BG61967B1

BG61967B1 - Метод и средство за профилактика и лечение на заболявания,причинени от ендотоксини

Info

Publication number: BG61967B1
Application number: BG101288A
Authority: BG
Inventors: Daniel M. Levine; Thomas S. Parker; Albert L. Rubin; Bruce R. Gordon; Stuart D. Saal
Original assignee: Rogosin Insitute
Priority date: 1994-08-10
Filing date: 1997-03-05
Publication date: 1998-11-30
Also published as: BR9508584A; CY2514B1; DE69532239D1; PL182043B1; RO115782B1; FI970534A0; CN1137688C; EP0767666A4; ATE255415T1; NO970582L; CZ37197A3; PL318593A1; NZ292315A; JP3818660B2; SK17697A3; OA11737A; EP0767666B1; JPH10504037A; CZ287614B6; PT767666E

Description

Настоящото изобретение се отнася до лечение на ендотоксемия, предизвикана от ендотоксини. По-конкретно то се отнася до лечението на такива отравяния чрез прилагането на различни средства, които действат за неутрализиране и/или отстраняване на ендотоксините от организма, както и за профилактика чрез използване на тези средства.

Предшестващо състояние на техниката

Ендотоксичният шок представлява състояние, често фатално, провокирано от освобождаването на липополизахарид (LPS) от външната мембрана на повечето грам-отрицателни бактерии (напр., Escherichia coli; Salmonella tymphimurium). Структурата на бактериалния LPS е достатъчно добре изяснена и е открита уникална молекула, означавана като липид А, която се свързва с ацилните вериги посредством глюкозаминовата верига на молекулата на липид A. (BHX.Raetz, Ann.Rev. Biochem. 59; 129-170 (1990).

Молекулата на липид А служи като мембранна “котва” на LPS- структура и точно тази структура, участва в развитието на ендотоксичния шок. Би трябвало да се отбележи, че молекулите на LPS се характеризират със структура от типа на липид А и с полизахариден участък. В различните молекули на LPS тази последна съставка може да варира в молекулните детайли, но тя ще запазва основните структурни мотиви, характерни за ендотоксините. Би било неточно да се каже, че молекулата на LPS не варира от бактерия до бактерия (виж Raetz, по-горе). В областта на техниката е общоприето различните молекули на LPS да се означават като “ендотоксини” и този термин ще се използва оттук нататък за колективно обозначаване на молекулите на LPS.

Според патент на САЩ No 5 128 318, чийто цитат е включен за справка, се смята, че като ефективно вещество за облекчаване на токсичност, причинена от ендотоксин, биха могли да се използват реконституирани частици, съдържащи както аполипопротеин, асоцииран с HDL (липопротеин с висока плътност), така и липид, който е в състояние да свързва ендотоксин и да го инактивира.

В публикувани заявки преди настоящата е посочено, че за лечение на токсичност, причинена от ендотоксини, могат да се използват различни други вещества. По специално, е намерено, че в реконституираните частици не са необходими аполипопротеини и че реконституираните частици могат да съдържат пептид и липид, при което пептидът не е аполипопротеин.

Изобретателите на настоящата заявка са установили, че токсичността .причинена от ендотоксини, може да се лекува чрез последователно приложение на аполипопротенин или пептид, последвани от липид. След последователното приложение компонентите се свързват под формата на реконституирана частица и след това действат за отстраняване на ендотоксина.

Намерено е също така, че поне някои индивиди притежават нативни количества аполипопротеин, които са по-големи от нормалните количества, така че е възможно да се проведе ефективно лечение на ендотоксемия чрез въвеждането на реконституирани частици, които не съдържат аполипопротеин или пептид, но съдържат липид съгласно настоящото изобретение.

Техническа същност на изобретението

Съгласно настоящото изобретение се използват реконституирани частици и дискутираните тук компоненти за профилактика срещу токсичност, причинена от ендотоксични, чрез въвеждането в субекти при необходимост от профилактика на профилактично ефективни количества. Такива субекти включват пациенти, страдащи от инфекции или възста новяващи се след операция. Тези пациенти понякога имат много ниски плазмени нива на HDL, понякога толкова ниски, че съставляват 20% от нормалните нива. Ранната профилактика с HDL в тези случаи е особено желателна, за да се компенсират тези ниски нива.

Намерено е, че фосфолипидите могат да се използват самостоятелно или в комбинация с допълнителни вещества, такива като неутрални липиди, холати и др., като ефективни агенти за облекчаване и/или предпазване от ендотоксемия. Специално предпочитано е използването на фосфатидилхолини нататък “PC”), или самостоятелно, или в комбинация с други фосфолипиди, такива като сфинголипиди, в препарати, които до голяма степен не го съдържат пептиди и белтъци, такива като аполипопротеини или пептиди, получени от тях. Когато препаратите се използват под формата на интравенозен болус, с фосфолипидите могат да се комбинират неутрални липиди, такива като моно-, ди- и триглицериди, дотогава, докато общото количество неутрални липиди остава под определен тегловен процент. Когато се използват в други форми на приложение - интравенозното чрез непрекъснато вливане, тегловните проценти не са толкова критични, но са желателни.

