JPH10507179A - 修飾ポリ不飽和脂肪酸 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、抗マラリアおよび／または好中球刺激活性を有するポリ不飽和脂肪酸化合物を提供する。該ポリ不飽和脂肪酸は、βオキサ、γオキサ、βチア、およびγチアからなる群から選択された１または２の置換基を有し、１８−２５の炭素数および１−６の二重結合を有することを特徴とする。ポリ不飽和脂肪酸は、アミノ酸に結合した、または、ヒドロキシ、ヒドロペルオキシ、ペルオキシ、カルボキシメチル置換基からなる群から選択されたさらなる置換基を含有することが好ましい。本発明はまた、アルコールのＯ−Ｈ結合にインサートされるカルベンと不飽和脂肪酸アルコールを反応させることを含有する、不飽和オキサ置換脂肪酸の製造方法を提供する。本発明はさらに、炎症治療方法であって、１−６のシスまたはトランス二重結合を有し、１８−２４の炭素数の炭素鎖を有するポリ不飽和脂肪酸のヒドロキシ、ヒドロキシペルオキシ、またはペルオキシ誘導体を少なくとも１つ含有する抗炎症組成物を用いる炎症治療方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 修飾ポリ不飽和脂肪酸 本発明は、抗マラリアおよび／または好中球刺激活性を有する新規なポリ不 飽和脂肪酸に関する。本発明はさらに、サイトカイン製造およびサイトカイン作 用の抑制性を有する修飾ポリ不飽和脂肪酸群に関する。これらの脂肪酸は、天然 のポリ不飽和脂肪酸と比較すると優れた安定性を有する。本発明はさらに、活性 成分としてポリ不飽和脂肪酸を含有する組成物、および、該組成物を投与するこ とを含有する、抗マラリア、抗感染、または抗炎症治療または防止方法に関する 。 世界の人口の半分以上が、マラリアの危険性にさらされており、毎年、約５ 億の急性感染者がおり、約１００万人が亡くなっていることが記録されている（ 文献：Ｔropical Ｄiseases Ｐrogress in Ｉnternational Ｒesearch，１ ９８７−１９８８，Ｎinth Ｐrogramme Ｒeport，ＵＮＤＰ／Ｗorld Ｂank／ ＷＨＯ，Ｇeneva，４３−４９；Ｓtevenson ＭＭ Ｐreface Ｉnc）。抗マラ リア剤の使用は、その増強する抵抗性と毒性副作用のため、主なる問題点が伴う ものである。近年使用されているほとんどの抗マラリア剤は、子供（致死性大脳 マラリアの危険性）、妊婦、および老人には不適当である。 炎症はバクテリア、ウイルス、および／または他の感染剤、日和見感染（た とえば、ガンまたは療法、特に毒性薬剤療法または放射線療法の結果としての免 疫抑制状態の結果を生じる可能性のある感染）、自己免疫等によって引き起こさ れる可能性がある。敗血性ショックが炎症を含む疾患の例である。グラム陰性敗 血性ショックの多くに臨床的特性は、動物へのＬＰＳの投与によって再生の可能 性があり、死に至る可能性のある重要な代謝および生理学的変化を促進する可能 性がある。ＬＰＳの注入に伴って、前炎症サイトカイン、たとえば腫瘍壊死ファ クタアルファ（ＴＮＦα）の大量製造が認められる。ＴＮＦまたはインターロイ キン−６に慢性的にさらされた特性である悪液質が、進行悪疾患および感染の一 般的な徴候である。これは、異常な蛋白質およびグルコース代謝物および体のる いそうによって特徴づけられる。マウス、ラット、および／またはヒトにＴＮＦ ＩＬ−１を慢性投与すると、食欲不振、体重減少、および体の脂質および蛋白 質の枯渇が、 ７〜１０以内に起こる（文献：Ｃerami et al．Ｉmmunol．Ｌett．１１，１７ ３；Ｆong et al．Ｊ．Ｅxp．Ｍed．１７０，１６２７；Ｍoldawer et al． Ａm．Ｊ．Ｐhysiol．，２５４ Ｇ４５０−Ｇ４５６，１９８８；Ｆong et al ．Ａm．Ｊ．Ｐhysiol．２５６，Ｒ６５９−Ｒ６６５（１９８９）；ＭcＣarthy et al．Ａm．Ｊ．Ｃlin．Ｎature，４２，１１７９−１１８２，１９８２） 。ＴＮＦレベルは、悪液質に関連した、慢性疾患およびガンを有する患者におい て測定されている。 発熱、睡眠発現性、および炎症メディエータである等のこれらの一般的な機 能的活性を有するＴＮＦαおよびＩＬ−１は、毒性ショックおよびガン関連悪液 質とは異なる慢性炎症に伴う他の疾患の病理と密接に関連している。ＴＮＦはリ ウマチおよび反応性関節炎の患者の滑液、およびリウマチ性関節炎の患者の血清 において発見されている（文献：Ｓaxne et en．Ａrthrit．Ｒheumat．３１， １０４１）。ＴＮＦのレベル上昇は、急性拒絶反応中の腎臓移植患者において発 見されている（文献：Ｍaury and Ｔeppo １９８７，Ｊ．Ｅxp．Ｍed．１６ ６，１１３２）。動物においては、同種異形骨髄移植後の皮膚及び腸における移 植片−対−ホスト症の病原において含有されることが発見されている。 ウサギ抗マウスＴＮＦ抗体を投与すると、移植片−対−ホスト症に関連した 組織学的変化を防止し、脂肪率を減少させることが示されている（文献：Ｐique t et an．Ｊ．Ｅxp．Ｍed．１６６，１２２０）。ＴＮＦはまた、マラリアの 病理学に対して非常に貢献することが示されている（文献：Ｃlark et al．１ ９８７，Ａm．Ｊ．Ｐathol．１２９，１９２−１９９）。さらに、ＴＮＦの血清 レベル上昇は、マラリア患者において報告されている（文献：Ｓcuderi et al ．１９８６，Ｌancet ２，１３６４−１３６５）。 多発性硬化症（ＭＳ）は中枢神経系の慢性脱髄症であり、若者の最も一般的 な慢性ニュートロリジカル（neutroligical）症である。ＭＳの発症と分布パタ ーンはこの１０年変わっていない。この病気は基本的には治療不可能である。 ＭＳは通常、中枢神経系（ＣＮＳ）の白質に多発し、最も頻繁には、白質、 脳幹、脊髄帯、および視神経に起こる。第１の方法はミエリンシースを破壊し、 ＭＳの特徴的プラークを創る稀突起膠細胞を結果として殺すことである。 プラークの早期発現は、脈管周囲の炎症の発現とそれに次ぐリンパ球、プラ ズマ細胞、マクロファージの病巣への移行により特徴づけられる。これに次いで 、星状グリオーシスおよびオリゴデンドロサイトによる脱ミエリン化がおこる。 プラークは白血球により取り囲まれている。抗Ｔ細胞剤、たとえば抗−ＣＤ４ト リートメントが効果的である。このような薬剤はＴ細部の増殖を抑制する。 ＭＳの原因は未だ知られていないが、まことしやかな仮説を導く研究の焦点 は、病気の実際の発現に役割を果たしている可能性のある遺伝的素因および自己 免疫を含有する免疫変質性の研究であった。ＴＮＦβ（リンホトキシン）および ＴＮＦαの双方が、病態生理学において役割を果たしていると考えられている。 多発性免疫学的異常症は病気の急性段階における患者に再発することが見受 けられる。末端では普通であるが、免疫グロブリンの合成が中枢神経系で増加し 、生成した抗体は特徴的な染色パターンを有する。これらの抗体の抗原特異性は 知られておらず、これらが病気の進行に役割を果たしているか否かは不明である 。 