ES2203646T3 - Analogos sinteticos de acidos grasos poliinsaturados. - Google Patents

Analogos sinteticos de acidos grasos poliinsaturados.

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ES2203646T3
ES2203646T3 ES95935757T ES95935757T ES2203646T3 ES 2203646 T3 ES2203646 T3 ES 2203646T3 ES 95935757 T ES95935757 T ES 95935757T ES 95935757 T ES95935757 T ES 95935757T ES 2203646 T3 ES2203646 T3 ES 2203646T3
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Merilyn Joy Sleigh
Fred Widmer
Paul Adam Schober
Antonio Ferrante
Alfred Poulos
Deborah Ann Rathjen
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Womens and Childrens Hospital Adelaide
Teva Pharmaceuticals Australia Pty Ltd
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Womens and Childrens Hospital Adelaide
Peptech Ltd
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Abstract

EN LA PRESENTE INVENCION SE PRESENTAN COMPUESTOS DE ACIDOS GRASOS POLIINSATURADOS QUE POSEEN UNA ACTIVIDAD ANTIPALUDICA Y/O ESTIMULADORA DE NEUTROFILOS, O UNA ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA. LOS ACIDOS GRASOS POLIINSATURADOS CONTIENEN UNA CADENA DE 16 A 26 CARBONOS, DE 3 A 6 BANDAS DOBLES Y ESTAN COVALENTEMENTE ACOPLADOS EN EL GRUPO DE ACIDO CARBOXILICO A UN AMINOACIDO. ES PREFERENTE QUE EL ACIDO GRASO CONTENGA DE 18 A 22 CARBONOS Y QUE EL AMINOACIDO SEA GLICINA O ACIDO ASPARTICO. LOS COMPUESTOS PREFERENTES CON ACIDO {GA} LINOLEICO AHEXAENOICO LINOLEICO PARTICO, ACIDO ARAQUIDONICO TAENOICO ARTICO.

Description

Análogos sintéticos de ácidos grasos poliinsaturados.
La presente invención se refiere al uso de ácidos grasos poliinsaturados para la fabricación de composiciones farmacéuticas para tratar la malaria y/o la inflamación y/o para estimular la actividad de los neutrófilos.
Más de la mitad de la población mundial corre el riesgo de contraer la malaria, con aproximadamente 500 millones de infecciones agudas y aproximadamente 1 millón de muertes registradas cada año. (Progreso sobre las Enfermedades Tropicales en la Investigación Internacional, 1987-1988, Informe del Noveno Programa, PNUD/Banco Mundial/OMS, Ginebra, 43-49; Prólogo de Stevenson MM en: Stevenson MM, Ed. Malaria: Host responses to Infection, CRC Press, Inc.). El uso de fármacos antimalaria está asociado con problemas importantes debido a la resistencia incrementada y a los efectos secundarios tóxicos. Los fármacos antimalaria que más se utilizan en la actualidad son inadecuados para su uso en niños (que corren el mayor riesgo de contraer malaria cerebral potencialmente fatal), mujeres embarazadas y personas de edad avanzada.
Los agentes estimulantes de neutrófilos/macrófagos pueden tener aplicación en el tratamiento de otras infecciones que incluyen las de Candida spp., Trypanosoma, esquistosomosis, tuberculosis, las de virus como por ejemplo los herpes, el virus Sindbis, legionela, listeriosis, las de Pneumocystis o las de Pseudomonas. Serían útiles también como terapia adjunta en individuos inmunocomprometidos incluidos los sometidos a quimioterapia contra el cáncer, receptores de trasplantes y pacientes con quemaduras. Además, se puede también tratar a otros individuos, los así llamados normales, por ejemplo, los de edad avanzada, niños menores de 2 años, alcohólicos, de los que se sabe que tienen una pobre actividad de las células fagocíticas.
La inflamación puede estar causada por bacterias, virus y/u otros agentes infecciosos, infecciones oportunistas (que pueden ser consecuencia de un estado inmunodeprimido, por ejemplo como resultado de un cáncer o una terapia, particularmente la terapia con fármacos citotóxicos o la radioterapia), autoinmunidad o de otra manera. El choque séptico es una ilustración de una enfermedad que implica la inflamación sistémica. Muchos de los rasgos clínicos del choque séptico por Gram negativas se pueden reproducir en animales mediante la administración de LPS a animales lo que puede promover cambios metabólicos y fisiológicos severos que pueden conducir a la muerte. Asociada con la inyección de LPS está la producción extensiva de citoquinas proinflamatorias tales como el factor alfa de necrosis tumoral (TNF\alpha).
La administración crónica de TNF a ratones, ratas y/o seres humanos causa anorexia, pérdida de peso y reducción de los lípidos y proteínas corporales en de 7 a 10 días (Cerami et al., 1985, Immunol. Lett. 11, 173; Fong et al. 1989 J. Exp. Med. 170, 1627; Moldawer et al., Am. J. Physiol. 254 G450-G456, 1988; Fong et al., Am. J. Physiol. 256, R659-R665 (1989); McCarthy et al., Am. J. Clin. Nature, 42, 1179-1182): Los niveles de TNF han sido medidos en pacientes con cáncer y enfermedad crónica asociada a la caquexia.
El TNF\alpha ha sido implicado en la patología de otras enfermedades asociadas con la inflamación crónica aparte del choque tóxico y la caquexia relacionada con el cáncer. El TNF se ha detectado en el líquido sinovial de pacientes con artritis tanto reumatoide como reactiva y en el suero de pacientes con artritis reumatoide (Saxne et al., 1988, Arthrit. Rheumat. 31, 1041). Se han detectado niveles elevados de TNF en pacientes con trasplantes de riñón durante episodios de rechazo agudo (Maury y Teppo, 1987, J. Exp. Med. 166, 1132). En los animales, se ha demostrado que el TNF está implicado en la patogénesis de la enfermedad del injerto contra el huésped en la piel y el intestino con posterioridad al trasplante de médula alógena.