Особено предпочитаните приложения на изобретението включват емулсии, в които заедно с фосфолипид и неутрален липид се използва жлъчна киселина или сол на жлъчна киселина.

Тук е показана ефикасността на жлъчните киселини и на солите на жлъчните киселини, които представляват холати, за лечението на ендотоксемия. Тези жлъчни киселини могат да се използват самостоятелно или в комбинация с един или повече фосфолипиди и/или неутрални липиди, такива като фосфатидилхолин и/или триглицерид.

Кратко описание на фигурите

На фигури 1А и 1В са показани резултати, получени при тестването на различни средства в модел, който определя неутрализа цията на ендотоксин посредством определянето на освобождаването на TNF (тумор некрозис фактор) в модел на тотална човешка кръв. Фигура 1А показва ролята на белтък, a 1В тази на фосфолипид. Тестваните средства включват неутрални липопротеини, (VLDL, LDL, HDL,), реконституиран HDL (“R-HDL”) и препарати на INTRALIPID^R, както и емулсии, съдържащи фосфолипид и белтък.

На фигури 2А и 2В е сравнена ролята на триглицерид (неутрален липид), фосфатидилхолин, и фосфолипид в същия модел.

Фигура 3 представя информация за токсичността, свързана с прилагането на различни препарати на PC/TG в миши модел, като е използван модела на 55%-на леталност при въвеждане на LPS на E.coli.

Фигура 4 показва данни, сравними с тези, получени от теста на тотална човешка кръв, посочен по-горе, но при използване на мястото на триглицеридите на фосфолипид с неестерифициран холестерол, сфингомиелин или на смеси от двете.

Фигури 5А и 5В показват резултати, сравними с тези, показани на фигури 1А и 1В, с тази разлика, че в тези нови фигури като неутрален липид се смесват фосфолипид, неестерифициран холестерол и/или сфиногомиелин с триглицериди или естерифициран холестерол.

Фигура 6 сравнява резултатите, получени от емулсии, съдържащи холестеролов естер и триглицерид, в миши модел in vivo.

Фигура 7 онагледява графично теоретичните количества триглицериди, освободени в кръвта след прилагане на различни препарати, съдържащи TG, с праговете на токсичност. “TPN” означава “total parenteral nutrition” (“тотално парентерално хранене”), докато “RI” означава препарати съгласно изобретението.

Примери за изпълнение на изобретението

Пример 1. Факторите, които влияят върху стимулирането на TNF-α, опосредствено от LPS, тъй като запазват ненарушено взаимодействието между плазмените белтъци и кле3 тъчните елементи на кръвта, могат да се изследват по съответен начин в система от тотална човешка кръв in vitro. Подобна система се използва, за да се определи, кой от компонен- 5 тите на липопротеините е важен за неутрализиране на LPS.

Веществата, които се тестват, представляват реконституиран липопротеин с висока плътност (R-HDL), естествени плазмени липопротеини (VLDL, LDS, HDL), серум с дефицит на липопротеин (LPDS) и емулсията, богата на триглецириди, 20% INTRALIPID^R(смес от триглицериди и фосфолипиди).

В хепаринзирана епруветка се събира кръв, разрежда се с балансиран солеви разтвор на Hank по-нататък (“HBSS”) или веществото, което ще се тества, се разтваря в HBSS. Полученият материал се прехвърля в епрувет- 20 ки Starstedt (250 μΐ/епруветка). LPS се разтваря в апирогенен физиологичен разтвор, съдържащ 10 mM HEPES, и се прибавя (2,5 μΐ) до крайна концентрация 10 ng/ml. След инкубиарне четири часа на 37°С епруветките се охлаждат до 4°С, последвано от центрофугиране при 10 000 х g за 5 минути. Течността над утайката се събира и се тестува за определяне на TNF-α като се използва търговски набор реактиви за ELISA.

В таблица 1, която следва, са сравнени съставите на тестваните вещества. На фигури 1А и 1В са представени резултатите. Данните са нанесени графично като произведено количество THF-a в зависимост от концентрацията на прибавения белтък (фигура 1А) и фосфолипид фигура (IB). Използвани са логаритмични скали, за да се покаже широкият обхват от използвани концентрации, при което 10° е равно на 1 mg/ml. За пояснение (ключ) към фигури 1А и 1В, всички инкубирания в тотална кръв съдържат 10 ng/ml LPS на E.coli 0111.-В4, допълнен с едно от средствата.

~3>актът, че веществата се различават по ефективност, когато на графиката се нанася белтъчно съдържание (фигура 1 А), но са много сходни, когато се нанася липидно съдържание (фигура 1В), предполага, че важният елемент е фосфолипидът. Това се потвърждава от откритието, че липидната емулсия, несъдържаща белтък, е по-ефективна, отколкото природния HDL, но по-малко ефективна от RHDL. Белтък не изглежда важен за неутрализацията.

