RO115782B1 - Compozitie farmaceutica - Google Patents

Abstract

Compozitia farmaceutica, conform inventiei, contine 3...70% lipida neutra, 10...95% fosfolipida, cu sau fara 5...30% acid colanoic sau o sare de acid colanoic si optional ingredienti acceptabili din punct de vedere farmaceutic, rapoartele fiind exprimate in greutate.

Description

Invenția se referă la o compoziție farmaceutică pentru tratamentul endotoxemiei legate de endotoxină, mai precis tratamentul condițiilor produse de substanțe toxice prin intermediul a diverse compoziții care acționează pentru neutralizarea și/sau îndepărtarea endotoxinelor din organism, precum și profilaxia care folosește aceste compoziții.

Șocul endotoxic este o condiție, adesea fetală, provocată prin eliberarea de lipopolizaharide (LPS] din membrana exterioară a majorității bacteriilor gram negative (de exemplu, Escherichia coli; Salmonella typhimurium]. S-a elucidat complet structura LPS bacteriene și s-a constatat că este o moleculă unică, denumită lipidă A, care este legată prin intermediul catenelor acil ale ei la structura principală a moleculei glucozamină. Vezi, în legătură cu aceasta, Raetz, Ann.Rev.Biochem.59: 129-170 (1990).

Molecula de lipidă A servește ca ancoră membranară a unei structuri lipopolizaharidice (“LPS”] și ea este LPS implicată în dezvoltarea șocului endotoxic. Ar fi de subliniat că moleculele LPS sunt caracterizate printr-o structură de tip lipidă A și o porțiune polizaharidică. Această ultimă porțiune poate varia în detalii moleculare între diferite molecule LPS, dar ea va păstra motivele structurale generale caracteristice endotoxinelor. Ar fi incorect să se spună că molecula LPS este aceeași de la bacterie la bacterie (vezi, Raetz, supra], în domeniul de specialitate se obișnuiește să se denumească diverse molecule LPS ca “endotoxine”, și acest termen se va folosi în continuare pentru a denumi colectiv moleculele LPS.

în brevetul US 5129318, a cărui descriere este încorporată aici ca referință, s-a expus că particule reconstituite care conțin o apolipoproteină asociată HDL și o lipidă capabilă să lege o endotoxină în vederea inactivării ei, s-ar putea folosi ca materiale eficiente pentru ameliorarea toxicității produse de endotoxină.

în cererile citate în secțiunea cererii înrudite și încorporate aici ca referințe, s-a descris că diverse alte materiale se pot folosi pentru tratarea toxicității cauzate de endotoxină. Mai precis, s-a dovedit că apolipoproteinele nu sunt necesare în particule reconstituite și că particula reconstituită poate să conțină o peptidă și o lipidă, în care peptida nu este o apolipoproteină.

De asemenea, s-a dovedit de către inventatori, că toxicitatea provocată de endotoxină se poate trata prin intermediul administrării secvențiale, fie a unei apolipoproteine, fie a unei peptide urmate de o lipidă. După administrarea secvențială, componentele se asamblează ca o particulă reconstituită și apoi acționează pentru îndepărtarea endotoxinei.

S-a dovedit de asemenea, că cel puțin unii indivizi posedă niveluri native de apolipoproteină, care sunt mai ridicate decât nivelurile normale astfel că, terapia endotoxemică se poate efectua prin administrarea particulelor reconstituite care nu conțin apolipoproteină sau peptidă, dar conțin lipida din descriere.

Invenția se referă la o compoziție farmaceutică care în absență de proteine și peptide, respectiva compoziție conține 3-70% lipidă neutră, 10-95% fosfolipidă, cu sau fără 5-30% acid colanoic sau o sare de acid colanoic și opțional ingredienți acceptabili din punct de vedere farmaceutic, conținuturile fiind exprimate în greutate; acidul colanoic sau sarea de acid colanoic este un acid biliar sau o sare de acid biliar; acidul biliar este ales dintre colatul de sodiu, deoxicolatul de sodiu și chenodeoxicolatul de sodiu; sarea acidului biliar este colatul de sodiu; fosfolipidă este fosfatidilcolina; fosfolipidă este o sfingolipidă; lipida neutră este o trigliceridă; lipida neutră este un colesterol ester; conține până la 70% în greutate lipidă neutră; cuprinde până la 5Q%în greutate lipidă neutră;

RO 115782 Bl conține 5 până la 10% în greutate lipidă neutră: conține fosfolipidă față de lipidă neutră la un raport în greutate de aproximativ 93:7: conține până la 30% în greutate acid colanoic sau sare de acid colanoic; cuprinde de la 10% la 15% în greutate acid colanoic sau sare de acid colanoic; conține acid colanoic sau o sare a acestuia, o fosfolipidă și o lipidă neutră, la un raport în greutate de aproximativ 13:81:6; fosfolipida este o fosfatidilcolină, lipidă neutră este o trigliceridă și sarea de acid colanoic este colatul de sodiu; compoziția mai conține sfingosină; este administrată la un om sau animal într-o cantitate suficientă pentru a asigura aproximativ 400 mg, în mod adecvat 200 mg, de preferință 100 mg fosfolipidă per kilogram greutate corporală, pentru profilaxia sau terapia endotoxemiei.

Invenția descrisă în aceste cereri implică folosirea particulelor reconstituite și componentelor discutate aici pentru profilaxia împotriva toxicității cauzate de endotoxină, prin administrarea de cantități eficiente profilactic la subiecți care au nevoie de profilaxie. Astfel de subiecți includ pacienți care suferă de infecții, sau sunt recuperați după intervenții chirurgicale. Astfel de pacienți au uneori niveluri plasmatice foarte reduse ale HDL, uneori mai mici decât 20% din nivelurile normale. în aceste cazuri, este de dorit o profilaxie timpurie cu HDL, astfel încât să se compenseze aceste scăderi.

