MXPA01008320A - Uso de una proteina ompa de enterobacterium asociada con un antigeno para generar una respuesta citotoxica antiviral, antiparasitaria o antitumoral - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a uso de una proteína OmpA de membrana de enterobacterium, en particular de Klebsiella pneumoniae asociada con un antígeno o un hapteno parapreparar una composición farmacéutica para generar o mejorar una respuesta T citotóxica dirigida contra una célula infecciosa o tumoral;la invención también concierne el uso de dichos compuestos para prevenir y tratar una infección o cáncer, en particular cánceres asociados con un antígeno tumoral tal como un melanoma, una composición farmacéutica que comprende algunos de dichos compuestos.

Description

USO DE UNA PROTEINA OMPA DE ENTEROBACTER1UM ASOCIADA CON UN ANTIGENO PARA GENERAR UNA RESPUESTA C.TOTOXICA ANTIVIRAL, ANTIPARASITARIA O ANTITUMORAL MEMORIA DESCRIPTIVA La invención se refiere al uso de una proteína OmpA de membrana, de enterobacterium, en particular Klebsiella pneumoniae, combinada con un antígeno o un hapteno, para preparar una composición farmacéutica que se pretende que genere o incremente una respuesta T citotóxica dirigida contra de un agente infeccioso o una célula tumoral. La invención comprende el uso de estos compuestos para prevenir y tratar infección o cáncer, en particular cánceres combinados con un antígeno tumoral, tal como melanoma, y también para composiciones farmacéuticas que comprenden algunos de estos compuestos. La inmunización es un medio efectivo de prevenir o reducir las infecciones virales o bacterianas. El éxito de las campañas de inmunización en estos dominios ha hecho posible extender el concepto de vacuna, hasta que ahora se usa en el dominio de ¡nfectología, en los dominios del cáncer y de enfermedades autoinmunes. Los antígenos solos administrados para inmunización al hospedero frecuentemente no son suficientemente inmunogénicos para inducir una respuesta inmune y deben, por lo tanto, combinarse con un adyuvante o acoplarse a una proteína acarreadora con el objeto de inducir (o incrementar) la inmunogenicidad. Bajo estas condiciones, solamente una respuesta inmune del tipo humoral puede ser inducida. Ahora, en el contexto de la terapia antiviral, es de gran importancia la generación de linfocitos T citotóxicos (CTL) capaces de reconocer y destruir el virus (Bachmann et al., 1994, Eur. J. Immunol., 24, 2228-2236; Borrow P., 1997, J. Viro!. Hepat, 4, 16-24), como se atestigua por muchos estudios que muestran, in vivo, el papel protector de las respuestas dirigidas contra epítopes virales (Arvin AM, 1992, J. Inf. Dis., 166, S35-S41 ; Koszinowski et al., 1987, Immunol. Lett., 16, 185-192). La importancia de las respuestas CTL se ha documentado ampliamente en las respuestas antitumorales, en particular aquellas dirigidas contra células de melanoma (revisión en Rivoltini et al., 1998, Crit. Rev. Immunol. 18, 55-63). El epítope(s) CTL (secuencia peptídica que interacciona con las moléculas de clase I y se presentan a los linfocitos T CD8+) se han definido por varios antígenos. Sin embargo, la dificultad yace en generar CTL in vivo, debido a la débil inmunogenicidad de estos péptidos (Melief, 1992, Adv. Cáncer Res., 58, 143-175; Nandaz y Sercaz, 1995, Cell, 82, 13-17). La investigación se dirige consecuentemente hacia la identificación de los adyuvantes novedosos, o un sistema de administración de antígeno, haciendo posible inducir los CTL. Debido a su efectividad en la presentación de los antígenos y en la estimulación del sistema inmune, las células dendríticas, por ejemplo, han sido usadas para generar respuestas antivirales CTL (Lude ig B et al., 1998, J. Virol., 72, 3812-3818; Brossard P. et al., 1997, J. Immunol., 158, 3270-3276) o respuestas CTL anticáncer (Nestle F.O. et al., 1998, Nat. Med., 4, 328-332). Los métodos han consistido en la carga de las células dendríticas ex vivo, con el antígeno de interés (péptido o lisado celular) y reimplantando estas células dentro del paciente. Otros métodos consisten en transfectar, ex vivo, las células dendríticas con el gen que codifica el antígeno de interés y al reinyectar estas células transfectadas (Gilbos E. et al., 1998, Cáncer Immunol. Immunother., 46, 82-87). Estos métodos se han usado exitosamente en ratones y recientemente en humanos (Hsu F.J. et al., 1996, Nat. Med., 2, 52-58), pero sin embargo permanece complejo puesto que las células deben tratarse ex vivo (transformación de las células o internalización de los antígenos) y transplantarse dentro del organismo hospedero (Layton G.T et al., 1993, J. Immunol., 151 , 1097-1107) o en el adyuvante incompleto de Freund (IFA) (Valmori et al., Eur. J. Immunol., 1994, 24, 1458-1462) hace posible generar respuestas CTL. Sin embargo, la inmunización antiviral o antitumoral llevada a cabo con péptidos que corresponden a epítopes CTL y en la presencia de dicho adyuvante pueden llevar a un estado de tolerancia específica, el cual puede, en ciertos casos, producir el efecto opuesto al deseado, es decir, un decremento en la respuesta inmune (Toes et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 7855-7860). Así, existe, ahora, una gran necesidad para un compuesto el cual, cuando se combina con una molécula, en particular un antígeno o hapteno, es capaz de generar CTL dirigidos contra dicha molécula. Dicho compuesto puede, en particular, usarse para preparar una composición de inmunización que se pretende que induzca protección inmune del tipo CTL antiviral, antibacteriano, antifungal, anti para sita rio o antitumoral. Sorprendentemente, se ha demostrado que una proteína de membrana externa de una bacteria gramm-negativa, en particular una proteína OmpA de enterobacterium tal como la proteína P40 de Klebsiella pneumoniae (proteína descrita en WO 95/27787 y WO 96/14415), tiene la propiedad de producir una respuesta CTL contra una molécula que esta covalentemente o no covalentemente asociada con ella, preferiblemente sin tener que añadir otro adyuvante. Por lo tanto, la presente invención se refiere al uso de una proteína OmpA de enterobacterium, o un fragmento de la misma o una secuencia de ácido nucleico que codifica dicha proteína OmpA o un fragmento de la misma, para preparar una composición farmacéutica que se pretende que genere o incremente una respuesta T citotóxica contra un agente infeccioso o una célula tumoral, in vitro o in vivo, preferiblemente in vivo, y también para preparar una composición farmacéutica que se pretende que genere o incremente dicha respuesta T citotóxica. En la presente invención, el término "proteína" se pretende que denote tanto a péptidos o proteínas y el término OmpA" (por "proteína de membrana externa") se pretende que denote proteínas de membrana externa del tipo A.

La expresión "fragmento de una proteína OmpA" se pretende que denote, en particular, cualquier fragmento de secuencia de aminoácidos incluida en la secuencia de aminoácidos de la proteína OmpA la cual, cuando se combina con un antígeno o hapteno específico para un agente infeccioso o para una célula tumoral, es capaz de generar o incrementar una respuesta citotóxica T dirigida contra dicho agente infeccioso o dicha célula tumoral, dicho fragmento de la proteína OmpA comprende al menos 5 aminoácidos, preferiblemente al menos 10 aminoácidos o más preferiblemente al menos 15 aminoácidos. La expresión "antígeno o hapteno específico para un agente infeccioso o para una célula tumoral" se pretende que denote, en particular, cualquier compuesto expresado por una agente infeccioso, tal como un virus, una bacteria, una levadura, un hongo o un parásito, o por una célula tumoral, o una estructura análoga de la misma, la cual, junta o en combinación con un adyuvante de inmunidad, es capaz de inducir una respuesta inmune específica para dicho agente infeccioso o para dicha célula tumoral. En la presente descripción, la expresión "análogo de un antígeno o hapteno" se pretende que denote, en particular, un compuesto que tiene similitud estructural con dicho antígeno o hapteno, capaz de inducir una respuesta inmunológica dirigida contra dicho antígeno o hapteno en un organismo inmunizado con anterioridad con dicho compuesto similar. Un objetivo de la invención también se usa como se reclama en la invención, caracterizado en tanto dicha composición farmacéutica también comprenda, combinada con dicha proteína OmpA de enterobacterium, un antígeno o un hapteno específico para dicho agente infeccioso o para dicha célula tumoral. Preferiblemente, la invención comprende el uso como se reclama en la invención, caracterizada por que dicho agente infeccioso es una partícula viral, una bacteria, una levadura, un hongo o un parásito. En una modalidad particular, la invención comprende el uso de una proteína OmpA de enterobacterium, o de un fragmento de la misma, como se reclama en la invención, caracterizada porque dicha proteína OmpA de enterobacterium, o un fragmento de la misma, se obtiene usando un método de extracción a partir de un cultivo de dicha enterobacterium. Los métodos para extraer proteínas bacterianas de membrana se conocen por los expertos en la técnica y no se desarrollarán en la presente descripción. Se puede hacer, por ejemplo, una mención, pero sin limitarse a la misma, del método de extracción descrito por Haeuw J.H. et al., (Eur. J.

