ES2132069T5 - Cuantificacion de acidos nucleicos utilizando la reaccion en cadena de la polimerasa. - Google Patents
Cuantificacion de acidos nucleicos utilizando la reaccion en cadena de la polimerasa. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2132069T5 ES2132069T5 ES90913621T ES90913621T ES2132069T5 ES 2132069 T5 ES2132069 T5 ES 2132069T5 ES 90913621 T ES90913621 T ES 90913621T ES 90913621 T ES90913621 T ES 90913621T ES 2132069 T5 ES2132069 T5 ES 2132069T5
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- nucleic acid
- segment
- internal standard
- target nucleic
- target
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
- C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
LA PRESENTE INVENCION PRESENTA UN METODO PARA DETERMINAR LA CANTIDAD DE UN SEGMENTO DE ACIDO DEL BLANCO EN UNA MUESTRA MEDIANTE LA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA. EL METODO CONSISTE EN LA AMPLIFICACION SIMULTANEA DEL SEGMENTO DE ACIDO NUCLEICO DEL BLANCO Y DE UN SEGMENTO DE ACIDO NUCLEICO ESTANDAR INTERNO. LA CANTIDAD DE ADN AMPLIFICADO DE CADA SEGMENTO SE DETERMINA Y COMPARA CON LAS CURVAS ESTANDAR PARA DETERMINAR LA CANTIDAD DEL SEGMENTO DE ACIDO NUCLEICO DEL BLANCO PRESENTE EN LA MUESTRA ANTES DE LA AMPLIFICACION. EL METODO ES ESPECIALMENTE PREFERENTE PARA DETERMINAR LA CANTIDAD DE UNA ESPECIE DE MARN ESPECIFICA EN UNA MUESTRA BIOLOGICA. ADICIONALMENTE, SE PRESENTA UN ESTANDAR INTERNO UTIL PARA LA CUANTIFICACION DE MULTIPLES ESPECIES DE MARN.
Description
Cuantificación de ácidos nucleicos utilizando la
reacción en cadena de la polimerasa.
La presente invención se refiere a la
determinación cuantitativa de un segmento particular de ácido
nucleico en una muestra. La invención es particularmente útil para
determinar la cantidad de moléculas de mRNA específicas en una
muestra biológica. El método es por tanto especialmente aplicable en
el campo del diagnóstico médico, pero puede aplicarse también en
los campos de la genética, biología molecular y bioquímica. La
invención se refiere también al uso de patrones internos en los
métodos de amplificación de ácidos nucleicos y a kits que contienen
éstos, así como a oligonucleótidos iniciadores que permiten su
co-amplificación junto con los segmentos de ácido
nucleico diana.
Las patentes U.S. Nos. 4,683,195 y 4,683,302
describen métodos para llevar a cabo la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR), un método de amplificación de ácidos nucleicos, y
para el uso de la PCR en la detección de secuencias nucleotídicas
específicas. La Publicación de la Oficina Europea de Patentes N.
258,017 describe la polimerasa de Taq, una polimerasa preferida para
el uso en PCR.
Los métodos de PCR tienen aplicaciones muy
extendidas en el diagnóstico de enfermedades genéticas (véase Wu
et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:
2757-2760 y Myerswitz, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 85: 3955-3959), así como en el diagnóstico de
la susceptibilidad a enfermedades y al cáncer (véase Horn et
al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6012-6016;
Todd et al., 1987, Nature, 329: 599-604;
Kawasaki, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
85:5698-5702; y Neri et al., 1988, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85:92 68-9272).
Sin embargo, estos usos han proporcionado
solamente resultados cualitativos a través de, por ejemplo, detectar
transcritos de mRNA específicos de células anormales en un fondo de
células normales.
Se ha publicado un intento de utilizar la PCR
para estudios cuantitativos de los niveles de mRNA de la timidilato
sintasa en tumores (véase Kashasi-Sabet, 1988,
Cancer Res., 48:5775-5778). Sin embargo, este
estudio proporciona solamente comparaciones relativas de cantidades
de mRNA en muestras biológicas. Ha sido mucho más difícil
cuantificar la cantidad absoluta de un mRNA específico sin un patrón
interno de concentración conocida. Se han descrito otros métodos
para cuantificar especies de ácidos nucleicos mediante el uso de la
PCR para co-amplificar un segundo cDNA molde no
relacionado (véase Chelly et al., 1988, Nature
333:855-860 y Rapopolee et al., 1988,
Science 241:708-712) El uso de un cDNA patrón no
relacionado precisa también del uso de un segundo conjunto de
oligonucleótidos iniciadores, no relacionados con el mRNA específico
diana.
Puesto que la amplificación es un proceso
exponencial, pequeñas diferencias en cualquiera de las variables
que controlan la velocidad de reacción, incluyendo la longitud y la
secuencia de nucleótidos del par de iniciadores, pueden conducir a
diferencias dramáticas en el rendimiento del producto de PCR. Por lo
tanto, los análisis que utilizan dos conjuntos de iniciadores no
relacionados, pueden proporcionar solamente una comparación relativa
de dos reacciones de amplificación independientes más que una
medida absoluta de la concentración de mRNA.
Gilliland et al. (J. Cellular
Biochemistry, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, Abril
3-21, 1989, Resumen WH001) describen aproximaciones
alternativas para la cuantificación del mRNA para evitar algunos de
los problemas asociados con moldes no relacionados como patrones de
amplificación. Sin embargo, las sugerencias de Gilliland et
al. tienen otras limitaciones inherentes. Una aproximación
requiere el mapeado de los intrones y exones genómicos para el gen
correspondiente a un mRNA diana específico. Gilliland et al.
también proponen una aproximación alternativa utilizando
mutagénesis dirigida para construir un patrón interno, lo que causa
la formación de heterodúplex tras la amplificación. Estos
heterodúplex tienen como resultado una sobreestimación de la
cantidad de la secuencia diana presente en la muestra original.
Smith et al. (Smith et al., 1989, J. Immunol. Meth.
118:265-272) han utilizado un ensayo de
transferencia en punto de RNA para evaluar cuantitativamente el
nivel de expresión de mRNAs de dos IL-1 en
macrófagos humanos. Smith et al. describieron que el nivel
de sensibilidad para el mRNA de la IL-1\alpha era
de aproximadamente 10^{7} moléculas por este método, y el mRNA de
la IL-1\alpha no se detectaba en macrófagos sin
inducir. La presente invención proporciona un método de
cuantificación que puede medir fácilmente 10^{4} moléculas y
detecta fácilmente el mRNA de la IL-1\alpha en
macrófagos tanto no inducidos como inducidos en una muestra de
ensayo. Este incremento de 1000 veces en sensibilidad representa un
importante avance en el análisis cuantitativo con fines clínicos y
de investigación.
Existe todavía una necesidad de un método para
cuantificar directamente, con precisión, y de forma reproducible la
cantidad de un segmento de ácido nucleico específico en una muestra.
La disponibilidad de la PCR cuantitativa proporcionará información
valiosa en varias áreas de investigación. Más en particular, la
invención proporciona información crítica en el diagnóstico de
enfermedades y la terapia del cáncer. Por ejemplo, un análisis
cuantitativo, fiable y sensible puede ser crítico para determinar
el grado de inducción de la síntesis de mRNA en respuesta a
estímulos exógenos. La presente invención supera las numerosas
limitaciones inherentes en los intentos de otros en este campo, y
proporciona así medios para cuantificar de forma precisa la cantidad
de un segmento de ácido nucleico en una muestra biológica.
Así, la presente invención se refiere a las
realizaciones caracterizadas en las reivindicaciones. Conforme a
ello la presente invención proporciona usos, kits y métodos para
cuantificar un segmento de ácido nucleico diana en una muestra.
La Figura 1 muestra las posiciones de los
iniciadores 5' y 3' de la Tabla I tal como están dispuestos en los
plásmidos AW108 y AW109. Se muestran otras características
relacionadas con la presente invención.
En la Figura 2A-C se determinó
la cantidad de mRNA de la IL-1\alpha presente en
macrófagos inducidos por lipopolisacárido (LPS) y sin inducir
utilizando el par de iniciadores de
IL-1\alpha.
La Figura 2A muestra un gel de acrilamida teñido
con bromuro de etidio en que son visibles los segmentos de DNA
patrón y diana amplificados.
En la Figura 2B se representan las cantidades de
DNA producto de PCR de IL-1\alpha patrón y diana
producidas frente a la concentración de molde.
La Figura 2C muestra una gráfica de las
cantidades de DNA producto de PCR de IL-1\alpha
patrón y diana producidas versus el número de ciclos de
amplificación.
La Figura 3 muestra los resultados de una
transferencia Northern que contiene muestras de cRNA de AW108, y RNA
aislado de macrófagos inducidos por LPS. La transferencia se hibridó
con el iniciador IL-1\alpha 3'.
La Figura 4 muestra la eficiencia de la
amplificación para diferentes conjuntos de iniciadores utilizando el
mismo cRNA molde en las mismas condiciones.
La presente invención proporciona un método para
determinar la cantidad absoluta de un segmento de ácido nucleico en
una muestra. El método implica la amplificación, mediante una
reacción en cadena de la polimerasa, de dos segmentos de ácido
nucleico diferentes combinados en una mezcla de reacción. Los dos
segmentos incluyen un segmento diana y un segmento patrón interno.
El patrón interno se amplifica utilizando el mismo par de
oligonucleótidos iniciadores que para el ácido nucleico diana; sin
embargo, los dos segmentos de ácido nucleico conducen a productos de
amplificación que son distinguibles por su tamaño.
El segmento patrón está presente en una cantidad
conocida. Tras la amplificación, se mide la cantidad de cada uno de
los dos productos de la reacción en cadena de la polimerasa, y se
cuantifica la cantidad de segmento diana presente en la muestra
original por extrapolación frente a una curva patrón. Además, el
patrón interno descrito aquí contiene secuencias iniciadoras para
múltiples genes, de manera que puede utilizarse el mismo patrón para
cuantificar varios segmentos de ácido nucleico de interés.
La presente invención es de particular utilidad
para proporcionar un método rápido, sensible y fiable para
determinar de forma precisa la cantidad de un mRNA específico de
baja abundancia presente en una muestra que contenga menos de 0,1
ng de RNA total. El método proporciona una aproximación
suficientemente potente como para permitir una medida de la
heterogeneidad en los niveles de expresión de mRNAs específicos
dentro de determinadas subpoblaciones, incluso al nivel de células
individuales.
Mediante la co-amplificación del
ácido nucleico diana y el ácido nucleico patrón interno, se
controlan internamente los efectos variables que afectan de forma
igual al rendimiento del producto de PCR de los ácidos nucleicos
patrón y diana. Numerosas variables influyen en la velocidad de la
reacción de PCR. Estas variables pueden incluir las concentraciones
de polimerasa, dNTPs, MgCl_{2}, moldes de ácido nucleico, e
iniciadores, así como la velocidad de formación de "dímeros de
iniciadores" y las variaciones de tubo a tubo.
La cantidad de segmento de ácido nucleico diana
presente en la muestra antes de la amplificación se determina
utilizando una curva patrón. La curva patrón se genera representando
la cantidad del segmento patrón producido en la reacción en cadena
de la polimerasa frente a cantidades variables, pero conocidas, de
RNA presente antes de la amplificación. Para mayor precisión, la
cantidad de segmento patrón presente antes de la amplificación se
varía por dilución sucesiva de la mezcla de reacción de
coamplificación. La cantidad de segmento diana producido en la
reacción en cadena de la polimerasa se compara entonces con la curva
patrón para determinar la cantidad del segmento diana presente en
la muestra antes de la amplificación. Alternativamente, la curva
patrón puede generarse representando las cantidades de los segmentos
diana y patrón producidos frente al número de ciclos de
amplificación. Para asegurar la precisión, se prefiere que el número
de ciclos de amplificación se varíe tomando alícuotas de una mezcla
de reacción de co-amplificación después de haberse
completado diferente número de ciclos de amplificación.
El método de la invención es muy superior a la
determinación de la cantidad de un segmento de ácido nucleico en
una muestra en forma de cantidad relativa, en lugar de absoluta.
Además, el método es mucho más preciso que cuando se determina una
cantidad absoluta empleando un segundo conjunto de oligonucleótidos
iniciadores para amplificar el patrón, en que este conjunto de
iniciadores es diferente al conjunto utilizado para amplificar el
segmento diana.
El método de la presente invención es útil para
cuantificar una molécula de RNA o DNA diana. Para determinar la
cantidad de DNA presente en una muestra, pueden aplicarse
directamente los métodos de amplificación que se describen aquí.
Tal como demostrarán los ejemplos descritos a continuación, la
presente invención es también útil para determinar la cantidad de
un mRNA específico en una muestra de RNA total. El segmento de ácido
nucleico patrón interno es proporcionado en un DNA plasmídico. La
presencia de un promotor de la polimerasa de T7 u otro promotor
adecuado, tal como el promotor SP6, situado apropiadamente permite
que el plásmido sea utilizado como molde para la síntesis de cRNA.
Tal como se define aquí a efectos de la presente invención, el
término "cRNA" se refiere a un segmento de ácido ribonucleico
sintetizado a partir de un DNA molde por una RNA polimerasa.
Además, el plásmido puede contener una secuencia de poliadenilación
en el extremo 3' para facilitar la purificación y subsiguiente
cuantificación del cRNA sintetizado in vitro. Tal como se
describe en las realizaciones preferidas, el DNA molde es el
plásmido AW108 o bien AW109, y la RNA polimerasa es la polimerasa de
T7. En una realización, el cRNA de AW108 se sintetiza en forma de
una hebra con sentido a partir de pAW108 mediante la polimerasa de
T7. La estructura de pAW108 se muestra en la Figura 1. El conjunto
de iniciadores que se muestra en la Figura 1 es idéntico para
pAW108 y pAW109. La molécula de cRNA sirve entonces como el molde
patrón interno para la transcripción inversa por la DNA polimerasa,
transcriptasa inversa. La transcriptasa inversa genera un
transcrito de cDNA a partir de un molde de RNA. La realización
preferida de la invención, el patrón interno de cRNA, se sintetiza
como una hebra con sentido. A continuación de la transcripción
inversa del mRNA diana y el cRNA patrón, se realiza el PCR.
Como resultará obvio a los expertos en la
materia, se conocen diversos métodos para construir plásmidos útiles
en el método de la presente invención. Higuchi, 1988, Nucleic Acids
Research 16:7351-7367 y Ho, 1989, Gene
77:51-59 describen dos métodos para construir nuevos
plásmidos que incorporen las secuencias de DNA sintéticas deseadas.
De modo alternativo, los segmentos de DNA sintéticos pueden
insertarse vía digestión con enzimas de restricción y ligación con
un vector precursor de tipo plásmido o fago, tratado de forma
apropiada. El patrón interno de la realización preferente, pAW108,
contiene múltiples conjuntos de iniciadores que permiten que un
único cRNA patrón pueda utilizarse para cuantificar varios mRNAs
diferentes. La presencia de dianas de restricción únicas en el
plásmido pAW108 proporciona la flexibilidad para añadir nuevos
conjuntos de iniciadores al plásmido. La diana BamHI única se
utiliza para linealizar el plásmido para producir un molde lineal
para la transcripción inversa. Un depósito de E. coli
conteniendo el plásmido AW108 se ha depositado en la Colección
Americana de Cultivos Tipo (ATCC) en 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland de acuerdo con los términos del Tratado de
Budapest, con el número de acceso 68094. Se ha depositado también un
depósito de E. coli conteniendo el plásmido AW109 en la
Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) en 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland de acuerdo con los términos del Tratado de
Budapest, con el número de acceso 68152.
El plásmido AW108 se obtiene a partir de pcDV1 y
pL1 que se describen en Okayama y Berg, 1983, Mol. Cell. Biol.
3:280-289. La región promotora de SV40 de pL1 se
insertó en pcDV1 en la forma indicada en el artículo citado. El
promotor de T7, las secuencias oligonucleotídicas sintéticas, y una
región de poliadenilación del gen IL-1\alpha se
insertaron a continuación proporcionando el plásmido AW108 como un
patrón interno para la cuantificación de doce mRNAs específicos. El
plásmido se transformó en E. coli y se cultivaron en medio de
Luria con ampicilina añadida a 50 \mug/ml.
El plásmido AW108 se utilizó a continuación como
material de partida para construir pAW109. Se cultivaron E.
coli conteniendo AW108, y el DNA plasmídico se purificó mediante
los métodos habituales. El plásmido se digirió con las
endonucleasas de restricción BamHI y BglII, y se purificó el
fragmento de 1 kb. Este fragmento contenía los conjuntos de
iniciadores 5' y 3' que se muestran en la Figura 1 así como la
secuencia de poliadenilación. El plásmido pSP72 (Promega Biotec,
Madison, Wisconsin) contiene un promotor de T7 adyacente a una
secuencia de poliengarce para facilitar el clonaje. El plásmido
contiene también el gen de resistencia a la ampicilina.
El fragmento BglII-BamHI de
pAW108 se ligó en pSP72 cortado con BglII y BamHI. Ambas son dianas
de restricción únicas dentro de la región de poliengarce. La mezcla
de ligación se uso para transformar E. coli DH5\alpha, y
se seleccionaron las colonias resistentes a ampicilina resultantes.