Se ha demostrado que la administración de un anticuerpo de conejo contra el TNF de ratón previene los cambios histológicos asociados con la enfermedad del injerto contra el huésped y reduce la mortalidad (Piquet et al. 1987, J. Exp. Med. 166, 1220). Se ha demostrado también que el TNF contribuye significativamente a la patología de la malaria (Clark et al. 1987, Am. J. Pathol. 129, 192-199). Además, se ha informado de niveles elevados de TNF en el suero de pacientes con malaria (Scuderi et al. 1986, Lancet 2, 1364-1365).
Los niveles elevados de citoquinas proinflamatorias han sido implicados además en causar la patología y la destrucción de tejidos en la artritis reumatoide, la esclerosis múltiple (MS) y la enfermedad de Crohn. Experimentalmente, los anticuerpos que neutralizan la actividad de las células productoras de citoquinas (por ejemplo los anticuerpos contra las células T CD4^{+} o los anticuerpos contra las CD3) o de las citoquinas mismas (por ejemplo anticuerpos anti-TNF) han demostrado ser beneficiosos. Se sabe que los altos niveles de interferón \gamma están asociados con la exacerbación de la enfermedad en la MS.
Los PUFA tienen una gama de actividades biológicas útiles (véanse por ejemplo las Solicitudes de Patentes Internacionales Nº WO 93/00084 y WO 95/00607 y las referencias citadas en ellas). Desgraciadamente, debido a su limitada estabilidad in vivo, los PUFA no han logrado un uso ampliamente extendido como agentes terapéuticos. Los presentes inventores han desarrollado un método para acoplar aminoácidos a PUFA que, aunque retienen la actividad biológica, tienen una estabilidad y una solubilidad incrementadas. Estos compuestos de ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) tienen una actividad directa antimalaria. Además de su actividad directa antimalaria, algunos de los nuevos PUFA activan los neutrófilos humanos causando la liberación de los contenidos granulosos, y exhiben sinergia con el TNF en la producción de superóxido. La activación de los neutrófilos humanos mediante los PUFA da como resultado una capacidad incrementada de estas células para matar al parásito de la malaria (P. falciparum) dentro de los glóbulos rojos y también a la bacteria Staphylococcus aureus.
Además, los presentes inventores han encontrado también que algunos de los PUFA acoplados a aminoácidos son antiinflamatorios porque hacen disminuir la producción de citoquinas proinflamatorias aunque no consiguen activar los neutrófilos.
La presente invención proporciona el uso de un ácido graso poliinsaturado que contiene una cadena de 16-26 carbonos y 3-6 dobles enlaces, en el que el ácido graso poliinsaturado está acoplado covalentemente por el grupo ácido carboxílico a un aminoácido seleccionado entre la glicina y el ácido aspártico, para la fabricación de una composición farmacéutica para estimular la actividad de los neutrófilos y/o tratar la infección de la malaria y/o la inflamación en un sujeto que requiere tal tratamiento.
En una realización preferida de la presente invención el ácido graso contiene 18-22 carbonos.
En otra realización preferida de la presente invención el ácido graso es un compuesto de n-3 a n-6.
En una realización preferida adicional más de la presente invención el compuesto es ácido \gamma-linolénico-glicina, ácido \alpha-linolénico-glicina, ácido araquidónico-glicina, ácido docosahexanoico-glicina, ácido eicosapentanoico-glicina, ácido \gamma-linolénico - ácido aspártico, ácido \alpha-linolénico - ácido aspártico, ácido araquidónico -ácido aspártico, ácido eicosapentanoico - ácido aspártico y ácido docosahexanoico - ácido aspártico.
Para que la naturaleza de la presente invención se pueda comprender más claramente, se describirá ahora una de sus formas preferidas con referencia a los siguientes ejemplos y figuras en los que:
Las Figuras 1 y 2 muestran los efectos de los PUFA sobre la liberación de gránulos azurófilos;
La Figura 3 muestra la liberación de contenidos específicos de gránulos de neutrófilos a continuación del tratamiento con los PUFA; y
La Figura 4 muestra el efecto de los PUFA sobre la muerte de S. aureus mediada por neutrófilos.
En estas Figuras se utilizan las siguientes abreviaturas:
20:4 Ácido araquidónico
20:5 Ácido eicosapentanoico
22:6 Ácido docosahexanoico
gly glicina
asp ácido aspártico
La Tabla 1 muestra la actividad directa antimalaria de los PUFA conjugados con aminoácidos.
La Tabla 2 muestra la capacidad de los PUFA conjugados con aminoácidos parasuprimir la producción de TNF\alpha y la producción de interferón \gamma mediante células mononucleares de sangre periférica estimuladas con PHA.
La Tabla 3 muestra la capacidad de los PUFA conjugados con aminoácidos para suprimir la proliferación estimulada por PHA (principalmente la proliferación de células T) de células mononucleares de sangre periférica.
Métodos Preparación de neutrófilos
Se situó sobre medio Ficoll-Hypaque de densidad 1,114 una capa de sangre heparinizada de individuos sanos normales y se centrifugó a 600 g durante 30-40 minutos a temperatura ambiente. Las células se lavaron tres veces en Solución Salina Equilibrada de Hanks (HBSS). Las preparaciones fueron de una pureza del 96-99% con respecto a los glóbulos blancos y de una viabilidad >99% juzgando por su capacidad para excluir el azul de tripano. La contaminación con glóbulos rojos fue siempre menor que 1 por neutrófilo estando las plaquetas ausentes por lo general.