Състав на природни липопротеини и реконституиран HDL

	Липопопротеин	тс	TG	PC	белтък
Клас	Плътност		Тегловен %
VLDL	<1,006	22	53	18	7
LDL	1,007-1,063	48	11	22	20,9
HDL	1,063-1,21	18	8	22	52
R-HDL	1,063-1,21	-	-	79	21
LPDS	>1,21	0	0	2	98
Intralipid	1	93	6	0

Пример 2. След това в тотална човешка кръв се тестват липидни емулсии, свободни от белтък, съдържащи различни количества неутрални липиди. Използва се същият тест In vitro на тотална човешка кръв, както е поместения в пример 1.

Всички описани тук частици се приготвят по един и същи протокол, който включва смесване на фосфолипид, сфингомиелин или фосфатидилхолин, триолеин и/или неестерифициран холестеролов естер, разтворен в хлороформ, и претегляне в колба. Като антиоксидант се добавя витамин Е (0,02% тегло/ обем). След това се получава сух липиден филм чрез продухването на азотен или аргонов газ над пробата.

След това в колбата се прибавя обем непирогенен физиологичен разтвор, следван от смесване с миксер тип Vortex, докато се суспендира целия липид. Разтворът след това се хомогенизира с хомогенизатор под високо налягане. Пробите, съдържащи фосфатидилхолин (PC), със или без триолеин, се пропускат през хомогенизатора 10 пъти при 20 000 х 6,895 kN/m². Пробите, съдържащи холестеролов естер с един или повече други липиди се пропускат 15-20 пъти при 30 000 х 6,895 kN/m². Хомогенизираните разтвори се филтрират през 0,45-микронови филтри за спринцовки и филтратът се съхранява на стайна температура до използването му (в рамките на три дни). На фигури 2А и 2В са представени тези резултати. В тези изследвания LPS-зависимата продукция на THF-α се на нанася в графиката като зависима от концентрацията на прибавения триглицерид (фигура 2А) или фосфолипид (фигура 2В). Както е означено в легендата, препаратите съдържат 7 % (тегловни) триглицерид (“TG”), 45% TG, 89% TG, 94% TG, R-HDL или фосфолипид без TG (показан само във фигура 2В). Препарат с 89% TG се равнява на 10-%ен препарат INTRALIPID^R, докато 94% TG отговаря на 20%-ен INTRALIP1D. Във всички други тестове се използват яйчен фосфатидилхолин (PC) и триолеин.

Тези резултати показват, че съставите, несъдържащи белтък, при сравняване по триглицеридно съдържание, са много различни. Те са много сходни, когато се тестват по фосфолипидно (PC) съдържание. Това потвърждава ролята на фосфолипида и по-специално доколко фосфолипидът е ефективен самостоятелно. Той е по-малко ефективен, отколкото емулсиите, съдържащи до 45% TG.

Пример 3. Работата след това преминаване към експерименти in vivo в миши модел, който се приема като надеждна система за предсказване на ефективността при хората.

В тези експерименти мишки се инжектират под формата на болус с достатъчни количества от препаратите, описани в пример 2, както и с други (чист фосфатидилхолин, 7%, TG, 25% TG, 45% TG, 71% TG, 81% TG, 89% TG, 94% TG) или с контрола от физиологичен разтвор, за да се получат дози на фосфатидилхолина (или 200 mg/kg или 400 mg/kg заедно с 25 mg/kg от LPS на Е. coli 0111:В4. В контролната група интравенозно се въвежда физиологичен разтвор в обем, достатъчен, за да покрие обема на емулсията. Във фигура 3 е представена преживяемостта след 72 часа. От 344 животни в контролната група преживяват 155.

PC самостоятелно има умерен предпазващ ефект, който при 95% доверителен интервал е статистически недостоверен докато препаратите със 7%, 45% и 71% TG подобряват значително преживяемостта. Препаратите с 80/% 89% TG са на горната граница на ефективността, докато 94% TG понижава преживяемостта.

Когато дозата се повиши, за да даде 400 mg/kg PC, емулсиите и с 89% и с 94% TG значително намаляват времето на преживяемост, вероятно поради отравяне с TG, както е обяснено по-долу.

Пример 4. В примери 1-3 е установено, че фосфолипидите представляват активен агент, който може да се използва за инхибиране на ендотоксемия. Фактът, че неполярни липиди, различни от триглицеридите, могат да образуват емулсии с фосфолипиди, различни от PC, навеждат на мисълта, че могат да бъ5 дат опитани и други сфиногомиелин (друг фосфолипид) и неестерифициран холестерол (полярен неутрален липид) и смеси от тях. Могат да се използват също така естерифициран холестерол (неполярен естер), сквален (въглеводород) и витамин Е (неполярен антиоксидант). За да се тестват те, се набелязва серия от експерименти, като се използва тестът на тотална човешка кръв в пример 1, по-горе, и тестът за преживяемост на мишки в пример 3.

Емулсиите се приготвят по начина, описан по-горе, като се използват чист фосфатидилхолин, фосфатидилхолин с 10% (тегло/ тегло) неестерифициран холестерол, с 10% (тегло/тегло) сфингомиелин или с общо 10% тяхна смес. Емулсиите се прибавят към тотална кръв в концентрация 100 mg/dl по отношение на PC и 10 mg/ml LPS. Сместа се инкубира и се измерва отделянето на TNF- .

Резултатите са показани на фигура 4.