Acum, în mod surprinzător, s-a dovedit că fosfolipidele se pot folosi singure, sau în combinație cu materiale suplimentare, ca lipide neutre, colați, etc., ca agenți eficienți pentru ameliorarea și/sau prevenirea endotoxemiei. în mod special, este de preferat să se folosească fosfatidilcoline (în continuare “PC”), fie singure, fie în combinație cu alte fosfolipide, cum ar fi sfingolipidele, în compoziții care în esență sunt lipsite de peptide și proteine cum sunt apolipoproteinele sau peptidele derivate de la acestea. Lipide neutre ca mono-, di- și trigliceride se pot combina cu fosfolipide, atâta timp cât cantitatea totală a lipidelor neutre este sub anumite greutăți procentuale, când compozițiile se folosesc sub forma unui bol intravenos. Când se folosesc în alte forme de administrare, ca intravenos, de exemplu, prin infuzare continuă, greutățile procentuale nu sunt atât de critice, dar sunt de dorit.

Realizările invenției, preferate în mod deosebit, includ emulsii în care se folosește un acid biliar sau o sare biliară împreună cu o fosfolipidă și o lipidă neutră.

Aici este prezentată eficacitatea acizilor biliari și sărurilor acizilor biliari, care sunt colații, în tratamentul endotoxemiei. Acești acizi biliari se pot folosi singuri sau în combinație cu una sau mai multe fosfolipide și/sau lipide neutre ca fosfatidilcolină și/sau o trigliceridă.

Se dau mai jos exemple de realizare ale compoziției.

Exemplu de realizare

Au fost preparate următoarele compoziții farmaceutice (emulsii):

Emulsie	Compoziție
PC cu 45% TG	55:45
PC + TG + C	54,5:45,3:0,3
PC + TG + SP	51,6:43,0:5,4
PC + TG + C + SP	51,4:42,9:0,3:5,4
PC + CE	54,5:45,5

RO 115782 Bl

Emulsie	Compoziție
PC + CE + C	54,4:45,3:0,3
PC + CE + SP	51,6:43,0:5,4
PC + CE + C + SP	51,5,-42,9:0,3:5,4

PC = fosfatidilcolină,

TG = trigliceridă,

C = colesterol neesterificat, CE = colesterol esterificat, SP = sfingomielină

Toate compozițiile de mai sus au fost preparate folosind același mod de lucru, care presupune amestecarea fosfatidilcolinei cu una sau mai multe dintre sfingomielină, trigliceridă și colesterol ester, neesterificat satr esterificat și dizolvarea în cloroform și cântărirea amestecului într-un vas. Ca antioxidant s-a adăugat vitamina E (0,02 % g/v). S-a preparat un film uscat de lipidă, prin trecerea peste probă a unui curent uscat de azot sau argon. în continuare, s-a adăugat în vas o cantitate de soluție salină fără sulf, după care s-a amestecat totul într-un amestecător vortex până când toată lipida trece în suspensie. în continuare, soluția a fost omogenizată într-un omogenizator de presiune ridicată. Probele care conțin fosfatidilcolină (PC), cu sau fără trioleină, au fost recirculate prin omogenizator de 10 ori la 20.000 psi. Probele conținând colesterol ester, cu una sau mai multe alte lipide, au fost recirculate de 15-20 ori la 30.000 psi. Soluțiile omogenizate s-au filtrat prin filtru cu piston de 0,45 μητι și filtratul s-a ținut la temperatura camerei până la folosire.

Forma în care compozițiile pot fi administrate poate varia, fiind preferate în mod deosebit un bol sau alte forme intravenoase. Când se folosește o formă de bol, și compoziția conține trigliceride, este necesară dozarea atentă, deoarece se cunoaște că trigliceridele sunt toxice dacă se administrează într-o cantitate prea mare. Totuși, specialistul cu pregătire obișnuită în domeniu, poate să formuleze cu ușurință compoziții, astfel încât riscul otrăvirii cu trigliceride să fie redus sau eliminat. în general, când se folosește o formă de bol, compozițiile nu trebuie să conțină mai mult de circa 80 procente în greutate trigliceridă sau altă lipidă neutră, de preferință nu mai mult decât 70 procente în greutate. Cel mai preferat, când se administrează un bol, compozițiile nu vor conține mai mult decât 50 procente în greutate lipidă neutră.

Când sunt folosite alte forme, cum ar fi cele intravenoase diferite de cele bol, riscul otrăvirii este scăzut. Cu toate acestea, domeniile delimitate mai sus, sunt preferate pentru administrare intravenoasă sau alte forme de administrare, deși trebuie să se înțeleagă că ele nu sunt necesare. Pentru acizi biliari și săruri de acizi biliari, dozele sunt de preferință, de la circa 25 mg/kg greutate corporală până la circa 500 mg/kg greutate corporală, doze preferate în mod special, fiind de la circa 50 mg/kg până la circa 100 mg/kg greutate corporală. Pentru fosfolipide sunt preferate doze de la circa 100 mg/kg greutate corporală până la circa 1000 mg/kg greutate corporală. Dozele sunt generale și vor varia în funcție de subiect și modul de administrare.

