ES2211900T3 - Composiciones de desparafinacion y metodos para su uso. - Google Patents
Composiciones de desparafinacion y metodos para su uso.Info
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Abstract
SE PROPORCIONAN COMPUESTOS Y METODOS PARA DESPARAFINAR ESPECIMENES BIOLOGICOS INMERSOS EN PARAFINA, ANTES DE SU ANALISIS HISTOQUIMICO. LAS COMPOSICIONES Y METODOS PROPORCIONADOS PUEDEN ELIMINAR DE FORMA EFECTIVA LA PARAFINA O LOS MATERIALES DE INMERSION MEJORADOS ELABORADOS A PARTIR DE PARAFINA, EN CONCRETO LOS BASADOS EN PARAFINA, DE LOS ESPECIMENES DURANTE LA PREPARACION PARA EL ANALISIS HISTOQUIMICO U OTROS TIPOS DE ANALISIS DE DIAGNOSTICO, AL MISMO TIEMPO QUE SE MINIMIZA EL PELIGRO PARA LOS USUARIOS, LOGRANDOSE LA COMPATIBILIDAD CON EL USO AUTOMATICO, Y MANTENIENDOSE LA COMPATIBILIDAD CON LOS ANALISIS HISTOQUIMICOS DE AGUAS ABAJO, EN CONCRETO CON LOS INMUNOCOLORANTES. LAS COMPOSICIONES DE LA INVENCION CONTIENEN UN SOLVENTE ORGANICO SOLUBILIZANTE DE PARAFINA, UN SOLVENTE ORGANICO POLAR, Y UN SURFACTANTE. LAS COMPOSICIONES PUEDEN ADEMAS CONTENER AGUA. EL METODO INCLUYE CONTACTAR UN ESPECIMEN SUMERGIDO EN PARAFINA CON LA COMPOSICION DESPARAFINADORA PARA SOLUBILIZAR LA PARAFINA QUE IMPREGNAEL ESPECIMEN ANTES DEL ANALISIS HISTOQUIMICO. EL METODO PUEDE COMPRENDER UNA FASE POSTERIOR DE LAVAR EL ESPECIMEN INMEDIATAMENTE DESPUES DEL DESPARAFINADO CON UNA COMPOSICION DE LAVADO ACUOSA QUE CONTIENE UN DETERGENTE PARA ELIMINAR LOS RESIDUOS DE LA COMPOSICION DESPARAFINADORA. TAMBIEN SE PROPORCIONA UN EQUIPO PARA DESPARAFINAR UN ESPECIMEN SUMERGIDO EN PARAFINA, QUE CONTIENE UNA COMPOSICION DESPARAFINADORA Y PUEDE ADEMAS CONTENER UNA SEGUNDA COMPOSICION DE (1) Y UN REACTIVO INMUNOCOLORANTE O (2) UNA SOLUCION DE LAVADO ACUOSA QUE CONTENGA UN DETERGENTE PARA ELIMINAR LA SOLUCION DESPARAFINADORA RESIDUAL.
Description
Composiciones de desparafinación y métodos para
su uso.
La parafina se ha usado durante muchos años como
medio de inclusión en la preparación de muestras de tejidos para
seccionar en un microtomo para producir secciones de muestra para
estudios histológicos. Dichos procesos de inclusión incluyen,
generalmente, las etapas bien conocidas de fijación de la muestra,
deshidratación, clarificación, infiltración o impregnación en
parafina, formación de un bloque o inclusión en un bloque de
parafina, corte del bloque y la muestra en secciones finas, montaje
de las secciones en portaobjetos, retirada de la parafina y los
disolventes usados con este fin (desparafinación) y tinción de las
secciones antes del análisis microscópico. El propósito principal
del medio de inclusión es permitir que las muestras se seccionen y
monten en estado natural. También se han usado resinas plásticas
como medio de inclusión para proporcionar una muestra más dura que
permite cortar secciones más finas. Sin embargo, el uso de
inclusión en parafina tiene la ventaja de que la cera se puede
disolver de las muestras antes de la tinción, permitiendo a las
secciones teñirse en forma de cortes desnudos de biopolímero y
evitando las dificultades extra y artefactos relacionados con la
presencia de un medio de inclusión de resina que no se puede
retirar. Véase, Horobin, R.W., en Histochemical and Immunochemical
Techniques: Application to Pharmacology and Toxicology (1991) Bach,
P. y Baker, J., eds, Chapman & Hall, Nueva York, NY, pág.
1-9.
Las recientes mejoras en las composiciones
incluidas en parafina han ampliado su aplicabilidad manteniendo su
compatibilidad con la manipulación y análisis posterior de muestras.
Por ejemplo, un material mejorado de inclusión basado en parafina,
que incluye una mezcla de parafina y una cantidad eficaz del
copolímero etileno-acetato de vinilo (del 0,5% al 5%
en peso de parafina) permite disminuir el tiempo de infiltración y
obtener secciones más finas (Patente de Estados Unidos 4.497.792).
Otra mejora, la técnica de inclusión doble, produce secciones de
membranas tisulares finas, tales como membranas mesentéricas de
roedores, que normalmente miden sólo 10 micrómetros de espesor. En
este método se fijan varias membranas y se montan en cuatro agujas
localizadas en el fondo de una caja de plástico y después se
incluyen en agarosa. El bloque de agarosa se retira, se deshidrata
en alcohol, se clarifica con HistoPetrol (nombre comercial para una
mezcla de hidrocarburos isoparafínicos), se infiltra con parafina y
se secciona. La morfología del tejido observada es comparable a la
obtenida con una inclusión en plástico de metacrilato pero consume
menos tiempo, es menos peligrosa ya que no se usan un endurecedor y
un activador para el plástico y hace que los estudios
inmunohistoquímicos sean más fáciles. Véase Ghassemifar, R. et
al., "A double-embedding technique for thin
tissue membranes" Biotech. Histochem. 67:
363-366 (1992).
En consecuencia, la desparafinación de secciones
de tejido incluidas en parafina fijadas, por ejemplo, fijadas en
formalina, es una metodología aún muy usada, particularmente en
laboratorios de histopatología en hospitales con fines de
inmunodiagnóstico.
El xileno, que es un disolvente orgánico tóxico,
volátil e inflamable, se usa habitualmente en protocolos para
solubilizar parafina para desparafinar secciones de muestras.
Típicamente, la muestra montada en el portaobjetos del microscopio
se sumerge en un baño de xileno hasta que la parafina se solubiliza.
La muestra desparafinada se lava entonces con una serie de
soluciones de alcohol para disminuir la concentración de alcohol,
típicamente como baños en los que se sumerge la muestra, para
retirar el xileno antes de un lavado final con agua. Se han hecho
esfuerzos para sustituir el xileno en el proceso de desparafinación
con disolventes menos tóxicos y menos volátiles. El aceite de
terpeno (por ejemplo, disponible con el nombre comercial AmeriClear
de Baxter Health Care Diagnostics, Inc. McGaw Park, IL) e
hidrocarburos isoparafínicos (por ejemplo, disponibles con el nombre
comercial Micro-Clear de Micron Diagnostics, Inc.,
Fairfax, VA) producen una desparafinación similar en comparación con
el xileno. Véase Jones, R.T. et al., "Comparison of
deparaffinization agents for an automated immunostainer" J.