Biochem, 255, 446-454, 1998). En otra modalidad preferida, la invención también comprende el uso de una proteína OmpA de enterobacterium, o de un fragmento de la misma, como se reclama en la invención, caracterizada porque dicha proteína OmpA de enterobacterium, o un fragmento de la misma, se obtiene vía la ruta recombinante. Los métodos para preparar las proteínas recombinantes son, actualmente, bien conocidas por los expertos en la técnica y no se desarrollarán en la presente descripción; sin embargo se puede hacer referencia a los métodos descritos en los ejemplos. Entre las células que pueden usarse para producir estas proteínas recombinantes, se debe mención, por supuesto, a las células bacterianas (Olins P.O. y Lee S.C., 1993, Recent advances in heterologous gene expression in E. coli. Curr. Op. Biotechnology 4: 520-525), y también células de levadura (Buckholz R.G., 1993, Yeast Systems for the Expression of Heterologous Gene Products. Curr. Op. Biotechnology 4:538-542), así como células animales, en particular los cultivos de células de mamífero (Edwaeds C.P. y Aruffo A., 1993, Current applications of COS cell based transient expression systems. Curr. Op. Biotechnology 4:558-563), y también células de insecto en las cuales los métodos pueden usarse los cuales implementen, por ejemplo, baculovirus (Luckow V.A., 1993, Baculovirus systems for the expression of human gene products. Curr. Op. Biotechnology 4:564-572). Completamente preferiblemente, el uso como el que se reclama en la invención está caracterizado en tanto que dicha enterobacterium sea Klebsiella pneumoniae. En particular, la invención se refiere al uso como se reclama en la invención, caracterizado en tanto que la secuencia de aminoácidos de dicha proteína OmpA de Klebsiella pneumoniae, o un fragmento de la misma, comprende: a) la secuencia de aminoácidos de la secuencia SEQ ID No. 2; b) la secuencia de aminoácidos de una secuencia que tiene al menos 80%, preferiblemente 90% y 95% de homología, después de un alineamiento óptimo, con la secuencia SEQ ID No. 2; o c) la secuencia de aminoácidos de un fragmento de al menos 5 aminoácidos, preferiblemente 10, 15, 20 y 25 aminoácidos, de una secuencia como se define en a). La expresión "ácido nucleico o secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de homología, después de un alineamiento óptimo con un ácido nucleico dado o una secuencia de aminoácidos" se pretende que denote una secuencia que, después de un alineamiento óptimo con dicha secuencia dada, comprende un porcentaje de identidad de al menos 80% con dicha secuencia dada. Para los propósitos de la presente invención, el término "porcentaje de identidad" entre las dos secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos se pretende que denote el porcentaje de nucleótidos o de residuos de aminoácidos que son idénticos entre las dos secuencias a ser comparadas, obtenidas después del mejor alineamiento, este porcentaje siendo puramente estadístico y las diferencias entre las dos secuencias estando distribuidas al azar y sobre sus longitudes totales. Las comparaciones entre dos secuencias de ácidos nucleicos o de aminoácidos se llevan a cabo convencionalmente al comparar estas secuencias después de que has sido alineadas óptimamente, dicha comparación se lleva a cabo por segmento o por "ventana de comparación" con el objeto de identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. El alineamiento óptimo de las secuencias para comparación se puede producir, de otra manera que manualmente, por medio del algoritmo de homología local de Smith y Waterman 1981 ) [Ad. App. Math. 2:482], o por medio del algoritmo de homología local de Neddleman y Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48:443], o por medio del método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman (1988) [Proc. Nati. Acacl. Sci. USA 85:2444], o por medio de software de computadora que usa estos algoritmos 8GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl, o con el software de comparación BLAST N o BLAST P. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácidos nucleicos o aminoácidos se determina al comparar estas dos secuencias las cuales se alinean óptimamente mediante la ventana de comparación en la que la región de la secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos a ser comparada puede comprender adiciones o deleciones con respecto a la secuencia de referencia para el alineamiento óptimo entre estas dos secuencias. El porcentaje de identidad esta calculado al determinar el número de posiciones idénticas para las que el nucleótido o residuo de aminoácido es idéntico entre las dos secuencias, dividiendo este número de posiciones idénticas por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado obtenido por 100 con el objeto de obtener el porcentaje de identidad entre estas dos secuencias.

Se puede hacer uso, por ejemplo, del programa BLAST "2 secuencias BLAST" el cual está disponible en el sitio http://www.ncbi.n1 m.nih.gov/gorf/bl2.html.los parámetros usados siendo aquellos dados por incumplimiento (en particular para el parámetro "sanción por espacio abierto" : 5, y el parámetro "sanción por extensión de espacio": 2; la matriz escogida siendo, por ejemplo, la matriz "BLOSUM 62" provista por el programa), el porcentaje de identidad entre las dos secuencias a ser comparadas siendo calculado directamente por el programa. Entre dichas secuencias que tienen al menos 80% de homología con referencia a la secuencia OmpA, se da preferencia a las secuencias de, o codificantes de, péptidos capaces de inducir actividad CTL específicamente contra el antígeno o hapteno que se combina con él, tal como la actividad CTL medida usando técnicas estándares descritas en los ejemplos aquí a continuación. La invención también comprende el uso como se reclama en la invención, caracterizada en tanto que dicho antígeno o hapteno se elige a partir de proteínas, lipopéptidos, polisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos, lípidos o cualquier compuesto capaz de dirigir específicamente la respuesta CTL contra dicho agente infeccioso o dicha célula tumoral. Un objetivo de la presente invención es también el uso como se reclama en la invención, caracterizada en tanto que dicho antígeno o hapteno está acoplado o mezclado con dicha proteína OmpA o un fragmento de la misma.

La invención también comprende el uso como se reclama en la invención, caracterizada en tanto que dicho antígeno o hapteno está acoplado mediante unión covalente, en particular mediante unión química, con dicha proteína OmpA o un fragmento de la misma. En una modalidad particular, el uso como se reclama en la invención está caracterizado en tanto que uno o más elementos de unión es (son) introducido dentro de dicha proteína OmpA, o un fragmento de la misma, y/o dentro de dicho antígeno o hapteno, con el objeto de facilitar el acoplamiento químico; preferiblemente, dicho elemento de unión introducido es un aminoácido. Como se reclama en la invención, es posible introducir uno o más elementos de unión, en particular aminoácidos, con el objeto de facilitar el acoplamiento de reacciones entre la proteína OmpA, o un fragmento de la misma, y dicho antígeno o hapteno. El acoplamiento covalente entre la proteína OmpA, o un fragmento de la misma, y dicho antígeno o hapteno como se reclama en la invención puede llevarse a cabo en el extremo N- o C-terminal de la proteína OmpA o de un fragmento de la misma. Los reactivos difuncionales que capacitan este acoplamiento se determinarán como una función del extremo de la proteína OmpA, o de un fragmento de la misma, la cual se elige para llevar a cabo el acoplamiento, y de la naturaleza de dicho antígeno o hapteno a ser acoplado. En otra modalidad particular, el uso como se reclama en la invención está caracterizada en tanto que el acoplamiento entre dicho antígeno o hapteno y dicha proteína OmpA, o un fragmento de la misma, se produce mediante recombinación genética, cuando dicho antígeno o hapteno es de naturaleza peptídica. Los conjugados derivados del acoplamiento a dicha proteína OmpA, o un fragmento de la misma, puede prepararse mediante recombinación genética. La proteína quimérica o híbrida (conjugada) puede producirse usando técnicas de ADN recombinante, al insertar o añadir una secuencia que codifica dicho antígeno o hapteno el cual es de naturaleza peptídica dentro de la secuencia de ADN que codifica dicha proteína OmpA o un fragmento de la misma. Los métodos para sintetizar las moléculas híbridas abarca los métodos usados en ingeniería genética para construir polinucleótidos híbridos que codifican secuencias polipeptídicas deseada. Ventajosamente, se puede hacer, por ejemplo, referencia, a la técnica para obtener genes que codifican para proteínas de fusión, descritas por D.V. Goeddel (Gene expression technology, Methods ¡n Enzymology, Vol. 185, 3-187, 1990). En otro aspecto, la invención se refiere al uso como se reclama en la invención, caracterizado en tanto que la composición farmacéutica comprende una construcción de ácido nucleico que codifica para dicha proteína híbrida, o comprende un vector que contiene una construcción de ácido nucleico que codifica dicha proteína híbrida o una célula hospedera transformada que contiene dicha construcción de ácido nucleico, la cual es capaz de expresar dicha proteína híbrida.