Așa cu s-a indicat mai sus, formulările fără proteină și peptidă necesită prezența cel puțin a unei fosfolipide sau acid biliar/sare de acid biliar. Pentru fosfolipide, este preferată prezența cel puțin a unei lipide neutre, cum ar fi o trigliceridă, digliceridă sau

RO 115782 Bl

135 monogliceridă. Compozițiile pot să includă materiale suplimentare ca steroli (de exemplu, colesterol, β-sitosterol), lipide esterificate sau neesterificate (de exemplu, ester colesterol sau colesterol neesterificat), uleiuri hidrocarbonate cu squalen, antioxidanți ca vitamină E, dar aceștia nu sunt necesari. Desigur, în oricare astfel de formulare se pot folosi mai mult decât o fosfolipidă, și/sau mai mult decât o lipidă neutră. Când se folosesc combinații de lipidă neutră și fosfolipidă, lipida neutră va fi prezentă de la circa 3% până la circa 50% în greutate relativă față de cantitatea totală de lipidă din compoziție.

în cazul acidului biliar/săruri de acid biliar, acestea se pot folosi separat sau în combinație cu o fosfolipidă, o lipidă neutră sau ambele. în funcție de aceste materiale suplimentare (de exemplu, fosfolipide și lipide neutre], sunt preferate speciile discutate și menționate mai sus. Ingrediente suplimentare le includ pe cele listate mai sus.

O compoziție conform invenției conține cel puțin una dintre un acid biliar/sare de acid biliar, o fosfolipidă și o lipidă neutră, în care compoziția ca un întreg, conține o cantitate de ingredient activ care ameliorează o endotoxemie. Această compoziție conține de preferință, în greutate procentuală, de la circa 5% până la circa 30% în greutate acid biliar/sare de acid biliar, de la circa 3% până la circa 50% în greutate lipidă neutră și de la circa 10% până la circa 95% în greutate fosfolipidă. Sunt preferate în special, compoziții care conțin de la circa 10-15% în greutate acid biliar/sare de acid biliar, de la circa 5% până la circa 10% în greutate lipidă neutră, echilibrarea compoziției fiind fosfolipidă.

Se va remarca, că aceste greutăți procentuale sunt relative la compoziții care constau din trei componente. Când sistemul de trei componente este combinat cu, de exemplu, un purtător, adjuvant, ingrediente opționale de felul celor discutate mai sus, procentul în greutate relativă față de întreaga compoziție va scădea. întotdeauna astfel de compoziții sunt lipsite de proteine și peptide.

în cazul compozițiilor care nu conțin un acid biliar sau o sare de acid biliar, astfel de compoziții fără proteine și fără peptide conțin de preferință, cel puțincirca 3% în greutate o lipidă neutră până la circa 50% în greutate lipidă neutră, echilibrarea fiind cel, puțin, o fosfolipidă. De preferință, lipida neutră este o trigliceridă, dar poate fi oricare dintre lipidele neutre suplimentare discutate mai sus. De asemenea, fosfolipidă este de preferință o fosfatidilcolină.

Se prezintă o descriere pe scurt a figurilor care însoțesc invenția.

- fig. 1A și 1B, arată rezultatele obținute când s-au testat diverse compoziții întrun model în care s-a determinat neutralizarea endotoxinei prin determinarea eliberării TNF, într-un model sânge uman integral. Figura 1A, arată rolul proteinei și 1B pe cel al fosfolipidei. Compozițiile testate au inclus lipoproteine naturale (VLDL, LDL, HDL), HDL reconstituit (R-HDL”) și compoziții INTRALIPID^tF precum și, emulsii care conțin fosfolipidă și proteină.

- figurile 2A și 2B, compară rolul trigliceridei (o lipidă neutră], și al fosfatidilcolinei, o fosfolipidă, în același model.

-fig. 3, prezintă informație asupra toxicității asociate cu administrarea a diverse compoziții PC și PC/TG într-un model șoarece, folosind un model de letalitate 55%, unde se administrează LPS E.coli.

- fig.4, arată date comparabile celor dobândite pentru testul de sânge uman integral, supra, dar folosind, în Iodul trigliceridelor fosfolipidă cu colesterol neesterificat, sfingomielină sau amestecuri ale ambelor.

140

145

150

155

160

165

170

175

RO 115782 Bl

- fig.5A și 5B, arată rezultate comparabile celor arătate în figurile 5A și 5B, cu excepția că în aceste figuri noi, fosfolipida, colesterolul neesterificat și/sau sfingomielina sunt amestecate cu trigliceride sau colesterol esterificat ca lipidă neutră.

- fig.6, compară rezultate obținute de la emulsii care conțin colesterol ester și trigliceride, într-un model șoarece, in vivo.

- fig.7, prezintă grafic cantitățile teoretice de trigliceride eliberate în sânge după administrarea diverselor compoziții care conțin TG cu toxicități limitate.

Test 1

Factorii care afectează stimularea mediată LPS a TNF-α, conservând în același timp integritatea interacțiunii dintre proteinele plasmatice și elementele celulare ale sângelui, se pot studia corespunzător într-un sistem, in vitro, de sânge uman integral. Un astfel de sistem s-a folosit pentru a determina care componente ale lipoproteinelor sunt importante în neutralizarea LPS.

Materialele testate au reconstituit lipoproteina de înaltă densitate (R-HDL), lipoproteinele plasmatice naturale (VLDL.LDS, HDL), lipoproteina serică deficientă (LPDS) și emulsia îmbogățită 2D% cu trigliceride INTRALIPID^(Rl (un amestec de trigliceride și fosfolipide).