Histotechnology 16: 367-369 (1993).
Sin embargo, aún se necesita una serie de lavados
con alcohol para retirar cualquier disolvente antes de lavar con
agua para lograr compatibilidad con la mayoría de tipos de tinción,
particularmente tinción inmunohistoquímica. Además, el uso de
muestras incluidas en parafina con sistemas automatizados, tales
como inmunocolorantes, está en aumento.
En consecuencia, aún existe una necesidad de
desparafinar composiciones y de métodos que puedan retirar
eficazmente la parafina o de mejorar los materiales de inclusión
basados en parafina de las muestras antes del análisis histoquímico
u otros análisis de diagnóstico, minimizando el riesgo para los
usuarios, permitiendo la compatibilidad con sistemas automatizados y
manteniendo la compatibilidad con los análisis posteriores. Se
necesitan composiciones y métodos de desparafinación que supongan
una toxicidad o carcinogenicidad limitada o inexistente, produzcan
olores mínimos o inexistentes, reduzcan la cantidad de disolventes
tóxicos usados, minimicen los residuos peligrosos y/o disminuyan la
corrosividad e inflamabilidad.
En el documento
US-A-4.983.224 se describen
composiciones que contienen un componente no polar de terpenos y/o
terpenoles, un disolvente aprótico polar y un tensioactivo para usar
en la retirada de residuos de flujo de soldadura de placas de
circuitos electrónicos ensamblados. En el documento
US-A-5.124.062 se describen
composiciones similares que comprenden un compuesto de terpeno,
N-metilpirrolidona y un tensioactivo emulsionante de
terpeno, para retirar y extraer pinturas y barnices.
La presente invención proporciona nuevas
composiciones de disolvente de desparafinación para retirar la
parafina u otras ceras de las muestras biológicas incluidas en cera
para análisis histoquímico u otros análisis. Las composiciones
comprenden un disolvente orgánico solubilizador de parafina, un
disolvente orgánico polar y un tensioactivo. En realizaciones
adicionales las composiciones de la invención se pueden diluir
opcionalmente con agua.
La presente invención elimina o minimiza el uso
de disolventes orgánicos tóxicos en laboratorios inmunohistológicos.
Las composiciones y metodología descritas en este documento retiran
eficazmente la parafina u otro residuo de cera de las secciones de
tejido y no tienen efecto negativo sobre la calidad de las
secciones de tejido preparadas para inmunohistoquímica. La
aplicación de esta metodología de desparafinación se puede extender
a otras aplicaciones en las que se desea retirar la cera de
secciones de tejido, tales como hibridación in situ.
Las composiciones y métodos proporcionados en
este documento para desparafinar muestras biológicas incluidas en
cera se usan antes del análisis histoquímico u otro análisis. Las
composiciones y métodos de desparafinación provistos pueden retirar
eficazmente los materiales de inclusión basados en cera o cera
modificada, particularmente basados en parafina o parafina
modificada, de las muestras antes de su análisis histoquímico u otro
análisis, minimizando el peligro para los usuarios, permitiendo la
compatibilidad con el uso automatizado, y manteniendo la
compatibilidad con los análisis posteriores. Se proporcionan
composiciones y métodos de desparafinación que suponen una
toxicidad o carcinogenicidad limitada o inexistente, producen olores
mínimos o inexistentes, reducen la cantidad de disolventes tóxicos
usados, minimizan los residuos peligrosos y/o disminuyen la
corrosividad e inflamabilidad. Las composiciones y métodos son
especialmente útiles para eliminar el uso de xileno y para reducir
el uso de alcohol en la preparación de secciones de tejido para
tinción inmunohistoquímica, particularmente en laboratorios de
hospitales.
Por "cera" se entiende una composición usada
en la técnica histoquímica para incluir muestras biológicas para
análisis histoquímico u otro análisis, que es sólida a temperatura
ambiente, normalmente consta de una mezcla compleja de hidrocarburos
superiores que a menudo incluyen ésteres de ácidos grasos superiores
y glicoles superiores, puede ser de origen mineral, natural o
sintético, es más dura y más quebradiza que las grasas, es soluble
en aceites y grasas, y opcionalmente puede contener aditivos que
potencian sus propiedades de inclusión de muestras. La parafina es
un ejemplo de una cera mineral utilizada más habitualmente en el
campo histoquímico. La parafina se prepara, típicamente, por
destilación de petróleo, y es una mezcla fundamentalmente de
hidrocarburos sólidos saturados.
Por "histoquímico" se entiende que incluye
las técnicas y métodos conocidos como inmunohistoquímico,
citoquímico, histopatológico, enzima histoquímica, tinciones
especiales, microtécnica, hibridación in situ, y el uso de
sondas moleculares. Los textos que ilustran técnicas histoquímicas
incluyen "Histochemical and Immunochemical Techniques: Application
to pharmacology and toxicology", (1991) Bach, P. y Baker J.,
eds., Champman & may, Nueva York, NY, pág. 1-9
y "Stains and Cytochemical Methods", (1993), M.A. Hayat, et.,
Plenum Press, Nueva York, NY.
Las composiciones de desparafinación de la
invención comprenden un disolvente orgánico solubilizador de
parafina, un disolvente orgánico polar, y un tensioactivo como se
especifica con detalle a continuación. Las composiciones pueden
comprender, opcionalmente, agua.
El método de la invención para desparafinar
muestras biológicas antes del análisis histoquímico u otro análisis
implica poner en contacto una muestra incluida en cera con una
composición de desparafinación de la invención para solubilizar la
cera que impregna a la muestra antes del análisis histoquímico, tal
como tinción inmunohistoquímica.
Se proporciona también un kit para desparafinar
una muestra incluida en cera. El kit comprende una composición de
desparafinación de la invención y puede comprender además una
segunda composición de (1) un reactivo de inmunotinción o (2) una
solución acuosa de lavado que comprende un detergente para retirar
la solución de desparafinación residual.
El disolvente orgánico solubilizador de parafina
es un hidrocarburo no polar o mezcla de hidrocarburos (por ejemplo,
de un destilado de petróleo) que tiene un punto de ebullición por
encima de la temperatura ambiente, preferiblemente por encima de
110ºC, más preferiblemente por encima de 140ºC a aproximadamente
250ºC, que está en fase líquida a las temperaturas usadas con la
presente invención (normalmente 5º a 50ºC), y que puede disolver la
parafina usada para incluir muestras biológicas. El disolvente
solubilizador de parafina puede ser una mezcla compleja de
hidrocarburos de alcano de cadena larga lineal o ramificada que
contiene, por ejemplo, ésteres de ácidos grasos y glicoles
superiores. La solubilidad en parafina del disolvente a 25ºC es,
típicamente, al menos 0,1 gramos de parafina por 1 litro de
disolvente, preferiblemente 0,1 gramos por 100 ml de disolvente, más
preferiblemente 0,1 gramos por 10 ml de disolvente y, más
preferiblemente, capaz de disolver una cantidad de parafina igual a
aproximadamente el 50% de las soluciones de disolvente en peso. El
disolvente solubilizador de parafina se miscible, además, con un
disolvente orgánico polar cuando se usa en una composición de la
invención. Los ejemplos de disolventes orgánicos solubilizadores de
parafina incluyen hidrocarburos aromáticos, hidrocarburos
alifáticos, terpenos, otros aceites y destilados de petróleo. Los
disolventes orgánicos solubilizadores de parafina preferidos tienen
efectos tóxicos muy pequeños o inexistentes. Además, los disolventes
preferidos son aquellos que la Agencia de Protección Medioambiental
no clasifica como residuo peligroso. Un disolvente solubilizador de
parafina preferido tiene un punto de inflamación mayor de
aproximadamente 60ºC que minimiza la inflamabilidad. Un disolvente
preferido, además, carece de toxicidad, carcinogenicidad y
corrosividad. Un hidrocarburo isoparafínico es un ejemplo de un
disolvente solubilizador de parafina preferido, en parte debido su
falta de toxicidad, carcinogenicidad y corrosividad. Véase Mullin,
L.S. et al., "Toxicology update isoparaffinic
hydrocarbons: a summary of physical properties, toxicity studies
and human exposure data" J. Appl. Toxicol.
