ES2205946T3

ES2205946T3 - Utilizacion de una proteina ompa de enterobacteria, para el apuntado especifico hacia las celulas presentadoras de antigenos.

Info

Publication number: ES2205946T3
Application number: ES99971719T
Authority: ES
Inventors: Jean-Yves Bonnefoy; Sybille Lecoanet; Jean-Pierre Aubry; Pascale Jeannin; Thierry Baussant
Original assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Current assignee: Pierre Fabre Medicament SA
Priority date: 1998-11-06
Filing date: 1999-11-08
Publication date: 2004-05-01
Anticipated expiration: 2019-11-08
Also published as: AU1164100A; AU764205B2; EP1124577B1; FR2785542B1; WO2000027432A1; CA2350183A1; JP2002529428A; DK1124577T3; BR9915071A; DE69910809D1; DE69910809T2; CN1181890C; FR2785542A1; ZA200103478B; EP1124577A1; CN1326360A; ATE247978T1; PT1124577E

Abstract

Utilización de una proteína OmpA de enterobacteria o de uno de sus fragmentos en asociación con una sustancia biológicamente activa cuya eficacia es modulada y/o ligada a la internalización de la OmpA en las células presentadoras de antígenos, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a prevenir o a tratar los cánceres, preferentemente los cánceres asociados a un antígeno tumoral, las enfermedades auto-inmunes, las alergias, los rechazos de injertos, las enfermedades cardiovasculares, las enfermedades del sistema nervioso central, las enfermedades inflamatorias, las enfermedades infeccionsas o las enfermedades ligadas a una inmunodeficiencia.

Description

Utilización de una proteína OmpA de enterobacteria, para el apuntado específico hacia las células presentadoras de antígenos.

La presente invención se refiere a la utilización de una proteína OmpA de enterobacteria, preferentemente la proteína P40 Klebsiella pneumoniae, en asociación con una sustancia biológicamente activa cuya eficacia es modulada y/o ligada a la internalización de la OmpA en las células presentadoras de antígenos, en particular las células dendríticas humanas, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a la prevención y/o el tratamiento de enfermedades, en particular los cánceres asociados a un antígeno tumoral, las enfermedades auto-inmunes o las enfermedades infecciosas.

La vacunación es un medio eficaz de prevenir o reducir las infecciones virales o bacterianas. El éxito de las campañas de vacunación en este campo ha permitido extender el concepto de vacuna a otros campos como el del cáncer y el de las enfermedades auto-inmunes. Por ejemplo, en lo que concierne a ciertas formas de cáncer, la ineficacia de terapias clásicas y/o sus efectos secundarios, como la quimio- o la radioterapia, ha motivado la búsqueda de terapia alternativa. Así, los antígenos tumorales específicos expresados en la superficie de las células tumorales pueden ser utilizados como diana en inmunoterapia para la eliminación de estas células. Uno de los principales problemas corrientemente encontrado para la preparación de estas vacunas, es que los antígenos vacunantes cuando son administrados solos en el huésped, no son bastante inmunogénicos para inducir una respuesta inmunitaria suficientemente eficaz para conferir la protección buscada. A menudo, estos antígenos son acoplados de forma covalente a una molécula portadora, como por ejemplo, un epítopo de la toxina diftérica, la anatoxina tetánica (TT), un antígeno de superficie del virus de la hepatitis B, el antígeno VP1 del virus de la poliomelitis o cualquier otra toxina o antígeno viral o bacteriano tal como las proteínas antigénicas salidas de la membrana externa de enterobacteria que tiene la propiedad de potenciar la respuesta inmunitaria (humoral y celular) del antígeno que le está asociado como la proteína OmpA denominada P40 salida de Klebsiella pneumoniae (descrita en las solicitudes internacionales de patente WO 95/27.787 y WO 96/14.415). Sin embargo, en la mayor parte de los casos ha resultado necesario otro componente para aumentar la eficacia de la vacuna y, actualmente, el único adyuvante autorizado en el hombre es el Alum.

Gracias a la inmunología, recientemente se ha descubierto que las células dendríticas (CD) desempeñaban una función principal en el sistema inmunitario. Estas células, derivadas de las células cepas de la médula ósea, son unas células presentadoras de antígenos profesionales implicadas en la respuesta inmune primaria específica de un antígeno (Peters J. et al. 1996). Las mismas ingieren o internalizan los antígenos y presentan los fragmentos de estos antígenos a unas células T simples. Esta ingestión induce a la superficie de las células dendríticas la expresión de moléculas de co-estimulación, tales como el CD80 y el CD86. Estas moléculas permiten una interacción estrecha con las células T (Girolomoni G y Ricciardi-Castagnoli P., 1997, Immunol. Today, 18. 102-104). Las células dendríticas están distribuidas de manera difusa en los tejidos. Las mismas se encuentran de nuevo a los niveles de la piel y de los órganos linfoides (Hinrich J. et al., 1996, Immunol. Today 17, 273-277).

Gracias a su eficacia para presentar los antígenos y para estimular el sistema inmunitario, las células dendríticas han sido utilizadas para generar respuestas citotóxicas CTL anvirales (Ludewig B. et al., 1998, J. Virol, 72, 3812-3818: Brossard P. et al., 1997, J. Immunol., 158, 3270-3276) o anticancerosos (Nestle F.O. et al., 1998, Nat. Med., 4, 328-332). Las aproximaciones han consistido en cargar las células dendríticas ex vivo con el antígeno de interés (péptidos o lisado celular) y reimplantar estas células en el paciente. Otras aproximaciones consisten en transfectar ex vivo las células dendríticas con el gen que codifica para el antígeno de interés y en reinyectar estas células transfectadas (Gilboa E., et al, 1998, Cancer Immunol. Immunother, 46, 82-87). Estas aproximaciones han sido utilizadas con éxito en ratas y, recientemente, en el hombre (Hsu F.J. et al, 1996, Nat. Med., 2, 52-58). Las células dendríticas cargadas en antígenos presentan los péptidos promedio de moléculas de clase I o II e inducen la activación de los linfocitos T CD4 o CD8+. Por consiguiente, la posibilidad de dirigir los antígenos designados, tales como unas proteínas o unos polisacáridos, o unos vectores virales capaces de transferir unos genes que codifican para estos antígenos hacia las células dendríticas permitiría mejorar la eficacia de la estimulación del sistema inmunitario. Además, el apuntado específico de las células presentadoras de antígenos (CPA), en particular las células dendríticas, permitiría evitar las etapas de extracción, de purificación, de tratamiento ex vivo de células CPA autologas o heterologas con los antígenos tumorales o los vectores virales y la reimplantación de las células CPA tratadas.