La invención también comprende el uso como se reclama en la invención, para preparar una composición farmacéutica que se pretende que elimine agentes infecciosos o inhiba el crecimiento tumoral. Preferiblemente, el uso como se reclama en la invención se refiere a la preparación de una composición farmacéutica que se pretende que prevenga o trate enfermedades infecciosas o cánceres, preferiblemente cánceres asociados con un antígeno tumoral. Entre los cánceres en los que los tumores expresan un antígeno tumoral asociado, y los cuales pueden prevenirse o tratarse con los usos como se reclama en la presente invención, se puede hacer mención, en particular, pero sin limitarse, de: • cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de colon y carcinoma gástrico (Kawashima, et al., 1999, Cáncer Res. 59:431-5); • mesotelioma, osteosarcoma y cánceres de cerebro (Xie et al., 1999, J. Nati. Cáncer. Inst.91 : 169-75); • melanoma (Zheuten et al., 1998, Bratilsl. Lek. Listy 99:426-34): • adenoma quístico del páncreas (Hammel et al., 1998, Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 10: 345-8); • cáncer colorectal (Ogura et al., 1998, Anticancer Res. 18:3669- 86); • carcinoma de la célula renal (Jantzer et al., 1998, Cáncer Res. 58:3078-86); y • cáncer del ovario y del cérvix (Sonoda et al., 1996., Cáncer. 77:1501-9). Un objetivo de la invención es en particular el uso de una proteína OmpA de enterobacterium, o de un fragmento de la misma, como se reclama en la invención, para preparar una composición de inmunización farmacéutica que se pretende que prevenga o trate una enfermedad infecciosa, en particular de origen viral, bacteriano, fungal o parasitario, o un cáncer, preferiblemente asociada con un antígeno tumoral, en particular melanomas. La invención también comprende el uso como se reclama en la invención, caracterizada en tanto que dicha composición farmacéutica se conforma en un vehículo en una forma que hace posible mejorar su estabilidad y/o su inmunogenicidad, en particular en la forma de un liposoma. Preferiblemente, la invención comprende el uso como se reclama en la invención, caracterizada en tanto que dicho vehículo es un vector viral que contiene una construcción de ácido nucleico que codifica dicha proteína OmpA o un fragmento de la misma, dicho antígeno o hapteno, o dicha proteína híbrida, o una célula hospedera transformada capaz de expresar dicha proteína OmpA o un fragmento de la misma, dicho antígeno o hapteno, o dicha proteína híbrida. La invención también comprende el uso como se reclama en la invención, caracterizada en tanto que dicha construcción de ácido nucleico, o la construcción de ácido nucleico contenida en dicho vector o dicha célula hospedera transformada, comprende una secuencia de ácido nucleico elegida a partir de la secuencia SEQ ID No. 1 , un fragmento de la misma que tiene al menos 15 nucleótidos consecutivos, preferiblemente 20, 25, 30, 40 y 50 nu eótidos consecutivos, de la secuencia SEQ ID No. 1 , o una secuencia que tiene al menos 80%, preferiblemente 90% y 95%, de homología, después del alineamiento óptimo, con una de dichas secuencias. En otro aspecto, la invención comprende una composición farmacéutica como se definió anteriormente en los usos como se reclama en la presente invención. Entre estas composiciones, se da preferencia a las composiciones farmacéuticas caracterizadas en tanto que ellas comprenden, en un medio farmacéuticamente aceptable, al menos una proteína OmpA de enterobacterium, o un fragmento de la misma, combinada, por mezcla o por acoplamiento, con al menos un antígeno o un hapteno asociado con o específico para una célula tumoral. Para los propósitos de la presente invención, el medio farmacéuticamente aceptable es el medio en el que los compuestos de la invención se administran, preferiblemente un medio el cual puede inyectarse dentro de humanos. Este puede consistir de agua, de una solución acuosa salina o de una solución acuosa basada en dextrosa y/o en glicerol. En una modalidad particular, la composición como se reclama en ia invención también contiene un detergente.

Las composiciones como se reclaman en la invención también pueden contener un detergente, y en particular cualquier tipo de agente tensioactivo farmacéuticamente aceptable, tal como por ejemplo agentes tensioactivos aniónicos, catiónicos, no iónicos o amfotéricos. Preferiblemente se hace uso de los detergentes zwiterdetergentes 3-12 y octilglucopiranósido, e incluso más preferiblemente de zwiterdetergente 3-14. Preferiblemente, la composición farmacéutica como se reclama en la invención está caracterizada en tanto que dicha proteína OmpA de enterobacterium, o un fragmento de la misma, se obtiene usando un método de extracción a partir de un cultivo de dicha enterobacterium o vía la ruta recombinante. De nuevo preferiblemente, la composición farmacéutica como se reclama en la invención está caracterizada en tanto que dicha enterobacterium es Klebsiella pneumoniae. En una modalidad preferida, la invención se refiere a una composición como se reclama en la invención, caracterizada en tanto que la secuencia de aminoácidos de dicha proteína OmpA, o un fragmento de la misma, comprende: a) la secuencia de aminoácidos de la secuencia SEQ ID No. 2; b) la secuencia de aminoácidos de la secuencia que tiene al menos 80% de homología con la secuencia SEQ ID No. 2; o c) la secuencia de aminoácidos de un fragmento de al menos 5 aminoácidos, preferiblemente 10, 15, 20 y 25 aminoácidos, de una secuencia como se definió en a). Entre los antígenos o haptenos que son parte de la composición como se reclama en la invención, se da preferencia a aquellos que se eligen a partir de péptidos, lipopéptidos, polisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos, lípidos o cualquier compuesto capaz de dirigir específicamente la respuesta CTL contra una célula tumoral. En una modalidad igualmente preferida, la invención se refiere a una composición como se reclama en la invención, caracterizada en tanto que dicho antígeno o hapteno está acoplado, mediante unión covalente, con dicha proteína OmpA, o un fragmento de la misma, en particular mediante acoplamiento producido mediante síntesis química y para la cual, cuando es apropiado, se pueden introducir uno o más elementos unidos, tales como aminoácidos, dentro de dicha proteína OmpA, o un fragmento de la misma, y/o dentro de dicho antígeno o hapteno, con el objeto de facilitar dicho acoplamiento químico. En una modalidad igualmente preferida, la invención se refiere a una composición como se reclama en la invención, caracterizada en tanto que el acoplamiento entre dicho antígeno o hapteno y dicha proteína OmpA, o un fragmento de la misma, se produce mediante recombinación genética, cuando dicho antígeno o hapteno es de naturaleza peptídica (expresión de una proteína híbrida).

Por lo tanto, la presente invención también se refiere a una composición como se reclama en la invención, caracterizada en tanto que la composición farmacéutica comprende una construcción de ácido nucleico que codifica dicha proteína híbrida, dicha construcción de ácido nucleico posiblemente esta contenida en un vector, o en una célula hospedera transformada capaz de expresar dicha proteína híbrida. En una modalidad preferida, la invención se refiere a una composición como se reclama en la invención, caracterizada en tanto que dicha construcción de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico elegida a partir de la secuencia SEQ ID No. 1 , o una secuencia que tiene al menos 80% de homología con una de dichas secuencias. Entre las composiciones como se reclaman en la invención, también se da preferencia a las composiciones farmacéuticas en vehículo en una forma que hace posible mejorar su estabilidad y/o su inmunogenicidad, en particular en la forma de un liposoma, de un vector viral que contiene una construcción de ácido nucleico que codifica dicha proteína OmpA, o un fragmento de la misma, dicho antígeno o hapteno, o dicha proteína híbrida, de una célula hospedera transformada capaz de expresar dicha proteína OmpA, o un fragmento de la misma, dicho antígeno o hapteno, o dicha proteína híbrida. En un aspecto final, la composición como se reclama en la invención está caracterizada en tanto que no contiene otros adyuvantes para inducir una respuesta CTL, además de dicha proteína OmpA de enterobacterium, o un fragmento de la misma, o una construcción de ácido nucleico que codifica dicha proteína OmpA, o un fragmento de la misma, un elemento característico de la composición como se reclama en la invención para inducir una respuesta CTL. Las leyendas de las figuras y ejemplos que siguen se pretende que ilustren la invención sin limitar en ningún sentido el alcance de la misma.

