JPH02225411A - 高度不飽和脂肪酸の溶血性低下方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、医薬品製剤に関し、特に高度不飽和脂肪酸の
持つ溶血作用を酸性α−アミノ酸誘導体にすることによ
って低下させる方法に関するものである。

（従来の技術） 一般に、分子内に極性基（親水性基）とかなりの大きさ
の非極性基（疎水性基）を合わせ持つ化合物（両親媒性
化合物）は界面活性作用を有する。

生体内に存在する界面活性剤、すなわちバイオサーファ
クタントをその親木基から分類すると、（１）　　カル
ボキシル基を親木基とする脂肪酸系、（２１１ｍを親水
基とする糖脂質系、 （３）オリゴペプチドを親木基とするアシルペプチド系
、 （４）　　リン酸基を親水基とするリン脂質系、ｆ５１
　　Ｉ！、タンパク質、脂質が結合した高分子系の５種
になる。

これら物質を多量に赤血球に作用させると細胞膜を破壊
し、溶血を起こさせる。たとえば、マウスにオレイン酸
ナトリウムを静脈内投与した場合のＬ　Ｄ　ｓ。（５０
％致死量）は１５２■／　ｋｇとかなりの急性毒性値を
示している。また、脂質輸液剤の長期継続投与に見られ
る貧血などの副作用は、カルボキシル基を親水基とする
脂肪酸が遊離し、この界面活性作用によって溶血が起こ
り貧血になると考えられている。

一方、近年の食習慣の変化に伴い、リノール酸から合成
されるω−６系列高度不飽和脂肪酸の過剰摂取が問題と
なっている。このω−３系列／ω−６系列高度不飽和脂
肪酸のバランスの乱れが動脈硬化症、血栓性疾患、アレ
ルギーなどの一つの要因と考えられ、α−リルン酸、γ
−リルン酸、エイコサベンクエン酸およびドコサヘキサ
エン酸などの投与が検討されている。これら高度不飽和
脂肪酸の投与の主な方法は、これら脂肪酸を含有する油
脂や、これら脂肪酸を濃縮したエチルエステルのカプセ
ルの服用のみで、高度不飽和脂肪酸の持つ溶血作用を酸
性α−アミノ酸誘導体及びその塩にすることによって低
下させる試みはこれまでなされていない。

また浜崎らは、Ｌｉｐｉｄｓ、　２２．１０３１　（１
９８７）において、ドコサヘキサエン酸トリグリセリド
を合成してその溶血作用の研究をしている。

（発明が解決しようとする課題） 上記のように、親水性基と疎水性基を合わせ持つ両親媒
性化合物、特に高度不飽和脂肪酸は、界面活性作用があ
り、多量に血中に投与した場合、赤血球を溶血させるば
かりでなく、他の白血球、血小板、内皮細胞などに対し
ても悪影響を与える可能性がある。さらに、近年の食事
の欧米化に伴い、動脈硬化症、血栓性疾患、アレルギー
などの疾病が増加している。この要因として食事中のω
３系列／ω−６系列高度不飽和脂肪酸の比の低下が考え
られている。また、糖尿病患者のようにリノール酸をＴ
−リルン酸に代謝するΔ６−デサチュラーゼの活性が低
下している状態での必須脂肪酸供給源として、γ−リル
ン酸が注目を集めている。一方、これまでに検討されて
いる高度不飽和脂肪酸の投与形態は、α−リルン酸、Ｔ
リルン酸、エイコサベンクエン酸およびドコサヘキサエ
ン酸などを含む油脂、これらを濃縮したエチルエステル
および合成ドコサヘキサエン酸トリグリセリドなどであ
る。これらの物質はすべて脂溶性であり、これらを体内
に投与する場合、乳化させなければならず非常に操作が
煩雑である。

このようなことから、α−リルン酸、Ｔ−リルン酸、エ
イコサベンクエン酸およびドコサヘキサエン酸などの高
度不飽和脂肪酸を含有し、界面活性作用の低い化合物を
合成することによって、溶血などの副作用が少な（なり
、大量投与、長期投与も可能になると考えられる。