S-a colectat sânge într-o eprubetă heparinizată, s-a diluat cu soluție salină echilibrată Hank (în continuare, “HBSS”), sau materialul de testat s-a dizolvat în HBSS. Materialul rezultat s-a transferat la eprubete Starstedt (25D μ/eprubetă). LPS s-a dizolvat în soluție salină apirogenă, care conține 10mM HEPES și s-a adăugat (2,5 pl) până la o concentrație finală de 10 ng/ml. După incubare timp de 4 ore la 37°C, eprubetele s-au răcit la 4°C și a urmat centrifugare la 1OOOD x g timp de 5 minute. S-a colectat supernatantul și s-a analizat pentru determinarea TNF-α, folosind ELISA, accesibilă comercial.

Tabelul 1, care urmează, compară compozițiile materialelor testate. Figurile 5A și 5B prezintă rezultatele. Datele sunt marcate prin cantitatea de TNF-α produsă, marcată față de concentrația proteinei adăugate (figura 5A) și fosfolipidă (figura 5B). Sau folosit scări logaritmice, în scopul prezentării mărimii gamei concentrațiilor folosite, cu 10° egal la 1 mg/ml. Toate incubatele de sânge integral au conținut 10 ng/ml LPS E.Coli, suplimentate cu una dintre compozițiile după cum arată codurile pentru figurile 5A și 5B.

Faptul că materialele diferă ca eficiență, când este marcat conținutul de proteină (figura 5A), fiind în același timp foarte asemănător când este marcat conținutul fosfolipidei (figura 5B), sugerează că fosfolipida este componenta importantă. Aceasta este confirmată prin descoperirea că o emulsie lipidică lipsită de proteină este mai eficientă decât este HDL naturală, dar mai puțin eficientă decât R-DHL. Proteina nu pare a fi importantă pentru neutralizare.

Compoziția lipoproteinelor naturale și HDL reconstituit:

Lipoproteină	TC	TG	PG	Proteină
Clasă	Densitate(g/ml)	Greutate %
VLDL	< 1,006	22	53	18	7
LDL	1,007-1,063	48	11	22	20,0
HDL	1,063-1,21	18	8	22	52

RO 115782 Bl

225

Lipoproteină	TC	TG	PG	Proteină
R-HDL	1,063-1,21	-	-	79	21
LPDS	> 1,21	□	□	2	98
Intralipid	-	1	93	6	□

Test 2

Ca etapă următoare, s-au testat în sânge uman integral, emulsii lipidice lipsite de proteină, conținând diferite cantități de lipidă neutră. S-a folosit aceeași analiză in vitro pe sânge uman integral.

Toate particulele descrise aici s-au obținut prin intermediul aceluiași protocol, care a implicat amestecarea unei fosfolipide, sfingomielină sau fosfatidilcolină, trioleină și/sau ester colesterol neesterificat, dizolvat în cloroform și cântărirea într-un balon. S-a adăugat vitamină E (0,02% g/v) ca antioxidant. Apoi, s-a preparat o peliculă lipidă uscată, prin suflare de azot sau argon gazos peste probă. Apoi, s-a adăugat la balon un volum de soluție salină apirogenă, urmat de amestecare pe un amestecător rotativ până când toată lipida s-a suspendat. Soluția a fost apoi omogenizată într-un omogenizator de presiune ridicată. Probele care conțin fosfatidilcolină (PC), cu sau fără trioleină, s-au trecut prin omogenizator de 10 ori la 20.000 psi. Probele conținând ester colesterol, cu una sau mai multe alte lipide, s-au trecut de 15-20 ori la 30000 psi. Soluțiile omogenizate s-au filtrat prin filtre seringă 0,45 pm și filtratul s-a păstrat la temperatura camerei până s-a folosit (în trei zile). Figurile 6A și 6B prezintă aceste rezultate. în aceste studii producerea TNF-α dependentă LPS, este marcată contra concentrației trigliceridei adăugate (figura BA). Compozițiile așa cum s-a indicat prin cod, au conținut (în greutate) 7% trigliceridă (“TG”), 45% TG, 89% TG, 94% TG, R-HDL sau fosfolipidă fără TG (prezentat numai în figura 6B). O compoziție 89% TG este într-o formulare INTRAUPID^(Rl 10%, în timp ce TG 94% se referă la INTRALIPID 20%. în toate celelalte teste s-au folosit fosfatidilcolină de ou (PC) și trioleină.

Aceste rezultate arată că, compozițiile lipsite de proteină când s-au comparat prin intermediul conținutului de trigliceridă, sunt foarte diferite. Ele sunt foarte asemănătoare când s-au testat prin intermediul conținutului de fosfolipidă (PC). Aceasta confirmă rolul fosfolipidei întrucât, în special, fosfolipidă singură este eficientă, dar mai puțin decât emulsiile care conțin până la 45% TG.

Test 3

Apoi s-a trecut la experimente in vivo într-un model șoarece, care este acceptat ca un sistem sigur pentru prezicerea eficacității umane.

în aceste experimente șoarecii s-au injectat, sub formă de bol, cu cantități suficiente din formulările descrise în Testul 2 precum și cu altele (fosfatidilcolină pură, TG 7%, TG 25%, TG 45%, TG 71%, TG 81%, TG 89%, TG 94%) sau o soluție salină de control, pentru a asigura dozele fosfolipidei (200 mg/kg sau 400 mg/kg), împreună cu 25 mg/kg LPS E.Coli 0111:B4. Grupul de control a primit intravenos soluție fiziologică salină într-un volum eficient pentru a corespunde cu volumul emulsiei. Supraviețuirea după 72 ore este prezentată în figura 7. Din cele 344 animale din grupurile de control au supraviețuit 155.