Leyenda de las figuras Figuras 1A, 1 B, 1 C y 1 D: Medición de la actividad anti-MELAN-A y anti-TRP-2 de CTL de las células efectoras. Después de la inmunización con 50 µg de hELA mezclada con 3 µg de rP40 (figura 1A), 50 µg de hELA mezclada con 300 µg de rP40 (figura 1 B), 50 µg de hELA acoplada a rP40 (figura 1 C) o 50 µg del péptido TRP-2 mezclado con 300 µg de rP40 (figura 1 D), las células drenadas del nodulo linfoide se estimulan con células EL-4 A2/kb (figuras 1A, 1 B y 1 C) o células EL-4 (figura 1 D) que han sido irradiadas y pre-estimuladas con 1 µM del péptido relevante, antes de ser evaluadas por su capacidad de eliminar células blanco la cuales pueden haber sido (rectángulo) o no (diamante) pre-estimuladas con el péptido relevante. El eje X de los puntos de las figuras 1A a 1 D corresponden a la relación de las células T efectoras (linfocitos activos) mezcladas junto con las células blanco (EL-4 A2/kb o EL-4).

Figuras 2A, 2B, 2C y 2D: Medición de la actividad anti-MELAN-A de CTL de las células efectoras en la presencia de la proteína rP40 en comparación con la actividad CTL obtenida con el protocolo estándar de inmunización. Después de la inmunización con hELA (50 µg) sola (figura 2A, ELA), hELA mezclada con 300 µg de rP40 (figura 2B, ELA + ELA), hELA acopiada a 300 µg de rP40 (figura 2C, ELA/P40) o hELA mezclada con 50 µg del péptido P30 con IFA como adyuvante (figura 2D, ELA + IFA + TT) (IFA por adyuvante incompleto de Freund y TT por Toxoide de tétanos), las células drenadas del nodulo linfático se estimulan in vitro por dos semanas con células EL-4 A2/kb las cuales han sido irradiadas y pre-estimuladas con 1 µM del péptido relevante, antes de ser evaluadas por su capacidad de eliminar células blanco EL-4 A2/kb las cuales pueden haber sido (rectángulo) o no (triángulo) pre-estimuladas con el péptido hELA. Figuras 3A, 3B, 3C y 3D: Actividad de CTL y efecto antitumoral de la inmunización con el péptido rP40 + TRP-2. Figura 3A: La inmunización con una mezcla del péptido TRP-2 con rP40 induce una respuesta CTL específica para el péptido. Los ratones C57BL/6 se inyectaron subcutáneamente con 50 µg del péptido TRP-2 mezclado con 300 µg de rP40. Diez días después, los nodulos linfáticos se disociaron y re-estimularon con células EL-4 irradiadas las cuales pueden haber sido (rectángulos) o no (diamantes) estimuladas con el péptido TRP-2.

Figuras 3B, 3C y 3D: Los ratones C57BL/6 recibieron 2 x 103 células del melanoma autólogo B16F10, subcutáneamente dentro del flanco. Simultáneamente (figuras 3B y 3D), o 4 días después (figura 3C), algunos de estos ratones fueron subcutáneamente inmunizados (en la base de la cola) con 50 µg del péptido TRP-2 mezclado con 300 µg de rP40 (o), y otros fueron inmunizados con la proteína P40 sola (M, para las figuras 3B y 3C) o con el péptido TRP-2 solo (M, para la figura 3D). A partir del día 18 postimplantación, el volumen de los tumores se midió. Figuras 4A, 4B y 4C: Medición de la actividad anti-OVA de CTL después de la inmunización con la proteína rP40 acoplada al péptido OVA p257-264. Los ratones C57BL/6 recibieron, por inyección subcutánea en la base de la cola, 200 µg de P40-Ova (-___.), de camas acopladas con Ova (O), de Ova solubilizada (O), u Ova-BS3 (A) (BS3 por suberato de bis(siccinimidil)), de P40 (<-), o de DT-Ova (•) (DT por toxoide diftérico). Las células blanco de timoma EL4 pulsadas con 50 µg/ml del péptido OVA (figura 4B) o no pulsadas (figura 4C), o transfectadas con el gen ova (línea E.G7) (figura 4A) se incuban con 51Cr a 37 °C y cultivadas con las células efectoras.

EJEMPLO 1 Clonación del gen que codifica la proteína P40 de Klebsiella pneumoniae El gen que codifica la proteína P40 se obtuvo por amplificación de PCR usando el ADN genómico de Klebsiella pneumoniae IP 1145 (Nguyen et col., Gene, 1998). El fragmento del gen que codifica este gen se inserta dentro de varios vectores de expresión bajo el control de varios promotores, en particular el del operón Trp. La secuencia nucleotídica y la secuencia peptídica de la proteína P40 se representan por las secuencias SEQ ID No. 1 y SEQ ID No. 2 de aquí en adelante. Una cepa productora K12 de E. coli se transformó con un vector de expresión pvaLP40. La proteína P40 recombinante (denominada rP40) se produce, en la forma de cuerpos de inclusión, con una producción considerable (> 10% de proteína/g de biomasa seca). Este ejemplo es solamente una ilustración de la expresión de la proteína rP40, esta posible ilustración se extiende a otras cepas bacterianas y a otros vectores de expresión.

EJEMPLO 2 Método de fermentación de las proteínas de fusión rP40 Un matraz Erlenmeyer que contenía 250 ml de medio TSB (Caldo tríptico de soja, Difco) que contiene ampicilina (100 µg/ml, Sigma) y tetraciclina (8 µg/ml, Sigma) se inocula con la cepa de E. coli transformada descrita anteriormente. Después de la ¡ncubación durante toda la noche a 37 °C, 200 ml de este cultivo se usó para sembrar 2 litros de medio de cultivo en un fermentador (Biolaffite, Francia). De un modo rápido convencional, el medio de cultivo puede estar compuesto por agentes químicos suplementados con vitaminas y/o extractos de levadura, que se conocen promueven alta densidad de crecimiento de células bacteriana. Los parámetros controlados durante la fermentación son: pH, agitación, temperatura, nivel de oxigenación y abastecimiento de fuentes combinadas (glicerol o glucosa). En general, el pH se regula a 7.0 y la temperatura se fija a 37 °C. El crecimiento se controla al suministrar glicerol (87%) a una velocidad constante (12 ml/h) con el objeto de mantener la señal de tensión de oxígeno disuelto a 30%. Cuando la turbidez del cultivo (medida a 580 nm) alcanza el valor de 80 (después de cultivar por aproximadamente 24 horas), la producción de proteína se trata al añadir ácido indol acrílico (lAA) a la concentración final de 25 mg/l. Aproximadamente 4 horas después de la inducción, las células se cosechan mediante centrifugación. La cantidad de biomasa húmeda obtenida es de aproximadamente 200 g.

EJEMPLO 3 Método para extraer y purificar la proteína rP40 Después de la centrifugación del caldo de cultivo (4000 fm (revoluciones por minuto), 10 min, 4°C), las células se resuspenden en un regulador de pH Tris-HCl 25 mM, pH 8.5. Los componentes ¡nsolubles, o cuerpos de inclusión, se obtienen después del tratamiento con lisozima (0.5 g/litro, 1 hora a temperatura ambiente con agitación suave). El concentrado de cuerpos de inclusión obtenido por centrifugación (15 min a 10,000 g a 4 °C) se toma en regulador de pH Tris-HCl 25 mM a pH 8.5 que contiene MgCI2 5 mM y entonces se centrifuga (15 min a 10,000 g). Los cuerpos de inclusión se solubilizan a 37 °C por 2 horas en regulador de pH Tris-HCl 25 mM, pH 8.5, que contiene urea 7M (agente desnaturalizante) y ditioteritol 10 mM (reducción de puente disulfuro). La centrifugación (15 min a 10,000 g) hace posible eliminar las partículas insolubles. Esto se sigue por la resuspensión en 13 volúmenes de regulador de pH Tris-HCl 25 mM, pH 8.5, que contiene NaCI (8.76 g/l) y Zwiterdetergente 3-14 (0.1 %, p/v). La solución se dejó a temperatura ambiente durante toda la noche con agitación suave en contacto con el aire (para promover renaturalización de la proteína por dilución y reoxidación de los puentes disulfuro).