A fin de apuntar específicamente las células dendríticas con las sustancias activas de interés, como las proteínas o los vectores virales capaces de transferir unos genes que codifican para estas proteínas de interés, numerosos trabajos han consistido en identificar unas moléculas que se fijarían preferentemente sobre las células dendríticas o unos receptores que serían expresados específicamente sobre las células dendríticas. Un receptor DEC 205 implicado en la toma a cargo del antígeno ha sido identificado sobre unas células dendríticas murinas (Jiang W. et al, 1995, Nature, 375, 151-155) y humanas (Kato M. et al., 1998, Immunogenetics, 47, 442-450). El análisis de la estructura de este receptor pone en evidencia unos campos de reconocimiento de hidratos de carbono que estarían implicados en la captura, la internalización y/o la presentación de antígenos que llevan unos residuos de hidratos de carbono. Sin embargo, los autores no dan ninguna información sobre los ligandos que pueden ser fijados por este receptor. Por otra parte, los autores mencionan que los campos de reconocimiento de hidratos de carbono del receptor DEC-205 que estarían implicados en la captura, la internalización y/o la presentación de antígenos (campos ricos en cisteína) también están presentes en más de 50 proteínas de las que algunos son receptores celulares.

También se puede citar la solicitud de patente publicada bajo el número WO 96/14.415 que sugiere que el efecto adyuvante de la proteína OmpA P40 de Klebsiella pneumoniae estaba ligada al reconocimiento específico de sus secuencias por las células presentadoras de antígenos y permitiría apuntar unos antígenos hacia estas células.

Así, existe actualmente una necesidad de disponer de un compuesto capaz de apuntar específicamente una célula presentadora de antígeno (CPA), en particular una célula dendrítica y que, además, sea capaz de ser internalizada por dicha célula. Un compuesto de este tipo capaz de fijarse específicamente sobre estas células y después de ser internalizado, tendría como ventaja poder ser utilizado como compuesto para el transporte y el apuntado de sustancia biológicamente activa cuya eficacia está modulada y/o ligada a la fijación y/o internalización de esta sustancia por estas células. Por otra parte, sería ventajoso que este compuesto buscado pueda ser fácilmente asociado a la sustancia activa por acoplamiento químico, por acoplamiento resultante de una fusión genética o puede ser expresado en la superficie de la célula huésped o también en la superficie de una partícula viral para la transferencia de gen de interés a estas células CPA.

Los autores de la presente invención han puesto en evidencia de forma sorprendente que una proteína de la membrana externa de tipo OmpA de enterobacteria, en particular la proteína P40 de Klebsiella pneumoniae, es capaz no solamente de fijarse específicamente sobre una célula CPA sino también capaz de ser internalizada por dicha célula CPA, en particular por una célula dendrítica.

Así, la presente invención se refiere a la utilización de una proteína OmpA de enterobacteria o de uno de sus fragmentos en asociación con una sustancia biológicamente activa cuya eficacia está modulada y/o ligada a la internalización de la OmpA en las células presentadoras de antígenos para la preparación de una composición destinada a prevenir o a tratar los cánceres, preferentemente los cánceres asociados a un antígeno tumoral, las enfermedades auto-inmunes, las alergias, los rechazos de injertos, las enfermedades cardiovasculares, las enfermedades del sistema central nervioso, las enfermedades inflamatorias, las enfermedades infecciosas o las enfermedades ligadas a una inmunodeficiencia.

Por células presentadoras de antígenos, se entenderá designar en la presente invención las células CPA profesionales que forman parte integrante del sistema inmunitario tales como las células dendríticas, los macrofagos, los linfocitos B o los monocitos.

En la presente invención, se entenderá designar también por el térmico "proteína" los péptidos o los polipéptidos y por el término "OmpA" ("Outer Membrane Protein") las proteínas de la membrana externa de tipo A.

Por fragmento de una proteína OmpA se entiende designar cualquier fragmento de secuencia de ácidos aminados comprendida en la secuencia de ácidos aminados de la proteína OmpA capaz de fijarse específicamente sobre las células CPA, en particular las células dendríticas y que comprenden por lo menos 5 ácidos aminados, preferentemente 10 ácidos aminados o, de forma más preferida 15 ácidos aminados, siendo además dichos fragmentos capaces de ser internalizados en dichas células CPA.

Por "sustancia biológicamente activa" se entiende designar cualquier compuesto capaz de ejercer una actividad terapéutica y cuya actividad puede ser modulada por medio de las células CPA. Como ejemplo de dichas sustancias biológicamente activas se pueden citar, pero sin limitarse a las mismas, los compuestos inmunógenos tales como unos antígenos o haptenos de naturaleza proteínica, poli- u oligosacarídica, glicoproteínica, lipoproteínica o en general de tipo orgánico, pudiendo estos compuestos inmunógenos ser soportados por las estructuras complejas, como unas bacterias o unas partículas virales.

Por "sustancia biológicamente activa", se entiende designar asimismo cualquier compuesto capaz de modificar la actividad funcional de las células CPA, en particular su crecimiento, su diferenciación o su sistema de expresión. Se pueden citar como ejemplo de dichas sustancias biológicamente activas, pero sin limitarse a los mismos, los factores de crecimiento celular como las citoquinas (IL-4, IL-3, GM-CSF, TNF-\alpha), los ácidos nucleicos que codifican para proteínas de interés homólogas o heterólogas y capaces de ser expresadas por las células CPA.

