MXPA00000556A - Conjugados inmunogenicos que comprenden una porina meningococica de grupo b y un polisacarido de h. influenzae - Google Patents

Abstract

Se describe un conjugado de un polisacárido de H. Influenzas de tipoß- proteína de membrana exterior meningocócica, composiciones farmacéuticas del mismo, y el uso del mismo para inducir una respuesta inmune contra H. Influenzas en un animal.

Description

CONJUGADOS INMUNOGÉNICOS QUE COMPRENDEN UNA PORINA MENINGOCÓCICA DE GRUPO B Y UN POLISACARIDO DE H. influenzae.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el campo de vacunas útiles para generar una respuesta inmune en un animal. En particular, la invención se relaciona con conjugados de polisacárido de H. influenzae-proteína de membrana exterior de N. meningi tidis, composiciones farmacéuticas y el uso de los mismos .

INFORMACIÓN ANTECEDENTE Haemophilus influenzae son cocobacilos gramnegativos pleomórficos pequeños. Los aislados se clasifican en seis tipos capsulares distintos antigénicamente (a-f) y cepas no tipificables no encapsuladas. Haemophilus influenzae puede causar meningitis, otitis media, sinusitis, epiglotitis, artritis séptica, bacteremia febril oculta, celulitis, neumonía y empiema; ocasionalmente, este organismo causa meningitis neonatal y septicemia. Otras infecciones por H. influenzae incluyen pericarditis purulenta, endocarditis, conjuntivitis, osteomielitis, peritonitis, epididimo-orquitis, glositis, uvulitis y tromboflebitis séptica. La mayor parte de los casos REF.: 32461 de enfermedades invasivas en niños antes de la introducción de la vacunación con el conjugado de H. influenzae tipo b (Hib) fueron causadas por el tipo b. Los organismos no encapsulados pueden provocar enfermedad invasiva en recién nacidos. Las cepas no encapsuladas causan infección en el tracto respiratorio superior, que incluyen otitis media, sinusitis y bronquitis, y pueden provocar neumonía. La fuente del organismo es el tracto respiratorio superior de los humanos. El modo de transmisión es probablemente de persona a persona, por contacto directo, o a través de inhalación de gotitas de las secreciones del tracto respiratorio que contienen el organismo. Es frecuente la colonización asintomática de cepas no encapsuladas; los organismos se recuperan de la garganta de 60% a 90% de niños. Sin embargo, la colonización por organismo del tipo b es poco frecuente, y varía de 2% a 5% de niños en la etapa previa a la vacuna, y parece ser incluso menos frecuente con la amplia diseminación de la vacunación con el conjugado Hib. Se desconoce el período exacto de capacidad de comunicación, pero puede ser tan largo en la medida en que el organismo está presente en el tracto respiratorio superior. Antes de la introducción de vacunas efectivas, Hib era la causa más común de meningitis bacteriana en niños en los Estados Unidos y en muchos otros países. La meningitis y otras infecciones invasivas eran más comunes en niños de 3 meses a 3 años de edad y aproximadamente la mitad de los casos se presentaban en lactantes menores de 12 meses. La incidencia específica de la edad de la enfermedad invasiva tipo b en diferentes poblaciones en los países ha variado; la proporción de la enfermedad en lactantes menores de 12 meses tiende ser mayor en poblaciones con una incidencia total más elevada, lo que resulta en una edad mediana inferior de casos. En contraste con la meningitis y la mayor parte de otras enfermedades invasivas de Hib, la epiglotitis es rara en lactantes menores de 12 meses; su presentación máxima en la época previa a la vacuna es de 2 a 4 años de edad. La epiglotitis también se puede presentar en niños no vacunados más grandes y en adultos. La enfermedad invasiva ha sido más frecuente en niños, Afro Americanos, esquimales de Alaska, Indios Apache y Navajo, niños atendidos en centros de- cuidado, niños que viven en condiciones asinadas y niños quienes no son alimentados por pecho. Los niños no inmunizados, particularmente aquellos menores de 4 años quienes están en contacto cercano y prolongado (por ejemplo en un vecindario) con un niño con la enfermedad Hib invasiva, están en un riesgo aumentado de una infección grave por este organismo. Otros factores que predisponen a la enfermedad invasiva incluyen enfermedad de células falsiformes, asplenia, infección por VIH, ciertos síndromes de inmunodeficiencia y canceres malignos. Los lactantes menores de 1 año con infección invasiva documentada tienen aproximadamente 1% de riesgo de recurrencia, si no se vacunan subsecuentemente . Desde 1988, cuando se introdujeron vacunas de conjugado de Hib, la incidencia de enfermedad Hib invasiva ha declinado en 95% en lactantes y niños pequeños y la incidencia de infecciones invasivas causadas por otros tipos encapsulados ahora es similar a la causada por el tipo b. Como un resultado de este éxito, el servicio de salud pública de los Estados Unidos ha planteado como objetivo que la enfermedad por Hib en niños menores de 5 años sea eliminada en este país. La enfermedad invasiva por Hib se presenta ahora en este país principalmente en niños subvacunados y en lactantes demasiado jóvenes para haber completado la serie primaria de vacunaciones . Se