Preparación de micelas de ácidos grasos y pretratamiento de los neutrófilos
Para superar la insolubilidad de los ácidos grasos en solución acuosa, se prepararon micelas mixtas de dipalmitoilfosfatidilcolina (DPC, 400 \mug):ácido graso (100 \mug) en HBSS mediante tratamiento con ultrasonidos. Los neutrófilos se pretrataron durante 30 minutos a 37ºC. En algunos experimentos los PUFA se solubilizaron en etanol.
Medida de la quimioluminiscencia de los neutrófilos
A 100 \mul de neutrófilos (1 x 10^{8}) en HBSS se les añadieron 100 \mul de micelas de ácidos grasos o DPC sola y 300 \mul adicionales de HBSS. Esto fue seguido de inmediato por la adición de 500 \mul de lucigenina (0,25 mg/ml en PBS) y se midió la emisión de luz resultante (mV) a lo largo del tiempo en un luminómetro. Los experimentos se llevaron a cabo por triplicado con células de cada individuo y los valores presentados representan los valores de los picos de las respuestas.
Medida de la desgranulación
La desgranulación se determinó midiendo la liberación de la proteína que se une a la vitamina B12 (como ha sido descrito por Gottleib et al., 1965, Blood 25:875-883) y de la \beta-glucuronidasa (como ha sido descrito por Kolodeney y Mumford, 1976, Clin. Chem. Acta 70:247-257).
Ensayo bactericida
La actividad bactericida de los neutrófilos frente a Staphylococcus aureus se midió de acuerdo con el procedimiento descrito por Ferrante y Abell, 1986, Infect. Immun. 51:607.
Ensayos de proliferación de células mononucleares
Las células mononucleares se separaron de la sangre periférica de donantes humanos normales como ha sido descrito por Ferrante y Thong (1978...). Las células mononucleares se resuspendieron en RPMI-1640 que contenía suero humano AB al 20% y se colocaron en microplacas de 96 pocillos (50 \mul por pocillo, densidad celular 4 x 10^{6} células/ml). El ácido graso se añadió entonces en 50 \mul y se preincubó con las células durante 30 minutos a 37ºC en CO_{2} al 5%. Se añadió luego un mitógeno (PHA; ConA, PWM, Staphilococcus aureus) en 100 \mul y las células se incubaron durante 66 horas a 37ºC en CO_{2} al 5% antes de la adición de timidina tritiada (1 \muCi/pocillo). Después de un total de 72 horas de cultivo, se recogieron las células y se ensayó la proliferación (incorporación de timidina) y la presencia de citoquinas en los sobrenadantes.
Ensayos de citoquinas
Se determinaron los niveles de citoquinas en los sobrenadantes de los cultivos mediante ELISA específicos utilizando anticuerpos anticitoquinas. Se determinaron los siguientes niveles de citoquinas: TNF\alpha, TNF\beta, interferón-\gamma, IL-1\beta, IL-2.
Síntesis química Ácido araquidónico-glicina-OH
Se disolvió ácido araquidónico (0,50 g) en DMF (2,0 ml). Se añadieron HOSu (0,38 g en 0,5 ml de DMF) y H-Gly-OtBu.HCl (0,55 g en 1,5 ml de DMF). La mezcla se enfrió en un baño de hielo. Se añadió DCC (0,41 g en 0,5 ml de DMF). Se añadió N-MM y se agitó la mezcla durante 30 minutos en un baño de hielo y luego se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas. La reacción no se llegó a completar y aproximadamente 20-3-% del ácido araquidónico permanecía sin reaccionar. Se añadieron más DCC (0,16 g), HOSu (0,19 g), H-Gly-OtBu.HCl (0,20 g) y N-MM (0,24 g) y se agitó la mezcla durante 24 horas. El DCU se separó mediante filtración y el producto se aisló mediante HPLC preparativa y se liofilizó para dar lugar a un aceite verde pálido (0,67 g, 98%). El aceite de araquidónico-Gly-OtBu se redisolvió en ácido trifluoroacético limpio (40 ml) en un baño de hielo y se agitó durante 30 minutos y luego a temperatura ambiente durante 30 minutos adicionales. El TFA se evaporó para dar lugar a araquidónico-Gly-OH en forma de aceite verde de aspecto fangoso (0,53 g). Éste se purificó mediante HPLC y se liofilizó para dar lugar a un sólido pegajoso amarillo claro (0,23 g, 39%).
Purificación
Condiciones de la HPLC preparativa:
tampón A: TFA al 0,1%/H_{2}O; tampón B: TFA al 0,1%/H_{2}O al 10%/CH_{3}CN al 90%
40 ml/min, 214 nm, C18 semiPrepPak
Incrementos paso a paso del % de B: 10- -20- -30- -40- -50- -60- -70- -80- -90- -100% de B.
El ácido araquidónico eluyó con B al 60%, el araquidónico-Gly-OH eluyó con 75-80% de B, el araquidónico-Gly-OtBu eluyó con B al 80-85%.