10:135-142 (1990).
Las isoparafinas preferidas son hidrocarburos
alifáticos ramificados con una estructura básica de carbono cuya
longitud varía aproximadamente de 10 a 15 carbonos, o mezclas de los
mismos. Una mezcla de hidrocarburo de isoparafina preferida tiene un
punto de inflamación de aproximadamente 74ºC. Otro disolvente
solubilizador de parafina preferido es una mezcla de hidrocarburos
de cadena de lineal o ramificada con 10 a 50 átomos de carbono que
tienen un intervalo de destilación que varía de un punto de
ebullición de 150ºC a aproximadamente 250ºC, y tiene la fórmula
general C_{n}H_{(2n\pm m)} en la que n = 10-50
y m = 0-4. Los alcoholes minerales son otro
disolvente orgánico solubilizador de parafina preferido. Un terpeno
preferido es limoneno. Otros terpenos que se pueden usar incluyen
terpinas, terpinenos y terpineoles. Menos preferiblemente, el
disolvente es un disolvente de hidrocarburo aromático tal como un
alquilbenceno, por ejemplo xileno, o dialquilbenceno, por ejemplo
tolueno. Tolueno y xileno son menos preferidos debido a su toxicidad
y a su clasificación como residuo peligroso. Además, como se
analiza a continuación, incluso cuando se usa xileno o tolueno en
las realizaciones de la invención, se eliminan los lavados
posteriores con alcohol y se sustituyen con soluciones acuosas de
lavado no peligrosas.
El disolvente orgánico solubilizador de parafina
en la composición es típicamente de aproximadamente el 25% a
aproximadamente el 75% en volumen de la composición de
desparafinación. Por debajo del límite inferior de disolvente
orgánico solubilizador de parafina la capacidad de desparafinación
de la composición disminuye significativamente. Por encima del
límite superior de disolvente solubilizador de parafina tiene lugar
un efecto negativo sobre la solubilidad en el detergente o la
solubilidad en agua, que afecta negativamente a la eficacia de un
lavado acuoso posterior. El límite superior de disolvente se puede
seleccionar entre los valores de límite superior de 50%, 70% y 75%,
mientras que el límite inferior de disolvente se puede seleccionar
entre los valores de límite inferior de 25%, 35% y 40%, para
obtener diversos intervalos para las realizaciones de la
invención.
Debido a que estas composiciones se preparan,
típicamente, combinando componentes sin una determinación precisa
del volumen final de la composición o sin considerar los cambios de
volumen tras la mezcla, los porcentajes para cada componente se
califican con el término "aproximadamente", pudiendo, un
especialista en la técnica, apreciar la imprecisión de los valores
como consecuencia de la preparación de la composición; sin embargo,
se considera que los valores de porcentaje preferibles significan
sus valores precisos cuando se tienen en cuenta los cambios de
volumen después de la mezcla.
El disolvente orgánico polar sirve para disolver
el disolvente solubilizador de parafina, tensioactivo y
opcionalmente agua. El disolvente orgánico polar es soluble en agua
hasta al menos 1 g por 100 g de agua, preferiblemente 5 g por 100 g
de agua, más preferiblemente 10 g por 100 g de agua y más
preferiblemente el disolvente orgánico polar es miscible con agua.
Los disolventes orgánicos polares incluyen cetonas y alcoholes
inferiores, que incluyen alcoholes polihidroxi y glicoles, y éteres
inferiores. Los alcoholes preferidos son alcoholes con 1 a 5 átomos
de carbono. Los más preferidos son etanol, etilenglicol,
isopropanol, propilenglicol y mezclas de los mismos. Un disolvente
de tipo cetona preferido es, típicamente una cetona con 3 a 5 átomos
de carbono. Los disolventes de tipo cetona más preferidos son
acetona y metiletilcetona. Los éteres preferidos son éteres con 2 a
6 átomos de carbono. Los disolventes orgánicos polares
particularmente preferidos se seleccionan entre el grupo compuesto
por metanol, etanol, isopropanol, butanol,
terc-butanol, alcohol alílico, acetona, etilenglicol
y propilenglicol, y mezclas de los mismos. Acetonitrilo y
dimetilformamida son los disolventes orgánicos polares menos
preferidos. Además, el disolvente orgánico polar puede ser una
mezcla de disolventes orgánicos polares.
El disolvente orgánico polar en la composición es
típicamente de aproximadamente el 25% a aproximadamente el 75% en
volumen de la composición. Preferiblemente la cantidad es de
aproximadamente el 35% a aproximadamente el 70%, más preferiblemente
de aproximadamente el 40% a aproximadamente el 65% y más
preferiblemente de aproximadamente el 50% a aproximadamente el 60%.
Se puede determinar fácilmente a qué combinación de componentes una
composición es miscible o se separa, a partir de un diagrama de
fases que muestra separación de fases para diferentes cantidades
relativas de los componentes de la solución/mezcla.
Los tensioactivos incluyen tensioactivos
catiónicos, tensioactivos aniónicos, tensioactivos no iónicos y
tensioactivos zwitteriónicos. Se enumeran diversos detergentes
biológicos (tensioactivos) como tales en Sigma Chemical Company en
las páginas 1502-1508 de su Catalog of Biochemicals
and Organic Compounds for Research and Diagnostic Agents de 1991. El
tensioactivo cumple el propósito del detergente ya que tiene tanto
propiedades hidrófilas como hidrófobas. Un tensioactivo para usar en
la invención es soluble en el disolvente usado en una composición de
la invención. Los tensioactivos preferidos son detergentes que son
solubles en agua, etanol y acetona. Los más preferidos son aquellos
que no interfieren prácticamente con los análisis histoquímicos
posteriores, que se pueden determinar, por ejemplo, mediante
inmunotinción usando una solución que contiene el tensioactivo.