230

235

240

245

250

255

260

265

RO 115782 Bl

PC singură a avut un efect de protecție modest, nesemnificativ statistic, la un nivel cert de 90%, în timp ce compozițiile TG 7%, 45% și 71% au îmbunătățit semnificativ supraviețuirea. Compozițiile TG 80% și 89% au avut eficiență limitată, în timp ce TG 94% a scăzut supraviețuirea.

Când s-a crescut doza pentru a asigura 400 mg/kg de PC, ambele emulsii TG de 89% și 94% au scăzut semnificativ timpul de supraviețuire, probabil datorită otrăvirii cu TG, așa cum s-a explicat mai sus.

Test 4

Lucrarea descrisă în testele 1-3, a stabilit că fosfolipidele sunt un agent util în inhibarea endotoxemiei. Faptul că lipide nepolare, altele decât trigliceridele, pot forma emulsii cu fosfolipide, altele decât PC, sugerează că se pot testa și altele. Exemplificatoare sunt sfingomielina (altă fosfolipidă] și colesterol neesterificat (o lipidă polară neutră] și amestecuri ale acestora. La fel se pot folosi colesterol esterificat (un ester nepolar), squalen (o hidrocarbură) și vitamină E (un antioxidant nepolar). Pentru testarea acestora s-au desemnat o serie de experimente, care folosesc analiza de sânge uman integral de la testul 1, supra, și analiza de supraviețuire a șoarecelui de la testul 3.

Emulsiile s-au preparat în modul descris mai sus, folosind fosfatidilcolină pură, fosfatidilcolină cu 10% (g/g) colesterol neesterificat, 10% sfingomielină, sau 10% dintrun amestec total al ambelor. Emulsiile s-au adăugat la sânge integral la o concentrație de 100 mg/dl, cu referire la PC și 10 ng/ml LPS. Amestecul s-a incubat și s-a măsurat eliberarea TNF-a.

Rezultatele sunt prezentate în Figura 8. Producerea TNF-α a fost substanțial redusă numai cu PC. Emulsiile care conțin colesterol neesterificat, sfingomielină sau amestecul ambelor, au suprimat de asemenea, eliberarea de TNF-a.

Test 5

S-a folosit de asemenea, analiza pe sânge integral pentru determinarea efectului colesterolului neesterificat și/sau sfingomielinei, față de emulsiile care conțin lipide neutre. Din nou, emulsiile s-au adăugat la 100 mg/dl PC. Diversele compoziții (g/g) sunt menționate în tabelul care urmează.

Emulsie	Compoziție
PC cu 45% TG	55:45
PC + TG + C	54,4:45,3:0,3
PC + TG + SP	51,6:43,0:5,4
PC + TG + C + SP	51,4:42,9:0,3:5,4
PC + CE	54,5:45,5
PC + CE + C	54,4:45,3:0,3
PC + CE + SP	51,6:43,0:5,4
PC + CE + C + SP	51,5:42,9:0,3:5,4

Figurile 9A și 9B prezintă rezultatele. Emulsiile PC obținute cu lipidă neutră, cu sau fără lipide polare suplimentare, au demonstrat inhibarea. Din nou, s-a folosit concentrația de LPS 10 ng/ml, care este o concentrație de endotoxină relevantă clinic.

RO 115782 Bl

Emulsiile care conțin ester colesterol sunt mai puțin eficiente decât sunt emulsiile care conțin TG, în timp ce acele emulsii care conțin colesterol neesterificat nu suprimă TNF-a 310 la fel de bine cum o fac acele emulsii care nu îl conțin. Adăugarea sfingomielinei la emulsii, pare să îmbunătățească suprimarea producerii TNF-a.

Test 6

Emulsiile care conțin ester colesterol s-au testat într-un model in vivo (cel folosit în testul 3), cu o doză letală de endotoxină. S-au preparat emulsii cu PC și TG sau PC și 315 ester colesterol (CE) și s-au administrat pentru a asigura o doză bol unică de 200 mg/kg de PC, împreună cu 25 mg/kg LPS E.coli 0111:B4 (o doză letală) prin vena codală. Grupurile de control au primit intravenos soluție fiziologică salină, într-un volum care să corespundă volumului de emulsie.

în figura 10, datele compară rezultatele de la emulsiile care conțin CE și TG. 320 Fiecare emulsie s-a testat într-un minim de două experimente, folosind un total de 16 sau mai multe animale.

Așa cum s-a arătat, emulsiile care conțin 7% sau 45% CE (g%) au îmbunătățit semnificativ supraviețuirea. Aceste rezultate luate împreună cu cele de la testul 5, dovedesc că, CE poate fi substituit pentru TG pentru a crea emulsii care neutralizează 325 endotoxină.