\newpage
1. HPLC
tampón: TFA al 0,1% / H_{2}O al 10% / CH_{3}CN al 90%
2 ml/min, 214 nm, NovaPak C18
isocrática
Tiempos de retención de los componentes:
Ácido araquidónico: Rt 4,14 min
Araquidónico-Gly-OH: Rt 2,78 min
Araquidónico-Gly-OtBu: Rt 5,23 min
2. N.M.R. de ^{13}C
Araquidónico-Gly-OH
_{-}(DMSO-d_{6}): 14,1, C20, 22,1, 25,4, 26,4, 26,8, 28,9, 31,0, 34,7, 10 x CH_{2}; 40,7, Ga; 127,7, 127,85, 127,93, 128,2, 128,3, 129,6, 130,1, 8 x CH; 171,5, C=O, G; 172,5, C1.
3. FAB-MS
m/z 362 (M + 1)
4. Análisis de aminoácidos
Gly presente
Araquidónico-ácido aspártico-OH
Se disolvieron juntos en DMF (3 ml) ácido araquidónico, HOSu y H-Asp(OtBu)-OtBu.HCl. La mezcla se enfrió en un baño de hielo y se le añadió DCC en DMF (0,7 ml). Se añadió N-MM y se agitó la mezcla durante 20 horas. Aproximadamente un 20% del ácido araquidónico permanecía sin reaccionar. Se añadieron más HOSu (0,19 g), H-Asp(OtBu)-OtBu.HCl (0,30 g), DCC (0,16 g) y N-MM (0,24 g) y la mezcla se agitó durante 20 horas adicionales. El DCU se separó mediante filtración y el producto se aisló mediante HPLC. El Ara-Asp(OtBu)-OtBu purificado se concentró hasta obtener un aceite y se añadió TFA (25 ml). Después de una hora de agitación, se evaporó el TFA para dar lugar a un aceite verde oscuro. El araquidónico-Asp-OH se purificó mediante HPLC. Las fracciones puras de Ara-Asp-OH se combinaron, se concentraron y se liofilizaron (en tBu-OH) para dar lugar a un aceite marrón (0,38 g, 55%).
Purificación
Purificación mediante HPLC:
tampón A: TFA al 0,1%,
tampón B: TFA al 0,1% + H_{2}O al 10% + CH_{3}CN al 90%
40 ml/min, 214 nm, C18 semiPrepPak
Incrementos paso a paso del % de B: 10%- -20- -30- -40- -50- -60- -70- -80- -85- -100% de B.
El ácido araquidónico eluyó con B al 70%.
El araquidónico-Asp(OtBu)-OtBu eluyó con B al 80%.
El araquidónico-Asp-OH eluyó con B al 60%.
Análisis 1. HPLC
tampón: TFA al 0,1% + H_{2}O al 10% + CH_{3}CN al 90%
2 ml/min, 214 nm, NovaPak C18
isocrática
Tiempos de retención:
Ácido araquidónico: Rt 4,12 min
Araquidónico-Asp(OtBu)-OtBu: Rt 9,52 min
Araquidónico-Asp-OH: Rt 2,31 min
2. N.M.R. de ^{13}C
Araquidónico-Asp-OH
_(DMSO-d6): 14,1, CH_{3}; 22,1, 25,4, 26,4, 26,8, 28,9, 31,0, 31,5, 34,8, 10 x CH_{2}; 34,4, ??; 36,2, D\beta; 48,7, Da; 67,1, ??; 127,7, 127,88, 127,97, 128,18, 128,23, 129,6, 130,1, 8 x CH; 171,6, D_; 172,1, C=O, Asp; 172,7, C=O, Araquidónico,
Ácido araquidónico
_(DMSO-d6): 14,1, CH_{3}; 22,2, 24,6, 25,4, 26,3, 26,8, 26,9, 28,9, 31,1, 33,3, 10 x CH_{2}; 127,7, 127,9, 128,0, 128,2, 128,3, 128,4, 129,3, 130,1, 8 x CH; 174,5, C=O.
3. FAB-MS y CI-MS
m/z 420 (M + 1).
4. Análisis de aminoácidos
Asp presente
Ácido eicosapentanoico-glicina-OH
Se disolvieron juntos en DMF (4 ml) ácido eicosapentanoico, H-Gly-OtBu.HCl y HOSu. La mezcla se enfrió en un baño de hielo y se le añadió DCC (en 1 ml de DMF). Se añadió N-metilmorfolina y se agitó la mezcla en el baño de hielo durante 20 minutos y luego a temperatura ambiente durante 20 horas. Aproximadamente un 36% del ácido eicosapentanoico permanecía sin reaccionar. Se añadieron más H-Gly-OtBu.HCl (0,22 g), HOSu (0,15 g), DCC (0,16 g) y N-MM (0,27 g) y se agitó durante 20 horas adicionales. Seguía habiendo algo de ácido eicosapentanoico sin reaccionar (aproximadamente el 30% según la HPLC). Se filtró la mezcla y el producto sin purificar se purificó mediante HPLC para dar lugar a Epe-Gly-OtBu en forma de aceite coloreado (0,49 g, 71%). El aceite se redisolvió en ácido trifluoroacético frío (30 ml) y se agitó durante una hora. El TFA se evaporó para dejar un aceite negro. El Epe-Gly-OH sin purificar se purificó mediante HPLC para dar lugar a 0,13 g (22%) de un aceite marrón.
Purificación
Purificación mediante HPLC:
tampón A: TFA al 0,1%/H_{2}O
tampón B: TFA al 0,1% + H_{2}O al 10% + CH_{3}CN al 90%
40 ml/min, 214 nm, C18 semiPrepPak
Incrementos del % de B: 10- -20- -30- -40- -50- -55- -60- -65- -68- -70% de B
El ácido Epe y el Epe-Gly-OtBu eluyeron con B al 65-70%. Se pudieron aislar algunas fracciones puras de Epe-Gly-OH. Las fracciones que contenían los dos compuestos se combinaron y se repurificaron.