従って、本発明は高度不飽和脂肪酸の持つ溶血作用の低
下方法を提供することを目的とする。

（課題を解決するための手段） 本発明は、高度不飽和脂肪酸を酸性α−アミノ酸と縮合
させることを特徴とする高度不飽和脂肪酸の溶血性低下
方法である。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明において、高度不飽和脂肪酸を酸性α−アミノ酸
と縮合させると、脂肪酸に対応するＮ−アシル酸性α−
アミノ酸誘導体が得られる。

この発明に用いられるＮ−アシル酸性α−アミノ酸誘導
体の製造法は、例えば高度不飽和脂肪酸をオキザリルク
ロライドと反応させることによって、５℃〜−１５℃で
脂肪酸クロライドとし、次いで、この脂肪酸クロライド
と酸性α−アミノ酸またはその塩とを水酸化アルカリ等
の縮合剤の存在下に反応させる。

酸性α−アミノ酸としては、天然物または合成物のアス
パラギン酸、グルタミン酸およびこれらのナトリウム塩
とカリウム塩が挙げられる。高度不飽和脂肪酸としては
、α−リルン酸、エイコサベンクエン酸、ドコサヘキサ
エン酸のω−３系列高度不飽和脂肪酸およびリノール酸
、γ−リルン酸、アラキドン酸のω−６系列高度不飽和
脂肪酸が挙げられる。

これら酸性α−アミノ酸と高度不飽和脂肪酸との縮合に
よって得られるＮ−アシル酸性α−アミノ酸誘導体とし
ては次のものが例示される。

Ｎ−α−リルノイルーし一グルタミン酸、Ｎ−エイコサ
ペンタエノイル−し−グルタミン酸、Ｎ−ドコサヘキサ
エノイル−Ｌ−グルタミン酸、Ｎ−リルオイルーし一グ
ルタミン酸、 Ｎ−γ−リルノイルーし一グルタミン酸、Ｎ−アラキト
ノイル−し−グルタミン酸、Ｎ−α−リルノイルーし一
アスバルギン酸、Ｎ−呈イコサペンタエノイル−し一ア
スバルギン酸、Ｎ−ドコサヘキサエノイル−し−アスパ
ラギン酸、Ｎ−リルオイルーＬ−アスパルギン酸、Ｎ−
γ−リルノイルーし一アスバルギン酸、Ｎ−アラキトノ
イル−し−アスパラギン酸、があり、さらにこれら上記
の化合物のナトリウム塩とカリウム塩が挙げられる。

次に、溶血性試験の方法について、その好適例を詳細に
説明する。ヒト血液をヘパリン処理した注射器で採取し
、遠心して血球成分と血漿を分離する。血球成分をリン
酸緩衝液ＣＰＢＳ）で再懸濁し、遠心した後、血球成分
の上層を少し取りながら、血球成分を洗浄する。この血
球成分を溶血試験用の赤血球とし、リン酸緩衝液に再懸
濁して一定濃度の赤血球懸濁液を調整する。

前記の高度不飽和脂肪酸、Ｎ−アシル酸性α−アミノ酸
誘導体を、それぞれ少量のエタノールに溶解した後、リ
ン酸緩衝液で一定の濃度に希釈する。リン酸緩衝液、赤
血球懸濁液および上記のように希釈したサンプルを加え
て、撹拌後、保温する。遠心して得られた上清について
、そのヘモグロビンの吸光度（５４０ｎｍ）を分光光度
計で測定する。

この方法は非常に筒便であり、溶血性試験に適している
。

以上の実験系を用いて、高度不飽和脂肪酸、これらの酸
性α−アミノ酸誘導体およびその塩の赤血球の溶血に対
する影響を調べたところ、高度不飽和脂肪酸の酸性α−
アミノ酸誘導体では赤血球の溶血活性が著しく低下して
いた。さらに好ましい投与形体として、高度不飽和脂肪
酸の酸性α−アミノ酸誘導体の塩では溶血活性の低下が
さらに著しかった。

（発明の効果） 本発明は高度不飽和脂肪酸の持つ溶血作用をＮ−アシル
酸性α−アミノ酸誘導体及びその塩にすることによって
低下させる効果がある。

このように、Ｎ−アシル酸性α−アミノ酸誘導体は赤血
球の溶血作用が低いので生理活性があると考えられてい
る高度不飽和脂肪酸を静脈内に多量投与さらに長期投与
もできるようになる。

