ES2211184T3 - Fosfatidilcolina como medicamento con efecto protector de mucosas. - Google Patents

Abstract

Uso de fosfatidilcolina para la preparación de medicamentos con efecto protector de las mucosas en el intestino grueso, para la administración rectal o para la administración oral con liberación retardada del principio activo en el íleon inferior o en el colon, para el tratamiento de colitis ulcerosa, inflamación del saco ileoanal (pouchitis), enfermedades del intestino grueso o inflamaciones en el intestino grueso como Morbus Crohn, colitis diversificada, enteritis/colitis infecciosas, inflamaciones por radiaciones, antibióticos, quimioterápicos, fármacos o sustancias químicas, o para el tratamiento o la profilaxis del carcinoma del intestino grueso.

Description

Fosfatidilcolina como medicamento con efecto protector de mucosas.

La presente invención se refiere a la preparación de medicamentos que contienen fosfatidilcolina como principio activo, en una cantidad de efecto terapéutico, para el tratamiento de enfermedades en las que es conveniente el efecto protector de mucosas de la fosfatidilcolina en el intestino grueso y el íleon terminal (mucosa del saco ileoanal). Los medicamentos son aptos para el tratamiento de la colitis ulcerosa, la inflamación del saco ileoanal (pouchitis), otras inflamaciones del intestino grueso (Morbus Crohn, colitis diversificada, enteritis/colitis infecciosas, inflamaciones por radiaciones, antibióticos, quimioterápicos, fármacos o sustancias químicas), así como para la profilaxis del carcinoma del intestino grueso.

Las enfermedades inflamatorias crónicas del intestino, colitis ulcerosa y Morbus Crohn, afectan en gran medida y con creciente frecuencia a seres humanos jóvenes y de mediana edad, (frecuencia en conjunto de 1 - 2%). El transcurso crónico con episodios inflamatorios agudos, así como con numerosas complicaciones (formación de fístulas y abscesos, estenosis, episodios inflamatorios agudos, hemorragias, deterioro de la funcionalidad del epitelio del intestino grueso, manifestación extraintestinal) caracterizan el transcurso natural de estas enfermedades. Particularmente, en el caso de la colitis ulcerosa, después del transcurso de ésta durante años, de debe destacar el riesgo aumentado de la formación de un carcinoma del intestino grueso. A pesar de que se han realizado exhaustivos trabajos de investigación, hasta ahora no se ha logrado hallar el origen de estas enfermedades. Por ello, también sólo existe una terapia sintomática que no es específica de la causa y a menudo no logra los éxitos deseados.

Entre la colitis ulcerosa y el Morbus Crohn existen diferencias esenciales, de manera que se puede partir de la presunción de que hay dos mecanismos de formación diferentes. El Morbus Crohn en principio puede afectar a todo el tracto gastrointestinal (la localización más frecuente es en el final del intestino delgado, en el íleon terminal). Las alteraciones inflamatorias están ubicadas de manera circunscripta, en una mucosa por lo demás sana, y pueden cambiar con el tiempo. Las complicaciones más frecuentes son estrechamientos inflamados de trechos intestinales, así como formaciones de fístulas y abscesos. Las manifestaciones fuera del tracto gastrointestinal son posibles. En cambio, la colitis ulcerosa presenta una inflamación continua con ulceraciones superficiales, partiendo del final del intestino grueso (el recto). Según la gravedad, la colitis ulcerosa puede extenderse hacia arriba y finalmente, puede afectar a todo el intestino grueso. En un alto porcentaje de casos, también está inflamado el final del intestino delgado (ileítis de reflujo). Las complicaciones más importantes son limitaciones funcionales del intestino grueso con numerosas diarreas, hemorragias y úlceras en las mucosas y, con poca frecuencia, una inflamación drástica de toda la pared intestinal (megacolon tóxico). Se teme la frecuente generación de un carcinoma del intestino grueso, después del transcurso de la enfermedad durante muchos años. Sin embargo, entre ambas enfermedades intestinales inflamatorias crónicas existen transiciones fluctuantes entre los síntomas, de manera que con frecuencia es muy difícil distinguirlas.