han otorgado cuatro vacunas de conjugado de Hib en los Estados Unidos. Estas vacunas consisten de polisacárido capsular de Hib (es decir, poliribosilribitol fosfato [PRP] u oligómeros de PRP) unidos covalentemente a una proteína portadora directamente o por medio de una molécula separadora intermedia. Los anticuerpos protectores se dirigen contra las vacunas de conjugado de PRP difieren en composición e inmunogenicidad y, como resultado, las recomendaciones para su uso difieren. Por ejemplo PRP-D se recomienda únicamente para niños de 12 meses de edad o más grandes, mientras que las otras tres vacunas HbOC, PRP-T y PRP-OMP se recomiendan para lactantes comenzando a los 2 meses de edad. Los adyuvantes son sustancias que aumentan la respuesta inmune a antígenos y, por lo tanto, se han utilizado en muchas vacunas y candidatos de vacuna. El efecto estimulador inmune de los adyuvantes no es específico de antígeno, pues refuerzan las respuestas inmunes hacia muchos tipos diferentes de antígenos. Los únicos adyuvantes actualmente aprobados para ' uso humano por la FDA son sales de aluminio, pero muchos adyuvantes utilizados en vacunaciones en animales y en candidatos de vacuna más recientes son de origen microbiano (61), por ejemplo el adyuvante de Freund's, Corynebacterium parvum, dipéptido de muramilo, toxoide del tétano, etc. Se desconoce los mecanismos para la capacidad inmunopotenciadora. de las sustancias microbianas. Las proteínas principales de la membrana exterior de Neisseria patogénica {Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meníngi tidis) se han investigado para determinar su potencial adyuvante (26,37,39,40,60) y para el mecanismo detrás de su capacidad inmunopotenciadora. Las proteínas de interés son la proteína IA (PÍA) y la proteína IB (PIB) del gonococo y las proteínas de clase 1, 2 ó 3 del meningococo (Cl, C2 y C3 , respectivamente) (4). Todas ellas funcionan como porinas (41,43,62) y tienen una homología de secuencia de aminoácidos significativa entre si (6,7,21,59) y se considera que son parte de la superfamilia de la porina gramnegativa (26) . Las porinas de Neissseria, cuando forman complejos no covalentemente con péptidos de paludismo, se demuestra que mejoran la respuesta de anticuerpos para estos péptidos en comparación a el caso en el que los péptidos se utilizan como inmunógenos solos o se unen covalentemente a otras proteínas (39,40) . Además, los péptidos derivados de estreptococus grupo A (38) , hemaglutinina de virus de influenza (38) o Trypanosome bruceii (40) se ha demostrado que son más inmunogénicos en ratones cuando se incorporan en complejos que contienen porinas de Neisseria en comparación a cuando los ratones se inmunizan con péptidos solos. Las vesículas meningocócicas de membrana exterior (OMV) consisten principalmente de la proteína clase 2 , y se utilizan como un portador para reforzar la respuesta inmune hacia la cápsula del polisacárido de H. influenzae en una vacuna de H. influenzae tipo b recién otorgada, desarrollada por Merck (10). Además, Livingston ha explorado el uso de porinas purificadas de Neisseria como adyuvantes en vacunas anti-melanoma. Las células de melanoma expresan niveles mucho más elevados de los gangleócidos humanos GM2 o GD3 en su superficie, en comparación con los melanocitos normales. Para aumenta la respuesta inmune a GM2 y GD3 y posiblemente inducir inmunidad tumoral en pacientes con melanoma, se asocian de manera no covalente GM2 y DG3 con porinas de Neisseria purificadas y a voluntarios con melanoma malignos se les inmuniza con estas construcciones de vacuna. Las respuestas de anticuerpos anti-GM2 o anti-GD3 se incrementan en gran medida en pacientes inmunizados con complejos de porina/GM2 o porina-GD3 en comparación con pacientes inmunizados con estos gangleócidos solos o formando complejos con BCG (36,37). Además, la carga tumoral en pacientes inmunizados con porina/GM2 disminuye significativamente (comunicación personal , P. Livingston) . Se desconoce los mecanismos por los cuales las porinas de Neisseria actúan como adyuvantes. El grupo de Merck (10,35,36) quien desarrolló la vacuna de conjugado de cápsula de polisacárido de hemofilus-OMV meningocócica, considera que puede ser debido a estimulación directa de células T por la proteína clase 2. Inicialmente demostraron que la proteína clase 2 puede estimular directamente al linfocito T, y por lo tanto, nombraron nuevamente a la proteína clase 2 como la proteína meningocócica mejoradora inmune (MIEP) (35) . Sin embargo, posteriormente se demostró que únicamente la proteína clase 2 a altas concentraciones (>50 µg) puede estimular a células T, mientras que la proteína nativa no tiene tal efecto (56) . Además, puesto que la mayor parte de las porinas de Neisseira están en su configuración nativa cuando se utilizan como un candidato de vacuna o adyuvante, la probabilidad de que la estimulación no específica de células T por porinas desnaturalizadas explique su capacidad inmunopotenciadora es baja. Durante los últimos años, se han dilucidado los detalles respecto a las interacciones entre los linfocitos T y B necesaria para el reconocimiento de antígeno, estimulación de linfocitos y producción de