外科手術またはウイルス感染等の免疫システムを活性化するとして知られて いる種々のストレスはまた、ＭＳを増悪させる可能性がある。γ−インターフェ ロン等の他のアクティベータは、投与した場合、類似の効果を示す。さらに、た とえばコルチコステロイドを用いた免疫抑制抗炎症治療は、最も穏和な緩解性を 示し、または、短い時間で少なくとも緩和可能である。 ミエロパシー、脊髄の異常は、種々の異なった要因を有している可能性があ り、これらのほとんどは、以下のことを含む炎症により媒介される。 神経梅毒： b₁₂または葉酸欠乏： サルコイドーシス： 横骨髄炎： アラキドニシス： 首の脊推炎： 運動神経症： 神経繊維腫症： 腫瘍、円板、または関節炎からの脊髄圧迫： 脊髄のエリテマトーデス：および ウイルス脳ミエリン症。 より一般的に知られているような慢性炎症または慢性免疫システム活性は、 その起源が外因性のまたは自己免疫状態からの結果である可能性のある持続性抗 原に反応して起こるものである。このような慢性炎症は、結果として局所組織崩 壊を起こし、炎症のタイプに応じて、炎症メディエータの継続製造による全身効 果となる可能性がある。このような炎症メディエータは、活性化白血球およびマ クロファージにより製造された溶解性メディエータであるサイトカインを含有し 、細胞伝達および生理学的反応に効果を与える。慢性免疫活性化は、感染症、た とえば慢性疲労シンドロームまたは毒性ショックシンドロームなどの結果として 、または、たとえば移植片−対−ホスト病などの他の病気およびクローン病、炎 症性腸疾患、リウマチ性関節炎の症状などとなる自己免疫メカニズムを通して起 こる可能性がある。 リウマチ性関節炎（文献：Ｍarrow et al．Ｉ “Ａutoimmune Ｒheumat ic Ｄiscase”，Ｂlackwell Ｓcientific Ｐubl．Ｏxford，ＵＫ．Ｃhapter ４，pp１４８−２０７（１９８７））は、子供を含む人口の３％までがかかる可 能性のある関節の腐食および慢性炎症により特徴づけられた病気である。リウマ チ性関節炎の徴候は、朝の硬化、膨潤、および少なくとも１つの関節における運 動時の痛みおよび関節膨潤を含有する。傾眠、食欲不振、および体力低下、並び に熱およびリンパ節症（免疫活性化の特徴）を含有する非特異的徴候から、関節 炎の予想をすることが可能である。リウマチ性関節炎の関節以外の発現としては 、脈管炎、白内障、ブドウ膜炎、介在性線維症、心膜炎、および心筋炎、末梢神 経細胞障害、骨髄性沈積物、慢性貧血、および皮下および肺の小結節を含有する 。 バクテリア、細菌、マイコプラズマ、およびウイルスを含有する感染性薬剤 および遺伝的要因は、リウマチ性関節炎の発現に関連している。穏和なリウマチ 性関節炎は非ステロイド系抗炎症剤で処理可能であるが、一方、重症な場合は、 全身系コルチコステロイド、抗代謝物または細胞毒性剤を必要とする。実験的に は、抗ＣＤ４モノクローナル抗体および抗−ＴＮＦα抗体は、リウマチ性関節炎 の治療に使用されている（文献：Ｈorneff et al．Ｃytokine ３，２６６− ２６７（１９９１）；Ｈorneff et al．Ａrth．Ｒheum．３４，１２９−１４ ０（１９９ １）；およびＳhoenfeld et al．Ｃlin．Ｅxp．Ｒheum．９，６６３−６７３ （１９９１）；Ｗilliams et al．１９９２，ＰＮＡＳ ８９，９７８４）。 炎症性腸炎（ＩＢＤ）およびクローン病は、自己免疫症のいくつかの基準を 満たす慢性炎症性疾患である（文献：Ｓnook，Ｇut，３１，９６１−９６３（１ ９９１））。炎症および組織ダメージは、サイトカインおよび前炎症分子、たと えばプロスタグランジンおよびロイコトリエンを発生する（ＭacＤermott，Ｍt ．Ｓinai，Ｊ．Ｍed．５７，２７３−２７８（１９９０））、好中球、マクロフ ァージ、および白血球の活性化および回復を含む（ＭacＤermott et al．Ａdv ．Ｉmmunol．４２，２８５−３２８（１９８８））。ＴＮＦα（文献：ＭacＤer mott，Ｍt．Ｓinai，Ｊ．Ｍed．５７，２７３−２７８（１９９０））、ＩＬ-１ 、ＩＬ-６（文献：Ｓtarter，Ｉmmunol．Ｒes．１０，２７３−２７８（１９９ ０）；Ｆiocchi，Ｉmmunol．Ｒes．１０，２３９−２４６（１９９１））が免疫 担当細胞の慢性活性化の結果として、ＩＢＤおよびクローン病患者の全てにおい て上昇する。 ＩＢＤおよびクローン病を治療するのに使用される薬剤は、抗炎症剤、たと えばスルファサラジン（５−ＡＳＡ）コルチコステロイド、シクロスポリンＡ、 およびアザチプリン（文献：Ｈanauer，Ｓcand，Ｊ．Ｇastroenterol，２５（Ｓ upl，１７５）９７−１０６（１９９０）；Ｐeppercorn，Ａnnal．Ｉntern．Ｍe d．１１２，５０−６０（１９９０））を含有する。実験的には、抗ＣＤ４およ び抗ＴＮＦモノクローナル抗体が潰瘍性大腸炎を継続して治療するのに使用され ている（文献：Ｅmmerich et al，Ｌancet，３３８，５７０−５７１（１９９ １））。 ホストは、ホスト−対−移植片反応を起こす遺伝的に合わない移植片に対し て反応可能であるが、免疫応答性移植片（たとえば骨髄または腸組織）がホスト に対して反応すると、移植片−対−ホスト症となる。これらの反応は、外部ＭＨ Ｃ分子に対してダイレクトな同種異形反応によって媒介され、混合白血球反応（ ＭＬＲ）によってインビトロで擬態される。移植片／ホスト相互作用は結果とし て、たとえばＡＤＳに見られるように免疫活性化のマーカーを増加させて、移植 片組織を囲む慢性炎症を起こす結果となる（文献：Ｇrant．Ｉmmunol．Ｔoday， １２，１７１−１７２（１９９１））。移植片／ホスト相互作用の治療は、近年 、アザチオプリン、シクロスポリンＡ、またはメチルプレドニソンのいずれかを 含 有し、より近年はラパマイシンを使用するものである（文献：Ｓpekowski et al．Ｔransplantation，５３，２５８−２６４（１９９２）：Ｈuber et al． Ｂibliotheca Ｃardiologica，４３，１０３−１１０（１９８８））。ＣＤ３ に特異的なモノクローナル抗体（文献：Ｗissing et al．Ｃlin．Ｅxp．Ｉmmu nol．８３，３３３−３３７（１９９１））、ＣＤ４（文献：Ｒeinke et al． Ｌancet，３３８，７０２−７０３（１９９１））、およびＴＮＦαは経験的に 移植片／ホスト反応を抑制するために使用されている。 上記したように、ＰＵＦＡは、有用な生物学的活性を有している（ＷＯ９３ ／０００８４およびＷＯ９５／００６０７参照、これらの文献はここに参照して 組み入れられるものである）。しかしながらＰＵＦＡはインビボで安定性が低い ため、治療剤として広範囲には使用されていなかった。本発明者らは、生物学的 活性を維持しつつ、安定性が増した、すなわちインビボで代謝回転が低い、置換 ＰＵＦＡを開発した。