Los tensioactivos que se pueden usar en las
composiciones de la invención incluyen tensioactivos catiónicos de
fórmula
en la que R_{1} es metilo, etilo o propilo o
isopropilo en la que n es 1 ó 2; R_{2} es un grupo alquilo
seleccionado entre C_{8}H_{17} a C_{30}H_{61} o un grupo
bencilo; y R_{3} es (CH_{2})_{m}, en el que m es de 1 a
10, o R_{3} es (OCH_{2}CH_{2})_{p} en el que p es de
1 a 10. Los tensioactivos catiónicos de esta fórmula son solubles en
los disolventes orgánicos polares. La mayoría de realizaciones
preferidas de la invención contienen el tensioactivo catiónico
cloruro de benzalconio o cloruro de bencetonio. Los detergentes
catiónicos adicionales, no necesariamente de esta fórmula, incluyen
bromuro de dodeciltrimetilamonio, cloruro de
bencidimetilhexadecilamonio, cloruro de cetilpiridinio, cloruro de
metilbencetonio y sulfato de
4-picolindodecilo.
Otros tensioactivos que se pueden usar en las
composiciones de la invención incluyen tensioactivos aniónicos que
tienen la fórmula
R_{1}---R_{3}----
\melm{\delm{\dpara}{O}}{S}{\uelm{\dpara}{O}}---O^{-}
Na^{+}
en la que R_{1} es C_{6}H_{13} a
C_{30}H_{61}, y R_{3} es CH_{2} o un grupo fenilo. Los
tensioactivos aniónicos de esta fórmula son solubles en disolventes
orgánicos polares. Los ejemplos de detergentes aniónicos, que no
necesariamente tienen esta fórmula, incluyen ácido algínico, ácido
caprílico, ácido cólico, ácido 1-decanosulfónico,
ácido desoxicólico, ácido 1-dodecanosulfónico,
N-lauroilsarcosina, y ácido taurocólico. Otros
detergentes sintéticos aniónicos que no son jabón, que están
representados por las sales solubles en agua de los productos de
reacción de ácido sulfúrico orgánico, tienen en su estructura
molecular un radical alquilo que contiene de aproximadamente 8 a 22
átomos de carbono y un radical seleccionado entre el grupo
compuesto por radicales éster de ácido sulfónico y ácido sulfúrico.
Los ejemplos de éstos son los alquilsulfatos de sodio o potasio,
derivados de aceite de sebo o de coco; alquilbencenosulfonatos de
sodio o potasio; sulfonatos de alquiléter de glicerilo sódico;
sulfonatos y sulfatos de monoglicérido de ácido graso de aceite de
coco sódico; sales sódicas o potásicas de ésteres de ácido
sulfúrico del producto de reacción de un mol de un alcohol graso
superior y aproximadamente 1 a 6 moles de óxido de etileno por
molécula y en el que los radicales alquilo contienen de 8 a 12
átomos de carbono; el producto de reacción de ácidos grasos
esterificados con ácido isetiónico y neutralizados con hidróxido
sódico, sales sódicas o potásicas de amida de ácido graso de
metiltaurida; y sales sódicas o potásicas de
\alpha-olefinas con 10 a 24 átomos de carbono
sulfonadas-SO_{3}.
Otros tensioactivos que se pueden usar en las
composiciones de la invención incluyen tensioactivos no iónicos que
tienen la fórmula
en la que R es un grupo alquilo con 1 a 10 átomos
de carbono lineal o ramificado y X es un entero de 5 a 40. Más
preferiblemente R
es
(CH_{3})_{3} C
CH_{2}----
\melm{\delm{\para}{CH _{3} }}{C}{\uelm{\para}{CH _{3} }}---
Los tensioactivos no iónicos de esta fórmula son
solubles en disolventes orgánicos polares. Los ejemplos de
detergentes no iónicos, que no necesariamente tienen esta fórmula,
incluyen decanoil-N-metilglucamida,
éter monopentílico de dietilenglicol,
\beta-D-glucopiranósido de
n-dodecilo, éteres de polioxietileno de ácidos
grasos (particularmente ácidos grasos con 12 a 20 átomos de
carbono, (por ejemplo, vendidos con el nombre comercial Triton),
condensados de óxido de etileno de alcoholes grasos, por ejemplos
los vendidos con el nombre Lubrol), éteres de ácido graso de
polioxietilensorbitano (por ejemplo, los vendidos con el nombre
comercial Tween), y éteres de ácido graso de sorbitano (por
ejemplo, los vendidos con el nombre comercial Span). Los
detergentes sintéticos no iónicos se prepararon por condensación de
grupos óxido de alquileno con un compuesto hidrófobo orgánico. Los
grupos hidrófobos típicos incluyen los productos de condensación
del óxido de propileno con propilenglicol, alquilfenoles, producto
de condensación de óxido de propileno y etilendiamina, alcoholes
alifáticos que tienen de 8 a 22 átomos de carbono y amidas de
ácidos grasos. También detergentes no iónicos tales como óxidos de
amina, óxidos de fosfina y sulfóxidos que tienen características
semipolares y se pueden retirar. Los ejemplos específicos de óxidos
de amina terciaria de cadena larga incluyen óxido de
dimetildodecilamina y
bis-(2-hidroxietil)dodecilamina. Los ejemplos
específicos de óxido de fosfina se encuentran en la patente de
Estados Unidos Nº 3.304.263 e incluyen óxido de
dimetildodecilfosfina y óxido de
dimetil-(2-hidroxidodecil)fosfina. Un
tensioactivo detergente no iónico preferido es Triton
X-100, que es un nombre comercial para un éter de
polioxietileno de ácidos grasos (particularmente ácidos grasos con
12 a 20 átomos de carbono).
Los tensioactivos zwitteriónicos incluyen
compuestos conocidos de fórmula
N-alquil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato.
Los ejemplos de detergentes zwitteriónicos incluyen
3-[(3-colamidopropil)-dimetilamonio]-1-propanosulfonato
(abreviado habitualmente CHAPS),
3-[(colamidopropil)-dimetilamonio]-2-hidroxi-1-propanosulfonato
(abreviado generalmente CHAPSO),
N-dodecil-N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato,
y
liso-\alpha-fosfatidil-colina.
El tensioactivo en la composición es típicamente
de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 20% en peso a
volumen (g/100 ml) de la composición. Por debajo del límite inferior
de tensioactivo se observa una solubilidad muy baja de la cera en la
composición. El límite superior de tensioactivo es un factor del
límite de solubilidad del tensioactivo. La cantidad de tensioactivo
es preferiblemente del 0,5% a aproximadamente el 15% en peso, más
preferiblemente de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 10%
en peso de tensioactivo, más preferiblemente de aproximadamente el
0,5% a aproximadamente el 5%.
Las composiciones de la invención pueden contener
también agua. Más preferiblemente el agua en una composición es una
cantidad saturante de agua. Por encima de este límite superior tiene
lugar la separación de fases de la composición. Típicamente, el agua
es menos de o aproximadamente el 10% en volumen de la composición.
Algunas realizaciones de la invención, por ejemplo como se
ejemplifican en los ejemplos tienen menos de aproximadamente el 7%
de agua, algunas tienen de aproximadamente 0,5% a aproximadamente el
1,5% de agua y aún otras tienen menos de aproximadamente el 1% de
agua en volumen.