anticuerpos. En el modelo actual de estimulación del linfocito T, se ha demostrado que se requieren dos conjuntos de señales entre la célula presentadora de antígeno (APC) y el linfocito T (24,25,51) . La primera señal (señal 1) es suministrada vía la interacción del complejo principal de histocompatibilidad (MHC, por sus siglas en inglés) o células presentadoras de antígeno (por ejemplo linfocitos B, células dentríticas, macrófagos, etc.) y el receptor de célula T en linfocitos T. La ranura en el complejo de MHC habitualmente es ocupada por un oligopéptido derivado de antígenos procesados (epitopo de célula T) . La especificidad de la reacción es conferida por la señal 1. La segunda señal o señal coestimuladora (señal 2) es suministrada por la unión de dos conjuntos de contrarreceptores durante la interacción entre los linfocitos B y T (figura 1) . Los linfocitos T activados después liberan citocinas las cuales a su vez estimulan a las células efectoras, por ejemplo, provocando que los linfocitos B se vuelvan células productoras de anticuerpos. La inducción de coestimulación por la interacción de estos contrarreceptores se ha demostrado que es importante en la inmunidad tumoral (1, 3 , 8 , 11, 51, 55) , la prevención de tolerancia (19,45,54) y para actividad citotóxica de linfocitos (1). Los contrarreceptores de linfocito T son CD28 y CTLA-4. Ambos son miembros de la superfamilia de inmunoglobulina (9) . CD28 está presente en células T en reposo y activadas (1,8,27,30,32,34,46), mientras que CTLA-4 únicamente se expresa en células T activadas (17,23,31,33,51) . El nivel de CD28 en células T activadas es 20 veces mayor que CTLA-4, pero la afinidad de CD28 por su contrarreceptor de célula B es mucho menor (31,33) . Los contrarreceptores de linfocito B es B7 (14,20,32,48,49) y el más recientemente descubierto B7-2 (2,12,13,16,24) . B7 y B7-2 son miembros de la superfamilia de inmunoglobulina (13-15) y únicamente están presentes en linfocitos B activados (14) . Varias líneas de evidencia demuestran la relación del nuevo ligando, B7-2 a coestimulación de linfocitos T; 1) la unión de CTLA-4 a células B activadas es inhibida solo parcialmente por un anticuerpo monoclonal (mAb) anti-B7 (24) , 2) los linfocitos derivados de ratones deficientes en expresión de B7 aún pueden coestimular células T (12,13), 3) los transfectantes que expresan únicamente B7-2 pueden coestimular células T (13,16), y 4) , un mAb específico para B7-2 puede inhibir la coestimulación de linfocito T por células B (24) o transfectantes de B7-2 (13) . Aún está en controversia la importancia del antígeno B7 descrito inicialmente como un contrarreceptor de coestimulación debido a que la expresión de B7-2 se produce antes que la expresión de B7 y existe más B7-2 presente en la superficie de linfocitos B activados que B7 (24) . En la figura 1 se ilustra una representación esquemática de la coestimulación de linfocito T y los contrarreceptores coestimuladores . Existe evidencia preliminar presentada por diversos investigadores de que los productos microbianos pueden estimular a los linfocitos B. Liu et al., han demostrado que el lipopolisacárido (LPS) , virus de influenza mitogénico y un antígeno que imita una infección viral (ácido poliisosínico-policitidílico) , estimulan todos a linfocitos B, lo cual a su vez coestimula a los linfocitos B (25) . Vordemeier ha demostrado que las porinas purificadas de Salmonella typhi (libres de LPS) son potentes estimuladores de células B, pero tienen un efecto mínimo sobre los linfocitos B (57, 58) . Además, las preparaciones de membrana exterior meningocócicas que consisten principalmente de las porinas meningocócicas actúan como mitógenos de células AB y no estimulan a los linfocitos T (44,52,53) . Esta evidencia sugiere que las porinas de Neisseria, y posiblemente otras porinas gramnegativas, pueden ser capaces de estimular linfocitos B e incrementar la expresión de B7-2. La expresión aumentada de B7-2 puede mediar la coestimulación de linfocito T y este puede ser un mecanismo por el cual las porinas mejoran la respuesta inmune a otros antígenos, tales como el polisacárido PRP presentado aquí.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un conjugado de un polisacárido de H. influenzae tipo b (Hib) - y un conjugado de proteína de membrana exterior meningocócica renaturalizado y sustancialmente puro (rPorB) . La presente invención también se relaciona con un método para preparar un conjugado de polisacárido de Hib rPorB, que comprende : (a) obtener un polisacárido de Hib; (b) oxidar o hidrolizar selectivamente el polisacárido para generar grupos aldehido; (c) obtener una rPorB; y (d) conjugar el polisacárido que contiene grupos aldehido con la rPorB, por aminación reductiva. La presente invención también se relaciona con los conjugados obtenidos de acuerdo con los métodos de la invención. Opcionalmente, los conjugados de la presente invención se pueden conjugar con DTaP (vacuna de difteria, tétanos y pertusis acelular) . La presente invención también se relaciona con composiciones farmacéuticas que comprenden los conjugados de la invención, y que opcionalmente comprenden DTaP, y un portador farmacéuticamente aceptable.