これら新規なポリ不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）化合物は直接 的な抗マラリア活性を有する。直接的な抗マラリア活性に加えて、新規なＰＵＦ Ａは、顆粒物の放出を起こすヒト好中球を活性化させ、スーパーオキシド生成に おいてＴＮＦと相乗作用を示す。該ＰＵＦＡによるヒト好中球の活性化は、結果 として、これらの細胞の、赤血球中のマラリア寄生虫（Ｐ．falcliarum）および バクテリアＳtaphylococcus aureusを殺す能力が増加することとなる。 さらに本発明者らは、あるポリ不飽和脂肪酸と新規なポリ不飽和脂肪酸およ びこれらのヒドロキシおよびヒドロペルオキシ誘導体がサイトカインの生成を抑 制することも見い出した。 これら新規のＰＵＦＡは、少なくとも１つのβ−オキサ、β−チア、γ−オ キサ、またはγ−チア置換基を含有する。飽和β−オキサ脂肪酸は、エーテル合 成用の標準的な方法を用いて、アルキルハライドをα−ヒドロキシ酸のジアニオ ンと反応させるか、または、α−ハロ酸を脱プロトン化アルコールで処理するこ とによって得られるが、本発明による不飽和β−オキサ脂肪酸は、常法では製造 できない。不飽和化合物は、この方法では、オレフィンおよびアリル炭素におけ る所望しない副反応から得られた分解生成物のみである。 常法の近年の変法としては、飽和β−オキサ脂肪酸は、激しくない反応条件 下、求核性置換反応を通して、ボロントリフルオライドエーテラートと複合する ことによって活性化したジアゾアセタートをアルコールで処理することによって 得られている。しかしながら、ボロントリフルオライドエーテラートはアルケン のアイソマリゼーションをおこすことが知られており、したがって、不飽和β− オキサ脂肪酸の合成に使用するのは適当ではない。 本発明者らは、不飽和β−オキサ脂肪酸が、良好な収率で、アルコールのＯ −Ｈ結合におけるカルベンのインサーションによって得られることを見い出した 。したがって、他のカルベンインサーション反応を併発することがなく、反応条 件下でオレフィン部位が影響されることはない。 カルベンは相当するジアゾアセタートまたはジアゾアルカンから、ロジウム 塩等の触媒処理することによって得られる。不飽和脂肪アルコールまたはα−ヒ ドロキシ酢酸の誘導体のいずれかである相補性アルコールとカルベンとを反応さ せることによって、不飽和β−オキサ脂肪酸が得られる。好ましい実施態様にお いては、アルコールは、天然不飽和脂肪酸または相当するエステルの還元によっ て得られたものであり、ジアゾ酢酸のエステルとの反応によって、不飽和β−オ キサ脂肪酸が得られる。 本発明者らは、また、β−オキサおよびβ−チア置換脂肪酸の双方が、β− 酸化を起こさないことを示した。さらに、ある新規な化合物は、溶解性の増加、 種々の酸化還元能力、および種々の電荷および極性を含む、天然のＰＵＦＡとは 異なる他の特性を示すことを見い出した。 したがって、本発明によれば、抗マラリアおよび／または好中球剌激活性を 有するポリ不飽和脂肪酸化合物であって、βオキサ、γオキサ、βチア、および γチアからなる群から選択された１または２の置換基を有し、１８−２５の炭素 数および１−６の二重結合を有する、ポリ不飽和脂肪酸化合物が提供される。 本発明の好ましい実施態様において、ポリ不飽和脂肪酸化合物は、ヒドロキ シ、ヒドロペルオキシ、ペルオキシ、カルボキシメチル置換基からなる群から選 択されたさらなる置換基を含有する。他の実施態様においては、不飽和脂肪酸は アミノ酸に共有結合する。 本発明の他の好ましい実施態様においては、ポリ不飽和脂肪酸化合物は、２ ０−２５の炭素数および３−６の二重結合を有し、好ましくは、ｎ−３からｎ− ６脂肪酸である。 本発明の他の好ましい実施態様においては、ポリ不飽和脂肪酸化合物は、β オキサまたはβチア置換基を含有する３−４の二重結合を有し、２１の炭素数を 有する；βオキサまたはγチア置換基を含有する３−４の二重結合を有し、２２ の炭素数を有する；βチア置換基を含有する３−４の二重結合を有し、２３の炭 素数を有する；γチア置換基を含有する３−４の二重結合を有し、２４の炭素数 を有する；βオキサ置換基を含有する３−６の二重結合を有し、２５の炭素数を 有する；βチア置換基を含有する３−６の二重結合を有し、２５の炭素数を有す る；α−カルボキシメチル基、βチア置換基、３−６の二重結合、および２３の 炭素数を有するものである。 また、本発明の他の好ましい実施態様においては、ポリ不飽和脂肪酸化合物 は、ωヒドロキシ置換基を有する。 本発明の他の好ましい形態においては、ポリ不飽和脂肪酸化合物は、アミノ 酸に共有結合し、好ましくは、アスパラギン酸またはグリシンに共有結合する。 また、本発明によれば、アルコールのＯ−Ｈ結合にカルベンがインサートさ れるように、カルベンと不飽和脂肪酸アルコールを反応させることを含有する、 不飽和オキサ置換脂肪酸の製造方法が提供される。 本発明の好ましい実施態様においては、不飽和脂肪酸アルコールが、１−６ の二重結合、および１８−２５の炭素数を有する。 本発明のさらなる好ましい実施態様においては、カルベンが、ジアゾ化合物 の酢酸ロジウム触媒を介して合成される。 本発明の他の好ましい実施態様においては、不飽和βオキサ置換脂肪酸が製 造される。 また、本発明によれば、患者の炎症治療方法であって、１−６のシスまたは トランス二重結合を有し、１８−２４の炭素数の炭素鎖を有するポリ不飽和脂肪 酸のヒドロキシ、ヒドロキシペルオキシ、またはペルオキシ誘導体を少なくとも １つ含有する、抗炎症組成物を治療有効量、患者に投与することを含有する、炎 症治療方法が提供される。 本発明の好ましい実施態様においては、ポリ不飽和脂肪酸が、オキサまたは チア誘導体として、炭素鎖内に酸素またはイオウ原子を含有する。 本発明の他の好ましい実施態様においては、ポリ不飽和脂肪酸が、Ｃ２０： ４ｎ−６（５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸）、Ｃ２０：５ｎ−３（ ５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸）、Ｃ２２：６ｎ−３（４， ７，１０，１３，１６，１９−エイコサヘキサエン酸）、およびアラキドン酸か らなる群から選択される。 好中球／マクロファージ刺激剤はカンジダsp、トリパノソーマ、住血吸虫症 、結核、ヘルペスなどのウイルス、シンドビス（Ｓindbis）ウイルス、レジュネ ラ、リステリア症、ニューモシスティス症、シュードモナス症を含有する他の感 染症の治療に適用可能である。これらはまた、ガンの化学療法中の患者、移植受 容体、やけど患者を含む免疫無防備状態の個々への補助治療として有用である。 さらに、いわゆる正常な個々もまた、たとえば食細胞活性が少ないとして知られ ているアルコール依存症の人、老人、２歳以下の子供も治療可能である。 本発明の特性は、以下の図（Ｆig．）および実施例を参照にして好ましい形 態を挙げて例解する。 Ｆig．１aは、アラキドン酸、５，８，１１，１４−エイコサテトラエン酸 を示す。 