Además de la terapia sintomática, frecuentemente insuficiente, en el caso de la colitis ulcerosa, debido al cuadro patológico complicado y grave y al peligro amenazante de un carcinoma, con frecuencia se debe extraer todo el intestino grueso. En este caso, a partir de la última curva del intestino delgado se forma un reservorio (saco), se coloca en el canal anal, se fija allí y se comunica con el ano natural, desobstruido por dentro. De esta manera, se crea un nuevo órgano receptor para el contenido intestinal con la obtención de una salida natural (creación de un saco ileoanal conservador de la continencia). En aproximadamente 30% de los pacientes con colitis ulcerosa se puede inflamar el saco (pouchitis) y puede conducir a considerables molestias. Si tal creación del saco se efectúa en el caso de otras enfermedades básicas (por ejemplo, poliposis adenomatosa familiar), en cambio, sólo en casos excepcionales se produce una inflamación.

El documento WO 95/18622 describe el uso de derivados del ácido 2-hidroxi-5-fenilazobenzoico como sustancia química protectora para el tratamiento de enfermedades cancerosas del colon.

El documento JP 61047418 A da a conocer medicamentos que entre otras cosas contienen lecitina, para el tratamiento de molestias gastrointestinales.

El documento WO 95/26646 A describe un producto alimenticio entérico que contiene lecitina de soja, para el tratamiento de la colitis ulcerativa.

FABIA, R. y col. (Digestion, 1992, tomo 53, páginas 35-44) describen un efecto terapéutico de la fosfatidilcolina en el tratamiento de ratas con colitis inducida por ácidos. MOURELLE, M y col. (Gastroenterology, 1996, tomo 110, páginas 1093-1097) describen el uso de fosfatidilcolina varias veces insaturada, para el tratamiento de estenosis intestinales.

El objetivo de la presente invención era proporcionar otros medicamentos para el tratamiento de enfermedades del intestino grueso.

Sorprendentemente, se halló que la fosfatidilcolina actúa como sustancia protectora de las mucosas del intestino grueso. La fosfatidilcolina recubre las células del intestino como película protectora y por ello es apta como principio activo terapéutico para el tratamiento de colitis ulcerosa, inflamación del saco ileoanal, otras inflamaciones del intestino grueso (Morbus Crohn, colitis diversificada, enteritis/colitis infecciosas, inflamaciones por radiación, antibióticos, quimioterápicos, fármacos o sustancias químicas), así como para la profilaxis del carcinoma del intestino grueso.

Fosfatidilcolina (PC) (como sinónimo también se usa el concepto lecitina) es un lípido compuesto que contiene fósforo (fosfolípido), de la siguiente fórmula estructural esquemática:

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Para el tratamiento de la colitis ulcerosa, de la inflamación del saco ileoanal y de las otras inflamaciones del intestino grueso antes nombradas, son aptas preparaciones orales de fosfatidilcolina con liberación selectiva o retardada del principio activo en el íleon inferior y en el colon y/o formas de administración rectales, por ejemplo, enema, supositorio o espuma. Para la profilaxis del carcinoma del colon, en particular, en el caso de la colitis ulcerosa, se prefiere la administración oral. Se puede efectuar la administración oral mediante formas farmacéuticas apropiadas, por ejemplo, como comprimidos o cápsulas que impidan la reabsorción desde los primeros dos tercios del intestino delgado y conduzcan a la liberación selectiva en el tramo inferior del intestino delgado.

Los medicamentos que contienen fosfatidilcolina pueden administrarse en forma local como forma de administración rectal (por ejemplo, supositorios, espuma o enemas), o también en forma oral. La administración de fosfatidilcolina se efectúa en el tramo inferior del intestino delgado y en el colon, ante todo, para proteger la mucosa del intestino grueso contra la infección bacteriana. Para la administración oral son especialmente apropiadas aquellas formas farmacéuticas que liberan el principio activo en forma retardada (las llamadas formas retard). El retardo se logra convenientemente mediante recubrimientos y/o matrices portadoras que son gastro-resistentes y liberan el principio activo, dependiendo del valor del pH, en el intestino delgado bajo y en el intestino grueso. Como recursos técnicos, son apropiados recubrimientos por película que por ejemplo, contienen polímeros acrílicos Eudragit®, para la liberación controlada del principio activo (por ejemplo, los productos con las marcas Eudragit® L y Eudragit® S de la empresa Röhm, Darmstadt).