Se ensayó la correcta orientación del inserto
BglII-BamHI en el plásmido. El plásmido resultante,
pAW109, es adecuado como un patrón interno para la cuantificación de
mRNA.
Tal como resultará obvio a un experto en la
materia, están disponibles muchos otros plásmidos para la inserción
de la secuencia de DNA deseada para proporcionar un patrón interno
útil en la presente invención. En general, los métodos para la
transformación de estos plásmidos en cepas huésped adecuadas, la
propagación de los huéspedes transformados y la preparación de DNA
plasmídico tal como se requiere para la práctica de la invención
pueden encontrarse en Maniatis et al. Molecular Cloning - A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, New York, 1985.
Tal como se utiliza aquí, el término
"iniciador 5'" se refiere a un oligonucleótido que comprende
una secuencia idéntica a la secuencia contenida en la hebra con
sentido de un segmento nucleotídico diana. Tal como se utiliza
aquí, el término "iniciador 3'" se refiere a un oligonucleótido
que comprende una secuencia complementaria a una secuencia
contenida en la hebra con sentido del mismo segmento nucleotídico
diana. Así, un iniciador 3' útil en el método de la presente
invención hibridará con un molde de mRNA, cDNA o DNA. Es también
descriptivo de los iniciadores 3' y 5' que tanto para el cRNA
patrón interno como para el segmento de RNA diana, la región de
hibridación del iniciador 3' está situada hacia 3' respecto a la
región de hibridación del iniciador 5'.
Los iniciadores 3' y 5' funcionan en el método
de la invención de la forma siguiente: el iniciador 3' inicia la
síntesis de DNA en una reacción de PCR produciendo una hebra de DNA
anti-sentido, que proporciona un molde para la
síntesis de la segunda hebra cuando se incluye el iniciador 5' en la
reacción de PCR. Estos iniciadores 5' y 3' son denominados aquí como
un "par de iniciadores".
\newpage
En la realización preferida, la mayor parte de
miembros de un par de iniciadores están diseñados para abarcar dos
empalmes exón-intrón dentro del gen que codifica
cada mRNA diana. De esta forma, los iniciadores solo hibridarán de
forma efectiva con el mRNA diana deseado. Así, pequeñas cantidades
de DNA genómico como contaminante en una muestra biológica no
afectarán a la cuantificación precisa del mRNA diana.
Así, un par de iniciadores funcionará en una
reacción de PCR amplificando un segmento de ácido nucleico que
posea una secuencia del iniciador idéntica a un segmento de DNA
contenido en el ácido nucleico patrón, esto es, tal como se
muestran como ejemplos, los plásmidos AW108 y AW109. Tal como se
describe aquí, ambos plásmidos contienen una secuencia de DNA que
comprende la secuencia de DNA de doce pares de iniciadores
dispuestos de la siguiente forma: un DNA idéntico en secuencia a
los iniciadores 5' de doce mRNAs diana está seguido por la
secuencia de DNA complementaria a los iniciadores 3' para los mismos
doce mRNAs diana (Figura 1). Las secuencias de DNA de los pares de
iniciadores en pAW108 y pAW109 corresponden a mRNAs que codifican el
factor de necrosis tumoral (TNF), factor estimulante de colonias de
macrófagos (M-CSF), factor de crecimiento derivado
de plaquetas A (PDGF-A), factor de crecimiento
derivado de plaquetas B (PDGF-B), receptor de
lipoproteínas de baja densidad (LDL-R),
3hidroxi-3-metilglutaril coenzima A
reductasa (HMG), interleuquina-1\alpha
(IL-1\alpha),
interleuquina-1\beta
(IL-1\beta), interleuquina-2
(IL-2), receptor tipo beta del factor de crecimiento
derivado de plaquetas (PDGF-\betaR), y
lipoproteína lipasa (LPL). Los pares de iniciadores útiles para
amplificar el patrón interno proporcionado por el cRNA de AW108 ó
AW109 en la práctica del método de la invención se muestran en la
Tabla I.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Otros mRNA diana que pueden ser fácilmente
cuantificados en muestras biológicas mediante la presente invención
incluyen, pero no están limitados a, factor estimulante de colonias
de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de
colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF),
factor de crecimiento de fibroblastos ácido (aFGF), factor de
crecimiento de fibroblastos básico (bFGF), c-sarcoma
felino de McDonough (c-fms),
factor-\beta de crecimiento transformante
(TGF-\beta), proteína-1 de
adhesión de leucocitos (LFA-1),
receptor-\alpha de interleuquina-2
(IL-2R\alpha), alfa-actina,
desmina, \beta-actina,
interleuquina-6 (IL-6),
interferón-\alpha (IFN-\alpha),
interferón-\gamma (IFN-\gamma),
receptor de interleuquina-6 (IL-6R),
receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas \alpha
(PDGF-\alphaR), receptor-\beta
de interleuquina-2 (IL-2R\beta),
interleuquina-3 (IL-3), y
interleuquina-4 (IL-4) así como
virus de inmunodeficiencia humana (HIV). En la Tabla II se muestran
secuencias de oligonucleótidos que constituyen ejemplos de pares de
iniciadores útiles para la detección y la medida de la expresión de
estos RNAs.
El producto de PCR de cada conjunto de
iniciadores de pAW10 8 y pAW10 9 tiene 300-308 pares
de bases (pb), dependiendo del par de iniciadores utilizado en
concreto. La longitud del segmento de 300-308 pb del
ejemplo mostrado no impone una limitación en el diseño de un patrón
interno cualquiera. Tan sólo es necesario que la longitud del
segmento patrón se diseñe de manera que sea de diferente tamaño que
los productos de PCR de los mRNAs diana y que las longitudes de los
segmentos estén dentro de los límites de detección inherentes al
sistema analítico preferido (por ejemplo, electroforesis en gel de
acrilamida, electroforesis en gel de agarosa, u otros medios
cromatográficos). La diferencia de tamaño entre los productos de
amplificación de PCR permite la fácil separación del producto de
amplificación patrón interno de cRNA del producto de amplificación
del mRNA diana mediante, por ejemplo, la electroforesis en gel. La
diana BamHI única se utiliza para linealizar el plásmido AW108 ó
AW109 para producir transcritos de cRNA. Estos transcritos son
útiles para la cuantificación de varios mRNAs específicos
diferentes en, por ejemplo, muestras tratadas y sin tratar. Este
método puede utilizarse para proporcionar un fenotipo
transcripcional de células o tejido tratado o sin tratar y
proporciona así diversas aplicaciones clínicas y de
investigación.
El cRNA y el mRNA diana se transcriben de forma
inversa en la misma reacción. De esta manera, el cRNA sirve no sólo
como patrón para la cuantificación de mRNA, sino que proporciona
también un control de mRNA interno para la reacción de
transcripción inversa. La transcriptasa inversa requiere un
iniciador para iniciar la síntesis de cDNA utilizando un molde de
RNA. En la práctica de la presente invención, éste será un
oligonucleótido iniciador que hibrida tanto con el cRNA patrón como
con el mRNA diana. El iniciador puede tener una secuencia idéntica
al iniciador 3' utilizado para la amplificación por PCR del mRNA
diana. De modo alternativo, el iniciador para la reacción de
transcripción inversa puede ser un oligonucleótido que hibrida con
el mRNA y el cRNA en una posición distal de la secuencia del
iniciador 3' de amplificación, por ejemplo, oligo(dT). Así,
el cDNA resultante contiene en su interior una secuencia idéntica a
la secuencia del iniciador 3' de amplificación. En la realización
preferida descrita aquí, el cRNA de AW108, así como el cRNA de
AW109, contienen una secuencia de poliadenilación en el extremo 3',
y el oligo(dT) se utiliza como iniciador para la
transcripción inversa de los moldes de cRNA y mRNA. Además, el
oligo(dT) permite la amplificación de más de una secuencia
diana a partir de la misma mezcla de reacción de transcriptasa
inversa.
Se utilizan los mismos iniciadores en la
amplificación por PCR de los moldes patrón y diana; por lo tanto no
hay diferencias de eficiencia entre la amplificación de los RNAs
patrón y diana. Cuando se amplifican diluciones en serie de mezclas
del mRNA diana y del cRNA patrón interno en el mismo tubo, y la
reacción se detiene en la fase exponencial de la amplificación, la
cantidad de mRNA diana que estaba presente en la mezcla antes de la
amplificación puede determinarse por extrapolación sobre la curva
patrón de cRNA patrón interno. La cantidad de DNA producida se
representa frente a la cantidad de material de partida tanto para el
patrón como para la diana. La curva patrón permite la extrapolación
de los datos de la diana para determinar la cantidad de diana en el
material de partida. Este valor puede expresarse como moléculas de
mRNA diana/ng RNA total. De forma alternativa, puede determinarse
como un porcentaje o una cantidad en peso, o como un número de
copias.
De modo alternativo, se proporciona un método
para determinar la cantidad de mRNA diana mediante la variación del
número de ciclos de amplificación. La cantidad de los productos de
amplificación producidos se representa frente al número de ciclos
de amplificación tanto para el segmento patrón como para el segmento
diana. Los datos representados muestran la parte de las reacciones
en que la velocidad de amplificación es exponencial. Por tanto, un
cociente entre los productos formados puede ser igualado a un
cociente entre los materiales de partida para determinar la
cantidad inicial de segmento diana presente. Esto se hace de acuerdo
con la fórmula:
en donde N0 es la cantidad inicial
de material, y N es la cantidad de producto amplificado
producido.
En otra realización de la presente invención, se
inserta un tercer conjunto de iniciadores en el plásmido patrón
interno entre el conjunto de iniciadores 5' y el conjunto de
iniciadores 3'. El tercer conjunto de oligonucleótidos está formado
por una serie de secuencias sintéticas en que existe una secuencia
correspondiente a cada uno de los RNA para los que el plásmido
contiene un par de iniciadores 5' y 3'. Este conjunto se diseña de
forma que para cada RNA diana a cuantificar, el producto de
amplificación contendrá una secuencia idéntica a una parte del
tercer conjunto de oligonucleótidos. De esta forma, tanto el
segmento de DNA patrón amplificado como el segmento diana
amplificado contienen un segmento idéntico que proporciona un lugar
para hibridación de sondas, por lo que para cada par de
iniciadores, es
útil una sonda oligonucleotídica para detectar el DNA diana amplificado así como el DNA patrón amplificado.
útil una sonda oligonucleotídica para detectar el DNA diana amplificado así como el DNA patrón amplificado.
Cuando se incluye un tercer conjunto de
oligonucleótidos en el plásmido patrón, la reacción de PCR puede
llevarse a cabo sin utilizar un marcador. Se prefiere que las
reacciones de transcripción inversa y amplificación se lleven a
cabo en tubos separados para cada molde patrón y diana, más que como
co-amplificación. Después de la amplificación, se
cuantifica la cantidad de producto mediante el uso de un formato de
transferencia en punto empleando una sonda oligonucleotídica
monohebra que tiene una secuencia correspondiente a la secuencia
interna proporcionada por el tercer conjunto de iniciadores.
Como ejemplo ilustrativo de la presente
invención, el patrón interno AW108 se utilizó para determinar la
cantidad de varios mRNAs de linfoquinas, incluyendo mRNA de
IL-1\alpha, aislados de cultivos de macrófagos
humanos inducidos con lipopolisacárido (LPS) y control. Se midieron
también los niveles de mRNA de linfoquinas en tejido de placa
aterosclerótica humana.
Como se ha proporcionado por la presente
invención, el mRNA diana se cuantifica con la mayor precisión
utilizando un patrón interno que tenga, en parte, la misma
secuencia que la propia diana. La cuantificación de secuencias de
mRNA mediante amplificación por PCR utilizando un molde no
relacionado como patrón interno proporciona solamente datos
comparativos a causa de las diferencias en eficiencia entre los
pares de iniciadores para los mRNAs patrón y diana. Esto es
inherente al proceso de amplificación puesto que la amplificación
por PCR es un proceso exponencial. El grado de amplificación (N)
viene dado por la ecuación: N=N_{0} (1+ef)^{n}, donde
N_{0} es la cantidad inicial de material, ef es la eficiencia, y n
es el número de ciclo. Así, pequeñas diferencias en eficiencia
conducen a grandes diferencias en el rendimiento de producto de PCR
y tienen como resultado la mala representación de la cantidad de
molde presente en una muestra biológica. Además, las diferencias en
la eficiencia de los iniciadores son parámetros difíciles de regular
para el análisis cuantitativo. La presente invención supera estos
problemas.
La contribución significativa de la eficiencia
de los iniciadores en la cuantificación precisa de un segmento de
ácido nucleico se subraya en uno de los siguientes ejemplos. Se
utilizó cRNA de AW108 como molde para la amplificación por PCR de
varios conjuntos de iniciadores diferentes. La eficiencia de la
amplificación por estos diferentes conjuntos de iniciadores, en las
mismas condiciones de PCR, varía en un rango de varios órdenes de
magnitud. La invención está dirigida a esta cuestión, que es
claramente crítica en cualquier intento de cuantificar expresión de
mRNA por PCR, y supera el problema de la eficiencia de los
iniciadores mediante el uso de los mismos iniciadores para la
amplificación del mRNA diana y el cRNA patrón interno.
La presente invención requiere que la
amplificación de los segmentos de ácido nucleico patrón y diana se
lleve a cabo en la misma reacción. En la realización preferida de
la presente invención, la reacción de transcripción inversa del
cRNA patrón y el mRNA diana se lleva también a cabo en la misma
reacción. Los entendidos en la materia reconocerán de lo anterior
que podría cuantificarse un ácido nucleico diana realizando las
reacciones de transcripción inversa y amplificación del patrón y la
diana por separado. Sin embargo, la precisión de este método
depende del grado en que las etapas de transcripción inversa y
amplificación procedan con eficiencia similar para ambas
amplificaciones. Mediante la realización de ambas reacciones de
transcripción inversa y ambas reacciones de amplificación en el
mismo tubo de reacción, se asegura una precisión excelente.
La cantidad de un fragmento de DNA amplificado
en una muestra determinada puede influir en la eficiencia de la
amplificación. Cuando se utiliza una concentración elevada de molde,
o existe como resultado de la amplificación por PCR, pueden tener
lugar fenómenos que constituyen factores limitantes de la
amplificación eficiente. Tales fenómenos incluyen la saturación por
sustrato del enzima, la inhibición por producto del enzima, la
separación incompleta de las hebras del producto, y la
rehibridación de las hebras del producto. Estos problemas se evitan
fácilmente, sin embargo, mediante una titulación inicial de los
mRNAs diana específicos, para encontrar el rango de concentraciones
que produce amplificación exponencial en un rango definido de número
de ciclos. Por consiguiente, para obtener una evaluación
cuantitativa fiable de un mRNA específico utilizando la invención
descrita, el rango de concentraciones de los moldes patrón y diana,
así como el número de ciclos de amplificación, deben ser tales que
las reacciones permanezcan en la fase exponencial.
Así, en la realización preferida, las
condiciones de reacción descritas utilizan 50 ng - 1 \mug de RNA
celular total en combinación con aproximadamente 2 x 10^{2} -2 x
10^{7} moléculas de cRNA. Una cantidad tan pequeña como 50 pg de
RNA celular es también adecuada con los fines de la presente
invención.
Las muestras adecuadas para el análisis por este
método pueden ser de origen humano o no humano; pueden obtenerse de
muestras en cultivo, o aislarse a partir de tejido diseccionado o a
partir de células de un fenotipo definido inmunológicamente. Estas
últimas pueden obtenerse mediante la tinción con un anticuerpo
monoclonal y el aislamiento mediante un separador de células
activado por fluorescencia (FACS) de células disociadas
enzimáticamente o mediante la separación de áreas específicas de
preparaciones teñidas inmunohistoquímicamente. Esto permitirá la
identificación definitiva de tipos de células que producen mRNAs
específicos.
La cantidad de DNA amplificado generado en el
método de la presente invención puede medirse de diferentes
maneras. Por ejemplo, pueden utilizarse en la PCR iniciadores
marcados en que uno o ambos miembros de un par cualquiera de
iniciadores está marcado, o nucleótidos marcados, y puede medirse la
incorporación de marca para determinar la cantidad de DNA
amplificado. La marca puede ser isotópica o no isotópica. De forma
alternativa, la cantidad de producto amplificado puede determinarse
por electroforesis y visualización del producto amplificado por
tinción o por hibridación con una sonda marcada. Puede usarse la
densitometría para calcular la cantidad de producto en un gel
teñido, o por extrapolación a partir de un autorradiograma cuando se
utiliza una sonda marcada. Cuando se utiliza una sonda marcada, la
sonda debe estar presente en exceso respecto al producto
amplificado. En una realización de este tipo de la invención, los
iniciadores se marcan isotópicamente y los productos de
amplificados resultantes se someten a electroforesis en un gel de
acrilamida. La región en que se espera que migre el producto se
corta, y la cantidad de marca se determina por contaje de Cerenkov.
La cantidad de marca presente se representa frente a la cantidad de
material de partida conocida.
El método de la invención requiere que se
determinen las cantidades amplificadas de un segmento molde y un
segmento patrón producidas en una única reacción en cadena de la
polimerasa. Por tanto, el método requiere que el segmento molde
amplificado sea distinguible del segmento patrón amplificado. Si los
segmentos son de diferentes tamaños, es relativamente simple
distinguir un segmento amplificado del otro, esto es, los productos
amplificados pueden separase fácilmente mediante electroforesis en
gel. La presente invención no precisa, sin embargo, que los
productos de amplificación sean de diferente tamaño, ya que pueden
utilizarse otros métodos para distinguir un segmento amplificado
del otro. Por ejemplo, la sonda interna específica para un segmento
puede marcarse de forma diferente a la sonda interna específica para
el otro segmento.