Asimismo, la invención tiene por objeto utilizar una proteína OmpA de enterobacteria o de uno de sus fragmentos según la invención, caracterizada porque dicha proteína OmpA de enterobacteria o uno de sus fragmentos se fija específicamente sobre las células presentadoras de antígenos y porque dicha proteína OmpA de enterobacteria o uno de sus fragmentos es internalizada en las células presentadoras de antígenos.

Preferentemente, la invención incluye la utilización de una proteína OmpA de enterobacteria o de uno de sus fragmentos según la invención, caracterizada porque dichas células presentadoras de antígenos se eligen entre las células dendríticas, los monocitos o los linfocitos B, de manera preferida, las células dendríticas.

En una realización particular, la invención incluye la utilización de una proteína OmpA de enterobacteria o de uno de sus fragmentos según la invención, caracterizada porque dicha proteína OmpA de enterobacteria, o uno de sus fragmentos, se obtiene a partir de un cultivo de dicha enterobacteria por un procedimiento de extracción.

\newpage

Los procedimientos de extracción de proteínas de membrana bacterianas son conocidos por los expertos en la materia y no serán desarrollados en la presente descripción. Por ejemplo, se pueden citar, pero sin limitarse al mismo, el procedimiento de extracción descrito por Haeuw J.H. et al. (Eur. J. Biochem, 255, 446-454, 1998).

En otro modo de realización preferido, la invención comprende asimismo la utilización de una proteína OmpA de enterobacteria o de uno de sus fragmentos según la invención, caracterizada porque dicha proteína OmpA de enterobacteria, o uno de sus fragmentos, se obtiene por vía recombinante.

Actualmente, los procedimientos de preparación de proteínas recombinantes son actualmente bien conocidos por los expertos en la materia y no serán desarrollados en la presente invención; sin embargo, se podrá hacer referencia al procedimiento descrito en los ejemplos. Entre las células utilizables para la producción de estas proteínas recombinantes, es preciso citar, desde luego, las células bacterianas (Olins P.O. y Lee S.C., 1993, Recent advances in heterologous gene expresión in E. coli. Curr. Op. Biotechnology 4:520-525), pero también las células de levadura (Buckholz R.GT., 1993, Yeast Systems for the Expression of Heterologous Gene Products. Curr. Op. Biotechnology 4:538-542), así como las células animales, en particular los cultivos de células de mamífero (Edwards C.P. y Aruffo A., 1993, Current applications of COS cell based transient expression systems. Curr. Op. Biotechnology 4:558-563) pero también las células de insectos en las cuales se pueden utilizar unos procedimientos que utilizan unos baculovirus, por ejemplo, (Luckow V.A., 1993, Baculovirus systems for the expression of human gene products. Curr. Op. Biotechnology 4:564-572).

Preferentemente, la utilización según la invención está caracterizada porque dicha enterobacteria es la Klebsiella pneumoniae.

En particular, la invención se refiere a la utilización según la invención, caracterizada porque la secuencia de ácidos aminados de dicha proteína OmpA de Klebsiella pneumoniae, o uno de sus fragmentos, incluye:

a) la secuencia de ácidos aminados de secuencia SEC ID nº 2;

b) la secuencia de ácidos aminados de una secuencia que presenta un grado de identidad después de alineación óptima de al menos 80%, preferentemente por lo menos 85%, 90% o 95% con la secuencia SEC ID nº 2; o

c) la secuencia de ácidos aminados de un fragmento de, por lo menos, 5 ácidos aminados de una secuencia SEC. ID nº 2, capaz de fijarse específicamente sobre las células presentadoras de antígenos, siendo dichos fragmentos, además, capaces de ser internalizados en dichas células presentadoras de antígenos.

Por secuencia que presenta una homología de por lo menos 80%, preferentemente de, por lo menos 85%, 90% o 95% con la secuencia de referencia SEC. ID nº 2, se entiende designar una secuencia de ácidos aminados que presentan un grado de identidad después de alineación óptima respectivamente de, por lo menos, 80%, 85%, 90% o 95% con la secuencia de referencia SEC.ID nº 2, estando dicha secuencia homóloga o uno de dichos fragmentos de, por lo menos, 5 ácidos aminados como los definidos precedentemente en c), caracterizados porque se fijan específicamente sobre las células presentadoras de antígenos y, en caso necesario, porque son internalizados en las células presentadoras de antígenos.

Por "porcentaje de identidad" entre dos secuencias de ácido nucleico o de ácidos aminados según la presente invención, se entiende designar un porcentaje de nucleótidos o de residuos de ácidos aminados idénticos entre las dos secuencias a comparar, obtenido después de la mejor alineación, siendo este porcentaje puramente estadístico y estando las diferencias entre las dos secuencias repartidas al azar y en toda su longitud. La mejor alineación o alineación óptima es la alineación para la cual el porcentaje de identidad entre las dos secuencias a comparar, como se calcula a continuación, es el más elevado. Las comparaciones de secuencias entre dos secuencias de ácido nucléico o de ácidos aminados son tradicionalmente realizadas comparando estas secuencias a continuación de haberlas alineado de forma óptima, siendo realizada dicha comparación por segmento o por "ventana de comparación" para identificar y comparar las regiones locales de similaridad de secuencia. La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede realizarse, además de manualmente, por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981) [Ad. App.. Math. 2:482] por medio del algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443] por medio del procedimiento de búsqueda de similaridad de Pearson y Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444], por medio de lógicas informáticas que utilizan estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI, o todavía BLASTN o BLASTX, Altschul et al, J. Mol. Biol. 215, 403, 1990).

El porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácido nucléico o de ácidos aminados es determinado comparando estos dos secuencias alineadas de manera óptima por ventana de comparación en la cual la región de la secuencia de ácido nucléico o de ácidos aminados a comparar pueden incluir unas adiciones o una deleciones con respecto a la secuencia de referencia para una alineación óptima entre estas dos secuencias. El porcentaje de identidad es calculado determinando el número de posiciones idénticas para las cuales el nucleótido o el residuo de ácido aminado es idéntico entre las dos secuencias, dividiendo este número de posiciones idénticas por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado obtenido por 100 para obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.