Test 7

Emulsii de fosfolipidă cu trigliceridă, lipsite de proteină, blochează efectiv producerea TNF-α în sânge integral, stimulat cu LPS. Teoretic, aceste emulsii pot fi de asemenea, eficiente in vivo, dacă ele se pot administra în siguranță, în doze care să 330 asigure concentrații protectoare de fosfolipidă în plasmă. Experimentele noastre anterioare cu R-HDL sugerează că doza minimă de fosfolipidă este de aproximativ 200 mg/kg. Folosind această doză și un volum de plasmă de 4,5% din greutatea corpului, se poate calcula concentrația trigliceridelor așteptate să se găsească în plasmă, după administrarea unei serii de emulsii având conținut crescut de trigliceride. Rezultatul este 335 arătat în figura 11 ca o linie ușor curbată în funcție de greutatea procentuală TG. Concentrațiile plasmatice TG rareori cresc peste 1000 mg/dl la adulți sănătoși chiar după o masă abundentă în grăsimi. Se raportează pancreatite la pacienți cu TG plasmatice peste 2000 mg/dl (Farmer, et al., Amer.J.Med.54:161-164 (1973); Krauss, et.al., Amer.J.Med. 62: 144-149 (1977); Glueck, et al., J.Lab. Clin.Med. 340 123:59-61 ).TG plasmatice peste 4000 mg/ol sunt extrem de rare și produc afecțiuni serioase. Ultimele două limite sunt arătate în figura de mai sus, prin linii orizontale. Administrarea fie a 10%, fie a 20% INTRAIJPID^(R1, este de așteptat să ridice mult concentrațiile TG plasmatice (vezi cele două cercuri deschise] peste limitele de siguranță, în contrast, administrarea emulsiilor care conțin 7%, 45%, 71% sau 78% (pătrate pline, 345 de la stânga la dreapta) ridică TG plasmatice la 136, 477, 1300 sau respectiv 2000 mg/dl. Emulsiile care au conținutul TG până la ~ 50% sunt de așteptat să fie lipsite de toxicitate provenită de la TG.

Test 8

Eficacitatea combinațiilor fosfolipidei și unui acid biliar, de exemplu, colat de sodiu, 350 a fost testată în același timp de experiment menționat în exemplele anterioare.

Totuși, procedura prin care s-au preparat formulările administrate la animalele testate a fost diferită.

RO 115782 Bl în acest test, și în testele care urmează, formulările s-au preparat folosind un omogenizator de presiune ridicată Microfluidizer. Acest aparat facilitează obținerea formulărilor.

S-a cântărit, într-o cantitate corespunzătoare de apă, sau apă plus colat de sodiu 9 mM, 18 mM sau 36 mM, fie trioleină lichidă, fie trigliceridă lichidă de soia. S-a cântărit pe hârtie de cântărire, fosfatidilcolină solidă, granulară și apoi s-a adăugat încet la soluție, amestecând în același timp. Au fost necesare în jur de 3-5 minute pentru dispersarea lipidei. După dispersare, materialele s-au turnat în microfluidizer.

Dispozitivul folosește presiunea hidraulică pentru a pune în mișcare o pompă care, în schimb dirijează două jeturi opuse de probă unul spre altul. Presiunea poate fi de ordinul a 25 □□□ livre per inch pătrat. La coliziune, jeturile sunt forțate în plus să treacă printr-un orificiu de formă marcată, prin aceasta omogenizându-se proba.

Proba s-a recirculat prin microfluidizer, ‘o trecere” fiind definită prin cantitatea de timp consumată pentru pomparea în întregime a probei prin instalație. Proba s-a circulat 2Q de treceri, pentru a obține o probă omogenizată. S-a adăugat dextroză la o concentrație finală de 5%.

Endotoxină purificată de la E.coli0111 :B4 (40 mg/kg), și emulsie, așa cum s-a discutat mai sus (2DO mg fosfatidilcolină/kg) s-au amestecat la temperatura camerei și s-au administrat imediat la șoareci C57BL6/J (greutatea între 19 și 30 g), prin injectare intravenoasă în vena codală. Acelor șoareci care au primit numai colat li s-a dat un volum de colat de sodiu egal preparatului colat/EMI (emulsie), la aceeași concentrație colat. Șoarecii de control au primit același volum de dextroză 5%, pentru a corespunde osmolarității plasmatice.

Rezultatele sunt menționate în Tabelul care urmează imediat. Emulsia este fosfatidilcolină/7% emulsie trigliceridă descrisă în exemplele precedente. Când s-a folosit colat de sodiu, s-a adăugat la concentrația indicată, la materialele brute, înainte de emulsionare.

Tabel 1. Protecția șoarecilor de provocare endotoxină letală
	TG 7% + CA	CA 18 mM
Timp ore	Control	TG7 %	9mM	18mM	36mM	fără PC sau TG	+ PC
Supraviețuitori (N)
0	28	28	8	16	8	8	8
24	9	12	4	15	8	8	8
48	5	10	2	15	8	8	8
72	2	5	1	15	8	8	8
96	1	□	1	15	8	7	8

Pentru comoditate, greutate procentuală este după cum urmează. Când s-au folosit 9mM colat, procentul greutății relative față de emulsie este 7% colat, 6,1% trigliceridă și 86,9% fosfatidilcolină. La 18mM colat, greutățile procentuale sunt 13,1%

RO 115782 Bl

400 colat, 5,7% trigliceridă și 81,2% fosfatidilcolina. La 36 mM colat, valorile relative sunt 23,2% colat, 5% trigliceridă și 71,8% fosfatidilcolina.

Ar fi de remarcat că, cantitatea de LPS administrată în aceste experimente (40 mg/kg], este mult mai ridicată decât cantitatea folosită pentru studiile de letalitate din experimentele anterioare. Intenția acestor doze mai ridicate este de a depăși orice efect de protecție care ar putea fi atribuit fosfatidilcolinei și/sau trigliceridei. Astfel, concluzia la care s-a ajuns după aceste experimente este că, există un efect de protecție care poate fi atribuit sării acidului biliar, colatul de sodiu.

Aici nu s-au prezentat studiile realizate folosind alte săruri de acizi biliari și care conțin săruri biliare taurine. Exemple suplimentare de acizi biliari includ acid allodeoxicolic, acid litocolic, acid hiodeoxicolic, acid hiocolic, acizi α, β și ω-muricolic, acid murodeoxcolic, acid ursodeoxicolic, acid ursocolic și toate sărurile acestora ca sărurile lor de sodiu, sau taurine, sau conjugați glicină. Vezi, Hoffman, supra.