El método cuantitativo aquí descrito es útil
para el análisis de muestras biológicas in vivo. Tal como se
muestra en el siguiente ejemplo, el análisis por PCR cuantitativo de
mRNA de las cadenas de PDGF-A y B en una lesión
aterosclerótica humana frente a un vaso sanguíneo normal hace
resaltar la sensibilidad de esta aproximación para investigar la
biología de las células y tejidos in vivo. Por ejemplo,
cuando se utilizó el presente método para medir mRNAs de
IL-1\alpha y IL-1\beta en tejido
aterosclerótico, los resultados sugirieron que puede haber
componentes inflamatorios o inmunológicos en la patogénesis de la
enfermedad.
Debido a su elevada sensibilidad, rapidez y
precisión, el presente método de PCR cuantitativo puede utilizarse
para estudiar la expresión génica de una forma más extensiva de lo
que has sido posible hasta ahora, permitiendo medidas cuantitativas
de la expresión génica en un número muy pequeño de células y a
partir de pequeñas cantidades de muestras de tejido disponibles a
partir de fuentes in vivo, tales como biopsias. Esta técnica
puede proporcionar también información de los cambios en el nivel
de expresión de moléculas de mRNA específicas que puede ser valiosa
en el diagnóstico y análisis de, por ejemplo, estados de
enfermedades infecciosas, cáncer, trastornos metabólicos, y
enfermedades autoinmunes.
Resultará evidente para los expertos en la
materia que el método de la presente invención puede comercializarse
en forma de kit para la cuantificación de uno o más ácidos
nucleicos en una muestra. Por ejemplo, en su realización más
sencilla, uno de estos kits proporcionaría un patrón interno y un
par de oligonucleótidos iniciadores apropiados. En otra
realización, un kit puede contener un patrón interno, un par de
oligonucleótidos iniciadores apropiados, una DNA polimerasa, una
RNA polimerasa, una transcriptasa inversa, trifosfatos de
nucleótidos, enzimas de restricción, tampones para llevar a cabo la
síntesis de cRNA y cDNA, digeridos de enzimas de restricción, y
amplificación por PCR. Además, los kits pueden contener una DNA
polimerasa termoestable; por ejemplo la DNA polimerasa termoestable
Taq aislada de Thermus aquaticus como agente de
polimerización.
A continuación se muestran ejemplos del método
de la invención, pero los expertos en la materia reconocerán que la
presente invención no está de ningún modo limitada a las
realizaciones específicas descritas a continuación.
Se construyó un gen sintético utilizando una
técnica de extensión de superposición de oligonucleótidos y
amplificación por PCR. El procedimiento utilizado fue similar al
descrito por Ho et al. para el uso en mutagénesis dirigida
(Ho et al.,1989, Gene 77:51-59). Después de
su construcción el gen sintético se subclonó en un vector de
Okayama-Berg conteniendo el promotor de la
polimerasa de T7 y una secuencia poliadenilada. El plásmido
resultante, AW108, se muestra en la Figura 1.
Este plásmido se utilizó como molde para la
transcripción por la polimerasa de T7 de acuerdo con el protocolo
de transcripción del fabricante (Promega Biotec, Madison Wisconsin).
El cRNA producto de AW108 resultante se purificó por cromatografía
sobre oligo(dT) y electroforesis en gel. De manera
alternativa, se utilizó pAW109 para preparar un patrón de cRNA. El
cRNA producto se purificó por elución selectiva utilizando el
sistema de puntas-Qiagen (Qiagen Inc., Studio City,
California) seguida de cromatografía sobre oligo(dT). La
punta-Qiagen se utilizó según las instrucciones del
fabricante para la purificación de RNA y transcritos de RNA
resultado de dejar correr la transcripción.
Tanto para el cRNA de AW10 8 como para el cRNA
de AW10 9, el cRNA purificado se cuantificó por determinación de la
absorbancia a 260 nm. El número de moléculas presentes se determinó
de acuerdo con el peso molecular del transcrito. El cRNA de AW108
tiene 1026 nucleótidos de longitud, por lo tanto, 1 mol = 3,386 x
10^{5} gm (1026 x 330). Así, 3,386 x 10^{5} gm contienen 6 x
10^{23} moléculas de cRNA. El número de moléculas en 1 pg de cRNA
de AW108 es (6 x 10^{23})/(3,386 x 10^{5} gm)= 1.77 x
10^{6}.
El RNA celular total se aisló a partir de
macrófagos y tejidos por el método de la extracción ácida con
tiocianato de
guanidinio-fenol-cloroformo de
acuerdo con Chomczynski et al. , 1987, Analyt.
Biochem. 162: 156-159.
\vskip1.000000\baselineskip
El cRNA preparado a partir de pAW108 se sometió
a electroforesis en agarosa de bajo punto de fusión al 1%, grado
ultra puro, en tampón TBE. La región del gel correspondiente a 1 kb
se cortó y separó del gel y se fundió en 0,2-0,4 ml
de tampón 0,1 M NETS (0,1 M NaCl, 0,01 M EDTA; 0,01 M
Tris-HCl, pH 7,4; 0,2% SDS) conteniendo 1 mM
2-ME, en un baño de agua a 95ºC durante
3-5 minutos y se solidificó rápidamente en un cubo
de hielo. A continuación las muestras se congelaron a -70ºC durante
al menos dos horas.
Las muestras de agarosa fundida congeladas se
calentaron a 37ºC y se centrifugó a la velocidad máxima en una
centrífuga eppendorf mantenida en la cámara fría. Se separó la
agarosa en forma de pellet. El líquido sobrenadante se transfirió a
otro tubo eppendorf y se extrajo con una mezcla de 100 \mul
defenol cloroformo conteniendo 1% de alcohol isoamílico. El fenol
se saturó con tampón 0,1 M NETS. La fase acuosa se recogió, y el
RNA se precipitó con etanol. El pellet de RNA se lavó con 0,1 ml de
LiCl 2M y a continuación con 0,1 ml de etanol. El RNA se secó y a
continuación se disolvió en una cantidad apropiada de agua destilada
estéril (2-100 \mul) quedando preparado para la
transcripción inversa.
\vskip1.000000\baselineskip
Los oligonucleótidos se sintetizaron en un
sintetizador de DNA Biosearch (San Rafael, California). La mayoría
de los iniciadores son iniciadores específicos de RNA. Los
iniciadores 5' abarcaban el empalme de los dos primeros exones y
los iniciadores 3' abarcaban el empalme de los dos siguientes
exones. De modo alternativo, los iniciadores 5' abarcaban el
empalme del primer y el segundo exón y los iniciadores 3' abarcaban
el empalme entre el segundo y tercer exón. Estas secuencias, los
genes a los que corresponden, y los tamaños de los productos
amplificados obtenidos utilizando los iniciadores se muestran en la
Tabla I.
\vskip1.000000\baselineskip
El RNA se sometió a transcripción inversa para
dar el cDNA en la forma descrita previamente (véase Gerard, 1987,
Focus (Bethesda Research Labs)9:5). Se preparó una
reacción de transcripción inversa de 10 \mul, conteniendo 1
\mug de RNA celular total, 1, 77 x 10^{2} -1, 77 x 10^{6}
moléculas de cRNA de AW108, 1 x tampón de PCR (20 mM
Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 2 mM MgCl_{2}, 100
\mug/ml de BSA) , 1 mm DTT, 0,5 mM dNTP, 10 unidades de RNasin
(Promega Biotec, Madison, Wisconsin), 0,1 \mug
oligo(dT)_{12-18}, y 100 unidades de
transcriptasa inversa de MuLV BRL Moloney (Bethesda Research
Laboratories, Bethesda, Maryland). La reacción se incubó a 37ºC
durante 60 minutos, se calentó a 95ºC durante 5-10
minutos, y se enfrió rápidamente en hielo.
\vskip1.000000\baselineskip
Una décima parte de la mezcla de reacción del
cDNA se diluyó en una serie de diluciones a la tercera parte con
0,1 \mug/\mul tRNA, seguidas del ajuste a una concentración
final de 1 x tampón de PCR, 50 \muM dNTPs, 0,1 \muM de cada uno
de los iniciadores 5' y 3', 1 x 10^{6} cpm de iniciador marcado en
el extremo con ^{32}P, y 1 unidad de Taq DNA polimerasa
(Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, Connecticut) en un
volumen total de 50 \mul. Se colocó sobre la mezcla una capa de
100 \mul de aceite mineral para evitar la evaporación y se
amplificó entonces durante 25 ciclos en un Termociclador Perkin
Elmer Cetus. De forma alternativa, una décima parte de la mezcla de
reacción del cDNA se amplificó utilizando las mismas condiciones que
antes con un número variable de ciclos. El perfil de amplificación
implica desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos, hibridación
del iniciador a 55ºC durante 30 segundos, y extensión a 72ºC durante
1 minuto. Los oligonucleótidos se marcaron con
\gamma-^{32}P-ATP utilizando
polinucleótido quinasa y los nucleótidos no incorporados se
eliminaron en una columna de Bio-Gel
P-4®.
\vskip1.000000\baselineskip
Diez \mul de cada mezcla de reacción de PCR se
sometieron a electroforesis en geles de poliacrilamida al 8% en
tampón Tris/borato/EDTA. Los geles se tiñeron con bromuro de etidio
y se fotografiaron bajo irradiación con luz-UV. Las
bandas apropiadas se cortaron del gel, y la radioactividad se
determinó por contaje de Cerenkov. La cantidad de radioactividad
recuperada a partir de las bandas cortadas del gel se representó
frente a las concentraciones de molde. Los datos se representaron
mediante un ajuste a una curva exponencial con un programa
Slide-Write Plus (Advanced Graphics Software). La
cantidad de mRNA diana se cuantificó por extrapolación frente a la
curva de patrón interno de cRNA de AW108.
\vskip1.000000\baselineskip
El RNA se sometió a electroforesis en un gel al
1,5% de agarosa conteniendo formaldehído y se transfirió a un
filtro de nitrocelulosa en 20 x SSC (1 x SSC contenía 0,15 M cloruro
sódico y 0,015 M citrato sódico). La transferencia se hibridó con
2x10^{6} cpm por ml de oligonucleótidos marcados en el extremo con
^{32}P. La hibridación se llevó a cabo durante 4 horas a 55ºC en
0,75 M NaCl, 0,075 M citrato sódico, pH 7,0, 20 mM fosfato sódico,
pH 7,0, 5 mM EDTA, 200 \mug de RNA de levadura por ml, y 1%
sarcosil (Sigma). La transferencia se lavó en 1 x SSC a 55ºC durante
30 minutos y se autorradiografió con pantallas intensificadoras a
-70ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Se aislaron monocitos de sangre periférica
humana a partir de preparaciones de capa de leucocitos mediante
centrifugación en gradiente de Ficoll/Hypaque® seguida de adherencia
a plástico durante una hora. Se separaron a continuación las
células adherentes y se replaquearon a 10^{6 }células/pozo en
placas de 6 pozos en medio RPMI 1640 suplementado con 2% de suero
fetal bovino y 2000 unidades/ml de factor estimulante de colonias
de macrófagos (Cetus Corporation, Emeryville, California). Después
de diez días, la mitad de los cultivos se trataron con 5 \mug/ml
de LPS (Sigma). Todos los cultivos se recolectaron para el
aislamiento de ácidos nucleicos 5 horas después.
\vskip1.000000\baselineskip
La muestra de endarterectomía de carótida se
obtuvo en el curso de una operación quirúrgica con el consentimiento
informado del paciente. La preparación de RNA de una arteria
coronaria histológicamente normal se recuperó del corazón de un
receptor de trasplante de corazón.
\vskip1.000000\baselineskip
Como un ejemplo del presente método, se utilizó
el patrón interno AW10 8 para determinar la cantidad de mRNA de
IL-1\alpha aislado de cultivos de macrófagos
humanos inducidos con LPS. Se utilizaron dos protocolos diferentes
para llevar a cabo este análisis. En el primer caso, la cantidad de
RNAs molde y patrón se varió por dilución en serie para generar una
curva patrón. En el segundo caso, se varió el número de ciclos de
amplificación y se representó frente a la cantidad de producto de
PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Se combinaron cincuenta ng de RNA total de
macrófago y 1,77 x 10^{6} moléculas de cRNA de AW108 y se
sometieron a transcripción inversa para dar cDNA. Diluciones en
serie a la tercera parte de una décima parte de la mezcla de cDNA
se amplificaron utilizando los iniciadores específicos de
IL-1\alpha listados en la Tabla 1. Se incluyeron
en la amplificación alrededor de 1 x 10^{6} cpm de iniciador
marcado en el extremo con ^{32}P. Los productos de reacción se
resolvieron por electroforesis en gel y se visualizaron por tinción
con bromuro de etidio (Figura 2A). Las cantidades de radioactividad
recuperadas de las bandas del gel cortadas se representaron frente
a las concentraciones de molde (Figura 2B). En este experimento, el
RNA diana y el cRNA de AW108 se amplificaron tras diluciones en
serie a la tercera parte, y los resultados demuestran que el método
puede resolver diferencias en concentraciones de RNA menores a un
factor de tres veces. El hecho de que las velocidades de reacción
del cRNA de AW10 8 y el mRNA de IL-1\alpha sean
idénticas dentro de esta fase exponencial de la reacción de PCR
permite la construcción de una curva patrón para el cRNA de AW108 y
la extrapolación como número de copias para el mRNA de
IL-1\alpha presente en los macrófagos. Tal como se
muestra en la Figura 2B, 1 ng de RNA total de macrófago inducido
con LPS y 1 x 10^{4} moléculas de cRNA de AW108 dieron la misma
cantidad de producto de PCR de IL-1\alpha. Dicho
de otra forma, 1 ng de RNA total de macrófago inducido con LPS
contenía 1 x 10^{4} moléculas de mRNA de
IL-1\alpha.
\vskip1.000000\baselineskip
Quinientos ng de RNA total de macrófago se
sometieron a transcripción inversa con 1, 77 x 10^{6} moléculas
de cRNA de AW108. Alícuotas que contenían cada una la décima parte
de la mezcla de cDNA se sometieron a 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 ó
28 ciclos de amplificación en las mismas condiciones que en el
protocolo E. Las cantidades de radioactividad recuperadas de las
bandas cortadas se representaron en función del número de ciclos
(Figura 2C). Las velocidades de amplificación fueron exponenciales
entre los 14 y los 22 ciclos para ambos moldes. En los ciclos 24,
26 y 28, las velocidades decrecieron drásticamente y se
estabilizaron. La eficiencia de amplificación se calculó a partir
de las pendientes de estas curvas y resultó ser de 88% tanto para el
cRNA de AW108 como para el mRNA de IL-1\alpha.
Puesto que la eficiencia de amplificación era la misma para las dos
dianas co- amplificadas dentro de la fase exponencial, el valor
absoluto del mRNA de IL-1\alpha puede calcularse
por comparación con el patrón interno de cRNA de AW108 utilizando la
fórmula:
en donde N_{0} es la cantidad
inicial de material, y N es el alcance de la amplificación. La
cantidad de mRNA de IL-1\alpha en 1ng de RNA
total de macrófago inducido con LPS calculada por este método fue de
1,1 x 10^{4} moléculas. Por tanto, los resultados obtenidos
utilizando cualquiera de estos dos protocolos alternativos para la
cuantificación son los
mismos.
\vskip1.000000\baselineskip
La cantidad de mRNA de
IL-1\alpha en macrófagos inducidos con LPS
determinada por el método de PCR cuantitativo se verificó mediante
análisis por transferencia Northern. El análisis por PCR (véase más
arriba) demostró que 1 ng de RNA de macrófago y 1 x 10^{4}
moléculas de cRNA de AW108 producían la misma cantidad de producto
de PCR de IL-1\alpha. Por tanto, 5 \mug de RNA
de macrófago y 5 x 10^{7} moléculas de cRNA de AW10 8 deberían
dar señales de intensidad similar en análisis por transferencia
Northern. Diluciones en serie a la mitad de RNA de macrófago y cRNA
de AW108 se sometieron a análisis por transferencia Northern
utilizando como sonda el iniciador 3' de
IL-1\alpha. Se estimó que los tamaños de las
moléculas de RNA diana eran de 2.200 nucleótidos para el mRNA de
IL-1\alpha de los macrófagos y 1026 nucleótidos
para el cRNA de AW108. Se detectaron señales de hibridación de
igual intensidad a todas las diluciones de RNA de macrófago y cRNA
de AW108, tal como se muestra en la Figura 3. Este resultado
demuestra que la cantidad de mRNA estimada por el método de PCR
cuantitativo correlaciona con los resultados del análisis por
Northern.