En las mismas condiciones que anteriormente, el Epe-Gly-OH eluyó con B al 60%.
Análisis 1. HPLC analítica
tampón: TFA al 0,1% + H_{2}O al 10% + CH_{3}CN al 90%
2 ml/min, 214 nm, NovaPak C18
isocrática
Tiempos de retención de los componentes de la reacción:
Ácido eicosapentanoico: Rt 3,1 min
Epe-Gly-OtBu: Rt 3,9 min
Epe-Gly-OH: Rt 2,1 min
2. N.M.R. de ^{13}C
_(DMSO-d_{6}): 14,3, CH_{3}; 20,2, 25,4, 26,4, 34,8, CH_{2}; 40,7, Ga; 127,2, 127,9, 128,1, 128,2, 128,3, 129,7, 131,8, CH; 171,6, 172,5, C=O.
3. CI-MS
m/z 360 (M + 1).
Ácido eicosapentanoico-ácido aspártico-OH
Se disolvieron juntos en DMF (4 ml) ácido eicosapentanoico, H-Asp(OtBu)-OtBu.HCl y HOSu. La mezcla se enfrió en un baño de hielo y se le añadió DCC (en 1 ml de DMF). Se añadió N-metilmorfolina y se agitó la mezcla en el baño de hielo durante 20 minutos y luego a temperatura ambiente durante 20 horas. Aproximadamente un 23% del ácido Epe permanecía sin reaccionar según la HPLC. Se añadieron más H-Asp(OtBu)- OtBu.HCl (0,28 g), HOSu (0,11 g), DCC (0,12 g) y N-MM (0,20 g) y la mezcla se agitó durante 20 horas adicionales. Aproximadamente el 17% del ácido Epe seguía sin reaccionar. Se filtró la mezcla y el Epe-Asp(OtBu)-OtBu sin purificar se purificó mediante HPLC para dar lugar a 0,83 g (94%) de aceite marrón. Se añadió al aceite marrón ácido trifluoroacético frío (30 ml) y se agitó la mezcla durante una hora. El TFA se evaporó para dejar un aceite marrón oscuro que se redisolvió en CH_{3}CN (10 ml) y se purificó mediante HPLC. El Epe-Asp-OH puro pesó 0,50 g (72%).
Purificación
Tampón A: TFA al 0,1%/H_{2}O
Tampón B: TFA al 0,1% + H_{2}O al 10% + CH_{3}CN al 90%
40 ml/min, 214 nm, C18 semiPrepPak
Incrementos del % de B: 10%- -20- -30- -40- -50- -52- -55- -57- -60- -65- -68- -70% de B
El ácido Epe eluyó con B al 65%, el Epe-Asp(OtBu)-OtBu eluyó con B al 70%, el Epe-Asp-OH eluyó con B al 55%.
Análisis 1. HPLC analítica
Tampón: TFA al 0,1% + H_{2}O al 10% + CH_{3}CN al 90%
2 ml/min, 214 nm, NovaPak C18, isocrática
Tiempos de retención:
Ácido Epe: Rt 3,1 min
Epe-Asp(OtBu)-OtBu: Rt 6,7 min
Epe-Asp-OH: Rt 1,8 min
2. N.M.R. de ^{13}C
(DMSO-d6): 14,3, CH_{3}; 20,2, 25,3, 25,4, 26,4, 31,5, 34,8, 8 x CH_{2}; 36,3, D\beta; 48,7, Da; 127,2, 127,92, 127,97, 128,1, 128,2, 128,3, 129,7, 131,8, 10 x CH; 171,9, 172,1, 172,7, 3 x C=O.
3. CI-MS
m/z 418 (M + 1).
Ácido docosahexanoico-glicina-OH
Se disolvieron juntos en DMF (2 ml) H-Gly-OtBu.HCl y HOSu. La mezcla se enfrió en un baño de hielo y se le añadió ácido docosahexanoico, DCC (en 0,4 ml de DMF) y N-metilmorfolina. La mezcla se agitó en el baño de hielo durante 30 minutos y luego a temperatura ambiente durante 5 horas. Un 30% del ácido docosahexanoico (ácido Dhe) permanecía sin reaccionar. Se añadió más DCC (0,11 g) y la mezcla se agitó durante 20 horas adicionales. Aproximadamente el 28% del ácido Dhe seguía sin reaccionar. Se filtró la mezcla y el producto sin purificar se purificó mediante HPLC. El Dhe-Gly-OtBu liofilizado (aceite amarillo claro) pesaba 0,62 g (92%). Se añadió al aceite TFA frío (30 ml) y se agitó la mezcla durante una hora. El TFA se evaporó para dejar un aceite marrón oscuro que se redisolvió en CH_{3}CN (10 ml) y se purificó mediante HPLC. El Dhe-Gly-OH purificado se liofilizó para dejar un aceite marrón oscuro (0,27 g, 46%).
Purificación
Condiciones de la HPLC:
Tampón A: TFA al 0,1%/H_{2}O
Tampón B: TFA al 0,1% + H_{2}O al 10% + CH_{3}CN al 90%
40 ml/min, 214 nm, C18 semiPrepPak
Incremento manual del % de B: 10%- -20- -30- -40- -50- -55- -60- -65- -70- -73- -100% de B
Tanto el ácido Dhe como el Dhe-Gly-OtBu eluyeron con B al 71-73%. El ácido eluyó ligeramente antes que el Dhe-Gly-OtBu.
El Dhe-Gly-OH eluyó con B al 60%.