$ Продукцията на TNF-α се редуцира значително само с PC. Емулсиите, съдържащи неестерифициран холестерол, сфингомиелин или смес от двете също подтискат отделянето на TNF-a.

1θ Пример 5. Тестът с тотална кръв се използва също за определяне ефекта на неестерифициран холестерол и/или сфингомиелин върху емулсиите, съдържащи неутрални липи15 ди. Емулсиите отново се прибавят при концентрация 100 ng/dl PC. Различните състави (тегло/тегло) са поместени в следващата таблица.

Емулсия		Състав
PC с 45% TG		55:45
PC + TG+C		54,4:45,3:0,3
PC + TG +SP		51,6:43,0:5,4
PC+TG+C+SP		51.4:42,9:0, 3:5,4
PC+CE		54,5:45,5
PC+CE+C		54,4:45,3:0,3
PC+CE+C+SP		51,6:43,0:5,4
PC+CE+C+SP		51,5:42,9:0,3:5,4

На фигури 5А и 5В са представени резултатите. PC-емулсиите, приготвени с неутрален липид, както със, така и без допълнителни полярни липиди, демонстрират инхибиране. Отново се използва концентрация на LPS 10 ng/ml, която е клинично съпоставима концентрация на еднотоксина. Емулсиите, съдържащи холестеролов естера, са по-слабо ефективни, отколкото емулсиите, съдържащи

TG, докато онези от емулсиите, които съдържат неестерифициран холестерол, не подтискат TNF-α , както и онези емулсии, които не го съдържат. Прибавянето на сфингомиелин към емулсиите изглежда подобрява супресията на продукцията на TNF-a.

Пример 6. Емулсии, съдържащи холестеролов естер, се тестват в модел in vivo (т.е. използвания в пример 3) с летална доза ендотоксин. Емулсиите се приготвят с PC и TG или с PC и холестеролов естер (СЕ) и се въвеждат през опашната вена, за да се получи единична болус доза от 200 mg/kg PC заедно с 25 mg/kg от LPS E.coli 0111:В4 (летална доза) . В контролните групи интравенозно се въвежда физиологичен разтвор в обем, който покрива обема на емулсията.

Данните във фигура 6 сравняват резултатите от емулсиите, съдържащи СЕ и TG. Всяка емулсия се тества в най-малко два експеримента, като се използват общо 16 или повече животни.

Както е показано, емулсиите, съдържащи 7% или 45% СЕ (тегловни %), значително подобряват преживяемостта. Тези резултати, взети заедно с тези от пример 5, показват че TG може да се замести с СЕ, за да се получат емулсии които неутрализират ендотоксина.

Пример 7. Емулсиите от фосфолипид и триглицерид, несъдържащи белтък, блокират ефективно продукцията на TNF- в тотална кръв, стимулирана с LPS. На теория тези емулсии биха могли да бъдат ефективни и in vivo ако могат да се въвеждат безопасно в дози, които осигуряват защитни концентрации на фосфолипид в плазмата.

Наши предишни изследвания с R-HDL установяват, че минималната доза от фосфолипид е приблизително 200 mg/kg. Като се използва тази доза и плазмен обем 4,5% от телесно тегло, може да се изчисли концентрацията на триглицерид, която се очаква в плазмата след въвеждането на серия емулсии с нарастващо триглециридно съдържание. Резултатът е показана във фигура 7 като крива, нарастваща плавно с покачване на тегловния процент TG. Плазмените концентрации на TG рядко се покачват над 1000 mg/dl (Farmer, et al., Amer, J.Med. 54: 161-164 (1973); Krauss, et al., Amer. J.Med. 62:144-149 (1977); Glueck, et al., J.Lab. Clin. Med. 123:59-61). Плазмен TG над 4000 е изключителна рядкост е и причина за сериозно безпокойство. Последните две прагови концентрации са показани чрез хоризон тални линии в горната фигура. Въвеждането на 10% или на 20% INTRALIPID^R в дози от 200 mg/kg фосфолипид се очаква да повиши плазмените концентрации на TG (виж двете незапълнени кръгчета) далеч над безопасните граници. За разлика от това въвеждането на емулсии съдържащи 7%, 45%, 71% или 78% (плътни квадратчета отляво надясно) повишава плазмения TG съответно до 136, 477, 1300 или 2000 mg/dl. Очаква се емулсиите със съдържание на TG до 50% да не са токсични по отношение на TG.

Пример 8. Ефикасността на препарати от фосфолипид и жлъчна киселина, т.е., натриев холат, се тества в същия тип експерименти, поместени в предишните примери.

Различава се, обаче, процедурата, по която се приготвят средствата за въвеждане в тест-животните.

В този пример и в примерите, които следват, средствата се приготвят като се използва хомогенизатор под високо налягане Microfluidizer. Този апарат улеснява мащабното производство.