Purificación de la proteína rP40 Paso de cromatografía de intercambio aniónico Después de una centrifugación adicional, la solución se dializa contra regulador de pH Tris-HCl 25 mM, pH 8.5, que contiene 0.1 % de zwiterdetergente 3-14 (100 volúmenes de regulador de pH) durante toda la noche a 4 °C. El dializado se carga en una columna que contiene un soporte del tipo de ¡ntercambiador aniónico fuerte (Biorad Macro Prop High Q gel) equilibrado en el regulador de pH descrito anteriormente, a una velocidad de flujo lineal de 15 cm/h. Las proteínas se detectan a 280 nm. La proteína rP40 se eluye, con una velocidad de flujo lineal de 60 cm/h, para una concentración de NaCI de 0.2 M en el regulador de pH Tris-HCl 25 mM, pH 8.5: 0.1 % Zwiterdetergente 3-14.

Paso de cromatografía de intercambio catiónico Las fracciones que contienen la proteína rP40 se agrupan y se concentran con la ayuda de un sistema Amicon cell con agitación, usado con una membrana Diaflo tipo YM10 (umbral de selección de 10 kDa), para volúmenes de alrededor de 100 ml, o con la ayuda de un sistema de filtración por flujo tangencial Millipore Minitan, usado con platos de membrana que tienen un umbral de selección de 10 kDa, para volúmenes mayores. La fracción así concentrada se dializa durante toda la noche a 4C contra un regulador de pH de citrato 20 mM, pH 3.0, que contiene 0.1% de Zwiterdetergente 3-14. El dializado se carga en una columna que contiene un soporte del tipo de ¡ntercambiador catiónico fuerte (Biorad Macro Prep High S gel) equilibrado en el regulador de pH de citrato 20 mM, pH 3.0, que contiene 0.1% de Zwiterdetergente 3-14. La proteína rP40 se eluye (velocidad 61 cm/h) para una concentración de NaCI de 0.7 M. Los perfiles electroforéticos muestran alrededor de 95% de título de pureza. La condición de la proteína se monitorea por SDS-PAGE. La proteína P40, extraída a partir de la membrana de Klebsiella pneumoniae, tiene una conducta electroforética (migración) característica que depende de si está en su forma desnaturalizada o nativa. La forma nativa (estructura en lámina ß) de hecho tiene una masa molecular inferior que la forma que se desnaturaliza (estructura en ahélice) por la acción de un agente desnaturalizante, tal como urea o hidrocloruro de guanidina, o mediante calentamiento a 100 °C en la presencia de SDS. La proteína rP40 no se renaturaliza adecuadamente al término de la renaturalización, a pesar de si esta última se lleva a cabo en la presencia o ausencia de 0.1 % del Zwiterdetergente 3-14 (resultados negativos en la ausencia de detergente).

EJEMPLO 4 Generación de CTL Las respuestas CTL antitumorales dirigidas contra las células del melanoma se definieron por varios antígenos. Estos antígenos se incluyeron en una de tres categorías: a) antígeno de rechazo específico para melanoma, tal como aquellos de la familia MAGE (revisión por van der Bruggen et al., Science 254: 1643); b) antígenos resultantes a partir de la mutación de proteínas normales. Este grupo incluye a los antígenos de diferenciación MUM-1 (Coulie et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 92:7976-7980 (1995)); CDK4 (Wolfel et al., Science 296:1281-1284 (1995)) y HLA-A2 (Brandel et al., J. Exp. Med. 183:2501-2508 (1996)); c) antígenos de diferenciación expresados por melanomas y melanocitos. Este grupo incluye tirosinasa (Wolfel et al., Eur. J. Immunol. 4:759 (1994) y Brichard et al., Eur. J. Immunol. 26:224 (1996), Cox et al., Science 264:716 (1994), y Kawakami et al., J. Immunol. 155:3961 (1995)); gp75 (wang et al., J. Exp. Med. 183:1131 (1996)), y Mart-1/MelanA (ver patente de E.U.A. 5,620,886). De todos estos antígenos, Mart-1/MelanA parece ser el mejor candidato para uso en inmunoterapia, siendo esto por varias razones.

Primeramente, este antígeno se identificó con base a la respuesta CTL, in vivo, de los linfocitos infiltrantes del melanoma y no de, in vitro, las células sanguíneas periféricas, lo cual podría sugerir una mayor relevancia de este antígeno en la respuesta natural, in vivo, contra el melanoma (Kawakami et al., J. Exp. Med. 180:347 (1994)). Además, Mart-1/MelanA se expresa en todos los melanomas examinados, lo cual lo hace un blanco preferido para la intervención por inmunoterapia. Finalmente, los péptidos derivados de Mart-1/MeianA son capaces de inducir una respuesta específica CTL en pacientes con melanoma que expresan el antígeno de histocompatibilidad HLA-A2 (Rivoltini et al., J. Immunol. 160:1750 (1998)). HLA-A2 es el alelo más común expresado en Caucásicos. Los epítopes CTL de Mart-1/MelanA se han definido para este alelo. El péptido antigénico reconocido por la mayoría de las líneas humanas CTL comprenden los aminoácidos 27-35 AAGIGILTV (Kawakami et al., J. Exp. Med. 180:347 (1994)). Además, los estudios de la afinidad de la unión con HLA-A*0201 y el reconocimiento por las clonas CTL han demostrado que el péptido óptimo para estas dos funciones es el decapéptido 26-35 EAAGIGILTV (Romero et al., J. Immunol. 159: 2366 (1997)). Sin embargo, parece que estos péptidos son débilmente inmunogénicos in vitro (Valmori et al., J. Immunol. 160:1750 (1998)) e in vivo (Jaeger et al., Int. J. Cáncer 66:162 (1996)). Cuando se compara la secuencia de aminoácidos de los epítopes T de Mart-1/MelanA con los motivos peptídicos de A*0201 (Rammensee et al., Immunogenetics 41 :178 (1995)), parece que los péptidos 26-35 y 27-35 tienen residuos de anclaje no dominantes en la posición 2 y por lo tanto se unen débilmente a la molécula HLA-A*0201 (Kawakami et al., J. Immunol. 154:3961 (1995)), lo cual puede explicar su débil inmunogenicidad. La solicitud de patente internacional publicada bajo el número WO 98/58951 describe un análogo del péptido 26-35, en el que la alanina en la posición 2 ha sido reemplazada con una leucina (secuencia que se denominará ELA de la secuencia SEQ ID No. 3). El péptido hELA, usado en los experimentos a continuación, es el sujeto de la solicitud de patente WO 98/58951 la cual es propiedad del Institut Ludwig de Recherche sur le Cáncer [Instituto Ludwig de Investigación en Cáncer]. HELA es un análogo del decapéptido 26-35 (EAAGIGILTV) de MelanA/Mart-1 , la cual es una proteína expresada en melanocitos y melanomas. Aunque el decapéptido 26-35 de MelanA / Mart-1es capaz de unir a la molécula HLA-A0201 (Romero et al., 1997, J. Immunol. 159, 2366-2374), es un débil inmunogénico in vitro e in vivo (Valmori et al., 1998, J. Immunol. 160: 1750-1758). El análogo hELA se generó al substituir el segundo aminoácido del decapéptido 26-35 de MelanA / Mart-1 (una alanina) con una leucina. El resultado de esta substitución, la cual se basa en el análisis de los residuos requeridos para anclar los péptidos a la molécula HLA-A0201 , es un reconocimiento más efectivo por los CTL de los pacientes con melanoma y una mejor inmunogenicidad in vitro (Valmori et al., 1998, J. Immunol. 160: 1750-1758). Los ratones transgénicos HLA-A*0201/kb (A2/kb) de la cepa C58BI/6 x BDA/2 (Vitiello et al., 1991 , J. Exp. Med., 173, 1007-1015) se usaron en este estudio para evaluar ELA. La molécula MHC de clase I expresada en estos ratones es una molécula quimérica hecha de los dominios a1 y a2 de la molécula humana HLA-A0201 (el alotipo más común encontrado) y del dominio a3 de la molécula de murino Kb. El péptido TRP-2 de la secuencia SEQ ID No. 4 es un octapéptido que corresponde a los aminoácidos 181-188 (VYDFFVWL) de la proteína 2 relacionada con tirosinasa (TRP-2). La TRP-2 se expresa en melanocito y melanomas. Se ha demostrado que este antígeno induce las respuestas CTL que protegen contra melanoma en los ratones C57BL/6 (H-2Kb) (Bloom et al., 1997, J. Exp. Med. 185, 453-459).