La presente invención también se relaciona con un método para inducir una respuesta inmune en un animal contra H. influenzae, que comprende administrar los conjugados de la invención al animal en una cantidad efectiva para reducir tal respuesta inmune . La invención se relaciona en parte con el descubrimiento sorprendente de que los conjugados de Hib rPorB de la invención inducen respuestas inmunes sustancialmente mayores en animales, en comparación a cuando se utiliza el toxoide tetánico y la proteína P2 de membrana exterior producida de manera recombinante de H. influenzae como la proteína antigénica. También se obtienen respuestas inmunogénicas sustancialmente mayores comparadas con el conjugado Hib-CRM el cual está disponible comercialmente de Lederle Laboratories, División of American Cyanamide Company, Pearl River, NY. CRM197 es una variante no tóxica mutante en un sitio de la toxina de difteria aislada de cultivos de Corynebacterium diphteriae C7(ßl97). Seid, R.C. Jr., et al., Glycoconj . J. 6 : 489-498 (1989). Además, el conjugado de la presente invención es específicamente útil en composiciones que también comprenden DTaP, como interacciones inmunológicas entre los componentes asi como supresión epitópica, que se observa con proteínas portadoras convencionales tales como toxoide del tétano. Los conjugados de la presente invención resuelven la limitación seria de composiciones de vacuna en composición.

