CN113368089B - 新型冠状病毒的抑制剂 - Google Patents

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    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses

Abstract

本发明涉及医药领域，特别涉及新型冠状病毒的抑制剂。本申请人研究结果表明，枸橼酸铋钾(Bismuth Potassium Citrate,BPC)(以下简称BPC)抑制SARS‑CoV‑2感染。进一步的研究结果表明，SARS‑CoV‑2 nsp13在体外具有解旋酶活性，进一步显示BPC能在体外抑制nsp13的解旋活性，继而确定BPC能在细胞水平抑制SARS‑CoV‑2复制。进一步的，枸橼酸铋钾能够在动物水平以及临床实验中，有效抑制SARS‑CoV‑2复制，并能够预防和/或治疗SARS‑CoV‑2感染引起的疾病。

Description

新型冠状病毒的抑制剂
技术领域
本发明涉及医药领域，特别涉及新型冠状病毒的抑制剂。
背景技术
冠状病毒是一大类有包膜的单股正链非节段RNA病毒，属于冠状病毒科， 广泛分布于人类和其它哺乳动物。在过去20年，冠状病毒造成了2次大规模 流行，其中2003-2004年暴发严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)感 染疫情；2012-2014年暴发中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)感染疫情。 SARS-CoV的致死率为9％，MERS-CoV致死率为36％。
SARS-CoV-2感染所造成的新型冠状病毒疾病(Covid-19)其症状范围很 广，从轻微的感冒发烧，到呼吸道综合症、肺炎、全身多器官衰竭甚至死亡。 目前，尚无针对冠状病毒及2019-nCoV的特效治疗药物。
对于包括冠状病毒在内的RNA病毒，其在被感染的宿主细胞内复制增殖 均需要病毒编码的RNA解旋酶的参与。冠状病毒的非结构蛋白nsP13具有 RNA解旋酶活性，是经典的超家族1(SF1)解旋酶。大量针对SAR-CoV及 MERS-CoV冠状病毒的研究证明nsP13的解旋酶活性对冠状病毒的复制增殖 是必需的，因此针对其解旋酶为靶标设计或筛选药物，是研发抗冠状病毒药 物的理想策略之一。2019-nCoV解旋酶与SARS-CoV解旋酶的氨基酸序列相似性大于99％，且其解旋酶活性核心区完全保守。这一超保守性的特点凸显 了解旋酶对SARS-CoV-2及SARS-CoV等冠状病毒的极度重要性。
目前用于临床的含有枸橼酸铋的药物包括枸橼酸铋钾(Bismuth PotassiumCitrate,BPC)。BPC具有治疗胃及十二指肠溃疡的作用，其发挥作用的区域 为消化系统。此次SARS-CoV-2感染引起的症状之一为胃肠道不适、腹泻； 且在多家医院的救治、诊断及研究中发现，许多感染SARS-CoV-2的患者在 其肛拭子及粪便中能检测到大量病毒，约30％患者只能从肛拭子而非咽拭子 检测出SARS-CoV-2。值得警惕的是，部分患者治愈后，尽管咽拭子核酸诊断 为阴性，而肛拭子却能持续检测出SARS-CoV-2，表明SARS-CoV-2持续存在于患者肠道系统中并持续排毒，有可能在出院后通过粪口途径继续造成周围 健康人群的感染。因此，人类消化系统也是SARS-CoV-2感染、复制及致病 的重要区域，应该引起极大重视。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了新型冠状病毒的抑制剂。本发明研究结果表明， SARS-CoV-2 nsp13在体外具有解旋酶活性，进一步显示枸橼酸铋钾能在体外 抑制nsp13的解旋活性，继而确定BPC能在细胞水平抑制SARS-CoV-2复制。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了枸橼酸铋钾在制备抑制冠状病毒nsP13的解旋活性的制剂 中的应用。SARS-CoV-2与SARS-CoV的nsP13解旋酶的氨基酸相似性>99％， 且其解旋酶活性核心区与ZBD区完全保守。这一超保守性的特点凸显了解旋 酶对nCoV及SARS-CoV的极度重要性。
在本发明的一些具体实施方案中，所述冠状病毒为包括严重急性呼吸综 合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)或新 型冠状病毒(SARS-CoV-2)。
在本发明的一些具体实施方案中，所述冠状病毒的感染细胞为Vero E6 细胞。
本发明还提供了枸橼酸铋钾在制备抑制冠状病毒感染的制剂中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述冠状病毒为包括严重急性呼吸综 合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)或新 型冠状病毒(SARS-CoV-2)。
在本发明的一些具体实施方案中，所述冠状病毒的感染细胞为Vero E6 细胞。
在本发明的一些具体实施方案中，枸橼酸铋钾的半数有效浓度EC50为 5.56μM。
本发明还提供了枸橼酸铋钾在制备预防和/或治疗冠状病毒感染疾病的药 物中的应用。
在本发明的一些具体实施方案中，所述冠状病毒为包括严重急性呼吸综 合征冠状病毒(SARS-CoV)、中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)或新 型冠状病毒(SARS-CoV-2)。