A: Generación de CTL anti-Melan-A y anti-TRP-2 después de inmunización con rP40 mezclada con un péptido el cual es un análogo de Melan-A o TRP-2 Protocolo experimental Los ratones A2/Kb recibieron, por inyección subcutánea en la base de la cola: - 50 µg de ELA mezclada con 3 o 300 µg de rP40; - 50 µg de ELA covalentemente acoplada a 300 µg de rP40. Los ratones C57BL7& recibieron, por inyección subcutánea en la base de la cola: - 50 µg del péptido TRP-2 (181-188) mezclado con 300 µg de rP40.

Generación de células efectoras citotóxicas 10 días después de la inmunización, los ratones se sacrificaron y se recuperaron los linfocitos a partir de los nodulos linfoides drenados con el objeto de ser estimulados, in vitro, con el péptido relevante. Estos linfocitos (4 a 5 x 106) se cultivaron en una caja de 24 pozos en DMEM más HEPES 10 mM, FCS al 10% y ß-2-mercaptoetanol 50 µM, con 2 a 5 x 105 células EL-4 A2/Kb o células EI4 las cuales habían sido irradiadas (10 kRads) y pre-estimuladas por 1 h a 37 °C con 1 µM del péptido relevante. Después de dos estimulaciones semanales, las células se evaluaron para su actividad citotóxica.

Medición de la actividad citotóxica Las células EL-4 A2/Kb o células EL4 se incuban por 1 h con 51Cr en presencia o ausencia del péptido relevante, se lavaron y luego se coincubaron con las células efectoras a varias proporciones, en un a caja de 96 pozos en un volumen de 200 µl por 4 a 6 h a 37 °C. Entonces las células se centrifugan y el 51Cr liberado se mide en 100 µl del sobrenadante. El porcentaje de lisis específica se calcula como sigue: % de lisis específica = (liberación experimental - liberación espontánea) / (liberación total - liberación espontánea) X 100.

Resultados Como se muestra en las figuras 1A a 1D, la inmunización de los ratones con una dosis óptima de rP40 (300 µg) en una mezcla con hELA (figura 1 B) o TRP-2 (figura 1 D) induce una fuerte respuesta CTL específica. Dicha respuesta también se observa después de la inmunización con rP40 acoplada a hELA (figura 1C). Por otra parte, la inmunización con el péptido solo o rP40 sola (resultados no mostrados) o con el péptido hELA en una mezcla con una dosis subóptima de rP40 (3 µg) no induce ninguna actividad CTL (figura 1A). Estos resultados demuestran que la molécula rP40 mezclada con o acoplada a péptidos inmunogénicos hace posible inducir una respuesta específica CTL in vivo, esto siendo posible sin la adición de un adyuvante.

B: Generación de CTL anti-Melan-A después de la inmunización con rP40 mezclada con un péptido el cual es análogo a Melan-A. en comparación con un protocolo de inmunización estándar Protocolo experimental Los ratones A2/Kb recibieron: - 50 µl de IFA (adyuvante incompleto de Freund) por inyección subcutánea en la base de la cola, luego, 3 semanas después, 50 µg de hELA en la presencia de 50 µg de un péptido p30 de célula T ayudadora derivado de toxoide tetánico (TT) (Panina- Bordignon et al., Eur. J. Immunol., 1989, 19, 2237) adyuvante con IFA. Este protocolo se ha descrito para generar CTL anti- péptido (Valmori et al., Eur. J. Immunol. 1994, 24, 1458) y se usa como control positivo. 50 µg de hELA sola o 300 µg de rP40 mezclado con o acoplado a 50 µg de hELA.

Generación de células efectoras citotóxicas 10 días después de la inmunización, los ratones se sacrificaron y se recuperaron los linfocitos a partir de los nodulos linfoides drenados con el objeto de ser estimulados, in vitro, con el péptido relevante. Estos linfocitos (4 a 5 x 106) se cultivaron en una caja de 24 pozos en DMEM más HEPES 10 mM, FCS al 10% y ß-2-mercaptoetanol 50 µM, con 2 a 5 x 105 células EL-4 A2/Kb (células de murino transfectadas con el gen HLA-A* 0201/Kb) las cuales habían sido irradiadas (10 kRads) y pre-estimuladas por 1 h a 37 °C con 1 µM del péptido relevante. Después de una, dos o tres estimulaciones semanales, las células se evaluaron para su actividad citotóxica. La actividad citótóxica se mide de acuerdo con el método descrito anteriormente.

Resultados Después de la inmunización con rP40 sin adyuvante acoplada a hELA, se midió una actividad CTL anti-hELA comparable a la observada después de la inmunización con hELA + P30/IFA (cf. Figuras 2D a 2D). Similarmente, la mezcla de péptido rP40 + hELA, ésta también sin adyuvante, genera CTL de manera similar a la obtenida con un protocolo convencional para generar CTL (cf. Figuras 2B y 2D). No se detectó ninguna actividad CTL después de la inmunización con el péptido solo (cf. Figura 2A) o de la proteína rP40 sola (no mostrada), sin importar el día en el que las células efectoras se estimularon.

EJEMPLO 5 Efecto antitumoral de la inmunización con una mezcla de rP40 y de un péptido expresado por un melanoma de ratón Con el objeto de evaluar la capacidad de rP40 para generar una respuesta CTL antitumoral, se evaluó la capacidad de la proteína rP40 para inducir una respuesta CTL dirigida contra el péptido de la secuencia SEQ ID No. 4 (VYDFFVWL). El péptido de la secuencia SEQ ID No. 4 (VYDFFVWL) se deriva de la Proteína 2 Relacionada con Tirosinasa (TRP-2) la cual se expresa por el melanoma B16F10 derivado de ratones C57BL/6. Este péptido es inmunogénico en esta cepa. Se evaluó el crecimiento de las células B16F10 implantadas dentro de los ratones C57BL/6 los cuales fueron o no inmunizados con una mezcla de rP40 y del péptido TRP-2.

Protocolo experimental Para generar una respuesta CTL anti péptido TRP-2, se usó un protocolo idéntico al descrito en el ejemplo 4, excepto que, en esta ocasión, se usaron los ratones C57BL/6. Para los ejemplos de protección, los ratones C57BL/6 recibieron 2 x103 células del melanoma autólogo B16F10, por infección simultánea (s.c.) dentro del flanco. Simultáneamente, o 4 días después, algunos de estos ratones se inmunizaron subcutáneamente (en la base de la cola) con 50 µg del péptido TRP-2 mezclado con 300 µg de rP40. El crecimiento del tumor se midió entonces a intervalos regulares.

Resultados Como se muestra en la figura 3A, la inmunización con una mezcla del péptido TRP-2 y de la proteína RP40 es capaz de generar una respuesta CTL específica a este péptido. Lo cual confirma los resultados con la proteína hELA (descrita en el ejemplo 4). Además, esta respuesta CTL se asocia con la inhibición del crecimiento del melanoma B16F10 (figuras 3B, 3C y 3D). Es valioso evidenciar que esta protección es significante no solamente cuando la inmunización con el péptido TRP-2 + rP40 se lleva a cabo simultáneamente con la implantación del tumor (figuras 3b y 3D), sino también cuando se lleva a cabo 4 días después de la implantación (figura 3C). Estos resultados muestran claramente el efecto terapéutico del uso de una proteína OmpA de enterobacterium, tal como la proteína OmpA de K. pneumoniae, combinada con un péptido antigénico tumoral, con el objeto de inducir una respuesta CTL específica la cual es efectiva para prevenir o tratar cáncer, tal como melanoma.

EJEMPLO 6 Generación de CTL anti-OVA después de inmunización con rP40 acoplada al péptido P257-264 de Ova El péptido p257-264 de Ova es un octapéptido que corresponde al fragmento de la secuencia consenso de ovoalbúmina la cual está entre los aminoácidos en la posición 257 a 264 de la secuencia de ovoalbúmina (extremos incluidos). La ovoalbúmina se usa como un péptido el cual protege contra células tumorales que expresan ovoalbúmina.

Protocolo experimental Los ratones C57BL/6 recibieron, por inyección subcutánea en la base de la cola, 200 µg de P40-Ova (D), de camas acopladas con Ova (O), de Ova solubilizada (O), u Ova-BS3 (D) (BS3 por suberato de bis(siccinimidil)), de P40 (<-), o de DT-Ova (•) (DT por toxoide diftérico).

Generación de células efectoras citotóxicas 7 días después de la inmunización, los ratones fueron sacrificados y los bazos se recuperaron. Las células del bazo (4 x 107) se cultivaron en botellas, en DMEM con 1.5 x 106 de células E.G7 irradiadas (4 kRads).

Medición de la actividad citotóxica Las células EL4 de timoma las cuales se expusieron o no momentáneamente al péptido OVA o se transfectaron con el gen ova (línea E.G7) se incubaron con 51Cr a 37 °C y se cultivaron con las células efectoras obtenidas anteriormente. El porcentaje de lisis específica se calcula como se describe en el ejemplo 4A.