Ｆig．１bは、５−ヒドロペルオキシ−６Ｅ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイ コサテトラエン酸を示す。 Ｆig．１cは、９−ヒドロペルオキシ−５Ｚ，７Ｅ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイ コサテトラエン酸を示す。 Ｆig．１dは、８−ヒドロペルオキシ−５Ｚ，９Ｅ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイ コサテトラエン酸を示す。 Ｆig．１eは、１２−ヒドロペルオキシ−５Ｚ，８Ｚ，１０Ｅ，１４Ｚ−エ イコサテトラエン酸を示す。 Ｆig．１fは、１１−ヒドロペルオキシ−５Ｚ，８Ｚ，１２Ｅ，１４Ｚ−エ イコサテトラエン酸を示す。 Ｆig．１gは、１５−ヒドロペルオキシ−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１３Ｅ−エ イコ サテトラエン酸を示す。 Ｆig．１hは、５−ヒドロキシ−６Ｅ，８Ｚ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサテ トラエン酸を示す。 Ｆig．１iは、９−ヒドロキシ−５Ｚ，７Ｅ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサテ トラエン酸を示す。 Ｆig．１jは、８−ヒドロキシ−５Ｚ，９Ｅ，１１Ｚ，１４Ｚ−エイコサテ トラエン酸を示す。 Ｆig．１kは、１２−ヒドロキシ−５Ｚ，８Ｚ，１０Ｅ，１４Ｚ−エイコサ テトラエン酸を示す。 Ｆig．１lは、１１−ヒドロキシ−５Ｚ，８Ｚ，１２Ｅ，１４Ｚ−エイコサ テトラエン酸を示す。 Ｆig．１mは、１５−ヒドロキシ−５Ｚ，８Ｚ，１１Ｚ，１３Ｅ−エイコサ テトラエン酸を示す。 Ｆig．１nからＦig．１zは、Ｙがヒドロキシ、ペルヒドロキシ、またはペル キシである置換ＰＵＦＡの範囲を示す。 Ｆig．２aは、β−オキサ ２３：４（ｎ−６）を示す。 Ｆig．２bは、β−オキサ ２１：３（ｎ−６）を示す。 Ｆig．２cは、β−オキサ ２１：３（ｎ−３）を示す。 Ｆig．２dは、β−オキサ ２５：６（ｎ−３）を示す。 Ｆig．２eは、β−オキサ ２１：４（ｎ−３）を示す。 Ｆig．２fは、β−チア２３：４（ｎ−６）を示す。 Ｆig．２gは、β−チア２１：３（ｎ−６）を示す。 Ｆig．２hは、β−チア２１：３（ｎ−３）を示す。 Ｆig．２iは、β−チア２５：６（ｎ−３）を示す。 Ｆig．２jは、α−カルボキシメチル−βチア２３：４（ｎ−６）を示す。 Ｆig．２kは、γ−チア２４：４（ｎ−６）を示す。 Ｆig．２lは、γ−チア２２：３（ｎ−６）を示す。 Ｆig．２mは、γ−チア２２：３（ｎ−３）を示す。 Ｆig．２nは、１６−ＯＨ−β−オキサ２２：３（ｎ−６）を示す。 Ｆig．２oは、１６−ＯＨ−β−オキサ２２：３（ｎ−３）を示す。 Ｆig．３は、マイトジェンＰＨＡにより刺激されたヒト末端血液単核細胞（ ＰＢＭＣ）によるサイトカイン生成における、２０：４、２０：４メチルエステ ル（ＭＥ）、２０：４ヒドロペルオキシ（ＨＰ）、および２０：４ヒドロキシ（ Ｈ）の効果を示す。２０：４ヒドロペルオキシおよび２０：４ヒドロキシは、サ イトカイン生成、マクロファージ−誘導サイトカイン（ＴＮＦα）およびＴ細胞 誘導サイトカイン（リンホカイン、インターフェロン、ＩＬ−２）を抑制する。 Ｆig．４は、ＰＨＡ誘発サイトカイン生成における２２：６、２２：６ＨＰ 、２２：６Ｈ、２０：５、２０：５ＨＰ、および２０：５Ｈの効果を示す。これ らの化合物はマクロファージおよびＴ細胞誘導サイトカインのインビトロ製造を 抑制する。 Ｆig．５は、２０：４、２０：４ヒドロペルオキシ（ＨＰ）、および２０： ４ヒドロキシ（Ｈ）がヒト穴状静脈内皮細胞によるＥ−選択性のＴＮＦα−誘発 を抑制することを示す。 Ｆig．６は、好中球アズロフィル顆粒からの脂肪酸刺激放出を示す。 Ｆig．７は、好中球特異的顆粒からの脂肪酸刺激放出を示す。 Ｆig．８は、脂肪酸によるＳtaph aureusの好中球媒介死の向上を示す。 Ｆig．９（a）は、アラキドン酸およびβ−オキサ２３：４（ｎ−３）のβ 酸化性の比較を示す。 Ｆig．９（b）は、化合物がアラキドン酸のβ酸化を抑制せず、正常な細胞 代謝を妨げるので不適当であることを示す。 表１は、クロロキン（chloroquine）感受性Ｐ．falciparumに対する新規な 脂肪酸の直接抗マラリア活性を示す。 表２は、Ｐ．falciparumを死亡させるための、新規な脂肪酸の好中球刺激性 を示す。 表３は、クロロキン（chloroquine）耐性Ｐ．falciparumの生存への、新規 な脂肪酸の直接的効果を示す。 表４は、脂肪酸による末梢血管単核増殖のマイトージェン刺激増殖の抑制を 示す。 表５は、脂肪酸によるＰＨＡ刺激ＴＮＦα生成の抑制を示す。 表６は、脂肪酸によるＳtaph aureus刺激インターフェロンγ生成の抑制を 示す。 方法 ＴＮＦ−誘発ＥＬＡＭ−１およびＩＣＡＭ−１の検定 ヒト穴状コード内皮細胞（human umbilical cord endothelial cells） （５Ｘ１０⁴継代１）を９６ウエルマイクロトレイの中央の６０ウエルにプレー トし、残りのウエルにピロジェン（pyrogen）フリーの蒸留水を充填し、細胞含 有のウエルにおける蒸発を減少させた。該細胞に新鮮な媒体（内皮細胞成長サプ ルメントおよび２０％ＦＣＳで補足したＭ１９９）を、融合するまで、２日毎に 与えた。アッセイの前日、細胞をＨＢＳＳで洗浄して、再度媒体補給した。アッ セイ時に媒体をアスピレートし、メディア内で調製された脂肪酸を各ウエルに添 加し、Ｆig．に示すように種々の時間でインキュベートした。５％二酸化炭素中 での３７℃。このインキュベーション後、ＰＢＳ中で３回洗浄して定着する（１ ００μl、ＰＢＳ中の０．０２５％グルタルアルデヒド、４℃で一昼夜）前に、 細胞を洗浄してＴＮＦまたはＰＭＡのいずれかで処理した。ウエルをＰＢＳで洗 浄し、抗ＥＬＡＭ（Ｂecton−Ｄickinson社、１００μl、２０％ＦＣＳ含有Ｍ１ ９９中１／１０００）または抗ＩＣＡＭ（Ｉmmunotech社、１００μl、２０％Ｆ ＣＳ含有Ｍ１９９中１２／２５００）のいずれかを添加し、室温で１時間インキ ュベートした。この後、ウエルをＰＢＳで洗浄し、１００μlのウサギ抗マウス Ｉg−ＨＲＰ接合体を添加した（１／１０００、Ｄako）。１００μlの基質（Ａ ＢＴＳ）の添加前で、３回プレートを洗浄する前に、室温で１時間さらなるイン キュベートをした。発色をマイクロプレートリーダーで４１０nmにおいて測定し た。 単核細胞増殖アッセイ 単核細胞を、ＦerranteおよびＴhong（１９７８．．．）により記載された ように正常なヒトドナーの末梢血液から分離した。単核細胞を、２０％ヒトＡＢ 血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０に再懸濁し、９６ウエルマイクロトレイ（ウ エルあ たり５０μl、細胞密度４Ｘ１０⁶細胞／ml）に入れた。