Para la preparación de fosfatidilcolina administrable en forma oral, se usa una forma farmacéutica de liberación retardada para evitar la reabsorción en los tramos proximales del íleon. La fosfatidilcolina puede administrarse en cápsulas (por ejemplo, de gelatina) de gran volumen (por ejemplo, de 0,68 ml de contenido). Éstas, por ejemplo, están recubiertas por polímeros acrílicos, (por ejemplo, se usan los preparados Eudragit®, citados anteriormente). Una combinación de compuestos Eudragit® S y L (por ejemplo, Eudragit® L/S 100) confiere una liberación retardada a pH > 6,4, como el que existe en el íleon terminal. El uso de preparados de Eudragit® y sus mezclas (compuestos L, S y R) está establecido desde hace mucho tiempo. Además, es posible usar otros recubrimientos o formas de administración (también de desarrollo reciente) para la liberación en el íleon terminal, si se ofrecen como solución óptima.

Para la preparación de las enemas, se pueden disolver preparados de fosfatidilcolina (lecitina) en un disolvente lipófilo (por ejemplo, aceite de soja). La dosis que se ha de administrar, por ejemplo, asciende a 5-20 g en 100 ml de aceite de soja. Se pueden administrar 100 ml de la solución en forma rectal como enema. Además, se pueden usar formas de administración en forma de supositorios o preparaciones en espuma.

Los medicamentos conforme a la invención contienen fosfatidilcolina en una cantidad de efecto terapéutico, que alcanza para originar el efecto protector de la mucosa en el intestino grueso. El contenido de principio activo en la forma medicamentosa terminada asciende a 1 - 500 mg, preferentemente a 100 - 300 mg. Para la administración oral, como formas farmacéuticas apropiadas entran en consideración comprimidos, granulados, cápsulas, pellets o pastillas. Además, las formas farmacéuticas pueden contener aditivos farmacéuticos usuales, como coadyuvantes o vehículos. Para la administración rectal, en primer lugar, entran en consideración enemas, preparados en espuma, pomadas, geles, lociones y supositorios. Éstos contienen el principio activo en una cantidad de 10 mg - 10 g, preferentemente hasta 5 g. Según la gravedad de la enfermedad, se administran las formas farmacéuticas una o varias veces por día.

Además, se describe un procedimiento de diagnóstico para detectar enfermedades que van acompañadas por una secreción reducida de fosfatidilcolina hacia la luz del intestino como, por ejemplo, la colitis ulcerosa, la inflamación del saco ileoanal, en el caso de la colitis ulcerosa, o también la colitis diversificada. En este contexto, también se describe un procedimiento para la determinación de la concentración de fosfatidilcolina en el moco de la mucosa del colon, en el que, por ejemplo, se puede retirar la muestra que se ha de analizar, mediante un preparado de toque. A continuación, mediante un análisis químico apropiado de lípidos, por ejemplo, por espectrometría de masas, se determina la composición de los lípidos.

Sorprendentemente, se halló que como indicador del efecto protector de mucosas de la fosfatidilcolina que se encuentra en el moco del intestino, es de importancia diagnóstica la determinación de proteínas análogas a MDR3 [MDR = multi drug resistance (resistencia a drogas múltiples)]. La falta de proteínas análogas a MDR3 en el íleon terminal, en este contexto puede ser un indicador de una secreción insuficiente de fosfatidilcolina hacia la luz intestinal, con la consiguiente alteración de la composición del moco en el intestino grueso y susceptibilidad aumentada frente a bacterias allí existentes. La producción insuficiente de proteínas análogas a MDR3 entonces podría explicar la cantidad reducida de fosfatidilcolina en la luz del intestino. En el sentido de la presente invención, se podría demostrar que en el epitelio de la mucosa del íleon terminal o del saco ileoanal, en pacientes con colitis ulcerosa, no está presente ninguna proteína análoga a MDR3. Por esto, la secreción de fosfatidilcolina hacia la luz del intestino está notablemente reducida, lo que se demostró en experimentos de incubación con muestras de biopsias. Así, además se describe la detección de proteínas análogas a MDR3 para el diagnóstico de la colitis ulcerosa en el íleon terminal y en el epitelio del saco ileoanal. Esto también abarca todas las enfermedades que están acompañadas por una reducción del contenido de la proteína análoga a MDR3.