Resultados Como se muestra en las figuras 4A a 4D, la inmunización de los ratones con la proteína rP40 acoplada a o mezclada con el péptido OVA induce una fuerte respuesta CTL específica. Esta respuesta es similar a la observada después de la inmunización con el control positivo, es decir las camas acopladas a ovoalbúmina (ver figuras 4A y 4B). Por otra parte, la inmunización con ovoalbúmina soluble, ova-BS3 y DT-Ova no es efectiva. Estos resultados demuestran que el módulo rP40 acoplado a un péptido inmunogénico induce una respuesta específica CTL in vivo, esto siendo posible sin la adición de un adyuvante.

LISTADO DE SECUENCIA <110> PIERRE FABRE MEDICAMENT <120> USO DE UNA PROTEINA OmpA DE ENTEROBACTERIUM ASOCIADA CON UN ANTIG?NO PARA GENERAR UNA RESPUESTA CITOTOXICA ANTIVIRAL, ANTIPARASITARIA O ANTITUMORAL <130> D 17921 <140> PCT/FR 00/00393 <141> 2000-02-17 <150> FR 99 01917 <151> 1999-02-17 <160> 4 <170> Patente En Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1035 <212> ADN <213> Klebsiella pneumoniae <220> <221> exón <222> (1) .. (1032) <220> <221> intrón <222> (1033) .. (1035) <220> <221> CDS <222> (1) . . (1032) <400> 1 atg aaa gca att ttc gta ctg aat gcg get ceg aaa gat aac acc tgg 48 Met Lys Ala lie Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp 1 5 10 15 tat gca ggt ggt aaa ctg ggt tgg tcc cag tat cae gac acc ggt ttc 96 Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe 20 25 30 tac ggt aac ggt ttc cag aac aac aac ggt ceg acc cgt aac gat cag 144 Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln 35 40 45 ctt ggt get ggt gcg ttc ggt ggt tac cag gtt aac ceg tac etc ggt 192 Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly 50 55 60 ttc gaa atg ggt tat gac tgg ctg ggc cgt atg gca tat aaa ggc age 240 Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser 65 70 75 80 gtt gac aac ggt get ttc aaa get cag ggc gtt cag ctg acc get aaa 288 Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys 85 90 95 ctg ggt tac ceg ate act gac gat ctg gac ate tac acc cgt ctg ggc 336 Leu Gly Tyr Pro lie Thr Asp Asp Leu Asp lie Tyr Thr Arg Leu Gly 100 105 110 ggc atg gtt tgg cgc get gac tcc aaa ggc aac tac get tet acc ggc 384 Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly 115 120 125 gtt tcc cgt age gaa cae gac act ggc gtt tcc cea gta ttt get ggc 432 Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly 130 135 140 ggc gta gag tgg get gtt act cgt gac ate get acc cgt ctg gaa tac 480 Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp lie Ala Thr Arg Leu Glu Tyr 145 150 155 160 cag tgg gtt aac aac ate ggc gac gcg ggc act gtg ggt acc cgt cct 528 Gln Trp Val Asn Asn lie Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro 165 170 175 gat aac ggc atg ctg age ctg ggc gtt tcc tac cgc ttc ggt cag gaa 576 Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Glu 180 185 190 gat get gca ceg gtt gtt get ceg get ceg get ceg get ceg gaa gtg 624 Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val 195 200 205 get acc aag cae ttc acc ctg aag tet gac gtt ctg ttc aac ttc aac 672 Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn 210 215 220 aaa get acc ctg aaa ceg gaa ggt cag cag get ctg gat cag ctg tac 720 Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr 225 230 235 240 act cag ctg age aac atg gat ceg aaa gac ggt tcc get gtt gtt ctg 768 Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu 245 250 255 ggc tac acc gac cgc ate ggt tcc gaa get tac aac cag cag ctg tet 816 Gly Tyr Thr Asp Arg lie Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser 260 265 270 gag aaa cgt get cag tcc gtt gtt gac tac ctg gtt get aaa ggc ate 864 Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly lie 275 280 285 ceg get ggc aaa ate tcc get cgc ggc atg ggt gaa tcc aac ceg gtt 912 Pro Ala Gly Lys lie Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val 290 295 300 act ggc aac acc tgt gac aac gtg aaa get cgc get gcc ctg ate gat 960 Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu lie Asp 305 310 315 320 tgc ctg get ceg gat cgt cgt gta gag ate gaa gtt aaa ggc tac aaa 1008 Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu lie Glu Val Lys Gly Tyr Lys 325 330 335 gaa gtt gta act cag ceg gcg ggt taa 1035 Glu Val Val Thr Gln Pro Ala Gly 340 <210> 2 <211> 344 <212> PRT <213> Klebsiella pneumoniae <400> 2 Met Lys Ala lie Phe Val Leu Asn Ala Ala Pro Lys Asp Asn Thr Trp' 1 5 10 15 Tyr Ala Gly Gly Lys Leu Gly Trp Ser Gln Tyr His Asp Thr Gly Phe 20 25 30 Tyr Gly Asn Gly Phe Gln Asn Asn Asn Gly Pro Thr Arg Asn Asp Gln 35 40 45 Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly Gly Tyr Gln Val Asn Pro Tyr Leu Gly 50 55 60 Phe Glu Met Gly Tyr Asp Trp Leu Gly Arg Met Ala Tyr Lys Gly Ser 65 70 75 80 Val Asp Asn Gly Ala Phe Lys Ala Gln Gly Val Gln Leu Thr Ala Lys 85 90 95 Leu Gly Tyr Pro lie Thr Asp Asp Leu Asp lie Tyr Thr Arg Leu Gly 100 105 110 Gly Met Val Trp Arg Ala Asp Ser Lys Gly Asn Tyr Ala Ser Thr Gly 115 120 125 Val Ser Arg Ser Glu His Asp Thr Gly Val Ser Pro Val Phe Ala Gly 130 135 140 Gly Val Glu Trp Ala Val Thr Arg Asp lie Ala Thr Arg Leu Glu Tyr 145 150 155 160 Gln Trp Val Asn Asn lie Gly Asp Ala Gly Thr Val Gly Thr Arg Pro 165 170 175 Asp Asn Gly Met Leu Ser Leu Gly Val Ser Tyr Arg Phe Gly Gln Glu 180 185 190 Asp Ala Ala Pro Val Val Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Glu Val 195 200 205 Ala Thr Lys His Phe Thr Leu Lys Ser Asp Val Leu Phe Asn Phe Asn 210 215 220 Lys Ala Thr Leu Lys Pro Glu Gly Gln Gln Ala Leu Asp Gln Leu Tyr 225 230 235 240 Thr Gln Leu Ser Asn Met Asp Pro Lys Asp Gly Ser Ala Val Val Leu 245 250 255 Gly Tyr Thr Asp Arg lie Gly Ser Glu Ala Tyr Asn Gln Gln Leu Ser 260 265 270 Glu Lys Arg Ala Gln Ser Val Val Asp Tyr Leu Val Ala Lys Gly lie 275 280 285 Pro Ala Gly Lys lie Ser Ala Arg Gly Met Gly Glu Ser Asn Pro Val 290 295 300 Thr Gly Asn Thr Cys Asp Asn Val Lys Ala Arg Ala Ala Leu lie Asp 305 310 315 320 Cys Leu Ala Pro Asp Arg Arg Val Glu lie Glu Val Lys Gly Tyr Lys 325 330 335 Glu Val Val Thr Gln Pro Ala Gly 340 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Péptido derivado a partir del antígeno Mart-1/MelanA expresado por células de melanoma. <400> 3 Glu Leu Ala Gly He Gly He Leu Thr Val 1 5 10 <210 > 4 <211 > 8 <212 > PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Derivado de la proteína 2 relacionada con tirosinasa. <400> 4 Val Tyr Asp Phe Phe Val Trp Leu 1 5

Claims (43)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de una proteína OmpA de enterobacterium, o de un fragmento de la misma, para preparar una composición farmacéutica que se pretende que genere o incremente una respuesta citotóxica T contra un agente infeccioso o una célula tumoral.

2.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicha composición farmacéutica también comprende, combinada con dicha proteína OmpA de enterobacterium, un antígeno o un hapteno específico para dicho agente infeccioso o dicha célula tumoral.

3.- El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde dicho agente infeccioso es una partícula viral, una bacteria o un parásito.

4.- El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha proteína OmpA de enterobacterium o un fragmento de la misma, se obtiene usando un método de extracción para un cultivo de dicha enterobacterium.