在本发明的一些具体实施方案中，所述冠状病毒的感染细胞为Vero E6 细胞。
在本发明的一些具体实施方案中，所述药物的给药途径包括口服给药或 呼吸道给药；所述呼吸道给药包括雾化、喷雾或呼吸道冲洗。
本申请人研究结果表明，枸橼酸铋钾(Bismuth Potassium Citrate,BPC) (以下简称BPC)抑制SARS-CoV-2感染。研究结果表明，SARS-CoV-2nsp13 在体外具有解旋酶活性，进一步显示BPC能在体外抑制nsp13的解旋活性， 继而确定BPC能在细胞水平抑制SARS-CoV-2复制。进一步的，枸橼酸铋钾 能够在动物水平以及临床实验中，有效抑制SARS-CoV-2复制，并能够预防 和/或治疗SARS-CoV-2感染引起的疾病。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示表达纯化融合MBP标签的SARS-CoV-2nsp13蛋白；
图2示MBP-nsp13具有解旋活性；
图3示BPC能够以浓度依赖的方式抑制nsp3的解旋酶活性；
图4示检测BPC的细胞毒性；
图5示在Vero E6细胞中检测BPC对SARS-CoV-2的抑制效率。
具体实施方式
本发明公开了新型冠状病毒的抑制剂，本领域技术人员可以借鉴本文内 容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对 本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的 方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发 明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合， 来实现和应用本发明技术。
本发明提供的新型冠状病毒的抑制剂中所述原料及试剂均可由市场购 得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1：SARS-CoV-2nsp13蛋白表达纯化
1.实验材料
大肠杆菌BL21，LB培养基、IPTG、麦芽糖结合蛋白(MBP)填料购自英 潍捷基公司。
2.实验过程
(1)取50μl保藏菌液接入500μl LB培养基，摇菌活化4-6h，按1:100 转接，大量诱导250ml，180rpm，37℃2-3h后OD值处于0.5-0.6之间时，室 温冷却10min，加入1mM IPTG(终浓度)，22℃、150rpm过夜(16-6h)诱 导表达，离心集菌。
(2)超声破碎(350W、30-60min)至透明，分装至2.5ml离心管中，12000g、 15min、4℃离心，取上清至15ml离心管中，置于冰上。
(3)准备填料：取2-3ml MBP填料加入洗涤过的柱子中，自然沉降，利 用恒流泵缓慢流出20％乙醇，用恒流泵缓慢加入10倍体积的去离子水水洗涤， 再用10倍体积PBS换体系，注意不要流干，流干会出现缝隙，泵速300。
(4)蛋白结合：将上清上柱(上清要放在冰上)，泵速60-130，收集液 再次上柱。
(5)10倍体积PBS洗涤(泵速120-300)。
(6)洗脱蛋白，收集目的蛋白(大概收集8-10ml即可)。
(7)纯化后的蛋白样品进行SDS-PAGE电泳。
结果如图1所示，成功纯化出带有MBP标签的SARS-CoV-2nsp13蛋白， MBP为对照。
实施例2：SARS-CoV-2nsp13具有解旋活性
1.实验材料
MBP-nsp13蛋白，HEX荧光标记的42nt长RNA单链、与HEX标记RNA 链互补的长为54nt的RNA单链。
2.实验过程
(1)用浓度为0.2pmol/μl的HEX标记链，加入相同浓度的互补链RNA， 通过退火制备具有HEX标记的双链dsRNA底物。
(2)退火过程：反应体系在75℃3min，以每分钟降低1℃的速率使反 应体系温度降至25℃，25℃2min。
(3)按照标准的解旋实验反应体系将目的蛋白与双链底物配好。并且设 置好单双链对照。单链需75℃煮样，3min，冰上2min。
(4)将配好的体系混匀后，放置于37℃，反应50min。
(5)将反应后的混合物进行电泳。
(6)最后利用Typhoon 9500直接扫描，得到HEX信号。
在电泳过程中，单链电泳速度比双链快。因此，如果MBP-nsp13蛋白具 有解旋酶活性，其能打开双链dsRNA底物，释放单链RNA，则该泳道会呈现 上下两条带。75℃煮样制成的单链RNA(泳道2)作为阳性对照。未加入蛋 白反应(泳道1)或只加入MBP蛋白(泳道3)为阴性对照。如图2泳道4 所示，MBP-nsp13能够解开双链dsRNA底物，表明SARS-CoV-2nsp13具有解旋酶活性。
实施例3：BPC抑制SARS-CoV-2nsp13解旋活性
1.实验材料
枸橼酸铋钾胶囊，BPC，丽珠集团丽珠制药厂，国药准字H10920098。 MBP-nsp13蛋白，HEX荧光标记的42nt长RNA单链、与HEX标记RNA链 互补的长为54nt的RNA单链。
2.实验过程
(1)用浓度为0.2pmol/μl的HEX标记链，加入相同浓度的互补链RNA， 通过退火制备具有HEX标记的双链dsRNA底物。
(2)退火过程：反应体系在75℃3min，以每分钟降低1℃的速率使反 应体系温度降至25℃，25℃5min。
(3)按照标准的解旋实验反应体系将目的蛋白与双链底物配好，并分别 加入0μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM的BPC。并且设置好 单双链对照。单链需75℃煮样，3min，冰上2min。