A partir de la correlación entre la concentración o la cantidad de proteínas análogas a MDR3 también pueden sacarse conclusiones acerca de la cantidad óptima necesaria de fosfatidilcolina en el transcurso de la terapia con los medicamentos conforme a la invención. El diagnóstico así posibilita una adaptación individual de la dosis necesaria de fosfatidilcolina para los pacientes que se han de tratar. Además, la determinación de la fosfatidilcolina en la luz del intestino posibilita un control importante del transcurso de la terapia, en cuanto a la complacencia del paciente.

La determinación de las proteínas análogas a MDR3 se efectúa de manera indirecta mediante el aumento en RT-PCR del RNA que codifica estas proteínas (información genética).

La proteína o las proteínas MDR3 son transportadoras de fosfolípidos en membranas plasmáticas. La familia de genes humanos de MDR (P-glucoproteína) está compuesta por dos miembros (MDR1 y MDR3). Desde el punto de vista de la historia del desarrollo, pertenecen a la muy antigua superfamilia de los transportadores ABC (módulo enlazante de ATP). Estas proteínas transportan diferentes sustratos (moléculas hidrófobas, oxianiones, Cl^{-}, entre otros) desde el interior de la célula, a través de la membrana plasmática, hacia afuera, gastando energía (ATP). Los dos genes homólogos de MDR están ubicados uno tras otro en el genoma (el de MDR3 está aproximadamente a 30 kilobases corriente abajo respecto al de MDR1) y juntos abarcan aproximadamente 230 kilobases. Ambos genes están compuestos respectivamente por 28 exones de los que 27 contienen la región codificante en MDR3. Del gen de MDR3 se conocen cuatro variantes de empalme, de las que cada una deja intacto el módulo de lectura. En la variante C^{-141} falta todo el exón 23 y así conduce a una región codificante acortada en 141 nucleótidos. El exón 23 contiene el dominio transmembránico 11. Una falta podría conducir a una proteína con topología de membrana completamente diferente. En tejidos que expresan MDR3, la transcripción normal y sus variantes en la mayoría de los casos están presentes en igual abundancia.

El producto del gen de MDR1 es responsable por la resistencia contra diversos citostáticos y dio su nombre a la familia: multi drug resistance [resistencia a drogas múltiples (MDR)]. MDR3 es una bomba de descarga de las más diversas sustancias lipófilas, dependiente de la energía, localizada en la membrana, de un tamaño de 170 KD. Como en el caso de otros miembros de los transportadores ABC, MDR1 está compuesto por dos mitades homólogas, cada una con seis dominios transmembránicos y un sitio de enlace de nucleótidos. MDR3, en cuanto a la estructura está construido en forma igual, pero tiene tanto un modelo distinto de distribución, específico del tejido, como también otra función, porque no conduce a la resistencia a drogas múltiples. En ratones, en los que se suprimió el gen específico de ratones (mdr2) correspondiente (modelo de noqueo de ratón), se halló una completa incapacidad del hígado de secretar fosfatidilcolina en la bilis. Se sacó la conclusión de que también la P-glucoproteína de MDR3 es responsable del transporte de fosfatidilcolina desde la célula hepática hacia la bilis. Acerca de la existencia de MDR3 en el tracto gastrointestinal restante hasta ahora no se ha informado en la bibliografía.