Análisis 1. HPLC analítica
Tampón: TFA al 0,1% + H_{2}O al 10% + CH_{3}CN al 90%
2 ml/min, 214 nm, NovaPak C18
Tiempos de retención de los componentes de la reacción:
Ácido Dhe: Rt 3,6 min
Dhe-Gly-OtBu: Rt 4,5 min
Dhe-Gly-OH: Rt 2,5 min
2. N.M.R. de ^{13}C
(DMSO-d6): 14,3, CH_{3}; 20,2, 23,2, 25,3, 25,36, 25,42, 35,1, 8 x CH_{2}; 40,8, Ga; 127,1, 127,90, 127,98, 128,06, 128,1, 128,27, 128,3, 129,1, 131,8, 6 x CH; 171,5, 172,0, 2 x C=O.
3. CI-MS
m/z 386 (M + 1)
Ácido docosahexanoico-ácido aspártico-OH
Se disolvieron juntos en DMF (2 ml) H-Asp(OtBu)-OtBu.HCl y HOSu. La mezcla se enfrió en un baño de hielo y se le añadieron ácido docosahexanoico, DCC (en 0,4 ml de DMF), y N-metilmorfolina. La mezcla se agitó en el baño de hielo durante 30 minutos y luego a temperatura ambiente durante 4 horas. El 30% del ácido docosahexanoico (ácido Dhe) permanecía sin reaccionar. Se añadió DCC (0,11 g) y la mezcla se agitó durante 20 horas adicionales. Aproximadamente el 18% del ácido Dhe seguía sin reaccionar. Se filtró la mezcla y el producto sin purificar se purificó mediante HPLC. El Dhe-Asp(OtBu)-OtBu liofilizado (aceite amarillo claro) pesaba 0,73 g (86%). Se añadió al aceite TFA frío (30 ml) y se agitó la mezcla durante una hora. El TFA se evaporó para dejar un aceite marrón oscuro que se redisolvió en CH_{3}CN (5 ml) y se purificó mediante HPLC. El Dhe-Gly-OH purificado se liofilizó para dejar un aceite marrón oscuro (0,33 g, 49%).
Purificación
Condiciones de la HPLC:
Tampón A: TFA al 0,1%/H_{2}O
Tampón B: TFA al 0,1% + H_{2}O al 10% + CH_{3}CN al 90%
40 ml/min, 214 nm, C18 semiPrepPak
Incremento manual del % de B: 10%- -20- -30- -40- -50- -55- -60- -65- -68- -70- -73- -75% de B
El ácido Dhe eluyó con B al 73%, el Dhe-Asp(OtBu)-OtBu eluyó con B al 73-75%, el Dhe-Asp-OH eluyó con B al 58%.
Análisis 1. HPLC analítica
Tampón: TFA al 0,1% + H_{2}O al 10% + CH_{3}CN al 90%
2 ml/min, 214 nm, NovaPak C18
Tiempos de retención de los componentes de la reacción:
Ácido Dhe: Rt 3,6 min
Dhe-Asp(OtBu)-OtBu: Rt 8,2 min
Dhe-Asp-OH: Rt 2,0 min
2. N.M.R. de ^{13}C
(DMSO-d6): 14,3, CH_{3}; 20,2, 23,2, 25,3, 25,4, 25,4, 35,0, 8 x CH_{2}; 36,4, D\beta; 48,7, Da; 127,1, 127,9, 127,98, 128,0, 128,1, 128,22, 128,28, 128,3, 129,0, 131,8, CH; 171,6, 171,8, 172,7, 3 x C=O.
3. CI-MS
m/z 444 (M + 1).
Ácido linolénico-glicina-OH
Se disolvieron juntos en DMF (3 ml) ácido linolénico, HOSu y H-Gly-OtBu.HCl, se enfrió la mezcla en un baño de hielo y se le añadió DCC (en 0,3 ml de DMF). Se añadió N-MM y se agitó la mezcla durante 20 minutos, tiempo tras el cual algo del ácido linolénico permanecía sin reaccionar. Se añadió más DCC (0,10 g) y la mezcla se agitó durante 20 horas adicionales. Se separó el DCU mediante filtración y el producto se aisló mediante HPLC en fase inversa. El producto purificado se concentró hasta obtener un aceite y se añadió TFA (30 ml). Después de una hora de agitación, se evaporó el TFA para dejar el producto en forma de aceite marrón que se redisolvió en CH_{3}CN (6 ml) y se purificó mediante HPLC. Las fracciones puras obtenidas se combinaron, se concentraron y se liofilizaron (en t-butanol) para dar lugar a un aceite marrón (0,24 g, 40%).
Purificación
Purificación mediante HPLC:
tampón A: TFA al 0,1% / H_{2}O
tampón B: TFA al 0,1% + H_{2}O al 10% + CH_{3}CN al 90%
40 ml/min, 214 nm, columna preparativa pequeña C18
El Lino-Gly-OH eluyó con B al 65%, el ácido linolénico eluyó con B al 67%, el linolenil-Gly-OtBu eluyó también con B al 67% pero ligeramente más tarde.
Análisis y caracterización 1. HPLC analítica
Tampón A: TFA al 0,1%, tampón B: TFA al 0,1%/ H_{2}O al 10%/ CH_{3}CN al 90%
2 ml/min, 214 nm, NovaPak C18
isocrática con B al 100%. tiempos de retención de los ingredientes:
ácido linolénico: Rt 3,96 min
linolenil-Gly-OtBu: Rt 4,63 min
linolenil-Gly-OH: Rt 2,59 min
2. N.M.R. de ^{13}C
(DMSO-d6): 14,2, CH_{3}; 20,2, 25,26, 25,32, 26,8, 28,7, 28,8, 29,2, 35,2, CH_{2}; 40,7, Ga; 127,1, 127,7, 128,1, 130,1, 131,7, CH; 171,6, 172,7, C=O.