Течен триолеин или течен соев триглицерид се претеглят в съответно количество вода или вода плюс 9 тМ, 18 тМ или 36 тМ натриев холат. Твърд фосфатидилхолин на гранули се претегля върху хартия и след това се прибавя бавно към разтвора при разбъркване. Необходими са някъде 3-5 минути за да се диспергира липида. След диспергирането веществата се изливат в хомогенизатора. Приспособлението използва хидравлично налягане, за да задейства помпа, която на практика задвижва две срещуположни струи от пробата една срещу друга. Налягането може да достига 25 000 х 6,8649 kN/m². След колизията струите се форсират през отверстие с формата на знака плюс, при което пробата се хомогенизира.

Пробите се рециркулират през хомогенизатора като един “пасаж” се дефинира като количеството време, което той отнема, за да се изпомпва цялата проба през машината. За да се получи хомогенизирана проба, тя се цир кулира 20 пасажа. Добавя се декстроза до крайна концентрация 5%.

Ендотоксин, пречистен от E.coli 0111:В4 (40 mg/kg) и емулсия, както се дискутира подолу (200 mg фосфатидилхолин/kg, се смесват на стайна температура и непосредствено се въвеждат в мишки C57BL6 (с тегло между 19 и 30 g) чрез интравенозна инжекция през опашната вена. В мишките, получили само холат, Ю се въвежда, обем натриев холат, равен на препарата (емулсията) холат/EML при същата концентрация на холата. Контролните мишки получават същия обем 5 % декстроза, за да се запази осмотичността на плазмата.

Резултатите са поместени в таблицата, която следва по-долу. Емулсията е фосфатидилхолин/7% триглицерид, описана в предхождащите примери. Когато се използва натриев холат, той се добавя при посочената концентрацията към суровия материал преди емулгирането на веществата.

Т аБлица Време	1. Предпазване на	мишки от летално 77.TG+CA	отравяне с ендотоксин 1втм СА
Контрола	77.TG	9мМ 18мМ	36)г\|М	без	PC и ли	TG 4-РС
часове			Преживели	(N)
0	28	28	8 16	8		8	8
24	9	12	4 15	8		8	8
4S	5	Ю	2 15	8		8	8
72	2	5	1 15	8		8	8
96	1	О	1 15	8		7	8

Тегловните проценти на емулсиите за удобство са както следва: Когато се използва 9 тМ холат тегловни проценти по отношение на емулсията са 7% холат, 6,1% триглицерид и 86,9% фосфатидилхолин. При 18 тМ холат тегловните проценти са 13,1% холат, 5,7% триглицерид и 81,2% фосфатидилхолин. При 36 тМ холат относителните стойности са 23,2% холат, 5% триглицерид и 71,8% фосфатидил- 40 холин.

Би трябвало да се отбележи, че количеството LPS, прилагано в тези експерименти (40 mg/kg), е доста по-голямо от количеството, из45 ползвано за изследвания на леталността в предишните експерименти. Целта на тези по-високи дози е да се потисне всеки защитен ефект, който се дължи на фосфадитилхолина и/или триглицерида. И така, изводът, до който може 50 да се достигне след тези експерименти е, че е налице защитен (предпазен) ефект, който се дължи на солта на жлъчната киселина - натриевия холат.

Тук не са представени изследвания, проведени с други соли на жлъчните киселини и с жлъчни соли, съдържащи таурин. Допълнителните .примери на жлъчни киселини включват алодезоксихолова киселина, литохолова киселина, хиодезоксихолова киселина, хихолова киселина, α , а - и омега-мурихолови киселини, муродезоксихолова киселина, урсодезоксихолова киселина, урсохолова киселина и всички техни соли, такива като натриеви соли или конюгати с таурин или глицин. Виж Hoffman, по-горе.

Пример 9. След това се провеждат понататъшни изследвания, първото от което е изследвано на преживяемостта чрез използване на мишка като животински субект.

В изследването на преживяемостта животинските субекти се разделят на четири групи. Първата група получава 5%-ен разтвор на декстроза и служи като контрола. Втората група получава емулсия от 93 % (тегловни) фосфатидилхолин и 7% (тегловни) триглицерид, приготвен, както е описано погоре. Емулсията съдържа 5% декстроза и соеви триглицериди с приблизително 50 mg/ml липид.

В третата и четвъртата група животните получават емулсия, подобна на тази, дадена на втората група, допълнена или с 18 тМ натриев холат или с 1 тМ натриев дезоксихолат. Използваният в този експеримент протокол е идентичен с този, поместен в пример

8.

Таблица 2. Е*ект на прибавянето на жлъчна сол към 77. триелицеридна емнлсия върху 72—часовата преживяемост на мишки

Г рупа	N	Преживяемост р-стойност с/у група
			7. 1	2 3
1	57. декстроза	2Θ	4 —. _	— —
2	77. TG	64	Θ NS	— —
3	натриев холат + 77. ТБ	16	94 Ο,ΟΟΟΟΙ	0,00001
4	натриев дезоксихолат + 77. TG	3	75 Ο,ΟΟΟΙ	0,00001 NS

Отбелязваме, че статистическата достоверност между сравненията на преживяемостта в групите е тествана чрез генерализирания метод на Wilcox, като е използвана компютърна програма. Сравненията срещу контролите от група I са изброени в τ. 1, сравненията срещу животните от група 2, третирани със 7%на емулсия, са изброени в т.2 и сравненията срещу животните от група 3, третирани с емулсия плюс натриев холат, са изброени в т.З.