En algunas realizaciones de la invención, las
composiciones de desparafinación o las soluciones de lavado acuoso
contienen tampón, sales u otros reactivos útiles para solubilizar
las ceras, lavados o posteriores etapas histoquímicas, siempre y
cuando dichos reactivos opcionales no interfieran con la capacidad
solubilizadora de cera de la composición, la eficacia de la etapa
de lavado o las posteriores etapas histoquímicas. Los reactivos
útiles para las posteriores etapas de procesado o histoquímicas
incluyen ésteres de ácido carboxílico, enzimas tales como lipasas, y
reactivos nucleófilos como se describe en la solicitud de Estados
Unidos de propiedad común con Nº de serie 07/821.931, presentada 16
de enero de 1992, titulada "Enhancement of immunochemical staining
in aldehide-fixed tissue". Los agentes opcionales
pueden servir para exponer o potenciar el(los)
antígeno(s) de tejido fijado por aldehído para tinción
inmunohistoquímica. Los reactivos opcionales adicionales incluyen
agentes antimicrobianos y estabilizantes que aumentan el período de
validez de la composición. Dichos agentes antimicrobianos y
estabilizantes se conocen bien en este campo. Dichos reactivos se
usan, típicamente, en porcentajes extremadamente pequeños,
típicamente por debajo del 0,1%, comparado con los componentes
principales. Los reactivos preferidos son los que no interfieren con
los análisis histoquímicos posteriores.
Cada uno de los componentes individuales de las
composiciones de la invención se puede obtener en el mercado, se
aísla de fuentes naturales usando procedimientos conocidos, o se
sintetiza de acuerdo con procedimientos conocidos.
Las composiciones de la invención se preparan por
mezcla simple de los componentes en las cantidades indicadas.
Los métodos de preparación de muestras biológicas
para seccionar por impregnación en cera o parafina se conocen,
generalmente y se llevan a cabo fácilmente. El proceso es bastante
simple e implica poner en contacto una muestra incluida en cera con
una composición de desparafinación de la invención para solubilizar
la cera que impregna la muestra antes del análisis histoquímico,
tal como inmunotinción. El método comprende opcionalmente una etapa
adicional de contacto de la muestra desparafinada inmediatamente
después de la desparafinación con una composición acuosa de lavado
que comprende un detergente para retirar la composición de
desparafinación residual.
Aunque el proceso de desparafinación se lleva a
cabo típica y convenientemente a temperatura ambiente, sin que sea
necesario un baño de temperatura controlada, se consigue un control
más preciso del tiempo requerido para una desparafinación
satisfactoria si se usan baños de temperatura controlada. El
calentamiento disminuye el tiempo de procesado. Las temperaturas de
operación varían de 5 a 50º, preferiblemente de aproximadamente 15
a aproximadamente 45ºC y más preferiblemente de aproximadamente 25
a aproximadamente 40ºC.
Típicamente, la muestra incluida en cera se pone
en contacto con una composición de la invención durante un tiempo
suficiente para solubilizar todo o parte de la muestra incluida en
cera. Los factores que influyen en el tiempo de solubilización
incluyen temperatura, espesor de la sección de la muestra y
composición de la cera. La mejor manera para determinar el tiempo
para un tipo de muestra particular es empíricamente. Sin embargo,
normalmente son suficientes cinco minutos de contacto para las
muestras montadas sobre portaobjetos de microscopio. Una muestra
seccionada, típicamente fijada a un portaobjetos de microscopio, se
pone en contacto con una composición de la invención de numerosas
maneras. Preferiblemente, la muestra se sumerge en un baño que
contiene la composición, o alternativamente una cantidad de la
composición suficiente para solubilizar la cera se puede situar
sobre la muestra de manera que la muestra queda cubierta con la
composición. Después de que ha transcurrido un tiempo de contacto
suficiente para que tenga lugar la solubilización de la cera, la
muestra se retira del contacto con la composición, y el exceso de
composición se retira de la muestra, por ejemplo drenando o secando.
Opcionalmente, se llevan a cabo una segunda o incluso una etapa o
etapas adicionales de desparafinación, preferiblemente con
composición de desparafinación fresca, para asegurar adicionalmente
la retirada de la cera de la muestra.
La invención disminuye o elimina la necesidad de
baños de alcohol para los lavados tras la desparafinación. Los
lavados tras la desparafinación no siempre son necesarios con las
composiciones de la invención. Si dicha etapa se considera deseable
(debido a un procedimiento de inmunotinción particularmente
sensible, por ejemplo) la muestra desparafinada se puede poner en
contacto con una composición acuosa de lavado de la invención que
comprende un detergente. Una solución de lavado preferida comprende
un tampón y un detergente. Preferiblemente el detergente es no
iónico. Una solución de lavado tampón/detergente preferida es
solución salina tamponada con fosfato con aproximadamente un 1% de
tensioactivo no iónico de éter polioxietileno tal como
BRIJ-35 (nombre comercial para el tensioactivo no
iónico polioxietilenglicoldodecil éter o
polioxietilen(23)lauril éter). Típicamente, la
cantidad de detergente es de aproximadamente el 0,1% a
aproximadamente el 5% (peso a volumen), preferiblemente de
aproximadamente del 0,1% al 2%, y más preferiblemente
aproximadamente el 1%. El pH de la composición de lavado es más
preferiblemente neutro para evitar que afecte negativamente a los
análisis histoquímicos posteriores, particularmente inmunoquímicos.
El pH puede variar de aproximadamente 4 a aproximadamente 10,
preferiblemente de aproximadamente 5 a aproximadamente 8, más
preferiblemente de aproximadamente 7,2 a aproximadamente 7,6 y más
preferiblemente de 7,4 a aproximadamente 7,5. Un tampón preferido es
uno que no interfiera con los análisis posteriores y/o se pueda
retirar fácilmente con un lavado acuoso posterior o un lavado
opcional con agua. Los ejemplos de tampones preferidos son los que
contienen solución salina tamponada con fosfato o Tris. El lavado
puede tener lugar de numerosas maneras, incluyendo inmersión en un
baño de lavado, solución de lavado que fluye sobre la muestra, o
difusión o permeación de la solución de lavado a través de la
muestra. La mejor manera para determinar el tiempo de lavado es
empíricamente; sin embargo, normalmente son suficientes cinco
minutos. Se pueden usar múltiples enjuagados y una mayor cantidad de
solución de lavado para conseguir una mayor retirada de la solución
de desparafinación. Un único lavado es suficiente para la mayoría de
propósitos; sin embargo, es preferible un segundo lavado si la
retirada no es suficiente. Opcionalmente, la muestra se lava o
enjuaga finalmente en agua. Un lavado en agua de 3 minutos
normalmente es suficiente para las condiciones más rigurosas.
Después del lavado la muestra está preparada para los análisis
histoquímicos u otros análisis.
Las composiciones de la invención, incluyendo las
soluciones de lavado, son compatibles con los sistemas de tinción
automatizados, como se describe por ejemplo en la solicitud de
Estados Unidos de propiedad común con número de serie 08/129.243.
Los portaobjetos desparafinados se pueden proveer a un sistema de
tinción automatizado o un sistema de tinción automatizado se puede
proveer con composiciones de la invención para permitir la
desparafinación automatizada de los portaobjetos antes de los
análisis automatizados.