\vskip1.000000\baselineskip
Existen muchas variables que pueden influir en
la eficiencia de la amplificación por PCR. Alguno de los parámetros
que pueden controlarse fácilmente son las concentraciones de molde,
dNTPs, MgCl_{2}, iniciadores, polimerasa, y el perfil del ciclo
de PCR. Sin embargo, las diferencias en la eficiencia de los
iniciadores son parámetros difíciles de regular para el análisis
cuantitativo. Con el fin de analizar el efecto de la eficiencia de
los iniciadores en el método de PCR cuantitativo, se utilizó cRNA
de AW108 como molde para la amplificación por PCR de siete
conjuntos de iniciadores diferentes; IL-1\beta,
PDGF-A, PDGF-B,
PDGF-R, IL-2, LPL, y
apo-E. Tal como se indica en la Figura 4, la
eficiencia de la amplificación para estos conjuntos diferentes de
iniciadores en las mismas condiciones de amplificación por PCR
varían en un rango de varios órdenes de magnitud. Por ejemplo, los
iniciadores de IL-1\beta son 10^{5} veces más
eficientes que los iniciadores de apo-E. Por lo
tanto, es crítico el uso de los mismos iniciadores para la
amplificación del mRNA diana y el patrón interno en cualquier
intento de cuantificar la expresión de mRNA mediante PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
Una de las principales ventajas de la presente
técnica de PCR cuantitativa es que el método permite analizar
varias especies de mRNA en paralelo. La Tabla III muestra los
resultados de la cuantificación de los niveles de expresión de seis
mRNAs de citoquinas en macrófagos humanos en respuesta al
tratamiento con LPS. Los niveles de los mRNAs de
IL-1\beta y IL-1\alpha, tras la
inducción con LPS, aumentan aproximadamente 50 veces. Los niveles
de los mRNAs de PDGF-A, M-CSF, y TNF
aumentan de 5 a 10 veces. Sin embargo, el nivel de mRNA de
PDGF-B permanece constante para las células control
y las tratadas con LPS. Puesto que se midió la cantidad absoluta de
cada mRNA, esta aproximación produce una visión detallada y con
múltiples facetas del fenotipo transcripcional tanto en el estado
latente como inducido, utilizando solamente fracciones de microgramo
de RNA total.
* móleculas/célula = moléculas/\mu/g RNA
(calculado como en la figura 2) x \mug RNA aislado por célula
^{\ding{61}} Se cultivaron macrófagos
obtenidos de monocitos durante diez días. 5 horas antes de la
recolección, la mitad de los cultivos se expusieron a 5 \mug/ml de
LPS.
\vskip1.000000\baselineskip
Puesto que mediante la presente tecnología
pueden obtenerse resultados cuantitativos precisos incluso con
cantidades pequeñas de material, el método constituye una importante
herramienta para el análisis de muestras que son raras o que están
en cantidades limitadas, p. ej. especímenes de biopsias obtenidos
in vivo. Como ejemplo, la Tabla IV muestra la comparación de
los resultados de la cuantificación de seis mRNAs diferentes en una
arteria carótida aterosclerótica humana y en una arteria coronaria
normal. Los datos muestran un incremento de 3 a 5 veces en el nivel
de los mRNAs de PDGF-A y PDGF-B,
ningún cambio en el receptor de PDGF tipo \beta
(PDGF-R) y una disminución de tres veces en el
receptor de LDL en el vaso aterosclerótico. Hubo aumentos en los
niveles de mRNAs de IL-1\alpha y
IL-1\beta en el tejido enfermo.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
* Calculado como en la Figura 2
^{\ding{61}} ND, No detectable
Claims (88)
1. Uso de un patrón interno para la
cuantificación de un segmento de ácido nucleico diana contenido en
una muestra mediante un método de amplificación por reacción de
polimerasa en cadena, comprendiendo dicho patrón interno en una
hebra un segmento de ácido nucleico que comprende una secuencia 5' y
una secuencia 3', las cuales proporcionan un lugar de hibridación de
un iniciador corriente arriba y el complemento de un lugar de
hibridación de un iniciador corriente abajo que son idénticos a un
lugar de hibridación de un iniciador corriente arriba y al
complemento de un lugar de hibridación de un iniciador corriente
abajo dentro de dicho segmento de ácido nucleico diana, en que dicho
segmento de ácido nucleico patrón interno y dicho segmento de ácido
nucleico diana se co-amplifican utilizando el mismo
conjunto de iniciadores y al ser amplificados dicho segmento de
ácido nucleico patrón interno y dicho segmento de ácido nucleico
diana se distinguen mediante sondas específicas de segmento que
llevan diferentes marcadores.
2. El uso de la reivindicación 1, en que dicho
patrón interno es adecuado para cuantificar entre 2 y 32 segmentos
de ácido nucleico diana.
3. El uso de la reivindicación 1 o 2, en que
dicho patrón interno es adecuado para la cuantificación de un
segmento de un ácido nucleico que codifica una linfoquina.
4. El uso de la reivindicación 1 o 2, en que
dicha secuencia de ácido nucleico diana está contenida dentro de una
secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína seleccionada
del grupo formado por TNF, M-CSF,
PDGF-A, PDGF-B,
PDGF-R, apo-E,
LDL-R, HMG, IL-1a,
IL-1P, IL-2, LPL,
G-CSF, GM-CSF, aFGF, bFGF,
c-fms, TGF-\beta,
LFA-1, IL-2R\alpha,
\alpha-actina, desmina,
\beta-actina, IL-6,
IFN-\alpha, IFN-\gamma,
IL-6R, PDGF-\alphaR,
IL-2R\beta, IL-3,
IL-1 y proteínas de HIV.
5. El uso de la reivindicación 4, en que el
patrón interno comprende las secuencias de DNA siguientes:
5'-CAGAGGGAAGAGTTCCCCAG-3'
5'-CCTTGGTCTGGTAGGAGACG-3'
5'-GAACAGTTGAAAGATCCAGTG-3'
5'-TCGGACGCAGGCCTTGTCATG-3'
5'-CCTGCCCATTCGGAGGAAGAG-3'
5'-TTGGCCACCTTGACGCTGGG-3'
5'-GAAGGAG.CCTGGGTTCCCTG-3'
5'-TTTCTCACCTGGACAGGTCG-3'
5'-GGTCAGTTGGCAGGATGCCAGGC-3'
5'-GGTCAGTTGTTCCTCCAGTTC-3'
5'-CAATGTCTCACCAAGCTCTG-3'
5'-TCTGTCTCGAGGGGTAGCTG-3'
5'-TACCATGTCAGGGGTACGTC-3'
5'-CAAGCCTAGAGACATAATCATC-3'
5'-GTCTCTGAATCAGAAATCCTTCTATC-3'
5'-CATGTCAAATTTCACTGCTTCATCC-3'
5'-AAACAGATGAAGTGCTCCTTCCAGG-3'
5'-TGGAGAACACCACTTGTTGCTCCA-3'
5'-GAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCC-3'
5'-TGTTTCAGATCCCTTTAGTTCCAG-3'
5'-TGACCACCCAGCCATCCTTC-3'
5'-GAGGAGGTGTTGACTTCATTC-3'
y
5'-GAGATTTCTCTGTATGGCACG-3'
5'-CTGCAAATGAGACACTTTCTC-3'
\vskip1.000000\baselineskip
6. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 5, en que dicho patrón interno es una molécula de cRNA.
7. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 6, en que dicho patrón interno se proporciona en forma de
plásmido.
8. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
1 a 7, en que dicho patrón interno comprende además un promotor de
polimerasa de T7 mediante el que se produce una molécula de cRNA,
usando como molde dicho segmento de ácido nucleico patrón
interno.
9. El uso de la reivindicación 8, en que dicho
patrón interno comprende además una secuencia de poliadenilación
mediante la cual dicha molécula de cRNA se usa como molde en una
reacción de transcriptasa inversa iniciada por oligo(dT).
10. Un kit para la cuantificación de un segmento
de ácido nucleico diana en una muestra biológica mediante un método
de amplificación por reacción de polimerasa en cadena que comprende
recipientes individuales con:
(a) una cantidad inicial predeterminada de un
patrón interno que comprende un segmento de ácido nucleico con una
secuencia 5' y una secuencia 3', las cuales proporcionan un lugar de
hibridación de un iniciador corriente arriba y el complemento de un
lugar de hibridación de un iniciador corriente abajo que son
idénticos a un lugar de hibridación de un iniciador corriente arriba
y al complemento de un lugar de hibridación de un iniciador
corriente abajo dentro de dicho segmento de ácido nucleico diana, y
al amplificarlos dicho segmento de ácido nucleico patrón interno y
dicho segmento de ácido nucleico diana pueden distinguirse mediante
sondas específicas de segmento;
(b) por lo menos un par de oligonucleótidos
iniciadores para la co-amplificación de dicho
segmento de ácido nucleico patrón interno y dicho segmento de ácido
nucleico diana;
(c) sondas específicas de segmento
diferencialmente marcadas para detectar dicho segmento de ácido
nucleico patrón interno y dicho segmento de ácido nucleico
diana.
\vskip1.000000\baselineskip
11. El kit de la reivindicación 10, en que dicho
patrón interno es adecuado para cuantificar entre 2 y 32 segmentos
de ácido nucleico diana.
12. El kit de la reivindicación 10 u 11, en que
dicho patrón interno es adecuado para la cuantificación de un
segmento de un ácido nucleico que codifica una linfoquina.
13. El kit de la reivindicación 10 u 11, en que
dicha secuencia de ácido nucleico diana está contenida dentro de una
secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína seleccionada
del grupo formado por TNF, M-CSF,
PDGF-A, PDGF-B,
PDGF-R, apo-E,
LDL-R, HMG, IL-1\alpha,
IL-1\beta, IL-2, LPL,
G-CSF, GM-CSF, aFGF, bFGF,
c-fms, TGF-\beta,
LFA-1, IL-2R\alpha,
\alpha-actina, desmina,
\beta-actina, IL-6,
IFN-\alpha, IFN-\gamma,
IL-6R, PDGF-\alphaR,
IL-2R\beta, IL-3,
IL-1 y proteínas de HIV.
14. El kit de la reivindicación 13, en que el
patrón interno comprende las secuencias de DNA siguientes:
5'-CAGAGGGAAGAGTTCCCCAG-3'
5'-CCTTGGTCTGGTAGGAGACG-3'
5'-GAACAGTTGAAAGATCCAGTG-3'
5'-TCGGACGCAGGCCTTGTCATG-3'
5'-CCTGCCCATTCGGAGGAAGAG-3'
5'-TTGGCCACCTTGACGCTGGG-3'
5'-GAAGGAG.CCTGGGTTCCCTG-3'
5'-TTTCTCACCTGGACAGGTCG-3'
5'-GGTCAGTTGGCAGGATGCCAGGC-3'
5'-GGTCAGTTGTTCCTCCAGTTC-3'
5'-CAATGTCTCACCAAGCTCTG-3'
5'-TCTGTCTCGAGGGGTAGCTG-3'
5'-TACCATGTCAGGGGTACGTC-3'
5'-CAAGCCTAGAGACATAATCATC-3'
5'-GTCTCTGAATCAGAAATCCTTCTATC-3'
5'-CATGTCAAATTTCACTGCTTCATCC-3'
5'-AAACAGATGAAGTGCTCCTTCCAGG-3'
5'-TGGAGAACACCACTTGTTGCTCCA-3'
5'-GAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCC-3'
5'-TGTTTCAGATCCCTTTAGTTCCAG-3'
5'-TGACCACCCAGCCATCCTTC-3'
5'-GAGGAGGTGTTGACTTCATTC-3'
y
5'-GAGATTTCTCTGTATGGCACG-3'
5'-CTGCAAATGAGACACTTTCTC-3'
\vskip1.000000\baselineskip
15. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
10 a 14, en que dicho patrón interno es una molécula de cRNA.
16. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
10 a 15, en que dicho patrón interno se suministra en forma de
plásmido.
17. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
10 a 16, en que dicho patrón interno comprende además un promotor de
polimerasa de T7 mediante el que se produce una molécula de cRNA,
usando como molde dicho segmento de ácido nucleico patrón
interno.
18. El kit de la reivindicación 17, en que dicho
patrón interno comprende además una secuencia de poliadenilación
mediante la cual dicha molécula de cRNA se usa como molde en una
reacción de transcriptasa inversa iniciada por oligo(dT).
19. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
10 a 18, que comprende además transcriptasa inversa.
20. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
10 a 19, que comprende además una polimerasa termoestable y
opcionalmente tampones apropiados para una reacción en cadena de la
polimerasa y trifosfatos de nucleósidos.
21. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
10 a 20, que comprende además una DNA polimerasa.
22. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
10 a 21, en que dicho ácido nucleico diana es un RNA.
23. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
10 a 22, en que dicho ácido nucleico diana es indicativo de una
enfermedad genética, cáncer o HIV.
24. Un método para cuantificar un segmento de
ácido nucleico diana en una muestra mediante un método de
amplificación por reacción de polimerasa en cadena que comprende las
etapas de:
(a) adicionar a dicha muestra una cantidad
inicial predeterminada de un patrón interno como el
caracterizado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, el
cual comprende un segmento de ácido nucleico que se une a los mismos
iniciadores que son fijados por dicho segmento de ácido nucleico
diana;
(b) tratar dicha muestra en condiciones
adecuadas para efectuar una reacción en cadena de la polimerasa, en
que dichos ácidos nucleicos se transforman en monohebra y se exponen
a un agente para la polimerización, deoxinucleósidos 5' trifosfato,
y a un par de oligonucleótidos iniciadores, en que dicho par de
iniciadores puede hibridar tanto con el segmento de ácido nucleico
diana como con el patrón, de manera que cada iniciador pueda servir
para iniciar la síntesis de un producto de extensión en una hebra de
DNA de cada uno de los segmentos de ácido nucleico diana y patrón,
de forma que el producto de extensión de un iniciador, cuando se
separa de la hebra molde, sirve de molde para la síntesis del
producto de extensión del otro iniciador de dicho par, donde dichos
segmentos de ácido nucleico diana y patrón amplificados son
distinguibles mediante sondas específicas de segmento;
(c) separar los productos de extensión del
iniciador del molde sobre los que han sido sintetizados, para dar
moléculas monohebra;
(d) repetir los pasos (b) y (c) sobre las
moléculas monohebra producidas en la etapa (c), por lo menos una
vez, por lo que cada repetición de las etapas (b) y (c) es un ciclo
de amplificación;
(e) medir las cantidades de los segmentos diana
y patrón amplificados en la etapa (d) con sondas específicas de
segmento diferencialmente marcadas; y
(f) calcular a partir de los segmentos diana y
patrón amplificados en la etapa (d) la cantidad de dicho segmento de
ácido nucleico diana presente en la muestra antes de la
amplificación.
\vskip1.000000\baselineskip
25. El método de la reivindicación 24, en que
dicho segmento de ácido nucleico diana es una molécula de mRNA,
dicho patrón interno es una molécula de cRNA y dichos RNAs se
someten a transcripción inversa para dar moléculas de cDNA después
de la etapa (a) y antes de la etapa (b).
26. El método de la reivindicación 25, en que
dicho segmento de ácido nucleico diana está contenido en una
secuencia de un mRNA que codifica una linfoquina.
27. El método de las reivindicaciones 24 ó 25,
en que dicho segmento de ácido nucleico diana está contenido dentro
de una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína
seleccionada entre TNF, M-CSF,
PDGF-A, PDGF-B,
PDGF-R, apo-E,
LDL-R, HMG, IL-1\alpha,
IL-1\beta, IL-2, LPL,
G-CSF, GM-CSF, aFGF, bFGF,
c-fms, TGF-\beta,
LFA-1, IL-2R\alpha,
\alpha-actina, desmina,
\beta-actina, IL-6,
IFN-\alpha, IFN-\gamma,
IL-6R, PDGF-\alphaR,
IL-2R\beta, IL-3,
IL-1 y proteínas de HIV.
28. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 27, que comprende además la etapa de preparar
al menos una dilución a partir de la mezcla de la etapa (a) antes de
la etapa (b) , con lo cual se modifica la cantidad de segmentos de
patrón interno y de ácido nucleico diana antes de dicha reacción de
amplificación.
29. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 28, en el cual se realizan de 10 a 28 ciclos
de amplificación y se toman muestras de dicha mezcla reaccionante
para determinar a través de qué ciclo la reacción está en fase
exponencial.
30. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 29, en que el par de oligonucleótidos
iniciadores de la etapa (b) está marcado y las cantidades de
segmentos diana y patrón interno amplificados se miden según la
etapa (e) por determinación de la cantidad de marcador incorporado
en cada uno de dichos segmentos de ácido nucleico amplificados.
31. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 27 a 30, en que dicho par de oligonucleótidos
iniciadores está seleccionado del grupo formado por:
5'-CAGAGGGAAGAGTTCCCCAG-3'
5'-CCTTGGTCTGGTAGGAGACG-3'
5'-GAACAGTTGAAAGATCCAGTG-3'
5'-TCGGACGCAGGCCTTGTCATG-3'
5'-CCTGCCCATTCGGAGGAAGAG-3'
5'-TTGGCCACCTTGACGCTGGG-3'
5'-GAAGGAGCCTGGGTTCCCTG-3'
5'-TTTCTCACCTGGACAGGTCG-3'
5'-GGTCAGTTGGCAGGATGCCAGGC-3'
5'-GGTCAGTTGTTCCTCCAGTTC-3'
5'-CAATGTCTCACCAAGCTCTG-3'
5'-TCTGTCTCGAGGGGTAGCTG-3'
5'-TACCATGTCAGGGGTACGTC-3'
5'-CAAGCCTAGAGACATAATCATC-3'
5'-GTCTCTGAATCAGAAATCCTTCTATC-3'
5'-CATGTCAAATTTCACTGCTTCATCC-3'
5'-AAACAGATGAAGTGCTCCTTCCAGG-3'
5'-TGGAGAACACCACTTGTTGCTCCA-3'
5'-GAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCC-3'
5'-TGTTTCAGATCCCTTTAGTTCCAG-3'
5'-TGACCACCCAGCCATCCTTC-3'
5'-GAGGAGGTGTTGACTTCATTC-3'
y
5'-GAGATTTCTCTGTATGGCACG-3'
5'-CTGCAAATGAGACACTTTCTC-3'
\vskip1.000000\baselineskip
32. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 31, en que dicha muestra es una muestra de
células sanguíneas humanas o una muestra de un vaso arterial
humano.