Процентът преживяемост, и статистическият анализ показват ясно неочакваното превъзходство на препаратите, съдържащи жлъчни киселини.

Пример 10. Втора серия от експерименти използва заешки модел. В този модел се определя освобождаването на TNF (тумор некрозис фактор) а.

Зайците се разделят на три групи и получават 5%-ен разтвор на декстроза, емулсия от фосфолипид и триглицерид (93%/7%), спо30 мената по-горе или емулсия 93%/7%, която съдържа също 18 тМ холова киселина. Всички емулсии се довеждат до 5 % декстроза, както в примера 9. На зайците се прави начален болус с емулсия и два часа по-късно се отравят със 100 ptg LPS на Е. coli 0111:В4. Препаратите се прилагат след началния болус чрез интравенозно,Въвеждане на 50 mg липид на килограм телесно тегло на час, за да се получи непрекъснато поддържащо вливане. Интравенозното въвеждане продължава три часа след отравянето.

От зайците се взема кръв в началото, 30 min след въвеждането на началния болус и 45 на всеки час през време на 5-те часа на въвеждане.

В таблицата, която следва, са представени пиковите стойности на TNF-α . Те се появяват два часа след въвеждането на ендоток50 сина.

Статистическата достоверност се опре9 деля като се използва добре познатият тест на те на TNF-α са значително редуцирани след Student. Както показва таблицата, стойности- въвеждането на 18 тМ холова киселина.

Таблииа 3. Е*ект на емулсии върху продукцията на TNF-α в зайии

Емулсия	ΤΝΕ-α	Достовернос т
	нг/мл	N	Р
контрола с 57. декстроза	134+70	9
77. TG емулсия	68+5	5	<0,05
77.TG емнлсия + 18/ftM холова киселина	39+20	4	<0,01

Предхождащите примери разкриват подробно изобретението, което в един аспект включва облекчаването или предпазването от еднотоксемия в субект чрез въвеждането на ефективно количество фосфолипид, с който свързва ендотоксина. Свързването от фосфолипид и ендотоксин след това се отстранява от субекта чрез стандартни биологични процеси, 25 добре познати на всеки, който е наясно с процесите, чрез които се отстраняват липопротеинови частици. Свързването на ендотоксина с фосфолипида го инактивира.

Примерите показват също, че въвеждането на член от фамилията на холановите киселини или на соли на холановите киселини, такива като жлъчна киселина или сол на жлъчна киселина, също може да се използва, за да се 35 постигне същия ефект, както с фосфолипидите, т.е., облекчаване или предпазване от ендотоксемия. И така, за лечението на ендотоксемия могат да ре използват средства, свободни от пептиди и белтъци, съдържащи едната или и двете от жлъчна киселина/сол на жлъчната киселина и фосфолипид. Холановите киселини са описани от, напр., Hofmann, Hepatology 4 (5): 4S-14S (1984), включен за справка. 45 Особено внимание трябва да се обърне на страница 5S, фигури 1 и 2, включени за справка, които показват структурите, характерни за холановите киселини.

Предпочита се субектът, който се лекува, да бъде човек, но практикуването на изобрете ниетсие^приложимо също така и във ветеринарен контекст.

“Облекчаване”, както се използва тук, се отнася до лечение, с което се смекчава тежестта на ендотоксемия, причинена от който и да е от ендотоксините, произвеждани от, напр., грам-отрицателните бактерии (S.tymphimurium, Е. coli, и т.н.). Профилактиката може да се извърши чрез въвеждането на агента в момент, когато субектът е във или близо до ситуация, в която може да настъпи отравяне с ендотоксин. Обикновено това се случва по време на операция. Така в субект, който се намира пред операционна процедура, активната съставка може да се въведе като подготовка към процедурата.

Ефективното количество от комбиниран препарат на фосфолипид с жлъчна киселина, необходймо за лечение на субекта, може да варира. Най-общо се предпочита доза от около 200 общи mg до около 800 mg фосфолипид на килограм телесно тегло на субекта, макар че количеството може да се намали или да се повиши в зависимост от тежестта на ендотоксемията или от степента на риска в контекста на профилактиката. За холановите киселини и соли, такива като жлъчните киселини и техните соли, се използва доза от около 10 mg до около 300 mg/kg телесно като повече се предпочитат 15 mg до около 275 mg на kg телесно тегло.

Желателно е жлъчната киселина/жлъч ната сол и фосфолипидите се прилагат като препарати, които съдържат също неутрални липиди, но това не е необходимо, тйй като се визират също и емулсии на фосфолипиди, несъдържащи неутрални липиди. Желателно за комбинирано приложение на фосфолипидите произтича от факта, че неутралните липиди и фосфолипидите асоциират в частици, които наподобяват липопротеините, но се различават от тях по това, че не съдържат белтъчини или пептидни компоненти, които разбира се винаги присъстват в липопротеините.