Aunque los tensioactivos preferidos y otros
componentes usados en una solución de desparafinación de la
invención son los que típicamente no interfieren con los análisis
posteriores, particularmente a los niveles residuales que quedan
sobre la muestra después de los procedimientos de lavado, se pueden
aplicar los métodos conocidos en la técnica para potenciar la
retirada del tensioactivo (u otro componente) el tensioactivo
residual (u otro componente) causaría problemas en los análisis
posteriores. Para la retirada del tensioactivo residual se pueden
incluir compuestos solubles que se sabe que se unen al tensioactivo
en una solución acuosa de lavado. Por ejemplo, se sabe que las
ciclodextrinas se unen a ciertos tensioactivos (US 5.032.503) y se
pueden incluir en una solución de lavado. Se pueden incluir
proteínas, tales como albúmina de suero bovino, en una solución de
lavado para unirse y retirar el tensioactivo residual. En una
realización preferida, un tensioactivo que no interfiere con los
análisis posteriores pero que puede desplazar el tensioactivo
residual, se puede usar en una solución acuosa de lavado. Este
tensioactivo desplazado se retira preferiblemente fácilmente con un
lavado con agua. Los tensioactivos no iónicos de tipo alquiléter de
polioxietileno son un tensioactivo de lavado preferido.
BRIJ-35 (nombre comercial del
polioxietilenglicoldodecil éter) es un ejemplo de dicho
tensioactivo.
También se proporciona un kit para desparafinar
una muestra incluida en cera. El kit comprende un recipiente de
composición de desparafinación y puede comprender adicionalmente un
segundo recipiente de (1) un reactivo de tinción histoquímico o (2)
una solución acuosa de lavado de la invención que comprende un
detergente para retirar la solución desparafinadora residual. Los
recipientes se localizan típicamente, en un receptáculo adaptado
específicamente para contenerlos. Preferiblemente, la solución de
lavado contiene un tampón y un detergente. En una realización, el
reactivo de tinción histoquímico es un reactivo de inmunotinción.
En otra realización, el reactivo de tinción histoquímico es un
reactivo de hibridación in situ. El kit puede ser un
componente de un kit más grande para análisis histoquímicos tal como
en un kit para usar con inmunotinción automatizada. Cualquier otro
reactivo descrito en este documento se puede usar en el kit en
combinación con los componentes especificados.
Las composiciones y métodos de la invención son
adecuados para ser utilizados en diversas aplicaciones
histoquímicas, particularmente tinción inmunoquímica. La hibridación
in situ con sondas de ácido nucleico es otro uso
particularmente pertinente compatible con las composiciones y
métodos de la invención.
La presente invención elimina o minimiza el uso
de ciertos disolventes orgánicos tóxicos en laboratorios
inmunohistológicos. Las composiciones y metodología descritas en
este documento retienen eficazmente parafina y otros residuos de
cera de secciones de tejidos y no tienen efectos negativos sobre la
calidad de las secciones de tejidos preparadas para
inmunohistoquímica. La aplicación de esta metodología de
desparafinación se puede extender a otras aplicaciones en las que
sea necesaria la retirada de parafina y otras ceras de los tejidos.
En realizaciones preferidas usando isoparafinas, las composiciones
tienen un orden muy bajo de toxicidad aguda, siendo prácticamente
inocuas por vía oral, dérmica e inhalación. Además las
composiciones permiten un método de desparafinación que elimina el
uso de lavados con alcohol de alta graduación. En consecuencia, las
realizaciones de la presente invención encuentran una necesidad en
proporcionar composiciones y métodos que minimizan los peligros para
el usuario y minimizan la creación de residuos peligrosos.
Los siguientes ejemplos de composiciones de
desparafinación se presentan como ilustración de las realizaciones
de la invención y no pretenden limitar la invención.
La composición 1 se preparó mezclando alcohol
reactivo (275 ml, una solución premezclada de 90% v/v de alcohol
etílico anhidro, 5% v/v de alcohol metílico y 5% v/v de alcohol
isopropílico), limoneno (100 ml), agua (25 ml) y benzalconio (20
g).
La composición 2 se preparó mezclando alcohol
reactivo (100 ml), limoneno (100 ml) y benzalconio (15 g).
La composición 3 se preparó mezclando alcohol
reactivo (100 ml), hidrocarburo isoparafínico (100 ml) y benzalconio
(15 g). El disolvente de hidrocarburo isoparafínico usado en las
composiciones de este ejemplo está disponible como
Micro-Clear, un nombre comercial de Micron
Diagnostics, Inc., para su disolvente de hidrocarburo
isoparafínico.
La composición 4 se preparó mezclando alcohol
reactivo (50 ml), limoneno (50 ml), agua (0,6 ml) y benzalconio (10
g).
La composición 5 se preparó mezclando alcohol
reactivo (50 ml), isoparafina (50 ml), agua (0,6 ml) y benzalconio
(15 g).
La composición 6 se preparó mezclando alcohol
reactivo (100 ml), isoparafina (50 ml), alcoholes minerales (50 ml)
y benzalconio (15 g).
La composición 7 se preparó mezclando alcohol
reactivo (50 ml), isoparafina (50 ml), agua (0,9 ml) y
Triton-X100 (100 g).
La composición 8 se preparó mezclando alcohol
reactivo (65 ml), isoparafina (45 ml), agua (0,5 ml) y
BRIJ-35 (1,0 g).
La composición 9 se preparó mezclando alcohol
reactivo (54 ml), isoparafina (35 ml), agua (1,0 ml) y
BRIJ-35 (2,5 g).
Se llevó a cabo la desparafinación de muestras de
tejido montadas sobre portaobjetos usando las composiciones
1-9 del ejemplo 1, antes de los análisis
inmunohistológicos. Los tejidos humanos usados en este estudio
incluyen carcinoma, melanoma y astrocitoma de piel, páncreas,
amígdala, bazo, pulmón, mama, próstata, colon. Las composiciones
1-9 se ensayaron individualmente. Se cubrió cada
sección de tejido incluido en parafina de 4 \mu (micrómetros)
sobre un portaobjetos con 1,9 ml de una composición de
desparafinación 1-9. Después de 5 minutos, la
composición de desparafinación se retiró y se añadieron 1,0 ml de
composición de desparafinación nueva para cubrir la sección durante
otros 5 minutos más. Se llevó a cabo también una tercera
desparafinación de la sección durante 5 minutos más en composición
de desparafinación nueva. Inmediatamente después de la
desparafinación final, los portaobjetos se enjuagaron en una
composición acuosa de lavado de PBS con un 1% de
BRIJ-35 durante 5 minutos. Los portaobjetos se
enjuagaron después en agua del grifo durante 3 minutos y se usaron
para inmunohistoquímica.
En este ejemplo se realizó un segundo método para
desparafinar muestras de tejido montadas sobre portaobjetos usando
las composiciones 1-9 del ejemplo 1 antes de los
análisis inmunohistológicos. Los tejidos humanos usados en este
estudio incluían carcinoma, melanoma y astrocitoma de piel,
páncreas, amígdala, bazo, pulmón, mama, próstata, colon. Las
composiciones 1-9 se ensayaron individualmente. Cada
portaobjetos que contenía secciones de tejido incluidas en parafina
se sumergió en un recipiente de vidrio que contenía 60 ml de una de
las composiciones de desparafinación 1-9. Después de
5 minutos, la composición de desparafinación se decantó y se
sustituyó con composición de desparafinación fresca y los
portaobjetos se desparafinaron durante 5 minutos más. Se llevó a
cabo también una tercera desparafinación de 5 minutos.