(4)将配好的体系混匀后，放置于37℃，反应50min。
(5)将反应后的混合物进行电泳。
(6)最后利用Typhoon 9500直接扫描，得到HEX信号。
以加入0μM BPC的解旋效率为100％，如图3、表1所示，BPC能够抑 制nsp13的解旋活性，并且其抑制效果是浓度依赖的。
表1
Figure BDA0002391469650000061
实施例4：BPC细胞毒性测定
1.实验材料
枸橼酸铋钾胶囊，BPC，丽珠集团丽珠制药厂，国药准字H10920098。
Vero E6细胞。DMEM培养基(Thermo)，血清(Gibco)购自英潍捷基 公司CCK-8试剂(MCE)购自启动子公司。
2.实验过程
检测BPC对细胞的毒性。因此通过细胞毒性测试来检测这一指标，以未 做任何处理的细胞为对照组。
步骤如下：
(1)用Vero E6细胞铺96孔细胞板，每孔5×104个细胞。
(2)待其长到70％-80％融合度时将含有10％血清的DMEM培养基换成 含2％血清的DMEM培养基，加入BPC，使得孔中最终的BPC浓度分别为0 μM、2.441μM、4.883μM、9.766μM、19.531μM、39.063μM、78.125μM、 0.15625mM、0.3125mM、0.625mM、1.25mM、2.5mM、5mM、10mM。
(3)加入BPC后收样，每孔中加入10μl活细胞检测剂CCK-8，混匀。
(4)37度放置2小时。
(5)用酶标仪检测OD450的吸光度值。
结果如图4、表2所示，以未处理细胞(0μM)的细胞活力为100％，计 算其半数细胞毒性浓度CC50＞10mM。
表2
Figure BDA0002391469650000071
实施例5:BPC抑制病毒效率的测定
1.实验材料
Total RNA提取试剂盒(Takara)、48孔板、100mm皿、50ml注射器购 自迪跃创新公司，0.22μm的滤膜(Millipore)购自飞羿公司，One step qRT-PCR 试剂盒(Takara)购自友名公司，提取RNA及qRT-PCR过程中使用的水为DEPC 水，整个实验在RNase Free环境中进行。
2.实验过程：
(1)用Vero E6细胞铺48孔细胞板，每孔1×105个细胞。
(2)待其长到70％-80％融合度时，将含有10％血清的DMEM培养基换 成含2％血清的DMEM培养基，每孔加入5μl 10^5PFU/mL SARS-CoV-2病 毒。
(3)1h后，弃病毒上清，用无血清DMEM清洗细胞2次。分别加入终 浓度为5μM、10μM、20μM、40μM、60μM、80μM、100μM的BPC。未 加药组为对照。
(4)病毒感染24h后收取每一孔上清，用total RNA提取试剂盒提取 RNA。
(5)向孔中加入350μl裂解液，放到摇床上5min。
(6)再向孔中加入200μl无水乙醇，放到摇床上5min。
(7)取出孔中溶液转移至RNA提取柱子中，12000g离心1min。
(8)将回收管中的溶液重新上一次柱子，12000g离心1min。
(9)加入RNA washing buffer 1，12000g离心30s。
(10)加入RNA washing buffer 2，12000g离心1min。
(11)空离柱子12000g，2min，以完全去除残余RNA washing buffer。
(12)加50μl DEPC水，12000g离心2min。
(13)取5μl RNA样品，用one step qRT-PCR试剂盒进行荧光定量实验。 以已知拷贝数的阳性对照为标曲，得到每孔RNA拷贝数。
计算不同浓度BPC的抑制效率，计算公式为：病毒抑制率＝(1-药物孔 RNA拷贝数/对照孔RNA拷贝数)×100％。如图5、表3所示，BPC能在Vero E6细胞上抑制SARS-CoV-2的复制，半数有效浓度EC50为5.56μM。
表3
Figure BDA0002391469650000081
Figure BDA0002391469650000091
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.枸橼酸铋钾在制备抑制冠状病毒nsP13的解旋活性的制剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述冠状病毒为新型冠状病毒。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述冠状病毒的感染细胞为Vero E6细胞。
4.枸橼酸铋钾在制备抑制冠状病毒感染的制剂中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述冠状病毒为新型冠状病毒。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述冠状病毒的感染细胞为Vero E6细胞。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，枸橼酸铋钾的半数有效浓度EC50为5.56 μM。
8.枸橼酸铋钾在制备预防和/或治疗冠状病毒感染疾病的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述冠状病毒为新型冠状病毒。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物的给药途径包括口服给药或呼吸道给药；所述呼吸道给药包括雾化、喷雾或呼吸道冲洗。
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