33. Uso de un patrón interno de cRNA para
cuantificar al menos un segmento de ácido nucleico diana RNA
contenido en una muestra mediante un método de amplificación por
reacción de polimerasa en cadena, en que dicho patrón interno lleva
sobre una hebra un segmento de ácido nucleico con una secuencia 5' y
una secuencia 3' que proporcionan un sitio de hibridación de
iniciador corriente arriba y el complemento de un sitio de
hibridación de iniciador corriente abajo que son idénticos a un
sitio de hibridación de iniciador corriente arriba y al complemento
de un sitio de hibridación de iniciador corriente abajo dentro de
dicho segmento de ácido nucleico diana, de modo que dicho segmento
de ácido nucleico patrón interno y dicho segmento de ácido nucleico
diana se coamplifican usando el mismo conjunto de iniciadores, la
reacción de transcriptasa inversa del cRNA patrón y del RNA diana se
realiza en la misma reacción y tras la amplificación puede
distinguirse dicho segmento de ácido nucleico patrón interno y dicho
segmento de ácido nucleico diana.
34. El uso de la reivindicación 33, en que dicho
patrón interno es adecuado para cuantificar entre 2 y 32 fragmentos
de ácido nucleico diana.
35. El uso de la reivindicación 33 o 34, en que
dicho patrón interno es adecuado para cuantificar un segmento de un
ácido nucleico que codifica una linfoquina.
36. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
33 a 35, en que dicha secuencia de ácido nucleico diana está
contenida dentro de una secuencia de ácido nucleico que codifica una
proteína seleccionada del grupo formado por TNF,
M-CSF, PDGF-A,
PDGF-B, PDGF-R,
apo-E, LDL-R, HMG,
IL-1a, IL-1P, IL-2,
LPL, G-CSF, GM-CSF, aFGF, bFGF,
c-fms, TGF-\beta,
LFA-1, IL-2R\alpha,
\alpha-actina, desmina,
\beta-actina, IL-6,
IFN-\alpha, IFN-\gamma,
IL-6R, PDGF-\alphaR,
IL-2R\beta, IL-3,
IL-1 y proteínas de HIV.
37. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
33 a 36, en que dicha molécula de cRNA patrón interno se sintetiza
usando un plásmido como molde.
38. El uso de la reivindicación 37, en que dicho
plásmido comprende además un promotor de polimerasa de T7 mediante
el que se produce una molécula de cRNA, usando como molde dicho
segmento de ácido nucleico patrón.
39. El uso de la reivindicación 38, en que dicho
plásmido comprende además una secuencia de poliadenilación mediante
la cual dicha molécula de cRNA se usa como molde en una reacción de
transcripción inversa iniciada por oligo(dT).
40. Un kit para cuantificar un segmento de ácido
nucleico diana RNA en una muestra biológica mediante un método de
amplificación por reacción de polimerasa en cadena, que comprende
recipientes individuales con:
(a) una cantidad inicial predeterminada de un
patrón interno que comprende un segmento de ácido nucleico con una
secuencia 5' y una secuencia 3', las cuales proporcionan un lugar de
hibridación de un iniciador corriente arriba y el complemento de un
lugar de hibridación de un iniciador corriente abajo que son
idénticos a un lugar de hibridación de un iniciador corriente arriba
y al complemento de un lugar de hibridación de un iniciador
corriente abajo dentro de dicho segmento de ácido nucleico diana, y
al amplificarlos dicho segmento de ácido nucleico patrón interno y
dicho segmento de ácido nucleico diana pueden distinguirse;
(b) por lo menos un par de oligonucleótidos
iniciadores para la co-amplificación de dicho
segmento de ácido nucleico patrón interno y dicho segmento de ácido
nucleico diana;
(c) una polimerasa termoestable; y
(d) opcionalmente tampones apropiados para una
reacción de polimerasa en cadena y nucleósido trifosfatos.
\vskip1.000000\baselineskip
41. El kit de la reivindicación 40, en que dicho
patrón interno es adecuado para cuantificar entre 2 y 32 fragmentos
de ácido nucleico diana.
42. El kit de la reivindicación 40 o 41, en que
dicho patrón interno es adecuado para cuantificar un segmento de un
ácido nucleico que codifica una linfoquina.
43. El kit de la reivindicación 40 o 41, en que
dicha secuencia de ácido nucleico diana está contenida dentro de una
secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína seleccionada
del grupo formado por TNF, M-CSF,
PDGF-A, PDGF-B,
PDGF-R, apo-E,
LDL-R, HMG, IL-1\alpha,
IL-1\beta, IL-2, LPL,
G-CSF, GM-CSF, aFGF, bFGF,
c-fms, TGF-\beta,
LFA-1, IL-2R\alpha,
\alpha-actina, desmina,
\beta-actina, IL-6,
IFN-\alpha, IFN-\gamma,
IL-6R, PDGF-\alphaR,
IL-2R\beta, IL-3,
IL-1 y proteínas de HIV.
44. El kit de la reivindicación 43, en que dicho
patrón interno comprende además una secuencia de poliadenilación
mediante la cual dicha molécula de cRNA se usa como molde en una
reacción de transcripción inversa iniciada por oligo(dT) y en
que dicho cRNA es producido con el empleo de un promotor de T7.
45. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
40 a 44, que además comprende transcriptasa inversa.
46. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
40 a 45, que además comprende una sonda para detectar el segmento de
ácido nucleico diana.
47. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
40 a 46, que además comprende una sonda para detectar el segmento de
ácido nucleico patrón interno.
48. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
40 a 47, que además comprende DNA polimerasa.
49. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
40 a 48, en que dicho ácido nucleico diana es indicativo de una
enfermedad genética, cáncer o HIV.
50. Un método para cuantificar un segmento de
ácido nucleico diana RNA en una muestra usando una reacción de
polimerasa en cadena, que comprende las etapas de:
(a) añadir a dicha muestra una cantidad inicial
predeterminada de un patrón interno de cRNA como el
caracterizado en cualquiera de las reivindicaciones 33 a 39,
el cual comprende un segmento de ácido nucleico que se une a los
mismos iniciadores que son fijados por dicho segmento de ácido
nucleico diana, de modo que dicho segmento de ácido nucleico patrón
interno y dicho segmento de ácido nucleico diana se coamplifican
usando el mismo conjunto de iniciadores;
(b) transcribir inversamente dicho segmento de
ácido nucleico diana y dicho segmento de ácido nucleico patrón
interno a moléculas de cDNA;
(c) tratar dicha muestra en condiciones
adecuadas para efectuar una reacción en cadena de la polimerasa, en
que dichas moléculas de cDNA se transforman en monohebra y se
exponen a un agente para la polimerización, deoxinucleótido 5'
trifosfatos, y a un par de oligonucleótidos iniciadores, en que
dicho par de iniciadores puede hibridar tanto con el segmento de
ácido nucleico diana como con el patrón, de manera que cada
iniciador pueda servir para iniciar la síntesis de un producto de
extensión en una hebra de DNA de cada uno de los segmentos de ácido
nucleico diana y patrón, de forma que el producto de extensión de un
iniciador, cuando se separa de la hebra molde, sirve de molde para
la síntesis del producto de extensión del otro iniciador de dicho
par, donde dichos segmentos de ácido nucleico diana y patrón
amplificados son distinguibles;
(d) separar los productos de extensión del
iniciador del molde sobre los que han sido sintetizados, para dar
moléculas monohebra;
(e) repetir los pasos (c) y (d) sobre las
moléculas monohebra producidas en la etapa (d), por lo menos una
vez, por lo que cada repetición de las etapas (c) y (d) es un ciclo
de amplificación;
(f) medir las cantidades de los segmentos diana
y patrón amplificados en la etapa (e); y
(g) calcular a partir de los segmentos diana y
patrón amplificados en la etapa (e) la cantidad de dicho segmento de
ácido nucleico diana presente en la muestra antes de la
amplificación.
\vskip1.000000\baselineskip
51. El método de la reivindicación 50, en que
dicho segmento de ácido nucleico diana está contenido dentro de una
secuencia de un mRNA que codifica una linfoquina.
52. El método de la reivindicación 50 o 51, en
que dicho segmento de ácido nucleico diana está contenido dentro de
una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína
seleccionada entre TNF, M-CSF,
PDGF-A, PDGF-B,
PDGF-R, apo-E,
LDL-R, HMG, IL-1\alpha,
IL-1\beta, IL-2, LPL,
G-CSF, GM-CSF, aFGF, bFGF,
c-fms, TGF-\beta,
LFA-1, IL-2R\alpha,
\alpha-actina, desmina,
\beta-actina, IL-6,
IFN-\alpha, IFN-\gamma,
IL-6R, PDGF-\alphaR,
IL-2R\beta, IL-3,
IL-1 y proteínas de HIV.
53. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 50 a 52 que además comprende la etapa de preparar
al menos una dilución a partir de la etapa (a) antes de la etapa
(c), con lo cual varía la cantidad de segmentos de ácido nucleico
patrón y de ácido nucleico diana antes de dicha reacción de
amplificación.
54. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 50 a 53, en el cual se realizan 10 hasta 28 ciclos
de amplificación y se toman muestras de dicha mezcla reaccionante
para determinar a través de qué ciclos la reacción está en fase
exponencial.
55. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 50 a 54, en que el par de oligonucleótidos
iniciadores de la etapa (c) está marcado y las cantidades de los
segmentos de patrón interno y diana amplificados se miden según la
etapa (f), determinando la cantidad de marcador incorporado en cada
segmento de ácido nucleico amplificado.
56. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 50 a 55, en que dicha muestra es una muestra de
células sanguíneas humanas o una muestra de vaso arterial
humano.
57. Uso de un patrón interno para cuantificar al
menos un segmento de ácido nucleico diana contenido en una muestra
mediante un método de amplificación por reacción de la polimerasa en
cadena, en que dicho patrón interno comprende en una hebra un
segmento de ácido nucleico con una secuencia 5' y una secuencia 3',
las cuales aportan un sitio de hibridación de un iniciador corriente
arriba y el complemento de un sitio de hibridación de un iniciador
corriente abajo que son idénticos a un sitio de hibridación de un
iniciador corriente arriba y al complemento de un sitio de
hibridación de un iniciador corriente abajo dentro de dicho segmento
de ácido nucleico diana, en que dicho segmento de ácido nucleico
patrón interno y dicho segmento de ácido nucleico diana se
coamplifican empleando el mismo conjunto de iniciadores y al ser
amplificados dicho segmento de ácido nucleico patrón interno y dicho
segmento de ácido nucleico diana son distinguibles, y dicho patrón
interno es adecuado para cuantificar entre 2 y 32 segmentos de ácido
nucleico diana.
58. El uso de la reivindicación 57, en que dicho
patrón interno es adecuado para cuantificar un segmento de un ácido
nucleico que codifica una linfoquina.
59. El uso de la reivindicación 57, en que dicha
secuencia de ácido nucleico diana está contenida en una secuencia de
ácido nucleico que codifica una proteína seleccionada del grupo
constituido por TNF, M-CSF, PDGF-A,
PDGF-B, PDGF-R,
apo-E, LDL-R, HMG,
IL-1\alpha, IL-1\beta,
IL-2, LPL, G-CSF,
GM-CSF, aFGF, bFGF, c-fms,
TGF-\beta, LFA-1,
IL-2R\alpha, \alpha-actina,
desmina, \beta-actina, IL-6,
IFN-\alpha, IFN-\gamma,
IL-6R, PDGF-\alphaR,
IL-2R\beta, IL-3,
IL-1 y proteínas de HIV.
60. El uso de la reivindicación 59, en que dicho
patrón interno comprende las siguientes secuencias de DNA:
5'-CAGAGGGAAGAGTTCCCCAG-3'
5'-CCTTGGTCTGGTAGGAGACG-3'
5'-GAACAGTTGAAAGATCCAGTG-3'
5'-TCGGACGCAGGCCTTGTCATG-3'
5'-CCTGCCCATTCGGAGGAAGAG-3'
5'-TTGGCCACCTTGACGCTGGG-3'
5'-GAAGGAG.CCTGGGTTCCCTG-3'
5'-TTTCTCACCTGGACAGGTCG-3'
5'-GGTCAGTTGGCAGGATGCCAGGC-3'
5'-GGTCAGTTGTTCCTCCAGTTC-3'
5'-CAATGTCTCACCAAGCTCTG-3'
5'-TCTGTCTCGAGGGGTAGCTG-3'
5'-TACCATGTCAGGGGTACGTC-3'
5'-CAAGCCTAGAGACATAATCATC-3'
5'-GTCTCTGAATCAGAAATCCTTCTATC-3'
5'-CATGTCAAATTTCACTGCTTCATCC-3'
5'-AAACAGATGAAGTGCTCCTTCCAGG-3'
5'-TGGAGAACACCACTTGTTGCTCCA-3'
5'-GAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCC-3'
5'-TGTTTCAGATCCCTTTAGTTCCAG-3'
5'-TGACCACCCAGCCATCCTTC-3'
5'-GAGGAGGTGTTGACTTCATTC-3'
y
5'-GAGATTTCTCTGTATGGCACG-3'
5'-CTGCAAATGAGACACTTTCTC-3'
\vskip1.000000\baselineskip
61. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
57 a 60, en que dicho patrón interno es una molécula de cRNA.
62. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
57 a 61, en que dicho patrón interno se proporciona en forma de
plásmido.
63. El uso de cualquiera de las reivindicaciones
57 a 62, en que dicho patrón interno comprende además un promotor de
polimerasa de T7 mediante el cual se produce una molécula de cRNA
empleando como molde dicho segmento de ácido nucleico patrón.
64. El uso de la reivindicación 63, en que dicho
patrón interno comprende además una secuencia de poliadenilación
mediante la cual dicha molécula de cRNA se emplea como molde en una
reacción de transcriptasa inversa iniciada por oligo(dT).
65. Un kit para cuantificar un segmento de ácido
nucleico diana RNA en una muestra biológica mediante un método de
amplificación por reacción de polimerasa en cadena, que comprende
recipientes individuales con:
(a) una cantidad inicial predeterminada de un
patrón interno que comprende un segmento de ácido nucleico con una
secuencia 5' y una secuencia 3', las cuales proporcionan un sitio de
hibridación de un iniciador corriente arriba y el complemento de un
sitio de hibridación de un iniciador corriente abajo que son
idénticos a un sitio de hibridación de un iniciador corriente arriba
y al complemento de un sitio de hibridación de un iniciador
corriente abajo dentro de dicho segmento de ácido nucleico diana, y
al amplificarlos dicho segmento de ácido nucleico patrón interno y
dicho segmento de ácido nucleico diana pueden distinguirse mediante
sondas específicas de segmento, y dicho patrón interno es apropiado
para cuantificar entre 2 y 32 segmentos de ácido nucleico.
(b) por lo menos un par de oligonucleótidos
iniciadores para la co-amplificación de dicho
segmento de ácido nucleico patrón interno y dicho segmento de ácido
nucleico diana.
\vskip1.000000\baselineskip
66. El kit de la reivindicación 65, en que dicho
patrón interno es apropiado para cuantificar un segmento de un ácido
nucleico que codifica una linfoquina.
67. El kit de la reivindicación 65, en que dicha
secuencia de ácido nucleico diana está contenida en una secuencia de
ácido nucleico que codifica una proteína seleccionada del grupo
constituido por TNF, M-CSF, PDGF-A,
PDGF-B, PDGF-R,
apo-E, LDL-R, HMG,
IL-1\alpha, IL-1\beta,
IL-2, LPL, G-CSF,
GM-CSF, aFGF, bFGF, c-fms,
TGF-\beta, LFA-1,
IL-2R\alpha, \alpha-actina,
desmina, \beta-actina, IL-6,
IFN-\alpha, IFN-\gamma,
IL-6R, PDGF-\alphaR,
IL-2R\beta, IL-3,
IL-1 y proteínas de HIV.