Inmediatamente después de la desparafinación, los portaobjetos se
enjuagaron en una composición acuosa de lavado que contenía PBS con
un 1% de BRIJ-35 durante 5 minutos, se enjuagaron
con agua del grifo durante 3 minutos y se usaron para
inmunohistoquímica.
Se llevó a cabo un protocolo de desparafinación
estándar ampliamente usado, que implica xileno, como control. Los
portaobjetos que contenían secciones de tejido incluidas en parafina
se sumergieron en xileno al 100% durante 5 minutos seguido de dos
cambios de xileno al 100% nuevo durante 5 minutos cada uno. Después
de esto, los portaobjetos se sumergieron en un baño de alcohol al
100% dos veces durante 3 minutos cada vez. Los portaobjetos se
sumergieron después secuencialmente en baños de alcohol al 95%,
alcohol al 85% y después alcohol al 75%, durante 3 minutos en cada
baño. Los portaobjetos se enjuagaron finalmente en agua del grifo
durante 3 minutos y se usaron para inmunohistoquímica. Se preparó
una serie de portaobjetos siguiendo este protocolo pero sustituyendo
el xileno por limoneno o Micro-Clear.
Se examinó la eficacia de retirada de parafina de
los portaobjetos desparafinados preparados en los ejemplos 2, 3 y 4.
Después de desparafinar los portaobjetos con las composiciones de
desparafinación 1-9 y lavar con composiciones
acuosas de lavado de PBS con un 1% de BRIJ-35, no
quedó ningún residuo de parafina sobre las secciones u otra
localización de los portaobjetos. No se detecto ningún residuo de
parafina sobre las secciones o portaobjetos desparafinados con el
procedimiento de control usando xileno e hidratado con alcoholes de
alta graduación y agua. No había ninguna diferencia distinguible de
eficacia para la retirada de parafina entre xileno, limoneno,
isoparafina y las composiciones de desparafinación
1-9 del ejemplo 1.
Se tiñeron tejidos humanos normales o tumorales
incluyendo carcinoma, melanoma y astrocitoma de piel, páncreas,
amígdala, bazo, pulmón, mama, próstata, colon, con los anticuerpos
monoclonales correspondientes para determinar los efectos de las
composiciones de desparafinación sobre la tinción
inmunohistoquímica. Se usaron portaobjetos con secciones de tejido
desparafinadas con xileno como controles estándar. Se examinó la
compatibilidad con los análisis inmunohistológicos de los
portaobjetos que contenían secciones parafinadas como se describe en
los ejemplos 2, 3 y 4. Los portaobjetos desparafinados se
sumergieron en solución de Block I (un nombre comercial de BioGenex,
San Ramon, California, para una solución de PBS y peróxido de
hidrógeno al 3%), durante 10 minutos. Cada portaobjetos se enjuagó
posteriormente en PBS dos veces, 5 minutos cada vez. Se incubaron
doscientos microlitros de anticuerpos primarios (obtenidos de
BioGenex con el nombre comercial anticuerpos Ready to Use) con sus
secciones respectivas durante 30 minutos o 2 horas de acuerdo con
los protocolos de tinción individual proporcionados por el
suministrador. Se usaron los siguientes anticuerpos monoclonales en
inmunohistoquímica: cóctel anti-humano de
citoqueratina, anti- NSE, anti-insulina,
anti-LCA, anti-cadena kappa,
anti-banda Q, anti-L26, anti- factor
VIII, anti-CEA, anti-p53,
anti-Cerb-2,
anti-PR, anti-vimentina,
anti-PSA, anti-HMB45,
anti-S-100 y
anti-GFAP. Los portaobjetos se lavaron después en
PBS 3 veces, 5 minutos cada vez. Después de una incubación de 20
minutos con anticuerpos secundarios biotinilados (disponibles con el
nombre comercial Super Sensitive Link de BioGenex, San Ramon,
California), los portaobjetos se lavaron en PBS tres veces, 5
minutos cada vez. Los portaobjetos se incubaron después con una
solución madre de estreptavidina conjugada con peroxidasa
(disponible con el nombre comercial Super Sensitive Label de
BioGenex, San Ramon, California) durante 20 minutos y se lavaron
tres veces en PBS. La reacción cromogénica se llevó a cabo usando
AEC
(3-amino-9-etilcarbazol)
para peroxidasa y Fast Red para fosfatasa alcalina. Después del
desarrollo de color, cada portaobjetos se enjuagó con agua del
grifo, se tiñó con un colorante de contraste, se montó y se examinó
por microscopía óptica.
Se evaluó la intensidad de reactividad de
inmunotinción mediante un microscopio óptico. No hubo ninguna
diferencia en la intensidad de inmunotinción entre los portaobjetos
desparafinados con las composiciones de desparafinación
1-9 y el control desparafinado con xileno.
Se usó la composición 8 para evaluar el efecto de
la frecuencia de los cambios de composición sobre la
desparafinación. Se determinó la extensión de la retirada de
parafina por inspección visual de los portaobjetos tratados. En
presencia de parafina residual, el agua formó numerosas gotas
pequeñas sobre la superficie de los portaobjetos que tenían una
apariencia cerosa. Tras la finalización de la desparafinación, el
agua formó una película uniforme sobre la superficie del
portaobjetos. Después de que los portaobjetos se sumergieran en la
composición 8 durante 5 minutos y después se lavaran con tampón de
lavado acuoso: PBS que contenía un 1% de BRIJ-35,
quedaba parafina residual sobre los portaobjetos. No había parafina
residual distinguible sobre los portaobjetos cuando las muestras se
desparafinaron por inmersión en la composición 8 durante 5 minutos,
seguido de inmersión en una solución nueva de la composición 8
durante 5 minutos, y se lavaron finalmente con una solución acuosa
de lavado. Las muestras se desparafinaron también mediante un
protocolo de dos cambios de composición 8 seguido de lavado acuoso.
No hubo diferencia en términos de intensidad de tinción
inmunohistoquímica entre las tres condiciones de
desparafinación.
Claims (31)
1. Un proceso para retirar la cera de una muestra
biológica incluida en cera, comprendiendo dicho proceso poner en
contacto dicha muestra incluida en cera con una composición de
desparafinación que comprende
a) un disolvente orgánico solubilizador de
parafina seleccionado entre el grupo compuesto por hidrocarburos
aromáticos, terpenos e hidrocarburos isoparafínicos,
b) un disolvente orgánico polar, y
c) un tensioactivo,
en condiciones suficientes para solubilizar la
cera asociada con la muestra biológica.
2. El proceso de la Reivindicación 1, en el que
dicha composición de desparafinación comprende:
(a) de aproximadamente el 25% a aproximadamente
el 75% en volumen de al menos un disolvente orgánico solubilizador
de parafina seleccionado entre el grupo compuesto por hidrocarburos
aromáticos, terpenos e hidrocarburos isoparafínicos,
(b) de aproximadamente el 25% a aproximadamente
el 75% en volumen de al menos un disolvente orgánico polar soluble
en agua;
(c) de aproximadamente 0,5% a aproximadamente el
20% en peso a volumen de un tensioactivo soluble en agua.