Специално желани форми за лечение са тези, в които фосфолипидът е фосфатидилхолин, такъв като фосфатидилхолин от яйчен жълтък, соев фосфатидилхолин или сфинголипид. Като жлъчна киселина/сол на жлъчната киселина се предпочитат холова киселина и/или нейни соли, такива като натриев холат, натриев дезоксихолат и натриев хенодезоксихолат. По отношение на неутралните липиди се предпочита да се използва холестеролов естер или триглицерид, но могат да се използват също и други неутрални липиди, такива като сквален или други въглеводороди масла, ди- и моно-глицериди и антиоксиданти, такива като витамин Е.

Формата, в която могат да се прилагат препаратите, може да варира като като специално се предпочитат болус или други интравенозни форми. Когато се използва формата болус (масирано еднократно въвеждане) и препаратът съдържа триглицерид, напр., дозирането трябва да се извърши внимателно. Достатъчно добре известно е, че триглицеридите са токсични ако се прилагат в твърде голямо количество. Специалист със средна квалификация, обаче, лесно може да приготви средството, така, че рискът от отравяне с триглицерид да се редуцира или елиминира. Найобщо, когато се използва формата болус, средствата би трябвало да съдържат не повече от 80 тегловни процента триглицерид или друг неутрален липид, за предпочитане не повече от 70 тегловни процента. Когато се прилага болусът, средствата би трябвало да съдържат не повече от около 50 тегловни процента, което е най-предпочитаното.

Когато се използват, обаче, не-болус форми, такива като други интравенозни форми, рискът от отравяне намалява. Независимо от това, за интравенозно или за други форми на приложение, границите, отбелязани по-горе се предпочитат, въпреки че трябва да се разбере, че те не се изискват, за жлъчните киселини и солите от жлъчните киселини се предпочитат дози от около 25 mg/kg телесно тегл до около 500 mg/kg телесно тегло като специално предпочетени са дозите от около 50 mg/kg телесно тегло до около 100 mg/kg телесно тегло. За фосфолипидите се предпочита доза от около 100 mg/kg телесно тегло до около 1000 mg/kg телесно тегло. Дозите, обаче, са най-общи и ще варират в зависимост от субекта и начина на приложение.

Както е посочено по-горе, средствата, несъдържащи белтъци и пептиди, изискват присъствието на най-малко един фосфолипид или жлъчна киселина/сол на жлъчната киселина. За фосфолипидите се предпочита присъствието на най-малко един неутрален липид, такъв като триглицерид, диглицерид или моноглицерид. Средствата могат да включват допълнителни вещества, такива като стероли (напр, холестерол, β-ситостерол), естерифицирани или неестерифицирани липиди (напр., холестеролов естер или неестерифициран холестерол,), въглеводородни масла, такива като сквален, антиоксиданти, такива като витамин Е, но те не са задължителни. Разбира се, във все5и такъв препарат може да се използва повече от един фосфолипид и/или повече от един неутрален липид. Когато се използват комбинирани препарати от неутрален липид и фосфолипид, неутралният липид би трябвало да присъства от около 3% до около 50% (тегловни процента) по отношение на общото количество липид в препарата.

В случая на жлъчна киселина/соли на жлъчната киселина те могат да се използват поотделно или в комбинация с фосфолипид, с неутрален липид или и с двете. По отношение на тези допълнителни вещества (напр., фосфолипиди и неутрални липиди), предпочете ни видове са тези, дискутирани и споменати по-горе. Възможните допълнителни съставки включват тези, изброени по-горе.

Част от изобретението са също така средства, приложими за лечение на ендотоксемия. Едно приложение на това свойство на изобретението представлява средство, съдържащо поне едното от: жлъчна киселина/сол на жлъчната киселина, фосфолипид и неутрален липид, при което като цяло препаратът съдържа количество активна съставка, облекчаващо ендотоксемията. Предпочита се този препарат да съдържа, в тегловни проценти, от около 5% до около 30% (тегловни) жлъчна киселина/ сол на жлъчна киселина, от около 3% до около 50% (тегловни) неутрален липид и от около 10% до около 95% (тегловни) фосфолипид. Специално предпочитани са средствата, съдържащи от около 10-15% (тегловни) жлъчна киселина/сол на жлъчната киселина, от около 5% до около 10% (тегловни) неутрален липид, а остатъкът от препарата (балансът) да бъде фосфолипид.

Би трябвало да се отбележи, че тези тегловни проценти са по отношение на средства, състоящи се от три компонента. Когато системата от три компонента се комбинира с, напр., носител, адювант, условни съставки, такива като тези, дискутирани по-горе, тегловният процент по отношение на целия препарат ще спадне, не трябва да се забравя, че такива терапевтични препарати никога не съдържат белтъци и пептиди.

В случая на средства, които не съдържат жлъчна киселина или сол на жлъчна киселина, тези средства, свободни от белтъци и свободни от пептиди, се предпочита да съдържат наймалко 3 % (тегловни) неутрален липид, до около 50% (тегловни) неутрален липид, като останалото (балансът) е най-малко един фосфолипид. Предпочита се неутралният липид да бъде триглицерид, но той може да бъде всеки от допълнителните неутрални липиди, дискутирани по-горе. Предпочита се също фосфолипидът да бъде фосфатидилхолин.