\newpage
68. El kit de la reivindicación 67, en que el
patrón interno comprende las siguientes secuencias de DNA:
5'-CAGAGGGAAGAGTTCCCCAG-3'
5'-CCTTGGTCTGGTAGGAGACG-3'
5'-GAACAGTTGAAAGATCCAGTG-3'
5'-TCGGACGCAGGCCTTGTCATG-3'
5'-CCTGCCCATTCGGAGGAAGAG-3'
5'-TTGGCCACCTTGACGCTGGG-3'
5'-GAAGGAG.CCTGGGTTCCCTG-3'
5'-TTTCTCACCTGGACAGGTCG-3'
5'-GGTCAGTTGGCAGGATGCCAGGC-3'
5'-GGTCAGTTGTTCCTCCAGTTC-3'
5'-CAATGTCTCACCAAGCTCTG-3'
5'-TCTGTCTCGAGGGGTAGCTG-3'
5'-TACCATGTCAGGGGTACGTC-3'
5'-CAAGCCTAGAGACATAATCATC-3'
5'-GTCTCTGAATCAGAAATCCTTCTATC-3'
5'-CATGTCAAATTTCACTGCTTCATCC-3'
5'-AAACAGATGAAGTGCTCCTTCCAGG-3'
5'-TGGAGAACACCACTTGTTGCTCCA-3'
5'-GAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCC-3'
5'-TGTTTCAGATCCCTTTAGTTCCAG-3'
5'-TGACCACCCAGCCATCCTTC-3'
5'-GAGGAGGTGTTGACTTCATTC-3'
y
5'-GAGATTTCTCTGTATGGCACG-3'
5'-CTGCAAATGAGACACTTTCTC-3'
\vskip1.000000\baselineskip
69. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
65 a 68, en que dicho patrón interno es una molécula de cRNA.
70. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
65 a 69, en que dicho patrón interno es suministrado en forma de
plásmido.
71. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
65 a 70, en que dicho patrón interno comprende además un promotor de
polimerasa de T7 mediante el cual se produce una molécula de cRNA
empleando como molde dicho segmento de ácido nucleico patrón.
72. El kit de la reivindicación 71, en que dicho
patrón interno comprende además una secuencia de poliadenilación
mediante la cual dicha molécula de cRNA se emplea como molde en una
reacción de transcriptasa inversa iniciada por oligo(dT).
73. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
65 a 72, que además comprende transcriptasa inversa.
74. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
65 a 73, que además comprende una polimerasa termoestable y
opcionalmente tampones apropiados para una reacción de polimerasa en
cadena y nucleósido trifosfatos.
75. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
65 a 74, que además comprende una sonda para detectar el segmento de
ácido nucleico diana.
76. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
65 a 75, que además comprende una sonda para detectar el segmento de
ácido nucleico patrón interno.
77. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
65 a 7 6, que además comprende una DNA polimerasa.
78. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
65 a 77, en que dicho ácido nucleico diana es un RNA.
79. El kit de cualquiera de las reivindicaciones
65 a 78, en que dicho ácido nucleico diana es indicativo de una
enfermedad genética, cáncer o HIV.
80. Un método para cuantificar un segmento de
ácido nucleico diana en una muestra mediante una reacción de
polimerasa en cadena, que comprende las etapas de:
(a) añadir a dicha muestra una cantidad inicial
predeterminada de un patrón interno como el caracterizado en
cualquiera de las reivindicaciones 57 a 64, el cual comprende un
segmento de ácido nucleico que se une a los mismos iniciadores
fijados por dicho segmento de ácido nucleico diana;
(b) tratar dicha muestra en condiciones
adecuadas para efectuar una reacción en cadena de la polimerasa, en
que dichos ácidos nucleicos se transforman en monohebra y se exponen
a un agente para la polimerización, deoxinucleótido 5' trifosfatos,
y a un par de oligonucleótidos iniciadores, en que dicho par de
iniciadores puede hibridar tanto con el segmento de ácido nucleico
diana como con el patrón, de manera que cada iniciador pueda servir
para iniciar la síntesis de un producto de extensión en una hebra de
DNA de cada uno de los segmentos de ácido nucleico diana y patrón,
de forma que el producto de extensión de un iniciador, cuando se
separa de la hebra molde, sirve de molde para la síntesis del
producto de extensión del otro iniciador de dicho par, donde dichos
segmentos de ácido nucleico diana y patrón amplificados son
distinguibles;
(c) separar los productos de extensión del
iniciador del molde sobre los que han sido sintetizados, para dar
moléculas monohebra;
(d) repetir los pasos (b) y (c) sobre las
moléculas monohebra producidas en la etapa (c), por lo menos una
vez, por lo que cada repetición de las etapas (b) y (c) es un ciclo
de amplificación;
(e) medir las cantidades de los segmentos diana
y patrón amplificados en la etapa (d); y
(f) calcular a partir de los segmentos diana y
patrón amplificados en la etapa (d) la cantidad de dicho segmento de
ácido nucleico diana presente en la muestra antes de la
amplificación.
\vskip1.000000\baselineskip
81. El método de la reivindicación 80, en que
dicho ácido nucleico diana es una molécula de mRNA, dicho patrón
interno es una molécula de cRNA y dichos RNAs se transcriben
inversamente a moléculas de cDNA después de la etapa (a) y antes de
la etapa (b).
82. El método de la reivindicación 81, en que
dicho segmento de ácido nucleico está contenido dentro de una
secuencia de un mRNA que codifica una linfoquina.
83. El método de la reivindicación 80 u 81, en
que dicho segmento de ácido nucleico diana está contenido en una
secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína seleccionada
del grupo constituido por TNF, M-CSF,
PDGF-A, PDGF-B,
PDGF-R, apo-E,
LDL-R, HMG, IL-1\alpha,
IL-1\beta, IL-2, LPL,
G-CSF, GM-CSF, aFGF, bFGF,
c-fms, TGF-\beta,
LFA-1, IL-2R\alpha,
\alpha-actina, desmina,
\beta-actina, IL-6,
IFN-\alpha, IFN-\gamma,
IL-6R, PDGF-\alphaR,
IL-2R\beta, IL-3,
IL-1 y proteínas de HIV.
84. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 80 a 83, que además comprende la etapa de preparar
al menos una dilución a partir de la mezcla de la etapa (a) antes de
la etapa (b) , con lo cual varía la cantidad de segmentos de ácido
nucleico patrón interno y de ácido nucleico diana antes de dicha
reacción de amplificación.
85. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 80 a 84, en que se realizan de 10 a 28 ciclos de
amplificación y se toman muestras de dicha mezcla reactiva para
determinar a través de qué ciclos la reacción está en fase
exponen-
cial.
cial.
86. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 80 a 85, en que el par de oligonucleótidos
iniciadores de la etapa (b) está marcado y las cantidades de
segmentos diana y patrón interno amplificados se miden según la
etapa (e), determinando la cantidad de marcador incorporado en cada
segmento de dichos ácidos nucleicos amplificados.
\newpage
87. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 83 a 86, en que dicho par de oligonucleótidos
iniciadores está seleccionado del grupo formado por:
5'-CAGAGGGAAGAGTTCCCCAG-3'
5'-CCTTGGTCTGGTAGGAGACG-3'
5'-GAACAGTTGAAAGATCCAGTG-3'
5'-TCGGACGCAGGCCTTGTCATG-3'
5'-CCTGCCCATTCGGAGGAAGAG-3'
5'-TTGGCCACCTTGACGCTGGG-3'
5'-GAAGGAGCCTGGGTTCCCTG-3'
5'-TTTCTCACCTGGACAGGTCG-3'
5'-GGTCAGTTGGCAGGATGCCAGGC-3'
5'-GGTCAGTTGTTCCTCCAGTTC-3'
5'-CAATGTCTCACCAAGCTCTG-3'
5'-TCTGTCTCGAGGGGTAGCTG-3'
5'-TACCATGTCAGGGGTACGTC-3'
5'-CAAGCCTAGAGACATAATCATC-3'
5'-GTCTCTGAATCAGAAATCCTTCTATC-3'
5'-CATGTCAAATTTCACTGCTTCATCC-3'
5'-AAACAGATGAAGTGCTCCTTCCAGG-3'
5'-TGGAGAACACCACTTGTTGCTCCA-3'
5'-GAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCC-3'
5'-TGTTTCAGATCCCTTTAGTTCCAG-3'
5'-TGACCACCCAGCCATCCTTC-3'
5'-GAGGAGGTGTTGACTTCATTC-3'
y
5'-GAGATTTCTCTGTATGGCACG-3'
5'-CTGCAAATGAGACACTTTCTC-3'
\vskip1.000000\baselineskip
88. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 80 a 87, en que dicha muestra es una muestra de
células de sangre humana o una muestra de vasos arteriales
humanos.
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US39698689A | 1989-08-21 | 1989-08-21 | |
| US396986 | 1989-08-21 | ||
| US07/413,623 US5219727A (en) | 1989-08-21 | 1989-09-28 | Quantitation of nucleic acids using the polymerase chain reaction |
| US413623 | 1989-09-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2132069T3 ES2132069T3 (es) | 1999-08-16 |
| ES2132069T5 true ES2132069T5 (es) | 2010-05-04 |
Family
ID=27015717
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES90913621T Expired - Lifetime ES2132069T5 (es) | 1989-08-21 | 1990-08-20 | Cuantificacion de acidos nucleicos utilizando la reaccion en cadena de la polimerasa. |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5219727A (es) |
| EP (1) | EP0497784B2 (es) |
| JP (2) | JP2878453B2 (es) |
| AT (1) | ATE178656T1 (es) |
| AU (1) | AU653920B2 (es) |
| CA (1) | CA2064906C (es) |
| DE (1) | DE69033044T2 (es) |
| DK (1) | DK0497784T5 (es) |
| ES (1) | ES2132069T5 (es) |
| WO (1) | WO1991002817A1 (es) |
Families Citing this family (234)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8227191B1 (en) * | 1986-12-15 | 2012-07-24 | City Of Hope | Method for amplification and detection of RNA sequences |
| US7252929B2 (en) | 1989-02-09 | 2007-08-07 | United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept Of Health & Human Services | Methods for identifying alpha PDGFR agonists and antagonists |
| EP0869177B1 (en) | 1989-02-09 | 2008-06-04 | THE UNITED STATES OF AMERICA, as represented by the Secretary of the Department of Health and Human Services | Polyclonal antibody against the human alpha pdgf receptor and use thereof |
| US6228600B1 (en) | 1992-07-20 | 2001-05-08 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Immunoassays for the alpha platelet-derived growth factor receptor |
| US5712125A (en) * | 1990-07-24 | 1998-01-27 | Cemv Bioteknik Ab | Competitive PCR for quantitation of DNA |
| GB9016163D0 (en) * | 1990-07-24 | 1990-09-05 | Cemu Bioteknik | Chemical method |
| US5994056A (en) | 1991-05-02 | 1999-11-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection |
| GB9112251D0 (en) * | 1991-06-07 | 1991-07-24 | Amersham Int Plc | Quantitative detection of nucleic acid amplification products |
| GB9116042D0 (en) * | 1991-07-24 | 1991-09-11 | Royal Free Hosp School Med | Diagnostic method |
| EP0525882B1 (en) * | 1991-08-02 | 2004-01-14 | bioMerieux B.V. | Quantification of nucleic acid |
| EP0534640B1 (en) * | 1991-09-23 | 1996-10-02 | Pfizer Inc. | Process for detecting specific mRNA and DNA in cells |
| FR2683827B1 (fr) * | 1991-11-15 | 1994-03-04 | Institut Nal Sante Recherc Medic | Procede de determination de la quantite d'un fragment d'adn d'interet par une methode d'amplification enzymatique. |
| US6197556B1 (en) | 1991-12-20 | 2001-03-06 | The University Of Chicago | Nucleic acid amplification using modular branched primers |
| USH1985H1 (en) | 1992-01-09 | 2001-08-07 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Method for detecting biological toxins |
| US5589333A (en) * | 1992-02-03 | 1996-12-31 | Thomas Jefferson University | In situ polymerase chain reaction |
| DE4234086A1 (de) * | 1992-02-05 | 1993-08-12 | Diagen Inst Molekularbio | Verfahren zur bestimmung von in vitro amplifizierten nukleinsaeuresequenzen |
| US6027887A (en) * | 1992-03-11 | 2000-02-22 | Institute Of Virology, Solvak Academy Of Sciences | MN gene and protein |
| USRE39031E1 (en) * | 1992-04-29 | 2006-03-21 | Biomerieux | RNA amplification method requiring only one manipulation step |
| FR2690691B1 (fr) * | 1992-04-29 | 1999-02-12 | Bio Merieux | Procede d'amplification d'arn necessitant une seule etape de manipulation. |
| FR2691162B1 (fr) * | 1992-05-12 | 1994-07-08 | Aremas | Moyen pour le dosage quantitatif de retrovirus, procede pour sa preparation et kit de diagnostic comportant ledit moyen. |
| WO1993023573A1 (en) * | 1992-05-15 | 1993-11-25 | New England Deaconess Hospital | Quantitation of viral rna by competitive polymerase chain reaction |
| US5612200A (en) * | 1992-06-24 | 1997-03-18 | Gen-Probe Incorporated | Method and kit for destroying ability of nucleic acid to be amplified |
| US6261808B1 (en) * | 1992-08-04 | 2001-07-17 | Replicon, Inc. | Amplification of nucleic acid molecules via circular replicons |
| WO1994003624A1 (en) * | 1992-08-04 | 1994-02-17 | Auerbach Jeffrey I | Methods for the isothermal amplification of nucleic acid molecules |
| EP0586112A3 (en) * | 1992-08-14 | 1994-09-14 | Pharma Gen S A | Control of pcr mediated detection of micro-organisms |
| ZA936015B (en) * | 1992-08-24 | 1994-03-10 | Akzo Nv | Elimination of false negatives in nuleic acid detection. |
| US6277606B1 (en) * | 1993-11-09 | 2001-08-21 | Cold Spring Harbor Laboratory | Representational approach to DNA analysis |
| US20040197774A1 (en) * | 1992-11-12 | 2004-10-07 | Michael Wigler | Representational approach to DNA analysis |
| US5639606A (en) * | 1993-04-06 | 1997-06-17 | The University Of Rochester | Method for quantitative measurement of gene expression using multiplex competitive reverse transcriptase-polymerase chain reaction |
| US5457027A (en) * | 1993-05-05 | 1995-10-10 | Becton, Dickinson And Company | Internal controls for isothermal nucleic acid amplification reactions |
| US5403707A (en) * | 1993-05-14 | 1995-04-04 | Eastman Kodak Company | Diagnostic compositions, elements, methods and test kits for amplification and detection of retroviral DNA using primers having matched melting temperatures |
| GB9311386D0 (en) * | 1993-06-02 | 1993-07-21 | Pna Diagnostics As | Nucleic acid analogue assay procedures |
| US5837501A (en) * | 1993-07-09 | 1998-11-17 | Akzo Nobel N.V. | Nucleic acid quantitation by co-amplification of target with multiple internal controls |
| WO1995006137A1 (en) * | 1993-08-27 | 1995-03-02 | Australian Red Cross Society | Detection of genes |
| WO1995006750A1 (en) * | 1993-09-03 | 1995-03-09 | Cellpro, Incorporated | Methods for quantifying the number of cells containing a selected nucleic acid sequence in a heterogenous population of cells |
| US5840573A (en) * | 1994-02-01 | 1998-11-24 | Fields; Robert E. | Molecular analyzer and method of use |
| PH31414A (en) * | 1994-02-24 | 1998-10-29 | Boehringer Ingelheim Int | Method of diagnosing cancer precancerous state, orsusceptibility to other forms of diseases by anal ysis of irf-1 specific rna in biopsy samples. |
| JPH10500862A (ja) * | 1994-05-28 | 1998-01-27 | テプネル・メディカル・リミテッド | 核酸のコピーの産生 |
| US5766889A (en) * | 1994-06-08 | 1998-06-16 | The Perkin-Elmer Corporation | Method for determining the characteristics of the concentration growth of target nucleic acid molecules in polymerase chain reaction sample |
| US6214980B1 (en) | 1994-06-20 | 2001-04-10 | University Of Florida | Materials and methods for detection of Oxalobacte formigenes |
| US6379897B1 (en) * | 2000-11-09 | 2002-04-30 | Nanogen, Inc. | Methods for gene expression monitoring on electronic microarrays |
| US5891629A (en) * | 1995-09-28 | 1999-04-06 | Ambion, Inc. | Compositions for improving RNase cleavage of base pair mismatches in double-stranded nucleic acids |
| ATE215993T1 (de) * | 1995-05-19 | 2002-04-15 | Abbott Lab | Nachweis von nukleinsäuren mit breitem dynamikbereich unter verwendung von aggregat- primer-reihen |
| US5705365A (en) * | 1995-06-07 | 1998-01-06 | Gen-Probe Incorporated | Kits for determining pre-amplification levels of a nucleic acid target sequence from post-amplification levels of product |
| US5710029A (en) * | 1995-06-07 | 1998-01-20 | Gen-Probe Incorporated | Methods for determining pre-amplification levels of a nucleic acid target sequence from post-amplification levels of product |
| US5667974A (en) * | 1995-06-07 | 1997-09-16 | Abbott Laboratories | Method for detecting nucleic acid sequences using competitive amplification |
| CA2188713A1 (en) * | 1995-10-27 | 1997-04-28 | Robert Collu | Internal standards for quantitative competitive pcr |
| FR2740781B1 (fr) | 1995-11-06 | 1998-03-20 | Aremas Ass Pour La Rech L Etud | Procede et kit pour la quantification et la detection des micro-organismes |