Además, la invención comprende la utilización según la invención, caracterizada porque dicha sustancia biológicamente activa se elige entre las proteínas o los péptidos, los lipopéptidos, los polisacáridos, los oligosacáridos, los ácidos nucléicos, los lípidos y las sustancias químicas.

Asimismo, la presente invención tiene por objeto la utilización de una proteína OmpA de enterobacteria o de uno de sus fragmentos según la invención, caracterizada porque dicha sustancia biológicamente activa es acoplada por enlace covalente con dicha proteína OmpA o uno de sus fragmentos, en particular por un acoplamiento químico.

En un modo de realización particular, la utilización según la invención está caracterizada porque se introduce uno o varios elementos de enlace en dicha proteína OmpA o uno de sus fragmentos, y/o de dicha sustancia biológicamente activa para facilitar el acoplamiento químico, preferentemente dicho elemento de enlace introducido es un ácido aminado.

Según la invención, es posible introducir uno o varios elementos de enlace, en particular, unos ácidos aminados para facilitar las reacciones de acoplamiento entre la proteína OmpA o uno de sus fragmentos, y la sustancia biológicamente activa, como un antígeno o un hapteno. El acoplamiento covalente entre la proteína OmpA o uno de sus fragmentos, y la sustancia biológicamente activa, como un antígeno o un hapteno según la invención pueden ser realizados en un extremo N- o C- terminal de la proteína OmpA o uno de sus fragmentos. Los reactivos bifuncionales que permiten este acoplamiento será determinados en función de la extremidad de la proteína OmpA o uno de sus fragmentos, elegido para efectuar el acoplamiento y de la naturaleza de la sustancia biológicamente activa a acoplar.

En otra realización particular, la utilización según la presente invención está caracterizada porque dicha sustancia biológicamente activa acoplada por enlace covalente con dicha proteína OmpA o uno de sus fragmentos, es una proteína quimérica recombinante resultante de la expresión de una construcción de ácido nucleico que codifica para dicha sustancia biológicamente activa y para dicha proteína OmpA o uno de sus fragmentos.

Los conjugados salidos de un acoplamiento con dicha proteína OmpA o uno de sus fragmentos, pueden ser preparados por recombinación genética. La proteína quimérica o híbrido (conjugado) puede ser producida por unas técnicas de ADN recombinante por inserción o adición a la secuencia de ADN que codifica para dicha proteína OmpA o uno de sus fragmentos, de una secuencia que codifica para dicha sustancia biológicamente activa de naturaleza proteínica.

Los procedimientos de síntesis de las moléculas híbridas engloban los procedimientos utilizados en ingeniería genética para construir unos polinucleótidos híbridos que codifican para las secuencias polipeptídicas buscadas. Por ejemplo, se podrá hacer referencia ventajosamente a la técnica de obtención de genes que codifican para las proteínas de fusión descrita por D.V. Goeddel (Gene expression technology, Methods in Enzymology, vol. 185, 3-187, 1990).

Muy particularmente, la invención se refiere a la utilización de una proteína OmpA de enterobacteria o de uno de sus fragmentos según la invención, caracterizada porque dicha sustancia biológicamente activa es un antígeno o un hapteno.

Según otro aspecto, la invención se refiere a la utilización de una proteína OmpA de enterobacteria o de uno de sus fragmentos según la invención para modular la respuesta inmune con respecto a un antígeno o un hapteno, preferentemente para mejorar la respuesta inmune con respecto a un antígeno o un hapteno.

Igualmente, la invención comprende la utilización de una proteína OmpA de enterobacteria o de uno de sus fragmentos según la invención para la preparación de una composición farmacéutica destinada a prevenir o a tratar una enfermedad por una sustancia activa cuya eficacia está modulada y/o ligada a su internalización por unas células presentadoras de antígenos, preferentemente por unas células dendríticas.

Particularmente, la invención tiene por objeto la utilización de una proteína OmpA de enterobacteria o de uno de sus fragmentos según la invención, para la preparación de una composición farmacéutica vacunante destinada a tratar una enfermedad infecciosa o un cáncer asociado a un antígeno tumoral.

Además, la invención incluye la utilización según la invención, caracterizada porque dicha composición farmacéutica incluye además un adyuvante que favorece la respuesta inmune, tal como el Alum.

La invención comprende también la utilización según la invención, caracterizada porque dicha composición farmacéutica es vehiculada en una forma que permite mejorar su estabilidad y/o su inmunogeneicidad, particularmente bajo la forma de un liposoma. La invención comprende también la utilización de una célula huésped transformada capaz de expresar una proteína quimérica recombinante resultante de la expresión de una construcción de ácido nucleico que codifica una proteína OmpA de enterobacteria o uno de sus fragmentos y una sustancia biológicamente activa consistente en un péptido y cuya eficacia está modulada y/o ligada a la internalización de la OmpA en las células presentadoras de antígenos para la preparación de una composición farmacéutica destinada a prevenir o a tratar los cánceres, preferentemente los cánceres asociados a un antígeno tumoral, las enfermedades auto-inmunes, las alergias, los rechazos de injertos, las enfermedades cardiovasculares, las enfermedades del sistema nervioso central, las enfermedades inflamatorias, las enfermedades infecciosas o las enfermedades ligadas a una inmunodeficiencia.

\newpage

Las leyendas de las figuras y ejemplos que siguen están destinadas a ilustrar la invención sin limitar en modo alguno el alcance de la misma.

Leyendas de las figuras

Figura 1: Fijación de rP40-Alexa sobre diferentes tipos celulares.

Después de incubación de rP40-Alexa sobre diferentes tipos celulares, la fijación específica de rP40-Alexa (trazo grueso) es medida por citometría en flujo. La fijación de una proteína no relevante (glicoforina) está representada en trazo fino.

Figura 2: Influencia de la concentración de rP40 sobre la fijación sobre las células dentríticas.