DESCRIPCIÓN BREVE DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra una representación gráfica de coestimulación de linfocitos T. La figura 2 muestra una gráfica que muestra el perfil de fermentación de B1HB1030. La figura 3 muestra un gel SDS-PAGE teñido de rPorB purificada utilizada para conjugación. La figura 4 muestra una gráfica de barras que muestra la respuesta específica de IgG al polisacárido Hib en ratas, para conjugado de Hib con diversas proteínas portadoras. Las figuras 5A-5H muestran tablas que muestran en anticuerpo sérico de ratas Sprague Dawley inmunizadas con Hib-TT, Hib-rPorB y Hib-rP2, medidos por ELISA. Las figuras 6A y 6B muestran datos que muestran la respuesta de IgG específica para PRP por ELISA, en ratas para vacunas de conjugado de Hib con diferentes proteínas portadoras. Se prueban dos preparaciones diferentes de Hib-rPorB (-1 y -2) . La figura 6A es una descripción gráfica de los datos tubulares que se muestran en la figura 6B.

La figura 7 muestra una gráfica que presenta la IgG específica para polisacárido inducida por las vacunas de conjugado de Hib en ratones CD-1. La figura 8 muestra gráfica que presenta las IgG específicas de polisacárido inducidas por vacunas de conjugado de Hib en ratas .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con una vacuna para inducir una respuesta inmune en un mamífero, que comprende la proteína porina de la membrana meningocócica grupo B unida a polisacárido Hib, junto con un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la vacuna se puede administrar en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune en un animal contra H. influenzae . En una modalidad preferida, el animal es un mamífero que se selecciona del grupo que consiste de humanos, ganado, cerdos, borregos y pollos. En otra modalidad preferida, el mamífero es un humano. Se pretende que el término "rPorB" mencione la proteína de membrana exterior clase 2 o clase 3 renaturalizada y madura de N. meningi tidis y fusiones de la misma que comprenden aminoácidos 1 a 20 o 1 a 22 de la proteína de capside flO del gen T7. Los métodos para la expresión del alto nivel de rPorB clase 2 y clase 3 madura y fusiones de la misma, la renaturalización y purificación se describen en (47) y en la patente de los Estados Unidos número 5,439,808, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente como referencia. La porina recombinante se puede expresar a altos niveles a partir de E. coli , de acuerdo con la patente de los Estados Unidos 5,439,808, o a partir de levadura, de acuerdo con el documento 08/792,302. En una modalidad preferida, rPorB clase 3 se expresa a partir del huésped BL21 (DE3) ?ompA el cual ha sido transformado con el gen que codifica para la rPorB, que es sustancialmente pura y que se renaturaliza de acuerdo con la patente de los Estados Unidos número 5,439,808. El polisacárido capsular de H. influenzae se puede aislar de acuerdo con los métodos bien conocidos por aquellos habitualmente expertos en la técnica. Véase, Schneerson et al . J. Exp . Med. 152:361-376 (1980); Marburg et al . J. Am. Chem. Soc. 108:5282 (1986), Jennings et al . , J. Immunol . 127:1011-1018 (1981); y Beuvery et al . Infect . Immunol . 40:39-45 (1983). En una modalidad preferida, el organismo es cultivado, el sobrenadante del cultivo se microfiltra y el filtrado se hace pasar a través de un filtro con corte de peso molecular de 300,000. El permeado después se concentra, por ejemplo, con un filtro de corte de peso molecular de 100,000. Este material de peso molecular 100,000-300,000 después se oxida con un oxidante moderado tal como metaperyodato, el producto se filtra a través de un filtro de peso molecular 30,000 y después se concentra con un filtro de peso molecular 5,000, para proporcionar un polisacárido que tiene grupos aldehido que pueden ser utilizados directamente para conjugación. El polisacárido preferido tiene un peso molecular de aproximadamente 5,000-50,000. Un polisacárido más preferido tiene un peso molecular de aproximadamente 10,000-50,000, sin embargo, se pueden utilizar según se deseen otros intervalos de peso molecular. Se comprenderá por aquellos expertos en la técnica que los conjugados de polisacárido capsular-portador de proteína de la vacuna se pueden producir por varios métodos diferentes. Los tipos de uniones covalentes los cuales acoplan un polisacárido a un portador de proteína, y el medio para producirlos, son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los detalles respecto al medio químico por el cual se pueden unir las dos porciones se pueden encontrar en las patentes de los Estados Unidos números 5,623,057, 5,371,197, 5,192,540, 4,902,506 y 4,356,170, el contenido de las cuales se incorpora en la presente como referencia en su totalidad. Para una revisión, véase Contr ibut ions to Microbiology and Immunology, vol. 10, Conjúgate Vaccines, volume editors, J.M. Cruse y R.E. Lewis, Jr., 1989, y (29) . Uno de tales métodos es el proceso de aminación reductiva descrito por Schwartz y Gray (Arch . Biochim. Biophys 181:542-549 (1977)). Este proceso involucra producir el polisacárido en una forma la cual tenga grupos de extremo reductores, y hacer reaccionar el polisacárido capsular y rPorB en presencia de iones cianoborohidruro, u otro agente reductor. Los grupos reductores se pueden formar por hidrólisis selectiva o por separación oxidativa específica, o una combinación de ambos. La vacuna de la presente invención comprende el conjugado Hib-rPor, en una cantidad efectiva que depende de la vía de administración. Aunque se prefieren las vías de administración subcutánea o intramuscular, la proteína de porina meningocócica del grupo B, la proteína de fusión o la vacuna de la presente invención también se pueden administrar por vía intraperitoneal, intravenosa o intranasal. Un experto en la técnica apreciará que las cantidades que se van a administrar para cualquier protocolo de tratamiento particular se pueden determinar fácilmente sin experimentación indebida. Se espera que las cantidades adecuadas se encuentran dentro del intervalo de 5 a 50 µg por animal, de manera más preferible de aproximadamente 10 µg por animal. La vacuna de la presente invención se puede utilizar en forma tales como cápsulas, soluciones líquidas, suspensiones o elixires para administración oral, o formas líquidas estériles tales como soluciones o suspensiones. Se utiliza preferiblemente cualquier portador inerte, tal como solución salina, solución salina amortiguada con fosfato o cualquier portador similar en el cual la vacuna conjugada tenga propiedades de solubilidad adecuadas. Las vacunas pueden estar en forma de preparaciones de una sola dosis o en frascos de dosis múltiples los cuales pueden ser utilizados para programas de vacunación en masa. Se hace referencia a Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, Osol (ed.) (1980) ; y New Trends and Developments in Vaccines, Voller et al . (eds.), University Park Press, Baltimore, MD (1978), para los métodos para la preparación y uso de vacunas . Las vacunas de la presente invención pueden comprender además adyuvantes los cuales mejoren la producción de anticuerpos específicos para H. influenzae . Tales adyuvantes incluyen, pero no se limitan a diversas formulaciones en aceite tales como adyuvante completo de Freund ' s (CFA) , esteariltirosina (ST, véase patente de los Estados Unidos número 4,258,029), el dipéptido conocido como MDP, saponina, hidróxido de aluminio y citocina linfática. El adyuvante de Freund ' s es una emulsión de aceite mineral y agua la cual se mezcla con una sustancia inmunogénica. Aunque el adyuvante de Freund's es poderoso, habitualmente no se administra a humanos. En vez de esto, se puede utilizar alúmina adyuvante (hidróxido de aluminio) o ST, para administración a un humano. La vacuna de conjugado se puede absorber en el hidróxido de aluminio desde el cual se libera lentamente después de la inyección. La vacuna de conjugado también puede ser encapsulada dentro de los liposomas, de acuerdo con Fullerton, patente de los Estados Unidos número 4,235,877. En otra modalidad preferida, el conjugado de la invención se combina con otros inmunógenos que son utilizados para vacunar animales. Por lo tanto, el conjugado de la invención se puede combinar con DTaP o DTaP IPV para administración al animal. DTaP es una combinación de vacuna para difteria, tétanos y pertusis acelular, la cual está disponible de Amvax, Inc., Beltsville, Maryland. En una modalidad preferida, la pertusis acelular es una forma oxidada como está disponible de Amvax, Inc. En otra modalidad preferida, la presente invención se relaciona con un método para inducir una respuesta inmune en un animal , que comprende administrar al animal la vacuna de la invención en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune. Opcionalmente, la vacuna de la invención se puede coadministrar con cantidades efectivas de otros inmunógenos como se mencionan antes para generar respuestas inmunes múltiples en el animal. Los siguientes ejemplos son ilustrativos, pero no limitantes, del método y composiciones de la presente invención. Otras modificaciones adecuadas y adaptaciones de la variedad de condiciones y parámetros normalmente encontrados en esta técnica los cuales son obvios para aquellos expertos en la técnica, están dentro del espíritu y alcance de la presente invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Expresidn, aislamiento, renaturalización y purificación de rPorB Cepas bacterianas, condiciones de crecimiento y reactivos - Se aisla ADN genómico de el grupo B de N. meningi tidis cepa 44/76 (serotipo 15) utilizando procedimientos estándar y se utiliza como una plantilla de reacción en cadena de polimerasa para amplificación del gen de proteína clase 3 como se describe en otra parte (47) . El producto amplificado se clona en los sitios Ndel y Xhol del plásmido pET17b (Novagen, Inc.) que se utiliza para transformar E. coli DH5a competente. El ADN plasmídico de las clonas seleccionadas de DH5a se aisla y utiliza para transformar E. coli BL21 [DE3] - L ompA. Los transformantes se seleccionan por carbenicilina y se induce la expresión por adición de IPTG hasta una concentración final de 0.4 mM.