5.- El uso como el que se reclama en una de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicha proteína OmpA de enterobacterium, o un fragmento de la misma, se obtiene vía una ruta recombinante.

6.- El uso como el que se reclama en una de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha enterobacterium es Klebsiella pneumoniae.

7.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 6, en donde dicha secuencia de aminoácidos de dicha proteína OmpA, o un fragmento de la misma, comprende: a) la secuencia de aminoácidos de la secuencia SEQ ID No. 2; b) la secuencia de aminoácidos de una secuencia que tiene al menos 80% de homología con la secuencia SEQ ID No. 2; o c) la secuencia de aminoácidos de un fragmento de al menos 5 aminoácidos de una secuencia como se define en a),

8.- El uso como el que se reclama en una de las reivindicaciones 2 a 7, en donde dicho antígeno o hapteno se elige a partir de péptidos, lipopéptidos, polisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos, lípidos o cualquier compuesto capaz de específicamente dirigir la respuesta CTL contra dicho agente infeccioso o dicha célula tumoral.

9.- El uso como el que se reclama en una de las reivindicaciones 2 a 8, en donde dicho antígeno o hapteno se acopla o se mezcla con dicha proteína OmpA o un fragmento de la misma.

10.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 9, en donde dicho antígeno o hapteno se acopla, mediante unión covalente, con dicha proteína OmpA o un fragmento de la misma.

11.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 10, en donde el acoplamiento por unión covalente se produce por el acoplamiento mediante síntesis química.

12.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 11 , en donde uno o más elementos de unión es (son) introducidos dentro de dicha proteína OmpA, o un fragmento de la misma, y/o dentro de dicho antígeno o hapteno, con el objeto de facilitar el acoplamiento químico.

13.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 12, en donde dicho elemento de unión introducido es un aminoácido.

14.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 10, en donde ei acoplamiento entre dicho antígeno o hapteno y dicha proteína OmpA, o un fragmento de la misma, se produce por recombinación genética, cuando dicho antígeno o hapteno es de naturaleza peptídica.

15.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 14, en donde la composición farmacéutica comprende una construcción de ácido nucleico que codifica dicha proteína híbrida.

16.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 14, en donde dicha construcción de ácido nucleico está contenida en un vector, o en una célula hospedera transformada capaz de expresar dicha proteína híbrida.

17.- El uso como el que se reclama en una de las reivindicaciones 1 a 16, para preparar una composición farmacéutica que se pretende elimine agentes infecciosos o inhiba el crecimiento tumoral.

18.- El uso como el que se reclama en una de las reivindicaciones 1 a 17, para preparar una composición farmacéutica que se pretende prevenga o trate enfermedades infecciosas que comprenden una infección viral, bacteriana, fungal y parasitaria.

19.- El uso como el que se reclama en una de las reivindicaciones 1 a 17, para preparar una composición farmacéutica que se pretende prevenga o trate cánceres.

20.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 19, para preparar una composición farmacéutica que se pretende prevenga o trate cánceres asociados con un antígeno tumoral.

21.- El uso como el que se reclama en las reivindicaciones 19 y 20, para preparar una composición farmacéutica que se pretende prevenga melanomas.

22.- El uso como el que se reclama en una de las reivindicaciones 1 a 21, en donde dicha composición farmacéutica está en un vehículo en una forma que hace posible su estabilidad y/o su inmunogenicidad.

23.- El uso como ei que se reclama en la reivindicación 22, en donde dicho vehículo es un liposoma, un vector viral que contiene una construcción de ácido nucleico que codifica dicha proteína OmpA, o un fragmento de la misma, dicho antígeno o hapteno, o dicha proteína híbrida, o una célula hospedera transformada capaz de expresar dicha proteína OmpA, o un fragmento de la misma, dicho antígeno o hapteno, o dicha proteína híbrida.

24.- El uso como el que se reclama en una de las reivindicaciones 15, 16 y 23, en donde dicha construcción de ácido nucleico, o la construcción de ácido nucleico contenida en dicho vector o dicha célula hospedera transformada, comprende una secuencia de ácido nucleico elegida a partir de la secuencia SEQ ID No. 1 , un fragmento de la misma que tiene al menos 15 nucleótidos consecutivos de la secuencia SEQ ID No. 1 , o una secuencia que tiene al menos 80% de homología con una de dichas secuencias.

25.- Una composición farmacéutica, caracterizada en tanto que comprenda, en un medio farmacéuticamente aceptable, al menos una proteína OmpA de enterobacterium, o un fragmento de ia misma, combinada, por mezcla o acoplamiento, con al menos un antígeno o un hapteno asociado con o específico para una célula tumoral.

26.- La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque dicha proteína OmpA de enterobacterium, o un fragmento de la misma, se obtiene usando un método de extracción de un cultivo de dicha enterobacterium.

27.- La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque dicha proteína OmpA de enterobacterium, o un fragmento de la misma, se obtiene vía la ruta recombinante.

28.- La composición de conformidad con las reivindicaciones 25 a 27, caracterizada además porque dicha enterobacterium es Klebsiella pneumoniae.

29.- La composición de conformidad con ía reivindicación 28, caracterizada además porque la secuencia de aminoácidos de dicha proteína OmpA de enterobacterium, o un fragmento de la misma, comprende: a) la secuencia de aminoácidos de la secuencia SEQ ID No. 2; b) ia secuencia de aminoácidos de una secuencia que tiene al menos 80% de homología con la secuencia SEQ ID No. 2; o c) la secuencia de aminoácidos de un fragmento de al menos 5 aminoácidos de una secuencia como se define en a).

30.- La composición de conformidad con una de las reivindicaciones 25 a 29, caracterizada además porque dicho antígeno o hapteno se elige a partir de péptidos, lipopéptidos, poiisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos, lípidos o cualquier compuesto capaz de específicamente dirigir la respuesta CTL contra dicha célula tumoral.

31.- La composición de conformidad con una de las reivindicaciones 25 a 30, caracterizada además porque dicho antígeno o hapteno se acopla por unión covalente, con dicha proteína OmpA o un fragmento de la misma.

32.- La composición de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada además porque el acoplamiento por unión covalente se produce por el acoplamiento mediante síntesis química.

33.- La composición de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque uno o más elementos de unión es (son) introducidos dentro de dicha proteína OmpA, o un fragmento de la misma, y/o dentro de dicho antígens o hapteno, con el objeto de facilitar el acoplamiento químico.

34.- La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque dicho elemento de unión introducido es un aminoácido.

35.- La composición de conformidad con ia reivindicación 31 , caracterizada además porque el acoplamiento entre dicho antígeno o hapteno y dicha proteína OmpA, o un fragmento de la misma, se produce por recombinación genética, cuando dicho antígeno o hapteno es de naturaleza peptídica.

36.- La composición de conformidad con la reivindicación 35, caracterizada además porque la composición farmacéutica comprende una construcción de ácido nucleico que codifica fa proteína híbrida obtenida después de dicho acoplamiento.

37.- La composición de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada además porque dicha construcción de ácido nucleico está contenida en un vector, o en una célula hospedera transformada capaz de expresar dicha proteína híbrida.

38.- La composición de conformidad con la reivindicación 37, caracterizada además porque dicha construcción de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico elegida a partir de la secuencia SEQ ID No. 1 , un fragmento de la misma que tiene al menos 15 nucleótidos consecutivos de la secuencia SEQ ID No. 1 , o una secuencia que tiene al menos 80% de homología con la secuencia SEQ ID No. 1.

39.- La composición de conformidad con una de ¡as reivindicaciones 25 a 30, caracterizada además porque dicha composición farmacéutica está en un vehículo en una forma que hace posible su estabilidad y/o su inmunogenicidad.

40.- La composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada además porque dicho vehículo es un liposoma, un vector viral que contiene una construcción de ácido nucleico que codifica dicha proteína OmpA, o un fragmento de la misma, dicho antígeno o hapteno, o dicha proteína híbrida, o una célula hospedera transformada capaz de expresar dicha proteína OmpA, o un fragmento de la misma, dicho antígeno o hapteno, o dicha proteína híbrida.

41.- La composición de conformidad con una de las reivindicaciones 25 a 40, caracterizada además porque dicho medio farmacéuticamente aceptable consiste de agua, o de una solución salina acuosa o de una solución acuosa basada en dextrosa y/o en glicerol.

42.- La composición de conformidad con una de las reivindicaciones 25 a 41 , caracterizada además porque dicha composición también contiene un detergente.

43.- La composición de conformidad con una de las reivindicaciones 25 a 41 , caracterizada además porque no tiene ningún otro adyuvante para inducir una respuesta CTL.