| DE19544332C2 (de) * | 1995-11-28 | 1999-07-08 | Deutsches Krebsforsch | Verfahren zum Nachweis der Expression von CD95 Ligand in Zellen |
| US6265152B1 (en) | 1995-12-22 | 2001-07-24 | Visible Genetics Inc. | Method and kit for evaluation of HIV mutations |
| US5795722A (en) * | 1997-03-18 | 1998-08-18 | Visible Genetics Inc. | Method and kit for quantitation and nucleic acid sequencing of nucleic acid analytes in a sample |
| US6007983A (en) * | 1995-12-22 | 1999-12-28 | Visible Genetics Inc. | Method and kit for evaluation of HIV mutations |
| US6063568A (en) * | 1996-05-02 | 2000-05-16 | Molecular Innovations, Inc. | Quantitation of RNA transcripts using genomic DNA as the internal amplification competitor |
| IT1286829B1 (it) * | 1996-09-05 | 1998-07-17 | Claudio Orlando | Plasmidi contenenti due o piu' competitori disposti in successione e loro uso in tecniche di pcr-competitiva |
| US6361940B1 (en) | 1996-09-24 | 2002-03-26 | Qiagen Genomics, Inc. | Compositions and methods for enhancing hybridization and priming specificity |
| AU6141098A (en) | 1997-01-30 | 1998-08-25 | University Technology Corporation | Diagnosis and treatment of myocardial failure |
| US6830887B2 (en) | 1997-03-18 | 2004-12-14 | Bayer Healthcare Llc | Method and kit for quantitation and nucleic acid sequencing of nucleic acid analytes in a sample |
| IL124275A (en) * | 1997-05-02 | 2002-03-10 | Bio Merieux Vitek Inc | A method to produce sequences of nucleic acids |
| US6558901B1 (en) * | 1997-05-02 | 2003-05-06 | Biomerieux Vitek | Nucleic acid assays |
| US5863736A (en) * | 1997-05-23 | 1999-01-26 | Becton, Dickinson And Company | Method, apparatus and computer program products for determining quantities of nucleic acid sequences in samples |
| ES2129365B1 (es) * | 1997-07-18 | 2000-04-01 | Pharmagen S A | Metodo para la deteccion de secuencias especificas de acidos nucleicos en presencia de un vector util como control positivo interno. |
| WO1999007895A1 (en) * | 1997-08-06 | 1999-02-18 | Ludwig Institute For Cancer Research | Methods for quantifying nucleic acid molecules |
| US5888740A (en) * | 1997-09-19 | 1999-03-30 | Genaco Biomedical Products, Inc. | Detection of aneuploidy and gene deletion by PCR-based gene- dose co-amplification of chromosome specific sequences with synthetic sequences with synthetic internal controls |
| WO1999024619A1 (en) * | 1997-11-07 | 1999-05-20 | Ixion Biotechnology, Inc. | Materials and methods for quantitative pcr |
| US6893877B2 (en) | 1998-01-12 | 2005-05-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for screening substances in a microwell array |
| US6289229B1 (en) | 1998-01-20 | 2001-09-11 | Scimed Life Systems, Inc. | Readable probe array for in vivo use |
| US6365346B1 (en) * | 1998-02-18 | 2002-04-02 | Dade Behring Inc. | Quantitative determination of nucleic acid amplification products |
| US5952202A (en) * | 1998-03-26 | 1999-09-14 | The Perkin Elmer Corporation | Methods using exogenous, internal controls and analogue blocks during nucleic acid amplification |
| US6232065B1 (en) | 1998-05-06 | 2001-05-15 | Case Western Reserve University | Analysis of gene family expression |
| US20030068635A1 (en) * | 1999-02-16 | 2003-04-10 | Boehringer Mannheim Gmbh | Determination of an analyte using two labels |
| CA2367912A1 (en) | 1999-03-19 | 2000-09-28 | Genencor International, Inc. | Multi-through hole testing plate for high throughput screening |
| US6573047B1 (en) | 1999-04-13 | 2003-06-03 | Dna Sciences, Inc. | Detection of nucleotide sequence variation through fluorescence resonance energy transfer label generation |
| US7655443B1 (en) * | 1999-05-07 | 2010-02-02 | Siemens Healthcare Diagnostics, Inc. | Nucleic acid sequencing with simultaneous quantitation |
| US6180349B1 (en) | 1999-05-18 | 2001-01-30 | The Regents Of The University Of California | Quantitative PCR method to enumerate DNA copy number |
| EP1238100B1 (en) | 1999-07-23 | 2005-09-07 | Gen-Probe Incorporated | Polynucleotide amplification method |
| IL149676A0 (en) | 1999-12-02 | 2002-11-10 | Dna Sciences Inc | Methods and kits for determining nucleotide variations |
| US20030022318A1 (en) * | 2000-01-25 | 2003-01-30 | Epiclone, Inc. | Method for thermocycling amplification of nucleic acid sequences and the generation of related peptides thereof |
| US20020151040A1 (en) | 2000-02-18 | 2002-10-17 | Matthew O' Keefe | Apparatus and methods for parallel processing of microvolume liquid reactions |
| US6248567B1 (en) | 2000-04-24 | 2001-06-19 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Template-specific termination in a polymerase chain reaction |
| US6783934B1 (en) | 2000-05-01 | 2004-08-31 | Cepheid, Inc. | Methods for quantitative analysis of nucleic acid amplification reaction |
| US6355433B1 (en) | 2000-06-02 | 2002-03-12 | Dna Sciences, Inc. | Determination of nucleotide sequence variations through limited primer extension |
| GB0021303D0 (en) * | 2000-08-30 | 2000-10-18 | Medinnova Sf | Use |
| US20070037144A1 (en) * | 2000-10-20 | 2007-02-15 | Jay Wohlgemuth | Leukocyte expression profiling |
| KR100624667B1 (ko) * | 2000-10-26 | 2006-09-18 | 내셔널 푸드 리서치 인스티튜트 | 유전자 재조합체의 정량법 및 그것에 이용하는 표준 분자 |
| JP2002159295A (ja) * | 2000-11-27 | 2002-06-04 | Keio Gijuku | Ｈｉｖ−１ｒｎａ−ｄｎａハイブリッドの定量法および診断キット |
| GB2370351A (en) * | 2000-12-22 | 2002-06-26 | Secr Defence Brit | Nucleic acid quantitation |
| JP2002221520A (ja) * | 2001-01-29 | 2002-08-09 | Sumitomo Chem Co Ltd | 免疫型の予測方法 |
| US7666588B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA and characterization of mitochondrial DNA heteroplasmy |
| US20040121311A1 (en) * | 2002-12-06 | 2004-06-24 | Ecker David J. | Methods for rapid detection and identification of bioagents in livestock |
| US20030027135A1 (en) | 2001-03-02 | 2003-02-06 | Ecker David J. | Method for rapid detection and identification of bioagents |
| US7718354B2 (en) | 2001-03-02 | 2010-05-18 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
| US7226739B2 (en) | 2001-03-02 | 2007-06-05 | Isis Pharmaceuticals, Inc | Methods for rapid detection and identification of bioagents in epidemiological and forensic investigations |
| US7026121B1 (en) | 2001-06-08 | 2006-04-11 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| US6905827B2 (en) * | 2001-06-08 | 2005-06-14 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing or monitoring auto immune and chronic inflammatory diseases |
| US7235358B2 (en) | 2001-06-08 | 2007-06-26 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| US7217510B2 (en) | 2001-06-26 | 2007-05-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for providing bacterial bioagent characterizing information |
| US8073627B2 (en) * | 2001-06-26 | 2011-12-06 | Ibis Biosciences, Inc. | System for indentification of pathogens |
| CA2400601A1 (en) * | 2001-08-31 | 2003-02-28 | University Of Utah Research Foundation | Real-time gene quantification with internal standards |
| DE60230787D1 (de) * | 2001-08-31 | 2009-02-26 | Gen Probe Inc | Sonden mit affinitätsverschiebung zur quantifizierung von analytenpolynukleotiden |
| DE60219692T2 (de) * | 2001-12-21 | 2007-12-27 | Ellipsis Biotherapeutics Corp., Toronto | Polymorphismen der kationentransporter octn1 und octn2 welche mit entzündlichen darmerkrankungen in zusammenhang stehen |
| US20050106568A1 (en) * | 2001-12-28 | 2005-05-19 | Makoto Kobayashi | Method of quantifying nucleic acid and kit for quantifying nucleic acid |
| GB0204022D0 (en) * | 2002-02-20 | 2002-04-03 | Onyvax Ltd | Nucleic acid quantification |
| US7629152B2 (en) * | 2002-03-01 | 2009-12-08 | Integrated Dna Technologies, Inc. | Methods for amplifying polymeric nucleic acids |
| FR2836918A1 (fr) * | 2002-03-06 | 2003-09-12 | Univ Angers | Diagnostic pcr chimioresistance des cancers |
| GB0205455D0 (en) | 2002-03-07 | 2002-04-24 | Molecular Sensing Plc | Nucleic acid probes, their synthesis and use |
| US8277753B2 (en) | 2002-08-23 | 2012-10-02 | Life Technologies Corporation | Microfluidic transfer pin |
| US8394944B2 (en) | 2002-09-20 | 2013-03-12 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Dual-purpose primers and probes for providing enhanced hybridization assays by disruption of secondary structure formation |
| US20050014176A1 (en) * | 2002-10-18 | 2005-01-20 | Swiger Roy R. | Method for quantitative end-point PCR |
| US20040096829A1 (en) * | 2002-11-14 | 2004-05-20 | Allaire Normand E. | Absolute quantitation of nucleic acids by RT-PCR |
| CN105349657A (zh) | 2002-12-06 | 2016-02-24 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 病原生物的多种分析检测 |
| US7718361B2 (en) | 2002-12-06 | 2010-05-18 | Roche Molecular Systems, Inc. | Quantitative test for bacterial pathogens |
| CA2508726A1 (en) | 2002-12-06 | 2004-07-22 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Methods for rapid identification of pathogens in humans and animals |
| AU2003302264A1 (en) | 2002-12-20 | 2004-09-09 | Biotrove, Inc. | Assay apparatus and method using microfluidic arrays |
| US7067298B2 (en) * | 2003-03-31 | 2006-06-27 | Ambion, Inc. | Compositions and methods of using a synthetic Dnase I |
| BRPI0408967B8 (pt) | 2003-03-31 | 2021-07-27 | Hoffmann La Roche | kit e métodos para detecção de um ácido nucléico de vários membros do sorogrupo do vírus da encefalite japonesa em uma amostra biológica sob condições de hibridização rigorosas |
| US7820030B2 (en) * | 2003-04-16 | 2010-10-26 | Handylab, Inc. | System and method for electrochemical detection of biological compounds |
| EP1469083A1 (en) * | 2003-04-17 | 2004-10-20 | Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs) | Method of calibration of reverse transcription using a synthetic messenger RNA (smRNA) as an internal control |
| US8046171B2 (en) | 2003-04-18 | 2011-10-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and apparatus for genetic evaluation |
| US20060263813A1 (en) * | 2005-05-11 | 2006-11-23 | Expression Diagnostics, Inc. | Methods of monitoring functional status of transplants using gene panels |
| US7892745B2 (en) * | 2003-04-24 | 2011-02-22 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection |
| US8057993B2 (en) | 2003-04-26 | 2011-11-15 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of coronaviruses |
| US8158354B2 (en) | 2003-05-13 | 2012-04-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
| US7964343B2 (en) | 2003-05-13 | 2011-06-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Method for rapid purification of nucleic acids for subsequent analysis by mass spectrometry by solution capture |
| WO2005002413A2 (en) * | 2003-07-01 | 2005-01-13 | Bar Ilan University | Methods and reagents for diagnosing gliomas and treating gliomas |
| US20050026175A1 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-03 | John Link | Devices and methods for isolating RNA |
| US20050042660A1 (en) * | 2003-07-31 | 2005-02-24 | Hall Gerald Edward | Devices and methods for isolating RNA |
| US8097416B2 (en) | 2003-09-11 | 2012-01-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
| US8546082B2 (en) | 2003-09-11 | 2013-10-01 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for identification of sepsis-causing bacteria |
| US8242254B2 (en) | 2003-09-11 | 2012-08-14 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of bacteria |
| US7788039B2 (en) * | 2003-09-25 | 2010-08-31 | Roche Molecular Systems, Inc. | Quantitation of nucleic acids using growth curves |
| US8163895B2 (en) | 2003-12-05 | 2012-04-24 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of orthopoxviruses |
| US20070128608A1 (en) * | 2003-12-19 | 2007-06-07 | Kankyo Engineering Co., Ltd. | Novel mixtures for assaying nucleic acid, novel method of assaying nucleic acid with the use of the same and nucleic acid probe to be used therefor |
| US7252946B2 (en) * | 2004-01-27 | 2007-08-07 | Zoragen, Inc. | Nucleic acid detection |
| US7666592B2 (en) * | 2004-02-18 | 2010-02-23 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for concurrent identification and quantification of an unknown bioagent |
| US8119336B2 (en) | 2004-03-03 | 2012-02-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of alphaviruses |
| WO2005089945A1 (en) | 2004-03-12 | 2005-09-29 | Biotrove, Inc. | Nanoliter array loading |
| US7595179B2 (en) * | 2004-04-19 | 2009-09-29 | Applied Biosystems, Llc | Recombinant reverse transcriptases |
| JP4810533B2 (ja) | 2004-05-24 | 2011-11-09 | アイビス バイオサイエンシズ インコーポレイティッド | ディジタルスレショルド化による選択的イオン濾過作用を用いた質量分光測定法 |
| US20050266411A1 (en) | 2004-05-25 | 2005-12-01 | Hofstadler Steven A | Methods for rapid forensic analysis of mitochondrial DNA |
| US7575864B2 (en) | 2004-05-27 | 2009-08-18 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Method for the direct detection of diagnostic RNA |
| EP1767655A4 (en) | 2004-07-13 | 2007-08-01 | Takeda Pharmaceutical | METHOD FOR CONTROLLING CELL FUCTIONS |
| US7811753B2 (en) | 2004-07-14 | 2010-10-12 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for repairing degraded DNA |
| US20060099605A1 (en) * | 2004-11-11 | 2006-05-11 | Hall Gerald E Jr | Devices and methods for isolating RNA |
| WO2006029184A2 (en) * | 2004-09-08 | 2006-03-16 | Expression Diagnostics, Inc. | Genes useful for diagnosing and monitoring inflammation related disorders |
| US8182992B2 (en) | 2005-03-03 | 2012-05-22 | Ibis Biosciences, Inc. | Compositions for use in identification of adventitious viruses |
| US8084207B2 (en) | 2005-03-03 | 2011-12-27 | Ibis Bioscience, Inc. | Compositions for use in identification of papillomavirus |
| EP1930730B1 (en) | 2005-03-10 | 2019-08-14 | Gen-Probe Incorporated | Systems and methods to perform assays for detecting or quantifying analytes |
| CA2967430C (en) | 2005-03-10 | 2018-05-08 | Gen-Probe Incorporated | Systems and methods to perform assays for detecting or quantifying analytes within samples |
| US20060270843A1 (en) * | 2005-05-26 | 2006-11-30 | Hall Gerald E Jr | Methods for isolation of nucleic acids |
| AU2006272776B2 (en) | 2005-07-21 | 2012-01-19 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods for rapid identification and quantitation of nucleic acid variants |
| US7368246B2 (en) * | 2005-09-15 | 2008-05-06 | Primera Biosystems, Inc. | Quantitative gene expression profiling |
| AU2006315489B2 (en) * | 2005-11-14 | 2012-09-06 | Gen-Probe Incorporated | Parametric calibration method |
| EP3167900B1 (en) | 2006-03-29 | 2018-11-21 | Merial Limited | Vaccine against streptococci |
| CA2648580A1 (en) * | 2006-04-07 | 2008-05-02 | Xdx, Inc. | Steroid responsive nucleic acid expression and prediction of disease activity |
| DE102006027675B4 (de) | 2006-06-14 | 2011-05-12 | Siemens Ag | Verfahren zur Bestimmung der Konzentration von Nukleinsäuren |
| JP5137096B2 (ja) * | 2006-07-05 | 2013-02-06 | 独立行政法人酒類総合研究所 | 特定の麹菌の同定方法 |
| WO2008021431A2 (en) * | 2006-08-14 | 2008-02-21 | Xdx, Inc. | Methods and compositions for diagnosing and monitoring the status of transplant rejection and immune disorders |
| AU2007353877B2 (en) | 2006-09-14 | 2012-07-19 | Ibis Biosciences, Inc. | Targeted whole genome amplification method for identification of pathogens |
| WO2008140484A2 (en) * | 2006-11-09 | 2008-11-20 | Xdx, Inc. | Methods for diagnosing and monitoring the status of systemic lupus erythematosus |
| AU2007325037B2 (en) | 2006-11-30 | 2012-09-20 | Gen-Probe Incorporated | Quantitative method employing adjustment of pre-defined master calibration curves |
| EP2099930B1 (en) | 2006-12-13 | 2015-02-18 | Luminex Corporation | Systems and methods for multiplex analysis of pcr in real time |
| US9938641B2 (en) * | 2006-12-18 | 2018-04-10 | Fluidigm Corporation | Selection of aptamers based on geometry |