脂肪酸（６６μｍ）を次 いで５０μlに添加し、５％二酸化炭素中３７℃で３０分間、細胞をプリインキ ュベートした。マイトジェン（ＰＨＡ、ＣonＡ、ＰＷＭ、Ｓtaph．aureus）を次 いで１００μlに添加し、三重水素化チミジン（１μＣi／ウエル）の添加前に、 ５％二酸化炭素中３７℃で６６時間、細胞をインキュベートした。全７２時間の 培養後、細胞を収集し、増殖（チミジン組み入れ）および上澄み液に対してサイ トカインの存在をアッセイした。 サイトカインアッセイ 培養上澄み液におけるサイトカインレベルを、特異的ＥＬＩＳＡによって、 抗サイトカイン抗体を用いた定めた。以下のサイトカインレベルを定めた。ＴＮ Ｆα、ＴＮＦβ、インターフェロン−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２。 脂肪酸ミセルの調製および好中球の前処理 脂肪酸の水溶液への不溶性を克服するために、混合ジパルミトイルホスファ チジルコリン（ＤＰＣ、４００μg）：脂肪酸（１００μg）ミセルをＨＢＳＳ中 、音波によって調製した。好中球を３０分間、３７℃で前処理した。いくつかの 実験では、ＰＵＦＡはエタノールに溶解した。 マラリア成長抑制アッセイ ＲＢＣ（５０Ｘ１０⁶、３０．５％パラサイチミア）を、９６−ウエルミク ロタイタープレートのウエル中の好中球（１０⁶）と混合し、次いで、１μＣiの ３Ｈ−ハイポキサチン添加前、空気中、５％二酸化炭素中で３７℃で２時間、イ ンキュベートした。プレートを次いで一昼夜インキュベートした。個々のウエル 含有物をガラスフィルタペーパーに収集し、液状シンチレーションカウンタ中で 組み入れられた３Ｈを測定した。寄生虫の成長抑制％を次いで計算した。 好中球の化学発光測定 ＨＢＳＳ中の好中球（１Ｘ１０⁶）、１００μlに、１００μlの脂肪酸ミセ ルま たはＤＰＣ単属および３００μlのＨＢＳＳをさらに添加した。これを次いで５ ００μlのルシジェニン（lucigenin）（ＰＢＳ中０．２５mg／ml）を直ちに添加 し、得られた光（mＶ）を発光測定機で測定した。実験は、分離した個々からの 細胞を用いて３回行い、示された値は、応答ピーク値を示す。 脱顆粒の測定 脱顆粒は、ビタミンＢ１２結合蛋白質（文献：Ｇottleib et al．，１９ ６５，Ｂlood，２５：８７５−８８３に記載されているようなもの）およびβ− グルクロニダーゼリリース（文献：Ｋolodeney and Ｍumford，１９７６，Ｃl in．Ｃhem．Ａcta．，７０；２４７−２５７に記載されているようなもの）を測 定することによって定めた。 殺菌性のアッセイ Ｓtaphylococcus aureusに対する好中球の殺菌活性を、文献：Ｆerrante and Ａbell，１９８６，Ｉnfect．Ｉmmun．，５１：６０７に記載された方法に したがって測定した。 化学合成 β−オキサ脂肪酸の合成 試薬 アラキドニルアルコール（１a）−Ｎu Ｃhek Ｐrep．，Ｅlysian．ＭＮ． ＵＳＡ ガンマリノレニルアルコール（１b）−Ｎu Ｃhek Ｐrep．，Ｅlysian．Ｍ Ｎ．ＵＳＡ リノレニルアルコール（１c）−Ｎu Ｃhek Ｐrep．，Ｅlysian．ＭＮ．Ｕ ＳＡ ドコサヘキサエニルアルコール（１d）−Ｎu Ｃhek Ｐrep．，Ｅlysian． ＭＮ．ＵＳＡ Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ−６，９，１２，１５−オクタデカテトラエニルアルコール （１e）−メチル＝６，９，１２，１５−オクタデカテトラエノアートの水素化 アルミニウムリチウム還元反応により合成 メチル＝Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ−６，９，１２，１５−オクタデカテトラエノアー ト−Ｓigma Ｃhemical Ｃompany 酢酸ロジウム２量体−Ａldrich Ｃhemical Ｃompany tert−ブチル＝ジアゾアセタート（２）−tert−ブチル＝アセタートから、 文献：Ｒegitz，Ｍ：Ｈocker，Ｊ：Ｌeidhegener，Ａ．Ｏrganic Ｓyntheses， Ｃoll，Ｖol．５，１７９にしたがって合成 tert−ブチル＝アセトアセタート−Ｆluka ＡＧ トリフルオロ酢酸−Ａldrich Ｃhemical Ｃompany 全ての溶媒は使用前に蒸留した。 メルクシリカゲル６０（２３０−４００メッシュ），Ａrt．９３８５を用い て、窒素圧力下、カラムクロマトグラフィを行った。 方法 tert−ブチル＝アルキルオキシアセタート（３） 相当する脂肪酸（１）（１モル当量）を２首丸底フラスコに乾燥窒素雰囲気 下、計り入れ、ジクロロメタンに溶解した。これに、酢酸ロジウム二量体溶液（ ０．５モル％）を添加し、tert−ブチル＝ジアゾアセタート（２）（２．５モル 当量）のジクロロメタン溶液をシリンジで滴下した。添加終了後、反応混合物を 窒素雰囲気下、２時間、室温で撹拌した。粗反応混合物を乾燥窒素気流下で濃縮 し、残さをシリカのカラムクロマトグラフィで、ヘキサン／ジエチルエーテル（ ９：１）で溶出して精製したところ、相当するtert−ブチル＝アルキルオキシア セタート（３）がオイルとして得られた。 アルキルオキシ酢酸（４） 相当するtert−ブチル＝アルキルオキシアセタート（３）（約１００mg、１ モル当量）を２首丸底フラスコに乾燥窒素雰囲気下、計り入れ、ジクロロメタン （約４ml）を添加して溶解した。これに、トリフルオロ酢酸（約１ml）を添加し 、反応混合物を窒素雰囲気下、２時間、室温で撹拌した。粗反応混合物を乾燥窒 素気流下で濃縮し、残さをシリカのカラムクロマトグラフィで、ヘキサン／ジエ チルエーテル／酢酸（４０：６０：２）で溶出して精製したところ、相当するア ルキルオキシ酢酸（４）がオイルとして得られた。 tert−ブチル＝（５，８，１１，１４−エイコサテトラエニルオキシ）アセタ ート（３a） ［t−Ｂu β−オキサ ２３：４（n−６）］ tert−ブチル＝Ｚ，Ｚ，Ｚ−（６，９，１２−オクタデカトリエニルオキシ） アセタート（３b） ［t-Ｂu β−オキサ ２１：３（n−６）］ tert−ブチル＝Ｚ，Ｚ，Ｚ−（９，１２，１５−オクタデカトリエニルオキシ ）アセタート（３c） ［t-Ｂu β−オキサ ２１：３（n−３）］ tert−ブチル＝Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ−（４，７，１０，１３，１６，１９ −ドコサヘキサエニルオキシ）アセタート（３d） ［t-Ｂu β−オキサ２５：６（n−３）］ tert−ブチル＝Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ−（６，９，１２，１５−オクタデカテトラエ ニルオキシ）アセタート（３e） ［t−Ｂu β−オキサ ２１：４ （n−３）］ Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ（５，８，１１，１４−エイコサテトラエニルオキシ）酢酸（ ４a） ［β−オキサ ２３：４（n−３）］ Ｚ，Ｚ，Ｚ−（６，９，１２−オクタデカトリエニルオキシ）酢酸（４b） ［β−オキサ ２１：３（n−６）］ Ｚ，Ｚ，Ｚ−（９，１２，１５−オクタデカトリエニルオキシ）酢酸（４c） ［β−オキサ ２１：３（n−３）］ Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ−（４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサ エニルオキシ）酢酸（４d） ［β−オキサ ２５：６（n−３）］ Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ−（６，９，１２，１５−オクタデカテトラエニルオキシ）酢 酸（４e） ［β−オキサ２１：４（n−３）］ βおよびγチア脂肪酸の合成 試薬 脂肪臭化物（１a−１d）−相当する脂肪アルコールからジクロロメタン中、 四臭化炭素およびトリフェニルヒスフィンで処理することによって合成 アラキドニルアルコール−Ｎu Ｃhek Ｐrep． ガンマリノレニルアルコール−Ｎu Ｃhek Ｐrep． リノレニルアルコール−Ｎu Ｃhek Ｐrep． ドコサヘキサエニルアルコール−Ｎu Ｃhek Ｐrep． メルカプト酢酸−Ａldrich Ｃhemical Ｃompany メルカプトプロピオン酸−Ａldrich Ｃhemical Ｃompany 全ての溶媒は使用前に蒸留した。 メルクシリカゲル６０（２３０−４００メッシュ），Ａrt．９３８５を用い て、窒素圧力下、カラムクロマトグラフィを行った。 方法 アルキルチオ酢酸（３a−d） ナトリウム（３モル当量）を２首丸底フラスコに乾燥窒素雰囲気下、メタノ ールに溶解し、これに、メルカプト酢酸（１．２モル当量）を添加した。最初の 白色沈殿物を溶解した後、ジエチルエーテル中の相当するブロミド（１）（１モ ル当量）溶液をシリンジで添加し、反応混合物を窒素雰囲気下、１６時間、室温 で撹拌した。粗反応混合物を、同当量の塩酸（１０％v／v）に注ぎ、ジエチルエ ーテルで抽出した。得られた抽出物を乾燥窒素気流下で濃縮し、残さをシリカの フラッシュカラムクロマトグラフィで、ヘキサン／ジエチルエーテル／酢酸（４ ０：６０：２）で溶出して精製したところ、相当するアルキルチオ酢酸（３）が オイルとして得られた。 アルキルチオプロピオン酢酸（５a−c） アルキルチオプロピオン酢酸（５a−c）を、アルキルチオ酢酸（３a−d）合 成と類似の方法で、メルカプトプロピオン酸（４）を用いて相当する脂肪臭化物 （１a−c）のアルカリ縮合によって合成した。 Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ−（５，８，１１，１４−エイコサテトラエニルチオ）コハク 酸（７a） Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ−（５，８，１１，１４−エイコサテトラエニルチオ）コハ ク酸（７a）を、上記アルキルチオ酢酸（３a−d）の場合と類似の方法で、ナト リウム（４５．５モル当量）の存在下、メルカプトコハク酸（６）（１．２モル 当量）を用いて脂肪臭化物（１a）（１モル当量）の縮合によって合成した。 Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ−（５，８，１１，１４−エイコサテトラエニルチオ）酢酸（ ３a） ［β−チア２３：４（n−６）］ Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ−（６，９，１２−オクタデカトリエニルチオ）酢酸（３b） ［β−チア ２１：３（n−６）］ Ｚ，Ｚ，Ｚ−（９，１２，１５−オクタデカトリエニルチオ）酢酸（３c） ［β−チア２１：３（n−３）］ Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ−（９，１２，１５−オクタデカトリエニルチオ）酢 酸（３d） ［β−チア２５：６（n−３）］ Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ−（５，８，１１，１４−エイコサテトラエニルチオ）プロピ オン酸（５a） ［γ−チア２４：４（n−６）］ Ｚ，Ｚ，Ｚ−（６，９，１２−オクタデカトリエニルチオ）プロピオン酸（５ b） ［γ−チア２２：３（n−６）］ Ｚ，Ｚ，Ｚ−（９，１２，１５−オクタデカトリエニルチオ）プロピオン酸（ ５c） ［γ−チア２２：３（n−３）］ Ｚ，Ｚ，Ｚ，Ｚ−（５，８，１１，１４−エイコサテトラエニルチオ）コハク 酸（７a） ［α−カルボキシメチル−βチア２３：４（n−６）］ ヒドロキシおよびヒドロキシペルオキシ誘導体の合成 アラキドン酸（Ｆig．１b−１g）のヒドロペルオキシ誘導体は、別々に、Ｆ ig．１aの酵素触媒反応から、または、Ｆig．１aの自己酸化による混合物として 得られる。反応条件に応じて種々の比率である、自己酸化混合物Ｆig．１b−１g の成分は、シリカにおけるＨＰＬＣによって分離可能である。ペルヒドロキシド Ｆig．１b−１gの還元物は、別々にまたは混合物として、Ｆig．１h−１mに示す 。相当するアルキルまたはアリールハイポハライト （ＲＯＸ）を含有する種々 の薬剤で処理することによって、アルコールＦig．１h−１mおよびペルヒドロキ シドＦig．１b−１gと同様の置換パターンを有する相当するペルオキシドＦig． １n（Ｒ−アルキルまたはアリール）に変換可能である。アルコールＦig．１h− １mまたはペル オキシドＦig．１nのいずれかの混合物はまた、ＨＰＬＣで分離可能である。 類似の方法で、他の天然不飽和脂肪酸（たとえば２２：６（n−３））およ び修飾脂肪酸、たとえばＦig．１o−１ｘ（Ｙ＝Ｈ）および、アラキドン酸以外 の酸のエラボレーションによって調製された関連化合物が、ヒドロペルオキシ、 ヒドロキシ、およびペルオキシ誘導体、Ｆig．１o−１ｘ（Ｙ＝ＯＯＨ、ＯＨ、 ＯＯＲ）、図１b−１nの類似体を調製するのに使用可能であり、ここで、置換パ ターンはアリル酸化によって定められるものである。酸Ｆig．１oおよびＦig． １p（Ｙ＝Ｈ）は、Ｆig．１aの相当するアルデヒドのアルドール縮合により調製 可能であり、Ｆig．１pはまた、同様のアルデヒドまたは相当するハライドのウ イティッヒ反応を経由して調製可能であり、一方、Ｆig．１qは、相当するＣ１ ９のアルデヒドまたはハライドのウイティッヒ反応を経由して調製可能である。 酸Ｆig．１rは、Ｆig．１aの相当するエステルのアルドール縮合によって調製可 能であり、一方、Ｆig．１s−Ｆig．１xは、金属触媒カップリング反応または求 核置換を通してエーテルまたはチオエーテル合成によって得られ、チオエーテル Ｆig．１v−Ｆig．１xは、相当するスルホキシドおよびスルホンに酸化可能であ る。アミノ酸誘導体Ｆig．１yおよびＦig．１zは、相当する脂肪酸（Ｆig．