Figura 3: Inhibición de la fijación de rP40-Alexa por rP40 no marcada sobre unas células dendríticas.

Después de incubación de células dendríticas con diferentes concentraciones de rP40 no marcada, se añade rP40-Alexa. La fijación de rP40-Alexa es cuantificada por citometría en flujo.

Figura 4: Evaluación de la fijación de diferentes proteínas marcadas sobre las células dendríticas.

Unas proteínas portadoras P40, TT (anatóxico tetánico) y BB (derivadas de la proteína G del estreptococo) marcadas con Alexa son incubadas con unas células dendríticas (trazo grueso). Una proteína no relevante es utilizada como testigo negativo (trazo fino). La fijación es medida por citometría en flujo.

Figuras 5A y 5B : Internalización de rP40-Alexa en las células dendríticas.

Después de incubación de células dendríticas con rP40-Alexa a 4ºC (panel izquierdo, figura 5A) o a 37ºC (panel derecho, figura 5B), las células son observadas por microscopía confocal (ampliación x 220).

Ejemplo 1 Clonación del gen rP40

El gen que codifica para la proteína recombinante P40 denominada rP40 ha sido obtenido por amplificación por PCR a partir del ADN genómino de Klebsiella pneumoniae IP/145 (Nguyen et al., Gene, 1998). El fragmento de gen codificante de rP40 es insertado en diversos vectores de expresión, particularmente un vector bajo el control del promotor del operon Trp. La secuencia de ácidos aminados de la proteína rP40 y la secuencia nucleotídica que codifica para la proteína P40 están representadas respectivamente por las secuencias SEC ID nº 2 y SEC ID nº 1 en la lista de las secuencias siguientes.

Una cepa productora E.coli K12, ha sido transformada por un vector de expresión pvaL.P40. La proteína rP40 es producida en forma de cuerpo de inclusión con un rendimiento importante (> 10%, g de proteínas/g de biomasa seca). Este ejemplo sólo es una ilustración de la expresión de la rP40, pero la misma puede extenderse a otras cepas bacterianas, así como a otros vectores de expresión.

Ejemplo 2 Procedimiento de fermentación de proteínas de fusión rP40

Un Erlenmeyer que contiene 250 ml de medio TSB (Tryptic Soy Broth, Difco) que contiene ampicilina (100 \mug/ml, Sigma) y tetraciclina (8 \mug/ml, Sigma) es inoculado con la cepa E. coli recombinante arriba descrita. La incubación se realiza durante una noche a 37ºC y a continuación, 200 ml de este cultivo se utiliza para inseminar 2 litros de medio de cultivo en un fermentador (Biolafitte, Francia). De manera bastante clásica, el medio de cultivo puede estar compuesto por agentes químicos, suplementados por las vitaminas, extractos de levadura, conocidos por tener un crecimiento a la densidad elevada de células bacterianas.

Los parámetros controlados durante la fermentación son: el pH, la agitación, la temperatura, el porcentaje de oxigenación, la alimentación de fuentes combinadas (glicerol o glucosa). Da forma general, el pH está regulado a 7,0, la temperatura está fijada a 37ºC. El crecimiento es controlado alimentando con glicerol (87%) a un caudal constante (12 ml/h) para mantener la señal de tensión del oxígeno disuelto a 30%. Cuando la turbidez del cultivo (medida a 580 nm) alcanza el valor de 80 (después de aprox. 24 horas de cultivo), la producción de las proteínas es disparada por adición de ácido indole acrílico (IAA) a la concentración final de 25 mg/l. Aproximadamente 4 horas después de inducción, las células son recolectadas por centrifugación. La cantidad de biomasa húmeda obtenida es de

\hbox{aprox. 200
g.}

Ejemplo 3 Procedimiento de extracción y de purificación de la proteína rP40 Extracción de la rP40

Después de la centrifugación, el caldo de cultivo (4.000 rpm, 10 min., 4ºC), las células son puestas en suspensión en un tampón Tris-HCI 25 mH pH 8,5. Los insolubles o cuerpos de inclusión se obtienen después de un tratamiento por el lisozima (0,5 g/litro, 1 hora a temperatura ambiente / agitación suave). El residuo de cuerpos de inclusión obtenido por centrifugación (15 min. a 10.000 g a 4ºC) es tomado en un tampón Tris-HCI 25 mM a pH 8,5 y 5 mM MgC12, después centrifugado (15 min. a 10.000 g).

Se solubilizan los cuerpos de inclusión a 37ºC durante 2 horas en un tampón Tris-HCI 25 mM pH 8,5 conteniendo 7 M urea (agente desnaturalizante) y 10 mM ditiotreitol (reducción de los puentes disulfuros). Una centrifugación (15 min. a 10.000 g) permite eliminar las partículas no solubles.

Se suspende de nuevo en 13 volúmenes de tampón Tri-HCI 25 mM pH 8,5 que contiene NaCl (8,76 g/l) y Zwittergent 3-14 (0,1%, p/v). La solución se deja durante una noche a temperatura ambiente bajo agitación suave en contacto con el aire (favorecer la renaturalización de la proteína por dilución y reoxidación de los puentes disulfuros).

Purificación de la proteína rP40 Etapa de cromatografía de intercambio de aniones

Después de una nueva centrifugación, la solución es dializada contra un tampón Tris-HCI 25 mM pH 8,5 conteniendo 0,1% de Zwittergent 3-14 (100 X volúmenes de tampón) durante una noche a 4ºC.

El dializado es depositado sobre una columna que contiene un soporte de tipo intercambiador de aniones fuertes (gel Biorad Macro Prep. High Q) equilibrado en el tampón descrito anteriormente con un caudal lineal de 15 cm/h. Las proteínas son detectadas a 280 nm. La proteína rP40 es eluída, con un caudal lineal de 60 cm/h, para una concentración de 0,2 M de NaCl en el tampón TrisHCI 25 mM, pH 8,5: 0,1% Zwittergent 3-14.