Ejemplo 1

Determinación de proteínas análogas a MDR3 mediante el ARN de MDR3 en el tracto gastrointestinal, mediante RT-PCR

Para el examen de una posible expresión se sintetizaron cebadores para la amplificación de transcripciones específicas de MDR3. La meta del diseño del cebador es amplificar el segmento de ADN deseado, en forma específica y eficiente. Para garantizar la especificidad, se seleccionan las secuencias del cebador en ámbitos de la secuencia del ADNc de MDR3, en los que MDR3 y MDR1 presentan una baja homología. Aquí los cebadores que presentan una alta homología respecto a MDR1, pero cuya base 3'-terminal se diferencia de la secuencia de ADNc de MDR1, también son específicos de MDR3. Para asegurar una amplificación eficaz del fragmento deseado de ADN, además se deben tener en cuenta otros factores. Se debe seleccionar de tal manera la secuencia del cebador, que los cebadores no sean capaces de formar estructuras en bucle a través de uniones intramoleculares por puentes de hidrógeno, ni de formar dímeros a través de uniones intermoleculares. La longitud de los oligonucleótidos preferentemente asciende a 20 hasta 25 pares de bases. El contenido según CG debería encontrarse en el intervalo de 50 a 60%. Los dos cebadores del par de cebadores, en lo posible deberían encontrarse el diferentes exones, para que se pudiera excluir o reconocer una amplificación de ADN genómico en la PCR.

Se eligieron secuencias de cebador que posibilitaran una amplificación fiable y específica de secuencias de MDR3. En la figura adjunta (figura 1, MDR1 frente a MDR3) están marcados correspondientemente con flechas ejemplos de cebadores apropiados que son específicos para MDR3.

Leyenda de la figura 1:

Homología entre las secuencias de ADNc de MDR1 y MDR3. La línea superior muestra respectivamente la secuencia de MDR1, la línea inferior la secuencia de MDR3. Las bases idénticas están marcadas por rayas verticales entre las secuencias. Las secuencias de las que se pueden derivar cebadores están impresas en negrilla; la orientación de los cebadores está indicada por flechas (5'- - - \rightarrow 3' o 3' \leftarrow - - - - 5')

Ejemplo de una PCR representativa, específica de MDR3

Como cebador 5' se selecciona un oligonucleótido del tamaño de 25 pares de bases, desde el par de bases 2411 al 2435 del ADNc en el exón 20. El cebador 3' es un oligonucleótido del tamaño de 33 pares de bases, desde el par de bases 3180 al 3148 y está en el exón 25. El producto de PCR que se forma de este modo tiene 769 pares de bases. Con este par de cebadores también se puede detectar la variante de empalme C^{-141} en el ARN, ya que aquí falta el exón 23 y así el producto de PCR que se forma está acortado en 141 pares de bases. Como material de partida para el aislamiento del ARN se usan biopsias que se produjeron en gastroscopías o coloscopías. Se usan respectivamente 2 biopsias de un paciente para aislar el ARN con el kit Fast-RNA de la empresa Dianova. Las cantidades de ARN total que se aíslan con éste ascienden a hasta 70 \mug. Se puede prescindir de un aislamiento de Poli (A^{+})RNA, ya que la cantidad de transcripción en el ARN total ya alcanza para una detección por PCR.

Se usan 5 \mug de ARN total para una síntesis de un primer cordón de ADNc. La síntesis de ADNc y la PCR se efectúan con el sistema Ready ToGo (Pharmacia), según las recomendaciones del fabricante. Se transcriben 5 \mug de ARN total en forma inversa en ADNc. La PCR se realiza con 2 de 33 \mul de ADNc y 10 pmoles de cada cebador, en un volumen total de 25 \mul. La amplificación se efectúa de la siguiente manera: una vez durante 5 minutos a 94ºC, a continuación, 33 ciclos de 2 s a 94ºC, 2 s a 55ºC y 45 s a 72ºC. Se analizan los productos de la RT-PCR mediante electroforesis en agarosa. Se ensayan las condiciones para una detección exitosa de MDR3 con ARN de hígado, ya que aquí existe una especial abundancia de transcripciones. Como patrón interno, se amplifica GAPDH (glicerina-aldehído-fosfato-dehidrogenasa) para poder comparar la cantidad de ADNc en las diferentes preparaciones. La metodología usada también es apta para la tecnología "Light Cycler" (de Roche Diagnostics GmbH) o la tecnología de PCR "Taq Man" (Perkin Elmer Applied Bio-Systems), en la que se puede determinar una gran cantidad de muestras al mismo tiempo, en forma rápida y (semi)cuantitativa.