Други аспекти на изобретението ще са ясни за квалифицирания специалист и не е не обходимо да се повтарят тук. Спецификата и примерите илюстрират, а не ограничават настоящото изобретение и че за специалиста те предполагат други приложения в рамките на изобретението.

Claims

1. Фармацевтично средство за профилактика и лечение на заболявания, причинени от ендотоксини, свободно от белтъци и пептиди, характеризиращо се с това, че съдържа холанова киселина в даден случай сол на холанова киселина, фосфолипид и неутрален липид.

Фармацевтично средство, съгласно претенция 1, характеризиращо се с това, че холановата киселина или сол на холановата киселина е жлъчна киселина или сол на жлъчна киселина.

3. фармацевтично средство, съгласно претенция 2, характеризиращо се с това, че солта на жлъчната киселина се избира от натриев холат, натриев дезоксихолат и натриев хенодезоксихолат.

4. Фармацевтично средство, съгласно претенция 2, характеризиращо се с това, че солта на жлъчната киселина е натриев холат.

5. Фармацевтично средство, съгласно която и да е от претенции 1-4, характеризиращо се с това, че фосфолипидът е фосфатидилхолин.

6. Фармацевтично средство, съгласно която и да е от претенции 1-4, характеризиращо се са това, че фосфолипидът е сфинголипид.

7. Фармацевтично средство, съгласно която и да е от претенции 1-6, характеризиращо се с това, че неутралният липид е триглицерид.

8. Фармацевтично средство, съгласно която и да е от претенции 1-6, характеризиращо се с това, че неутралният липид е холестеролов естер.

9. Фармацевтично средство, съгласно която и да е от претенции 1-8, характеризиращо се с това, че съдържа до 70% тегл.неутра12 лен липид.

10. Фармацевтично средство, съгласно която и да е от претенции 1-9, характеризиращо се с това, че съдържа до 50% тегл. неутрален липид.

11. Фармацевтично средство, съгласно която и да е от претенции 1-10, характеризиращо се с това, че съдържа от около 5% до около 10% тегл. неутрален липид.

12. Фармацевтично средство, съгласно която и да е от претенции 1-11, характеризиращо се с това, че съдържа фосфолипид:неутрален липид в тегловно отношение около 93:7.

13. Фармацевтично средство, съгласно която и да е от претенции 1-12, характеризиращо се с това, че съдържа от около 5% до около 30% тегл. холанова киселина или сол на холанова киселина.

14. Фармацевтично средство, съгласно която и да е от претенции 1-13, характеризиращо се с това, че съдържа от около 10% до около 15% тегл. холанова киселина или сол на холанова киселина.

15. Фармацевтично средство за профилактика и лечение на заболявания причинени от ендотоксини, свободно от белтъци и пептиди, характеризиращо се с това ,че съдържащо холанова киселина, в дадения случай - сол на холанова киселина, фосфолипид и неутрален липид, които имат общо тегловно отношение съответно около 13:81:6.

16. Фармацевтично средство, съгласно претенция 15, характеризиращо се с това, че фосфолипидът е фосфатидилхолин, неутралният липид и триглицерид и холановата киселина или сол на холановата киселина е натриев холат.

17. Фармацевтично средство, съгласно която и да е от претенции 1-16, характеризиращо се с това, че се използва за терапия.

18. Използване на фармацевтично средство, съгласно която и да е от претенции 1-16 за производство на медикамент за лечение или профилактика на хора или животни, страдащи от ендотоксемия.

19. Метод за лечение или профилактика на човек или животно, страдащи от ендо токсемия, характеризиращ се с това ,че се прилага фармацевтично средство, съгласно която и да е от претенции 1-16, в количество, достатъчно да осигури до около 400 mg, подходящо 200 mg за предпочитане 100 mg фосфолипид на килограм телесно тегло на субекта.

20. Фармацевтично средство за профилактика и лечение на заболявания, причинени от ендотоксини, пептиди, характеризиращо се с това, че е свободно от белтъци и съдържа:

a) най-малко един неутрален липид в количество от около 3% да около 50% от теглото на тоталния липид в състава, и

b) най-малко един фосфолипид.

21. Фармацевтично средство, съгласно претенция“20, характеризиращо се с това, че фосфолипидът е фосфатидилхолин.

22. Фармацевтично средство, съгласно претенция 20, характеризиращо се с това, че фосфолипидът е сфинголипид.

23. Фармацевтично средство, съгласно претенции 20-22, характеризиращо се с това, че неутралният липид е триглицерид.

24. Фармацевтично средство, съгласно която и да е от претенции 20-22, характеризиращо се с това, че неутралният липид включва холестеролов естер.

25. Фармацевтично средство, съгласно всяка една от претенции 20-24, характеризиращо се с това, че включва допълнително сфингозин.

26. Метод за лечение или профилактика на човек или животно, страдащи от ендотоксемия, характеризиращ се с това, че се прилага фармацевтично средство, свободно от белтъци, пептиди, и съдържащо най-малко един фосфолипид и най-малко един неутрален липид.

27. Метод за лечение или профилактика на човек или животно, страдащи от ендотоксемия, характеризиращ се с това, че се прилага фармацевтично средство, съгласно която и да е от претенции 1-16 или претенции 22-26.