Etapa de cromatografía de intercambio de cationes

Las fracciones que contienen la proteína rP40 son asociadas y concentradas por ultrafiltración con ayuda de un sistema de célula de agitación Amicon utilizado con una membrana Diaflo de tipo YM10 (umbral de corte 10 kDa) para volúmenes del orden de 100 ml, o con la ayuda de un sistema de filtración de flujo tangencial Minitan Millipore utilizado con unas placas de membranas que poseen un umbral de corte 10 kDa para unos volúmenes superiores. La fracción así concentrada es dializada durante una noche a 4ºC contra un tampón citrato 20 mM pH 3,0, con 0,1% de Zwittergent 3-14.

El dializado es depositado sobre una columna que contiene un soporte de tipo intercambiador de cationes fuertes (gel Biorad Macro Prep High S) equilibrado en el tampón citrato 20 mM pH 3,0, con 0,1% de Zwittergent 3-14. La proteína rP40 es eluída (velocidad 61 cm/h) para una concentración 0,7 M de NaCI. Los perfiles electroforéticos muestran un grado de pureza del orden de 95%. El estado de la proteína es seguido por SDS-PAGE. Según su forma desnaturalizada o nativa, la proteína P40 extraída de la membrana de Klebsiella pneumoniae posee un comportamiento electroforético (migración) característico. La forma nativa (estructura en hojas \beta) presenta en efecto una masa molecular más baja que la forma desnaturalizada (estructura en hélices \alpha) bajo la acción de un agente desnaturalizante, como la urea o el clorhidrato de guanidina, o por calentamiento a 100ºC en presencia de SDS). La proteína rP40 no está correctamente renaturalizada al final de la renaturalización, ya sea realizada en ausencia o en presencia de 0,1%; (p/v) Zwittergent 3-14. Por el contrario, una renaturalización total se obtiene después de diálisis contra un tampón Tris/HCI 25 mM pH 8,5 que contiene 0,1% (p/v) de Zwittergent 3-14. Sin embargo, debe observarse que esta renaturalización sólo se obtiene cuando la etapa de dilución y el tratamiento a temperatura ambiente se realizan en presencia de Zwittergent 3-14 (resultados negativos en ausencia de detergente).

Ejemplo 4 Fijación específica de rP40 sobre las células presentadoras de antígeno (CPA). Metodología Purificación de los linfocitos T humanos

Las células mononucleadas (CMN) son aisladas a partir de la sangre periférica de voluntarios sanos por centrifugación (1.800 rpm, 20 min. a temperatura ambiente), sobre un gradiente de Ficoll. Después de centrifugación, las CNM situadas en la intercara ficoll/plasma, son recolectadas y lavadas 2 veces con medio de cultivo completo (MC) (RPMI 1640 + 10% SVF + L-glutamina + antibiótico). Entonces, los linfocitos T son aislados por la técnica del rosetting que utiliza su capacidad para fijarse a los glóbulos rojos de cordero (GRM). Brevemente, las CMN son incubadas con unos GRM durante 1 hora a 4ºC. Después de la centrifugación sobre gradiente de ficoll, los linfocitos B y los monocitos están situados en la intercara mientras que los linfocitos T fijados a los GRM están en el residuo celular. Después de recuperación del residuo celular y lisis de los GRM con una solución salina hipotónica, la pureza de los linfocitos T es apreciada por citometría en flujo con un anticuerpo anti-CD3 y es superior al 95%.

Purificación de los monocitos humanos

Los monocitos son purificados a partir de las CMN por selección positiva utilizando la tecnología MACS (Magnetic Activated Cell Sorter). Las CMN son marcadas con un anticuerpo anti-CD14 acoplado a unas partículas magnéticas y después pasadas sobre una columna imantada. Los monocitos sobre los cuales se han fijado los complejos anticuerpo-coloide permanecen en la columna mientras que las células que no han fijado el anticuerpo son eluídas por lavados sucesivos. A continuación los monocitos son desenganchados efectuando unos lavados en ausencia de imán. La pureza de la fracción recogida es superior al 98%.

Generación de células dendríticas humanas (CD) a partir de monocitos

Los monocitos purificados son cultivados a la concentración de 106/ml en MC durante 6-7 días en presencia de IL 4 (20 ng/ml) y de GMCSF (20 ng/ml). Las CD generadas en esta fase son CD inmaduras que expresan el CDla y poco o nada el CD83. Su fenotipo es verificado por la técnica de citometría en flujo.

Purificación de los linfocitos B humanos a partir de amígdalas

Las amígdalas son trituradas y las células recolectadas se depositan sobre un gradiente de ficoll. Las CMN recogidas en una intercara son lavadas e incubadas con unos GRM. Después de ficoll, los linfocitos B están situados en la intercara mientras que los linfocitos T fijados a los GRM están en el residuo celular. Entonces, los linfocitos B son lavados. Su pureza, verificada por citometría en flujo, es superior a 96%.

Cultivo de las progenies celulares

Las progenies celulares RPMI 8866, DAUDI, HL60 y Jurkat son cultivados en MC.

Acoplamiento de rP40 al fluorocromo Alexa488

La concentración de la proteína rP40 es ajustada a 2 mg/ml en PBS. A 500 \mul de la proteína se añaden 50 \mul de bicarbonato de sodio a 1 M. Entonces, la soluciones transferida a un tubo de reacción conteniendo el colorante Alexa488 y el acoplamiento se efectúa a temperatura ambiente. Después de 1 hora, la reacción del acoplamiento es parada por adición de 15 \mul de hidroxilamina. La proteína marcada es separada del colorante libre por purificación sobre columna.

A continuación, la cantidad de rP40 marcada con Alexa488 es estimada por dosificación colorimétrica.

- Estudio de la fijación de P40-Alexa488 sobre las diferentes células por citometría en flujo.

Para cada marcado, 200.000 células son lavadas con tampón FACS (PBS + 1% BSA + 0,01% azida de sodio) y suspendidas luego en una placa de 96 pocillos de fondo cónico en 50 \mul de tampón FACS. Entonces, la proteína P40-Alexa488 o la proteína control (glicoforina-Alexa488) son añadidas a 10^{-6}M durante aprox. 1 hora a 4ºC. Después de incubación, las células son lavadas 3 veces con tampón FACS y después suspendidas de nuevo en 200 \mul de este mismo tampón y analizadas por citometría en flujo.

