odstránené. Všeobecne, pokiaľ sa používa forma jednorazovej injekcie, prostriedky by nemali obsahovať viac než 80 % hmotnostných triglyceridu alebo iného neutrálneho lipidu, výhodne nie viac než 70 % hmotnostných. Najvýhodnejšie by prostriedky na podávanie jednorazovou injekciou nemali obsahovať viac než 50 % hmotnostných neutrálneho lipidu.

Keď sa však použije iná intravenózna forma, než je jednorazová injekcia, riziko otravy je znížené. Aj pre intravenózne a ostatné formy podávania sú viac menej uvedené rozsahy výhodné, aj keď sú nevyhnutné. Pre žlčové kyseliny a soli žlčových kyselín sa dávky výhodne pohybujú od približne 25 mg/kg telesnej hmotnosti až do približne 500 mg/kg telesnej hmotnosti, pričom zvlášť výhodné sú dávky od približne 50 mg/kg telesnej hmotnosti do približne 100 mg/kg telesnej hmotnosti. Pre fosfolipidy sú výhodné dávky od približne 100 mg/kg telesnej hmotnosti až do približne 1000 mg/kg telesnej hmotnosti. Uvedené dávky sú všeobecné použiteľné, ale budú sa líšiť v závislosti od pacienta a spôsobu podávania.

Ako je uvedené, prostriedky bez proteínov a peptidov vyžadujú prítomnosť aspoň jedného fosfolipidu alebo žlčovej kyseliny/soli žlčovej kyseliny. V prípade fosfolipidov je výhodné, aby bol prítomný aspoň jeden neutrálny lipid, ako je triglycerid, diglycerid alebo monoglycerid. Prostriedky môžu obsahovať ďalšie materiály, ako sú steroly (napríklad cholesterol, B-sitosterol), esterifikované alebo neesterifikované lipidy (napríklad ester cholesterolu alebo neesterifikovaný cholesterol), uhľovodíkové oleje, ako je skvalén, antioxidanty ako je vitamín E, ale tieto látky nie sú nevyhnutné. V takomto prostriedku môže byť samozrejme použitých viac než jeden fosfolipid a/alebo viac než jeden neutrálny lipid. Pokiaľ sa používa kombinácia neutrálneho lipidu a fosfolipidu, neutrálny lipid by mal byť prítomný v koncentrácii od približne 3 % až do približne 50 % hmotnostných vzhľadom na celkové množstvo lipidu v prostriedku.

V prípade žlčových kyselín/solí žlčových kyselín je možné použiť oddelene alebo v kombinácii s fosfolipidom, neutrálnym lipidom alebo oboma. S ohľadom na tieto ďalšie materiály (napríklad fosfolipidy a neutrálne lipidy) sú výhodné uvedené látky. Je možné prípadne použiť ďalšie zlúčeniny z uvedených.

Súčasťou vynálezu sú aj prostriedky použiteľné na liečenie endotoxémie. Jedným z uskutočnení vynálezu v tejto skupine je prostriedok, obsahujúci aspoň jednu látku zo skupiny žlčová kyseiina/soľ žlčovej kyseliny, fosfolipid a neutrálny lipid, pričom prostriedok ako celok obsahuje množstvo látky, ktoré umožní zmierniť endotoxémiu. Tento prostriedok výhodne obsahuje (v % hmotnostných) od približne 5 % do približne 30 % žlčovej kyseliny/soli žlčovej kyseliny, od približne 3 % do približne 50 % neutrálneho lipidu a od približne 10 % do približne 95 % fosfolipidu. Zvlášť výhodné sú prostriedky, obsahujúce od približne 10

SK 282493 Β6 až 15 % hmotnostných žlčovej kyseliny/soli žlčovej kyseliny, od približne 5 % do približne 10 % hmotnostných neutrálneho lipidu a zvyšok tvorí fosfolipid.

Je potrebné zdôrazniť, že tieto hmotnostné percentá sa vzťahujú na prostriedky skladajúce sa z troch zložiek. Keď je trojzložkový systém kombinovaný napríklad s nosičom, pomocnou látkou a prípadnými uvedenými látkami, percento vztiahnuté na celý prostriedok tým poklesne. Ďalej je potrené zdôrazniť, že tieto farmaceutické prostriedky sú vždy bez proteínov a peptidov.