Test 9

Apoi s-au realizat studii suplimentare, dintre care primul a fost un studiu de supraviețuire care folosește șoareci ca animale subiect.

în studiul de supraviețuire, animalele subiect s-au divizat la patru grupuri. Primul grup a primit o soluție de dextroză 5% și a funcționat ca grup de control. Al doilea grup a primit o emulsie de 93% (în greutatejfosfatidilcolină și 7% (în greutate) trigliceridă, preparată cum s-a descris mai sus. Emulsia a conținut 5% dextroză și fosfolipide de soia la aproximativ 50 mg/mg de lipidă.

în al treilea și al patrulea grup, animalele au primit o emulsie similară celei date celui de-al doilea grup, suplimentată fie cu 18 mM colat de sodiu, fie cu 18 mM deoxicolat de sodiu. în acest experiment, protocolul folosit a fost identic celui menționat în exemplul 9.

Supraviețuirea s-a măsurat la 72 ore după provocare și este rezumată în tabelul următor:

Tabel 1.

405

410

415

420

425

Efectul adăugării acidului biliar la emulsia 7% trigliceridă asupra supraviețuirii 72 ore la șoareci

Grup	N	Supraviețuire	valoare p față de grup
			%	1	2	3
1	Dextroză 5%	28	4	-	-	-
2	TG 7%	64	8	NS	-	-
3	Colat de Na+TG7%	16	94	□,OOOO1	0,00001	-
4	Deoxicolat de Na + TG 7%	8	75	0,0001	0,00001	NS

430

435

Semnificația statistică a comparațiilor supraviețuirii între grupuri s-a testat prin metoda generalizată Wilcox, folosind un program de computer. Comparațiile față de grupul 1 control, sunt listate sub ”1, comparațiile față de grupul 2 de animale, tratate

RO 115782 Bl de emulsie 7%, sunt listate sub “2 și comparațiile față de grupul 3 de animale, tratate cu emulsie plus colat de sodiu, sunt listate sub “3.

Ambele procente de supraviețuire, și analizele statistice arată cu claritate, superioritatea neașteptată a formulărilor care conțin sarea de acid biliar.

Test 10

Un al doilea set de experimente a folosit un model iepure. în acest model, s-a determinat eliberarea TNF (factorul necrozei tumorale)-a.

Iepurii s-au împărțit în trei grupuri și au primit soluție dextroză 5%, emulsia de fosfolipidă și trigliceridă (93%/7%), discutată mai sus, sau o emulsie 93%/7% care a conținut, de asemenea, acid colic 18 mM. Toate emulsiile s-au ajustat la 5% dextroză, ca în exemplul 10. Iepurii au primit un bol de emulsie și, două ore mai târziu, s-au provocat cu 1OQ pg de LPS E.coli 0111:B4 După primirea bolului, s-au administrat formulările pentru asigurarea menținerii infuzării continue, prin intermediul administrării intravenoase, a 5D mg lipid per kilogram de greutate corporală per oră. Administrarea intravenoasă s-a continuat timp de trei ore după provocare.

S-a luat sânge de la iepuri la începutul experimentului, 30 minute după administrarea bolului inițial și la fiecare oră pe durata a cinci ore de administrare.

în tabelul care urmează sunt prezentate valorile maxime TNF-α. Acestea se întâlnesc la două ore după administrarea endotoxinei.

Semnificația statistică s-a determinat folosind bine cunoscutul test Student. Așa cum prezintă tabelul, valorile TNF-α s-au redus semnificativ după administrarea de acid colic 18 mM.

Tabel 2

Efectul emulsiilor asupra producerii TNF-α la iepuri

Emulsie	TNF-a	Semnificație
	ng/ml	N	P
Control dextroză 5%	134±70	9
Emulsie TG 7%	68±5	5	<0,05
Emulsie TG 7% + Acid colic 18 mM	39±2D	4	<0,01

Testele anterioare au prezentat în detaliu invenția care implică, într-un aspect ameliorarea sau prevenirea endotoxemiei la un subiect prin intermediul administrării unei cantități eficiente de fosfolipidă care se asociază cu o endotoxină. Asocierea fosfolipidei și endotoxinei se îndepărtează apoi din subiect pe calea proceselor biologice standard, prin intermediul cărora se îndepărtează particulele lipoproteice. Asocierea fosfolipidei inactivează endotoxină.

De asemenea, testele arată că administrarea unui membru al familiei acizilor colanoici sau sărurilor acizilor colanoici, cum ar fi un acid biliar sau o sare de acid biliar, de asemenea, se poate folosi pentru a obține același rezultat ca și în cazul fosfolipidelor, adică, ameliorarea sau prevenirea endotoxemiei. Astfel, compozițiile lipsite de peptidă și proteină care conțin una, sau mabele dintre un acid biliar/sare de acid biliar și o fosfolipidă se pot folosi pentru a trata endotoxemia. Acizii colanoici sunt descriși, de

RO 115782 Bl exemplu, de către Hofmann, Hepatology 4(5): 4S-14S (1984), încorporată aici ca 4so referință. Atenția este atrasă în mod deosebit la pagina 5S, figurile 1 și 2, încorporate aici ca referințe, care prezintă structurile caracteristice ale acizilor colanoici.

Subiectul de tratat este de preferință un om, dar practica invenției este aplicabilă în mod egal într-un context veterinar.