１a ）およびグリシンおよびアスパラギン酸をそれぞれカップリングさせることによ って得られる。 ヒドロキシβ−オキサ脂肪酸の合成 試薬 β−オキサ脂肪酸（１，３）−ジアゾアセタートエステルと酢酸ロジウム触 媒カップリングによって相当する脂肪アルコールから合成 トリフェニルホスフィン−Ａldrich Ｃhemical Ｃompany オルソリン酸二水素カリウム−Ａjax Ｃhemicals ダイズ１５−リポキシゲナーゼ−Ａldrich Ｃhemical Ｃompany 全ての溶媒は使用前に蒸留した。 石膏含有のメルクシリカゲル６０ＰＦ₂₅₄，Ａrt．７７４９を用いて、ＰＬ Ｃを行った。 方法 ヒドロキシβ−オキサ脂肪酸（２）および（４） 相当する脂肪酸（１）および（３）（約５０mg）を３０℃でリン酸緩衝液（ ０．１Ｍ、pＨ＝９．０、約４５ml）に溶解した。リン酸緩衝液（約５ml）中の ダイズ１５−リポキシゲナーゼ（約８mg）を添加し、該溶液を撹拌しながら酸素 を１０分間、吹き込んだ。トリフェニルホスフィン（約５０mg）をジクロロメタ ン（約５０ml）に添加し、次いで塩酸（０．２Ｍ、約２０ml）を添加して、該溶 液を０℃で２０分間撹拌した。粗反応混合物をジクロロメタンで抽出し、抽出物 を乾燥窒素気流下で濃縮し、残さをシリカのＰＬＣで、酢酸エチル／ヘキサン／ 酢酸（８０：２０：０．１）で溶出して精製したところ、相当するヒドロキシβ −オキサ脂肪酸（２）および（４）がオイルとして得られた。 Ｚ，Ｚ，Ｅ−（１３−ヒドロキシ−６，９，１１−オクタデカトリエニルオキ シ）酢酸（２） 「１６’−ＯＨ−β−オキサ２１：３（n−６）］ Ｚ，Ｅ，Ｚ−（１３−ヒドロキシ−９，１１，１５−オクタデカトリエニルオ キシ）酢酸（４） ［１６’−ＯＨ−β−オキサ２１：３（n−６）］ アシル−ＣoＡ−オキシダーゼの作用に対する新規脂肪酸の効果 脂肪酸のβ−酸化 β−酸化は、脂肪酸（１）を主に酸化代謝し、該方法は、アセチル−コエン ザイムＡ（４）を当モル量、付随生成して、２つの炭素原子の脂肪酸炭素鎖の分 解によって特徴づけられる（反応式１）。 アシル−ＣoＡ−オキシダーゼ β−酸化の第１段階は、アシル−ＣoＡ-オキシダーゼにより制御される。ペ ルオキシソームにおいて、アシル−ＣoＡ−オキシダーゼは、エノイル−コエン ザイムＡチオエステルを製造するため、酸素とアシル−コエンザイムＡチオエス テルの反応を触媒する。ペルオキシダーゼ酵素の存在下、付随生成した過酸化水 素は、酸化されたアシル−コエンザイムＡチオエステルの各モルあたり１モルの 水を生成して、酸素に戻って循環する。 新規脂肪酸 β位に保護基を有する脂肪酸は、β−酸化の通常のコースに不活性であると して知られている。β位にヘテロ原子を有する新規な脂肪酸は、合成されている 。現在の研究において使用されている化合物は、アラキドニルオキシ酢酸［β− オキサ２３：４（n−６）］、ガンマリノレニルオキシ酢酸［β−オキサ２１： ３（n−６）］、リノレニルオキシ酢酸［β−オキサ２１：３（n−３）］、およ びアラキドニルチオ酢酸［β−チア２３：４（n−６）］であった。アラキドニ ルチオプロピオン酸［γ−チア２２：４（n−６）］もまた、β−酸化の際、脂 肪酸のγ位において保護基の効果を評価するために研究された。 アシル−Ｃｏ−Ａオキシダーゼアッセイ アルトロバクター属からのアシル−ＣｏＡオキシダーゼは、“Ｂoehringer Ｍannheim”社から安定化錠剤で入手可能であり、通常、シーラムまたはプラス マにおいてフリー酸の測定用としてアシル−ＣｏＡシンセターゼとともに用いら れる。 アッセイ原理 フリーの脂肪酸を、酵素アシル−ＣｏＡシンセターゼ（アシル−ＣＳ）の存 在下、アデノシン−５’−トリホスファート（ＡＴＰ）およびコエンザイムＡ（ ＣｏＡ）によってアシル−コエンザイムＡ（アシル−ＣｏＡ）に変換し、アデ ノシン−５’−モノホスファート（ＡＭＰ）およびピロホスファートが得られる 。 アシル−ＣｏＡは、アシル−ＣｏＡ−オキシダーゼ（ＡＣＯＤ）の存在下、 酸素と反応して、過酸化水素の発生を伴って、２，３−エノイルーコエンザイム Ａ（エノイル−ＣｏＡ）を形成する。 発生した過酸化水素は４−アミノアンチピリン（４−ＡＡ）及び２，４，６ −トリブロモ−３−ヒドロキシ安息香酸（ＴＢＨＢ）をペルオキシダーゼ（ＰＯ Ｄ）の存在下、赤色染料に変える。該染料は、５４６ｎｍで可視領域において測 定される。 アッセイ法 波長：５４６ｎｍ ミクロキュベット：１ｃｍライトパス 温度：２５℃（±１℃） アッセイ容量：１．１５ｍｌ 空気に対する反応混合物の測定 キュベットへのピペット： １．００ｍｌ 反応混合物：ＫＨ₂ＰＯ₄（８７ミルモル／ｌ）、Ｍｇ²⁺（１ ．３ミルモル／ｌ）、ＡＴＰ（１．５ミルモル／ｌ）、ＣｏＡ（０．２６ミルモ ル／ｌ）、ＰＯＤ（２１．７ｋＵ／ｌ）、アシルＣＳ（１６５Ｕ／ｌ）。 ０．０５ｍｌ フリー脂肪酸のサンプル溶液 ［ブランクとして、０．０５ｍｌの蒸留水で置換］ サンプルを混合して２５℃で約１０分間テンペラート（temperateted）した 。 この後、０．０５ｍｌのＮ−エチルマレインアミド溶液（０．８６ミリモル ／ｌ）を添加する。 溶液の吸光度（Ａｌ）を５４６ｎｍで測定し、次いで０．０５ｍｌのＡＣＯ Ｄ溶液（８．７ｋＵ／ｌ）を添加した。 反応混合物へのＡＣＯＤ添加のｔ＝１０秒後、５４６ｎｍでの溶液の可視吸 光度を２０分間測定した。 アッセイキャリブレーション／オーセニカーション サンプル濃度依存性 アラキドン酸（２０：４（ｎ−６）、１０）を以下の濃度でアッセイした。 ４．３ｍＭ、２．１ｍＭ、０．９９ｍＭ、０．４９ｍＭ、０．２５ｍＭ、お よび０ｍＭ（ブランク）。 Ｆig．１は、脂肪酸の濃度に対する速度（rate）依存性を示す。 酵素（ＡＣＯＤ）濃度依存性 ０．９９ｍＭの濃度のアラキドン酸（２０：４（ｎ−６）、１０）サンプル 溶液を、以下の濃度のアシル−ＣｏＡオキシダーゼを用いてアッセイした。 ２００ｋＵ／１、１００ｋＵ／ｌ、および５０ｋＵ／ｌ。 Ｆig．２は、酵素（ＡＣＯＤ）の濃度に対する速度（rate）依存性を示す。 新規脂肪酸のアッセイ １．０ｍＭ、１．０ｍＭ、１．０ｍＭ、１．０ｍＭ、および１．１ｍＭの濃 度の新規化合物の溶液を各々、１００ｋＵ／ｌの濃度のアシル−ＣｏＡオキシダ ーゼを用いてアッセイした。 Ｆig．３−６に示すように、β−オキサ化合物およびβ−チア化合物はそれ ぞれ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ用基質ではない（Ｆig．１１Ａ）ことがわか る。 アシル−ＣｏＡオキシダーゼによるアラキドン酸代謝における新規化合物の効 果 各新規化合物とアラキドン酸（１０）を当モル含有するサンプル溶液を、１ ００ｋＵ／ｌの濃度のアシル−ＣｏＡオキシダーゼを用いてアッセイした。 アッセイの結果から、新規化合物は、アシル−ＣｏＡオキシダーゼによるア ラキドン酸の取り込みに効果を示さないことがわかった。 さらに、新規化合物およびアラキドン酸（１０）を４：１及び１６：１の相 対濃度で含有するサンプルをアッセイしたところ、アシル−ＣｏＡオキシダーゼ によるアラキドン酸の取り込みに顕著な効果を示さないことがわかった。 