Ｎ−アシル基に生理活性の強いα−リルン酸、エイコサ
ペンタエン酸やドコサヘキサエン酸などのω−３系列高
度不飽和脂肪酸を含有しているので近年増加しつつある
動脈硬化症、血栓性疾患およびアレルギーなどに有効で
あり、その治療に利用できる。また、必須脂肪酸欠乏状
態における脂肪栄養物質の補給としてリノール酸、Ｔ−
リルン酸などのω−６系列高度不飽和脂肪酸の酸性α−
アミノ酸誘導体を利用できる。さらに、糖尿病患者のよ
うにリノール酸をＴ−リルン酸に代謝するΔ６−デサチ
ュラーゼ活性が低下している状態での必須脂肪酸の補給
源としてもＴ−リルン酸の酸性α−アミノ酸誘導体を利
用することができる。

また、これに用いる高度不飽和脂肪酸の酸性αアミノ酸
誘導体は水溶性であるため、経口、経腸あるいは静注な
どの方法で投与することができ、従来、脂溶性であるた
めに投与方法に制限があった分野にも利用することがで
きる。さらに、Ｎ−アシル化酸性α−アミノ酸誘導体は
、生体内に存在する脂肪酸とアミノ酸から構成されてお
り、生体中に広く分布するベブチターゼによって代謝さ
れても副作用がなくきわめて安全である。

（実施例） 以下の実施例に使用したエイコサペンタエン酸およびド
コサヘキサエン酸は、精製魚油を加水分解して得た脂肪
酸を尿素付加処理して高度不飽和脂肪酸を分別した後、
逆相クロマトグラフィーで精密分取して得たものである
。

実施例１ Ｎ−ドコサヘキサエノイル−し−グルタミン酸を以下の
方法で合成した。

ドコサヘキサエン酸８０ｇをヘキサン４８０　＋ｄに溶
解し、オキザリルクロライド４５ｇを窒素気流下、撹拌
しながら滴下ロートを用いて一１０’ＣでＬｔｋｆｆｉ
ずつ滴下し、滴下終了後、０℃で一晩撹拌を続けた。

未反応物と溶媒を減圧除去し、７０ｇの黄褐色液状ドコ
サヘキサエノイルフロラロイドを得た。

窒素雰囲気下で、Ｌ−グルタミン酸３０ｇを６０％含水
アセトン中に溶解した。その溶液に撹拌下、水酸化すｌ
・リウム１６ｇを加えて水冷（２〜５℃）下で反応液が
透明な二層になるまで反応を行い、Ｌ−グルタミン酸ジ
ナトリウム塩溶液とした。

次に、このＬ−グルタミン酸ジナトリウム塩溶液に、３
０％水酸化ナトリウム水溶液４０−と上記ドコサヘキサ
エノイルクロライド７０ｇを各々滴下ロートを通して同
時に約４０分かけて滴下した。さらに水冷下で２時間攪
拌すると白濁し一部結晶が析出した。次いで５０〜６０
℃で１時間加熱還流し、反応物に水３００−を加えて、
６規定塩酸４０−でｐｌｌｌに調整した。Ｎ−ドコサヘ
キサエノイル−し−グルタミン酸を含む反応液中の透明
なアセトン層を分取し、溶媒を留去してから、この残留
物を少量のエタノールに溶解し、無水硫酸ナトリウムに
通してから不溶物を濾別して、Ｎ−ドコサヘキサエノイ
ル−し−グルタミン酸を得た。

実施例２ Ｎ−アラキトノイル−し−アスパルギン酸を以下の方法
で合成した。

アラキドン酸９０ｇをヘキサン４８０−に）容解し、オ
キサリルクロライド５０ｇを窒素気流下、攪拌しながら
滴下ロートを用いて一１０℃で微量ずつ滴下し、滴下終
了後、０℃で一晩攪拌を続けた。未反応物と溶媒を減圧
除去し、６８ｇの黄褐色液状アラキトノイルクロライド
を得た。

窒素雰囲気下で、Ｌ−アスパルギン酸３０ｇを６０％含
水アセトン中に溶解した。その溶液に攪拌下、水酸化ナ
トリウム１６ｇを加えて氷冷（２〜５℃）下で反応液が
透明な二層になるまで反応を行い、Ｌ−アスバルギン酸
ジナトリウム塩溶液とした。