| JP5680304B2 (ja) | 2007-02-23 | 2015-03-04 | アイビス バイオサイエンシズ インコーポレイティッド | 迅速な法医学的ｄｎａ分析法 |
| EP3091088B1 (en) | 2007-03-28 | 2019-02-06 | Signal Diagnostics | System and method for high resolution analysis of nucleic acids to detect sequence variations |
| ES2714007T3 (es) | 2007-04-09 | 2019-05-24 | Univ Florida | Composiciones de vectores rAAV que tienen proteínas de la cápside modificadas en tirosina y métodos para su uso |
| WO2008151023A2 (en) | 2007-06-01 | 2008-12-11 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids |
| SI2152663T1 (sl) * | 2007-06-04 | 2014-08-29 | Ben Gurion University Of The Negev Research And Development Authority | Tri-arilne spojine in sestavki, ki vsebujejo isto |
| EP2175999B1 (en) | 2007-06-21 | 2017-01-04 | Gen-Probe Incorporated | Receptacles for use in performing processes |
| SG190670A1 (en) | 2008-02-01 | 2013-06-28 | Gen Hospital Corp | Use of microvesicles in diagnosis, prognosis and treatment of medical diseases and conditions |
| EP2130929B1 (en) * | 2008-06-06 | 2013-10-09 | F. Hoffmann-La Roche AG | Internally controlled multiplex detection and quantification of microbial nucleic acids |
| WO2010033627A2 (en) | 2008-09-16 | 2010-03-25 | Ibis Biosciences, Inc. | Sample processing units, systems, and related methods |
| US8534447B2 (en) | 2008-09-16 | 2013-09-17 | Ibis Biosciences, Inc. | Microplate handling systems and related computer program products and methods |
| EP2349549B1 (en) | 2008-09-16 | 2012-07-18 | Ibis Biosciences, Inc. | Mixing cartridges, mixing stations, and related kits, and system |
| AU2009294850B2 (en) | 2008-09-22 | 2015-07-02 | Oregon Health & Science University | Methods for detecting a Mycobacterium tuberculosis infection |
| EP2352847B1 (en) | 2008-11-10 | 2014-01-08 | The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services | Gene signature for predicting prognosis of patients with solid tumors |
| US10669574B2 (en) | 2008-11-18 | 2020-06-02 | XCR Diagnostics, Inc. | DNA amplification technology |
| US8346485B2 (en) | 2008-11-25 | 2013-01-01 | Quest Diagnostics Investments Incorporated | Methods and apparatuses for estimating initial target nucleic acid concentration in a sample by modeling background signal and cycle-dependent amplification efficiency of a polymerase chain reaction |
| US20110244460A1 (en) | 2008-12-16 | 2011-10-06 | Arkray, Inc. | Method for detecting controls for nucleic acid amplification and use thereof |
| JP5564795B2 (ja) * | 2009-01-06 | 2014-08-06 | 株式会社島津製作所 | Ｄｎａ定量方法、及び遺伝子解析方法 |
| CA2750900C (en) | 2009-01-30 | 2017-03-28 | Gen-Probe Incorporated | Systems and methods for detecting a signal and applying thermal energy to a signal transmission element |
| EP2396803A4 (en) | 2009-02-12 | 2016-10-26 | Ibis Biosciences Inc | IONIZATION PROBE ASSEMBLIES |
| US8715928B2 (en) | 2009-02-13 | 2014-05-06 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Molecular-based method of cancer diagnosis and prognosis |
| EP2399131B1 (en) | 2009-02-20 | 2014-08-27 | The U.S.A. As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Method for the diagnosis of age-associated vascular disorders |
| AU2010273928A1 (en) | 2009-07-16 | 2012-02-09 | The General Hospital Corporation | Nucleic acid analysis |
| WO2011008972A1 (en) | 2009-07-17 | 2011-01-20 | Ibis Biosciences, Inc. | Systems for bioagent identification |
| WO2011008971A1 (en) | 2009-07-17 | 2011-01-20 | Ibis Biosciences, Inc. | Lift and mount apparatus |
| EP3330385A1 (en) * | 2009-07-21 | 2018-06-06 | Gen-Probe Incorporated | Methods for quantitative detection of nucleic acid sequences over an extended dynamic range |
| EP2475988B1 (en) | 2009-09-09 | 2018-11-14 | The General Hospital Corporation | Use of microvesicles in analyzing nucleic acid profiles |
| US20130029339A1 (en) | 2009-09-09 | 2013-01-31 | The General Hospital Corporation | Use of microvesicles in analyzing kras mutations |
| WO2011047307A1 (en) | 2009-10-15 | 2011-04-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Multiple displacement amplification |
| CN102834106A (zh) | 2009-11-20 | 2012-12-19 | 俄勒冈健康科学大学 | 产生针对结核病的免疫应答的方法 |
| US20130316338A1 (en) | 2010-06-29 | 2013-11-28 | The United States Government As Represented By The Department Of Veterans Affairs | CCR6 As A Biomarker of Alzheimer's Disease |
| US8877464B2 (en) * | 2010-07-29 | 2014-11-04 | Roche Molecular Systems, Inc. | Qualitative and quantitative detection of microbial nucleic acids |
| US20140045915A1 (en) | 2010-08-31 | 2014-02-13 | The General Hospital Corporation | Cancer-related biological materials in microvesicles |
| WO2012064993A1 (en) | 2010-11-10 | 2012-05-18 | Exosome Diagnosties, Inc. | Method for isolation of nucleic acid containing particles and extraction of nucleic acids therefrom |
| US10196691B2 (en) | 2011-01-25 | 2019-02-05 | Almac Diagnostics Limited | Colon cancer gene expression signatures and methods of use |
| ES2744589T3 (es) | 2011-05-11 | 2020-02-25 | Exosome Diagnostics Inc | Extracción de ácido nucleico de materiales biológicos heterogéneos |
| EP2748335B1 (en) | 2011-08-22 | 2018-10-03 | Exosome Diagnostics, Inc. | Urine biomarkers |
| CN102352414A (zh) * | 2011-10-18 | 2012-02-15 | 中国科学院地球化学研究所 | 多参照内标法定量基因表达量的方法 |
| EP2776587A4 (en) | 2011-11-10 | 2015-07-15 | Exosome Diagnostics Inc | LIQUOR ASSAY |
| AU2013277971B2 (en) | 2012-06-22 | 2018-11-15 | Htg Molecular Diagnostics, Inc. | Molecular malignancy in melanocytic lesions |
| US9932628B2 (en) | 2012-07-27 | 2018-04-03 | Gen-Probe Incorporated | Dual reference calibration method and system for quantifying polynucleotides |
| CN104995311A (zh) | 2012-08-30 | 2015-10-21 | 外来体诊断公司 | 用于核酸测定的对照 |
| EP2903597B1 (en) | 2012-10-03 | 2019-12-18 | Exosome Diagnostics Inc. | Use of microvesicles in diagnosis, prognosis, and treatment of medical diseases and conditions |
| AU2013202805B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-07-16 | Gen-Probe Incorporated | System and method for extending the capabilities of a diagnostic analyzer |
| AU2014228343B2 (en) | 2013-03-15 | 2019-11-07 | Gen-Probe Incorporated | Calibration method, apparatus and computer program product |
| RU2668164C2 (ru) | 2013-08-06 | 2018-09-26 | Эксосам Дайэгностикс, Инк. | Когорты биомаркеров мочи, профиль экспрессии генов и способы их применения |
| CN105793435A (zh) | 2013-10-09 | 2016-07-20 | 弗洛雷森特里克公司 | 多重探针 |
| WO2015073709A2 (en) | 2013-11-14 | 2015-05-21 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Detection of atherosclerotic cardiovascular disease risk and heart failure risk |
| WO2015106003A1 (en) | 2014-01-08 | 2015-07-16 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services | Ras pathways as markers of protection against hiv and methods to improve vaccine efficacy |
| US10844436B2 (en) | 2014-04-01 | 2020-11-24 | Cornell University | Use of double-stranded DNA in exosomes: a novel biomarker in cancer detection |
| US10465232B1 (en) * | 2015-10-08 | 2019-11-05 | Trace Genomics, Inc. | Methods for quantifying efficiency of nucleic acid extraction and detection |
| US11306362B2 (en) | 2016-02-08 | 2022-04-19 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Gene signature predictive of hepatocellular carcinoma response to transcatheter arterial chemoembolization (TACE) |
| US20190093172A1 (en) | 2016-04-15 | 2019-03-28 | Exosome Diagnostics, Inc. | Plasma-based detection of anaplastic lymphoma kinase (alk) nucleic acids and alk fusion transcripts and uses thereof in diagnosis and treatment of cancer |
| CN109642229A (zh) | 2016-05-13 | 2019-04-16 | 外来体诊断公司 | 从生物液体分离细胞外囊泡和共分离无细胞dna的自动和手动方法 |
| JP2019535307A (ja) | 2016-10-21 | 2019-12-12 | エクソサム ダイアグノスティクス，インコーポレイティド | エキソソーム結合型核酸の配列決定および分析 |
| US11427864B2 (en) | 2016-11-30 | 2022-08-30 | Exosome Diagnostics, Inc. | Methods and compositions to detect mutations in plasma using exosomal RNA and cell free DNA from non-small cell lung cancer patients |
| WO2018126278A2 (en) | 2017-01-02 | 2018-07-05 | Exosome Diagnostics, Inc. | Methods to distinguish rna and dna in a combined preparation |
| US11899024B2 (en) | 2017-07-12 | 2024-02-13 | Exosome Diagnostics, Inc. | Treatment and diagnosis of parkinson's disease using isolated and enriched populations of biofluid-derived extracellular vesicles |
| US11345957B2 (en) | 2017-07-18 | 2022-05-31 | Exosome Diagnostics, Inc. | Methods of treating glioblastoma in a subject informed by exosomal RNA signatures |
| EP3768858A1 (en) | 2018-03-19 | 2021-01-27 | Modernatx, Inc. | Assembly and error reduction of synthetic genes from oligonucleotides |
| WO2019236853A1 (en) | 2018-06-06 | 2019-12-12 | Exosome Diagnostics, Inc. | Methods for developing urine biomarkers and for detecting bladder cancer |
| DE102018213027A1 (de) * | 2018-08-03 | 2020-02-06 | Robert Bosch Gmbh | Reaktionsgemisch, Verfahren und Kit zur Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR |
| WO2020106853A1 (en) | 2018-11-20 | 2020-05-28 | Exosome Diagnostics, Inc. | Compositions and methods for internal controls of microvesicle isolations |
| EP3914734B1 (en) | 2019-01-25 | 2024-03-13 | President and Fellows of Harvard College | Compositions and method for synthesizing nucleic acids |
| WO2021119189A1 (en) | 2019-12-09 | 2021-06-17 | Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc., | Compositions and methods for identifying and modulating thrombotic conditions in a cancer patient |
| CA3161183A1 (en) | 2019-12-12 | 2021-06-17 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and methods for light-directed biomolecular barcoding |
| WO2021204642A1 (en) | 2020-04-06 | 2021-10-14 | Fast Track Diagnostics Luxembourg S.À.R.L. | Pcr based diagnostic kit, compositions and methods for amplification and detection of sars-cov-2 |
| KR20230002943A9 (ko) | 2020-04-22 | 2024-04-26 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 핵산 검출을 위한 등온 방법, 조성물, 키트, 및 시스템 |
| WO2022076559A1 (en) | 2020-10-06 | 2022-04-14 | President And Fellows Of Harvard College | Methods, compositions, kits and systems for signal-on detection of neutralization targets |
| CA3217862A1 (en) | 2021-05-05 | 2022-11-10 | Radius Pharmaceuticals, Inc. | Animal model having homologous recombination of mouse pth1 receptor |
| WO2023006642A1 (en) | 2021-07-26 | 2023-02-02 | Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited | Assay methods for titration of retrovirus and retroviral vectors |
| WO2024264065A1 (en) | 2023-06-23 | 2024-12-26 | Guardant Health, Inc. | Methods and compositions for quantifying immune cell nucleic acids |
| WO2025029475A1 (en) | 2023-07-28 | 2025-02-06 | Guardant Health, Inc. | Methods to enrich nucleotide variants by negative selection |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4683195A (en) * | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
| US4889818A (en) * | 1986-08-22 | 1989-12-26 | Cetus Corporation | Purified thermostable enzyme |
| IL86724A (en) * | 1987-06-19 | 1995-01-24 | Siska Diagnostics Inc | Methods and kits for amplification and testing of nucleic acid sequences |
-
1989
- 1989-09-28 US US07/413,623 patent/US5219727A/en not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-08-20 DK DK90913621T patent/DK0497784T5/da active
- 1990-08-20 EP EP90913621A patent/EP0497784B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-20 DE DE69033044T patent/DE69033044T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-20 CA CA002064906A patent/CA2064906C/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-20 ES ES90913621T patent/ES2132069T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-08-20 AU AU63523/90A patent/AU653920B2/en not_active Expired
- 1990-08-20 AT AT90913621T patent/ATE178656T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-08-20 WO PCT/US1990/004707 patent/WO1991002817A1/en active IP Right Grant
- 1990-08-20 JP JP2512734A patent/JP2878453B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-03-09 US US08/028,464 patent/US5476774A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-08-17 JP JP23075898A patent/JP3331178B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE69033044T2 (de) | 1999-11-25 |
| DK0497784T5 (da) | 2009-12-21 |
| US5219727A (en) | 1993-06-15 |
| EP0497784B1 (en) | 1999-04-07 |
| CA2064906A1 (en) | 1991-02-22 |
| WO1991002817A1 (en) | 1991-03-07 |
| ATE178656T1 (de) | 1999-04-15 |
| AU6352390A (en) | 1991-04-03 |
| ES2132069T3 (es) | 1999-08-16 |
| CA2064906C (en) | 2001-12-04 |
| US5476774A (en) | 1995-12-19 |
| JPH05504886A (ja) | 1993-07-29 |
| DK0497784T3 (da) | 1999-10-18 |
| JP2878453B2 (ja) | 1999-04-05 |
| DE69033044D1 (de) | 1999-05-12 |
| AU653920B2 (en) | 1994-10-20 |
| JP3331178B2 (ja) | 2002-10-07 |
| JPH11123095A (ja) | 1999-05-11 |
| EP0497784A1 (en) | 1992-08-12 |
| EP0497784B2 (en) | 2010-01-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2132069T5 (es) | Cuantificacion de acidos nucleicos utilizando la reaccion en cadena de la polimerasa. | |
| US6720144B1 (en) | Detection of clonal T-cell receptor-γ gene rearrangement by PCR/temporal temperature gradient gel electrophoresis (TTGE) | |
| CN101225441A (zh) | 一种检测克隆特异性t淋巴细胞tcr bv cdr3基因组成的方法 | |
| CN106435018B (zh) | 一种定量检测血液中hbv dna和rna的双通道实时荧光定量pcr检测方法 | |
| Rieckmann et al. | Semi-quantitative analysis of cytokine gene expression in blood and cerebrospinal fluid cells by reverse transcriptase polymerase chain reaction | |
| US6063568A (en) | Quantitation of RNA transcripts using genomic DNA as the internal amplification competitor | |
| Shinomiya et al. | Mapping an initiation region of DNA replication at a single-copy chromosomal locus in Drosophila melanogaster cells by two-dimensional gel methods and PCR-mediated nascent-strand analysis: multiple replication origins in a broad zone | |
| JP2004532641A (ja) | キー遺伝子の遺伝子発現比の測定方法 | |
| CN114959029B (zh) | 利用Crispr技术检测BRAF基因突变的试剂盒及应用 | |
| Karasawa et al. | Detection of c-myc oncogene amplification in a CML blastic phase patient with double minute chromosomes | |
| ES2229440T3 (es) | Deteccion de un carcinoma de vejiga urinaria en una muestra de orina. | |
| GROVER et al. | Simple, sensitive and accurate method for the quantification of prothrombin mRNA by using competitive PCR | |
| Therwath et al. | Altered globin gene transcription pattern and the presence of a 7‐8 kb alpha A globin gene transcript in avian erythroblastosis virus‐transformed cells. | |
| CN110551821A (zh) | 利用荧光定量pcr检测mef2d基因重排的引物和探针及试剂盒 | |
| Malcomson et al. | The scope of quantitative polymerase chain reaction assays in clinical molecular pathology | |
| CN110592211A (zh) | 基因foxd4在制备急性髓系白血病诊断试剂盒的应用及试剂盒 | |
| Schatzmann-Turhani et al. | Determination of the protooncogene ets-2 gene transcript in human brain at the atto-gram-level by the use of competitive RT/PCR | |
| WO2022093159A1 (en) | Method of using real-time pcr device in a new diagnostic field and diagnostic kit developed to use in real-time pcr device for this new diagnostic field | |
| CN113684261A (zh) | 利用荧光定量pcr检测znf384基因重排的引物和探针及试剂盒 | |
| Goetzl et al. | Relative quantification of collagen mRNA in fibroblasts by a radioactive polymerase chain reaction technique | |
| WO1995011316A1 (en) | A NUCLEIC ACID DIAGNOSTIC METHOD USING RIBOPROBES, RNAse DIGESTION, AND MOLECULAR WEIGHT EXCLUSION CHROMATOGRAPHY | |
| JP2003509065A (ja) | スピロヘータを検出するための一本鎖オリゴヌクレオチド、プローブ、プライマーおよび方法 | |
| CN113481301A (zh) | 检测样本中laptm4b基因相对表达量的寡核苷酸、方法和试剂盒 | |
| JP2000069969A (ja) | プライマーＤＮＡ及びこれを用いる前立腺特異抗原をコードするｍＲＮＡの検出方法 | |
| KR20090089094A (ko) | 시노비올린 유전자 또는 단백질의 신규한 용도 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG2A | Definitive protection |
Ref document number: 497784 Country of ref document: ES |