“Ameliorare” așa cum s-a folosit aici se referă la tratamentul pentru alinarea stării 485 de endotoxemie cauzată de oricare dintre diversele endotoxine produse de către, de exemplu, bacterii gram negative [S.typhimurium, E.coli, etc.). Profilaxia se poate realiza prin administrarea agentului la un moment când subiectul este în, sau este aproape de a fi într-o situație în care poate rezulta expunere la endotoxină. în mod clasic aceasta se întâlnește în timpul intervențiilor chirurgicale. Astfel, un subiect care este aproape să 490 suporte o procedură chirurgicală, poate avea ingredientul activ administrat preoperator procedurii.

Cantitatea efectivă de fosfolipidă, combinația de acid biliar necesară pentru tratamentul subiectului poate varia. în general este preferată o doză totală de la circa 2OO mg până la circa 800 mg de fosfolipidă per kilogram de greutate corporală a 495 subiectului, deși cantitatea poate să scadă, sau să crească, depinzând de severitatea endotoxemiei sau gradului de risc în contextul profilaxiei. Pentru acizii și sărurile colanoice, precum și pentru acizii biliari și sărurile lor se folosește o doză de la circa 10 mg până la circa 300 mg/kg de greutate corporală, mai preferat 15 mg până la circa 275 mg/kg de greutate corporală. 500

Este de dorit să se administreze acidul biliar/sarea de acid biliar și fosfolipidele în compoziții care conțin lipide neutre, dar acestea nu sunt neapărat necesaare, avânduse de asemenea în vedere și astfel de emulsii lipsite de lipide neutre. Oportunitatea administrării combinate rezultă din faptul că, lipidele neutre și fosfolipidele se asociază în particule care se aseamănă cu lipoproteinele, dar diferă de acestea prin faptul că ele 505 nu conțin componente proteice sau peptidice, care desigur, sunt întotdeauna prezente în lipoproteine.

Formele de tratament dorite în mod special, sunt cele în care fosfolipidă este o fosfatidilcolină, ca fosfatidilcolină din gălbenuș de ou, fosfatidilcolină pe bază de soia sau o sfingolipidă. Pentru acidul biliar/sare de acid biliar, sunt preferate acid colic și/sau 510 sărurile sale, cum ar fi colat de sodiu, deoxicolat de sodiu și chenodeoxicolat de sodiu, în legătură cu lipidele neutre, se preferă folosirea ester colesterolului sau trigliceridei dar se pot folosi de asemenea, alte lipide neutre ca squalen sau alte uleiuri hidrocarbonate, di- și monogliceride și antioxidanți ca vitamina Ξ.

Claims (18)

1. Compoziție farmaceutică, caracterizată prin aceea că, în absență de proteine și peptide, respectiva compoziție conține 3-70%) lipidă neutră, 10-95% fosfolipidă, cu sau 520 fără 5-30% acid colanoic sau o sare de acid colanoic și oțional ingredienți acceptabili din punct de vedere farmaceutic, conținuturile fiind exprimate în greutate.

2. Compoziție farmaceutică conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, acidul colanoic sau sarea de acid colanoic este un acid biliar sau o sare de acid biliar.

RO 115782 Bl

3. Compoziție farmaceutică conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, acidul biliar este ales dintre colatul de sodiu, deoxicolatul de sodiu și chenodeoxicolatul de sodiu.

4. Compoziție farmaceutică conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că, sarea acidului biliar este colatul de sodiu.

5. Compoziție farmaceutică conform revendicărilor 1 la 4, caracterizată prin aceea că, fosfolipida este fosfatidilcolina.

6. Compoziție farmaceutică conform revendicărilor 1 la 4, caracterizată prin aceea că, fosfolipida este o sfingolipidă.

7. Compoziție farmaceutică conform revendicărilor 1 la 6, caracterizată prin aceea că, lipida neutră este o trigliceridă.

8. Compoziție farmaceutică conform revendicărilor 1 la 6, caracterizată prin aceea că, lipida neutră este un colesterol ester.

9. Compoziție farmaceutică conform revendicărilor 1 la 8, caracterizată prin aceea că, conține până la 70% în greutate lipidă neutră.

10. Compoziție farmaceutică conform revendicărilor 1 la 9, caracterizată prin aceea că, cuprinde până la 50% în greutate lipidă neutră.

11. Compoziție farmaceutică conform revendicărilor 1 la 10, caracterizată prin aceea că, conține 5 până la 10% în greutate lipidă neutră.

12. Compoziție farmaceutică conform revendicărilor 1 la 11, caracterizată prin aceea că, conține fosfolipida față de lipidă neutră la un raport în greutate de aproximativ 93:7.

13. Compoziție farmaceutică conform cu oricare dintre revendicările de la 1 la 12, caracterizată prin aceea că, conține până la 30% în greutate acid colanoic sau sare de acid colanoic.

14. Compoziție farmaceutică conform revendicărilor 1 la 13, caracterizată prin aceea că, cuprinde de la 10% la 15% în greutate acid colanoic sau sare de acid colanoic.

15. Compoziție farmaceutică conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, conține acid colanoic sau o sare a acestuia, o fosfolipidă și o lipidă neutră, la un raport în greutate de aproximativ 13:81:6.

16. Compoziție farmaceutică conform revendicării 15, caracterizată prin aceea că, fosfolipida este o fosfatidilcolină, lipida neutră este o trigliceridă și sarea de acid colanoic este colatul de sodiu.

17. Compoziție farmaceutică conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că, compoziția mai conține sfingosină.

18. Compoziție farmaceutică conform revendicărilor 1 la 17, caracterizată prin aceea că, este administrată la om sau animal într-o cantitate suficientă pentru a asigura aproximativ 400 mg, în mod adecvat 200 mg, de preferință 100 mg fosfolipidă per kilogram greutate corporală, pentru profilaxia sau terapia endotoxemiei.