次に、このＬ−アスバルギン酸ジナトリウム塩溶液に、
３０％水酸化ナトリ゛ウム水溶液４Ｍと上記アラキトノ
イルクロライド７０ｇを各々滴下！コートを通して同時
に約４０分かけて滴下した。さらに水冷下で２時間攪拌
すると、白濁し、一部結晶が析出した。次いで５０〜６
０℃で１時間加熱還流し、反応物に水３００−を加えて
、６規定塩酸４ＱｍｌでｐＨ１に１周整した。Ｎ−アラ
キトノイル−し−アスバルギン酸を含む反応液中の透明
なアセトン層を分取し、溶媒を留去してから、この残留
物を少量のエタノールに溶解し、無水硫酸ナトリウムに
通してから不溶物を濾別して、Ｎ−アラキトノイル−し
−アスパルギン酸を得た。

実施例３ Ｎ−エイコサペンタエノイル−し−グルタミン酸ジナト
リウムを以下の方法で合成した。

エイコサベンクエン酸８０ｇをヘキサン４８０−に溶解
し、オキザリルクロライド４８ｇを窒素雰囲気下、撹拌
しながら滴下ロートを用いて一１０℃で微量ずつ滴下し
、滴下終了後、０℃で一晩攪拌を続けた。未反応物と溶
媒を減圧除去し、７２ｇの黄褐色液状エイコサペンタエ
ン酸クロライドを得た。

窒素雰囲気下で、Ｌ−グルタミン酸３０ｇを６０％含水
アセトン中に溶解した。その溶液に攪拌下、水酸化ナト
リウム１６ｇを加えて、水冷（２〜５℃）下で反応液が
透明な二層になるまで反応を行い、Ｌ−グルタミン酸ジ
ナトリウム塩溶液とした。

次に、このＬ−グルタミン酸ジナトリウム塩溶液に、３
０％水酸化ナトリウム水溶液４０−と上記エイコサペン
タエノイルクロライド７２ｇを、各々滴下ロートを通し
て同時に約４０分かけて滴下した。

さらに水冷下で２時間攪拌すると白濁し、一部結晶が析
出した。次いで５０〜６０℃で１時間加熱還流し、反応
物に水３００ｍ／を加えて、６規定塩酸４０ｍ１でｐ）
ＩＩに言周整した。Ｎ−エイコサペンタエノイル−Ｌ−
グルタミン酸を含む反応液中の透明なアセトン層を分取
し、溶媒を留去してから、この残留物を少量のエタノー
ルに溶解し、無水硫酸ナトリウムに通してから不溶物を
濾別して、Ｎ−エイコザベンタエノイルーＬ−グルタミ
ン酸を得た。このＮ−エイコサペンタエノイル−し−グ
ルタミン酸をさらに大量のエタノールに希釈し、１０％
水酸化ナトリウム溶液でｐＨｌｌに調整し、沈澱が生じ
たことを確認してから、エタノールを留去して、Ｎ−エ
イコサペンタエノイル−し一グルタミン酸ジナトリウム
の白色の粉末状結晶８１ｇを得た。

比較例 Ｎ−１’コサヘキサエノイル−Ｔ−アミノ酪酸を以下の
方法で合成した。

１００−のナスフラスコに、ドコサヘキサエン酸３．２
８ｇ　（０，０１モル）および無水クロロホルム５０ｍ
１を入れ、溶解後、水冷下にジクロロへキシルカルボジ
イミド２．２７　ｇ　（０，０１１モル）を加え、２時
間攪拌した。生成したジシクロへキシルウレアを濾過し
、濾液を１００Ｉｎ！ナスフラスコに入れ、減圧濃縮し
た。生成したドコサヘキザエノイルイミダゾールへ無水
テラヒドロフラン５０−を加え粉砕して、減圧乾燥させ
たγ−アミノ酪酸１．．０３ｇ　（０，０１モル）およ
びイミダゾール０．７５　ｇ　（０，０１１モル）を加
え、室温で一晩攪拌した。

反応終了後、溶媒を減圧蒸留し、残留物をクロロホルム
−メタノール（５：１）に？容かした。この溶液を分液
ロートに移し、ＩＮ塩酸で２回、飽和食塩水で１回、水
で１回洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後
、溶媒を減圧留去した。