Sobreexpresión de rPorB en E. coli y procedimientos de purificación y renaturalización . Se monitorearon los niveles de proteína rPorB expresados en diversos momentos después de la inducción al someter los extractos celulares a SDS-PAGE en geles de gradiente 8-16%, utilizando un sistema Novex (Novex, San Diego, CA) seguido por tinción con azul brillante de Comassie y análisis densitométrico utilizando Digital Imaging System, modelo IS-1000 (Alpha Innotech Co., San Leandro, CA) . Se aisla rPorB sobreexpresado al resuspender y lisar las células bacterianas con un disruptor de células impulsado por aire Stansted (Stansted Fluid Power Ltd.) en amortiguador TEN (Tris-HCl 50 mM, EDTA 1 mM, NaCl 100 mM, pH 8.0) seguido por centrifugación y aislamiento del sedimento que contiene rPorB agregado en forma de cuerpos de inclusión (IB) . Después de lavar el sedimento con desoxicolato 0.5% en amortiguador TEN, seguido por dos enjuagues con amortiguador TEN, la proteína se solubiliza al resuspender y sonicar los IB recién preparados en una solución de urea 8M durante 5 min utilizando un sonicador en baño de agua. La renaturalización de rPorB en su conformación nativa se obtiene al utilizar un procedimiento de renaturalización ayudado por detergente. Se combinan volúmenes iguales de los IB disueltos en urea y Z 3-14 10% (Calbiochem) y el extracto de porina final aplicado a una columna de Sephacryl S-300 (5 x 100 cm) (Pharmacia Biotech Inc.) equilibrada en un amortiguador que comprende Tris-HCl 100 mM, NaCl 200 mM, EDTA 10 mM, CaCl2 20 mM y Z 3-14 0.05%, pH 8.0. Las fracciones que contienen rPorB se identificaron por SDS-PAGE, se acumularon y se aplicaron a una columna de intercambio iónico Hiload Q-Sepharose HP (2.6 x 20 cm) (Pharmacia) equilibrada en Tris-HCl 25 mM, NaCl 200 mM, EDTA 1.0 mM y Z 3-14 0.05%, pH 8.0. Se aplica un gradiente de NaCl 0.2-1.0 mM y eluye rPorB como un pico único. Se determina la concentración de proteína al medir la absorbancia a 280 nM, utilizando un espectrofotómetro de exploración rápida HP modelo 8453 UV/Vis equipado con un detector de arreglo de diodo (Hewlett-Packard Company, Palo Alto, CA) , utilizando un coeficiente de extinción molar de 41,960 el cual se calcula en base en el contenido de aminoácido aromático de PorB, de acuerdo con Mach et al. (42) .

Ejemplo 2 Producción, purificación y oxidación de polisacárido PRP Se realiza la fermentación de 14 1 de H. influenzae tipo B utilizando medio MAE II, como sigue. Se obtiene H. influenzae tipo B, cepa Eagan en un frasco de cultivo de siembra de 4 ml a partir de un congelador de nitrógeno líquido Ultra Low y se calienta hasta la temperatura ambiente durante 30 minutos. Un matraz de agitación de 250 ml con 50 ml de medio MME II (10 mg/l de hemina) se inocula con 1 ml de cultivo de siembra para producir la semilla I (SI) . El matraz SI se inocula durante 10 horas a 37°C y 150 rpm en un incubador con agitador (Innova 4330, New Brunswick Sci) . Se utilizan 12 ml de SI para inocular 600 ml de MME II (10 mg/l de hemina) en un matraz Fernbach de 2.8 1 para producir Sil. El matraz Sil se incuba durante 9 horas a 37°C y 150 rpm en un incubador con agitación. Se utilizan 600 ml [4% (v/v) de inoculo] de cultivo Sil para inocular 13.4 1 de MME II (10 g/1 de xilosa, 10 mg/l de hemina) en un fermentador BIOFLO IV de 20 1 (New Brunswick Se.) . En la figura 2 se muestra un ejemplo de perfil de fermentación. Después de 10 h de fermentación, se inicia la cosecha por microfiltración utilizando un cartucho de fibra hueca con un tamaño de poro de 0.2 µm clasificado con un área superficial de 0.14 m2 elaborado de polisulfona (Milipore) . El permeado se filtra por esterilización en 20 1 de carboy el carboy se coloca a 2-8°C hasta que se procesa adicionalmente. El filtrado después se procesa a través de un filtro de corte de peso molecular (MWCO) de 300,000 (Milipore) y se retiene el permeado. Este permeado después se aplica a un filtro de 100,000 (MWCO) (Milipore) y se concentra a más de 20 mg/ml. El retenido se oxida a 25 °C durante 2 h con metaperyodato de sodio. El PRP oxidado se somete a ultrafiltración a través de un filtro de 30,000 MWCO (Milipore) y se retiene el permeado.

Este permeado después se aplica a un filtro de 5,000 MWCO (Milipore) , se concentra hasta una concentración final mayor de 90 mg/ml, se somete a diafiltración contra agua DI, y se liofiliza .