V prípade prostriedkov, ktoré neobsahujú žlčovú kyselinu alebo soľ žlčovej kyseliny, sú tieto prostriedky bez proteínov a peptidov výhodne obsahujú aspoň približne 3 % hmotnostné neutrálneho lipidu, až do približne 50 % hmotnostných neutrálneho lipidu, pričom zvyšok tvorí aspoň jeden fosfolipid. Neutrálny lipid je výhodne triglycerid, ale môže ním byť akýkoľvek z ďalších neutrálnych lipidov, ktoré sa uvádzajú. Fosfolipidom tiež môže výhodne byť ťosfatidylcholín.

Ďalšie aspekty vynálezu budú odborníkovi v danej oblasti techniky jasné a nie je potrebné ich tu ďalej rozvádzať.

Uvedené príklady a špecifikácie je nutné považovať za ilustračné a v žiadnom prípade nemajú predkladaný vynález obmedzovať. Ďalšie uskutočnenia v rámci podstaty vynálezu sú potom odborníkom v danej oblasti techniky samozrejmé.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Farmaceutický prostriedok bez proteínov a peptidov, na liečenie alebo prevenciu endotoxémie alebo sepsy u človeka alebo zvieraťa, vyznačujúci sa tým, že obsahuje: do 30 % hmotnostných kyseliny cholovej alebo jej soli; do 70 % hmotnostných neutrálneho lipidu, a zvyšnú časť tvorí najmenej jeden fosfolipid.
2. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, v y značujúci sa tým, že kyselinou cholovou alebo soľou kyseliny cholovej je žlčová kyselina alebo soľ kyseliny žlčovej.
3. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 2, vyzná č u j ú c i sa t ý m , že soľ kyseliny žlčovej je zvolená zo skupiny cholát sodný, deoxycholát sodný a chenodeoxycholát sodný.
4. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 2, v y značujúci sa tým, že soľou kyseliny žlčovej je cholát sodný.
5. Farmaceutický prostriedok podľa niektorého z nárokov laž 4, vyznačujúci sa tým, že fosfolipidom je fosfatidylcholín.
6. Farmaceutický prostriedok podľa niektorého z nárokov laž 4, vyznačujúci sa tým, že fosfolipidom je sfingolipid.
7. Farmaceutický prostriedok podľa niektorého z nárokov laž 6, vyznačujúci sa tým, že neutrálnym lipidom je triglycerid.
8. Farmaceutický prostriedok podľa niektorého z nárokov laž 6, vyznačujúci sa tým, že neutrálnym lipidom je ester cholesterolu a prostriedok je vo forme emulzie.
9. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 8, v y značujúca sa tým, že obsahuje 10 až 15 % hmotnostných kyseliny žlčovej alebo jej soli, od 5 do 10 % hmotnostných neutrálneho lipidu a zvyšok tvorí fosfolipid.
10. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 8 alebo 9, vyznačujúca sa tým, že je vo forme na intravenózne podávanie.
11. Farmaceutická kompozícia podľa niektorého z nárokov 6až 10, vyznačujúca sa tým, že fosfolipidom je fosfatidylcholín.
12. Farmaceutická kompozícia podľa niektorého z nárokov 6až 10, vyznačujúca sa tým, že fosfolipidom je sfingolipid.
13. Farmaceutická kompozícia podľa niektorého z nárokov 6 až 12, vyznačujúca sa tým, že neutrálnym lipidom je triglycerid.
14. Farmaceutická kompozícia podľa niektorého z nárokov 6 až 12, vyznačujúca sa tým, že neutrálnym lipidom je ester cholesterolu.
15. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 7 až 14, vyznačujúca sa tým, že soľ kyseliny žlčovej je zvolená zo skupiny cholát sodný, deoxycholát sodný a chenodeoxycholát sodný.
16. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 15, v y značujúca sa tým, že soľou kyseliny žlčovej je cholát sodný.
17. Farmaceutická kompozícia podľa niektorého z nárokov 6 až 11, 13 a 16, vyznačujúca sa tým, že obsahuje fosfatidylcholín, triglycerid a cholát sodný.
18. Farmaceutická kompozícia podľa nároku ^vyznačujúca sa tým, že hmotnostný pomer fosfatidylcholínu k triglyceridu je 93 : 7.
19. Farmaceutická kompozícia podľa nároku 17, vyzná ί u j ú c a sa tým,že hmotnostný pomer kyseliny cholovej alebo soli kyseliny cholovej, fosfolipidu a neutrálneho lipidu je 13,1: 81,2 : 5,7.
20. Použitie farmaceutickej kompozície podľa ktoréhokoľvek z nárokov 6 až 19, na výrobu lieku na liečenie alebo profylaxiu ľudí alebo zvierat trpiacich endotoxémiou.