Resultado

La proteína rP40 se fija selectivamente sobre las CPA humanas tales como:

-: los monocitos salidos de la sangre periférica,

-: las células dendríticas generadas a partir de los monocitos de la sangre periférica,

-: los linfocitos B salidos de amígdala, las progenies linfocitarias B: DAUDI Y RPMI 8866 (ver figura 1) y los linfocitos B salidos de la sangre periférica (resultado no presentado).

No se observa ninguna fijación sobre células que no posean la capacidad de presentar unos antígenos como linfocitos T de la sangre periférica no activados, la progenie linfocitaria T Jurkat no activada y la progenie monocitaria HL60 no activada.

Ejemplo 5 La fijación de rP40 a las CD es específica

1) La fijación de rP40 a las CD es dependiente de la dosis.

Procedimiento

200.000 CD son lavadas con tampón FACS e incubadas en 50 \mul de tampón en presencia de diferentes concentraciones de rP40 (de 10^{-10} a 5 x 10^{-6} M) durante aprox. 1 hora a 4ºC. Después de incubación, las células son lavadas 3 veces con tampón FACS y después de nuevo en 50 \mul de este mismo tampón que contiene 5 \mug/ml de un anticuerpo policlonal de conejo anti-P40 o de un anticuerpo IgG de conejo control. Después de 20 minutos de incubación, las células son lavadas de nuevo e incubadas en 100 \mul de tampón FACS que contiene un anticuerpo policlonal de cabra anti-IgG de conejo marcado con fluoresceína (diluido a 1:200). Después de 20 minutos de incubación, las células son lavadas, tomadas de nuevo en tampón FACS y analizadas por citometría en flujo.

Resultado

La fijación de rP40 a la CD es significativa a partir de 10^{-7} M (p<0,001) y máximo a 2 x 10^{-6} M (ver figura 2).

2) La proteína rP40 no marcada disminuye la fijación de rP40 Alexa488 a las CD.

Procedimiento

Para demostrar la especifidad de la fijación P40 se realiza una competición entre rP40-Alexa488 y rP40 no marcada. Las CD han sido incubadas 10 minutos con 5 x 10^{-3} a 2 x10^{-6}M de rP40 no marcada y después ha sido añadido P40-Alexa488 (utilizado al 2 x 10^{-6}M). Después de 20 minutos de incubación a 4ºC, las células han sido analizadas por citometría en flujo, como se ha descrito previamente.

Resultado

La proteína rP40 no marcada inhibe de forma dependiente de la dosis la fijación de 2 x 10^{-6} M de P40 Alexa488 (a más de 60% cuando es utilizado a 2 x 10^{-6} M) (ver figura 3).

Ejemplo 6 Entre la proteínas portadoras, TT, BB y rP40, solamente la proteína rP40 se fija a las CD Procedimiento

Las proteínas portadoras, anatoxina tetánica (TT) y BB (de origen de la proteína G del estreptococo que tiene una afinidad para la albúmina humana), así como la proteína rP40 y la proteína control glicoforina A han sido marcadas por Alexa488 como se describe anteriormente. La fijación de estas moléculas sobre las CD ha sido evaluada por citometría en flujo como se describe anteriormente. Brevemente, 200.000 CD son lavadas con tampón FACS e incubadas en 50 \mul de tampón, en presencia de 10^{-6}M de cada una de las proteínas marcadas por Alexa488, durante aprox. 1 hora a 4ºC. Después de incubación, las células son lavadas 3 veces con tampón FACS y después suspendidas de nuevo en 200 \mul de este mismo tampón y analizadas por citometría en flujo.

Resultado

A la concentración de 10^{-6}M, solamente la rP40 se fija a las células dendríticas. No se ha detectado ninguna fijación de TT, BB y glicoforina (ver figura 4).

Ejemplo 7 rP40 es internalizada por las CD Procedimiento

200.000 CD son lavadas con tampón PBS-BSA 1% y suspendidas en una placa con 96 pocillos de fondo cónico, en 50\mul de tampón PBS-BSA (tampón fosfato salino - suero albúmina bovina). Entonces la proteína rP40-Alexa488 o la proteína glicoforina-Alexa488 es añadida a 2 x 10^{-6}M. Una cinética de internalización se efectúa incubando las células con las proteínas marcadas con la Alexa, a 37ºC, de 15 minutos a 2 horas. Se realiza un control negativo de internalización en las mismas condiciones cambiando los parámetros siguientes: adición de azida de sodio 0,01% al tampón PBS-BSA e incubación de las células a 4ºC con las proteínas marcadas con la Alexa.

Después de incubación, las células son lavadas 3 veces con tampón PBS-BSA, suspendidas en 100 \mul de este mismo tampón y después citocentrifugadas sobre unas láminas de microscopio. Enseguida se analizan las láminas por microscopía confocal.

Resultado

La observación de las células incubadas a 37ºC con rP40-Alexa presenta un marcado intracitoplásmico detectable desde los 30 minutos y siempre observado después de 2 horas de incubación: un resultado representativo, obtenido después de 1 hora de incubación a 37ºC es presentado en la figura 5B. Se observa un marcado membranario pero no intracitoplásmico cuando las células son incubadas a 4ºC con rP40 (ver figura 5A), mientras que no se observa ningún marcado en presencia de glicoforina-Alexa (después de incubación a 4ºC como a 37ºC). El ejemplo de Alexa, molécula química, demuestra que cualquier molécula química acoplada a P40 puede ser suministrada así a las células presentadoras de antígenos, comprendidas las células dendríticas.