Ejemplo 3 Preparación de conjugado de PRP-PorB El rPorB utilizado para conjugación se muestra en la figura 3. El polisacárido PRP oxidado descrito previamente se agrega a una solución de rPorB (a una concentración de 10 mg/ml en HEPES 0.25 M, NaCl 0.2 M y Zwittergen 0.05%, 3,14 de pH 8.5) para elaborar una solución de polisacárido de 10 mg/ml. La solución se mezcla durante 1 min después de lo cual se agrega cianoborohidruro de sodio a una concentración final de 6 mg/ml . La solución después se coloca en un baño de agua a 28-30°C durante 16 a 24 h. La reacción de conjugación se detiene por la adición de una solución 2 M de etanolamina a pH 8.5 y se incuba de 28 a 30°C durante 16 a 24 horas adicionales. La mezcla de reacción después se aplica a una columna Grade preparativa de Superdex 200 (Pharmacia) preequilibrada y corrida con PBS que contiene timerosal 0.01%. La fracción que eluye en el volumen vacío de esta columna como se monitorea por absorbancia de UV 280 nm se recolecta, se acumula y almacena a 4°C antes de su análisis. Se realizan dos análisis químico para determinar el contenido de PRP (ensayo de orcinol/cloruro férrico/ácido clorhídrico (50) ) , y el contenido de rPorB (ensayo de proteína por Comassie (5) ) .

Ejemplo 4 Evaluación del conjugado PRP-rPorB en ratas A ratas Sprague-Dawley hembra (4-6 semanas de edad) en grupos de diez se les inyectó subcutáneamente con 10 µg de PRP conjugado en 0.5 ml de PBS que contiene timerosal 0.01%, ya sea no absorbido o preabsorbido en hidróxido de aluminio (Alhydrogel, Superfos, Dinamarca) (concentración final de aluminio elemental 1 mg/ml), los días 0, 28 y 49. Se realizan extracciones de sangre en los días 0, 28, 38 y 49 y los animales son sometidos a exsanguinación en el día 59.

Medición de anticuerpos séricos por ELISA . Los conjugados de albúmina sérica humana (HSA) (Sigma, St . Louis, MO) utilizados para ensayos de ELISA se preparan por aminación reductiva como se describe previamente. Se agrega el polisacárido PRP oxidado a HSA seguido por reducción con NaBH3CN, como se ha descrito (28) . Los conjugados se aislan por cromatografía de filtración en gel y se almacenan liofilizados a -70°C. Se determinaron los títulos de anticuerpo específicos para PRP mediante un ensayo inmunosorbente unido a enzima (ELISA) . Se recubren placas de microtitulación de fondo plano de 96 pozos, de poliestireno (NUNC Polysorb) (Nunc, Naperville, IL) con conjugados de PRP-HSA en PBS (fosfato de sodio 0.01 M, NaCl 0.15 M, pH 7.4) a 0.25 µg/pozo (100 µl/pozo) al incubar durante 1 hora a 37°C, seguido por un lavado (5 veces) con PBS-Tween (Tween 20 0.05% [v/v] en PBS). Todas las incubaciones subsecuentes se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Se utiliza PBS-Tween para todos los lavados requeridos. Las placas recubiertas después se bloquean con PBS y leche seca sin grasa Carnation 0.1% (p/v) para las pruebas de ELISA de IgM a 0.15 ml/pozo durante 1 hora, seguido por un lavado. Los sueros se diluyen dos veces, por duplicado, en la placa a 100 µl/pozo y se incuban durante 1 hora, seguido por un lavado. Se agrega el conjugado de anticuerpo (anticuerpo de chivo contra rata, marcado con peroxidasa [Kirkegaard & Perry Lab. Gaithersburg, MD] a 100 µl/pozo e incubado durante 30 minutos, seguido por un lavado. Se agrega una solución de colorante y sustrato 1:1 [Kirkegaard & Perry TMB y peróxido) a 0.05 ml/pozo y se incuba durante 10 minutos. Después se detiene la reacción de peroxidasa con H3P04 1 M a 0.05 ml/pozo, y la placa se lee en un lector de microplaca Molecular Devices Emax (Molecular Devices, Menlo Park, CA) a una longitud de onda de 450 nm, utilizando 650 nm como una longitud de onda de referencia. Se determinan absorbancias de fondo en varios pozos control sin suero y se promedian para cada placa. Para cada dilución de suero, se resta la absorbancia de fondo promedio, y se promedian los valores de absorbancia de suero por duplicado. Se utiliza una gráfica de Scatchard modificada para el análisis de datos subsecuente, en donde se gráfica la absorbancia (eje de las y) contra la absorbancia multiplicada por el recíproco de la dilución (eje de las x) (18,22). Bajo condiciones que permiten el equilibrio y el exceso de anticuerpos, se obtiene una línea recta para cada serie de diluciones de suero; esta línea se extrapola al eje x para la determinación de un título de anticuerpo. Se utiliza un suero de control positivo, con un título de anticuerpo determinado previamente, en cada placa, con el fin de proporcionar una referencia con la cual todos los sueros se estandarizan, minimizando las variaciones placa a placa y día a día. Los resultados de estos ensayos, comparando el conjugado PorB-PRP (con y sin alúmina) con conjugados construidos a partir de toxoide tetánico, CRM, se muestran en las figuras 4 y 5A-5H.