3. El proceso de la Reivindicación 1, que
comprende además agua en al menos o aproximadamente el 10% en
volumen.
4. El proceso de la Reivindicación 1, en el que
el disolvente orgánico solubilizador de parafina es limoneno.
5. El proceso de la Reivindicación 1, en el que
el disolvente orgánico solubilizador de parafina comprende un
hidrocarburo isoparafínico.
6. El proceso de la Reivindicación 1, en el que
el disolvente orgánico solubilizador de parafina es un alquilbenceno
o dialquilbenceno.
7. El proceso de la Reivindicación 1, en el que
el disolvente orgánico polar se selecciona entre el grupo compuesto
por alcoholes con 1 a 5 átomos de carbono, cetonas con 3 a 5 átomos
de carbono y éteres con 2 a 6 átomos de carbono.
8. El proceso de la Reivindicación 7, en el que
el disolvente orgánico polar comprende al menos un disolvente
seleccionado entre el grupo compuesto por metanol, etanol, propanol,
isopropanol, butanol, terc-butanol, acetona,
etilenglicol, alcohol alílico y propilenglicol.
9. El proceso de la Reivindicación 1, en el que
el tensioactivo comprende un tensioactivo catiónico o aniónico.
10. El proceso de la Reivindicación 9, en el que
el tensioactivo es un tensioactivo catiónico que tiene la
fórmula
en la que R_{1} es metilo, etilo o propilo o
isopropilo, en el que n es 1 ó 2; R_{2} es un alquilo de
C_{8}H_{17} a C_{30}H_{61} o un grupo bencilo; y R_{3} es
(CH_{2})_{m} en el que m es de 1 a 10, o R_{3} es
(OCH_{2}CH_{2})_{p} en el que p es de 1 a
10.
11. El proceso de la Reivindicación 10, en el que
el tensioactivo catiónico es cloruro de benzalconio o cloruro de
bencetonio.
12. El proceso de la Reivindicación 9, en el que
el tensioactivo es un tensioactivo aniónico que tiene la fórmula
R_{1}---R_{3}----
\melm{\delm{\dpara}{O}}{S}{\uelm{\dpara}{O}}---O^{-}
Na^{+}en la que R_{1} es C_{6}H_{13} a
C_{30}H_{61} y R_{3} es CH_{2} o un grupo
fenilo.
13. El proceso de la Reivindicación 1, en el que
el tensioactivo es un tensioactivo no iónico.
14. El proceso de la Reivindicación 13, en el que
el tensioactivo no iónico tiene la fórmula
en la que R es un grupo alquilo lineal o
ramificado con 1 a 10 átomos de carbono y X es de 5 a
40.
15. El proceso de la Reivindicación 13, en el que
el tensioactivo no iónico contiene éteres de polioxietileno de
ácidos grasos con 12 a 20 átomos de carbono.
16. El proceso de la Reivindicación 1, que
comprende además la etapa de lavar dicha muestra después de dicha
etapa de contacto con una solución acuosa de lavado que comprende un
detergente en condiciones suficientes para retirar al menos una
parte de cualquier composición desparafinadora residual de dicha
muestra.
17. Un kit de desparafinación para retirar la
cera de una muestra biológica incluida en cera que comprende:
un receptáculo adaptado para contener recipientes
de reactivos individuales
un primer recipiente que contiene una composición
de desparafinación que comprende
a) un disolvente orgánico solubilizador de
parafina seleccionado entre el grupo compuesto por hidrocarburos
aromáticos, terpenos e hidrocarburos isoparafínicos,
b) un disolvente orgánico polar, y
c) un tensioactivo,
para solubilizar la cera de la muestra, y
un segundo recipiente que contiene (1) un
reactivo de inmunotinción o (2) una solución acuosa de lavado que
comprende un detergente para retirar la composición de
desparafinación residual de dicha muestra.
18. El kit de la Reivindicación 17, en el que
dicha composición de desparafinación comprende:
(a) de aproximadamente el 25% a aproximadamente
el 75% en volumen de al menos un disolvente orgánico solubilizador
de parafina seleccionado entre el grupo compuesto por hidrocarburos
aromáticos, terpenos e hidrocarburos isoparafínicos,
(b) de aproximadamente el 25% a aproximadamente
el 75% en volumen de al menos un disolvente orgánico polar soluble
en agua;
(c) de aproximadamente 0,5% a aproximadamente el
20% en peso a volumen de un tensioactivo soluble en agua.
19. El kit de la Reivindicación 17 en el que la
composición comprende, además, menos de o aproximadamente el 10% en
volumen de la composición.
20. El kit de la Reivindicación 17 en el que el
disolvente orgánico solubilizador de parafina es limoneno.
21. El kit de la Reivindicación 17 en el que el
disolvente orgánico solubilizador comprende un hidrocarburo
isoparafínico.
22. El kit de la Reivindicación 17 en el que el
disolvente orgánico solubilizador de parafina es un alquilbenceno o
dialquilbenceno.
23. El kit de la Reivindicación 17 en el que el
disolvente orgánico polar se selecciona del grupo compuesto por
alcoholes con 1 a 5 átomos de carbono, cetonas con 3 a 5 átomos de
carbono y éteres con 2 a 6 átomos de carbono.
24. El kit de la Reivindicación 23 en el que el
disolvente orgánico polar comprende al menos un disolvente
seleccionado entre el grupo compuesto por metanol, etanol, propanol,
isopropanol, butanol, terc-butanol, acetona,
etilenglicol, alcohol alílico y propilenglicol.
25. El kit de la Reivindicación 17 en el que el
tensioactivo comprende un tensioactivo catiónico o aniónico.
26. El kit de la Reivindicación 25 en el que el
tensioactivo es un tensioactivo catiónico que tiene la fórmula
en la que R_{1} es metilo, etilo o propilo o
isopropilo, en el que n es 1 ó 2; R_{2} es un alquilo de
C_{8}H_{17} a C_{30}H_{61} o un grupo bencilo; y R_{3} es
(CH_{2})_{m} en el que m es de 1 a 10, o R_{3} es
(OCH_{2}CH_{2})_{p} en el que p es de 1 a
10.
27. El kit de la Reivindicación 26, en el que el
tensioactivo catiónico es cloruro de benzalconio o cloruro de
bencetonio.
28. El kit de la Reivindicación 25, en el que el
tensioactivo es un tensioactivo aniónico que tiene la fórmula
R_{1}---R_{3}----
\melm{\delm{\dpara}{O}}{S}{\uelm{\dpara}{O}}---O^{-}
Na^{+}en la que R_{1} es C_{6}H_{13} a
C_{30}H_{61} y R_{3} es CH_{2} o un grupo
fenilo.
29. El kit de la Reivindicación 17, en el que el
tensioactivo comprende un tensioactivo no iónico.
30. El kit de la Reivindicación 29, en el que el
tensioactivo no iónico tiene la fórmula
en la que R es un grupo alquilo lineal o
ramificado con 1 a 10 átomos de carbono y X es de 5 a
40.
31. El kit de la Reivindicación 30, en el que el
tensioactivo no iónico contiene éteres de polioxietileno de ácidos
grasos con 12 a 20 átomos de carbono.
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