3. CI-MS
m/z 336 (M + 1)
Ácido linolénico-ácido aspártico-OH
Se disolvieron juntos en DMF (3 ml) ácido linolénico, HOSu y H-Asp(OtBu)- OtBu.HCl, se enfrió la mezcla en un baño de hielo y se le añadió DCC (en 0,3 ml de DMF). Se añadió N-MM y se agitó la mezcla durante 20 minutos, tiempo tras el cual algo del ácido linolénico permanecía sin reaccionar. Se añadió más DCC (0,10 g) y la mezcla se agitó durante 20 horas adicionales. Se separó el DCU mediante filtración y el producto se aisló mediante HPLC en fase inversa. El producto purificado se concentró hasta obtener un aceite (0,66 g) y se añadió TFA (30 ml). Después de una hora de agitación, se evaporó el TFA para dejar el producto en forma de aceite marrón que se redisolvió en CH_{3}CN (6 ml) y se purificó mediante HPLC. Las fracciones puras obtenidas se combinaron, se concentraron y se liofilizaron (en t-butanol) para dar lugar a un aceite marrón (0,38 g, 54%).
Purificación
Purificación mediante HPLC:
tampón A: TFA al 0,1% / H_{2}O
tampón B: TFA al 0,1% + H_{2}O al 10% + CH_{3}CN al 90%
40 ml/min, 214 nm, columna preparativa pequeña C18
El Lino-Asp-OH eluyó con B al 55%, el ácido linolénico eluyó con B al 65%, el linolenil-Asp(OtBu)-OtBu eluyó con B al 70%.
Análisis y caracterización 1. HPLC analítica
Tampón A: TFA al 0,1%, tampón B: TFA al 0,1%/ H_{2}O al 10%/ CH_{3}CN al 90%
2 ml/min, 214 nm, NovaPak C18
isocrática con B al 100%. tiempos de retención de los ingredientes:
ácido linolénico: Rt 4,14 min
linolenil-Asp(OtBu)-OtBu: Rt 8,46 min
linolenil-Asp-OH: Rt 2,04 min
2. N.M.R. de ^{13}C
(DMSO-d6): 14,2, CH_{3}; 20,2, 25,26, 25,34, 26,8, 28,69, 28,72, 28,83, 29,2, 35,2, CH_{2}; 36,3, D\beta; 48,7, Da; 127,1, 127,7, 128,1, 130,1, 131,7, CH; 171,8, 172,2, 172,7, C=O.
3. CI-MS
m/z 394 (M + 1).
Ácido gamma-linolénico-glicina-OH
Se disolvieron juntos en DMF (3 ml) ácido \gamma-linolénico, HOSu y H-Gly- OtBu.HCl, se enfrió la mezcla en un baño de hielo y se le añadió DCC (en 0,3 ml de DMF). Se añadió N-MM y se agitó la mezcla durante 20 minutos, tiempo tras el cual algo del ácido linolénico permanecía sin reaccionar. Se añadió más DCC (0,10 g) y la mezcla se agitó durante 20 horas adicionales. Se separó el DCU mediante filtración y el producto se aisló mediante HPLC en fase inversa. El producto purificado se concentró hasta obtener un aceite (0,46 g) y se añadió TFA (30 ml). Después de una hora de agitación, se evaporó el TFA para dejar el producto en forma de aceite marrón que se redisolvió en CH_{3}CN (6 ml) y se purificó mediante HPLC. Las fracciones puras obtenidas se combinaron, se concentraron y se liofilizaron (en t-butanol) para dar lugar a un aceite marrón (0,35 g, 58%).
Purificación
Purificación mediante HPLC:
tampón A: TFA al 0,1% / H_{2}O
tampón B: TFA al 0,1% + H_{2}O al 10% + CH_{3}CN al 90%
40 ml/min, 214 nm, columna preparativa pequeña C18
El \gamma-Lino-Gly-OH eluyó con B al 66%, el ácido \gamma-linolénico eluyó con B al 66%, el \gamma-linolenil-Gly-OtBu eluyó con B al 67%. Los compuestos eluyeron en el orden expuesto.
Análisis y caracterización 1. HPLC analítica
Tampón A: TFA al 0,1%, tampón B: TFA al 0,1%/ H_{2}O al 10%/ CH_{3}CN al 90%
2 ml/min, 214 nm, NovaPak C18
isocrática con B al 100%. tiempos de retención de los ingredientes:
ácido \gamma-linolénico: Rt 4,07 min
\gamma-linolenil-Gly-OtBu: Rt 4,85 min
\gamma-linolenil-Gly-OH: Rt 2,82 min
2. N.M.R. de ^{13}C
(DMSO-d6): 14,1, CH_{3}; 22,2, 25,0, 25,4, 26,7, 26,8, 28,8, 28,9, 31,1, 35,1, CH_{2}; 40,7, Ga; 127,7, 127,9, 128,1, 128,2, 129,9, 130,1, CH; 171,6, 172,6, C=O.
3. CI-MS
m/z 336 (M + 1).