残留物に３０−のｎ−ヘギサンを加え、激しく攪拌した
後、静置して上層のｎ−へキサンを除いた。

下層の油状物を４０ｇのシリカゲルを用い、カラムクロ
マ］・グラフィー（カラム：　　２．５ＸＩ５ｃｍ、ン
容媒；クロロホルム：メタノール：酢酸＝１００：５：
１（容積比））で精製し、純粋なＮ−ドコサヘキサエノ
イル−Ｔ−アミノ酪酸を黄色油状物として得た。

収ｆ３１ｔ３．６７　ｇ。

実施例４ 次に、溶血性試験を行った。

ヒト血液をヘパリン処理した注射器で採取し、２．５０
０ｒｐｍで５分間遠心して血球成分と血漿を分離した。

血球成分をリン酸緩衝液ｐＨ７，４（Ｐ　Ｂ　Ｓ）で再
懸濁し、２．５０Ｏｒｐｍで１０分間遠心した後、血球
成分の上層を少し取りながら、血球成分を３回洗浄した
。この血球成分を溶血試験用の赤血球とし、リン酸緩衝
液に再懸濁して１％（Ｖ／Ｖ）赤血球懸濁液を調製した
。

本発明としてＮ−ドコサヘキサエノイル−Ｌ　−グルタ
ミン酸、Ｎ−エイコサペンタエノイル−Ｌグルタミン酸
、Ｎ−エイコサペンタエノイル−し−グルタミン酸ジナ
トリウム、およびＮ−ドコサヘキサエノイル−し−アス
バルギン酸を各用い、比較例としてアラキドン酸、エイ
コサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸およびＮ−ドコ
サヘキサエノイル−Ｔ−アミノ酪酸を各用い、各々少量
のエタノールに溶解した後、リン酸緩衝液で１０硝／−
から１，３５０ｘ／ＩＲ１の濃度に希釈した。リン酸緩
衝液３−１１％赤血球懸濁液１１１１１および上記のよ
うに希釈したサンプルｌｄを加えて攪拌後、３７℃で２
０分間保温した。２．５０Ｏｒｐｍで５分間遠心した後
、上清の吸光度（５４０ｎｍ）を分光光度計で測定した
（Ａ）。

サンプルの代わりに１−のリン酸緩衝液を加えたものを
ブランク　（Ｂ）とし、３１ｎ１のリン酸緩衝液の代わ
りに蒸留水３−を加えたものを１００χ溶血（Ｃ）とし
た。溶血率は次の式で算出した。

溶血作用が一層低いことが明らかとなった。

また、脳における神経伝達物質として知られ、さらにア
ミノ酸に構造が類似しているγ−アミノ酪酸を含むＮ−
ドコサヘキサエノイル−Ｔ−アミノ酪酸では、溶血活性
の低下はまったく見られなかった。

試験結果 第１表のごとく、Ｎ−アラキトノイル−し−アスバルギ
ン酸およびＮ−ドコサヘキサエノイル−し−グルタミン
酸は、遊離脂肪酸であるドコサヘキサエン酸およびエイ
コサベンクエン酸と比較して、高濃度でも溶血活性が著
しく低下した。さらに、ナトリウム塩であるＮ−エイコ
サペンタエノイル−し−グルタミン酸ジナトリウムでは
、よりいっそうの溶血活性の低下が見られた。よって、
高度不飽和脂肪酸の酸性α−アミノ酸誘導体は赤血球瀉
血作用が弱く、さらに、これらの塩の形がＡＡ　−ａｓ
ｐ：　Ｎ−アラキトノイル−し−アスパラギン酸 ＤＨＡ−ｇｌｕ：　Ｎ−ドコサヘキサエノイル−Ｌ−グ
ルタミン酸 ＥＰＡ−ｇｌｕ：Ｎ−エイコサペンタエノイル−Ｌグル
タミン酸 ＥＰ八・ｇｌｕ・２Ｎａ：Ｎ−エイコサペンタエノイル
−し−グルタミン酸ジナトリウム ＡＡ：アラキドン酸 ＥＰＡ　：エイコサペンクエン酸 ＤＨ＾ニドコサへキサエン酸 ＤＨ八・ＧＡＢＩＮ−ドコサヘキサエノイル−Ｔ−アミ
ノ酪酸

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 高度不飽和脂肪酸を酸性α−アミノ酸と縮合させること
   を特徴とする高度不飽和脂肪酸の溶血性低下方法。