Se analizan biopsias del esófago, estómago, duodeno, íleon terminal, colon transversal y recto. En pacientes sanos se pudieron detectar transcripciones de MDR3 en el estómago, el duodeno y en el íleon terminal, mientras que faltaban en el esófago, en el colon transversal y en el recto.

La preparación citada precedentemente también siempre se amplifica junto con la misma cantidad de variante de empalme C^{-141}. Ambos productos de PCR entonces fueron clonados en el puc18 y agregados por secuenciación. De esta manera se pudo documentar que en el caso de las secuencias amplificadas realmente se trata de MDR3. En principio, mediante el procedimiento descrito precedentemente también es posible detectar otras proteínas homólogas en el íleon, además de la proteína análoga a MDR3, específica del órgano, pudiéndose tratar, en el caso de estas otras proteínas homólogas, por ejemplo, de formas iso de la proteína análoga a MDR3 (por ejemplo, la forma iso de la proteína MDR3 del hígado o del intestino)

Ejemplo 2 Expresión de proteínas análogas a MDR3 (ARN) en el epitelio del saco ileoanal

Se examinaron pacientes a los que, debido a una colitis ulcerosa avanzada, se tuvo que extraer el colon y que recibieron un saco ileoanal. En ninguno de estos pacientes de colitis ulcerosa se pudieron detectar transcripciones de análogos de MDR3 en la mucosa del saco. Por ello, se planteó la pregunta de si la falta de las transcripciones se debía al hecho de que se trataba de pacientes con colitis ulcerosa. También sería imaginable que por la creación de un saco en sí y el medio bacteriano modificado que lo acompaña, para el íleon terminal podría haberse presentado un modelo de expresión modificado. Por ello, para comparar se examinaron pacientes que recibieron un saco ileoanal, después de que se les extrajera el colon por poliposis adenomatosa familiar (FAP). Estos pacientes presentaban transcripciones de MDR3 en el saco. Esto señalaba que la falta de MDR3 en el saco es específica de la colitis ulcerosa. La secreción reducida de fosfatidilcolina hacia el moco, condicionada posiblemente por esto, podría provocar la inflamación observada del saco. Como la mucosa del saco corresponde a la del íleon terminal, la conclusión correcta sería que en la colitis ulcerosa en este tramo del intestino delgado también debería faltar la MDR3.

Ejemplo 3 Expresión de proteínas análogas a MDR3 (ARN) en el íleon terminal en personas sanas, pacientes con Morbus Crohn y con colitis ulcerosa

Se examinó si pacientes con colitis ulcerosa presentan expresión de análogos de MDR3 en el íleon terminal. Se analizaron 31 pacientes con colitis ulcerosa y se compararon con 14 personas sanas y con 6 pacientes con Morbus Crohn.

En ninguno de los pacientes con colitis ulcerosa se pudo detectar ARN de análogos de MDR3 en el íleon terminal mediante la técnica altamente sensible usada, mientras que en todas las personas sanas de control y en los pacientes con Morbus Crohn se pudo detectar. Este resultado unívoco señala que exclusivamente en el caso de la colitis ulcerosa existe un defecto en la expresión de análogos de MDR3. De esto se puede sacar la conclusión de que en estos pacientes existe una secreción perturbada de fosfolípidos en el intestino, que altera de tal manera la composición del moco, que las bacterias puedan atacar más fácilmente al epitelio.

Claims (3)

1. Uso de fosfatidilcolina para la preparación de medicamentos con efecto protector de las mucosas en el intestino grueso, para la administración rectal o para la administración oral con liberación retardada del principio activo en el íleon inferior o en el colon, para el tratamiento de colitis ulcerosa, inflamación del saco ileoanal (pouchitis), enfermedades del intestino grueso o inflamaciones en el intestino grueso como Morbus Crohn, colitis diversificada, enteritis/colitis infecciosas, inflamaciones por radiaciones, antibióticos, quimioterápicos, fármacos o sustancias químicas, o para el tratamiento o la profilaxis del carcinoma del intestino grueso.

2. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque se efectúa la administración rectal para el tratamiento local de inflamaciones en el recto o en el saco ileoanal.

3. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque la administración oral se efectúa con un contenido de principio activo de 1 - 500 mg por forma farmacéutica terminada.