Gamma-linolénico-ácido aspártico-OH
Se disolvieron juntos en DMF (3 ml) ácido gamma-linolénico, HOSu y H-Asp(OtBu)-OtBu.HCl, se enfrió la mezcla en un baño de hielo y se le añadió DCC (en 0,3 ml de DMF). Se añadió N-MM y se agitó la mezcla durante 20 minutos, tiempo tras el cual algo del ácido linolénico permanecía sin reaccionar. Se añadió más DCC (0,10 g) y la mezcla se agitó durante 20 horas adicionales. Se separó el DCU mediante filtración y el producto se aisló mediante HPLC en fase inversa. El producto purificado se concentró hasta obtener un aceite (0,65 g) y se añadió TFA (30 ml). Después de una hora de agitación, se evaporó el TFA para dejar el producto en forma de aceite marrón que se redisolvió en CH_{3}CN (6 ml) y se purificó mediante HPLC. Las fracciones puras obtenidas se combinaron, se concentraron y se liofilizaron (en t-butanol) para dar lugar a un aceite marrón (0,30 g, 42%).
Purificación
Purificación mediante HPLC:
tampón A: TFA al 0,1% / H_{2}O
tampón B: TFA al 0,1% + H_{2}O al 10% + CH_{3}CN al 90%
40 ml/min, 214 nm, columna preparativa pequeña C18
El gamma-linolénico-Asp-OH eluyó con B al 50%, el ácido linolénico eluyó con B al 70%, el linolenil-Asp(OtBu)-OtBu eluyó con B al 75%.
Análisis y caracterización 1. HPLC analítica
Tampón A: TFA al 0,1%, tampón B: TFA al 0,1%/ H_{2}O al 10%/ CH_{3}CN al 90%
2 ml/min, 214 nm, NovaPak C18
isocrática con B al 100%, tiempos de retención de los ingredientes:
ácido gamma-linolénico: Rt 4,14 min
gamma-linolenil-Asp(OtBu)-OtBu: Rt 8,71 min
gamma-linolenil-Asp-OH: Rt 2,28 min
2. N.M.R. de ^{13}C
(DMSO-d6): 14,1, CH_{3}; 22,2, 25,1, 25,4, 26,7, 26,8, 28,7, 28,9, 31,08, 35,1, CH_{2}; 36,3, D\beta; 48,7, Da; 127,8, 127,9, 128,1, 128,2, 130,0, 130,1, CH; 171,9, 172,2, 172,7, C=O.
3. CI-MS
m/z 394 (M + 1).
Las personas expertas en la técnica apreciarán que se le pueden hacer a la invención numerosas variaciones y/o modificaciones como se muestra en las realizaciones específicas sin alejarse del espíritu o alcance de la invención tal como se ha descrito ampliamente. Las presentes realizaciones han de considerarse, por ello, en todo lo que a ellas respecta como ilustrativas y no restrictivas.
TABLA 1 Inhibición de la cepa K resistente a cloroquina de P. falciparum mediante PUFA conjugados con aminoácidos
Compuesto % de inhibición
Cloroquina 20,1
Ácido araquidónico-glicina-OH 84,2
Ácido docosahexanoico-glicina-OH 84,9
Ácido linolénico-glicina-OH 81,5
Todos los PUFA a 11 \muM
TABLA 2 Efecto de los PUFA conjugados con aminoácidos sobre la producción de TNF\alpha e interferón \gamma estimulada por PHA
Compuesto TNF\alpha IFN\gamma
ácido \alpha-linolénico-glicina-OH 29,3 14,5
ácido \alpha-linolénico-ácido aspártico-OH 0 0
ácido \gamma-linolénico-glicina-OH 21,5 0
ácido \gamma-linolénico-ácido aspártico-OH 4,7 0
ácido araquidónico-glicina-OH 26,6 35,9
ácido araquidónico-ácido aspártico-OH 38,3 68,4
ácido eicosapentanoico-glicina-OH 11 68,2
ácido eicosapentanoico-ácido aspártico-OH 17,1 66,1
ácido docosahexanoico-glicina-OH 16,2 44
ácido docosahexanoico-ácido aspártico-OH 17,4 8,3
Todos los PUFA estaban a 20 \muM
TABLA 3 Efecto de los PUFA sobre la proliferación celular inducida por PHA
Compuesto % de inhibición de la proliferación
ácido \gamma-linolénico-glicina-OH 15,6
ácido \gamma-linolénico-ácido aspártico-OH 7,3
ácido \alpha-linolénico-glicina-OH 29
ácido \alpha-linolénico-ácido aspártico-OH 15,4
ácido araquidónico-glicina-OH 8
ácido araquidónico-ácido aspártico-OH 39,7
ácido eicosapentanoico-glicina-OH 5,4
ácido eicosapentanoico-ácido aspártico-OH 20,7
ácido docosahexanoico-glicina-OH 16,6
ácido docosahexanoico-ácido aspártico-OH 21,1
Todos los PUFA estaban a 20 \muM

Claims (8)

1. El uso de un ácido graso poliinsaturado que contiene una cadena de 16-26 carbonos y 3-6 dobles enlaces, en el que el ácido graso poliinsaturado está acoplado covalentemente por el grupo ácido carboxílico a un aminoácido seleccionado entre la glicina y el ácido aspártico, para la fabricación de una composición farmacéutica para estimular la actividad de los neutrófilos y/o tratar la infección de la malaria y/o la inflamación en un sujeto que requiere tal tratamiento.
2. El uso según la reivindicación 1, en el que el ácido graso contiene 18-22 carbonos.
3. El uso según la reivindicación 1, en el que el ácido graso es un compuesto de n-3 a n-6.
4. El uso según la reivindicación 1, en el que el ácido graso es el ácido \gamma-linolénico.
5. El uso según la reivindicación 1, en el que el ácido graso es el ácido \alpha-linolénico.
6. El uso según la reivindicación 1, en el que el ácido graso es el ácido araquidónico.
7. El uso según la reivindicación 1, en el que el ácido graso es el ácido eicosapentanoico.
8. El uso según la reivindicación 1, en el que el ácido graso es el ácido docosahexanoico.
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