\vskip0.333000\baselineskip

<110> PIERRE FABRE MÉDICAMENT

\vskip0.333000\baselineskip

<120> UTILIZACIÓN DE UNA PROTEÍNA OmpA DE ENTEROBACTERIA, PARA EL APUNTADO ESPECÍFICO DE UNA SUSTANCIA BIOLÓGICAMENTE ACTIVA QUE LE ESTÁ ASOCIADA HACIA LAS CÉLULAS PRESENTADORAS DE ANTÍGENOS

\vskip0.333000\baselineskip

<130> D17777

\vskip0.333000\baselineskip

<140>

\vskip0.333000\baselineskip

<141>

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<150> FR 98 14007

\vskip0.333000\baselineskip

<151> 1998-11-06

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<160> 2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<170> PatentIn Ver. 2.2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 1

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 1035

\vskip0.333000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Klebsiella pneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> exon

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1)..(1032)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> intron

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1033)..(1035)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<220>

\vskip0.333000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.333000\baselineskip

<222> (1)..(1032)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 1

1

2

3

\vskip0.333000\baselineskip

<210> 2

\vskip0.333000\baselineskip

<211> 344

\vskip0.333000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.333000\baselineskip

<213> Klebsiella pneumoniae

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.333000\baselineskip

<400> 2

4

5

Claims

1. Utilización de una proteína OmpA de enterobacteria o de uno de sus fragmentos en asociación con una sustancia biológicamente activa cuya eficacia es modulada y/o ligada a la internalización de la OmpA en las células presentadoras de antígenos, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a prevenir o a tratar los cánceres, preferentemente los cánceres asociados a un antígeno tumoral, las enfermedades auto-inmunes, las alergias, los rechazos de injertos, las enfermedades cardiovasculares, las enfermedades del sistema nervioso central, las enfermedades inflamatorias, las enfermedades infecciosas o las enfermedades ligadas a una inmunodeficiencia.

2. Utilización según la reivindicación 1, caracterizada porque dicha proteína OmpA de enterobacteria o uno de sus fragmentos se fija específicamente sobre las células presentadoras de antígenos.

3. Utilización según una de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizada porque dichas células presentadoras de antígenos se seleccionan de entre las células dendríticas, los monocitos o los linfocitos B.

4. Utilización según la reivindicación 3, caracterizada porque dichas células presentadoras de antígenos son las células dendríticas.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque dicha proteína OmpA de enterobacteria o uno de sus fragmentos, se obtiene a partir de un cultivo de dicha enterobacteria por un procedimiento de extracción.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque dicha proteína OmpA de enterobacteria o uno de sus fragmentos, se obtiene por vía recombinante.

7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada porque dicha enterobacteria es Klebsiella pneumoniae.

8. Utilización según la reivindicación 7, caracterizada porque la secuencia de ácidos aminados de dicha proteína OmpA o uno de sus fragmentos, comprende:

a): la secuencia de ácidos aminados de secuencia SEC ID nº 2;

b): la secuencia de ácidos aminados de una secuencia que presenta un grado de identidad después de alineación óptima de, por lo menos, 80% con la secuencia SEC ID nº 2; o

c): la secuencia de ácidos aminados de un fragmento de, por lo menos, 5 ácidos aminados de la secuencia SEC ID nº 2 capaz de fijarse específicamente sobre las células presentadoras de antígenos, siendo dichos fragmentos además capaces de ser internalizados en dichas células presentadoras de antígenos.

9. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada porque dicha sustancia biológicamente activa se selecciona de entre los péptidos, los lipopéptidos, los polisacáridos, los oligosacáridos, los ácidos nucléicos, los lípidos y las sustancias químicas.

10. Utilización según la reivindicación 9, caracterizada porque dicha sustancia biológicamente activa está acoplada por enlace covalente con dicha proteína OmpA o uno de sus fragmentos.

11. Utilización según la reivindicación 10, caracterizada porque el acoplamiento por enlace covalente es un acoplamiento químico.

12. Utilización según la reivindicación 11, caracterizada porque se introducen uno o varios elementos de enlace en dicha proteína OmpA o uno de sus fragmentos, y/o de dicha sustancia biológicamente activa para facilitar el acoplamiento químico.

13. Utilización según la reivindicación 12, caracterizada porque dicho elemento de enlace introducido es un ácido aminado.

14. Utilización según la reivindicación 10, caracterizada porque dicha sustancia biológicamente activa acoplada por enlace covalente con dicha proteína OmpA o uno de sus fragmentos, es una proteína quimérica recombinante resultante de la expresión de una construcción de ácido nucléico que codifica para dicha sustancia biológicamente activa y para dicha proteína OmpA, o uno de sus fragmentos.

15. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, caracterizada porque dicha sustancia biológicamente activa es un antígeno o un hapteno.

16. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para modular la respuesta inmune con respecto a un antígeno o un hapteno.

17. Utilización según la reivindicación 16, para mejorar la respuesta inmune con respecto a un antígeno o un hapteno.

18. Utilización según de las reivindicaciones 1 a 17, para la preparación de una composición farmacéutica vacunante destinada a prevenir o a tratar una enfermedad infecciosa o un cáncer asociado a un antígeno tumoral.

19. Utilización según la reivindicación 18, caracterizada porque dicha composición farmacéutica incluye además un adyuvante de la inmunidad.

20. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 18 y 19, caracterizada porque dicha composición farmacéutica es vehiculada en una forma que permite mejorar su estabilidad y/o su inmunogenicidad.

21. Utilización según la reivindicación 20, caracterizada porque dicha composición farmacéutica es vehiculada en forma de un liposoma.

22. Utilización de una célula huésped transformada que codifica para una proteína quimérica recombinante resultante de la expresión de una construcción de ácido nucleico que codifica para una proteína OmpA de enterobacteria o de uno de sus fragmentos, y una sustancia biológicamente activa consistente en un péptido y cuya eficacia está modulada y/o ligada a la internalización de la OmpA en las células presentadoras de antígenos para la preparación de una composición farmacéutica destinada a prevenir o a tratar los cánceres, preferentemente los cánceres asociados a un antígeno tumoral, las enfermedades auto-inmunes, las alergias, los rechazos de injertos, las enfermedades cardiovasculares, las enfermedades del sistema nervioso central, las enfermedades inflamatorias, las enfermedades infecciosas o las enfermedades ligadas a una inmunodeficiencia.