アミノ酸への脂肪酸の共有結合 ポリ不飽和脂肪酸（１．８０ミリモル）、ＨＯＳｕ（０．４１ｇ、３．６０ ミリモル）、およびアミノ酸ｔ−ブチルエステル（３．６０ミリモル（をジメチ ルホルムアミド（３ｍＬ）に溶解し、該混合物を氷浴で冷却した。Ｎ−メチルモ ルホリン（０．７３ｇ、７．２０ミリモル）およびＤＭＦ中（０．３ｍＬ）のジ シクロヘキシルカルボジイミド（０．４４ｇ、２．１６ミリモル）を添加した。 該混合物を２０時間撹拌したが、この時点で、未反応のポリ不飽和脂肪酸が残存 していた。さらにＤＣＣ（０．１０ｇ）を添加してさらに２０時間撹拌した。Ｄ ＣＵを濾過して、生成物を逆相ＨＰＬＣで単離した。精製した生成物を濃縮して オイルとし、トリフルオロ酢酸（３０ｍＬ）を添加した。１時間撹拌後、トリフ ルオロ酢酸を除去すると、茶色のオイルが得られ、これをＣＨ₃ＣＮ（６ｍＬ） に再溶解し、逆相ＨＰＬＣで単離した。得られた純粋なフラクションを集め、濃 縮して、凍結乾燥（ｔ−ブタノール中）すると、生成物が茶色のオイルとして得 られた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｃ 51/367 Ｃ０７Ｃ 51/367 235/12 235/12 323/52 323/52 409/04 409/04 409/16 409/16 409/40 409/40 409/42 409/42 // Ｃ０７Ｂ 61/00 ３００ Ｃ０７Ｂ 61/00 ３００ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ， ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 フェランテ， アントニオ オーストラリア国 サウス オーストラリ ア 5064 マウント オズモンド グレニ ーグルズ ロード 59 (72)発明者 ポウロス， アルフレッド オーストラリア国 サウス オーストラリ ア 5068 ケンジントン ガーデンズ ブ リガロー アヴェニュー 11 (72)発明者 イーストン， クリストファー ジョン オーストラリア国 オーストラリアン キ ャピタル テリトリー 2614 ウィータン ゲラ シュマック ストリート 40 (72)発明者 ピット， マイケル ジョゼフ オーストラリア国 オーストラリアン キ ャピタル テリトリー 2605 ギャラン ライト プレイス ５ (72)発明者 ロバートソン， トーマス アリステア オーストラリア国 オーストラリアン キ ャピタル テリトリー 2614 アランダ ジダバル ストリート 11 (72)発明者 ラスジェン， デボラー アン オーストラリア国 サウス オーストラリ ア 5158 シェイドー パーク ノリス コート ２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 抗マラリアおよび／または好中球刺激活性を有するポリ不飽和脂肪 酸化合物であって、βオキサ、γオキサ、βチア、およびγチアからなる群から 選択された１または２の置換基を有し、１８−２５の炭素数および１−６の二重 結合を有する、ポリ不飽和脂肪酸化合物。 ２． アミノ酸に結合し、ヒドロキシ、ヒドロペルオキシ、ペルオキシ、 カルボキシメチル置換基からなる群から選択されたさらなる置換基を含有する、 請求項１に記載のポリ不飽和脂肪酸化合物。 ３． ２０−２５の炭素数および３−６の二重結合を有する、請求項１ま たは２に記載のポリ不飽和脂肪酸化合物。 ４． ｎ−３からｎ−６脂肪酸である、請求項１ないし３のいずれか１項 に記載のポリ不飽和脂肪酸化合物。 ５． βオキサまたはβチア置換基を含有する３−４の二重結合を有し、 ２１の炭素数を有する、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリ不飽和脂 肪酸化合物。 ６． βオキサまたはγチア置換基を含有する３−４の二重結合を有し、 ２２の炭素数を有する、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリ不飽和脂 肪酸化合物。 ７． βチア置換基を含有する３−４の二重結合を有し、２３の炭素数を 有する、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリ不飽和脂肪酸化合物。 ８． γチア置換基を含有する３−４の二重結合を有し、２４の炭素数を 有する、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリ不飽和脂肪酸化合物。 ９． βオキサ置換基を含有する３−６の二重結合を有し、２５の炭素数 を有する、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリ不飽和脂肪酸化合物。 １０． βチア置換基を含有する３−６の二重結合を有し、２５の炭素数 を有する、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリ不飽和脂肪酸化合物。 １１． ωヒドロキシ置換基を有する、請求項１ないし１０のいずれか１ 項に記載のポリ不飽和脂肪酸化合物。 １２． α−カルボキシメチル基、βチア置換基、３−６の二重結合、お よび２３の炭素数を有する、請求項１ないし４のいずれか１項に記載のポリ不飽 和脂肪酸化合物。 １３． カルボキシ末端を介してアミノ酸に共有結合する、請求項１ない し４のいずれか１項に記載のポリ不飽和脂肪酸化合物。 １４． アスパラギン酸またはグリシンに共有結合する、請求項１３に記 載のポリ不飽和脂肪酸化合物。 １５． アルコールのＯ−Ｈ結合にカルベンがインサートされるように、 カルベンと不飽和脂肪酸アルコールを反応させることを含有する、不飽和オキサ 置換脂肪酸の製造方法。 １６． 不飽和脂肪酸アルコールが、１−６の二重結合、および１８−２ ５の炭素数を有する、請求項１５に記載の方法。 １７． カルベンが、ジアゾ化合物の酢酸ロジウム触媒を介して合成され る、請求項１５または１６に記載の方法。 １８． 不飽和βオキサ置換脂肪酸が製造される、請求項１５ないし１７ のいずれか１項に記載の方法。 １８． 患者の炎症治療方法であって、１−６のシスまたはトランス二重 結合を有し、１８−２４の炭素数の炭素鎖を有するポリ不飽和脂肪酸のヒドロキ シ、ヒドロキシペルオキシ、またはペルオキシ誘導体を少なくとも１つ含有する 、抗炎症組成物を治療有効量、患者に投与することを含有する、炎症治療方法。 １９． ポリ不飽和脂肪酸が、オキサまたはチア誘導体として、炭素鎖内 に酸素またはイオウ原子を含有する、請求項１８に記載の方法。 ２０． ポリ不飽和脂肪酸が、Ｃ２０：４ｎ−６（５，８，１１，１４− エイコサテトラエン酸）、Ｃ２０：５ｎ−３（５，８，１１，１４，１７−エイ コサペンタエン酸）、Ｃ２２：６ｎ−３（４，７，１０，１３，１６，１９−エ イコサヘキサエン酸）、およびアラキドン酸からなる群から選択される、請求項 １８に記載の方法。