Ejemplo 5 Comparaciones de Hib-rPorB, Hib- TT y dos vacunas de Hib disponibles comercialmente Se compararon los efectos inmunoestimuladores de dos preparaciones de conjugados Hib-rPorB (Hib-rPorB-1 y Hib-rPorB-2) , el conjugado Hib TT (toxoide de tétanos) y dos vacunas disponibles comercialmente, HbOC de Lederle Laboratories, División of American Cyanamid Conpany, Pearl River, NY, (portador CRM), y PRP-T de Connaught Laboratories, Inc., Swiftwater, PA (portador de toxoide de tétanos) . Se inmunizaron ratas (4-6 semanas de edad) con dosis de PRP conjugado de 10 µg a l, 28 y 49 días. Además de las muestras preinmunes, se tomaron muestras de suero a los 28, 38, 49 y 59 días. Los resultados se muestran en las figuras 6A y 6B. El título de IgG de ELISA se refiere a los anticuerpos anti-polisacárido . La representación gráfica de los datos en la figura 6A muestra que los conjugados Hib-rPorB producen una respuesta por lo menos dos ordenes de magnitud mayor que el de las otras vacunas de conjugado. La figura 6B muestra los datos tabulados correspondientes. Los "sensibles" (que responden) se definen como aquellos que muestran títulos de ELISA de IgG mayores que o iguales a 4 veces por encima del valor preinmune, en donde todos los valores preinmunes son <50 y se ajustan a 25 para los cálculos. Se realizan en ratones experimentos similares comparando Hib-TT, Hib-rPorB y Hib-rPorB-2 utilizando dosificaciones de conjugado de 5.0 µg y 0.5 µg. En la figura 7 se muestran los datos. Finalmente, se comparan ocho preparaciones diferentes de Hib-rPorB (A-H en la figura 8) para los conjugados Hib-TT y Hib-CRM. Las preparaciones de Hib-rPorB fueron consistentemente dos órdenes de magnitud más estimuladoras que los conjugados Hib-TT o Hib-CRM, como se muestra por el ensayo de ELISA de anticuerpos IgG antipolisacárido en ratas. En la figura 8 se muestra este dato. Habiendo descrito ahora completamente esta invención, se comprenderá por aquellos habitualmente expertos en la técnica que la invención se puede llevar a la práctica dentro de un intervalo amplio y equivalente de condiciones, formulaciones y otros parámetros sin alterar el alcance de la invención o de cualquier modalidad de la misma. Todas las patentes, solicitudes de patentes y publicaciones mencionadas en la presente se incorporan por completo como referencia en la presente, en su totalidad.

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Claims (19)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un conjugado de polisacárido de H. influenzae tipo b (Hib) -proteína de membrana exterior meningocócica renaturalizada (rPorB) sustancialmente pura.

2. El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polisacárido tiene un intervalo de peso molecular de 5,000 a 50,000.

3. El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el conjugado se obtiene por aminación reductiva de un polisacárido Hib y rPorB, en donde el polisacárido Hib debe ser oxidado o hidrolizado selectivamente para proporcionar grupos aldehido.

4. El conjugado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el conjugado se obtiene por aminación reductiva de un polisacárido Hib y rPorB, en donde el polisacárido Hib debe ser oxidado para proporcionar grupos aldehido.

5. El conjugado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque rPorB es rPorB clase 3.

6. Un método para preparar un conjugado de polisacárido de Hib-rPorB, caracterizado porque comprende: (a) obtener un polisacárido de Hib; (b) oxidar o hidrolizar selectivamente el polisacárido para generar grupos aldehido; (c) obtener una rPorB; y (d) conjugar el polisacárido que contiene grupos aldehido con la rPorB, por aminación reductiva.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el polisacárido Hib se oxida y tiene un intervalo de peso molecular de 5,000 a 50,000.

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-7, caracterizado porque rPorB es una rPorB clase 3.

9. El conjugado, caracterizado porque se obtiene de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 6.

10. El conjugado, caracterizado porque se obtiene de acuerdo con el método de conformidad con la reivindicación 8.

11. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el conjugado de conformidad con la reivindicación 1 ó 9 y un portador farmacéuticamente aceptable.

12. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el conjugado de conformidad con la reivindicación 10 y un portador farmacéuticamente aceptable.

13. Un método para inducir una respuesta inmune en un animal contra H. influenzae, caracterizado porque comprende administrar el conjugado de conformidad con la reivindicación 1 ó 9 al animal en una cantidad efectiva para inducir tal respuesta inmune.

14. Un método para inducir una respuesta inmune en un animal contra H. influenzae, caracterizado porque comprende administrar el conjugado de conformidad con la reivindicación 10 al animal en una cantidad efectiva para inducir tal respuesta inmune.

15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el conjugado se obtiene por aminación reductiva de un polisacárido Hib y rPorB, en donde el polisacárido Hib se ha oxidado para proporcionar grupos aldehido.

16. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el conjugado se obtiene por aminación reductiva de un polisacárido Hib y rPorB, en donde el polisacárido Hib se ha oxidado para proporcionar grupos aldehido .

17. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el polisacárido tiene un intervalo de peso molecular de 5,000 a 50,000.

18. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque el polisacárido tiene un intervalo de peso molecular de 5,000 a 50,000.

19. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque rPorB es rPorB clase 3.